JPS6030688A - ヒト癌壊死因子の製造法 - Google Patents
ヒト癌壊死因子の製造法Info
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- JPS6030688A JPS6030688A JP58139228A JP13922883A JPS6030688A JP S6030688 A JPS6030688 A JP S6030688A JP 58139228 A JP58139228 A JP 58139228A JP 13922883 A JP13922883 A JP 13922883A JP S6030688 A JPS6030688 A JP S6030688A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒト癌壊死因子（Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｕｒ
Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｌ：ｏｒ；以下１（ｕ Ｔ
Ｎ Ｆと略記する）の製造法に関する。
Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｌ：ｏｒ；以下１（ｕ Ｔ
Ｎ Ｆと略記する）の製造法に関する。
Ｃａｒ３ｗｅｌｌ らは、あらかじめｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｃａｌｍｅｔ；シｅ−Ｇｕ＆ｒｉｎ （ＢＯＧ）で感染
させ、次いでエンドトキシンで処理したマウスの血清中
には、移植したＭｅＬｈへ肉腫による癌を壊死させる物
質が含まれていることを見いだし、この物質を癌壊死因
子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔ、ｏｒ；
以下ＴＮＦと略記する）と名づけた（Ｐｒｏｃ、Ｎａし
。
Ｃａｌｍｅｔ；シｅ−Ｇｕ＆ｒｉｎ （ＢＯＧ）で感染
させ、次いでエンドトキシンで処理したマウスの血清中
には、移植したＭｅＬｈへ肉腫による癌を壊死させる物
質が含まれていることを見いだし、この物質を癌壊死因
子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔ、ｏｒ；
以下ＴＮＦと略記する）と名づけた（Ｐｒｏｃ、Ｎａし
。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７２．３６６６（１９７５
））。
））。
ＴＮＦはマクロファージから放出される生理活性物質と
考えられておシ、その特徴としては、（１）担癌動物に
投与するとある種の癌を壊死させること、（１ｉ） ｉ
ｎ ｖｉ Ｌｒｏである種の癌細胞（例 マウスの癌細
胞であるＬ細胞、ヒト癌由来のＰＣＬＯ細胞）を傷害す
るが、正常細胞にはほとんど有害な作用を及はさないこ
と、及び＋ｍ＋その作用が種特異的でないことが知られ
ている。このような特徴の故にＴＮＦ’は制癌剤として
期待されるものである。
考えられておシ、その特徴としては、（１）担癌動物に
投与するとある種の癌を壊死させること、（１ｉ） ｉ
ｎ ｖｉ Ｌｒｏである種の癌細胞（例 マウスの癌細
胞であるＬ細胞、ヒト癌由来のＰＣＬＯ細胞）を傷害す
るが、正常細胞にはほとんど有害な作用を及はさないこ
と、及び＋ｍ＋その作用が種特異的でないことが知られ
ている。このような特徴の故にＴＮＦ’は制癌剤として
期待されるものである。
ＴＮＦの製造は、通常、あらかじめＢＯＧ又はＰｒｏｐ
ｉｏｎｉｂａｃｌ；ｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ （Ｏｏｒ
ｙｎｅ−ｂａｃｔ、ｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）を注射
し、次いでエンドトキシンを注射した哺乳動物（例 マ
ウス、ウサギ、ラット）の血清からＴＮＦを回収するこ
とによシ行われている。ＴＮＦを医薬として使用するた
めには、抗原性等の副作用の観点からヒト由来のＴＮＦ
がよシ好ましいことは明らかであるが、上記方法はヒト
由来のＴＮＦ製造には採用できない。
ｉｏｎｉｂａｃｌ；ｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ （Ｏｏｒ
ｙｎｅ−ｂａｃｔ、ｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）を注射
し、次いでエンドトキシンを注射した哺乳動物（例 マ
ウス、ウサギ、ラット）の血清からＴＮＦを回収するこ
とによシ行われている。ＴＮＦを医薬として使用するた
めには、抗原性等の副作用の観点からヒト由来のＴＮＦ
がよシ好ましいことは明らかであるが、上記方法はヒト
由来のＴＮＦ製造には採用できない。
従来、ヒトマクロファージ由来の癌細胞傷害′因子とし
ては、正常人の末梢単球細胞あるいは骨髄性半球性白血
病患者の白血病細胞からの因子（Ａｎｔ、ｉ−ｊｕｍｏ
ｒ ｃｙＬｏしｏｘｉｎ）（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。
ては、正常人の末梢単球細胞あるいは骨髄性半球性白血
病患者の白血病細胞からの因子（Ａｎｔ、ｉ−ｊｕｍｏ
ｒ ｃｙＬｏしｏｘｉｎ）（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。
±４．１３５（１９８１）：］ 及びヒト末梢血中の培
養器壁付着細胞からの因子（Ａｄｈｅｒｅｎｔ； ｃｅ
ｌｌしｏｘｉｎ）［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１１５，３
９５（１９７５））が報告されている。しかし、これら
の因子については、ｉｎ ｖｉｔ、ｒｏである種の癌細
胞を傷害することが知られているだけで、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ系、すなわち担癌動物に投与したときに癌組織を壊死
させるかどうかは確認されていない。
養器壁付着細胞からの因子（Ａｄｈｅｒｅｎｔ； ｃｅ
ｌｌしｏｘｉｎ）［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１１５，３
９５（１９７５））が報告されている。しかし、これら
の因子については、ｉｎ ｖｉｔ、ｒｏである種の癌細
胞を傷害することが知られているだけで、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ系、すなわち担癌動物に投与したときに癌組織を壊死
させるかどうかは確認されていない。
本発明者らは、ヒト由来のＴＮＦの大量生産法を確立す
るために、ヒト白血病細胞に着目し鋭意研究を行った結
果、無限に増殖することのできるある種のヒト白血病株
細胞を分化誘導能を有する物質（以下、分化誘導物質と
略記する）の存在下に培養することにより、ｉｎ ｖｉ
ｆ；ｒｏ培養系においてヒト由来のＴＮＦを大量に生産
できることを見いだし、本発明を完成した。
るために、ヒト白血病細胞に着目し鋭意研究を行った結
果、無限に増殖することのできるある種のヒト白血病株
細胞を分化誘導能を有する物質（以下、分化誘導物質と
略記する）の存在下に培養することにより、ｉｎ ｖｉ
ｆ；ｒｏ培養系においてヒト由来のＴＮＦを大量に生産
できることを見いだし、本発明を完成した。
本発明は、マクロファージ様細胞に分化し得るヒト白血
病細胞を、分化誘導物質の存在下に培養することを特徴
とするＨｕＴＮＦの製造法に関するものである。
病細胞を、分化誘導物質の存在下に培養することを特徴
とするＨｕＴＮＦの製造法に関するものである。
本発明において、ＨｕＴＮＦとはヒト由来のマクロファ
ージ又はマクロファージ様細胞が・産生ずる物質であっ
て、ｉｎ ｖｉｊ、ｒｏで少なくともＬ細胞を傷害する
能力及び少なくとも移植したＭｅＬｈＡ肉腫による癌を
壊死させる能力を有するものを意味する。
ージ又はマクロファージ様細胞が・産生ずる物質であっ
て、ｉｎ ｖｉｊ、ｒｏで少なくともＬ細胞を傷害する
能力及び少なくとも移植したＭｅＬｈＡ肉腫による癌を
壊死させる能力を有するものを意味する。
本発明の方法によれば、培養規模を調節することによシ
任意の量のＨｕＴＮＦを製造することができる。
任意の量のＨｕＴＮＦを製造することができる。
本発明で用いられるマクロファージ様細胞に分化し得る
ヒト白血病細胞とは、分化誘導物質の作用によシ初めて
マクロファージ様細胞に分化する細胞又は本来マクロフ
ァージの性質の一部を有しているが１分化誘導物質の作
用によシ更にマクロファージの性質を有するように変化
する細胞を意味する。白血病患者から分離した初代細胞
及び株細胞のいずれも用いることができるが、株細胞が
好ましい。マクロファージ様細胞への分化は、例えば培
養容器面への付着を指標として確認することができる。
ヒト白血病細胞とは、分化誘導物質の作用によシ初めて
マクロファージ様細胞に分化する細胞又は本来マクロフ
ァージの性質の一部を有しているが１分化誘導物質の作
