JPH05130863A - サイトカイン活性化マクロフア−ジ - Google Patents
サイトカイン活性化マクロフア−ジInfo
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- JPH05130863A JPH05130863A JP3296567A JP29656791A JPH05130863A JP H05130863 A JPH05130863 A JP H05130863A JP 3296567 A JP3296567 A JP 3296567A JP 29656791 A JP29656791 A JP 29656791A JP H05130863 A JPH05130863 A JP H05130863A
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- JP
- Japan
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- cytokine
- cells
- monocytes
- activated
- macrophages
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＬＡＫ細胞誘導の際に抑制的に働くと考えら
れていたヒト末梢血から単離した単球を、未分化の状態
からインタ−ロイキン−２と単球／マクロファ−ジの分
化又は活性化に関与するその他のサイトカインの存在
下、ヒト血清含有栄養培地中で培養することにより広範
囲の腫瘍細胞に対して高い細胞傷害活性を有するマクロ
ファ−ジを得る。 【構成】 ヒト末梢血から単離した単球を、インタ−ロ
イキン−２と単球／マクロファ−ジの分化又は活性化に
関与するその他のサイトカインの存在下にヒト血清含有
栄養培地を用いて長期間培養し、培養液中に生成したサ
イトカイン活性化マクロファ−ジを分離、採取する。
れていたヒト末梢血から単離した単球を、未分化の状態
からインタ−ロイキン−２と単球／マクロファ−ジの分
化又は活性化に関与するその他のサイトカインの存在
下、ヒト血清含有栄養培地中で培養することにより広範
囲の腫瘍細胞に対して高い細胞傷害活性を有するマクロ
ファ−ジを得る。 【構成】 ヒト末梢血から単離した単球を、インタ−ロ
イキン−２と単球／マクロファ−ジの分化又は活性化に
関与するその他のサイトカインの存在下にヒト血清含有
栄養培地を用いて長期間培養し、培養液中に生成したサ
イトカイン活性化マクロファ−ジを分離、採取する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はサイトカイン活性化マク
ロファ−ジの新規な製造方法に関し、更に詳細には、ヒ
ト末梢血から単離した単球を、インタ−ロイキン−２
（Interleukin-2:ＩＬ−２）と単球／マクロファ−ジの
分化又は活性化に関与するその他のサイトカインの存在
下にヒト血清含有栄養培地を用いて培養し、培養液中に
生成したサイトカイン活性化マクロファ−ジを分離、採
取することを特徴とするサイトカイン活性化マクロファ
−ジの新規な製造方法、および該方法により得られるサ
イトカイン活性化マクロファ−ジに関する。
ロファ−ジの新規な製造方法に関し、更に詳細には、ヒ
ト末梢血から単離した単球を、インタ−ロイキン−２
（Interleukin-2:ＩＬ−２）と単球／マクロファ−ジの
分化又は活性化に関与するその他のサイトカインの存在
下にヒト血清含有栄養培地を用いて培養し、培養液中に
生成したサイトカイン活性化マクロファ−ジを分離、採
取することを特徴とするサイトカイン活性化マクロファ
−ジの新規な製造方法、および該方法により得られるサ
イトカイン活性化マクロファ−ジに関する。
【０００２】
【従来の技術】腫瘍に対する免疫療法の一つとして、サ
イトカインなどの生体反応修飾物質（Biological Respo
nse Modifier:ＢＲＭ）で活性化又は増殖させた末梢血
リンパ球や腫瘍組織浸潤リンパ球を使用することは従来
から公知であり、特にマウスの実験系において優れた抗
腫瘍効果が認められていることが報告されている（J.Im
munology,132,2123-2128,1984及びJ.Exp.Med.,156,385-
397,1982など）。
イトカインなどの生体反応修飾物質（Biological Respo
nse Modifier:ＢＲＭ）で活性化又は増殖させた末梢血
リンパ球や腫瘍組織浸潤リンパ球を使用することは従来
から公知であり、特にマウスの実験系において優れた抗
腫瘍効果が認められていることが報告されている（J.Im
munology,132,2123-2128,1984及びJ.Exp.Med.,156,385-
397,1982など）。
【０００３】米国国立癌研究所（ＮＣＩ）のRosenberg
らは、抗原刺激を加えていない末梢血リンパ球にＩＬ−
２を加えることによって高い抗腫瘍活性を有する細胞が
誘導されることを報告している（Science,223,1412-141
5,1984）。該細胞は抗原刺激を必要とせず、主要組織適
合遺伝子複合体（Major Histocompatibility Complex:
ＭＨＣ）に規定されない広範囲の抗腫瘍活性を有するこ
と、並びに該細胞を誘導する場合にはＩＬ−２の存在が
必要十分な条件であるとして、彼らは誘導された細胞に
対しリンホカイン活性化キラ−（Lymphokine Activated
Killer:ＬＡＫ）細胞と命名した。（J.Exp.Med.,155,1
823-1841,1982）。
らは、抗原刺激を加えていない末梢血リンパ球にＩＬ−
２を加えることによって高い抗腫瘍活性を有する細胞が
誘導されることを報告している（Science,223,1412-141
5,1984）。該細胞は抗原刺激を必要とせず、主要組織適
合遺伝子複合体（Major Histocompatibility Complex:
ＭＨＣ）に規定されない広範囲の抗腫瘍活性を有するこ
と、並びに該細胞を誘導する場合にはＩＬ−２の存在が
必要十分な条件であるとして、彼らは誘導された細胞に
対しリンホカイン活性化キラ−（Lymphokine Activated
Killer:ＬＡＫ）細胞と命名した。（J.Exp.Med.,155,1
823-1841,1982）。
【０００４】その後、遺伝子組換えの技術により組換え
ＩＬ−２の入手が容易になったことから（Nature,302,3
05-310,1983）、ＬＡＫ細胞を用いた腫瘍に対する免疫
療法の一つである、いわゆる養子免疫療法の臨床的な応
用が開始され、その有用性が認められるようになってき
た（N.Engl.J.Med.,313,1485-1492,1985及びN.Engl.J.M
ed.,316,898-905,1987など）。
ＩＬ−２の入手が容易になったことから（Nature,302,3
05-310,1983）、ＬＡＫ細胞を用いた腫瘍に対する免疫
療法の一つである、いわゆる養子免疫療法の臨床的な応
用が開始され、その有用性が認められるようになってき
た（N.Engl.J.Med.,313,1485-1492,1985及びN.Engl.J.M
ed.,316,898-905,1987など）。
【０００５】この養子免疫療法に用いられるＬＡＫ細胞
は、通常、ヒトの末梢血から分離したリンパ球を、ＩＬ
−２存在下に血清含有又は非含有栄養培地中で培養する
ことにより誘導されるが、ＬＡＫ細胞の前駆細胞として
使用されるリンパ球以外の細胞群、特に単球はＬＡＫ細
胞の誘導に対して抑制的に作用するものと考えられ、前
駆細胞から除去されるのが望ましい（特開昭63-28388号
公報, 特開昭63-202378号公報,特開昭63-295510号公報
など）。
は、通常、ヒトの末梢血から分離したリンパ球を、ＩＬ
−２存在下に血清含有又は非含有栄養培地中で培養する
ことにより誘導されるが、ＬＡＫ細胞の前駆細胞として
使用されるリンパ球以外の細胞群、特に単球はＬＡＫ細
胞の誘導に対して抑制的に作用するものと考えられ、前
駆細胞から除去されるのが望ましい（特開昭63-28388号
公報, 特開昭63-202378号公報,特開昭63-295510号公報
