CN114736858A - 一种脐带血nkt细胞的培养液及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脐带血NKT细胞的培养液及培养方法；该培养液包括组分为：由基础培养基添加细胞因子CD3、CD137、IL‑2、IL‑15、IL‑1β、SCF、FGF‑2及阿魏酸钠组成的第一培养基、由基础培养基添加细胞因子IL‑2、IL‑18、阿魏酸钠及大豆磷脂组成的第二培养基及由基础培养基添加细胞因子IL‑2、阿魏酸钠及大豆磷脂组成的第三培养基。该培养液中添加了细胞因子阿魏酸钠及大豆磷脂，缩短了37.5%的细胞培养周期，同时提升了NKT细胞的扩增倍数、纯度以及杀瘤效果。

Description

一种脐带血NKT细胞的培养液及培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养液的配制及培养方法，尤其涉及一种脐带血NKT细胞的培养液及培养方法。
背景技术
NKT 细胞（natural killer T Cell），是一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，是介导细胞毒活性最强的免疫细胞，兼具有T淋巴细胞的高度杀瘤活性和NK细胞非主要组织相兼容复合物（MHC）的限制性杀瘤效应。NKT 细胞其具有增殖速度快、杀瘤活性高等优点。
现阶段而言，NKT细胞培养是将分离的外周血单个核细胞( PBMC )用IFN-γ处理24小时后，加入CD3单抗，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，获得一定数量的NKT细胞，但最终获得的NKT细胞中有效细胞含量纯度低、细胞杀伤活性弱、且细胞扩增倍率相对不高。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种高纯度、高活性等脐带血NKT细胞的培养液及培养方法。
本发明的技术方案之一如下：
一种脐带血NKT细胞的培养液，包括如下组分：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为200～500ng/ml的CD3、终浓度为100～300ng/ml的CD137、终浓度为2000～3000IU/ml的IL-2、终浓度为20～50ng/ml的IL-15、终浓度为20～50ng/ml的IL-1β、终浓度为50～80ng/ml 的SCF、终浓度为600～800ug/ml的FGF-2及终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为10～30ng/ml的IL-18、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂。
一实施例，所述培养液中，包括如下组分：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为300ng/ml的CD3、终浓度为200ng/ml的CD137、终浓度为2500IU/ml的IL-2、终浓度为40ng/ml的IL-15、终浓度为25ng/ml的IL-1β、终浓度为65ng/ml 的SCF、终浓度为700ug/ml的FGF-2及终浓度为50ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2、终浓度为20ng/ml的IL-18、终浓度为55ng/ml阿魏酸钠及550ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2、终浓度为55ng/ml阿魏酸钠及550ug/ml的大豆磷脂。
一实施例，所述培养液中，包括如下组分：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为200ng/ml的CD3、终浓度为300ng/ml的CD137、终浓度为3000IU/ml的IL-2、终浓度为20ng/ml的IL-15、终浓度为20ng/ml的IL-1β、终浓度为50ng/ml 的SCF、终浓度为600ug/ml的FGF-2及终浓度为30ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为10ng/ml的IL-18、终浓度为30ng/ml阿魏酸钠及300ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为30ng/ml阿魏酸钠及300ug/ml的大豆磷脂。
一实施例，所述培养液中，包括如下组分：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为500ng/ml的CD3、终浓度为100ng/ml的CD137、终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的IL-15、终浓度为50ng/ml的IL-1β、终浓度为80ng/ml 的SCF、终浓度为800ug/ml的FGF-2及终浓度为80ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000IU/ml的IL-2、终浓度为30ng/ml的IL-18、终浓度为80ng/ml阿魏酸钠及800ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000IU/ml的IL-2、终浓度为80ng/ml阿魏酸钠及800ug/ml的大豆磷脂。