用によシ更にマクロファージの性質を有するように変化
する細胞を意味する。白血病患者から分離した初代細胞
及び株細胞のいずれも用いることができるが、株細胞が
好ましい。マクロファージ様細胞への分化は、例えば培
養容器面への付着を指標として確認することができる。
本発明で用いられるヒト白血病株細胞の具体例としては
、■Ｌ−５Ｑ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションＣＣＬ２４０）。
、■Ｌ−５Ｑ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションＣＣＬ２４０）。
ＴＩ−ＩＰ−１細胞、 Ｍｏｎｏ −１−２０７細胞等
が挙げられる。これらの株細胞の樹立法及び特徴は、そ
れぞれＮａｔｕｒｅ、２７０，３４７（１９７７）、Ｉ
ｎｔ、Ｊ。
が挙げられる。これらの株細胞の樹立法及び特徴は、そ
れぞれＮａｔｕｒｅ、２７０，３４７（１９７７）、Ｉ
ｎｔ、Ｊ。
Ｃａｎｃｅｒ、２６，１７１（１９８０）及びψｉｒｃ
ｈｏｗ６Ａｒｃｈ、Ａ Ｐａｔ、ｈ、ＡｎａＪ ａｎｄ
Ｈｉｓ ｔｏｌ、、３７１．１５（１９７６）に記載
されている。
ｈｏｗ６Ａｒｃｈ、Ａ Ｐａｔ、ｈ、ＡｎａＪ ａｎｄ
Ｈｉｓ ｔｏｌ、、３７１．１５（１９７６）に記載
されている。
本発明で用いられる分化誘導物質とは、マクロファージ
様細胞に分化し得るヒト白血病細胞のマクロファージ様
細胞への分化を誘導する物質を意味Ｌ、例、ｔハホルポ
ールエステル類、メゼレイン（以下ＭＥＺと略記する）
のようなジテルペン系化合物、テレオシジン（以下ＴＣ
Ｄと略記する）が挙げられる。ホルボールエステル類は
、４β−ヒドロキシ体が好ましく、例えば１２−０−テ
トラデカノイルホルボール−１３−アセテート（以下Ｔ
ＰＡと略記する）、ホルボール−１２，１３−ジデカノ
エ−１−（以下ＰＤＤと略記する）、ホルボー／Ｌ／−
１２，１３−ジベンゾエート（以下ＰＤＢｚと略記する
）、ホルボール−１２，１３−ジアセテート（以下ＰＤ
Ａと略記する）、ホルボ−）ｌｚ−１２，１３−ジブチ
ンートが挙げられるが、ＴＰＡ、ＰＤＤ及びＰＤＢｚが
特に好ましい。ポルボールエステル類、メゼレイン、テ
レオシジンについては、例えば［癌”８０Ｊ（ｒ代謝」
第１７巻直時増刊号）、１３１１（１９８０）、ｒ癌′
８１」（「代謝」第１８巻直時増刊号） 、７８５（１
９８１）及び特表昭５７−５００９６１号にその化学構
造式及び生物学的性質が記載されている。
様細胞に分化し得るヒト白血病細胞のマクロファージ様
細胞への分化を誘導する物質を意味Ｌ、例、ｔハホルポ
ールエステル類、メゼレイン（以下ＭＥＺと略記する）
のようなジテルペン系化合物、テレオシジン（以下ＴＣ
Ｄと略記する）が挙げられる。ホルボールエステル類は
、４β−ヒドロキシ体が好ましく、例えば１２−０−テ
トラデカノイルホルボール−１３−アセテート（以下Ｔ
ＰＡと略記する）、ホルボール−１２，１３−ジデカノ
エ−１−（以下ＰＤＤと略記する）、ホルボー／Ｌ／−
１２，１３−ジベンゾエート（以下ＰＤＢｚと略記する
）、ホルボール−１２，１３−ジアセテート（以下ＰＤ
Ａと略記する）、ホルボ−）ｌｚ−１２，１３−ジブチ
ンートが挙げられるが、ＴＰＡ、ＰＤＤ及びＰＤＢｚが
特に好ましい。ポルボールエステル類、メゼレイン、テ
レオシジンについては、例えば［癌”８０Ｊ（ｒ代謝」
第１７巻直時増刊号）、１３１１（１９８０）、ｒ癌′
８１」（「代謝」第１８巻直時増刊号） 、７８５（１
９８１）及び特表昭５７−５００９６１号にその化学構
造式及び生物学的性質が記載されている。
以下本発明の方法を詳細に説明する。
本発明で使用される細胞の培養には、高等動物細胞の培
養に適した各種合成培地が用いられる。
養に適した各種合成培地が用いられる。
代表的な培地としては、例えば几ＰＭＩ−１６４０培地
、イーグルのＭＥＭ培地、ダルベツコ変法によるＭＥＭ
培地、Ａｌｐｈａ ＭＥＭ培地、Ｈａｍ培地。
、イーグルのＭＥＭ培地、ダルベツコ変法によるＭＥＭ
培地、Ａｌｐｈａ ＭＥＭ培地、Ｈａｍ培地。
１９９培地、ＬＶｌ、ｃＣｏｙ ５Ａ培地（以上の培地
の組成については、例えば宗村庚修編「細胞培養マニュ
アル」、講談社、１９８２年に記載されている）。
の組成については、例えば宗村庚修編「細胞培養マニュ
アル」、講談社、１９８２年に記載されている）。
Ｈｉｇｈ ＧＥＭ培地（ダルベツコ変法によるＭ、 Ｅ
Ｍ培地中のグルコースをフルクトースに変えたもの）
。
Ｍ培地中のグルコースをフルクトースに変えたもの）
。
ｌ５ｃｏｖｅ培地（Ｊ、ＥｘｐｏＭｅｄ、、 １４７
、９２３（１９７８）〕が挙げられるが、几ＰＭＩ−１
６４０培゛地、１９９培地、 Ｉ−Ｉｉｇｈ ＧＥＭ培
地とｌ（ａｍＦ１２培地の等容量混合培地（以下Ｈｉｇ
ｈ ＧＥＭ＋ＨａｍＦ１２と略記することがある）が好
ましい。これらの培地には、アルブミン、インシュリン
、トランスフェリンなどのある種の蛋白質、トド血清、
仔つシ血清、ウシ胎児血清などの動物血清を単独で、あ
るいは適宜組み合わせて添加してもよい。血清の添加容
量は、全培養液容量の約１〜２０φが好ましい。また必
要に応じて、微生物による汚染を防止するために、抗性
物質、例えば２０〜１００単位／ｍ１、好ましくは５０
単位／ ｍ ｌのペニシリン及び２０〜１００μｇ／ｍ
１１好ましくは５０ｔｔｇ／ｍ１のストレプトマイシン
又は２０〜１００μｇＡｎ１、好ましくは６０μ、９／
ｍ １のカナマイシン、更に５〜４０μｇ／ｍｌ、好壕
しくは２５μ９／ｍＬのアンホテリシンＢ又は５〜３０
単位／ｍ１、好ましくは２０単位／ｍｌのナイスタチン
を添加することもできる。培養容器の材質は、プラスチ
ック、ガラスあるいは金属など細胞が付着できるもので
あればいずれでもよい。
、９２３（１９７８）〕が挙げられるが、几ＰＭＩ−１
６４０培゛地、１９９培地、 Ｉ−Ｉｉｇｈ ＧＥＭ培
地とｌ（ａｍＦ１２培地の等容量混合培地（以下Ｈｉｇ
ｈ ＧＥＭ＋ＨａｍＦ１２と略記することがある）が好
ましい。これらの培地には、アルブミン、インシュリン
、トランスフェリンなどのある種の蛋白質、トド血清、
仔つシ血清、ウシ胎児血清などの動物血清を単独で、あ
るいは適宜組み合わせて添加してもよい。血清の添加容
量は、全培養液容量の約１〜２０φが好ましい。また必
要に応じて、微生物による汚染を防止するために、抗性
物質、例えば２０〜１００単位／ｍ１、好ましくは５０
単位／ ｍ ｌのペニシリン及び２０〜１００μｇ／ｍ
１１好ましくは５０ｔｔｇ／ｍ１のストレプトマイシン
又は２０〜１００μｇＡｎ１、好ましくは６０μ、９／
ｍ １のカナマイシン、更に５〜４０μｇ／ｍｌ、好壕
しくは２５μ９／ｍＬのアンホテリシンＢ又は５〜３０
単位／ｍ１、好ましくは２０単位／ｍｌのナイスタチン
を添加することもできる。培養容器の材質は、プラスチ
ック、ガラスあるいは金属など細胞が付着できるもので
あればいずれでもよい。
Ｈｕ Ｔ Ｎ Ｆを産生させるためには、適当な培地に
約１×１０５〜５ＸｌＯ’個／ｍｌ、好ましくは約５×
１０５〜３Ｘ１０６個／ｍｌの割合で浮遊させたヒト白
血病細胞を培養容器面１ｃｍ当シ約２ＸｌＯ’〜１×１
０６個、好ましぐは約１×１０５〜６×１０５個となる
ように植え込み、次いで、これらの細胞をマクロファー
ジ様細胞に分化させるのに有効な量の分化誘導物質を添
加する。なお、分化誘導物質は、細胞を植え込む前にあ
らかじめ細胞浮遊液に添加しておいてもよい。分化誘導
物質の有効量は、物質の種類、細胞の種類、培養条件等
によシ異なるが、一般に約５〜５０００ｎｇ／ｍｌ（培
養液、以下同じ）、好ましくは約１００〜２ｏｏｏｎｇ
／ｍｔである。細胞及び分化誘導物質を含む培養容器を
約３５〜３８℃、好ましくは約３７℃、約５〜ｌＯチ炭
酸ガス含有空気中、温度約９０〜１００φで約２４〜１
２０時間培養することによｐ 、ＨｕＴＮＦが産生され
、培養上清中に放出される。培地のｐＩ（は、培養期間
巾約６．５〜７．４に維持することが好ましい。分化誘
導物質は、培養期間中存在させ５沈よいが、細胞が−り
・ファージ様細胞に分化した後、例えば培養開始後約０
．５〜４８時間目時間表するのが望ましい。また、マク
ロファージ様細胞に分化した細胞は、細胞が培養容器面
に付着するような条件下で培養することが重要で、細胞
が付着しないような条件下では、ＨｕＴＮＦの産生けほ
とんど認められない。細胞がマクロファージ様細胞に分
化し、培養容器面に付着する期間中の培養液には、動物
血清を添加するのが望ましい。
約１×１０５〜５ＸｌＯ’個／ｍｌ、好ましくは約５×
１０５〜３Ｘ１０６個／ｍｌの割合で浮遊させたヒト白
血病細胞を培養容器面１ｃｍ当シ約２ＸｌＯ’〜１×１
０６個、好ましぐは約１×１０５〜６×１０５個となる
ように植え込み、次いで、これらの細胞をマクロファー
ジ様細胞に分化させるのに有効な量の分化誘導物質を添
加する。なお、分化誘導物質は、細胞を植え込む前にあ
らかじめ細胞浮遊液に添加しておいてもよい。分化誘導
物質の有効量は、物質の種類、細胞の種類、培養条件等
によシ異なるが、一般に約５〜５０００ｎｇ／ｍｌ（培
養液、以下同じ）、好ましくは約１００〜２ｏｏｏｎｇ
／ｍｔである。細胞及び分化誘導物質を含む培養容器を
