JPS63129994A - ヒト由来生理活性物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規な生理活性物質の製造方法に関するもので
ある。更に詳しくは、ヒト由来の白血病細胞を培養する
ことによって産生きれる、細胞分化誘導作用を有する蛋
白性のヒト由来の生理活性物Ｍ（以下、細胞分化誘導物
質と略記）の製造法に間するものである。

［従来の技術］ 免疫反応をつかさどっている細胞群の中で、最近マクロ
ファージ（以下Ｍφと略す）が注目されるようになって
きた。Ｍφが、どん食作用による抗原の処理を始めとし
て、生体の防御機構の中で、中心的な役割を演じている
ことが、明らかになつ、゛　血清細胞は、造血幹細胞よ
り、増帰分化を繰り返し、成熟して機能細胞へ到達する
のである。この分化成軌の過程で増鼎能をもち、腫よう
化してしまったものが白血病細胞である。このような腫
よう細胞を正常な機能をもった細胞へと分化を誘導する
のが、分化誘導能をもった物質であり、これら分化誘導
能をもった物質を用いることにより、新しい癌の治療方
法を開発てきるものとして、近年、注目されている。

分化誘導能をもった物質としては、安全性の高い蛋白性
の物質、特にヒト由来の蛋白性の物質が朋待を集め、近
年活発に研究がなされている。現在までに、ヒト末梢血
リンパ球をレクチンで刺激ずろことにより、分化誘導活
性か生成されろことが報告されている（ジャーナル　ナ
ショナル　カンサー　インステチュート（，１，Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒｌ　ｎ　ｓ　＋、口ｕｔ、ｅ
）　６７巻、１２２５頁（１９８１年）、カンサーリサ
ーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　４２巻、　
３９２８頁（１９８２年））。しかしながらこれらの報
告において、ヒト末梢血リンパ球から得られたものは、
セファデックスＧ−７５（ファルマシア社、スウェーデ
ン）を用いたゲルろ過分画法によって分子ｆｔ２５．０
００と４０．０００の債白性物質であることが報告され
ているのみてあったが、その後の研究において、公開特
許公報、昭Ｇ　（１−２８９３４号に示される分子量４
５．０００〜６０．０００または１００，０００　、等
電点５〜７の物質であり、トリプシンに感受性を示し、
熱に不安定な物質であるとされた。一方、ヒト−ニーリ
ンパ球性白血病細胞の培ｒ＠Ｅ連中に見いだされた分化
誘導活性は、アクリルアミドゲル電気泳動法によって、
分子＠５０．ｏｏｏ〜６０．０００の蛋白性の物質に由
来するものとされたが、単離工程中で、その活性の約６
０〜９０％が失われた（日本Ｍｉ織培養学会要旨、４３
頁、（１９８３年））。

［発明が解決しようとする問題点］ このように、ヒト末梢血リンパ球およびヒｌ−−Ｔ−リ
ンパ球性白血病細胞から生成される分化誘導活性は、そ
の活性をもたらす物質の性質はほとんどわかっていない
か、熱や蛋白質分解酵素に強い感受性を示す不安定な物
質であると共に、これらの物質の活性は弱く、ビタミン
Ａ誘導体などが共存しないと、白血病細胞に充分な分化
を誘導することができなかった。

また、ヒト末梢血リンパ球はヒトの血液から採はなかっ
た。またヒト−ニーリンパ性白血病細胞は、ヒトのＴ細
胞白血病ウィルスに維持感染することによって、増殖性
を獲得したものであり、大量の細胞培養は安全性の点で
問題が多かった。

