RU2811901C1 - Средство для стимуляции пролиферативной активности клеток костного мозга - Google Patents
Средство для стимуляции пролиферативной активности клеток костного мозга Download PDFInfo
- Publication number
- RU2811901C1 RU2811901C1 RU2023102541A RU2023102541A RU2811901C1 RU 2811901 C1 RU2811901 C1 RU 2811901C1 RU 2023102541 A RU2023102541 A RU 2023102541A RU 2023102541 A RU2023102541 A RU 2023102541A RU 2811901 C1 RU2811901 C1 RU 2811901C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bone marrow
- apoa
- cells
- marrow cells
- thc
- Prior art date
Links
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 60
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 title description 20
- AODPIQQILQLWGS-UHFFFAOYSA-N (3alpa,5beta,11beta,17alphaOH)-form-3,11,17,21-Tetrahydroxypregnan-20-one, Natural products C1C(O)CCC2(C)C3C(O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC21 AODPIQQILQLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 45
- AODPIQQILQLWGS-GXBDJPPSSA-N tetrahydrocortisol Chemical compound C1[C@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@@H]21 AODPIQQILQLWGS-GXBDJPPSSA-N 0.000 claims abstract description 40
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 claims description 79
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 claims description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 28
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 abstract description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 23
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 23
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 11
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 abstract description 6
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 abstract description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 208000018240 Bone Marrow Failure disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000014905 bone marrow failure syndrome Diseases 0.000 abstract description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 25
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 22
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 20
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 18
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 18
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 15
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 11
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 11
- 239000000306 component Substances 0.000 description 10
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 7
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 6
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 5
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 5
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000003003 monocyte-macrophage precursor cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 210000004206 promonocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 4
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 4
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 4
- 102100027662 Sphingosine kinase 2 Human genes 0.000 description 4
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 4
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 4
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 3
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 108010075016 Ceruloplasmin Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 101000651197 Homo sapiens Sphingosine kinase 2 Proteins 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 101710156532 Sphingosine kinase 2 Proteins 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 238000007474 nonparametric Mann- Whitney U test Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 2
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 2
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- CAOTVXGYTWCKQE-UHFFFAOYSA-N 3-(4-chlorophenyl)-N-(pyridin-4-ylmethyl)-1-adamantanecarboxamide Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C1(C2)CC(C3)(C(=O)NCC=4C=CN=CC=4)CC2CC3C1 CAOTVXGYTWCKQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001395 Acute radiation syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 101710189714 Major cell-binding factor Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010068142 Radiation sickness syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100030000 Recombining binding protein suppressor of hairless Human genes 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 150000001886 cortisols Chemical class 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000015961 delipidation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 150000002031 dolichols Chemical class 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000000222 eosinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002709 granulomonocytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000633 hematostimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001096 hypoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- PVBQYTCFVWZSJK-UHFFFAOYSA-N meldonium Chemical compound C[N+](C)(C)NCCC([O-])=O PVBQYTCFVWZSJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002937 meldonium Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001167 myeloblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011338 personalized therapy Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 208000022256 primary systemic amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004765 promyelocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 229960002181 saccharomyces boulardii Drugs 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Предложено применение комплекса сывороточного белка аполипопротеин A-I с тетрагидрокортизолом для стимуляции пролиферативной активности клеток костного мозга. Изобретение может применяться при культивировании клеток костного мозга в условиях, требующих использования бессывороточной среды, а также в регенеративной медицине для стимуляции пролиферативной активности клеток костного мозга in vivo при патологиях, связанных с нарушением кроветворения, например, при синдроме недостаточности костного мозга или при кровопотерях, наступивших после прохождения курсов химио- или лучевой терапии. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 7 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и регенеративной медицины и может быть использовано при культивировании клеток костного мозга в условиях, требующих использования бессывороточной среды, а также для стимуляции пролиферативной активности клеток костного мозга при патологиях, связанных с нарушением кроветворения, например, при синдроме недостаточности костного мозга, при кровопотерях, после прохождения курсов химио- или лучевой терапии.
Кроветворение (гемопоэз) представляет собой сложный многостадийный процесс клеточных делений и дифференцировок, в результате которого образуются зрелые, функционально полноценные клетки крови. В постнатальный период основным кроветворным органом является костный мозг. В нем содержится основная масса стволовых кроветворных клеток и образуются все клетки крови. Высокая пролиферативная активность всех типов клеток является одной из важнейших характеристик ткани костного мозга. Регуляция кроветворения в костном мозге находится под контролем широкого спектра факторов, среди которых наиболее изученными являются гемопоэтические факторы роста. Главными источниками этих факторов являются макрофаги, эндотелиальные клетки, лимфоциты и клетки стромы.
В настоящее время одной из актуальных задач гематологии и регенеративной медицины является поиск способов и лекарственных средств, направленных на стимуляцию кроветворения в костном мозге с целью восстановления необходимого при заболеваниях системы крови и гематологических осложнениях, резистентных к современной медикаментозной терапии.
Известно использование средства Энтерол-250 для коррекции эритропоэза при инфекционной патологии. Указанное средство представляет собой лиофилизированный препарат культуры дрожжевых грибков Saccharomyces boulardii, содержащий в 1 г препарата следующие соединения: тиамин (60 мкг), рибофлавин (40 мкг), никотиновая кислота (480 мкг), пиридоксин (33 мкг), пантотеновая кислота (77 мкг), ферменты, аминокислоты, стимуляторы IgA и т.д. [патент на изобретение РФ №2189826 С1, Способ коррекции эритропоэза и лечения анемии при инфекционной патологии. 2001. МПК А61К 35/72 (2000.01), А61Р 7/06 (2000.01)]. Недостатком энтерола-250 является то, что его эффект ограничен увеличением количества эритроцитов на 17% по сравнению с исходным уровнем, при этом не установлено его влияние на другие клеточные линии костного мозга.
