KR102081585B1 - 활성화 림프구 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD62L⁺CD44⁺ 세포의 비율이 60% 이상인 활성화 림프구 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 중심 기억 T 세포의 비율이 매우 높아 면역세포치료제, 항암제 등으로 활용 시에 우수한 체내 지속성을 나타내며, 제조 시에 혈청을 사용하지 않아 생산 원가가 낮고, 우수한 안전성을 나타낼 수 있는 활성화 림프구 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

활성화 림프구 및 이의 제조 방법{ACTIVATED LYMPHOCYTE AND PREPARING METHOD THEREOF}

본 발명은 활성화 림프구 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

암은 다양한 유전적 변이의 축적과 정상적인 세포의 조절 과정이 사라짐으로써 나타난다. 암의 발생을 조절하는 과정에서 면역체계는 암세포를 효과적으로 사멸시키기 위하여 몇 가지 순차적인 과정이 진행되어야 한다. 이를 암 면역 주기(Cancer Immunity Cycle)라고 한다. 암 면역 주기의 첫 번째 과정에서는 종양발생으로 만들어진 신규종양항원(Neoantigen)이 방출되고 이것을 처리하기 위해서 수지상세포(Dendritic Cell, DC)가 작용한다. 이 과정에서 전염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokine)과 같은 요소들이 죽어가는 종양세포에서 방출된다. 두 번째 단계에서는 수지상세포가 포획된 항원을 MHC-I과 MHC-II 분자형태로 표지하게 되고, 이것은 작용 T 세포(Effector T cell)을 활성화하여 종양 특이적인 항원에 대해 반응하게 된다. 마지막 단계에서는 활성화된 작용 T 세포가 종양이 있는 위치로 이동 및 침투하여 종양세포를 특이적으로 인지하고 사멸을 일으킨다. 암 환자에서는 이런 암 면역 주기가 정상적으로 작동하지 않는다.

암 발생의 억제와 촉진에 대한 면역체계의 역할에 대하여 “암 면역 편집(Cancer Immunoediting)”이라는 것이 존재하는데, 이는 크게 3단계로 구분된다. 1단계는 Elimination으로, 선천면역(innate immunity)과 획득면역(adoptive immunity)이 함께 작용하여 종양의 발생을 감지하고 사멸시키는 cancer immunosurveillance 과정을 말한다. 이 과정은 상기에서 말한 암 면역 주기과정과 동일하다. 2단계는 Equilibrium으로, Elimination 단계에서 종양이 살아남아서 획득면역이 종양의 증식을 막으면서도 종양에 면역원성이 형성되는 과정이다. 이 과정에서 면역체계가 잔여 종양세포에 대해서 일종의 ‘기능적 휴면기 상태’를 유지함으로써 암 면역 편집 과정에서 가장 긴 시간이 소요되는 단계로 여겨진다. 3단계는 Escape로, 종양세포가 면역체계를 피하여 증식하는 단계이다. 이 단계에서 종양세포는 항원을 잃고 세포독성면역에 대한 저항성이 증가되어있다. 또한 종양미세환경은 면역억제상태로, VEGF, TGF-beta와 같은 면역억제 사이토카인이 종양에서 분비된다. 더불어 조절 T 세포는 인터루킨-10, TGF-beta를 분비하여 종양 특이적인 T 림프구의 기능을 억제하고, negative-co-stimulatory molecule(PD-1등)을 발현하며 인터루킨-2를 소비하여 CTL의 기능 저하를 유도한다.