約３５〜３８℃、好ましくは約３７℃、約５〜ｌＯチ炭
酸ガス含有空気中、温度約９０〜１００φで約２４〜１
２０時間培養することによｐ 、ＨｕＴＮＦが産生され
、培養上清中に放出される。培地のｐＩ（は、培養期間
巾約６．５〜７．４に維持することが好ましい。分化誘
導物質は、培養期間中存在させ５沈よいが、細胞が−り
・ファージ様細胞に分化した後、例えば培養開始後約０
．５〜４８時間目時間表するのが望ましい。また、マク
ロファージ様細胞に分化した細胞は、細胞が培養容器面
に付着するような条件下で培養することが重要で、細胞
が付着しないような条件下では、ＨｕＴＮＦの産生けほ
とんど認められない。細胞がマクロファージ様細胞に分
化し、培養容器面に付着する期間中の培養液には、動物
血清を添加するのが望ましい。
ＨｕＴＮＦの産生を増強するために、細胞の培養に際し
て各種の物質を添加することができる。例えば、約１〜
１０００μｌ／ｍ１１好ましくは約１０〜２００μｇ／
ｍＬのグラム陰性菌由来の鴨ポポリサツカライド（以下
ＬＰＳと略記する）、約０．５〜５０００ ｎｇ／ＩＩ
Ｉ ｌ、好ましくは約５０〜３０００ｎｇ／ｍｌ のビ
タミンＡ誘４体（例 ビタミンＡ酸。
て各種の物質を添加することができる。例えば、約１〜
１０００μｌ／ｍ１１好ましくは約１０〜２００μｇ／
ｍＬのグラム陰性菌由来の鴨ポポリサツカライド（以下
ＬＰＳと略記する）、約０．５〜５０００ ｎｇ／ＩＩ
Ｉ ｌ、好ましくは約５０〜３０００ｎｇ／ｍｌ のビ
タミンＡ誘４体（例 ビタミンＡ酸。
ビタミンＡアルコール、ビタミンＡアルデヒド。
ビタミンＡアルコール、ビタミンＡパルミテート）、約
０．３〜２ｙ／ｖφ、好ましくは約１ ｖ／ｖφのジメ
チルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと略記する）、約０．
１〜５ｗ／ｖφ、好ましくは約１ｗ／ｖφのペプトン〔
例 プロテオース・ペプトン（ディフコ社、米国）、ポ
リペプトン（大五栄養）〕又はカゼイン加水分解物（例
カザミノ酸）、約２〜２０ｍＭの酪酸塩（例 ナトリ
ウム塩）、約０．１〜５μｇ／ｍ１のインシュリン、約
０．１〜２ｎＭのヒドロコーチシンをそれぞれ単独で、
あるいは適宜組み合わせて添加することによｐ、ＨｕＴ
ＮＦの産生を増強することができる。これらＨｕＴＮＦ
産生増強物質のうちでは、ＬＰＳ、ビタミンＡ酸、ビタ
ミンＡアルコール、ビタミンＡアルデヒド、特にビタミ
ンＡ酸のようなビタミンＡ誘導体、ＤＭＳＯ、ペプトン
、カゼイン加水分解物が特に好ましい。
０．３〜２ｙ／ｖφ、好ましくは約１ ｖ／ｖφのジメ
チルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと略記する）、約０．
１〜５ｗ／ｖφ、好ましくは約１ｗ／ｖφのペプトン〔
例 プロテオース・ペプトン（ディフコ社、米国）、ポ
リペプトン（大五栄養）〕又はカゼイン加水分解物（例
カザミノ酸）、約２〜２０ｍＭの酪酸塩（例 ナトリ
ウム塩）、約０．１〜５μｇ／ｍ１のインシュリン、約
０．１〜２ｎＭのヒドロコーチシンをそれぞれ単独で、
あるいは適宜組み合わせて添加することによｐ、ＨｕＴ
ＮＦの産生を増強することができる。これらＨｕＴＮＦ
産生増強物質のうちでは、ＬＰＳ、ビタミンＡ酸、ビタ
ミンＡアルコール、ビタミンＡアルデヒド、特にビタミ
ンＡ酸のようなビタミンＡ誘導体、ＤＭＳＯ、ペプトン
、カゼイン加水分解物が特に好ましい。
これらの物質の好ましい添加時期は次の通りである。Ｌ
ＰＳは、細胞の全培養期間中存在させていてもよいが、
細胞がマクロファージ様細胞に分化し、培養容器面に付
着した後に、添加するのが望ましい。ビタミンＡ誘導体
は、細胞がマクロファージ様細胞に分化し、培養容器面
に付着しつつある期間中存在させるのが望ましい。ＤＭ
ＳＯは、特にＨＬ−６０＃Ｉ胞によるＨ ｕ Ｔ Ｎ
Ｆ産生に対して有効で、ビタミンＡ誘導体の場合と同様
の時期に添加するのが望ましいが、分化誘導物質を作用
させる前にＨＬ−６０細胞をＤＭＳＯで処理してもよい
。
ＰＳは、細胞の全培養期間中存在させていてもよいが、
細胞がマクロファージ様細胞に分化し、培養容器面に付
着した後に、添加するのが望ましい。ビタミンＡ誘導体
は、細胞がマクロファージ様細胞に分化し、培養容器面
に付着しつつある期間中存在させるのが望ましい。ＤＭ
ＳＯは、特にＨＬ−６０＃Ｉ胞によるＨ ｕ Ｔ Ｎ
Ｆ産生に対して有効で、ビタミンＡ誘導体の場合と同様
の時期に添加するのが望ましいが、分化誘導物質を作用
させる前にＨＬ−６０細胞をＤＭＳＯで処理してもよい
。
ペプトン及びカゼイン加水分解物の添加時期は、細胞が
マクロファージ様細胞に分化し、培養容器面に付着しつ
つある期間中であっても、その後であってもよい。酪酸
塩は、ＨＬ−５Ｑ及びＭｏｎｏ−１−２０７細胞による
ＨｕＴＮＦ産生に対して有効で、細胞がマクロファージ
様細胞に分化し、培養容器面に付着した後に、添加する
のが望ましい。インシュリン及ヒヒドロコーチゾンは、
ＨＬ−６Ｑ細胞によるＨｕＴＮＦ産生に対して有効で、
細胞がマクロファージ様細胞に分化し、培養容器面に付
着しつつある期間中存在させるのが望ましい。
マクロファージ様細胞に分化し、培養容器面に付着しつ
つある期間中であっても、その後であってもよい。酪酸
塩は、ＨＬ−５Ｑ及びＭｏｎｏ−１−２０７細胞による
ＨｕＴＮＦ産生に対して有効で、細胞がマクロファージ
様細胞に分化し、培養容器面に付着した後に、添加する
のが望ましい。インシュリン及ヒヒドロコーチゾンは、
ＨＬ−６Ｑ細胞によるＨｕＴＮＦ産生に対して有効で、
細胞がマクロファージ様細胞に分化し、培養容器面に付
着しつつある期間中存在させるのが望ましい。
Ｈｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生増強物質の特に好ましい組み合わ
せは、ビタミンＡ酸とＬＰＳあるいはビタミンＡ酸、ペ
プトンとＬＰＳである。
せは、ビタミンＡ酸とＬＰＳあるいはビタミンＡ酸、ペ
プトンとＬＰＳである。
ＨｕＴＮＦ産生に充分な期間培養した後、培養上清を収
集し、遠心分離によシ細胞屑を除去すれば、ＨｕＴＮＦ
を含む溶液が得られる。このＨｕＴＮＦを含む溶液を生
化学的分離操作における常法、例えば限外濾過による濃
縮、透析脱塩、陰イオン交換体によるイオン交換クロマ
トグラフィー、ゲ）ｖｆ過、電気泳動等を適宜組み合わ
せて精製することによシ、精製１−Ｉ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ
を得ることができる。
集し、遠心分離によシ細胞屑を除去すれば、ＨｕＴＮＦ
を含む溶液が得られる。このＨｕＴＮＦを含む溶液を生
化学的分離操作における常法、例えば限外濾過による濃
縮、透析脱塩、陰イオン交換体によるイオン交換クロマ
トグラフィー、ゲ）ｖｆ過、電気泳動等を適宜組み合わ
せて精製することによシ、精製１−Ｉ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ
を得ることができる。
ＨｕＴＮＦ活性の測定は、１ｎＶｉ１１．ｒｏテ癌細胞
を傷害する効果を測定するｉｎ ｖｉｔ、ｒｏ法と１ｎ
ｖｉｖｏで癌組織を壊死させる効果を測定する１ｎｖｉ
ｖｏ法の両方法によシ行った。
を傷害する効果を測定するｉｎ ｖｉｔ、ｒｏ法と１ｎ
ｖｉｖｏで癌組織を壊死させる効果を測定する１ｎｖｉ
ｖｏ法の両方法によシ行った。
本発明者らが用いているｉｎ ｖｉシｒｏ法は、Ｒｕｆ
ｆらの方法［Ｊ＋Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １２５．１６７
１（１９８０））を改良したものであシ、ＨｕＴＮＦが
Ｌ細胞の亜株であるＬｌ−ｙｒ細胞（アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション ＣＯＬ １．２） 全
傷害する効果を測定するものである。すなわち、順次培
地Ｃ希釈したＨｕＴＮＦ試料０．１ ｍｌ 、 ４ｔｔ
ｇ／ｍ１のアクチノマイシンＤ溶液０．０５ｍ１及び１
×１０６個／ｍｌの濃度ノＬ Ｍ細胞浮遊液０．０５ｍ
１を９６穴の平底型組織培養用マイクロプレート（フロ
ラ社、米絹の各穴に加える。培地には１ｖ／ｖ％のウシ
胎児血清（以下ＦＢ８と略記する）を含むイーグルのＭ
ＥＭ培地を用いる。マイクロブレートを５チの炭酸ガス
を含む空気中、３７℃で２４時間培養する。培養終了後
、’２５％グルタルアルデヒド水溶液２０μｍを加えて
生き残った細胞を固定し、次いで０．０５’％メチレン
ブルー水溶液Ｑ、１ｍｌを加えて染色する。マイクロプ
レートを水で充分に洗い、乾燥後、０．３６Ｎ塩酸０．
２ｍｌを加えて細胞からメチレンブルーを抽出する。
ｆらの方法［Ｊ＋Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １２５．１６７
１（１９８０））を改良したものであシ、ＨｕＴＮＦが
Ｌ細胞の亜株であるＬｌ−ｙｒ細胞（アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション ＣＯＬ １．２） 全
傷害する効果を測定するものである。すなわち、順次培