本发明的技术方案之二如下：
一种脐带血NKT细胞的培养方法，包括如下步骤：
1）配制第一培养基、第二培养基、第三培养基；其中，
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为200～500ng/ml的CD3、终浓度为100～300ng/ml的CD137、终浓度为2000～3000IU/ml的IL-2、终浓度为20～50ng/ml的IL-15、终浓度为20～50ng/ml的IL-1β、终浓度为50～80ng/ml 的SCF、终浓度为600～800ug/ml的FGF-2及终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为10～30ng/ml的IL-18、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂；
2）接种脐带血PBMC和培养；
第0天：使用悬浮细胞培养瓶500ml规格，加入285ml第一培养基及5v/v%血替15ml；接着，接种5000万个细胞，静置培养5天，第3天之后，摇晃培养瓶1～2次，使聚集的细胞分散开；
第5天：移除部分培养液，更换加入400ml第二培养基，摇匀细胞后静置培养3天；
第8天：移除部分培养液，更换加入500ml第三培养基，摇匀细胞后静置培养2天；
第10天：停止细胞培养，收集细胞，离心去除上清液，收集沉淀物，用生理盐水反复洗涤沉淀物多次，获得高纯度、高活性的脐带血NKT细胞。
一实施例，所述培养方法的步骤1)中：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为300ng/ml的CD3、终浓度为200ng/ml的CD137、终浓度为2500IU/ml的IL-2、终浓度为40ng/ml的IL-15、终浓度为25ng/ml的IL-1β、终浓度为65ng/ml 的SCF、终浓度为700ug/ml的FGF-2及终浓度为50ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2、终浓度为20ng/ml的IL-18、终浓度为55ng/ml阿魏酸钠及550ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2、终浓度为55ng/ml阿魏酸钠及550ug/ml的大豆磷脂。
一实施例，所述培养方法的步骤1)中：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为200ng/ml的CD3、终浓度为300ng/ml的CD137、终浓度为3000IU/ml的IL-2、终浓度为20ng/ml的IL-15、终浓度为20ng/ml的IL-1β、终浓度为50ng/ml 的SCF、终浓度为600ug/ml的FGF-2及终浓度为30ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为10ng/ml的IL-18、终浓度为30ng/ml阿魏酸钠及300ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为30ng/ml阿魏酸钠及300ug/ml的大豆磷脂。
一实施例，所述培养方法的步骤1)中：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为500ng/ml的CD3、终浓度为100ng/ml的CD137、终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的IL-15、终浓度为50ng/ml的IL-1β、终浓度为80ng/ml 的SCF、终浓度为800ug/ml的FGF-2及终浓度为80ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000IU/ml的IL-2、终浓度为30ng/ml的IL-18、终浓度为80ng/ml阿魏酸钠及800ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000IU/ml的IL-2、终浓度为80ng/ml阿魏酸钠及800ug/ml的大豆磷脂。
上述基础培养基为KBM581、GT-T551、X-VIVO 15或AIM-V。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、NKT细胞培养液中，配制三种不同营养组分的培养基质，并根据NKT细胞的生长活性周期，添加不同的培养基质，缩短了细胞培养周期（由16天缩短到10天左右），缩短37.5%的培养周期时间；
2、在三种培养基质，通过添加阿魏酸钠组分，来减少营养液中NKT细胞的聚集，起到疏散细胞的作用，有利于细胞快速生长；在第二、三培养基质中添加大豆磷脂组分，通过大豆磷脂的疏水性和增溶性，对悬浮的细胞起到进一步疏散作用，同时增溶性又可以充分溶解高密度的细胞代谢产生的物质，减少局部细胞聚集结团而导致大量死亡，从而维持细胞的高密度快速扩增生长。
3、培养基质加入阿魏酸钠和大豆磷脂组分，能够促进NKT细胞的激活，对NKT细胞的CD3+CD56+流式含量有较大的促进作用，提高了NKT细胞的纯度。
4、NKT细胞培养过程中，不同培养时间，添加不同组分的上述培养基质，尤其是阿魏酸钠和大豆磷脂组分的加入，使得培养出的NKT细胞纯度高、生长快且扩增倍率高，达到255~284倍左右，且NKT细胞杀伤活率高，具有较强的杀伤肿瘤细胞效果。