암을 치료하는 방법에는 1890년대 이전부터 현재까지 가장 오래 사용한 방법인 수술, 그 후로 방사선치료, 화학요법, 정밀의학요법이 발전되어왔다. 수술적인 방법으로 암을 치료하는 경우, 수술의 범위가 제한적일 수 있어 종양이 완전히 제거되지 않을 수 있다는 단점이 있다. 방사선 치료와 화학요법으로 암을 치료하는 경우, 암세포뿐 아니라 정상세포까지 독성의 영향을 받아 강한 부작용을 동반하는 경우가 많다. 정밀의학요법의 경우 환자마다 다른 유전체 정보, 환경적 요인, 생활습관 등을 종합적으로 분석하여 최적의 치료방법을 제공하는 것이지만, 현재 적용하고 있는 표준치료법은 특정집단에서의 결과로 도출된 방법을 사용함으로써 유전적, 생화학적으로 다양한 개인의 질환을 모두 치료할 수 없다는 단점이 있다. 항암면역치료법은 암 환자에서 면역시스템을 유발, 강화 또는 억제 시킴으로써 치료하는 방법으로 능동적 면역치료법과 수동적 면역치료법이 있다. 능동적 면역치료법은 반응이 느리지만 오랜 기간 치료효과가 유지된다는 장점을 가지고 있다. 대표적인 능동적 면역치료에는 백신, 면역관문억제제 등이 있다. 수동적 면역치료법은 빠르게 반응하지만 지속시간이 짧은 것이 특징이다. 대표적인 수동적 면역치료법에는 종양침윤림프구(Tumor infiltrating Lymphocyte, TIL), 단일클론항체, CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T Cell)과 획득성 면역치료법이 있다.

획득성 면역치료법은 환자로부터 채혈하여 면역세포만을 분리한 후 체외에서 항암활성을 증진시킬 수 있는 배양 과정을 통해 분화와 증식을 유도하고, 이로 인해 활성화된 면역세포를 다시 환자에게 주입함으로써 항암효과를 증진시키는 방법이다. 인터루킨-2 의 존재 하에 암환자의 말초 혈액에서 분리한 단핵구를 배양하여 세포독성 활성이 증가된 림프구 (Lymphokine-activated killer cells, LAK cells)를 얻었고, 이를 암환자의 치료에 시도하였으며 암환자의 암조직에 존재하는 림프구(Tumor Infiltration Lymphocytes, TIL)를 분리하여 같은 방식으로 배양하여 이를 암 환자의 치료에 이용하였다. 그러나 로젠버그 등의 방법은 결과적으로 제한된 임상효과를 보이는데 반하여 몇 가지 문제를 가지고 있었다. 고농도의 인터루킨-2 를 이용하기 때문에 이로 인한 부작용의 발생과 치료효과를 내기에 충분한 숫자의 림프구 확보가 어렵다는 것이었다.

세포독성 T 림프구(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)는 MHC의존성 세포독성을 보이는 CD8+ 림프구로서, 항원특이적으로 표적세포에 작용하여 Perforin과 Granzyme을 통한 세포사멸을 유도한다. 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine induced killer cell, CIK cells)는 CD3⁺CD56⁺의 표현형을 가지는 CTL의 일종이다. 말초혈액이나 백혈구분반술로 얻은 산물을 IFN-γ와 OKT-3, 인터루킨-2로 배양하는 CIK세포는 MHC 비의존성이면서 CD3-CD56+인 LAK에 비해서 더 높은 증식률과 세포독성활성을 가진다.

그러나, 이러한 기존 사이토카인 유도 살해세포 조성물의 배양 방법은 소태아혈청을 사용하기 때문에 높은 생산 원가 및 안전성 부분의 문제가 있었다. 또한 기존 배양 방법을 통해 생산한 사이토카인 유도 살해세포 조성물 안에는 즉각적인 암세포 사멸 효과를 가지는 효과 T 세포(Effector T cell)가 함유되어 있어 즉각적인 사멸 효과는 있으나 세포의 체내 지속성에 있어서는 그 효과가 불분명하였다.

한국공개특허 제2019-0004722호

본 발명은 우수한 체내 지속성을 갖는 활성화 림프구를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 원가를 절감하고 우수한 안전성을 갖는 활성화 림프구의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 활성화 림프구를 포함하는 항암 면역세포치료제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. CD62L⁺CD44⁺ 세포의 비율이 60% 이상인 활성화 림프구.