地Ｃ希釈したＨｕＴＮＦ試料０．１ ｍｌ 、 ４ｔｔ
ｇ／ｍ１のアクチノマイシンＤ溶液０．０５ｍ１及び１
×１０６個／ｍｌの濃度ノＬ Ｍ細胞浮遊液０．０５ｍ
１を９６穴の平底型組織培養用マイクロプレート（フロ
ラ社、米絹の各穴に加える。培地には１ｖ／ｖ％のウシ
胎児血清（以下ＦＢ８と略記する）を含むイーグルのＭ
ＥＭ培地を用いる。マイクロブレートを５チの炭酸ガス
を含む空気中、３７℃で２４時間培養する。培養終了後
、’２５％グルタルアルデヒド水溶液２０μｍを加えて
生き残った細胞を固定し、次いで０．０５’％メチレン
ブルー水溶液Ｑ、１ｍｌを加えて染色する。マイクロプ
レートを水で充分に洗い、乾燥後、０．３６Ｎ塩酸０．
２ｍｌを加えて細胞からメチレンブルーを抽出する。
この抽出液の６６５ ｎｍにおける吸光度をタイターチ
ック・マルチスキャン（フロラ社）で測定する。この吸
光度は、生き残った細胞数に比例する。
ック・マルチスキャン（フロラ社）で測定する。この吸
光度は、生き残った細胞数に比例する。
Ｌ 、 Ｍ＠胞の５０％を傷害するために必要な生理活
性量を１単位（Ｕ）７ｍ １と定義し、試料を加えない
対照の吸光度の５０チの値に相当する試料の希釈率を、
グラフあるいは計算によってめ、その希釈率の逆数を試
料の生理活性量（単位／ｍｌ又は０７ｍ ｌで表記）と
する。以下、本発明におけるＨｕＴＮＦ ノｉｎ ｖｉ
ｔ、ｒｏ活性は、すヘテコノ単位で表示される。
性量を１単位（Ｕ）７ｍ １と定義し、試料を加えない
対照の吸光度の５０チの値に相当する試料の希釈率を、
グラフあるいは計算によってめ、その希釈率の逆数を試
料の生理活性量（単位／ｍｌ又は０７ｍ ｌで表記）と
する。以下、本発明におけるＨｕＴＮＦ ノｉｎ ｖｉ
ｔ、ｒｏ活性は、すヘテコノ単位で表示される。
ｉｎ ｖｉｖｏでノＨｕＴＮＦ活性の測定は、ＣａｒＳ
ｗｅｌｌらの方法［Ｐｒｏｃ、ＮａＪ Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ。
ｗｅｌｌらの方法［Ｐｒｏｃ、ＮａＪ Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ。
ＵＳＡ、７ス、３６６６（１９７５））に準じて行った
。
。
この方法は、移植したＭｅｔｈＡ肉腫細胞による癌をＨ
ｕＴＮＦが壊死させる効果を測定するものである０すな
わち、ＢＡＬＢ／ｃマウヌの腹部皮肉に２×１０５個の
Ｍｅｔ；ｈＡ肉腫細胞を移植し、７日後、形成された癌
の大きさが直径７〜８ｒｎｍとなシ、自然発生的な出血
性壊死などがなく、良好な血行状態にある癌を有するマ
ウスを選び、尾静脈あるいは癌組織内に１（ｕＴＮＦ試
料を注射し、２４時間後に次の判定基準によシ試料のＨ
ｕ Ｔ Ｎ Ｆ活性を測定する。
ｕＴＮＦが壊死させる効果を測定するものである０すな
わち、ＢＡＬＢ／ｃマウヌの腹部皮肉に２×１０５個の
Ｍｅｔ；ｈＡ肉腫細胞を移植し、７日後、形成された癌
の大きさが直径７〜８ｒｎｍとなシ、自然発生的な出血
性壊死などがなく、良好な血行状態にある癌を有するマ
ウスを選び、尾静脈あるいは癌組織内に１（ｕＴＮＦ試
料を注射し、２４時間後に次の判定基準によシ試料のＨ
ｕ Ｔ Ｎ Ｆ活性を測定する。
（−）：変化なし
く−１−１：かすかな出血性壊死
冊：中程度の出血性壊死（移植癌表面の真中から５０チ
以上にわたって壊死） ０４（１：顕著な出血性壊死（移植癌の中央部が重度に
壊死し、周囲の癌組織がわずかに残った状態） 次に実験例及び実施例を挙げて本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以上にわたって壊死） ０４（１：顕著な出血性壊死（移植癌の中央部が重度に
壊死し、周囲の癌組織がわずかに残った状態） 次に実験例及び実施例を挙げて本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお以下の記載において、「チ」は特に記載しない限シ
容量パーセン゛ト（Ｖ／Ｖｌを表す。また、特に記載し
ない限シ、培養は３７℃、湿度９０〜１００％、５’％
炭酸ガス含有空気中で行い、ＨｕＴＮＦ活性の測定はｉ
ｎ ｖｉシｒｏ法で行った。
容量パーセン゛ト（Ｖ／Ｖｌを表す。また、特に記載し
ない限シ、培養は３７℃、湿度９０〜１００％、５’％
炭酸ガス含有空気中で行い、ＨｕＴＮＦ活性の測定はｉ
ｎ ｖｉシｒｏ法で行った。
実験例１
１０９６のＦＢ８ （フロラ社）を含む各種培地（いず
れもフロラ社製）に、ＨＬ−５９細胞をｌ×１０６個／
ｍｌとなるように浮遊させた。この細胞浮遊液１０ｍ１
を直径８ ｃｍのプラスチック製ベトリデイツシュ（コ
ーニング社、米国）に植え込み、ＴＰＡ（Ｉ’−Ｌバイ
オケミカルズ社、米国）をｌ ＯＯｎｇ／ｍｌとなるよ
うに添加したディツシュと添加しないディツシュをつ＜
Ｄ、ａ７℃、５多炭酸ガス含有空気中で４８時間培養し
た。次いで、ＴＰＡを含まない新鮮培地１０ｍ１と置き
換え、１ｏ μｇ／ｍ、ｌノＬ Ｐ Ｓ （大腸菌０２
６ ：Ｂ６由来、ディフコ社）の存在下あるいは非存在
下で更に２４時間培養を続けた後、培養上清中のＨｕＴ
ＮＦ活性を測定した。結果を表１に示す。
れもフロラ社製）に、ＨＬ−５９細胞をｌ×１０６個／
ｍｌとなるように浮遊させた。この細胞浮遊液１０ｍ１
を直径８ ｃｍのプラスチック製ベトリデイツシュ（コ
ーニング社、米国）に植え込み、ＴＰＡ（Ｉ’−Ｌバイ
オケミカルズ社、米国）をｌ ＯＯｎｇ／ｍｌとなるよ
うに添加したディツシュと添加しないディツシュをつ＜
Ｄ、ａ７℃、５多炭酸ガス含有空気中で４８時間培養し
た。次いで、ＴＰＡを含まない新鮮培地１０ｍ１と置き
換え、１ｏ μｇ／ｍ、ｌノＬ Ｐ Ｓ （大腸菌０２
６ ：Ｂ６由来、ディフコ社）の存在下あるいは非存在
下で更に２４時間培養を続けた後、培養上清中のＨｕＴ
ＮＦ活性を測定した。結果を表１に示す。
（以 下 余 白）
表Ｉ ＨＬ−６０細胞によるＨｕＴＮＦ産生に及はす各
種培地の影響 ｆ（ｉｇｈ（）ＥＭ −（４＜４ 十Ｈａｍ Ｆ１２ ＋ １２１ ２０９− （４（４ ５ｃｏｖｅ ＋４７ ９１ イーグルの ＜４〈４ ＭＥＭ ＋ ３６ ５９ ＊１ ０ ｇ６ＦＢＳ添力Ｅｌ 、＄＄ １ ０ ０
ｎＪｉ！／ｍｌ 、申＊＊ ｌ Ｑμ、９／ｍｌ。
種培地の影響 ｆ（ｉｇｈ（）ＥＭ −（４＜４ 十Ｈａｍ Ｆ１２ ＋ １２１ ２０９− （４（４ ５ｃｏｖｅ ＋４７ ９１ イーグルの ＜４〈４ ＭＥＭ ＋ ３６ ５９ ＊１ ０ ｇ６ＦＢＳ添力Ｅｌ 、＄＄ １ ０ ０
ｎＪｉ！／ｍｌ 、申＊＊ ｌ Ｑμ、９／ｍｌ。
表１から明らかなように、ＴＰＡを添加しない場合には
Ｈｕ Ｔ Ｎ ｌ’は全く産生されず、ＴＰＡが存在す
る場合にはいずれの培地中でもＨｕ Ｔ Ｎ Ｆは産生
されたが、ＪＬＰＭｊ−１６４０培地、１９９培地。
Ｈｕ Ｔ Ｎ ｌ’は全く産生されず、ＴＰＡが存在す
る場合にはいずれの培地中でもＨｕ Ｔ Ｎ Ｆは産生
されたが、ＪＬＰＭｊ−１６４０培地、１９９培地。
ＨｉｇｈＧＥＭ培地とＨａｍＦ１２培地の等容量混合培
地中でのＨｕＴＮＦ産生が多かった。また、いずれの培
地においてもＬＰＳ添加によりＩ（ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生
が増強された。
地中でのＨｕＴＮＦ産生が多かった。また、いずれの培
地においてもＬＰＳ添加によりＩ（ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生
が増強された。
実験例２
ＨｕＴＮＦ産生に及ぼす細胞密度の影響ＨＬ−６０、’
ｌ”ＨＰ−１あるいはＭｏｎｏ−１−２０７細胞を直径
８ｃｍのプラスチック製ベトリディツシュに２〜３０Ｘ
１０６個植え込み、ＴＰＡで４８時間処理後ＬＰ８を添
加して培養した後の培養上清中のＨｕＴＮＦ活性を測定
した。培地として、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６
４ｏ培地（ディツシュ当ｌ） ｌ Ｑ ｍｌ）を用い、
ＴＰＡ、ＬＰＳ ｏ濃度及びその他の条件は実験例１の
場合と同じであった。
ｌ”ＨＰ−１あるいはＭｏｎｏ−１−２０７細胞を直径
８ｃｍのプラスチック製ベトリディツシュに２〜３０Ｘ
１０６個植え込み、ＴＰＡで４８時間処理後ＬＰ８を添
加して培養した後の培養上清中のＨｕＴＮＦ活性を測定
した。培地として、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６
４ｏ培地（ディツシュ当ｌ） ｌ Ｑ ｍｌ）を用い、
ＴＰＡ、ＬＰＳ ｏ濃度及びその他の条件は実験例１の
場合と同じであった。
結果を表２に示す。
表２ ＨＬ−６Ｑ、ＴＨＰ−１及びＭｏｎｏ−１−２０
７細胞によるＨｕＴＮＦ産生に及ぼす細胞密度の影響 ２Ｘ１０６５６ １２２ ９５ ５Ｘ１０６８２ ２７９ １３９ １０ＸＩＯ６１４６４５２２０８ ３０ＸＩ ０６１４７ ３５３ ２５８培地 ＲＰＭＩ
−１６４０−１−１０’％ＦＢＳ（１，Ｑｍｌ／−１ｉ
’イツシユ）； ＴＥＡ ＩＱＱｎ、９／ｍｌ； ＬＰＳ ＩＱμｇ／ｍ
ｌ。
７細胞によるＨｕＴＮＦ産生に及ぼす細胞密度の影響 ２Ｘ１０６５６ １２２ ９５ ５Ｘ１０６８２ ２７９ １３９ １０ＸＩＯ６１４６４５２２０８ ３０ＸＩ ０６１４７ ３５３ ２５８培地 ＲＰＭＩ