［問題点を解決するための手段］ 木発明者らは、上記先行知見を認識し、マクロファージ
（Ｍφ）系の細胞が、より安定性に優れた、強い細胞分
化誘導作用を有する蛋白性の生理活性物質を産生ずると
の作業仮説に基いて、鋭意検討を続け、ヒトのＮ１φ前
駆細胞に作用して、単独で、Ｍφへと分化を誘導しろる
活性を有するヒト由来の蛋白性の細胞分化誘導物質を見
いだし、発明を完成し、特許出願を行なった。しかしな
がら、先願では、Ｎ１φ前駆細胞である白血病細胞を使
用する場合においても、Ｍφ前駆細胞をＭφ様細胞へ変
化させた後、分化誘導剤を洗浄、除去するために、大変
手間取り、大量の細胞を処理することがむずかしかった
。そこで、細胞分化誘導物質を大量かつ容易に取得する
ための手段について、検討をかさねた。従来、マクロフ
ァージは器壁への強い付着性を示し、また付着状態にお
いて、マクロファージのもつ種々の機能が発揮されろも
のと考えられてきた。しかしながら、意外にもＭφ様細
胞に分化しつるヒト白血病細胞を用い、分化誘導能を有
する物質およびＭφ活性化物質の存在下に攪はん培養す
ることにより、高濃度で細胞分化誘導物質が産生ずるこ
とを見いだし本発明を完成した。このようにすることに
より、はじめて安全に大量の細胞を取り扱うことができ
、かつ容易に培養装置を大型化できるため、細胞分化誘
導物質を大量に取得てきるようになったのである。

［発明の内容］ すなわち、本発明はマクロファージ様細胞に分化しうる
ヒト白血病細胞を分化誘導能を有する物質およびマクロ
ファージ活性化物質の存在下に攪はん培養することによ
る、下記の特性を有し、ａ）分子量　５０．０００±５
，０００　（ゲルろ過法）５０．０００±５．０００　
（Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動法） ｂ）等重点　６．５±　１．０（等電点電気泳動法）ｃ
）＃Ｊ１安定性　７０℃にて失活しない：、！　血＠細
胞に対して細胞分化誘導活性を有するヒ・１１ ト由来の生理活性物質の生産法に関する。

で少なくともマウスＭ−１細胞を分化させ、どん食油を
誘起する能力を有するものを意味する。

木発明の方法によれば、培養規模を調節することごこよ
り任意の量の細胞分化誘導物質を、随時、製造すること
ができる。

木発明で用いられるＭφ様細胞に分化しうるヒト白血病
細胞とは、Ｍφ前駆細胞に相当し、分化誘導能を有する
物質（以下、分化誘導剤と略す）の作用により始めてＭ
φ様細胞に変化する細胞又は本来Ｍφの性質の一部を有
しているが、分化誘導剤の作用により更にＭφの性質を
有するように変化する細胞を意味する。Ｍφ前駆細胞は
、白血病患者から分離した初代細胞及び株化細胞などか
ら得られるが、株化細胞が大量に得やすく好ましい。木
発明で用いられる白血病細胞の株化細胞の例としては、
ＨＬ−６０細胞（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７０
巻、３４７頁（１０７７年））ＴＨＰ−１細胞（インタ
ーナショナル　ジャーナル　カンサー（Ｉｎｔ、　、ｊ
−Ｃａｎｃｅｒ）　２６巻、１７＋頁（１９８０年）　
）　、Ｍｏｎｏ−１２０７細胞（ウィルヒョーズ　アル
ヒーフ　ァーパソロジカル　アナトミー　ヒスドパソロ
ジー（・：　Ｖｉｒｃｈｏｗｓ　Ａｒｃｈ、　Ａ　　Ｐ
ａｔｈ、　Ａｎａｔ、　ａｎｄ　　Ｈｉｓｔｏｌ。

□・；３７１巻、１５頁（１９７６年））などが挙げら
れる。こ゛こで用いられる分化誘導剤としては、Ｍφ様
！Ｓ胞へ変化し得る白血病５ｓ胞のＭφ様細胞への変化
を誘導する物質を意味し、例えば、ホルボールニス　　
　゛チル類、メゼレインのようなジテルペン系化合物、
テレオシジンなどが挙げられる。ホルボールエステル類
では、４β−ヒドロキシ体が好ましく、中でも、１２−
０−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（
以下、ＴＰＡと略記する）が特に好ましい。

本発明において用いられるＭφ活性化物質としては、ビ
タミンＡ誘導体く例えば、ビタミンＡ酸、ビタミンＡア
ルコール、ビタミンＡアセテート、ビタミンＡパルミテ
ート）、ジメチルスルホキシド、酪酸ナトリウム塩、ハ
イドロコーチシン、ダラム陰性菌由来のりボボリサッカ
ライド（以下ＬＰＳと略す）、リピッドＡ、ＢＣＧ菌な
どの菌体壁、ムラミルジペブチＦなどが挙げられ、それ
ぞれ単独、あるいは適宜絹み合わせて用いることにより
、Ｍφを活性化させ、細胞分化誘導物質の産生を促すこ
とができろ。これらＭφ活性化物質の中でも、約１〜５
０００ｎｇ／ｍｌ　、好ましくは約１００〜３０００ｎ
ｇ／ｍｌ　、より好ましくは約５００〜２００００８／
ＩＩ＋１のビタミンＡ誘導体、中でもビタミンＡｒＩｊ
の使用が特に好ましい。