附图说明
图1为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1及对比例2的脐带血NKT细胞生长曲线图；其中，实施例1、实施例2、实施例3的脐带血NKT细胞培养10天，对比例1和2的脐带血NKT细胞培养16天；
图2为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1及对比例2的脐带血NKT细胞对肿瘤细胞K562的杀伤曲线图；
图3、4、5、6、7分别为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1及对比例2的脐带血NKT细胞培养后的CD3+CD56+表型检测图；其中，实施例1、实施例2、实施例3的脐带血NKT细胞培养10天，对比例1和对比例2的脐带血NKT细胞培养16天。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明中，采用外周血，即脐带血NKT细胞的培养。首先需要从脐带血中分离出单个核细胞PBMC，然后才由单个核细胞培养成NKT细胞。
脐带血中分离单个核细胞分离的具体操作如下：
（1）粗分离
本发明中，将血液分装到两支规格为50ml的离心管（标记为1号和2号离心管）中，每支离心管分装30ml，并计算血液体积。
用3ml规格的巴氏吸管吸取血样，滴2滴到EP管中，进行血细胞分析仪检测细胞数量。
将离心管中的血液离心处理；离心过程中，离心力为650g、离心时间为10min，且先升8档、后降8档。
另外准备两支相同规格的离心管（标记为3号和4号），每支离心管加入15ml淋巴细胞分离液。
（2）血浆制备
两支装有全血的离心管离心结束后，将离心管转移至安全柜台面，用25ml移液管吸取上层血浆至一支新的离心管（标记为5号）中；取1ml血浆作为留样，标记并放置于-20度冰箱储存；将装有剩余血浆的5号离心管封口膜封口，放置56℃水浴锅，灭活30min。
灭活结束后，立即将装有血浆的5号离心管放置在-20℃冰箱中15min，随后，取出5号离心管进行离心处理，此时，离心力为3000g、离心时间为10min。
最后，将5号离心管中的血浆上清液倒入至另一支新的离心管（标记为6号）中，封口，置于2-8℃冰箱中冷冻保存，待用。
（3）单个核细胞制备
用生理盐水1:1稀释上述1号和2号离心管中剩余下层血细胞并混匀；并将对应的将血细胞稀释液分别加入到盛有淋巴细胞分离液的3号和4号离心管中，进行如下处理。
即倾斜45°装有淋巴分离液的3号和4号离心管，分别用电动移液器将少量血细胞悬液加入到分离液上方1cm处，把血细胞悬液铺开；倾斜离心管的目的是使悬液与分离液接触。
再继续沿3号和4号离心管壁缓慢加入剩余的细胞悬液。操作时，切勿打乱液面界面，每管最多加到45ml。完后，保持3号和4号离心管竖直放置，小心转移放置到离心机中，进行离心处理，离心力为650g、离心时间为30分钟，且升1档，降0档（即最慢档）。
3号和4号离心管离心结束，小心取出离心管，可清晰看到细胞分层。注意轻拿轻放，保持离心管竖直放置，以免破坏细胞分层。缓慢转移到安全柜中，用10ml移液管将上层残留血浆去除后剩余2ml，再分别吸取3号和4号离心管中第二层白膜细胞约10ml加入到另外新的对应离心管（标记为7号和8号）中。
往7号和8号离心管中分别加入生理盐水到50ml刻度，混匀。将7号和8号离心管离心处理，离心力为650g、离心时间为10min，且离心时升8档、将8档。离心结束后，分别向7号和8号离心管内加入5~10ml生理盐水重悬细胞，将各离心管中的细胞沉淀后，合并收集到7号离心管中，并添加生理盐水补足到50ml刻度，再用10ml移液管吹打均匀后，滴2滴到EP管中，进行计数。
计数结束，从细胞液中按照5000万个数目单个核细胞为一份，单独装入到多支离心管中并重悬到50ml。随后将这些离心管进行离心处理，离心力为300g、离心时间为10min，且离心时升8档、降8档。离心结束后，弃去上清，每支离心管中的沉淀物即为所需的单个核细胞，也成为脐带血单个核细胞（PBMC）。
本发明还提供一种上述脐带血NKT细胞的培养液，其组分配比具体如下：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为200～500ng/ml的CD3、终浓度为100～300ng/ml的CD137、终浓度为2000～3000IU/ml的IL-2、终浓度为20～50ng/ml的IL-15、终浓度为20～50ng/ml的IL-1β、终浓度为50～80ng/ml 的SCF、终浓度为600～800ug/ml的FGF-2及终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为10～30ng/ml的IL-18、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂。
优选地，基础培养基为KBM581、GT-T551、X-VIVO 15或AIM-V中的任一种。