В качестве средства, стимулирующего гемопоэз при гипопластических состояниях костного мозга, вызванных цитостатиком, предложено использовать внутривенное введение 50 мг/кг N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоты. Данное средство снижает токсическое действие цитостатиков на миелопоэз за счет стимуляции эритропоэза и грануломоноцитопоэза [патент на изобретение РФ №2058138 С1. Средство, стимулирующее гемопоэз. 1996. МПК А61К 31/7012 (2006.01), А61К 31/185 (2006.01), А61Р 7/00 (2006.01)]. Указанное средство позволяет увеличить количество эритроидных элементов, а также зрелых форм нейтрофильных лейкоцитов в костном мозге мышей, подвергнутых воздействию циклофосфана. Однако не установлено стимулирующее влияние указанного средства на количество лимфоцитов и лимфоцитарных клеток, а также ретикулярных клеток костного мозга.
Для восстановления гемопоэза после применения цитостатиков используют лекарственную композицию, в состав которой входит D-глюкуроновая кислота, милдронат и изотонический раствор в соотношении: Д-глюкуроновая кислота 0,133-0,267; 3(2,2,2-триметилгидрозиний)пропионат - 0,133-0,267; изотонический раствор - остальное [патент РФ №2033152 С1. Средство для стимуляции гемопоэза. 1995. МПК А61К 31/15, А61К 31/70]. Средство позволяет существенно повысить незрелых и зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов и миелокариоцитов в костном мозге экспериментальных животных, получавших данный состав. В зависимости от соотношения ингредиентов содержание незрелых форм нейтрофильных гранулоцитов повышалось до 189-261%, зрелых нейтрофильных гранулоцитов - до 136-200%, общее количество миелокариоцитов у животных экспериментальной группы восстанавливалось до 106-118% от исходного уровня. Однако не установлено влияние указанного средства на количество лимфоцитов и лимфоцитарных клеток, а также ретикулярных клеток костного мозга.
Известно применение церулоплазмина для стимуляции гемопоэза при лучевой болезни у собак. Церуплазмин вводят капельно со скоростью 29-30 капель в минуту один раз в сутки в суточной дозе от 1,5 до 2,5 мг/кг массы тела животного. Курс лечения церуплазмином составляет 7 процедур с интервалом 47-48 часов. Установлено, что применение церулоплазмина на фоне лазерной остеоперфорации у собак происходит увеличение содержания в периферической крови эритроцитов в 1,29 раза от исходного уровня и снижение повышенного количества лейкоцитов в 1, 84 раза [патент РФ 2329791 С2. Способ стимуляции гемопоэза при лечении острой лучевой болезни у собак. 2006. МПК А61К 31/00 (2006.01)]. Недостатком известного средства является то, что его стимулирующее воздействие на гемопоэз ограничено увеличением эритроцитов и не распространяется на другие клеточные линии.
Для стимуляции миелопоэза вводят пегилированную гиалуронидазу в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней и дополнительно однократно внутривенно препарат, содержащий D-глюкуроновую кислоту, в дозе 2 мг/кг. Введение препарата на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии сопровождалось стимуляцией процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения. Отмечалось увеличение содержания кроветворных прекурсоров (КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) и морфологически распознаваемых клеточных элементов эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения в гемопоэтической ткани, а также количества зрелых клеток эритроидного и гранулоцитарного ряда в периферической крови. Способ позволяет ускорить регенеративные процессы гемопоэтической ткани, усиливая при этом миелопоэз [патент на изобретение РФ №2442589 С1. Способ стимуляции миелопоэза. 2012. МПК А61К 31/712 (2006.01), А61К 38/47 (2006.01), А61Р 43/00 (2006.01)]. Недостатком заявленного средства является его неэффективность для стимуляции пролиферации клеток лимфоцитарного звена.
Известно применение гиалуронидазы, иммобилизированной на низкомолекулярном полиэтиленгликоле, для стимуляции гемопоэза. Указанное средство вводят парентерально либо перорально 1 раз в сутки в течение 1-5 дней в дозе 10-1000 ЕД/кг [патент на изобретение РФ №2414926 С1. Гемостимулирующее средство и способ стимуляции гемопоэза. 2011. МПК А61К 38/43, А61К 41/00, А61К 47/48, А61Р 7/00]. Иммобилизированная гиалуронидаза оказывает выраженный стимулирующий эффект в отношении эритроидного, гранулоцитарного и мегакариоцитарного (тромбоцитарного) ростков кроветворения, однако не оказывает стимулирующего влияния на лимфоцитарное звено гемопоэза.
Недостатком перечисленных средств является также присутствие в препаратах компонентов ксеногенного происхождения.
Известно применение долихола и его эфиров в качестве активного компонента для стимулирования дифференцировки и пролиферации гемопоэтических стволовых клеток и улучшения гемопоэза при нарушении функций кроветворения [патент JP S6112622 (A). Agent for promoting differentiation and proliferation of hemopoietic stem cell. 1986. МПК A61K 31/045; A61P 7/00; C07C 27/00; C07C 33/02; C07C 67/00; C07C 69/145; (IPC1-7): A61K 31/045; С07С 33/02]. Эффективность средства ограничена его стимулирующим действием на эритроцитарное звено гемоэза, что обусловливает его использование для лечения старческой анемии.
Предложен препарат (3-интерферона для внутримышечного введения с целью стимуляции эритропоэза при нарушениях, связанных с недостаточным созреванием клеток предшественников крови в эритроциты [патент США 5104653. Use of human interferon-beta for stimulation of erythropoiesis. 1992]. Недостатком указанного средства является то, что оно стимулирует эритроцитарное звено гемопоэза и не оказывает более широкого стимулирующего действия на другие клеточные линии гемопоэза.