細胞外１ヒ誘導物質産生に充分な時間、ヒト由来の白血
病細胞を培養した後、培養上清を収集し、遠心分離によ
り細胞屑を除去すれば、細胞分化誘導物質を含む溶液が
得られる。この細胞分化誘導物質を含む溶液を生化学的
分離操作における常法、限外ろ過による濃縮、透析脱塩
、陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィー
、ゲルろ過、電気泳動等を適宜絹み合わせて精製するこ
とにより、高純度の細胞分化誘導物質を得ることがてき
る。

細胞分化誘導物質の活性の測定は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏて
マウス骨髄性白血病細胞Ｍ−１細胞に、とん食油を誘起
する効果を測定することにより行なった。本発明者らが
用いている方法は、林の方法（トキシコロジーフォーラ
ム、７巻、５０頁、（１９８４年））を改良したもので
ある。即ち、Ｆ！！殖間にあるＭ−１細胞５ＸＩＯ５ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌ　（培地：イーグルＭ　Ｅ　％ｉ　＋　
２培量ビタミン・アミノ酸＋１０％牛脂児血清）浮遊液
に細胞分化誘導物質溶液（試験液）を混じ、その１１を
１０ｍ１ガラス管にとり、横に倒して、炭え攪はんした
後、さらに４時間培養する。この細胞をＰＢＳｌｍｌで
よく洗浄、遠心し、細胞外のラテックス粒子を除去する
。この操作を２回繰り返したのち、遠心管の底に沈殿し
た＠胞をピベツトて吸いヒげ、スライドガラス−Ｈに１
部落とす。

これに０．５％エオシン１α１滴を加え、カバーガラス
をのせ、顕徹鏡で観察する。赤く染色されろ死細胞を除
き、生細胞のみについて、ラテックス粒子をどん食した
細胞と非とん食細胞とを計数し、とん食細胞の比率を求
める。試験液を適宜希釈して、ｈ記の測定を行ない、と
ん食細胞の比率が１０％になるのに必要な、細胞分化誘
導物質の試料の希釈率の逆数をもって、本発明における
細胞分化誘導物質の活性量を　１単位（Ｕ）／ｍｌ　と
定義する。以下本発明における！Ｒ抱分化誘導物質の活
性量は、このどん食能測定法によって測定した単位で示
されている。

上記の細胞の培養により産生される、本発明の細胞分化
誘導物質の性質を詳しく述べる。

０．０＋！ポリエチレングリコールを添加した溶液にて
平衡（ヒした５ｕｐｅｒｏｓｅ　ｎ　＋　５ｕｐｅｒｏ
ｓｅ　１２　（ファルマシア社（スエーデン）製）を用
いるゲルろ過法により分画し、Ｍ−１細胞でのとん食油
の誘起によろ彊胞分化誘導活性を測定する。

Ｂ）分子＠　：　５０．０００±５．０００（Ｓ　Ｄ　
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動法） Ｓｅｇｒｅｓｔらの方２夫［メソッド　イン　エンザイ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）　２）３−８巻、５！１頁（１９７２年）コに従い、
トリス／グリシン／５ＤＳ（ｐＨ８，３）で、電気泳動
を行なった。標準分子量キット（ファルマシア社製）を
用いて分子竜検改線を作成し、分画したゲルからの抽出
物のＭ　−Ｉ　Ｘ１ｌｌ胞のどん食油誘起活性評価によ
り分子量を決定する。