など）。
【０００６】最近に至り、ヒト末梢血から分離した単球
／マクロファ−ジ画分を、サイトカイン、例えば、ＩＬ
−１，ＩＬ−２，Tumor Necrosis Factor（ＴＮＦ）又
はInterferon-γ（ＩＦＮ−γ）などのＢＲＭの存在下
に血清含有栄養培地中18〜48時間培養することにより細
胞傷害活性を有するマクロファ−ジが誘導されることが
報告されている（Nature,325,262-265,1987、Nature,32
3,86-89,1986 、J.Immunology,140,1345-1349,1988及び
Jpn.J.Cancer Res.,80,59-64,1989）。
／マクロファ−ジ画分を、サイトカイン、例えば、ＩＬ
−１，ＩＬ−２，Tumor Necrosis Factor（ＴＮＦ）又
はInterferon-γ（ＩＦＮ−γ）などのＢＲＭの存在下
に血清含有栄養培地中18〜48時間培養することにより細
胞傷害活性を有するマクロファ−ジが誘導されることが
報告されている（Nature,325,262-265,1987、Nature,32
3,86-89,1986 、J.Immunology,140,1345-1349,1988及び
Jpn.J.Cancer Res.,80,59-64,1989）。
【０００７】しかしながら、これらの方法に従い誘導さ
れた活性化マクロファ−ジの細胞傷害活性は必ずしも高
くはなく、かつ一過性であり、また特定の腫瘍細胞にの
み効果を有するに過ぎないものである。
れた活性化マクロファ−ジの細胞傷害活性は必ずしも高
くはなく、かつ一過性であり、また特定の腫瘍細胞にの
み効果を有するに過ぎないものである。
【０００８】
【発明が解決しようとする問題点】本発明者らは、従来
よりＬＡＫ細胞誘導の際に抑制的に働くと考えられてい
た単球に着目し、鋭意研究を重ねた結果、ヒト末梢血か
ら単離した単球を、未分化の状態からＩＬ−２と単球／
マクロファ−ジの分化又は活性化に関与するその他のサ
イトカインの存在下、ヒト血清含有栄養培地中で長期間
培養することにより誘導されるマクロファ−ジが、広範
囲の腫瘍細胞に対して高い細胞傷害活性を有することを
見出し、本発明を完成するに至った。更に、本発明者ら
は、ＩＬ−２単独で使用する場合に比べて、ＩＬ−２と
ＩＬ−１又はＣＳＦ−１などのサイトカインを併用して
誘導されるマクロファ−ジが極めて高い細胞傷害活性を
有するとの知見を得た。
よりＬＡＫ細胞誘導の際に抑制的に働くと考えられてい
た単球に着目し、鋭意研究を重ねた結果、ヒト末梢血か
ら単離した単球を、未分化の状態からＩＬ−２と単球／
マクロファ−ジの分化又は活性化に関与するその他のサ
イトカインの存在下、ヒト血清含有栄養培地中で長期間
培養することにより誘導されるマクロファ−ジが、広範
囲の腫瘍細胞に対して高い細胞傷害活性を有することを
見出し、本発明を完成するに至った。更に、本発明者ら
は、ＩＬ−２単独で使用する場合に比べて、ＩＬ−２と
ＩＬ−１又はＣＳＦ−１などのサイトカインを併用して
誘導されるマクロファ−ジが極めて高い細胞傷害活性を
有するとの知見を得た。
【０００９】
【問題点を解決するための手段】即ち、本発明はヒト末
梢血から単離した単球を、未分化の状態から、インタ−
ロイキン−２と単球／マクロファ−ジの分化又は活性化
に関与するその他のサイトカインの存在下にヒト血清含
有栄養培地を用いて長期間培養し、培養液中に生成した
サイトカイン活性化マクロファ−ジを分離、採取するこ
とから成るサイトカイン活性化マクロファ−ジの新規な
製造方法、および該方法により得られるサイトカイン活
性化マクロファ−ジを提供するものである。
梢血から単離した単球を、未分化の状態から、インタ−
ロイキン−２と単球／マクロファ−ジの分化又は活性化
に関与するその他のサイトカインの存在下にヒト血清含
有栄養培地を用いて長期間培養し、培養液中に生成した
サイトカイン活性化マクロファ−ジを分離、採取するこ
とから成るサイトカイン活性化マクロファ−ジの新規な
製造方法、および該方法により得られるサイトカイン活
性化マクロファ−ジを提供するものである。
【００１０】なお、本明細書において使用する末梢血、
単球、単球／マクロファ−ジの分化又は活性化に関与す
るその他のサイトカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＣＳＦ
−１、ヒト血清及びサイトカイン活性化マクロファ−ジ
とは、下記の通りである。
単球、単球／マクロファ−ジの分化又は活性化に関与す
るその他のサイトカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＣＳＦ
−１、ヒト血清及びサイトカイン活性化マクロファ−ジ
とは、下記の通りである。
【００１１】ａ）末梢血 本発明で使用される「末梢血」とは、年齢、種差、性差
などに限定されることのない健常人又は、担癌患者など
から採取した末梢血である。
などに限定されることのない健常人又は、担癌患者など
から採取した末梢血である。
【００１２】ｂ）単球 本発明で使用される「単球」とは、ａ）において定義さ
れる末梢血から単離される。即ち、「末梢血」を遠心分
離してバフィ−コ−ト（淡黄色の白血球層）を得、この
バフィ−コ−トを比重分離液（パ−コ−ル(Pharmacia社
製)など）に重層し、必要により、リン酸緩衝液（Pho
sphate Buffered Saline: ＰＢＳ）を重層した後、密度
勾配遠心分離を行う。比重分離液とＰＢＳとの界面に集
まる比重の小さい細胞群（単球、マクロファ−ジ、ナチ
ュラルキラ−（Natural Killer:NK）細胞及び血小板な
ど）を採取し、得られた細胞群を遠心分離により数回洗
浄する。密度勾配遠心分離は必要に応じて繰り返し行う
こともできる。洗浄後、５〜10％のヒト血清を含有する
栄養培地（RPMI-1640など）に懸濁させ96 穴マイクロタ
イタ−プレ−トに加え、５％CO2下、37℃で60〜90分間
培養する。培養後、上清の非粘着性の細胞を除去し、37
℃に保温した前記栄養培地で数回洗浄することにより純
度の高い単球を調製することができる。
れる末梢血から単離される。即ち、「末梢血」を遠心分
離してバフィ−コ−ト（淡黄色の白血球層）を得、この
バフィ−コ−トを比重分離液（パ−コ−ル(Pharmacia社
製)など）に重層し、必要により、リン酸緩衝液（Pho
sphate Buffered Saline: ＰＢＳ）を重層した後、密度
勾配遠心分離を行う。比重分離液とＰＢＳとの界面に集
まる比重の小さい細胞群（単球、マクロファ−ジ、ナチ
ュラルキラ−（Natural Killer:NK）細胞及び血小板な
ど）を採取し、得られた細胞群を遠心分離により数回洗
浄する。密度勾配遠心分離は必要に応じて繰り返し行う
こともできる。洗浄後、５〜10％のヒト血清を含有する
栄養培地（RPMI-1640など）に懸濁させ96 穴マイクロタ
イタ−プレ−トに加え、５％CO2下、37℃で60〜90分間
培養する。培養後、上清の非粘着性の細胞を除去し、37
℃に保温した前記栄養培地で数回洗浄することにより純
度の高い単球を調製することができる。
【００１３】ｃ）単球／マクロファ−ジの分化又は活性
化に関与するその他のサイトカイン本発明で使用される
「単球／マクロファ−ジの分化又は活性化に関与するそ
の他のサイトカイン」とは、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１、Ｔ
ＮＦ及びＩＦＮなどを意味し、特に好ましくは、ＣＳＦ
−１又はＩＬ−１を意味する。
化に関与するその他のサイトカイン本発明で使用される
「単球／マクロファ−ジの分化又は活性化に関与するそ
の他のサイトカイン」とは、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１、Ｔ
ＮＦ及びＩＦＮなどを意味し、特に好ましくは、ＣＳＦ
−１又はＩＬ−１を意味する。
【００１４】ｄ）ＩＬ−２、ＣＳＦ−１及びＩＬ−１ 本発明で使用される「ＩＬ−２」、「ＣＳＦ−１」及び
「ＩＬ−１」とは、共にヒト由来の又はマウス、ラット
などの動物由来の天然若しくは、遺伝子組換え技術によ