Известно использование ингибитора сфингозин киназы 2 (SphK2) для восстановления системы костно-мозгового гемопоза после лучевой терапии и химиотерапии [патент AU 2019101780 (А4). Use of SPHK2 inhibitor as drug for repairing bone marrow hematopoietic system injury or treating bone marrow hematopoietic dysfunction. 2021. МПК A01K 67/027; A61K 31/4409; A61K 31/7088; G01N 33/50; A61P 37/00; A61P 43/00; А61Р 7/00]. На экспериментальных животных (мыши) показано, что инъекция ингибитора SPHK2 АВС294640 позволяет значительно ускорить восстановление количества лейкоцитов и тромбоцитов после радиационной стимуляции, тромбоцитов после воздействия химиотерапевтических препаратов, восстановление количества лейкоцитов и тромбоцитов после трансплантации мышам гемопоэтических стволовых клеток костного мозга. Однако указанное средство не обеспечивает увеличение количества моноцитарных и лимфоцитарных клеток, лимфоцитов.
Предложено средство, стимулирующее гемопоэз у млекопитающих in vivo или в культуре стволовых клеток млекопитающих in vitro, включающее мутантный рекомбинантный гемоглобин либо композицию, включающую указанный гемоглобин и один или более гемопоэтических ростовых факторов (ГМКСФ, ГКСФ, интерлейкины 1-13 и др.) [патент США №5631219. Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin. 1997. МПК A61K 38/42 (20060101); A61K 38/41 (20060101); C12N 5/06 (20060101); A61K 038/16; A01N 061/00; A01N 001/02; G01N 033/20]. Недостатком известного средства является то, что его эффект ограничен действием гемоглобина или его комбинации с эритропоэтином на эритроидные клетки.
Известно средство, стимулирующее гемопоэз, включающее гибридный рекомбинантный белок, содержащий гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и эритропоэтин (ЕРО), слитые с помощью линкера. Установлено, что гибридный белок проявляет более выраженный эффект на дифференцировку эритроидного ростка в культуре гематопоэтических стволовых клеток костного мозга по сравнению с эквимолярной смесью несвязанных молекул GM-CSF и ЕРО [патент США 5916773. Recombinant production of fusion proteins comprising erythropoietin and GM-CSF components. 1999. МПК C07K 14/535; C07K 14/435; C07K 14/505; A61K 38/00; C07K 019/00; C12N 015/62; A61K 038/19]. Недостатком известного средство является то, что его эффект ограничен стимуляцией эритропоэза в культуре стволовых клеток.
Известен препарат, содержащий пептидные фрагменты а 1-антитрипсина, стимулирующие образование ретикулоцитов. Этот фактор можно выделить и очистить из человеческой плазмы. Он обладает высокой способностью стимулировать генерацию ретикулоцитов у мышей. Фактор роста ретикулоцитов можно применять для изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения тяжелой анемии [патент РФ 2703176 С2. Фактор роста ретикулоцитов, способ его получения и применения. 2014. МПК С07К 14/475 (2006.01), С07К 14/505 (2006.01), А61Р 7/06 (2006.01)]. Недостатком данного средства является то, что оно обладает избирательным действием на генерацию ретикулоцитов и не оказывает комплексного воздействия на другие гемопоэтические ростки.
Известно, что сывороточные липопротеины высокой плотности (ЛПВП), помимо участия в обратном транспорте холестерина из периферических тканей в печень, оказывают важное регуляторное влияние на функции клеток разных органов и тканей организма [White R., Giordano S. and Datta G. Role of HDL-Associated Proteins and Lipids in the Regulation of Inflammation. In.: Advances in Lipoprotein Research., 2017, http://dx.doi.org/10.5772/67141]. Механизм регуляторного действия ЛПВП связывают с наличием на поверхности липопротеиновой частицы белкового компонента - аполипопротеина A-I (АпоА-I) [Nofer J.R. Signal transduction by HDL: agonists, receptors, and signaling cascades. Handb Exp Pharmacol. 2015, 224, pp. 229-256. doi: 10.1007/978-3-319-09665-0 6; Mangara M et al., Apolipoprotein A-I: A Molecule of Diverse Function. Ind J Clin Biochem, 2016. 31(3), pp. 253-259. DOI 10.1007/s12291-015-0513-l]. Основная часть данного белка находится в связанном с липидами состоянии в составе ЛПВП.
Известно, что как ЛПВП, так и изолированный АпоА-I стимулируют пролиферацию клеток костного мозга in vitro, но по сравнению с исходными частицами ЛПВП изолированный апоА-I оказывает более выраженный стимулирующий эффект in vitro [Usynin I.F., Dudarev A.N., Gorodetskaya A. Yu., Miroshnichenko S. M., Tkachenko T. A., Tkachenko V. I. Apolipoprotein A-I Stimulates Cell Proliferation in Bone Marrow Cell Culture // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2018. Vol. 164, P. 308-311. https://doi.org/10.1007/s10517-018-3978-0.]. В культуре клеток костного мозга апоА-1 стимулирует пролиферацию моноцитарных (монобласты, промоноциты) и гранулоцитарных (миелобласты, промиелоциты) прогениторных клеток, а также стромальных клеток костного мозга. Однако пролиферативный эффект апоА-1 недостаточно выражен, в том числе в отношении полихроматофильных и оксифильных нормоцитов, клеток моноцитарного ростка (монобласты, промоноциты и Ring-клетки) и клеток лимфоцитарного ростка (лимфобласт, пролимфоцит, лимфоцит) и не показан его эффект на пролиферацию клеток костного мозга in vivo. Данное средство выбрано в качестве прототипа.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышение эффективности средства, стимулирующего пролиферативную активность клеток костного мозга in vitro и in vivo.
Решение изобретательской задачи достигается тем, что предложено средство, включающее комплекс АпоА-I и тетрагидрокортизола (ТГК), полученный путем совместной инкубации белка АпоА-I в изотоническом фосфатно-солевом буфере (рН 7.4) в присутствии гормона ТГК в течение 15 мин при температуре 22±2°С в соотношении белка и гормона, выраженное в мкг как АпоА-I :ТГК=20:1.