以Ｅの結果より、本発明の細胞分化誘導物質はサブ・ユ
ニット構造をとっていない物τ１であることが分かる。

Ｃ）等電点：６．５±１．０（等電点電気泳動法）アト
−株式会社製の等電点電気泳動装置（Ｓ、１ア社製、ｐ
Ｈ４〜８）とクリセロールを含む５％ポリアクリルアミ
ド平板ゲルを作成した。陽極側に０．０４ＭＤＩ、−グ
ルタミン酸、陰極側に０．２Ｍ　Ｌ−ヒスチジンを使用
して、７００ｖて５０分間の前泳動を行なう。続いて試
料を付与し、７００（て１時間、５００ｖて１６時間泳
動を行なう。泳動終了後ゲルを２．５　ｍｍ巾で切り出
し、次いて各ゲル片を０．１５　Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．０２　Ｍ　トリス−塩酸緩衝ｉｆｆ　（ｐＨ８，
２）　０．２　ｍｌで抽出し、各抽出液について、Ｍ−
１細胞を用いた細、胞分化誘導活性の評価を行なう。

Ｄ　）ＰＪ１安定性 本発明の細胞分化誘導物質を０．０Ｉ＄ポリエチレング
リコールを添加したｐＨ７，４リン酸緩衝液にて３倍に
希釈し、所定の時間、所定の温度にて加執した後、Ｎ１
−１細胞を用いた細胞分化誘導活性の評価を行なう。本
発明の細胞分化誘導物質は、７０°Ｃ，１時間の熱処理
において、その活性を失わない、熱的に安定な生理活性
物質である。

［）レクチンカラムへの吸着性 市販の各種レクチン固定化樹脂を市販セパコールミニカ
ラム（バイオラット社Ｕ）に充填し　１５０ｍＭの塩化
ナトリウムを含む５０　ｍＭリン酸緩衝漬（ｐＨ７，５
）で充分に洗θ後、本発明の細胞分化誘導物質試料を添
加し、同緩衝液にて洗浄し、次いで、各種糖類を含む溶
離液で溶出を（〒なう。コンカナバリン−Ａ、および、
レンチルレクチンのカラムを用いた場合に、レクチンカ
ラムへの吸４が認められ、いずれのカラムにおいても０
．２Ｍα−メチル−ｄ−マンノシド溶液により、細胞分
化誘導活性が溶出する。

Ｆ）ジスルフィド結合の還元剤によろ影響ジスルフィド
結合の還元剤としてジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、
又は、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を、本発
明になる細胞分化誘導物質の溶ンα中に加え、３７℃で
、４時間反応させる。

反応後、Ｍ−１細胞に対するとん良能誘起活性を測定す
る。５０　ｍＭのジチオスレイトールを添加した場合に
、その活性の低下が認められろ。

Ｇ）ｐＨ安定性 １０の範囲において、活性の低下は認められない。

■）蛋白分解酵素安定性 本発明になる細胞分化誘導物質を含む溶液（ｐＨ７，４
）に蛋白分解酵素トリプシン、または、プロナーゼ・Ｅ
　　（２００単位）を添加し、３７℃にて、３時間反応
させる。反応後において、Ｍ−１，＊　ｌｌａに対する
細胞分化誘導活性の低下は認められない。上記実験に０
．１％ＳＤＳを添加したこと以外は、同一の条件にて蛋
白分解酵素の効果を検討したところ、０．１％ＳＤＳの
添加時のプロナーゼ−Ｅにより、細胞分化誘導活性が消
失することが認められる。

１）ヒト白血病細胞に対する生理作用 牛胎児血清を１０％含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０ｆｇ
地にヒト単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１）、ヒト前骨髄
性白血病細胞（ＨＬ−６０）を３７℃、炭酸ガス培養器
中でそれぞれ培養し、増稙期にある細胞をリン酸緩衝ｉ
αてよく洗浄した後、５％牛脂児血？５および　１０　
ｎＭビタミンＡ酸をン、禿カロしたＲ　Ｐ　Ｍ　Ｔ　１
６４０培地（ビタミン、アミノ酸強化）に、それぞれ２
Ｘ１０５個／　ｍｌ培地になるように！！＆濁する。細
胞懸シグマ社）の溶ｔα（０，２ｕｇ／…ＩＴＰＡ含有
培地に溶かした溶ｊｆｆ）　　１ｏ０７ｚｌを加えて、
さらに４５分間培養後、顕微鏡下で観察する。青く沈着
した色素を有する細胞がＮＥＴ還元能陽性細胞として観
察される。