上述培养液的三种培养基中，基础培养基及添加的细胞因子CD3、CD137、IL-2、IL-15、IL-1β、SCF、FGF-2等为常用的基础性培养因子，现阶段NKT培养液中，基本上都会包含有这些细胞因子，或者包含部分细胞因子。但是，在本发明中，NKT培养液中还包括有阿魏酸钠和大豆磷脂等组分。阿魏酸钠组分，可以减少营养液中NKT细胞生长时的聚集，起到疏散细胞的作用，有利于细胞快速生长；大豆磷脂组分，具有疏水性和增溶性，对悬浮的细胞起到进一步疏散细胞、增溶细胞的聚集性，从而维持细胞的高密度生长；以及阿魏酸钠和大豆磷脂组分，能够促进NKT细胞的激活，对NKT细胞的CD3+CD56+流式含量有较大的促进作用，能够提高NKT细胞的纯度。
本发明还提供一种使用上述培养液进行脐带血NKT细胞培养的方法，其培养工艺步骤如下：
1）配制上述第一培养基、第二培养基、第三培养基；
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为200～500ng/ml的CD3、终浓度为100～300ng/ml的CD137、终浓度为2000～3000IU/ml的IL-2、终浓度为20～50ng/ml的IL-15、终浓度为20～50ng/ml的IL-1β、终浓度为50～80ng/ml 的SCF、终浓度为600～800ug/ml的FGF-2及终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为10～30ng/ml的IL-18、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂；
2）接种脐带血PBMC和培养
第0天：使用悬浮细胞培养瓶500ml规格，加入285ml第一培养基及5v/v%血替15ml；接着，接种5000万个上述脐带血分离出来的NKT细胞，静置37℃，5％CO2饱和湿度环境中的培养箱中培养5天；自第3天之后，摇晃培养瓶1～2次，使聚集的细胞分散开；其中，摇晃操作，如果培养瓶数量少，可以是人工手动操作摇晃；如果培养瓶数量较多，则可以采用摇摆床进行摇晃。
第5天：移除部分培养液，更换加入400ml第二培养基，摇匀细胞后静置培养3天；
第8天：移除部分培养液，更换加入500ml第三培养基，摇匀细胞后静置培养2天；
第10天：停止细胞培养，收集细胞，离心去除上清液，收集沉淀物，用生理盐水反复洗涤沉淀物多次，获得高纯度、高活性的脐带血NKT细胞。
由上可知，本发明NKT细胞培养过程中，不同培养时间，添加不同组分的上述培养基质，尤其是阿魏酸钠和大豆磷脂组分的加入，使得培养出的NKT细胞纯度高、生长快且扩增倍率高，且NKT细胞杀伤活率高，具有较强的杀伤肿瘤细胞效果。
下面通过一些具体实施例说明脐带血NKT细胞的培养。
一、NKT细胞培养
实施例1
1）、配制第一培养基、第二培养基、第三培养基
第一培养基：在X-VIVO 15基础培养基中添加终浓度为300ng/ml的CD3、终浓度为200ng/ml的CD137、终浓度为2500IU/ml的IL-2、终浓度为40ng/ml的IL-15、终浓度为25ng/ml的IL-1β、终浓度为65ng/ml 的SCF、终浓度为700ug/ml的FGF-2及终浓度为50ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在X-VIVO 15基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2、终浓度为20ng/ml的IL-18、终浓度为55ng/ml阿魏酸钠及550ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在X-VIVO 15基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2、终浓度为55ng/ml阿魏酸钠及550ug/ml的大豆磷脂。
2）、接种脐带血PBMC和培养
第0天：使用悬浮细胞培养瓶500ml规格，加入285ml第一培养基及5v/v%血替15ml；接着，接种5000万个上述脐带血分离出来的NKT细胞，静置37℃，5％CO2饱和湿度环境中的培养箱中培养5天，第3天之后，摇晃培养瓶1～2次，使聚集的细胞分散开；
第5天：移除部分培养液，更换加入400ml第二培养基，摇匀细胞后静置培养3天；
第8天：移除部分培养液，更换加入500ml第三培养基，摇匀细胞后静置培养2天；
第10天：停止细胞培养，收集细胞，离心去除上清液，收集沉淀物，用生理盐水反复洗涤沉淀物多次，获得高纯度、高活性的脐带血NKT细胞。
实施例2
1）、配制第一培养基、第二培养基、第三培养基
第一培养基：在KBM581基础培养基中添加终浓度为200ng/ml的CD3、终浓度为300ng/ml的CD137、终浓度为3000IU/ml的IL-2、终浓度为20ng/ml的IL-15、终浓度为20ng/ml的IL-1β、终浓度为50ng/ml 的SCF、终浓度为600ug/ml的FGF-2及终浓度为30ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在KBM581基础培养基中添加终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为10ng/ml的IL-18、终浓度为30ng/ml阿魏酸钠及300ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在KBM581基础培养基中添加终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为30ng/ml阿魏酸钠及300ug/ml的大豆磷脂。
2）、接种脐带血PBMC和培养