Техническим результатом является повышение пролиферативной активности клеток костного мозга in vivo и повышение пролиферативной активности клеток костного мозга в отношении полихроматофильных и оксифильных нормоцитов клеток моноцитарного ростка (монобласты, промоноциты и Ring-клетки) и клеток лимфоцитарного ростка (лимфобласт, пролимфоцит, лимфоцит) in vitro.
Раскрытие сущности изобретения
Средство для стимуляции пролиферативной активности костного мозга представляет собой комплекс АпоА-I и ТГК, полученный путем совместной инкубации в изотоническом фосфатно-солевом буфере (рН 7.4) белка АпоА-I и гормона ТГК в течение 15 мин при температуре 22±2°С в соотношении АпоА-I :ТГК=20:1, выраженном в мкг.
Для получения АпоА-I используют фракцию липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), выделенную из плазмы крови здоровых доноров. Способ получения АпоА-I описан в примере 1.
В качестве второго компонента комплекса может быть использован коммерчески доступный препарат тетрагидрокортизол (ТГК), полученный путем синтеза с высокой степенью очистки от примесей, например, ТГК производства компании Research Plus, Inc., (США). ТГК является метаболитом кортизола и выявляется у здоровых людей в плазме крови и моче. Он имеет молекулярную массу 366,5 и эмпирическую формулу С21Н34О5.
Образование комплекса ТГК с АпоА-I путем совместной инкубации в изотоническом фосфатно-солевом буфере подтверждают методом тушения флуоресценции триптофана, как описано в примере 2.
Для стимуляции пролиферативной активности клеток костного мозга in vivo данный комплекс вводят в терапевтически эффективных дозах внутривенно для получения быстрых терапевтических эффектов, как показано в примере 3, однако возможно и подкожное введение для получения долгосрочных терапевтических эффектов.
Для стимуляции пролиферативной активности клеток костного мозга in vitro заявленный комплекс вводят в первичную культуру клеток костного мозга в бессыворотной питательной среде, как описано в примерах 4-6, что позволяет также определить пролиферацию отдельных клеточных линий костного мозга.
Перечень фигур
Фиг. 1. Электрофореграмма суммарной фракции ЛПВП и АпоА-I, выделенных из сыворотки крови человека с помощью процедуры, описанной в примере 1. Обозначения: 1 - АпоА-I ; 2 - ЛПВП; 3 - белки-стандарты.
Фиг. 2. Тушение собственной триптофановой флуоресценцию АпоА-I (0,1 мг/мл) при образовании комплексов с ТГК (а) и кортизолом (б).
Фиг. 3. Графики Штерна-Фольмера для вычисления констант связывания (Kb) на основании концентрационного тушения триптофановой флуоресценции АпоА-I при добавлении возрастающих концентраций ТГК (а) и кортизола (б). Примечание: По оси ординат - отношение максимальной флуоресценции белка в отсутствие лиганда [F0] к интенсивности флуоресценции белка после добавления лиганда [F]. По оси абсцисс -концентрация лигандов [Q]. R - коэффициент корреляции Пирсона.
Фиг. 4. Влияние заявленного средства (комплекс АпоА-I -ТГК) на пролиферативную активность клеток костного мозга, культивируемых в бессывороточной среде в течение 24 ч. Примечание: Для сравнения представлены результаты влияния на данный показатель исходных компонентов комплекса (АпоА-I и ТГК), а также кортизола и комплекса АпоА-I-кортизол, альбумина и комплекса альбумина с ТГК. * - Статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05).
Осуществление изобретения
Пример 1. Получение белка АпоА-I из сыворотки крови человека и его биохимическая характеристика.
Из 50-100 мл сыворотки крови человека выделяют фракцию липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) методом изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе KBr при 105000 g [Mills G.L., Lane P.A., Weech P.K. In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology: a guidebook to lipoprotein technique / Eds. R.H. Burdon, R.H. Knippenberg P.H. Elsevier, Amsterdam, 1984. - P. 18-116]. Из полученной фракции ЛПВП удаляют липиды смесью бутанола с диизопропиловым эфиром [Cham В.Е., Knowlee B.R. A solvent system for delipidation of plasma or serum without protein precipitation / J. Lipid Res. 17. - 1976. - P. 176-181]. Из полученной белковой фракции выделяют основной белок ЛПВП, используя метод высаливания сульфатом аммония с последующим растворением белка в 6 М мочевине и его ренатурацией с помощью диализа против фосфатно-солевого буфера (рН 7.4) в течение 24 ч [Jiang L., Неа L., Fountoulakis М. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis / Journal of Chromatography A, 1023. - 2004. - P. 317-320; Пыхтина М.Б., Иванов И.Д., Беклемишев А.Б. Разработка эффективных способов выделения аполипопротеина A-I из плазмы крови человека. Биофарм. журн. - 2012. - Т. 4. - №6. - С. 37-45.]. Полученный концентрированный белок фильтруют через одноразовые стерильные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, что позволяет отделить не только потенциально содержащиеся микроорганизмы, но и агрегаты белка. Чистоту выделенного белка и его молекулярную массу оценивают с помощью электрофореза в ПААГ по методу Лэмли, используя набор белковых маркеров. На основании литературных данных о молекулярной массе белков, входящих в состав ЛПВП [Sakata N., Hoshii Y., Nakamura Т., Kiyama M., Arai H., Omoto M., Morimatsu M., Ishihara Т. Colocalization of apolipoprotein AI in various kinds of systemic amyloidosis / J. Histochem Cytochem. 2005. - Feb; 53. - P. 237-42.], делают вывод о соответствии выделенного белка аполипопротеину A-I (АпоА-I). Как видно из фиг. 1, используемый метод позволяет очистить АпоА-I от альбумина и минорных белков ЛПВП. С помощью данного способа из 100 мл сыворотки крови человека можно получить не менее 40 мг очищенного АпоА-I .