り得られた組換え型のものが包含される。
「ＩＬ−１」とは、共にヒト由来の又はマウス、ラット
などの動物由来の天然若しくは、遺伝子組換え技術によ
り得られた組換え型のものが包含される。
【００１５】ｅ）ヒト血清 本発明で使用される「ヒト血清」とは、血液型に限定さ
れない成人のヒト血清を意味する。
れない成人のヒト血清を意味する。
【００１６】ｆ）サイトカイン活性化マクロファ−ジ 本発明における「サイトカイン活性化マクロファ−ジ」
とは、ヒト末梢血から単離した単球を、インタ−ロイキ
ン−２と単球／マクロファ−ジの分化又は活性化に関与
するその他のサイトカインの存在下にヒト血清含有栄養
培地を用いて長期間培養することにより誘導され、ＮＫ
細胞感受性又は非感受性に限定されない広範囲の腫瘍細
胞を傷害する能力などを有するサイトカイン活性化マク
ロファ−ジを意味する。
とは、ヒト末梢血から単離した単球を、インタ−ロイキ
ン−２と単球／マクロファ−ジの分化又は活性化に関与
するその他のサイトカインの存在下にヒト血清含有栄養
培地を用いて長期間培養することにより誘導され、ＮＫ
細胞感受性又は非感受性に限定されない広範囲の腫瘍細
胞を傷害する能力などを有するサイトカイン活性化マク
ロファ−ジを意味する。
【００１７】
【実施例】以下に、本発明の態様を実施例により更に具
体的に説明するが、本発明はここに記載される特定の態
様に限定されるものではない。
体的に説明するが、本発明はここに記載される特定の態
様に限定されるものではない。
【００１８】Ａ．単球の単離 ヒトから末梢血 200mlを採取し、遠心分離により赤血球
を除去してバフィ−コ−トを得た。バフィ−コ−トの 1
/2 量のパ−コ−ル液（比重1.128）４mlと混合し、更
に、パ−コ−ル液（比重1.064）３mlとＰＢＳ１mlを重
層し、400×ｇで20分間密度勾配遠心分離した。遠心分
離後、パ−コ−ル液（比重1.064）とＰＢＳとの界面に
集まった細胞画分を回収した。この画分を150×ｇで10
分間遠心分離により洗浄した。洗浄後、再びＰＢＳに懸
濁させ、パ−コ−ル液（比重1.064）に重層し、400×ｇ
で20分間密度勾配遠心分離してパ−コ−ル液とＰＢＳと
の界面に集まった細胞画分を回収した。この細胞画分を
遠心分離（150×ｇ，５分間）により３回洗浄した後、1
0％ヒト血清を含有するRPMI-1640培地（Gibco社製）に
懸濁させ、1×105 cell/100μl/wellの濃度で96穴平底
マイクロタイタ−プレ−トに加え、５％CO2下 37 ℃で6
0分間培養した。培養後、上清の非粘着性の細胞群を除
去し、37℃に保温したRPMI-1640培地で３回洗浄して極
めて純度の高い（99％以上）単球を得た。
を除去してバフィ−コ−トを得た。バフィ−コ−トの 1
/2 量のパ−コ−ル液（比重1.128）４mlと混合し、更
に、パ−コ−ル液（比重1.064）３mlとＰＢＳ１mlを重
層し、400×ｇで20分間密度勾配遠心分離した。遠心分
離後、パ−コ−ル液（比重1.064）とＰＢＳとの界面に
集まった細胞画分を回収した。この画分を150×ｇで10
分間遠心分離により洗浄した。洗浄後、再びＰＢＳに懸
濁させ、パ−コ−ル液（比重1.064）に重層し、400×ｇ
で20分間密度勾配遠心分離してパ−コ−ル液とＰＢＳと
の界面に集まった細胞画分を回収した。この細胞画分を
遠心分離（150×ｇ，５分間）により３回洗浄した後、1
0％ヒト血清を含有するRPMI-1640培地（Gibco社製）に
懸濁させ、1×105 cell/100μl/wellの濃度で96穴平底
マイクロタイタ−プレ−トに加え、５％CO2下 37 ℃で6
0分間培養した。培養後、上清の非粘着性の細胞群を除
去し、37℃に保温したRPMI-1640培地で３回洗浄して極
めて純度の高い（99％以上）単球を得た。
【００１９】Ｂ．サイトカイン活性化マクロファ−ジの
誘導 ａ）前記Ａで得られた単球を、10〜1,000IU/mlの組換え
型ＩＬ−２（recombinant IL-2:rＩＬ−２、塩野義製薬
（株）製）及び10％ヒト血清を含有するRPMI-1640培地
中で、５％CO2下、37℃で３〜17日間培養することによ
りサイトカイン活性化マクロファ−ジを得た。
誘導 ａ）前記Ａで得られた単球を、10〜1,000IU/mlの組換え
型ＩＬ−２（recombinant IL-2:rＩＬ−２、塩野義製薬
（株）製）及び10％ヒト血清を含有するRPMI-1640培地
中で、５％CO2下、37℃で３〜17日間培養することによ
りサイトカイン活性化マクロファ−ジを得た。
【００２０】ｂ）前記Ａで得られた単球を、50〜500IU/
mlのrＩＬ−２及び50〜50,000IU/mlのＣＳＦ−１（ミド
リ十字（株）製）を用い、ａ）と同様にして培養するこ
とによりサイトカイン活性化マクロファ−ジを得た。
mlのrＩＬ−２及び50〜50,000IU/mlのＣＳＦ−１（ミド
リ十字（株）製）を用い、ａ）と同様にして培養するこ
とによりサイトカイン活性化マクロファ−ジを得た。
【００２１】ｃ）Ａで得られた単球を50〜500IU/mlのr
ＩＬ−２及び6.25×10-7〜1.25×10-4μg/mlのＩＬ−１
（大日本製薬（株）製）を用い、ａ）と同様にして培養
することによりサイトカイン活性化マクロファ−ジを得
た。
ＩＬ−２及び6.25×10-7〜1.25×10-4μg/mlのＩＬ−１
（大日本製薬（株）製）を用い、ａ）と同様にして培養
することによりサイトカイン活性化マクロファ−ジを得
た。
【００２２】Ｃ．サイトカイン活性化マクロファ−ジの
分離、採取 Ｂにおいてサイトカイン活性化マクロファ−ジを、ＰＢ
Ｓで洗浄後、0.5ml/wellで２mＭのＥＤＴＡ−ＰＢＳ（p
H7.2）を添加し、５％CO2下、37℃で15分間培養した。
培養後、浮遊してきたサイトカイン活性化マクロファ−
ジを回収した。また、必要に応じラバ−ポリスマンを用
いてプレ−トに残存するサイトカイン活性化マクロファ
−ジを回収した。
分離、採取 Ｂにおいてサイトカイン活性化マクロファ−ジを、ＰＢ
Ｓで洗浄後、0.5ml/wellで２mＭのＥＤＴＡ−ＰＢＳ（p
H7.2）を添加し、５％CO2下、37℃で15分間培養した。
培養後、浮遊してきたサイトカイン活性化マクロファ−
ジを回収した。また、必要に応じラバ−ポリスマンを用
いてプレ−トに残存するサイトカイン活性化マクロファ
−ジを回収した。
【００２３】Ｄ．サイトカイン活性化マクロファ−ジの
特性 本発明により得られたサイトカイン活性化マクロファ−
ジの特性を、細胞内非特異的エステラ−ゼ（Non Specif
ic Esterase :ＮＳＥ）染色及び蛍光色素標識抗体法（F
luorescence-labelled Antibody Method）により検討し
た。
特性 本発明により得られたサイトカイン活性化マクロファ−
ジの特性を、細胞内非特異的エステラ−ゼ（Non Specif
ic Esterase :ＮＳＥ）染色及び蛍光色素標識抗体法（F
luorescence-labelled Antibody Method）により検討し
た。
【００２４】ａ）ＮＳＥ染色 方法：α−ナフチルブチレ−ト（半井化学（株）製）を
基質に用いて、C.Y.Liらの方法（J.Histochem.Cytoche
m.,21,1-22,1973）に準じて行った。前記Ａにおいて得
られた単球0.5×106〜1.0×106/wellをLab Tek Camber
（三光純薬（株）製，#4804）にまき、10％ヒト血清及
び1000IU/mlのrＩＬ−２を含有するRPMI-1640培地中で
５％CO2下、37℃で８日間培養してサイトカイン活性化
マクロファ−ジを得た。固定液（冷アセトン：ホルマリ
ン：水＝９：５：６）で約１分間細胞を固定した後、水
洗して風乾させた。次いでパラロザニリン溶液で約60分
間染色した後、水洗、風乾しサイトカイン活性化マクロ
ファ−ジの標本を作成した。なお、対照には、単球、ヒ
ト末梢血単核細胞及びrＩＬ−２を含有しない10％ヒト
血清含有RPMI-1640培地中で培養したマクロファ−ジの
標本をそれぞれ作成した。これらの標本を位相差顕微鏡
を用いて検鏡（倍率:×125）し単球及びマクロファ−ジ
を同定した。 結果：図１乃至図４（写真）に示した。