−１６４０−１−１０’％ＦＢＳ（１，Ｑｍｌ／−１ｉ
’イツシユ）； ＴＥＡ ＩＱＱｎ、９／ｍｌ； ＬＰＳ ＩＱμｇ／ｍ
ｌ。
表２から明らかなように、ＨｕＴＮＦ産生量はディツシ
ュ当Ｉ）１０〜３０Ｘ１０６個の細胞数のときが最も多
かった。
ュ当Ｉ）１０〜３０Ｘ１０６個の細胞数のときが最も多
かった。
実験例３
ＭＬ−６０、ＴＩＩＩＰ−１あるいはＭｏｎｏ−１−２
１７細胞を直径８ｃｍのプラスチック製ベトリデイツシ
ュに１×１０７個植え込み、１００ｎ、９／ｍｌ ｃｒ
） ＴＰ Ａを添加して１，６．２４及び４８時間培養
した後、ＴＰＡを含まない新鮮培地と置き換えた。培養
開始後４８時間目にすべてのディツシュの培地を除去し
、１ｇｇ／ｍ１のＬ ｒ ｓ含有あるいは非含有新鮮培
地と再び置き換え、その２４時間後の培養上清中のＨｕ
Ｔ Ｎ Ｆ活性を測定した。結果を表３に示す。
１７細胞を直径８ｃｍのプラスチック製ベトリデイツシ
ュに１×１０７個植え込み、１００ｎ、９／ｍｌ ｃｒ
） ＴＰ Ａを添加して１，６．２４及び４８時間培養
した後、ＴＰＡを含まない新鮮培地と置き換えた。培養
開始後４８時間目にすべてのディツシュの培地を除去し
、１ｇｇ／ｍ１のＬ ｒ ｓ含有あるいは非含有新鮮培
地と再び置き換え、その２４時間後の培養上清中のＨｕ
Ｔ Ｎ Ｆ活性を測定した。結果を表３に示す。
表３ Ｉ−Ｉｆ、−５Ｑ、Ｔｉ−ＩＰ−１及びＭｏｎｏ
−１−２０７細胞によｌ了ａ ｌυ１ＪｎＩｙ／ｍＪＬ
； ＬｒＢ ｌμ％／ｍＪＬ＋表３から明らかなよう
に、各細胞とも１〜４８時間のいずれのＴＰＡ処理時間
でもｎｕＴＮＦを産生じたが、１（−Ｌ−６０細胞では
２４時間、ＴＩＩＰ−１細胞では４８時間、Ｍｏｎｏ−
１−２０７細胞では１〜２４時間のＴＰＡ処理が最も多
量のｌ−Ｉ ｕ Ｔ Ｎ Ｆを産生させた。
−１−２０７細胞によｌ了ａ ｌυ１ＪｎＩｙ／ｍＪＬ
； ＬｒＢ ｌμ％／ｍＪＬ＋表３から明らかなよう
に、各細胞とも１〜４８時間のいずれのＴＰＡ処理時間
でもｎｕＴＮＦを産生じたが、１（−Ｌ−６０細胞では
２４時間、ＴＩＩＰ−１細胞では４８時間、Ｍｏｎｏ−
１−２０７細胞では１〜２４時間のＴＰＡ処理が最も多
量のｌ−Ｉ ｕ Ｔ Ｎ Ｆを産生させた。
実験例４
ＨｕＴＮＦ産生に及はすＴＰＡ濃度の影響Ｉ−ＩＬ−６
０，ＴＨＰ−１あるいはＭｏｎｏ−１−２０７細胞を直
径８ｃｍのプラスチック製ベトリディッシュに１Ｘ１０
７個植え込み、５〜２０００ ｎ、ｙ／ｍ１（７）ＴＰ
Ａを添加して４８時間培養した゛後、ＴＰＡを含まない
新鮮培地と置き換えた。１０μｍ７／ｍｌのＬＰ８存在
下あるいは非存在下でＨＬ−６ｇ及びＭｏｎｏ−１−２
０７細胞についてはその後２４時間、ＴＨＰ−１細胞に
ついてはその後４８時間培養を続けた後、培養上清中の
ＨｕＴＮＦ活性を測定した。
０，ＴＨＰ−１あるいはＭｏｎｏ−１−２０７細胞を直
径８ｃｍのプラスチック製ベトリディッシュに１Ｘ１０
７個植え込み、５〜２０００ ｎ、ｙ／ｍ１（７）ＴＰ
Ａを添加して４８時間培養した゛後、ＴＰＡを含まない
新鮮培地と置き換えた。１０μｍ７／ｍｌのＬＰ８存在
下あるいは非存在下でＨＬ−６ｇ及びＭｏｎｏ−１−２
０７細胞についてはその後２４時間、ＴＨＰ−１細胞に
ついてはその後４８時間培養を続けた後、培養上清中の
ＨｕＴＮＦ活性を測定した。
なお、培地としテＨｉ ｇｈ ＧＥＭ培地と１−１ａ１
−１ａ培地の等容量混合培地を使用した。結果を表４に
示す。
−１ａ培地の等容量混合培地を使用した。結果を表４に
示す。
表４ ＨＬ−６０，ＴＩ（Ｐ−１及びＭｏｎｏ−１−２
０７細胞によるＨｕＴＮＦ産生に及ぼすＴＰＡ濃度の影
響−＜４ ＜４ ２３ ＋（４（４２７ −３１２１１８２ 十 ４７ ２９ ２３０ ＋ １１５ ３８７ ２９６ ＋ ２２８ ５３０ ２９８ ＋ ２８６ ９６４ ２７４ ＋ ２４３ １５１５ ２６５ 培地 （ｆｉｉｇｈＧＥＭ＋ＨａｍＦ１２） ＋１０％
ＦＢＳ（１０ｍｌ／ディツシュ）； ＬＰＳ １ｏμＩ
／ｍ１゜表４から明らかなように、各細胞とも５〜２０
ｏｏｎ、ｙ／ｍ１のいずれのＴＰＡ濃度でもＨｕ Ｔ
Ｎ Ｆを産生じたが、Ｉ（Ｌ−６０＃］胞では１００〜
２０００ｎｇ／ｍｌ、ＴＨＰ−１細胞では２０００ ｒ
ｔｊｊ／ｍ ｌ 、Ｍｏｎ。
０７細胞によるＨｕＴＮＦ産生に及ぼすＴＰＡ濃度の影
響−＜４ ＜４ ２３ ＋（４（４２７ −３１２１１８２ 十 ４７ ２９ ２３０ ＋ １１５ ３８７ ２９６ ＋ ２２８ ５３０ ２９８ ＋ ２８６ ９６４ ２７４ ＋ ２４３ １５１５ ２６５ 培地 （ｆｉｉｇｈＧＥＭ＋ＨａｍＦ１２） ＋１０％
ＦＢＳ（１０ｍｌ／ディツシュ）； ＬＰＳ １ｏμＩ
／ｍ１゜表４から明らかなように、各細胞とも５〜２０
ｏｏｎ、ｙ／ｍ１のいずれのＴＰＡ濃度でもＨｕ Ｔ
Ｎ Ｆを産生じたが、Ｉ（Ｌ−６０＃］胞では１００〜
２０００ｎｇ／ｍｌ、ＴＨＰ−１細胞では２０００ ｒ
ｔｊｊ／ｍ ｌ 、Ｍｏｎ。
−１−２０７細胞では２０〜１００ ｎＪ／ｍｌノＴＰ
ＡＩ度が最も多量のＩ（ｕＴＮＦを産生させた。
ＡＩ度が最も多量のＩ（ｕＴＮＦを産生させた。
実験例５
種４の化合物の１（ｕＴＮＦ産生誘導効果ＨＬ−６０，
ＴＨＰ−１あるいはＭｏｎｏ−１−２０７細胞を直径８
ｃｍのプラスチック製ぺ１−リディッシュにｌＸ１０７
個植え込み、表５に示す各種化合物１００ｎ ９７ｍ
１及びＬＰＳ １ｏｐ、ＩＩｍｌ−を添加して培養した
。Ｉ（Ｌ−６０細胞については７２時間後、ＴｆｆＰ−
１細胞については９６時間後、Ｍｏｎｏ−１２０７細胞
についそは４８時間後に、培養上清中のＨｕＴＮＦ活性
を測定した。同時に顕微鏡で細胞を観察し、細胞が培養
器壁に付着しているか否かでマクロファージへの分化誘
導能の有無を調べた。結果を表５に示す。
ＴＨＰ−１あるいはＭｏｎｏ−１−２０７細胞を直径８
ｃｍのプラスチック製ぺ１−リディッシュにｌＸ１０７
個植え込み、表５に示す各種化合物１００ｎ ９７ｍ
１及びＬＰＳ １ｏｐ、ＩＩｍｌ−を添加して培養した
。Ｉ（Ｌ−６０細胞については７２時間後、ＴｆｆＰ−
１細胞については９６時間後、Ｍｏｎｏ−１２０７細胞
についそは４８時間後に、培養上清中のＨｕＴＮＦ活性
を測定した。同時に顕微鏡で細胞を観察し、細胞が培養
器壁に付着しているか否かでマクロファージへの分化誘
導能の有無を調べた。結果を表５に示す。
なお、表５中の略号のうちで前出以外のものは次の通電
である。
である。
Ｐ ■几 ： ホルボール
ＭＰＭＡ ： ４ − ０ −メ チルホルボール−リ
ステート−１３−アセテート ４（２ＰＤＤ： ４ ａ−ホルポー／ｖ−１２．１３−
ジデカノ工−１・ 表５ 種々の化合物のｌ−ＩＩ−６０細胞におけるＨｕ
ＴＮＦ産生誘導効果 な し （４ ＜４ ２１ ＴＰＡ １２８ ２５０ １６７ ＰＥＩ几 （４ ＜：４ ２６ ＰＤＤ １２７ ２０６ １８２ ＰＤＢｚ １９７ ２２３ ２３２ ＰＤＡ ８ １５ ８３ ＭＰＭＡ 〈４ （４ ４４ ４αＰＤＤ （４ ＜４ ３０ ＭＥＺ ４５ ８９ １６６ ＴＯＤ １７ ３０ ４５ 培地 ＲＰＭＩ−１６４０＋ｌＯＳＦＢＳ（１０ｍｌ／
ディツシュ）； ＬＰＳ １０μＩ／ｍ１。
ステート−１３−アセテート ４（２ＰＤＤ： ４ ａ−ホルポー／ｖ−１２．１３−
ジデカノ工−１・ 表５ 種々の化合物のｌ−ＩＩ−６０細胞におけるＨｕ
ＴＮＦ産生誘導効果 な し （４ ＜４ ２１ ＴＰＡ １２８ ２５０ １６７ ＰＥＩ几 （４ ＜：４ ２６ ＰＤＤ １２７ ２０６ １８２ ＰＤＢｚ １９７ ２２３ ２３２ ＰＤＡ ８ １５ ８３ ＭＰＭＡ 〈４ （４ ４４ ４αＰＤＤ （４ ＜４ ３０ ＭＥＺ ４５ ８９ １６６ ＴＯＤ １７ ３０ ４５ 培地 ＲＰＭＩ−１６４０＋ｌＯＳＦＢＳ（１０ｍｌ／
ディツシュ）； ＬＰＳ １０μＩ／ｍ１。
表５から明らかなように、ＫＬ−５９及びＴＩ：ＩＰ−
１細胞に関しては、ＴＰＡ，ＰＤＤ，ＰＤＢｚ，ＰＩＪ
Ａ，Ｍ．ＥＺ。
１細胞に関しては、ＴＰＡ，ＰＤＤ，ＰＤＢｚ，ＰＩＪ
Ａ，Ｍ．ＥＺ。
Ｔ（３ＤにＨｕＴＮＦ産生誘導効果が認められ、ＭＯｎ
Ｏ−１−２０７細胞に関しては、ＰＨＲ及び４αＰＤＤ
を除くすべての化合物にＨ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生誘導効
果が認められた。各細胞ともＴＰＡ 、 ＰＤＤ及びＰ
ＤＢＺに強いＨｕＴＮＦ産生誘導効果が認められたが、
Ｍｏｎｏ−１−２０７細胞に関してはＭＥＺにも強イＨ
ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生誘導効果が認められた。なお、分
化誘導能の有無とＩ（ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生誘導能の有
無とは完全に一致していた。
Ｏ−１−２０７細胞に関しては、ＰＨＲ及び４αＰＤＤ
を除くすべての化合物にＨ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生誘導効
果が認められた。各細胞ともＴＰＡ 、 ＰＤＤ及びＰ
ＤＢＺに強いＨｕＴＮＦ産生誘導効果が認められたが、
Ｍｏｎｏ−１−２０７細胞に関してはＭＥＺにも強イＨ
ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生誘導効果が認められた。なお、分
化誘導能の有無とＩ（ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生誘導能の有
無とは完全に一致していた。
実験例６
の影響
■Ｌ−５Ｑ細胞を直径８ｃｍのプラスチック製ペトリデ
イツシュに１×１０７個植え込み、ＰＤＩ３ｚ，ＰＤＤ
，ＭＥＺあるいはＴＯＤを種４の濃度で添加し４８時間
培養した。次いで、分化誘導物質を含まない新鮮培地と
置き換え、１０μｇ／ｍ１．のＬＰＳの存在下あるいは
非存在下で更に２４時間培養を続けた後、培養」−苗中
の．１（ｕＴＮＦ活性を測定した。
イツシュに１×１０７個植え込み、ＰＤＩ３ｚ，ＰＤＤ
，ＭＥＺあるいはＴＯＤを種４の濃度で添加し４８時間
培養した。次いで、分化誘導物質を含まない新鮮培地と
置き換え、１０μｇ／ｍ１．のＬＰＳの存在下あるいは
非存在下で更に２４時間培養を続けた後、培養」−苗中
の．１（ｕＴＮＦ活性を測定した。
結果を表６に示す。
表５ １（Ｌ−６０細胞によるＨ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生
に及ぼす各種分化誘導物質の濃度の影響 − ＜４ ＜４ ＜４ ＜４ 十 〈４ 〈４ 〈４ 〈４ − （４ １７ １４ （４ ０ ＋ ＜４ ３２ １９ ＜４ − ５０ ７８ ２０ １０ ００ ＋ １３０ １１５ ２９ １４ − １６９ １２４ ３２ ４９ ００ 一Ｉ− ２９４ ２０４ ３８ ５１ ＊ 試験しなかった、ことを意味する。
に及ぼす各種分化誘導物質の濃度の影響 − ＜４ ＜４ ＜４ ＜４ 十 〈４ 〈４ 〈４ 〈４ − （４ １７ １４ （４ ０ ＋ ＜４ ３２ １９ ＜４ − ５０ ７８ ２０ １０ ００ ＋ １３０ １１５ ２９ １４ − １６９ １２４ ３２ ４９ ００ 一Ｉ− ２９４ ２０４ ３８ ５１ ＊ 試験しなかった、ことを意味する。
培地 ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢｓ（１０ｍｌ／
ディツシュ）； ＬＰＳ １０４／ｍｌ。
ディツシュ）； ＬＰＳ １０４／ｍｌ。
表６から明らかなように、ＰＤＢｚ及びＴＣＤ は１１
００ｎ／ｍ１以上の濃度で、ＰＤＤ及びＭＥＺは２０ｎ
ｇ／ｍ １以上の濃度でＨｕＴＮＦ産生を誘導した。
００ｎ／ｍ１以上の濃度で、ＰＤＤ及びＭＥＺは２０ｎ
ｇ／ｍ １以上の濃度でＨｕＴＮＦ産生を誘導した。
ＰＤＢｚは２０００ ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＤは５００〜２
０００ ｎｇ／ｍｌ 、 ＭＥＺ 及ヒＴＣＤは５００
ｎ、９／ｍｌの濃度で最も多量のＨｕＴＮＦを産生させ
た。
０００ ｎｇ／ｍｌ 、 ＭＥＺ 及ヒＴＣＤは５００
ｎ、９／ｍｌの濃度で最も多量のＨｕＴＮＦを産生させ
た。
実験例７
１φＤＭＳ Ｏで３日間前処理したＨＬ−６０細胞ある
いは非削処理ＨＬ−６０細胞を直径８ｃｍのプラスチッ
ク製ベトリデイツシュに１×１６７個植え込み、５００
ｎｇ／ｍｌ ｃｒ） ＴＰＡを添加し、更に０．１〜１
％のＤＭＳＯあるいは５０〜１０００ ｎｇ／ｍｌノビ
タミンＡ酸を添加して４８時間培養した。次いで、１０
１１ｎ／ｍｌのＬＰＳを含む新鮮培地と置き換え、更に
２４時間培養を続けた後、培養上清中の１（ｕＴＮＦ活
性を測定した。結果を表７に示す。
いは非削処理ＨＬ−６０細胞を直径８ｃｍのプラスチッ
ク製ベトリデイツシュに１×１６７個植え込み、５００
ｎｇ／ｍｌ ｃｒ） ＴＰＡを添加し、更に０．１〜１
％のＤＭＳＯあるいは５０〜１０００ ｎｇ／ｍｌノビ
タミンＡ酸を添加して４８時間培養した。次いで、１０
１１ｎ／ｍｌのＬＰＳを含む新鮮培地と置き換え、更に
２４時間培養を続けた後、培養上清中の１（ｕＴＮＦ活
性を測定した。結果を表７に示す。
表７ ＨＬ−６０荊ｌｌ胞にｊ ルＨＭＴＮＦ産生に対
するＤＭＳＯ及びビタミンＡ酸の増強効果 な し ２６６ ３３３ ０．１％ ２８６ ３３９ ｎＭＳ、０ ０．３〃 ３５７ ４５４Ｌ 〃 ６９７
６７４ ５ｇ＋ｙ／ｍｌ ９９４ １２０２ ビタミンＡ酸 ２００ 〃 １３４７ １１０９１００
０ 〃１３７４ ９６２ ＊ １φＤＭＳＯの存在下に３日間培養したもの培地
（Ｈｉｇｈ ＧＥＭ−１−Ｈａｍ Ｆ１２ ） ＋１０
％ ＦＢＳ（１０ｍ１／デイツシユ）： ＴＰＡ５０
０ｎ！ｊ／ｍ１：ＬＰＳ １０μｇ／ｍ１゜ 表７から明らかなように、ＤＭＳＯは０．３〜１％の濃
度で、ＤＭＳＯ前処理あるいは非削処理ｍ、−６０細胞
によるＩ−Ｉ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生に対して増強効果を
示したが、１φのときがより強い増強効果を示した。
するＤＭＳＯ及びビタミンＡ酸の増強効果 な し ２６６ ３３３ ０．１％ ２８６ ３３９ ｎＭＳ、０ ０．３〃 ３５７ ４５４Ｌ 〃 ６９７
６７４ ５ｇ＋ｙ／ｍｌ ９９４ １２０２ ビタミンＡ酸 ２００ 〃 １３４７ １１０９１００
０ 〃１３７４ ９６２ ＊ １φＤＭＳＯの存在下に３日間培養したもの培地
（Ｈｉｇｈ ＧＥＭ−１−Ｈａｍ Ｆ１２ ） ＋１０
％ ＦＢＳ（１０ｍ１／デイツシユ）： ＴＰＡ５０
０ｎ！ｊ／ｍ１：ＬＰＳ １０μｇ／ｍ１゜ 表７から明らかなように、ＤＭＳＯは０．３〜１％の濃
度で、ＤＭＳＯ前処理あるいは非削処理ｍ、−６０細胞
によるＩ−Ｉ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生に対して増強効果を
示したが、１φのときがより強い増強効果を示した。
一方、ビタミンＡ酸は５０〜１１０００ｎ／ｍ１の濃度
で、両細胞によるＨ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生に対して著し
い増強効果を示した。また、ＤＭＳ Ｏ前処理ＨＬ−５
Ｑ細胞は、ＤＭＳＯ又はビタミンＡ酸を添加しないとき
、あるいはこれらの濃度が低いときに、ＤＭＳＯ非前処
理ＨＬ−６０細胞よシも多量のＨｕ Ｔ Ｎ Ｆを産生
じた。
で、両細胞によるＨ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生に対して著し
い増強効果を示した。また、ＤＭＳ Ｏ前処理ＨＬ−５
Ｑ細胞は、ＤＭＳＯ又はビタミンＡ酸を添加しないとき
、あるいはこれらの濃度が低いときに、ＤＭＳＯ非前処
理ＨＬ−６０細胞よシも多量のＨｕ Ｔ Ｎ Ｆを産生
じた。
実験例８
Ｈｕ Ｔ Ｎ Ｆ産生に対するビタミンＡ酸の増強効果
ＨＬ−６ＱあるいはＴＨＰ−１細胞を直径８ｃｍのプラ
スチック製ベトリデイツシュにＩ Ｘ １０７個植え込
み、ＴＰＡ又はＰＤＢｚを表８に示す濃度で添加し、更
に各種濃度のビタミンＡ酸を添加して４８時間培養した
。次いで、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳを含む新鮮培地と置
き換え、Ｉ（Ｌ−６０ｆｉｌ’ｌｌ胞ではその後２４時
間、またＴＨＰ −１細胞ではその後４８時間培養を続
けた後、培養上清中のＨｕＴＮＦ活性を測定した。結果
を表８に示す。
ＨＬ−６ＱあるいはＴＨＰ−１細胞を直径８ｃｍのプラ
スチック製ベトリデイツシュにＩ Ｘ １０７個植え込
み、ＴＰＡ又はＰＤＢｚを表８に示す濃度で添加し、更
に各種濃度のビタミンＡ酸を添加して４８時間培養した
。次いで、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳを含む新鮮培地と置
き換え、Ｉ（Ｌ−６０ｆｉｌ’ｌｌ胞ではその後２４時
間、またＴＨＰ −１細胞ではその後４８時間培養を続
けた後、培養上清中のＨｕＴＮＦ活性を測定した。結果
を表８に示す。
表８ ＨＬ−６０及びＴＨＰ−１細胞によるＨｕＴＮＦ
産生に対するビタミンＡ酸の増強効果 ビタミンＡ 培養上清中のＨｕＴＮＦ活性（０７ｍ ｌ
）０ ２８７ ３４２ ９１８ ８１９ ５ ５３２ １１９５ １９８３ １８３２５０ ７３
８ ２０６２ ２７２５ ２５５４２００ １４５９
２０１４ ３０３９ ２７１８１０００ １４８６ ２
４１４ ３７４５ ２９５１培地 （ＨｉｇｈＵＥＭ＋
ＨａｍＦ１２）＋１０％ＦＢＳ（１０ｍｌ／ディツシュ
）； ＬＰＳ ＩＱ １１ｇ７ｍ１゜表８から明らかな
ように、ビタミンＡ酸は、ＨＬ−５Ｑ及びＴＨＰ−１＃
Ｉｌ胞によるＨｕＴＮＦ産生に対して、分化誘導物質の
種類に関係なく５〜１０００ｎ、９／ｍｌではその濃度
に依存して増強効果を示した。
産生に対するビタミンＡ酸の増強効果 ビタミンＡ 培養上清中のＨｕＴＮＦ活性（０７ｍ ｌ
）０ ２８７ ３４２ ９１８ ８１９ ５ ５３２ １１９５ １９８３ １８３２５０ ７３
８ ２０６２ ２７２５ ２５５４２００ １４５９
２０１４ ３０３９ ２７１８１０００ １４８６ ２
４１４ ３７４５ ２９５１培地 （ＨｉｇｈＵＥＭ＋
ＨａｍＦ１２）＋１０％ＦＢＳ（１０ｍｌ／ディツシュ
）； ＬＰＳ ＩＱ １１ｇ７ｍ１゜表８から明らかな
ように、ビタミンＡ酸は、ＨＬ−５Ｑ及びＴＨＰ−１＃
Ｉｌ胞によるＨｕＴＮＦ産生に対して、分化誘導物質の