第0天：使用悬浮细胞培养瓶500ml规格，加入285ml第一培养基及5v/v%血替15ml；接着，接种5000万个上述脐带血分离出来的NKT细胞，静置37℃，5％CO2饱和湿度环境中的培养箱中培养5天，第3天之后，摇晃培养瓶1～2次，使聚集的细胞分散开；
第5天：移除部分培养液，更换加入400ml第二培养基，摇匀细胞后静置培养3天；
第8天：移除部分培养液，更换加入500ml第三培养基，摇匀细胞后静置培养2天；
第10天：停止细胞培养，收集细胞，离心去除上清液，收集沉淀物，用生理盐水反复洗涤沉淀物多次，获得高纯度、高活性的脐带血NKT细胞。
实施例3
1）、配制第一培养基、第二培养基、第三培养基
第一培养基：在AIM-V基础培养基中添加终浓度为500ng/ml的CD3、终浓度为100ng/ml的CD137、终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的IL-15、终浓度为50ng/ml的IL-1β、终浓度为80ng/ml 的SCF、终浓度为800ug/ml的FGF-2及终浓度为80ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在AIM-V基础培养基中添加终浓度为1000IU/ml的IL-2、终浓度为30ng/ml的IL-18、终浓度为80ng/ml阿魏酸钠及800ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在AIM-V基础培养基中添加终浓度为1000IU/ml的IL-2、终浓度为80ng/ml阿魏酸钠及800ug/ml的大豆磷脂。
2）、接种脐带血PBMC和培养
第0天：使用悬浮细胞培养瓶500ml规格，加入285ml第一培养基及5v/v%血替15ml；接着，接种5000万个上述脐带血分离出来的NKT细胞，静置37℃，5％CO2饱和湿度环境中的培养箱中培养5天，第3天之后，摇晃培养瓶1～2次，使聚集的细胞分散开；
第5天：移除部分培养液，更换加入400ml第二培养基，摇匀细胞后静置培养3天；
第8天：移除部分培养液，更换加入500ml第三培养基，摇匀细胞后静置培养2天；
第10天：停止细胞培养，收集细胞，离心去除上清液，收集沉淀物，用生理盐水反复洗涤沉淀物多次，获得高纯度、高活性的脐带血NKT细胞。
对比例1
1）、配制第一培养基、第二培养基、第三培养基；三种培养基中不含阿魏酸钠和大豆磷脂组分；
第一培养基：在X-VIVO 15基础培养基中添加终浓度为300ng/ml的CD3、终浓度为200ng/ml的CD137、终浓度为2500IU/ml的IL-2、终浓度为40ng/ml的IL-15、终浓度为25ng/ml的IL-1β、终浓度为65ng/ml 的SCF及终浓度为700ug/ml的FGF-2；
第二培养基：在X-VIVO 15基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2及终浓度为20ng/ml的IL-18；
第三培养基：在X-VIVO 15基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2。
2）、接种脐带血PBMC和培养
第0天：使用悬浮细胞培养瓶500ml规格，加入285ml第一培养基及5v/v%血替15ml；接着，接种5000万个上述脐带血分离出来的NKT细胞，静置37℃，5％CO2饱和湿度环境中的培养箱中培养5天，第3天之后，摇晃培养瓶1～2次，使聚集的细胞分散开；
第5天：移除部分培养液，更换加入400ml第二培养基，摇匀细胞后静置培养3天；
第8天：移除部分培养液，更换加入500ml第三培养基，摇匀细胞后静置培养2天；
第10天：停止细胞培养，收集细胞，离心去除上清液，收集沉淀物，用生理盐水反复洗涤沉淀物多次，获得高纯度、高活性的脐带血NKT细胞。
对比例2
1）、配制活化培养基和增殖培养基
初始培养基：含500U/mlIFN-γ，3μg/ml维生素C、1000U/mlIL-2和1μg/mlOK432的X-VIVO 15培养基；
扩增培养基：含1000U/ml IL-2和500ng/ml维生素C的X-VIVO 15培养基；
2）、NKT细胞培养
采用上述正常分血取得脐带血PBMC;
第0天接种，按1×106个/mL接种T175培养瓶，预先用含有5ug/ml CD3和2ug/ml重组人纤连蛋白的PBS（10ml体积）2-8℃包被3h；接着，45ml初始培养基加5ml血清，控制总体积50ml，静置37℃，5％CO2饱和湿度环境中的培养箱培养3天；
第3天补液，添加50ml扩增培养基，总体积为100ml；
第5天补液，添加100ml扩增培养基，总体积为200ml；
第7天补液，NKT细胞培养由培养瓶转入培养袋中仅需培养，添加400ml扩增培养基，总体积为600ml；
第9天补液，添加600ml扩增培养基，总体积为1200ml；
第11天补液，添加800ml扩增培养基，总体积为2000ml；
第13天补液，添加1000ml扩增培养基，总体积为3000ml；
第16天，培养停止，将培养袋中外周血NKT细胞及培养液一同转至离心管中，进行离心处理并去除上层液，并对采用0.9%的氯化钠溶液对下层的脐带血NKT细胞进行反复离心洗涤2~3次，得到脐带血NKT细胞。
二、试验测试结果表征
（一）、NKT细胞生长数量与扩增倍数