基質に用いて、C.Y.Liらの方法（J.Histochem.Cytoche
m.,21,1-22,1973）に準じて行った。前記Ａにおいて得
られた単球0.5×106〜1.0×106/wellをLab Tek Camber
（三光純薬（株）製，#4804）にまき、10％ヒト血清及
び1000IU/mlのrＩＬ−２を含有するRPMI-1640培地中で
５％CO2下、37℃で８日間培養してサイトカイン活性化
マクロファ−ジを得た。固定液（冷アセトン：ホルマリ
ン：水＝９：５：６）で約１分間細胞を固定した後、水
洗して風乾させた。次いでパラロザニリン溶液で約60分
間染色した後、水洗、風乾しサイトカイン活性化マクロ
ファ−ジの標本を作成した。なお、対照には、単球、ヒ
ト末梢血単核細胞及びrＩＬ−２を含有しない10％ヒト
血清含有RPMI-1640培地中で培養したマクロファ−ジの
標本をそれぞれ作成した。これらの標本を位相差顕微鏡
を用いて検鏡（倍率:×125）し単球及びマクロファ−ジ
を同定した。 結果：図１乃至図４（写真）に示した。
【００２５】本染色法によれば、通常、単球及びマクロ
ファ−ジは細胞内にＮＳＥを有するため紫赤色に染まる
が、細胞内にＮＳＥを有さないリンパ球などの細胞群は
染色されず無色のままである。従って、本試験における
単球及びサイトカイン活性化マクロファ−ジは極めてよ
く紫赤色に染色されており、99％以上がＮＳＥ陽性であ
ると認められ、単球及びマクロファ−ジであることが確
認された。
ファ−ジは細胞内にＮＳＥを有するため紫赤色に染まる
が、細胞内にＮＳＥを有さないリンパ球などの細胞群は
染色されず無色のままである。従って、本試験における
単球及びサイトカイン活性化マクロファ−ジは極めてよ
く紫赤色に染色されており、99％以上がＮＳＥ陽性であ
ると認められ、単球及びマクロファ−ジであることが確
認された。
【００２６】ｂ）蛍光色素標識抗体法 本法は免疫組織化学的方法の一つであり、細胞の表面抗
原に対する抗体のマ−カ−としてＦＩＴＣ（Fluorescei
n Isothiocyanate）などの蛍光色素を用い、蛍光顕微鏡
下に励起された蛍光を観察することにより表面抗原を有
する細胞の所在を確認する方法である。ヒト末梢血中の
単球及びマクロファ−ジは表面抗原としてＣＤ14を、ま
たＮＫ細胞及び好中球はＣＤ16を有している。なお、Ｃ
Ｄ14及びＣＤ16を認識するモノクロ−ナル抗体としてそ
れぞれ例えば、ＭＯ２−ＦＩＴＣ（Coulter Corp.製）
及びanti Leu11a−ＦＩＴＣ（BectonDickinson社製）が
用いられている。
原に対する抗体のマ−カ−としてＦＩＴＣ（Fluorescei
n Isothiocyanate）などの蛍光色素を用い、蛍光顕微鏡
下に励起された蛍光を観察することにより表面抗原を有
する細胞の所在を確認する方法である。ヒト末梢血中の
単球及びマクロファ−ジは表面抗原としてＣＤ14を、ま
たＮＫ細胞及び好中球はＣＤ16を有している。なお、Ｃ
Ｄ14及びＣＤ16を認識するモノクロ−ナル抗体としてそ
れぞれ例えば、ＭＯ２−ＦＩＴＣ（Coulter Corp.製）
及びanti Leu11a−ＦＩＴＣ（BectonDickinson社製）が
用いられている。
【００２７】方法：Ｂのａ）により得られたサイトカイ
ン活性化マクロファ−ジに、ＭＯ２−ＦＩＴＣを0.1％
アジ化ナトリウム及び0.1％ウシ血清アルブミン（Fract
ionＶ,生化学工業（株）製）を加えたＰＢＳに溶かして
加え、氷冷下30分間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで
洗浄し標本を作成した。なお、対照にはanti Leu11a−
ＦＩＴＣを用い前記と同様にして標本を作成した。これ
らの標本を蛍光顕微鏡（倍率:×400）を用いて観察し、
サイトカイン活性化マクロファ−ジを同定した。 結果：図５及び図６（写真）に示した。
ン活性化マクロファ−ジに、ＭＯ２−ＦＩＴＣを0.1％
アジ化ナトリウム及び0.1％ウシ血清アルブミン（Fract
ionＶ,生化学工業（株）製）を加えたＰＢＳに溶かして
加え、氷冷下30分間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで
洗浄し標本を作成した。なお、対照にはanti Leu11a−
ＦＩＴＣを用い前記と同様にして標本を作成した。これ
らの標本を蛍光顕微鏡（倍率:×400）を用いて観察し、
サイトカイン活性化マクロファ−ジを同定した。 結果：図５及び図６（写真）に示した。
【００２８】本発明のサイトカイン活性化マクロファ−
ジは、ＭＯ２−ＦＩＴＣで、極めてよく黄緑色の蛍光を
発しており、ＭＯ２陽性であり、即ち大部分がマクロフ
ァ−ジであることが認められた。また、anti Leu11a−
ＦＩＴＣを用いた標本は全く蛍光を発していないことか
ら、本発明のサイトカイン活性化マクロファ−ジには、
anti Leu11a陽性であるＮＫ細胞のような抗腫瘍活性有
する細胞が全く混入していないことが認められた。 以
上の通り、ａ）及びｂ）の方法で得られた結果から、本
発明により誘導された細胞傷害活性を有する細胞は、極
めて純度の高い単球からサイトカインによって誘導され
る活性化マクロファ−ジであることが確認された。
ジは、ＭＯ２−ＦＩＴＣで、極めてよく黄緑色の蛍光を
発しており、ＭＯ２陽性であり、即ち大部分がマクロフ
ァ−ジであることが認められた。また、anti Leu11a−
ＦＩＴＣを用いた標本は全く蛍光を発していないことか
ら、本発明のサイトカイン活性化マクロファ−ジには、
anti Leu11a陽性であるＮＫ細胞のような抗腫瘍活性有
する細胞が全く混入していないことが認められた。 以
上の通り、ａ）及びｂ）の方法で得られた結果から、本
発明により誘導された細胞傷害活性を有する細胞は、極
めて純度の高い単球からサイトカインによって誘導され
る活性化マクロファ−ジであることが確認された。
【００２９】Ｅ．細胞傷害活性 本発明のサイトカイン活性化マクロファ−ジの細胞傷害
活性の測定は、特に断わりのない限り下記に述べる3Ｈ
−チミジン放出試験（Tritirated Thymidine Release T
est）を用いて測定した。また、本試験において使用し
た標的腫瘍細胞は、特に断わりのない限り、ヒト由来の
Hela細胞であり、また、サイトカイン活性化マクロファ
−ジ及び標的腫瘍細胞の数はそれぞれ、1×105cell及び
1×104cellとした。
活性の測定は、特に断わりのない限り下記に述べる3Ｈ
−チミジン放出試験（Tritirated Thymidine Release T
est）を用いて測定した。また、本試験において使用し
た標的腫瘍細胞は、特に断わりのない限り、ヒト由来の
Hela細胞であり、また、サイトカイン活性化マクロファ
−ジ及び標的腫瘍細胞の数はそれぞれ、1×105cell及び
1×104cellとした。
【００３０】（3Ｈ−チミジン放出試験法）腫瘍細胞を
ファルコンカルチャ−ボトルで培養し、継代後２〜３日
目に得られる腫瘍細胞を標的細胞として使用した。この
標的細胞に25μCi/ホ゛トルの3Ｈ−チミジンを加え、４〜５
時間培養して、得られた3Ｈ−チミジン標識腫瘍細胞を3
Ｈ−チミジンを含有しない新しい培地中で１時間培養し
て本試験で使用する3Ｈ−チミジン標識腫瘍細胞を得
た。この3Ｈ−チミジン標識腫瘍細胞を、10％ウシ胎児
血清含有RPMI-1640培地中に懸濁し、96穴平底マイクロ
タイタ−プレ−ト中で誘導したサイトカイン活性化マク
ロファ−ジに加え、37℃で48時間培養した後、各ウェル
から上清100μlを採取し、上清中に放出された3Ｈ−チ
ミジンの放射活性を液体シンチレ−ションカウンタ−に
より測定した。細胞傷害活性は、下記式により算出でき
る。
ファルコンカルチャ−ボトルで培養し、継代後２〜３日
目に得られる腫瘍細胞を標的細胞として使用した。この
標的細胞に25μCi/ホ゛トルの3Ｈ−チミジンを加え、４〜５
時間培養して、得られた3Ｈ−チミジン標識腫瘍細胞を3
Ｈ−チミジンを含有しない新しい培地中で１時間培養し
て本試験で使用する3Ｈ−チミジン標識腫瘍細胞を得
た。この3Ｈ−チミジン標識腫瘍細胞を、10％ウシ胎児