本発明の細胞分化誘導物質と３日間培養することにより
、Ｔ　ＨＰ−１細胞、ＨＬ−６０細胞にＮＢＴ還元能が
誘導されるのみならず、ラテックス粒子とん食能、培養
容器壁への付着能、酵母量殺菌能、酸性ホスファターゼ
活性、β−グルクロニダーゼ活性など、Ｍφの特徴とし
て、細胞鑑定に常用される（「マニュアル　オブ　マク
ロファージ　メソトロシー（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍａ
ｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）、マーセ
ル　デツカ−社、米国、１９８１年」　「図解白血球、
金芳堂、１９８２年」）各種指標の活性の増強が認めら
れる。

なお、これまでの説明で明らかなように、本発明になる
新規生理活性物質は、Ｍφ前駆細胞であるヒトおよびマ
ウスの骨髄性白血病細胞に作用して、Ｎτφ様細胞へと
分化を誘導し、Ｍφに特有なンカナバリンーＡ、レンチ
ルレチン等のレクチンに対して結合性を有することから
、本発明の細胞分化誘導物質は、サブ・ユニット構造を
有しない糖蛋白質であると考えられる。

次に本発明の細胞分化誘導物質の製造方法について詳し
く述べる。

本発明で使用される細胞の培養には、高等動物細胞の培
養に適した各種合成培地が用いられる。

代表的な培地としては、例えばＲＰ　Ｍ　ｒ−１６４０
培地、イーグルのＭＥＭ培地、ダルベツコ変法のＭＥＭ
培地、ａ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地、Ｈａｍの培地、１９９培
地、　ＭｃＣｏｙ　５Ａ培地、Ｉ　５ｃｏｖｅの培地な
どを単独もしくは適宜混合したｔｇ地が用いられる。こ
れらの培地の組成は「細胞組織培養マニュアル、講談社
、１９８２年」に記載されている。これらの培地には、
アルブミン、インシュリン、トランスフェリンなどの血
清由来の蛋白質、ヒト血清、牛胎児血清、牛血清、馬血
清なとの動物血清を単独で、あるいは適宜絹み合わせて
添加してもよい。また必要に応じて、微生物による汚染
を防止するため炭酸イオン濃度の調節のために、例えば
１０〜（ｉｏｍＭのヘベス［４−（２−ハドロキシエチ
ル）弓−ピペラジンエタンスルホン酸コなとのｐＨ緩衝
剤を使用してもよい。培養容器の材質は特に限定せずに
使川でき、プラスチック、ガラスあるいは金属製のもの
であって、細胞の増へ吉が可能であればよい。

細胞外イヒ誘導物Ｎを産生させろためには、適当な培地
を用いて、ヒト白血病細胞を、培地１　ｍｌ当たりに約
＋ｘ＋ｏ５〜４×Ｉ−個、好ましくは、約４×１０５〜
２ＸＩ０６個となるように懸重し、培養容器に植え込む
。次いて、分化誘導能を有する物ｉｔ　（分（ヒ誘導削
）およびＮ１φ活性化物質を添加する。細胞、分化誘導
剤及びＭφ活性化物質を含む培養容器を、回転数約１５
〜４０　ｒｐｍ　、好ましくは２０〜３Ｏｒｐｍにて攬
はんしつつ、約３５〜３８°Ｃ１好ましくは約３７°Ｃ
１約５〜１０％炭酸ガス含何空気中、湿度約９０〜１０
０％のる件の下で、４０〜１００時間培養することによ
り、細胞分化誘導物質が産生され、培養）、連中に放出
される。培地のｐＨは、培養間間中ｇ′１６．０〜７．
５に維持することが好ましい。