種類に関係なく５〜１０００ｎ、９／ｍｌではその濃度
に依存して増強効果を示した。
実験例９
）ＩｕＴＮＦの移植ＭｅしｈＡ肉腫に対する効果後記実
施例１．４及び６でＬＰＳを添加しなかったディツシュ
から得られた培養上清を、それぞれ限外沖過膜ＰＭＩＯ
（アミコン社、米国）を用いて濃縮した後、ｉｎ ｖｉ
ｖｏ法でＨｕＴＮＦの活性を測定した。試料は癌組織内
に投与し、投与２４時間後の癌壊死効果を調べた。また
、投与１５５日目でに移植した癌が完全に消失したかど
うかも調べた。結果を表９に示す。
施例１．４及び６でＬＰＳを添加しなかったディツシュ
から得られた培養上清を、それぞれ限外沖過膜ＰＭＩＯ
（アミコン社、米国）を用いて濃縮した後、ｉｎ ｖｉ
ｖｏ法でＨｕＴＮＦの活性を測定した。試料は癌組織内
に投与し、投与２４時間後の癌壊死効果を調べた。また
、投与１５５日目でに移植した癌が完全に消失したかど
うかも調べた。結果を表９に示す。
（以 下 余 白）
表ｇ Ｈ，ｕ ＴＮＦの移植Ｍｅｔ；ｈＡ肉腫に対する
効果５００ ４ ０ ０ ０ ０／４ ＨＬ−６０１００００１２１２／４ ２０００ ０ ０ ０ ４ ４／４ ２０００ ０ ０ ０ ４ ４／４ 対照（生理食塩水投与）８００００／８＊ ｆ（ｕＴＮ
Ｆ投与１投与１甘 失したマウスの数／総マウス数 マウス：ＢＡＬＢ／ｃ系雌マウヌ（６週令）移植細胞数
：２Ｘ１０５個１０．１ｍ１（皮肉移植）投与時期：移
植後７日目 投与経路：癌組織内 表９から明らかなように、いずれの細胞から産生される
Ｈ ｕ Ｔ Ｎ Ｆも２０００単位／マウスの投与量で
、癌組織を２４時間以内に壊死させ、その後宿主動物に
何ら影響を及ばずことなく癌組織を完全に消失させた。
効果５００ ４ ０ ０ ０ ０／４ ＨＬ−６０１００００１２１２／４ ２０００ ０ ０ ０ ４ ４／４ ２０００ ０ ０ ０ ４ ４／４ 対照（生理食塩水投与）８００００／８＊ ｆ（ｕＴＮ
Ｆ投与１投与１甘 失したマウスの数／総マウス数 マウス：ＢＡＬＢ／ｃ系雌マウヌ（６週令）移植細胞数
：２Ｘ１０５個１０．１ｍ１（皮肉移植）投与時期：移
植後７日目 投与経路：癌組織内 表９から明らかなように、いずれの細胞から産生される
Ｈ ｕ Ｔ Ｎ Ｆも２０００単位／マウスの投与量で
、癌組織を２４時間以内に壊死させ、その後宿主動物に
何ら影響を及ばずことなく癌組織を完全に消失させた。
なお、実施例１，４及び６でＬＰＳを添加したディツシ
ュから得られた培養上清をゲ）Ｌｉ２過に付してＬＰＳ
を除いたものについても、同様の効果が認められた。
ュから得られた培養上清をゲ）Ｌｉ２過に付してＬＰＳ
を除いたものについても、同様の効果が認められた。
実施例１
培養容器として、５０枚の直径８ｃｍのプラスチック製
ペトリデイッシュを用いた。また培地として、Ｈｉｇｈ
ＧＥＭ培地とＨａｍ Ｆｔｚ４地の等容量混合培地に
１０チのＦＢＳ，５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０
μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加して調製したも
のを用いた。
ペトリデイッシュを用いた。また培地として、Ｈｉｇｈ
ＧＥＭ培地とＨａｍ Ｆｔｚ４地の等容量混合培地に
１０チのＦＢＳ，５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０
μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加して調製したも
のを用いた。
１×ｌＯ６個／ｍ１の細胞密度Ｏ ＨＬ−６ ０ 細胞
浮遊液を上記培地で調製し、そのｌＱｍｌを各ディツシ
ュに植え込み、ＴＰＡを５ Ｑ Ｑ ｎ，９／ｍｌとな
るように添加し、３７℃，５チ炭酸ガス含有空気中で２
４時間培養した。培養液を除去し、ＴＰＡを含まない血
清不含の新鮮培地ＩＱｍｌと置き換えた。更に２４時間
培養した後、ＬＰＳを１０μ！！／ｍ１となるように添
加したディツシュと添加しないディツシュをっくシ培養
を続けた。２４時間後に各ディツシュの培養上清を収集
し、３０００回転／分で１０分間遠心した後、上清中の
Ｈ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ活性を測定した。その結果、各培養
上清中のＨｕＴＮＦ活性は、ＬＰＳを添加したものでは
２８９単位／ ｍｌ 、 ＬＰＳを添加しなかったもの
では２２０単位／ｍｌであった。
浮遊液を上記培地で調製し、そのｌＱｍｌを各ディツシ
ュに植え込み、ＴＰＡを５ Ｑ Ｑ ｎ，９／ｍｌとな
るように添加し、３７℃，５チ炭酸ガス含有空気中で２
４時間培養した。培養液を除去し、ＴＰＡを含まない血
清不含の新鮮培地ＩＱｍｌと置き換えた。更に２４時間
培養した後、ＬＰＳを１０μ！！／ｍ１となるように添
加したディツシュと添加しないディツシュをっくシ培養
を続けた。２４時間後に各ディツシュの培養上清を収集
し、３０００回転／分で１０分間遠心した後、上清中の
Ｈ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ活性を測定した。その結果、各培養
上清中のＨｕＴＮＦ活性は、ＬＰＳを添加したものでは
２８９単位／ ｍｌ 、 ＬＰＳを添加しなかったもの
では２２０単位／ｍｌであった。
実施例２
培養容器として、数枚の直径８ｃｍのプラスチック製ベ
トリディッシュを用い、培地として実施例１で使用した
寺のと同じものを用いた。
トリディッシュを用い、培地として実施例１で使用した
寺のと同じものを用いた。
１Ｘ１０６個／ｍｌノ細胞密度（７）Ｉ（Ｌ−５Ｑ細胞
浮遊液を上記培地で調製し、そのｌ Ｑ ｍｌを各ディ
ツシュに植え込み、ＰＤＢｚ及びビタミンＡ酸をそれぞ
れ２ ０ ０ ０ ｎ，９／ｒｎｌ及び１０００ ｎ，
９／ｍｌとなるように添加し、３７℃，５チ炭酸ガヌ含
有空気中で４８時間培養した。培養液を除去し、ＰＤＢ
ｚを含まない新鮮培地（ＦＥＳの添加量を１％に減じた
もの）ｔｏｍ］−と置き換え、ＬＰＳをｔ ｏ ｉｔｇ
／ｍ１となるように添加したディツシュと添加しないデ
ィツシュをつくシ培養を続けた。２４時間後に各ディツ
シュの培養上清を収集し、３０００回転／分で１０分間
遠心した後、上清中のＨｕ Ｔ Ｎ Ｆ活性を測定した
。その結果、各培養上清中の１−Ｉ ｕＴＮＦ活性は、
ＬＰＳを添加したものでは１６８３単位／ｍｌ 、 Ｌ
ＰＳを添加しなかったものでは１０７６単位／ｍｌであ
った。
浮遊液を上記培地で調製し、そのｌ Ｑ ｍｌを各ディ
ツシュに植え込み、ＰＤＢｚ及びビタミンＡ酸をそれぞ
れ２ ０ ０ ０ ｎ，９／ｒｎｌ及び１０００ ｎ，
９／ｍｌとなるように添加し、３７℃，５チ炭酸ガヌ含
有空気中で４８時間培養した。培養液を除去し、ＰＤＢ
ｚを含まない新鮮培地（ＦＥＳの添加量を１％に減じた
もの）ｔｏｍ］−と置き換え、ＬＰＳをｔ ｏ ｉｔｇ
／ｍ１となるように添加したディツシュと添加しないデ
ィツシュをつくシ培養を続けた。２４時間後に各ディツ
シュの培養上清を収集し、３０００回転／分で１０分間
遠心した後、上清中のＨｕ Ｔ Ｎ Ｆ活性を測定した
。その結果、各培養上清中の１−Ｉ ｕＴＮＦ活性は、
ＬＰＳを添加したものでは１６８３単位／ｍｌ 、 Ｌ
ＰＳを添加しなかったものでは１０７６単位／ｍｌであ
った。
実施例３
培養容器として、数枚の直径８ｃｍのプラヌチック製ベ
トリディッシュを用い、培地として実施例１で使用した
のと同じものを用いた。
トリディッシュを用い、培地として実施例１で使用した
のと同じものを用いた。
Ｉ Ｘ １０’個／ｍｌの細胞密度のＭｏｎｏ−１−２
０７細胞浮遊液を培地で調製し、そのｌ Ｑ ｍｌを各
ディツシュに植え込み、ＴＰＡを１００ｎ、９／ｍｌと
なるように添加し、３７℃、５φ炭酸ガス含有空気中で
２４時間培養した。培養液を除去し、ＴＰＡを含まない
血清不含の新鮮培地１０ｍ１と置き換えＬＰＳを１０μ
ｇ／ｍ３−となるように添加したディツシュと添加しな
いディツシュをつくり培養を続けた。２４時間後に各デ
ィツシュの培養上清を収集し、３０００回転／分で１０
分間遠心した後、上清中のＨｕＴＮＦ活性を測定した。
０７細胞浮遊液を培地で調製し、そのｌ Ｑ ｍｌを各
ディツシュに植え込み、ＴＰＡを１００ｎ、９／ｍｌと
なるように添加し、３７℃、５φ炭酸ガス含有空気中で
２４時間培養した。培養液を除去し、ＴＰＡを含まない
血清不含の新鮮培地１０ｍ１と置き換えＬＰＳを１０μ
ｇ／ｍ３−となるように添加したディツシュと添加しな
いディツシュをつくり培養を続けた。２４時間後に各デ
ィツシュの培養上清を収集し、３０００回転／分で１０
分間遠心した後、上清中のＨｕＴＮＦ活性を測定した。
その結果、各培養上清中のＨｕ Ｔ Ｎ Ｆ活性は、Ｉ
、ＰＳを添加したものでは３４８単位／ｍ １、ＬＰＳ
を添加しなかったものでは２９０単位／ｍｌであった。
、ＰＳを添加したものでは３４８単位／ｍ １、ＬＰＳ
を添加しなかったものでは２９０単位／ｍｌであった。
実施例４
培養容器として、５０枚の直径８ｃｍのプラスチック製
ベトリディッシュを用い、培地として実施例１で使用し
たのと同じものを用いた。
ベトリディッシュを用い、培地として実施例１で使用し