血清含有RPMI-1640培地中に懸濁し、96穴平底マイクロ
タイタ−プレ−ト中で誘導したサイトカイン活性化マク
ロファ−ジに加え、37℃で48時間培養した後、各ウェル
から上清100μlを採取し、上清中に放出された3Ｈ−チ
ミジンの放射活性を液体シンチレ−ションカウンタ−に
より測定した。細胞傷害活性は、下記式により算出でき
る。
【００３１】
【数１】
【００３２】ａ）ＩＬ−２により活性化されるマクロフ
ァ−ジの細胞傷害活性 ・ＩＬ−２濃度 方法：ヒト末梢血より単離した単球を10％ヒト血清又は
10％ウシ胎児血清、及びそれぞれ10、100、1,000IU/ml
のrＩＬ−２を含有するRPMI-1640培地中で、８日間培養
して得られたサイトカイン活性化マクロファ−ジの細胞
傷害活性を測定した。なお、対照にはrＩＬ−２を含ま
ない10％ヒト血清又は10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640
培地中で培養したものを用いた。 結果：表１に示した。
ァ−ジの細胞傷害活性 ・ＩＬ−２濃度 方法：ヒト末梢血より単離した単球を10％ヒト血清又は
10％ウシ胎児血清、及びそれぞれ10、100、1,000IU/ml
のrＩＬ−２を含有するRPMI-1640培地中で、８日間培養
して得られたサイトカイン活性化マクロファ−ジの細胞
傷害活性を測定した。なお、対照にはrＩＬ−２を含ま
ない10％ヒト血清又は10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640
培地中で培養したものを用いた。 結果：表１に示した。
【００３３】
【表１】
【００３４】rＩＬ−２を添加した場合には、各濃度に
おいて、ヒト血清含有培地を用いて培養して得られたサ
イトカイン活性化マクロファ−ジの方が、ＦＣＳ含有培
地を用いて培養したものより高い細胞傷害活性を示し、
またrＩＬ−２濃度については、10IU/ml以上、特に100I
U/ml以上の場合に顕著な効果が認められた。
おいて、ヒト血清含有培地を用いて培養して得られたサ
イトカイン活性化マクロファ−ジの方が、ＦＣＳ含有培
地を用いて培養したものより高い細胞傷害活性を示し、
またrＩＬ−２濃度については、10IU/ml以上、特に100I
U/ml以上の場合に顕著な効果が認められた。
【００３５】・ＩＬ−２の添加時期 方法：ヒト末梢血から単離した単球を10％ヒト血清含有
RPMI-1640培地中で、それぞれ０、１、３、５及び７日
前培養した後、500IU/mlのrＩＬ−２を加えた10％ヒト
血清含有RPMI-1640培地中でそれぞれ８、７、５、３及
び１日培養して得られたサイトカイン活性化マクロファ
−ジの細胞傷害活性を測定した。なお、対照には、rＩ
Ｌ−２を含まない10％ヒト血清含有RPMI-1640培地中で
８日間培養して得られたマクロファ−ジを用いた。 結果：表２に示した。
RPMI-1640培地中で、それぞれ０、１、３、５及び７日
前培養した後、500IU/mlのrＩＬ−２を加えた10％ヒト
血清含有RPMI-1640培地中でそれぞれ８、７、５、３及
び１日培養して得られたサイトカイン活性化マクロファ
−ジの細胞傷害活性を測定した。なお、対照には、rＩ
Ｌ−２を含まない10％ヒト血清含有RPMI-1640培地中で
８日間培養して得られたマクロファ−ジを用いた。 結果：表２に示した。
【００３６】
【表２】
【００３７】細胞傷害活性は、単球を単離直後（０日
目）からrＩＬ−２を含有する培地で８日間培養して誘
導されたサイトカイン活性化マクロファ−ジが最大値を
示し、前培養期間が長くなるに従い細胞傷害活性が低下
した。これより、単球／マクロファ−ジを用いてrＩＬ
−２により細胞傷害活性を有するマクロファ−ジを誘導
する際には、誘導初期の未分化の状態からrＩＬ−２と
培養することにより最も高い細胞傷害活性を有するサイ
トカイン活性化マクロファ−ジを誘導することができる
ことが認められた。
目）からrＩＬ−２を含有する培地で８日間培養して誘
導されたサイトカイン活性化マクロファ−ジが最大値を
示し、前培養期間が長くなるに従い細胞傷害活性が低下
した。これより、単球／マクロファ−ジを用いてrＩＬ
−２により細胞傷害活性を有するマクロファ−ジを誘導
する際には、誘導初期の未分化の状態からrＩＬ−２と
培養することにより最も高い細胞傷害活性を有するサイ
トカイン活性化マクロファ−ジを誘導することができる
ことが認められた。
【００３８】・ＬＡＫ細胞との比較 本発明より得られたサイトカイン活性化マクロファ−ジ
とＬＡＫ細胞との細胞傷害作用の機序の差異を比較する
目的で、51Ｃｒ放出試験及び3Ｈ−チミジン放出試験を
用いて下記の実験を行った。
とＬＡＫ細胞との細胞傷害作用の機序の差異を比較する
目的で、51Ｃｒ放出試験及び3Ｈ−チミジン放出試験を
用いて下記の実験を行った。
【００３９】方法：ヒト末梢血より単離した単球を、10
％ヒト血清及び1,000IU/mlのrＩＬ−２を含有するRPMI-
1640培地中で、３又は10日間培養して得られたサイトカ
イン活性化マクロファ−ジの細胞傷害活性と、ヒト末梢
血より単離したリンパ球を、前述と同様に操作して得ら
れたＬＡＫ細胞を用いて両者の細胞傷害活性を４時間51
Ｃｒ放出試験及び48時間3Ｈ−チミジン放出試験により
測定した。 結果：表３及び表４に示した。
％ヒト血清及び1,000IU/mlのrＩＬ−２を含有するRPMI-
1640培地中で、３又は10日間培養して得られたサイトカ
イン活性化マクロファ−ジの細胞傷害活性と、ヒト末梢
血より単離したリンパ球を、前述と同様に操作して得ら
れたＬＡＫ細胞を用いて両者の細胞傷害活性を４時間51
Ｃｒ放出試験及び48時間3Ｈ−チミジン放出試験により
測定した。 結果：表３及び表４に示した。
【００４０】
【表３】
【００４１】
【表４】
【００４２】51Ｃｒ放出試験では、標的腫瘍細胞がＬＡ
Ｋ細胞や本発明で得られたサイトカイン活性化マクロフ
ァ−ジなどの細胞傷害活性を有するエフェクタ−により
細胞膜に傷害を受けると腫瘍細胞の細胞質に取り込まれ
ている51Ｃｒが放出され、その放射活性を測定すること
により細胞傷害活性が算出される。一方、3Ｈ−チミジ
ン放出試験では、上記のようなエフェクタ−により標的
腫瘍細胞の核内のＤＮＡが破壊されるとＤＮＡに取り込
まれている3Ｈ−チミジンが放出され、その放射活性を
測定することにより細胞傷害活性が算出される。
Ｋ細胞や本発明で得られたサイトカイン活性化マクロフ
ァ−ジなどの細胞傷害活性を有するエフェクタ−により
細胞膜に傷害を受けると腫瘍細胞の細胞質に取り込まれ
ている51Ｃｒが放出され、その放射活性を測定すること
により細胞傷害活性が算出される。一方、3Ｈ−チミジ
ン放出試験では、上記のようなエフェクタ−により標的
腫瘍細胞の核内のＤＮＡが破壊されるとＤＮＡに取り込
まれている3Ｈ−チミジンが放出され、その放射活性を
測定することにより細胞傷害活性が算出される。
【００４３】本発明のサイトカイン活性化マクロファ−
ジは、短時間の51Ｃｒ放出試験ではいずれの培養期間に
おいても低い細胞傷害活性しか示さなかったが、48時間
の3Ｈ−チミジン放出試験では、10日間培養して得られ
たものが、極めて高い細胞傷害活性を示した。
ジは、短時間の51Ｃｒ放出試験ではいずれの培養期間に
おいても低い細胞傷害活性しか示さなかったが、48時間
の3Ｈ−チミジン放出試験では、10日間培養して得られ
たものが、極めて高い細胞傷害活性を示した。
【００４４】一方、ＬＡＫ細胞は、51Ｃｒ放出試験では
高い細胞傷害活性を示したが、3Ｈ−チミジン放出試験
ではいずれの培養期間においてもほとんど細胞傷害活性
を示さなかった。以上の結果から、本発明で得られたサ
イトカイン活性化マクロファ−ジは、公知のＬＡＫ細胞
が有する腫瘍細胞傷害作用とは全く異なる機序で、即
ち、標的腫瘍細胞の核内のＤＮＡを破壊することにより
腫瘍細胞を壊死させるという機序を有していることが示
唆された。
高い細胞傷害活性を示したが、3Ｈ−チミジン放出試験
ではいずれの培養期間においてもほとんど細胞傷害活性
を示さなかった。以上の結果から、本発明で得られたサ
イトカイン活性化マクロファ−ジは、公知のＬＡＫ細胞