（Ｖ／Ｖ％）を表わす。また特に記載がない限り、培養
は３７Ｔ：、湿度９０〜１００％、５％炭酸カス含有空
気中で行なった。

実施例１ ヒト急性単球性白血病細胞ＴＨＰ−１細胞を、５０Ｑｉ
　ｆ７　／ｍ　ｌのペニシリン、および５０７１ｇ／ｍ
ｌのストレプトマイシンを含有し、血清を含まないＲＰ
　Ｍ　１ｉ６４０培地にて、細胞密度６ｘｌＣ？佃／ｍ
ｔとなるように細胞層が一αを調製し、その５００　ｍ
ｌ　を１刊皇１焙養川スピンナーフラスコにも存え込み
、分化誘導剤として、１２−０−テトラデカノイルホル
ボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）　、Ｍφ活性化物
質としてヒダ、ミンＡ酸（ＲＡ）をそれぞれＩｕｇ／ｍ
ｌとなるように添加し、回転数３Ｏｒｐｍにて撹はんし
、３７℃、５％炭酸カス含有空気中で７２時間培養した
。その後、スピンナーフラスコ中の培養上清を収嘱し、
３００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、細胞層を除去した後
１、上清中の細胞分化誘導物質の活性を測定した。即ち
、増殖間にあるＭ−Ｌｍｔｔ２！　５ＸＩＯ”’ｃｅｌ
ｌｓ／ｍｌ　（ｔｇ地：イーグルＭ　Ｅ　Ｍ　＋　２培
竜ビタミン・アミノ酸十１０％牛脂児血清）浮遊？ａに
得られた培養γαを混し、その１ｍｌを　１０ｍ１ガラ
ス管にとり、横に倒して、炭酸カス培百器中で、３７℃
で２日間培養後、遠心処理（１０００ｒｐｍ、　１０分
間）を施し、上澄み？αを捨て血清を含まない培養源１
ｍｌを加えて再び細胞を１眉し、２７ｚｌ／ｍｌの濃度
のポリスチレン・ラテ・ソクス稙子（１，００４１１ｍ
　：清水化学社製）を加え撹；よんした後、さらに４時
間培養する。この細胞をＰＢＳｌｍｌ　てよくン先ン争
、遠心し、細＋＋包外のラテックス粉子を除去する。こ
の操作を２回繰り返したのち、遠心管の底に沈殿した細
胞をピペットで吸いトげ、スライドガラス上にｌａ落と
す。これに０．５％エオシン？α１Ｍを加え、カバーガ
ラスをのせ、顕微鏡で観察する。赤く・新色されろ死細
胞を除き、生細胞のみについて、ラテックス粒子をとん
注した細胞と非とん食細胞とを計数し、とん１１細胞の
比率を求める。培養）夜を適宜希釈して、Ｆ、記の測定
を行ない、とん食細胞の比率が１０％になるのに必要な
、培養液の希釈率の逆数をもって、１屯（☆（［Ｊ）／
ｍｌ　と定義されろ本発明の細胞分化イオラット社製）
に充填し、ｌ５０ｍＭの塩化すトリウムを含む５０　ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐｎ　７．５　’）で充分に洗ｔｐ後
、培養２α試料を添加し、同緩衝マαにて洗浄し、次い
て、各様糖頚を含む溶離液て溶出を行なった。コンカナ
バリン−Ａ　（Ｃｏｎ−Ａ　）、および、レンチルレク
チンのカラムを用いた場合に、レクチンカラムへの吸着
が認められ、いずれのカラムにおいても０．２Ｍα−メ
チル−１１−マンノシ］・；育）αにより、細胞分化誘
導物質性が溶出した。

Ｃｏ１ｔ−Ａカラムに吸着、溶出した細胞分イし誘導活
性について、分子量、等電点の測定を１テなった。

分子借測定のたぬ、該細胞分化誘導物質の活性画分を、
プルヘツコ　リン酸緩衝ｉａ（塩化カリウム０．２ｇ／
１．塩化ナトリウム８ｇ／１．リン酸第１カリウム０．
２．／１．リン酸第２ナトリウム１．１５ｇ／１．　　
ｐ　Ｎ７　、．１　）に０．Ｏ１χポリエチレングリコ
ールを添加した溶液ζこで平衡化した５ｕｐｅｒｏｓｅ
　６　＋　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２（ファルマシア社製
）を用いるゲルろ過性により分画し、Ｍ−１細胞でのと
ん食油の誘起による細胞分化誘導活性を測定したところ
、分子ｆｆｉ　５０．０００（ｐＨ８，３）で、電気泳
動を行なった。標準分子量キット（ファルマシア社製）
を用いて分子ｆｆｉ　ｔ４９７１線を作成し、分画した
ゲルからの抽出物のＭ−１細胞のどん食油誘起活性評価
により分子量を決定したとこる、分子１５０．０００±
５．０００の両分に細胞分化誘導物質の活性が認められ
た。