图1表示实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的脐带血NKT细胞培养生长曲线图；其中，实施例1、实施例2、实施例3的脐带血NKT细胞培养10天；对比例1和对比例2的脐带血NKT细胞培养16天，而对比例1中与实施例1相比，只是培养基不含阿魏酸钠和大豆磷脂组分。表1为对应图1中脐带血NKT细胞生长数量计数统计结果表。
图1和表1显示，NKT细胞经过10天或16天的培养增殖后，本发明实施例1至3的培养方法中，阿魏酸钠细胞因子的疏散作用下，减少了营养液中NKT细胞的聚集，提升了NKT细胞快速生长，缩短了细胞培养周期，获得相同细胞数量时，培养时间则由16天可以缩短到10天左右，如对比例2中，培养16天，NKT细胞的数量为1.38×1010个/ml，而本发明实施例1至3中，只需要培养10天，细胞生长数量就可以为就1.29×1010个/ml~1.42×1010个/ml，培养时间缩短37.5%。
本发明实施例1至3中，由于阿魏酸钠和大豆磷脂组分的加入，使得NKT细胞扩增倍数也得到显著提高，且获得大体相似的扩增倍数，培养时间确缩短40%左右，即由16天缩短到10天，缩短培养周期率高达37.5%。本发明实施例1至3中，NKT细胞培养10天的扩增倍数为283.4倍、270.4倍、255.6倍；对比例1和2中，NKT细胞培养16天的扩增倍数分别为280.4倍、275.2倍。
其中，对比例1与实施例1相比较，由于对比例1中培养基中未添加阿魏酸钠和大豆磷脂组分，所以从表1中可以看出，实施例1中，NKT细胞10天培养获得的细胞数量，在对比例1中，则需要培养16天左右；扩增倍数也是如此，实施例1培养10天达到283.4倍，对比例1需要培养16天才能达到280.4倍。这也就说明了阿魏酸钠和大豆磷脂组分可以促进NKT细胞快速扩增生长，从而大大缩短培养期。
NKT细胞快速生长的另一个因素是培养基质中的大豆磷脂组分，由于大豆磷脂具有较好的疏水性和增溶性，其疏水性可以对培养液中悬浮的NKT细胞可以起到进一步疏散作用，同时增溶性又可以充分溶解高密度的细胞代谢产生的物质，从而减少局部细胞聚集结团而导致大量死亡，进而达到维持细胞的高密度快速扩增生长的效果。
表1脐带血NKT细胞生长数量计数表（×108个/ml）
Figure 774558DEST_PATH_IMAGE001
（二）、外周血NKT细胞杀伤活性测试
取实施例1至3、对比例1、对比例2各自培养后的脐带血NKT细胞且细胞数量相同；其中，实施例1、实施例2、实施例3的脐带血NKT细胞培养10天；对比例1和对比例2的脐带血NKT细胞培养16天，而对比例1中与实施例1相比，只是培养基不含阿魏酸钠和大豆磷脂组分。
转至3组离心管组（每组离心管组5支离心管，每组都对应有实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2中培养的NKT细胞）中，将3组离心管组分别调整浓度约为1.0×106/ml、2.0×106/ml、4.0×106/ml的细胞悬液，作为3组效应细胞。
K562细胞作为靶细胞，按照效靶比1:1、5:1、10:1、20:1进行效应细胞NKT细胞和靶细胞K562进行铺孔，每组3个复孔。NKT细胞和K562靶细胞的每个孔分别为500μl。每孔加入500μl实施例1至3、对比例1和2中各自对应的培养基。
效应细胞NKT细胞自然释放组：1.0×106/ml、2.0×106/ml、4.0×106/ml的NKT细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
K562靶细胞最大释放组：1.0×105/ml的靶细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养40分钟。
K562靶细胞自然释放组：1.0×105/ml的靶细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
培养液空白对照试验组：每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
铺板后，将培养板250g离心4分钟，置于于37℃、5%CO2培养箱中培养4小时。在培养结束后前45分钟，取出培养板，在靶细胞最大释放组加入解冻液，250g离心4分钟，继续培养45分钟取出，之后轻轻混匀细胞，再300g离心5min，收集上清液，用LDH(乳酸脱氢酶)测定492nm波长的吸光度值。
杀伤活性按照如下公式计算：
杀伤活性=（A-B-C）/（D-C）×100%;
其中：
A-表示试验组吸光度值校正值；
B-表示效应细胞自然释放组；
C-表示靶细胞自然释放组；
D-表示靶细胞最大释放组；
测试结果见表2和图2；表2为图2中对应数据的具体整理，两者表示相一致。如图2所示， NKT细胞对肿瘤细胞K562的杀伤曲线图；其中分别表示实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2中对应脐带血NKT细胞杀伤活性率曲线。
表2 NKT细胞对K562靶细胞的杀伤活性检测
Figure 49551DEST_PATH_IMAGE002
由表2和图2可知，在杀伤K562细胞时，本发明实施例1至3中诱导的NKT细胞，比对比例1和2诱导的NKT细胞的杀伤效果更好，差异较明显。说明采用本发明培养液中细胞因子含阿魏酸钠和大豆磷脂的组合在培养NKT细胞时，可以增强杀伤肿瘤的活性。