が有する腫瘍細胞傷害作用とは全く異なる機序で、即
ち、標的腫瘍細胞の核内のＤＮＡを破壊することにより
腫瘍細胞を壊死させるという機序を有していることが示
唆された。
【００４５】・ＩＬ−２含有培地での培養期間 方法：ヒト末梢血より単離した単球を、10％ヒト血清及
び500IU/mlのrＩＬ−２を含有するRPMI-1640培地中で
３、６、10及び17日間培養して得られたサイトカイン活
性化マクロファ−ジの細胞傷害活性を測定した。 結果：表５に示した。
び500IU/mlのrＩＬ−２を含有するRPMI-1640培地中で
３、６、10及び17日間培養して得られたサイトカイン活
性化マクロファ−ジの細胞傷害活性を測定した。 結果：表５に示した。
【００４６】
【表５】
【００４７】ｒＩＬ−２を使用して細胞傷害活性を有す
るマクロファ−ジを誘導する場合、３日以内の培養では
ほとんど細胞傷害活性を示さないが、６日目以降急激に
細胞傷害活性が高くなり、10日目で最高値を示し、以後
17日目においても極めて高い細胞傷害活性が維持され
た。これより、従来の短期間（１〜３日間以内）培養と
比較して、６日間以上培養することにより極めて高い細
胞傷害活性を有するサイトカイン活性化マクロファ−ジ
が誘導されることが認められた。
るマクロファ−ジを誘導する場合、３日以内の培養では
ほとんど細胞傷害活性を示さないが、６日目以降急激に
細胞傷害活性が高くなり、10日目で最高値を示し、以後
17日目においても極めて高い細胞傷害活性が維持され
た。これより、従来の短期間（１〜３日間以内）培養と
比較して、６日間以上培養することにより極めて高い細
胞傷害活性を有するサイトカイン活性化マクロファ−ジ
が誘導されることが認められた。
【００４８】・各種腫瘍細胞に対する細胞傷害活性 方法：ヒト末梢血より単離した単球を、500IU/mlのrＩ
Ｌ−２及び10％ヒト血清を含有するRPMI-1640培地中で
８日間培養して得られたサイトカイン活性化マクロファ
−ジを用いて、各種腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を検
討した。なお、対照にはrＩＬ−２を含まない10％ヒト
血清を含有するRPMI-1640培地中で、同様にして得られ
たマクロファ−ジを用いた。
Ｌ−２及び10％ヒト血清を含有するRPMI-1640培地中で
８日間培養して得られたサイトカイン活性化マクロファ
−ジを用いて、各種腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を検
討した。なお、対照にはrＩＬ−２を含まない10％ヒト
血清を含有するRPMI-1640培地中で、同様にして得られ
たマクロファ−ジを用いた。
【００４９】使用した標的腫瘍細胞は次の通りである。 Hela,K562,A375,HL60,U937,P815,MethA,LP3 なお、標的腫瘍細胞のうち、K562はＮＫ細胞感受性であ
り、Hela、A375、HL60及びU937はＮＫ細胞非感受性であ
る。 結果：表６に示した。
り、Hela、A375、HL60及びU937はＮＫ細胞非感受性であ
る。 結果：表６に示した。
【００５０】
【表６】
【００５１】ＮＫ細胞感受性、非感受性に限定されず、
全ての腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示した。特に、
ヒト由来のHela細胞及びK562細胞に対し、極めて高い細
胞傷害活性を示した。これより、本発明のサイトカイン
活性化マクロファ−ジは、ＮＫ細胞感受性、非感受性に
限定されず広範囲の腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を有
することが認められた。
全ての腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示した。特に、
ヒト由来のHela細胞及びK562細胞に対し、極めて高い細
胞傷害活性を示した。これより、本発明のサイトカイン
活性化マクロファ−ジは、ＮＫ細胞感受性、非感受性に
限定されず広範囲の腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を有
することが認められた。
【００５２】ｂ）ＩＬ−２及びＣＳＦ−１により活性化
されるマクロファ−ジの細胞傷害活性 ・ＣＳＦ−１の濃度 方法：ヒト末梢血（供与者２名）より単離した単球を10
％ヒト血清、500IU/mlのrＩＬ−２及び、50、500、5,00
0又は50,000IU/mlのＣＳＦ−１をそれぞれ含有するRPMI
-1640培地中で、５日間培養して得られたサイトカイン
活性化マクロファ−ジの細胞傷害活性を測定した。な
お、対照にはＣＳＦ−１を含まない10％ヒト血清及び50
0IU/mlのrＩＬ−２を含有するRPMI-1640培地中で、上記
と同様にして培養して得られたサイトカイン活性化マク
ロファ−ジを用いた。 結果：表７に示した。
されるマクロファ−ジの細胞傷害活性 ・ＣＳＦ−１の濃度 方法：ヒト末梢血（供与者２名）より単離した単球を10
％ヒト血清、500IU/mlのrＩＬ−２及び、50、500、5,00
0又は50,000IU/mlのＣＳＦ−１をそれぞれ含有するRPMI
-1640培地中で、５日間培養して得られたサイトカイン
活性化マクロファ−ジの細胞傷害活性を測定した。な
お、対照にはＣＳＦ−１を含まない10％ヒト血清及び50
0IU/mlのrＩＬ−２を含有するRPMI-1640培地中で、上記
と同様にして培養して得られたサイトカイン活性化マク
ロファ−ジを用いた。 結果：表７に示した。
【００５３】
【表７】
【００５４】細胞傷害活性については、ＣＳＦ−１濃度
が500IU/ml以上で対照に比べ有意な細胞傷害活性を示
し、5,000IU/mlで最高値を示した。
が500IU/ml以上で対照に比べ有意な細胞傷害活性を示
し、5,000IU/mlで最高値を示した。
【００５５】・ＣＳＦ−１含有培地中での培養期間 方法：ヒト末梢血より単離した単球を10％ヒト血清、5,
000IU/mlのＣＳＦ−１及び、０、50または500IU/mlのr
ＩＬ−２をそれぞれ含有するRPMI-1640培地中で、３、
６、10または17日間培養して得られたサイトカイン活性
化マクロファ−ジの細胞傷害活性を測定した。なお、対
照には10％ヒト血清及び各濃度のrＩＬ−２を含有するR
PMI-1640培地中で上記と同様にして得られたサイトカイ
ン活性化マクロファ−ジを用いた。 結果：表８に示した。
000IU/mlのＣＳＦ−１及び、０、50または500IU/mlのr
ＩＬ−２をそれぞれ含有するRPMI-1640培地中で、３、
６、10または17日間培養して得られたサイトカイン活性
化マクロファ−ジの細胞傷害活性を測定した。なお、対
照には10％ヒト血清及び各濃度のrＩＬ−２を含有するR
PMI-1640培地中で上記と同様にして得られたサイトカイ
ン活性化マクロファ−ジを用いた。 結果：表８に示した。
【００５６】
【表８】
【００５７】rＩＬ−２濃度を高くしても培養期間が３
日以内の場合にはほとんど細胞傷害活性を示さないが、
50又は500IU/mlのrIL-2を含有させて培養して得られた
サイトカイン活性化マクロファ−ジは、６日目以降急激
に細胞傷害活性が高くなり、10日目で最高値を示し、以
後17日目においても極めて高い細胞傷害活性が維持され
た。これより、従来の短期間（１〜３日間以内）培養と
比較して、６日間以上培養することにより極めて高い細
胞傷害活性を有するサイトカイン活性化マクロファ−ジ
が誘導されることが認められた。上記に加え、rＩＬ−
２単独で誘導されるサイトカイン活性化マクロファ−ジ
と比較して、rＩＬ−２とＣＳＦ−１との相乗効果によ
り、更に高い細胞傷害活性を有するサイトカイン活性化
マクロファ−ジが誘導されることが認められた。
日以内の場合にはほとんど細胞傷害活性を示さないが、
50又は500IU/mlのrIL-2を含有させて培養して得られた
サイトカイン活性化マクロファ−ジは、６日目以降急激
に細胞傷害活性が高くなり、10日目で最高値を示し、以
後17日目においても極めて高い細胞傷害活性が維持され