等電点測定のために、等電点電気泳動法を以下の方法に
よって行なった。即ち、アト−株式会社製の等電点電気
泳動装置（Ｓ　、Ｊ　１０７１ＥＣ型）を用い、ファル
マライト（ファルマシア社製、ｐＨ４〜８）とグリセロ
ールを含む５％ポリアクリルアミド平板ゲルを作成した
。陽極側に０．０４Ｍ　ＯＬ−グルタミン酸、陽極側に
０．２Ｍ　Ｌ−ヒス子ジンを使用して、７００ｖて５０
分間の前泳動を行なった。続いて試料を付与し、７００
■て１時間、５００Ｖて１６時間泳動を行なった。泳動
終７後ゲルを２．５　ｍｍ　［ｌで切り出し、次いて各
ゲル片を０．Ｉ５Ｍ塩化ナトリウＪ、を含む０−０２　
Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐｔｌ　８．２　）０．２　
ｍｌで抽出し、各抽出２αについて、Ｍ−１細胞を用い
た細胞分化誘導活性の評価を行なったとこ定の時間、所
定の温度にて加熱した後、Ｍ−１細胞を用いた細胞分化
誘導活性の評ＩＩｌ！ｉを１１なったところ、７０℃の
加熱処理において、その活性を保持し・でおり、＋００
°Ｃ，１５分の加熱により、失活した。

ジスルフィド結合の還元剤によろ影響を検討ずろために
、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、又は、２−メルカプ
トエタノール（２−Ｍ　Ｅ　）を、培養（α中に加え、
３７℃で、４時間反応させた。反応後、ｈに＋細飽に対
するとん食油誘起活性を測定した。

！’ｉｏ　ｍＭのＤＴＴ処理により、その活性を失った
。

ｐＨ安定性を次に示す。細胞分化誘導物質を含む培養液
に、４倍量のｐ　Ｈ２，４、７，３、９、１０の各挿緩
Ｗｊ湾を添加し、２４時間、３７℃に加温した後、ｐＨ
を中性にもどし、Ｍ−１細胞に対するｍ胞分化誘導活性
を測定した。ｐＨ２〜ｌＯの範囲のいずれにおいても活
性の低下は認められなかった。

ついて、蛋白分解酵素に対する安定性を検討した。細胞
分化誘導物質を含む培養液に蛋白分解酵素トリプシン、
または、プロナーゼ−Ｅ　　（２００１１イ立）を添加
し、３７℃にて、３時間反応させた。反素の効果を検討
したところ、０．１％ＳＤＳの添加時のプロナーゼ−Ｅ
により、細胞分化誘導活性が完全に消失した。

さらに、ヒト白血病細胞に対する生理作用な確認すへく
、牛胎児血清を１０％含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０培
地にヒト単球性白血病！ｍ胞（ＴＨＰ−１）、ヒト前骨
髄性白血病細胞（ＨＬ−６０）を３７℃、／￥酸ガス培
養器中でそれぞれ培養し、増殖間にある細胞をリン酸緩
衝濠てよく洗浄した後、ｌＯ％牛脂児血清および１０　
ｎＭビタミンＡｍを添加したＲＰＭｌ−１６４０培地、
（ビタミン、アミノ酸強化）に、それぞれ２×１０個／
慣１培地になるように懸濁した。

細胞懸濁液１００ｕｌ　と培養液１００ｕｌ　との混合
液を９６穴プレートに入れ、３７℃、５％炭酸ガス混合
空気の下で、３日間培養した。０．２％ニトロブルーテ
トラゾリウム（ＮＢＴ、シグマ社）の溶液（０，２ｕ　
ｇ／ｍｌ　Ｔ　Ｐ　Ａ含有培地）　　ＩＱＯｌｌｌを加
えて、更に４５分間培養下後２顕微鏡下で観察した。青
く沈着した色素を有するＮＢＴ還元能陽性細胞が、ＴＨ
Ｐ−１細胞において３９％、ＨＬ−６０細胞にお削化す
ることにより、従来にない新しい医藁品を得ることがで
きる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）マクロファージ様細胞に分化しうるヒト白血病細
   胞を分化誘導能を有する物質およびマクロファージ活性
   化物質の存在下に攪はん培養することを特徴とする、下
   記の特性を有し、 ａ）分子量５０，０００±５，０００（ゲルろ過法）５
   ０，０００±５，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
   電気泳動法） ｂ）等電点６．５±１．０（等電点電気泳動法） ｃ）熱安定性７０℃にて失活しない白血病細胞に対して
   細胞分化誘導活性を有するヒト由来の生理活性物質の生
   産法