其中，对比例1与实施例1相比较，由于对比例1中培养基中未添加阿魏酸钠和大豆磷脂组分，所以从表2中可以看出，实施例1中的NKT细胞相对于对比例1而已，NKT细胞的杀伤效果更好，尤其是效靶比20:1对应的杀伤率中，实施例1中杀伤率（128.45%）是对比例1为杀伤率（21.52%）的5.97倍，是对比例2杀伤率（17.49%）的7.34倍。这进一步说明，培养基中的阿魏酸钠和大豆磷脂组分，可以增强NKT细胞的杀伤肿瘤活性。
（三）、脐带血NKT细胞流式表型检测
图3、4、5、6、7分别为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的脐带血NKT细胞培养后的CD3+CD56+表型检测图；其中，实施例1、实施例2、实施例3的脐带血NKT细胞培养10天；对比例1和对比例2的脐带血NKT细胞培养16天，而对比例1中与实施例1相比，只是培养基不含阿魏酸钠和大豆磷脂组分。
分别取实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2培养的NKT细胞，制成细胞悬液并调整细胞浓度为1×105个/ml，加入标记的CD3+CD56+单克隆抗体，于室温暗处孵育20分钟，洗去多余抗体，用上流式细胞仪检测，测试结果如图3、4、5、6、7所示。
由图3、4、5、6、7说明，实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2中培养的脐带血NKT细胞, CD3+CD56+含量分别为75.71%、74.24%、74.51%、42.78%、38.08%。由此可知，本发明培养基中添加的细胞因子阿魏酸钠和大豆磷脂的组合使得CD3+CD56+含量（实施例1）高达75.71%，比对比例1和2的CD3+CD56+含量42.78%、38.08%分别高出约为2倍左右，从而反映出实施例1、实施例2、实施例3的培养液中，细胞因子含阿魏酸钠和大豆磷脂的组合后可以提升脐带血NKT细胞纯度。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脐带血NKT细胞的培养液，其特征在于，包括如下组分：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为200～500ng/ml的CD3、终浓度为100～300ng/ml的CD137、终浓度为2000～3000IU/ml的IL-2、终浓度为20～50ng/ml的IL-15、终浓度为20～50ng/ml的IL-1β、终浓度为50～80ng/ml 的SCF、终浓度为600～800ug/ml的FGF-2及终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为10～30ng/ml的IL-18、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂。
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，包括如下组分：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为300ng/ml的CD3、终浓度为200ng/ml的CD137、终浓度为2500IU/ml的IL-2、终浓度为40ng/ml的IL-15、终浓度为25ng/ml的IL-1β、终浓度为65ng/ml 的SCF、终浓度为700ug/ml的FGF-2及终浓度为50ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2、终浓度为20ng/ml的IL-18、终浓度为55ng/ml阿魏酸钠及550ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2、终浓度为55ng/ml阿魏酸钠及550ug/ml的大豆磷脂。
3.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，包括如下组分：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为200ng/ml的CD3、终浓度为300ng/ml的CD137、终浓度为3000IU/ml的IL-2、终浓度为20ng/ml的IL-15、终浓度为20ng/ml的IL-1β、终浓度为50ng/ml 的SCF、终浓度为600ug/ml的FGF-2及终浓度为30ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为10ng/ml的IL-18、终浓度为30ng/ml阿魏酸钠及300ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为30ng/ml阿魏酸钠及300ug/ml的大豆磷脂。
4.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，包括如下组分：
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为500ng/ml的CD3、终浓度为100ng/ml的CD137、终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的IL-15、终浓度为50ng/ml的IL-1β、终浓度为80ng/ml 的SCF、终浓度为800ug/ml的FGF-2及终浓度为80ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000IU/ml的IL-2、终浓度为30ng/ml的IL-18、终浓度为80ng/ml阿魏酸钠及800ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000IU/ml的IL-2、终浓度为80ng/ml阿魏酸钠及800ug/ml的大豆磷脂。