た。これより、従来の短期間（１〜３日間以内）培養と
比較して、６日間以上培養することにより極めて高い細
胞傷害活性を有するサイトカイン活性化マクロファ−ジ
が誘導されることが認められた。上記に加え、rＩＬ−
２単独で誘導されるサイトカイン活性化マクロファ−ジ
と比較して、rＩＬ−２とＣＳＦ−１との相乗効果によ
り、更に高い細胞傷害活性を有するサイトカイン活性化
マクロファ−ジが誘導されることが認められた。
【００５８】ｃ）ＩＬ−２及びＩＬ−１により活性化さ
れるマクロファ−ジの細胞傷害活性 方法：ヒト末梢血より単離した単球を０、50又は500IU/
mlのrＩＬ−２の各濃度に対して、6.25×10-7 又は1.25
×10-4μg/mlのＩＬ−１、及び10％ヒト血清を含有する
RPMI-1640培地中で６又は９日間培養して得られたサイ
トカイン活性化マクロファ−ジの細胞傷害活性を測定し
た。なお、対照にはrＩＬ−２各濃度において、ＩＬ−
１を含まない10％ヒト血清含有RPMI-1640培地中で培養
して得られたサイトカイン活性化マクロファ−ジを用い
た。 結果：表９に示した。
れるマクロファ−ジの細胞傷害活性 方法：ヒト末梢血より単離した単球を０、50又は500IU/
mlのrＩＬ−２の各濃度に対して、6.25×10-7 又は1.25
×10-4μg/mlのＩＬ−１、及び10％ヒト血清を含有する
RPMI-1640培地中で６又は９日間培養して得られたサイ
トカイン活性化マクロファ−ジの細胞傷害活性を測定し
た。なお、対照にはrＩＬ−２各濃度において、ＩＬ−
１を含まない10％ヒト血清含有RPMI-1640培地中で培養
して得られたサイトカイン活性化マクロファ−ジを用い
た。 結果：表９に示した。
【００５９】
【表９】
【００６０】rＩＬ−２濃度と細胞傷害活性との関係に
おいては、rＩＬ−２濃度が高くなるに従い高い細胞傷
害活性を示した。また、培養期間と細胞傷害活性との関
係においては、６及び９日目ともに極めて高い細胞傷害
活性を示し、更に、６日間の培養に比べ９日間培養して
得られたサイトカイン活性化マクロファ−ジは更に高い
細胞傷害活性を示した。これより、従来の短期間（１〜
３日間以内）培養と比較して、６日間以上培養すること
により極めて高い細胞傷害活性を有するサイトカイン活
性化マクロファ−ジが誘導されることが認められた。上
記に加え、rＩＬ−２単独で誘導されるサイトカイン活
性化マクロファ−ジと比較して、rＩＬ−２とＩＬ−１
との相加効果により、更に高い細胞傷害活性を有するサ
イトカイン活性化マクロファ−ジが誘導されることが認
められた。
おいては、rＩＬ−２濃度が高くなるに従い高い細胞傷
害活性を示した。また、培養期間と細胞傷害活性との関
係においては、６及び９日目ともに極めて高い細胞傷害
活性を示し、更に、６日間の培養に比べ９日間培養して
得られたサイトカイン活性化マクロファ−ジは更に高い
細胞傷害活性を示した。これより、従来の短期間（１〜
３日間以内）培養と比較して、６日間以上培養すること
により極めて高い細胞傷害活性を有するサイトカイン活
性化マクロファ−ジが誘導されることが認められた。上
記に加え、rＩＬ−２単独で誘導されるサイトカイン活
性化マクロファ−ジと比較して、rＩＬ−２とＩＬ−１
との相加効果により、更に高い細胞傷害活性を有するサ
イトカイン活性化マクロファ−ジが誘導されることが認
められた。
【００６１】Ｆ．動物モデルにおける抗腫瘍活性 本発明のサイトカイン活性化マクロファ−ジの抗腫瘍活
性を動物モデルを用いて測定した。本実験で用いたサイ
トカイン活性化マクロファ−ジ、腫瘍細胞及び動物は下
記のとおりである。 （サイトカイン活性化マクロファ−ジ）実施例Ａで得ら
れた単球を、500IU/mlのrIL-2（塩野義製薬（株）製）
及び10％ヒト血清を含有するRPMI-1640培地中で、5％Ｃ
Ｏ2下、37℃で６乃至１０日間培養し、実施例Ｃと同様
にして得たサイトカイン活性化マクロファ−ジを、洗浄
液（HANKS；日水社製）で２回洗浄した後、同洗浄液中
に懸濁させた。 （腫瘍細胞）10％ヒト血清含有RPMI-1640培地中で培養
したA375ヒトメラノ−マ細胞株を用いた。 （動物）生後４乃至６週齢のBalb/c nu/nuヌ−ドマウス
を用いた。
性を動物モデルを用いて測定した。本実験で用いたサイ
トカイン活性化マクロファ−ジ、腫瘍細胞及び動物は下
記のとおりである。 （サイトカイン活性化マクロファ−ジ）実施例Ａで得ら
れた単球を、500IU/mlのrIL-2（塩野義製薬（株）製）
及び10％ヒト血清を含有するRPMI-1640培地中で、5％Ｃ
Ｏ2下、37℃で６乃至１０日間培養し、実施例Ｃと同様
にして得たサイトカイン活性化マクロファ−ジを、洗浄
液（HANKS；日水社製）で２回洗浄した後、同洗浄液中
に懸濁させた。 （腫瘍細胞）10％ヒト血清含有RPMI-1640培地中で培養
したA375ヒトメラノ−マ細胞株を用いた。 （動物）生後４乃至６週齢のBalb/c nu/nuヌ−ドマウス
を用いた。
【００６２】方法１：前記のBalb/c nu/nuヌ−ドマウス
１匹（１群５匹）に対し、サイトカイン活性化マクロフ
ァ−ジ（２×１０6cell）とA375ヒトメラノ−マ細胞
（１×１０6cell）をHANKS（２００μｌ）中に懸濁させ
た混合物を背部皮下投与（ｓ．ｃ．；subcutaneously i
njection）した。投与後、７、１２、１４及び２０日目
に腫瘍面積算出式に基づき検体マウスの腫瘍面積を測定
した。
１匹（１群５匹）に対し、サイトカイン活性化マクロフ
ァ−ジ（２×１０6cell）とA375ヒトメラノ−マ細胞
（１×１０6cell）をHANKS（２００μｌ）中に懸濁させ
た混合物を背部皮下投与（ｓ．ｃ．；subcutaneously i
njection）した。投与後、７、１２、１４及び２０日目
に腫瘍面積算出式に基づき検体マウスの腫瘍面積を測定
した。
【００６３】
【数２】
【００６４】なお、対照にはA375ヒトマラノ−マ細胞
（１×１０6cell/200μｌ/匹）のみを投与したBalb/c n
u/nuヌ−ドマウスを用いた。結果を図７に示した。
（１×１０6cell/200μｌ/匹）のみを投与したBalb/c n
u/nuヌ−ドマウスを用いた。結果を図７に示した。
【００６５】方法２：前記のBalb/c nu/nuヌ−ドマウス
（１群６匹）に、A375ヒトメラノ−マ細胞（１×１０6c
ell/200μｌ/匹）を背部皮下投与し、投与後２日目にサ
イトカイン活性化マクロファ−ジ（２×１０6cell/200
μｌ/匹）を同じく背部皮下投与した。投与後、４、
７、１０及び１４日目に方法１と同様に検体マウスの腫
瘍面積を測定した。なお、対照にはA375ヒトマラノ−マ
細胞（１×１０6cell/200μｌ/匹）のみを投与したBalb
/c nu/nuヌ−ドマウスを用いた。結果を図８に示した。
（１群６匹）に、A375ヒトメラノ−マ細胞（１×１０6c
ell/200μｌ/匹）を背部皮下投与し、投与後２日目にサ
イトカイン活性化マクロファ−ジ（２×１０6cell/200
μｌ/匹）を同じく背部皮下投与した。投与後、４、
７、１０及び１４日目に方法１と同様に検体マウスの腫
瘍面積を測定した。なお、対照にはA375ヒトマラノ−マ
細胞（１×１０6cell/200μｌ/匹）のみを投与したBalb
/c nu/nuヌ−ドマウスを用いた。結果を図８に示した。
【００６６】A375ヒトメラノ−マ細胞のみを投与し本発
明のサイトカイン活性化マクロファ−ジを投与していな
い対照群では、著しい腫瘍の増大が観察されたのに対
し、A375ヒトメラノ−マ細胞に本発明のサイトカイン活
性化マクロファ−ジを混合して投与した動物群（方法
１）では腫瘍の増大の顕著な抑制が認められた。また、
ヒト癌患者を想定してA375ヒトメラノ−マ細胞を前投与
した後に腫瘍部位に本発明のサイトカイン活性化マクロ
ファ−ジを投与した動物群（方法２）においても、対照
群に比べ腫瘍の増大の抑制が認められた。本実験によ
り、本発明のサイトカイン活性化マクロファ−ジが、担
癌動物における癌の治療に有効であることが示された。
明のサイトカイン活性化マクロファ−ジを投与していな
い対照群では、著しい腫瘍の増大が観察されたのに対