Пример 2. Получение комплекса АпоА-I с ТГК и определение константы связывания ТГК с АпоА-I .
Для получения заявленного средства очищенный АпоА-I, полученный как указано в примере 1, разводят в изотоническом фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (рН 7.4) до концентрации 2-5 мг/мл.
На основе коммерческого препарата ТГК готовят концентрированный раствор ТГК в смеси органических растворителей - спирта и диметилсульфоксида в соотношении 1:1 и хранят при -20°С. Перед приготовлением комплекса АпоА-I с ТГК концентрированный раствор ТГК разводят до рабочей концентрации 100 мкг/мл в изотоническом фосфатно-солевом буфере (рН 7.4).
Указанные растворы АпоА-I и ТГК в фосфатно-солевом буфере смешивают в пропорциях, обеспечивающих соотношение АпоА-I :ТГК, равное 20:1, выраженное в мкг, и инкубируют в течение 15 мин при температуре 22±2°С.
Окончательное содержание органических растворителей при инкубации смеси АпоА-I и ТГК не превышает 0,5%.
Для подтверждения образования комплекса АпоА-I с ТГК оценивают взаимодействие ТГК с АпоА-I методом тушения (снижения) флуоресценции триптофана [Lakowicz J.R. // Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. Springer, Boston, MA, 2006]. Для сравнения в аналогичных условиях анализируют взаимодействие кортизола (активная форма стероидного гормона) с АпоА-I. Для этой цели измеряют интенсивность флуоресценции раствора АпоА-I в отсутствие и в присутствии возрастающих концентраций гормонов (кортизола или ТГК), выступающих в качестве тушителей флуоресценции. Титрование проводят в термостатируемой (37°С) кварцевой кювете, содержащей 100 мкг АпоА-I в 1 мл фосфатно-солевого буфера (рН 7.4). После добавления каждой аликвоты гормона к раствору АпоА-I содержимое кюветы интенсивно перемешивают и проводят измерение несколько раз до достижения максимального снижения флуоресценции. Флуоресценцию триптофановых остатков АпоА-I регистрируют на спектрофлуориметре RF-5301 (Shimadzu, Япония) при длине волны возбуждения 280 нм и испускания (эмиссии) в диапазоне 300-500 нм. Вклад растворителя без гормона в интенсивность флуоресценции составляет не более 1.5% и не изменяется в исследуемом диапазоне волн 300-500 нм.
Как известно, аминокислотная последовательность АпоА-I (28 кДа) состоит из 243 аминокислот, включая триптофан [Gursky О., Atkinson D. Thermal unfolding of human high-density apolipoprotein A-l: implications for a lipid-free molten globular state // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 2991-2995]. Анализ спектральных свойств показал, что исходный спектр флуоресценции АпоА-I имеет максимум при 336 нм (фиг. 2). При регистрации спектров в присутствии возрастающих концентраций гормонов максимум спектра флуоресценции АпоА-I не изменялся (фиг. 2). Наблюдаемое снижение интенсивности флуоресценции АпоА-I в ответ на увеличение концентрации гормонов свидетельствует о формировании комплексов АпоА-I -ТГК или АпоА-I - кортизол.
В данном примере наибольшее снижение флуоресценции триптофана обнаружено у АпоА-I под влиянием кортизола. Различия, обнаруженные между влиянием гормонов на спектральные характеристики белков, можно объяснить разной способностью гормонов проникать во внутренние области белка. Менее выраженное снижение флуоресценции АпоА-I под влиянием ТГК, вероятно, связано с тушением остатков триптофана преимущественно на поверхности данного белка и отражает неспособность ТГК проникать во внутренние области белка.
Расчет констант связывания (Kb) гормонов проводят с помощью уравнения Штерна-Фольмера: F0 / F=1 - Kb × [Q]. Для определения Kb измеряют интенсивность флуоресценции АпоА-I в отсутствие (F0) и в присутствии (F) различных концентраций [Q] кортизола или ТГК, но при постоянной концентрации АпоА-I [Lakowicz J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. Springer, Boston, MA, 2006.]. На основании кривых тушения флуоресценции триптофана рассчитывают константы связывания, которые составили для комплекса АпоА-I - кортизол - (1.0±0.1) × 103 м-1 и для комплекса АпоА-I -ТГК-(3.1±0.4) × 102 М-1 (фиг. 3).
Как известно, взаимодействие гормонов с белком может сопровождаться конформационными изменениями последнего. Например, изменение вторичной структуры человеческого альбумина в сторону снижения доли α-спиралей зарегистрировано при его взаимодействии с тестостероном [Chanphai P., Vesper A.R., Bariyanga J., Tajmir-Riahi H.A. Review on the delivery of steroids by carrier proteins // J. Photochem. Photobiol. B. 2016. V. 161. P. 184-191], дексаметазоном [Naik P.N., Chimatadar S.A., Nandibewoor S.T. Interaction between a potent corticosteroid drug -Dexamethasone with bovine serum albumin and human serum albumin: A fluorescence quenching and fourier transformation infrared spectroscopy study // J. Photochem. Photobiol. B. 2010. V. 100. P. 147-159.] и прогестероном [Abu Teir M.M., Ghithan J.H., Darwish S.M., Abu-Hadidal M.M. Study of Progesterone interaction with Human Serum Albumin: Spectroscopic approach // J. Appl. Biol. Sci. 2011. V. 5. P. 35-47].