5.根据权利要求1至4任一所述的培养液，其特征在于，所述基础培养基为KBM581、GT-T551、X-VIVO 15或AIM-V。
6.一种脐带血NKT细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）配制第一培养基、第二培养基、第三培养基；其中，
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为200～500ng/ml的CD3、终浓度为100～300ng/ml的CD137、终浓度为2000～3000IU/ml的IL-2、终浓度为20～50ng/ml的IL-15、终浓度为20～50ng/ml的IL-1β、终浓度为50～80ng/ml 的SCF、终浓度为600～800ug/ml的FGF-2及终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为10～30ng/ml的IL-18、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000～2000IU/ml的IL-2、终浓度为30-80ng/ml阿魏酸钠及300-800ug/ml的大豆磷脂；
2）接种脐带血PBMC和培养；
第0天：使用悬浮细胞培养瓶500ml规格，加入285ml第一培养基及5v/v%血替15ml；接着，接种5000万个细胞，静置培养5天，第3天之后，摇晃培养瓶1～2次，使聚集的细胞分散开；
第5天：移除部分培养液，更换加入400ml第二培养基，摇匀细胞后静置培养3天；
第8天：移除部分培养液，更换加入500ml第三培养基，摇匀细胞后静置培养2天；
第10天：停止细胞培养，收集细胞，离心去除上清液，收集沉淀物，用生理盐水反复洗涤沉淀物多次，获得高纯度、高活性的脐带血NKT细胞。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述步骤1)中，
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为300ng/ml的CD3、终浓度为200ng/ml的CD137、终浓度为2500IU/ml的IL-2、终浓度为40ng/ml的IL-15、终浓度为25ng/ml的IL-1β、终浓度为65ng/ml 的SCF、终浓度为700ug/ml的FGF-2及终浓度为50ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2、终浓度为20ng/ml的IL-18、终浓度为55ng/ml阿魏酸钠及550ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1600IU/ml的IL-2、终浓度为55ng/ml阿魏酸钠及550ug/ml的大豆磷脂。
8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述步骤1)中，
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为200ng/ml的CD3、终浓度为300ng/ml的CD137、终浓度为3000IU/ml的IL-2、终浓度为20ng/ml的IL-15、终浓度为20ng/ml的IL-1β、终浓度为50ng/ml 的SCF、终浓度为600ug/ml的FGF-2及终浓度为30ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为10ng/ml的IL-18、终浓度为30ng/ml阿魏酸钠及300ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为30ng/ml阿魏酸钠及300ug/ml的大豆磷脂。
9.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述步骤1)中，
第一培养基：在基础培养基中添加终浓度为500ng/ml的CD3、终浓度为100ng/ml的CD137、终浓度为2000IU/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的IL-15、终浓度为50ng/ml的IL-1β、终浓度为80ng/ml 的SCF、终浓度为800ug/ml的FGF-2及终浓度为80ng/ml阿魏酸钠；
第二培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000IU/ml的IL-2、终浓度为30ng/ml的IL-18、终浓度为80ng/ml阿魏酸钠及800ug/ml的大豆磷脂；
第三培养基：在基础培养基中添加终浓度为1000IU/ml的IL-2、终浓度为80ng/ml阿魏酸钠及800ug/ml的大豆磷脂。
10.根据权利要求6至9任一所述的培养方法，其特征在于，所述基础培养基为KBM581、GT-T551、X-VIVO 15或AIM-V。
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