し、A375ヒトメラノ−マ細胞に本発明のサイトカイン活
性化マクロファ−ジを混合して投与した動物群（方法
１）では腫瘍の増大の顕著な抑制が認められた。また、
ヒト癌患者を想定してA375ヒトメラノ−マ細胞を前投与
した後に腫瘍部位に本発明のサイトカイン活性化マクロ
ファ−ジを投与した動物群（方法２）においても、対照
群に比べ腫瘍の増大の抑制が認められた。本実験によ
り、本発明のサイトカイン活性化マクロファ−ジが、担
癌動物における癌の治療に有効であることが示された。
【００６７】
【発明の効果】本発明のサイトカイン活性化マクロファ
−ジは、広範囲の腫瘍細胞に対する高い細胞傷害活性を
有し、癌の治療分野における養子免疫療法で用いられる
細胞種として有用である。
−ジは、広範囲の腫瘍細胞に対する高い細胞傷害活性を
有し、癌の治療分野における養子免疫療法で用いられる
細胞種として有用である。
【００６８】
【図面の簡単な説明】
【００６９】図１乃至図４はＮＳＥ染色試験におけるヒ
ト末梢血単核細胞、マクロファ−ジ等の生物形態を示す
検鏡写真である。
ト末梢血単核細胞、マクロファ−ジ等の生物形態を示す
検鏡写真である。
【図１】ヒト末梢血単核細胞の生物形態を示す検鏡写
真。
真。
【図２】マクロファ−ジの生物形態を示す検鏡写真。
【図３】単球の生物形態を示す検鏡写真。
【図４】rＩＬ−２によって活性化されたマクロファ−
ジの生物形態を示す検鏡写真。
ジの生物形態を示す検鏡写真。
【００７０】図５及び図６は蛍光色素標識抗体法試験に
おけるサイトカイン活性化マクロファ−ジの生物形態を
示す検鏡写真である。
おけるサイトカイン活性化マクロファ−ジの生物形態を
示す検鏡写真である。
【図５】ＭＯ２−ＦＩＴＣによるサイトカイン活性化マ
クロファ−ジの生物形態を示す検鏡写真。
クロファ−ジの生物形態を示す検鏡写真。
【図６】anti Leu11a−ＦＩＴＣによるサイトカイン活
性化マクロファ−ジの生物形態を示す検鏡写真を示す。
性化マクロファ−ジの生物形態を示す検鏡写真を示す。
【００７１】図７及び図８は、動物モデルにおける本発
明のサイトカイン活性化マクロファ−ジの抗腫瘍活性を
腫瘍面積の増減により示したものである。
明のサイトカイン活性化マクロファ−ジの抗腫瘍活性を
腫瘍面積の増減により示したものである。
【図７】Balb/c nu/nuヌ−ドマウスに、本発明のサイト
カイン活性化マクロファ−ジとA375ヒトメラノ−マ細胞
を混合物を投与した後の腫瘍面積の増減を示す。縦軸は
腫瘍面積算出式に基づいて得られた腫瘍面積（mm2）
を、横軸はA375ヒトメラノ−マ細胞投与後の経過日数を
表す。
カイン活性化マクロファ−ジとA375ヒトメラノ−マ細胞
を混合物を投与した後の腫瘍面積の増減を示す。縦軸は
腫瘍面積算出式に基づいて得られた腫瘍面積（mm2）
を、横軸はA375ヒトメラノ−マ細胞投与後の経過日数を
表す。
【図８】Balb/c nu/nuヌ−ドマウスに、A375ヒトメラノ
−マ細胞を前投与し、２日後本発明のサイトカイン活性
化マクロファ−ジを投与した後の腫瘍面積の増減を示
す。縦軸は腫瘍面積算出式に基づいて得られた腫瘍面積
（mm2）を、横軸はA375ヒトメラノ−マ細胞投与後の経
過日数を表す。
−マ細胞を前投与し、２日後本発明のサイトカイン活性
化マクロファ−ジを投与した後の腫瘍面積の増減を示
す。縦軸は腫瘍面積算出式に基づいて得られた腫瘍面積
（mm2）を、横軸はA375ヒトメラノ−マ細胞投与後の経
過日数を表す。
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒト末梢血から単離した単球を、インタ
−ロイキン−２と単球／マクロファ−ジの分化又は活性
化に関与するその他のサイトカインの存在下にヒト血清
含有栄養培地を用いて培養し、培養液中に生成したサイ
トカイン活性化マクロファ−ジを分離、採取することを
特徴とするサイトカイン活性化マクロファ−ジの製造方
法。 - 【請求項２】 培養期間が６日間以上である請求項１記
載のサイトカイン活性化マクロファ−ジの製造方法。 - 【請求項３】 培養期間が６乃至17日間である請求項２
記載のサイトカイン活性化マクロファ−ジの製造方法。 - 【請求項４】 単球／マクロファ−ジの分化又は活性化
に関与するその他のサイトカインがインタ−ロイキン−
１又はコロニ−刺激因子−１である請求項１から請求項
３のいずれか１項に記載のサイトカイン活性化マクロフ
ァ−ジの製造方法。 - 【請求項５】 請求項１から請求項４のいずれか１項に
記載の方法により得られるサイトカイン活性化マクロフ
ァ−ジ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3296567A JPH05130863A (ja) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | サイトカイン活性化マクロフア−ジ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3296567A JPH05130863A (ja) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | サイトカイン活性化マクロフア−ジ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2101839A Division JPH0789907B2 (ja) | 1990-04-19 | 1990-04-19 | サイトカイン活性化マクロファージ及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05130863A true JPH05130863A (ja) | 1993-05-28 |
Family
ID=17835219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3296567A Pending JPH05130863A (ja) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | サイトカイン活性化マクロフア−ジ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05130863A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0804072A4 (en) * | 1994-07-03 | 1999-06-02 | Crotty Daphna | METHOD AND SYSTEM FOR CULTURING CELLS, ESPECIALLY MACROPHAGES |
| CN114107204A (zh) * | 2021-10-12 | 2022-03-01 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 脑胶质瘤巨噬细胞类配体的体系构建 |
-
1991
- 1991-10-17 JP JP3296567A patent/JPH05130863A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0804072A4 (en) * | 1994-07-03 | 1999-06-02 | Crotty Daphna | METHOD AND SYSTEM FOR CULTURING CELLS, ESPECIALLY MACROPHAGES |
| CN114107204A (zh) * | 2021-10-12 | 2022-03-01 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 脑胶质瘤巨噬细胞类配体的体系构建 |
| CN114107204B (zh) * | 2021-10-12 | 2023-10-27 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 脑胶质瘤巨噬细胞类配体的体系构建 |
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