Используя инфракрасную Фурье-спектроскопию, ранее нами было показано, что при инкубации АпоА-I в присутствии ТГК происходит дозозависимое снижение содержания α-спиралей и увеличение содержания β-поворотов в АпоА-I. Под влиянием кортизола, напротив, количество а-спиралей в АпоА-I возрастало, а β-поворотов - снижалось [Дударев А. Н., Городецкая А.Ю., Ткаченко Т.А., Усынин И.Ф. Влияние кортизола и тетрагидрокортизола на вторичную структуру АпоА-I по данным инфракрасной Фурье-спектроскопии // Биоорганическая химия, 2021, том 47, №6, с. 785-794]. Эти результаты позволяют предполагать, что конформационные изменения АпоА-I, происходящие под влиянием стероидных гормонов в процессе комплексообразования, могут приводить к изменению акцепторных и регуляторных свойств данного белка.
Пример 3. Оценка влияние заявленного комплекса АпоА-I -ТГК на пролиферативную активность клеток костного мозга у интактных животных и в разные сроки после острой кровопотери.
Острая кровопотеря является одной из причин смертности при техногенных и природных катастрофах, во время военных конфликтов, а также при проведении оперативных вмешательств. Эффективность лечения острой кровопотери зависит как от средств ее возмещения, так и от объема трансфузионной терапии. Возмещение утраченной крови адекватным количеством донорской крови в настоящее время считается патогенетически и патофизиологически необоснованным. Показаниями к проведению гемотрансфузии при острой кровопотере являются лишь угрожающие жизни анемия и гипопротеанемия. Во всех остальных случаях предпочтение отдается кровезаменителям, компонентам и препаратам крови [Кузнецов Н.Л. Современные технологии лечения острой кровопотери. 2003, Consilium Medicum. Т. 5., №6. С. 347-357]. К числу последних могут быть отнесены стимуляторы пролиферации клеток костного мозга. В связи с этим, демонстрация эффективности влияния заявленного комплекса АпоА-I - ТГК на пролиферативную активность клеток костного мозга in vivo осуществлена на модели острой кровопотери.
Описание модели острой кровопотери
Для доказательства влияния заявленного комплекса на пролиферативную активность костного мозга in vivo используют модель острой кровопотери. Для этого под общим эфирным наркозом из ретроорбитального синуса животного с помощью гематокритного капилляра или пастеровской пипетки однократно отбирают 0,5 мл крови [Sadahira Y. et al. Impaired splenic erythropoiesis in phlebotomized mice injected with CL2MDP-liposome: an experimental model for studying the role of stromal macrophages in erythropoiesis. 2000. J. Leukoc. Biol. 68: 464÷470].
Испытания проводят в несколько серий опытов, каждая из которых имеет свой контроль (таблица 1). В работе используют здоровых половозрелых мышей-гибридов (CBA×C57BL/6) F1 (CBF1), 10-12- недельного возраста, массой 25±2 г. Контрольные и опытные животные содержатся в виварии в стандартных пластиковых клетках на стандартном рационе. Все исследования проводятся в одно и то же время суток. Хирургические манипуляции с экспериментальными животными проводят под ингаляционным эфирным наркозом в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных (Страсбург, 1986) и одобренные комитетом по биомедицинской этике ФИЦ ФТМ. Оценку различий между выборками проводят с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни [Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1998. - 459 с.].
Заявленный комплекс готовят согласно примеру 2 и вводят в хвостовую вену мышей из расчета 15 мг АпоА-I в составе указанного средства на 1 кг массы тела животного сразу после проведения кровопотери (группа 2 и 4) (таблица 1). Одновременно контрольным животным (группа 1 и 3) вводят внутривенно эквивалентный объем фосфатно-солевого буфера (ФСБ).
Метод оценки влияния заявленного средства на пролиферативную активность клеток костного мозга животных при кровопотере
Пролиферативную активность костного мозга оценивают через 5 и 24 ч после проведения кровопотери. Для этого за 60 мин до забоя животным внутрибрюшинно вводят меченый предшественник [3Н]-тимидин («Изотоп», Россия) из расчета 1,5 мкКю на 1 г массы тела. Клетки костного мозга получают из бедренной кости стандартным методом [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск. - 1992.]. После лизиса клеток полученный гомогенат наносят на фильтры, которые проходят многоэтапную отмывку от не связавшейся метки. Радиоактивность проб измеряют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика [Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. 288 с.]. Скорость включения [3Н]-тимидина в ДНК клеток костного мозга оценивают в имп/мин на 1 мг белка гомогената.
Результаты оценки влияния заявленного средства на пролиферативную активность клеток костного мозга in vivo при кровопотере
Как видно из таблицы 1, внутривенное введение мышам заявленного комплекса ТГК-АпоА-I сопровождается возрастанием скорости включения [3Н]-тимидина в ДНК клеток костного мозга через 5 и 24 ч на 22% и 42%, соответственно. Скорость биосинтеза ДНК в течение первых 5 ч после кровопотери достоверно не изменялась, а через 24 ч возрастала на 30%. Инъекция комплекса на фоне кровопотери через 24 ч приводила к увеличению пролиферативной активности клеток костного мозга на 74% по сравнению с интактными животными и на 34% по сравнению с животными, которым не вводили комплекс (группа 3).
Таким образом, использование комплекса АпоА-I -ТГК позволяет повысить пролиферативную активность клеток костного мозга in vivo.
Пример 4. Получение культуры клеток костного мозга для оценки влияния заявленного средства на пролиферативную активность клеток костного мозга in vitro.
Для демонстрации эффективности заявленного средства на пролиферативную активность клеток костного мозга используют первичную культуру клеток костного мозга экспериментальных животных. Клетки получают из бедренной кости крыс линии Wistar стандартным методом [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск. - 1992.]. Очистку костного мозга от эритроцитов и лейкоцитов проводят с помощью противоточного центрифугирования в элютриаторном роторе JE-5.0 центрифуги Avanti J-26XP («Beckman Coulter», США) при 2500 об/мин и скорости тока жидкости 14 мл/мин.