たのと同じものを用いた。
Ｉ Ｘ １０６個／ｍｌの細胞密度（７）ＴＨＰ−１細
胞浮遊液を培地で調製し、そのｌＱｍｌを各ディツシュ
に植え込み、ＴＰＡ及びビタミンＡ酸をそれぞれ１００
０ ｎ、ｐ／ｍｌとなるように添加し、３７℃、５φ炭
酸ガス含有空気中で４８時間培養した。培養液を除去し
、ＴＰＡを含まない新鮮培地（ＦＢＳの添加量を１％に
減じたもの） ｌ Ｑ ｍｌと置き換え、ＬＰＳを１０
μｇ／ｍｌとなるように添加したディツシュと添加しな
いディツシュをつくり培養を続けた。４８時間後に各デ
ィツシュの培養上清を収集し、３０００回転／分で１０
分間遠心した後、上清中のＩ（ｕＴＮＦ活性を測定した
。その結果、各培養上清中のｌ−Ｉ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ活
性は、ＬＰＳ′ｆ：添加したものでは３８１４単位／ｍ
ｌ、ＬＰＳｉ添加しなかったものでは２１４１単位／ｍ
ｌであった。
胞浮遊液を培地で調製し、そのｌＱｍｌを各ディツシュ
に植え込み、ＴＰＡ及びビタミンＡ酸をそれぞれ１００
０ ｎ、ｐ／ｍｌとなるように添加し、３７℃、５φ炭
酸ガス含有空気中で４８時間培養した。培養液を除去し
、ＴＰＡを含まない新鮮培地（ＦＢＳの添加量を１％に
減じたもの） ｌ Ｑ ｍｌと置き換え、ＬＰＳを１０
μｇ／ｍｌとなるように添加したディツシュと添加しな
いディツシュをつくり培養を続けた。４８時間後に各デ
ィツシュの培養上清を収集し、３０００回転／分で１０
分間遠心した後、上清中のＩ（ｕＴＮＦ活性を測定した
。その結果、各培養上清中のｌ−Ｉ ｕ Ｔ Ｎ Ｆ活
性は、ＬＰＳ′ｆ：添加したものでは３８１４単位／ｍ
ｌ、ＬＰＳｉ添加しなかったものでは２１４１単位／ｍ
ｌであった。
実施例５
培養容器として、数枚の直径８ｃｍのプラスチック製ベ
トリディッシュを用い、培地として１０φＦＢＳを含む
ｆｔＰＭＩ−１６４０培地を用いた。
トリディッシュを用い、培地として１０φＦＢＳを含む
ｆｔＰＭＩ−１６４０培地を用いた。
５×１０５個／ｍ１）細胞密度のＴＨＰ−１ｍ胞浮遊液
を培地で調製し、その２Ｑｍｌを各ディツシュに植え込
み、’１”ＦＡを２００ ｎｇ／ｍｌとなるように添加
し、３７°Ｇ、５’％炭酸ガス含有空気中で１時間培養
した。培養液を除去し、ＴＰＡを含まない新鮮培地２０
ｍ１と置き換え、ポリペプトン及びビタミンＡ酸をそれ
ぜれ１ｗ／ｖチ及びａｏｏｏｎｇ、’ｍ１になるように
添加し、４８時間培養を続けた。
を培地で調製し、その２Ｑｍｌを各ディツシュに植え込
み、’１”ＦＡを２００ ｎｇ／ｍｌとなるように添加
し、３７°Ｇ、５’％炭酸ガス含有空気中で１時間培養
した。培養液を除去し、ＴＰＡを含まない新鮮培地２０
ｍ１と置き換え、ポリペプトン及びビタミンＡ酸をそれ
ぜれ１ｗ／ｖチ及びａｏｏｏｎｇ、’ｍ１になるように
添加し、４８時間培養を続けた。
培養液の半量を除去し、新鮮培地Ｉ Ｑ ｍｌを加え、
ＬＰＳを１０μｇ／ｍ１となるように添加したディツシ
ュと添加しないディツシュをつくシ培養を続けた。１６
時間後に各ディツシュの培養上清を収集し、３０００回
転／分で１０分間遠心した後、上清中のＨｕＴＮＦ活性
を測定した。その結果、各培養上清中の１−１ｕＴＮＦ
活性は、ＬＰＳを添加したものでは１６０７単位／ｍｌ
、ＬＰＳを添加しなかったものでは９５８単位／ｍｌで
あった。
ＬＰＳを１０μｇ／ｍ１となるように添加したディツシ
ュと添加しないディツシュをつくシ培養を続けた。１６
時間後に各ディツシュの培養上清を収集し、３０００回
転／分で１０分間遠心した後、上清中のＨｕＴＮＦ活性
を測定した。その結果、各培養上清中の１−１ｕＴＮＦ
活性は、ＬＰＳを添加したものでは１６０７単位／ｍｌ
、ＬＰＳを添加しなかったものでは９５８単位／ｍｌで
あった。
実施例６
培地として、実施例１で使用したのと同じものを用いた
。
。
Ｉ Ｘ １０６個／ｍｌの細胞密度ノＭｏｎｏ−１−２
０７細胞浮遊液５００ ｍｌを培地で調製し、容量１０
００ ｍｌのスピンナーフラスコ（ベルコ社。
０７細胞浮遊液５００ ｍｌを培地で調製し、容量１０
００ ｍｌのスピンナーフラスコ（ベルコ社。
米国）に入れ、ＰＤＢｚを５００ ｎｇ／ｍｌとなルヨ
うに添加した後、密封状態で３７℃で攪拌しながら培養
した。培養開始３時間後に、遠心操作（ｔｏｏｏ回転／
分、５分間）によシ紬胞を集め、ＰＤＢｚを含まない新
鮮培地５００ ｍｌに再び浮遊させた。その細胞浮遊液
を３５ｍ１ずつ直径１５ｃｍのプラヌチック製ベトリデ
ィッシュ１２枚に植え込み、３７℃、５φ炭酸ガス含有
空気中で培養した。培養４８時間後に、６枚のディツシ
ュに１０μｇ／ｍＪとなるようにＬＰＳを添加し、更に
２４時間培養した。各テ゛イッシュの培養上清を収集し
、３０００回転／分で１０分間遠心した後、上清中のＨ
ｕＴＮ、Ｆ活性を測定した。その結果、培養上清中のＨ
ｕ Ｔ Ｎ Ｆ活性は、ＬＰＳを添加したものでは平均
３８６単位／ｍｌ、ＬＰＳを添加しなかったものでは平
均２７５単位／ｍｌであった。
うに添加した後、密封状態で３７℃で攪拌しながら培養
した。培養開始３時間後に、遠心操作（ｔｏｏｏ回転／
分、５分間）によシ紬胞を集め、ＰＤＢｚを含まない新
鮮培地５００ ｍｌに再び浮遊させた。その細胞浮遊液
を３５ｍ１ずつ直径１５ｃｍのプラヌチック製ベトリデ
ィッシュ１２枚に植え込み、３７℃、５φ炭酸ガス含有
空気中で培養した。培養４８時間後に、６枚のディツシ
ュに１０μｇ／ｍＪとなるようにＬＰＳを添加し、更に
２４時間培養した。各テ゛イッシュの培養上清を収集し
、３０００回転／分で１０分間遠心した後、上清中のＨ
ｕＴＮ、Ｆ活性を測定した。その結果、培養上清中のＨ
ｕ Ｔ Ｎ Ｆ活性は、ＬＰＳを添加したものでは平均
３８６単位／ｍｌ、ＬＰＳを添加しなかったものでは平
均２７５単位／ｍｌであった。
特許出願人 大日本製薬株式会社
旭化成工業株式会社
代理人 小島−晃
Claims (1)
- マクロファージ様細胞に分化し得るヒト白血病細胞を、
分化誘導能を有する物質の存在下に培養することを特徴
とするヒト癌壊死因子の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58139228A JPH088873B2 (ja) | 1983-07-28 | 1983-07-28 | ヒト癌壊死因子の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58139228A JPH088873B2 (ja) | 1983-07-28 | 1983-07-28 | ヒト癌壊死因子の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6030688A true JPS6030688A (ja) | 1985-02-16 |
| JPH088873B2 JPH088873B2 (ja) | 1996-01-31 |
Family
ID=15240469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58139228A Expired - Lifetime JPH088873B2 (ja) | 1983-07-28 | 1983-07-28 | ヒト癌壊死因子の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH088873B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6127923A (ja) * | 1984-07-17 | 1986-02-07 | Denichi Mizuno | ヒト腫瘍壊死因子の製造法 |
| US5288852A (en) * | 1984-03-06 | 1994-02-22 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Human tumor necrosis factor polypeptides |
| US6057391A (en) * | 1997-06-06 | 2000-05-02 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | Polyurethane resin type composition for slush molding |
| US6177508B1 (en) | 1998-07-06 | 2001-01-23 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | Polyurethane resin type composition for slush molding |
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1983
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH088873B2 (ja) | 1996-01-31 |
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