Полученную суспензию клеток, содержащую не более 10% эритроцитов и лимфоцитов, культивируют в 24-луночных планшетах (2-5×106 клеток на 1 лунку) в бессывороточной среде RPMI-1640 в присутствии заявленного средства. Культивирование клеток проводят в СО2 - инкубаторе («Cole Panner», США) в атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха, при температуре 37°С.
Пример 5. Метод оценки влияния заявленного средства на пролиферативную активность клеток костного мозга в культуральной среде
Пролиферативную активность клеток костного мозга определяют по включению радиоактивно меченого предшественника [Н]-тимидина («Изотоп», Россия) в ДНК [Dawson C.W., Young L.S. In vitro assays to study epithelial cell growth / Methods Mol Biol. -2001. - Vol. 174. - P. 165-172.]. Данный показатель отражает скорость биосинтеза ДНК, что лежит в основе пролиферативной активности клеток, т.к. [3Н]-тимидин включается в ДНК в синтетической фазе (S-фазе) клеточного цикла. Для оценки данного показателя за 2 ч до окончания инкубации клеток костного мозга в культуральную среду вносят по 2,0 мкКю/мл меченого предшественника [3Н]-тимидина. После лизиса клеток костного мозга гомогенат клеток наносят на фильтры, которые проходят многоэтапную отмывку от не связавшейся метки. Радиоактивность проб измеряют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика [Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. 288 с.]. Скорость включения меченого предшественника оценивают в импульсах (имп) в 1 мин на 106 клеток или в % по отношению к контролю. Результаты представляют как среднее значение ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов, выполненных в трех параллелях. Оценку различий между выборками проводят с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни [Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1998. - 459 с.].
Пример 6. Влияние заявленного средства на пролиферативную активность клеток костного мозга при их культивировании в бессывороточной среде
На фиг. 4 дано сравнение пролиферативной активности клеток костного мозга при культивировании в присутствии заявленного средства (комплекс АпоА-I -ТГК) и компонентов заявленного средства раздельно (АпоА-I и ТГК). Для сравнения представлены данные о влиянии в этих условиях сывороточного человеческого альбумина и его комплекса с ТГК, а также кортизола и его комплекса с АпоА-I. Комплексы приготовлены согласно примеру 2. Культура клеток костного мозга получена согласно примеру 4. Оценка пролиферативной активности клеток костного мозга выполнена согласно примеру 5. Для доказательства наиболее выраженного эффекта заявленного средства по сравнению с эффектами его компонентов использовали эквивалентное содержание всех компонентов в культуральной среде.
Как видно из фиг. 4, культивирование клеток костного мозга в бессывороточной питательной среде RPMI-1640 в присутствии альбумина (10 мкг/мл) или ТГК (0,5 мкг/мл) или их комплекса не оказывало статистически значимого влияния на пролиферативную активность клеток костного мозга. Добавление в культуральную среду кортизола (0,5 мкг/мл) или АпоА-I (10 мкг/мл) приводило к повышению скорости синтеза ДНК в 1,8 и 2,6 раза, соответственно. Еще более выраженный эффект на данный показатель обнаружен при культивировании клеток костного мозга в присутствии комплекса АпоА-I -ТГК (10 мкг/мл АпоА-I и 0,5 мкг/мл ТГК): скорость включения [3Н]-тимидина в ДНК в присутствии данного комплекса была в 1,8 раз выше, чем в присутствии одного АпоА-I и в 4,7 раз выше, чем в контроле (без добавок). Следует отметить, что в отличие от комплекса АпоА-I -ТГК, инкубация клеток костного мозга в присутствии комплекса АпоА-I -кортизол (10 мкг/мл АпоА-I и 0,5 мкг/мл кортизола) приводила к снижению скорости биосинтеза ДНК в 1,6 раза по сравнению с эффектом АпоА-I (фиг. 4).
Механизм влияния стероидных гормонов на конформацию АпоА-I не изучен, и поэтому полученный максимальный эффект комплекса сывороточного АпоА-I -ТГК на функциональную активность клеток костного мозга с очевидностью не вытекает из уровня техники.
Пример 7. Влияние заявленного средства на изменение клеточного состава клеток костного мозга при их культивировании в бессывороточной среде.
Костный мозг состоит из чрезвычайно гетерогенной популяции клеток, включающей клетки ретикулярной стромы, кроветворные клетки костного мозга и клетки крови на различных этапах дифференцировки [Гаврилов О.К., Козинец Г.И., Черняк Н.Б. Клетки костного мозга и периферической крови. М.: Медицина, 1985. 288 с.]. Для идентификации разных типов клеток костного мозга готовят мазки клеток и окрашивают по методу Романовского-Гимза [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск. - 1992]. Учитывая морфологические особенности некоторых типов клеток костного мозга крысы, проводят дифференциальный анализ клеточного состава культивируемых клеток [Bolliger А.P. Cytologic evaluation of bone marrow in rats: indications, methods, and normal morphology. // Vet. Clin Pathol. 2004. Vol. 33, N 2. P. 58-67]. Подсчитывают не менее 1000 клеток и вычисляют процент каждого вида клеток костного мозга для составления миелограммы.
Культуру клеток костного мозга готовят, как описано в примере 4. Комплекс АпоА-I -ТГК готовят согласно примеру 2. После культивирования клеток в течение 24 ч в присутствии заявленного средства готовят мазки клеток костного мозга и анализируют миелограмму.
Как видно из таблицы 2, культивирование клеток костного мозга в присутствии заявленного средства сопровождается достоверно более значительным в сравнении с прототипом пролиферативным эффектом, заключающимся в достоверном увеличении количества полихроматофильных и оксифильных нормоцитов, клеток моноцитарного ростка (монобласты, промоноциты и Ring-клетки), клеток лимфоцитарного ростка (лимфобласт, пролимфоцит, лимфоцит), ретикулярных клеток, а также в некотором увеличении количества эритроцитов и ретикулоцитов, эозинофильных гранулоцитов, мегакариоцитов. При этом возрастает в 3,5 раза процентное содержание полихроматофильных и оксифильных нормоцитов, в 2,3 раза - клеток моноцитарного ростка (монобласты, промоноциты и Ring-клетки) и в 1,8 раза - клеток лимфоцитарного ростка (лимфобласт, пролимфоцит, лимфоцит).
Добавление в культуру клеток костного мозга только АпоА-I вызывало подобные, но менее выраженные изменения (табл. 2). Напротив, в этих условиях относительное содержание моноцитов и макрофагов снижалось, а содержание эритроцитов, клеток гранулоцитарного ростка, тучных клеток и мегакариоцитов не изменялось. Вероятно, для созревания клеток этих ростков необходимо присутствие в культуральной среде специфических ростовых факторов. Например, известно, что для формирования эритроидных островков и предотвращения апоптоза эритроидных предшественников необходимо постоянное присутствие в окружающей микросреде эритропоэтина [Sadahira Y., Mori М. Role of the macrophage in erythropoiesis. Pathol. Inter., 1999, 49, 841-848].
Таким образом, использование комплекса АпоА-I - ТГК позволяет повысить пролиферативную активность клеток костного мозга in vitro при культивировании клеток в бессывороточной среде, содержащей данный комплекс, а также in vivo с помощью внутривенного введения комплекса в организм на фоне нестимулированного или стимулированного кроветворения в костном мозге. Учитывая, что стимулирующий эффект комплекса АпоА-I - ТГК достигается при небольшой концентрации сывороточного АпоА-I, это позволяет использовать в составе комплекса АпоА-I, выделенный из сыворотки крови донора, одновременно являющегося реципиентом, что обеспечит практически безопасную персонифицированную терапию у больных при кровопотерях, после проведения химиотерапии и в других случаях, когда возникает необходимость стимуляции пролиферации клеток костного мозга различных линий.
Установленный эффект заявленного средства открывает также перспективы для применения культуры клеток костного мозга в бессывороточной питательной среде для клеточной терапии, при этом предпочтительным является включение в состав питательной среды комплекса АпоА-I -ТГК, полученного с использованием АпоА-I донора, одновременно являющегося реципиентом клеток костного мозга.
Работа выполнена в рамках выполнения государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (регистрационный номер 1021050400914-1-1.6.4) с использованием оборудования ЦКП «Спектрометрические измерения» и ЦКП «Протеомный анализ», поддержанного финансированием Минобрнауки России (соглашение №075-15-2021-691).
Claims (2)
1. Применение комплекса аполипопротеина A-I и тетрагидрокортизола в качестве средства для стимуляции пролиферативной активности клеток костного мозга.
2. Способ получения комплекса аполипопротеина A-I и тетрагидрокортизола по п.1, включающий совместную инкубацию в изотоническом фосфатно-солевом буфере с рН 7.4 аполипопротеина A-I и тетрагидрокортизола в соотношении 20:1, выраженном в мкг, при температуре 22±2°С в течение 15 мин.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2811901C1 true RU2811901C1 (ru) | 2024-01-18 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5631219A (en) * | 1994-03-08 | 1997-05-20 | Somatogen, Inc. | Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5631219A (en) * | 1994-03-08 | 1997-05-20 | Somatogen, Inc. | Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin |
Non-Patent Citations (1)
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69634982T2 (de) | Verfahren zur steigerung von hematopoietischen zellen | |
Gamble | The effects of phytohemagglutinin on mouse spleen cells in vivo | |
US5906984A (en) | Methods of using aminothiols to promote hematopoietic progenitor cell growth | |
JP5759988B2 (ja) | 貧血および赤血球機能不全を治療するためのlcatの使用 | |
CN115066491A (zh) | 细胞外囊泡及其用途 | |
US5258367A (en) | Uteroferrin and rose proteins for stimulating hematopoietic cells | |
Murphy et al. | In vitro aspects of erythropoiesis | |
RU2811901C1 (ru) | Средство для стимуляции пролиферативной активности клеток костного мозга | |
JPH0680568A (ja) | 抗レトロウイルス療法に伴う毒性を減少または阻止する方法 | |
US6258352B1 (en) | Compositions and methods of treating thrombocytopenia with IL-15 | |
US20230146680A1 (en) | Method for producing enhanced anti-inflammatory / anti-catabolic agents from autologous physiological fluid | |
US20080206196A1 (en) | Differentiation of cord blood into neural like cells, and method to treat neurological condition patients | |
JPH06340553A (ja) | 骨髄形成不全の軽減または防止法 | |
RU2301071C1 (ru) | Гепатопротекторное средство и способ его получения | |
EA010735B1 (ru) | Средство, нормализующее репродуктивную функцию у мужчин, и способ его получения | |
Brodsky et al. | Acquired sideroblastic anaemia following progesterone therapy | |
McDonald et al. | Effects of thrombopoietin and erythropoietin on platelet production in rebound‐thrombocytotic and normal mice | |
RU2801099C1 (ru) | Препарат, содержащий человеческий альбумин, и способ его получения | |
RU2301072C1 (ru) | Средство, нормализующее функции кровеносных сосудов, и способ его получения | |
Kovacevic et al. | Erythroid progenitor cells from pig bone marrow and peripheral blood | |
RU2392947C1 (ru) | Способ получения клеточного материала для трансплантации при миелосупрессии | |
RU2302867C1 (ru) | Средство, нормализующее тонус мочевого пузыря, и способ его получения | |
US20040170697A1 (en) | Amniotic apoptosis modulating substances | |
CN117243975A (zh) | 人脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备促进免疫制剂中的应用 | |
RU2620069C2 (ru) | Вещество и способ модуляции пролиферации и дифференцировки регуляторных, стволовых и других соматических клеток |