2. 위 1에 있어서, 상기 CD62L⁺CD44⁺ 세포의 비율이 60% 내지 70%인, 활성화 림프구.

3. 위 1에 있어서, CD3⁺CD8⁺의 세포의 비율이 50% 내지 70%, CD3⁺NKG2D⁺ 세포의 비율이 50% 내지 70%인, 활성화 림프구.

4. 위 1 내지 3 중 어느 한 항의 활성화 림프구를 포함하는 항암 면역세포치료제 조성물.

5. 위 4에 있어서, 상기 암은 췌장암, 위암, 유방암, 악성 폐신생물, 난소암, 뇌신생물, 담관암, 결장직장암, 담낭암, 직장암, 악성흑색종, 자궁경부암, 담관암, 결장암, 전이성 위암, 교모세포종, 신장암, 십이지장 신생물, 침샘 신생물, 식도암, 자궁내막암, 부비강암, 소장암종, 유잉육종, 자궁육종, 바터팽대의 악성 신생물, 전립샘암, 전립선 신생물, 골육종, 다형교모세포종, 별아교세포종, 자궁암, 흉선종, 내분비 신생물, 연부조직암, 뇌간교종, 재발 난소암, 혀신생물, 지방육종, 신경섬유종, 신경내분비 암종, 방광암, 악성 신생물, 림프종, 피부 신경내분비암종, 부신암, 횡문근 육종, 신생물, 자궁 평활근종, 전이성 유방암, 간암 및 반지세포암종으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 조성물.

6. 위 4에 있어서, 상기 암은 교모세포종인, 조성물.

7. 말초혈액에서 분리된 림프구를 항 CD3 항체 및 인터루킨-2를 포함하되, 혈청을 포함하지 않는 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 CD62L⁺CD44⁺ 세포의 비율이 60% 이상인 활성화 림프구의 제조 방법.

8. 위 7에 있어서, 상기 배양은 2단계 이상으로 수행되며,

1단계 배지는 항 CD3 항체 및 인터루킨-2를 포함하고, 2단계 배지는 인터루킨-2를 포함하는, 방법.

9. 위 7에 있어서, 상기 항 CD3 항체의 농도는 1㎍/ml 내지 10㎍/ml 이고, 상기 1단계 배지 및 2단계 배지에서 인터루킨-2의 농도는 100 내지 300U/ml인, 방법.

10. 위 1 내지 3 중 어느 한 항의 활성화 림프구를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

11. 위 10에 있어서, 상기 암은 췌장암, 위암, 유방암, 악성 폐신생물, 난소암, 뇌신생물, 담관암, 결장직장암, 담낭암, 직장암, 악성흑색종, 자궁경부암, 담관암, 결장암, 전이성 위암, 교모세포종, 신장암, 십이지장 신생물, 침샘 신생물, 식도암, 자궁내막암, 부비강암, 소장암종, 유잉육종, 자궁육종, 바터팽대의 악성 신생물, 전립샘암, 전립선 신생물, 골육종, 다형교모세포종, 별아교세포종, 자궁암, 흉선종, 내분비 신생물, 연부조직암, 뇌간교종, 재발 난소암, 혀신생물, 지방육종, 신경섬유종, 신경내분비 암종, 방광암, 악성 신생물, 림프종, 피부 신경내분비암종, 부신암, 횡문근 육종, 신생물, 자궁 평활근종, 전이성 유방암, 간암 및 반지세포암종으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 조성물.

12. 위 10에 있어서, 상기 암은 간암, 신장암, 췌장암, 악성흑색종, 전립샘암 및 대장암로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 조성물.

13. 위 10에 있어서, 상기 조성물은 상기 활성화 림프구, 식염수 및 사람 혈청 알부민을 포함하는 것인, 조성물.

본 발명의 활성화 림프구는 중심 기억 T 세포의 비율이 매우 높아, 면역세포치료제, 항암제 등으로 사용시에 우수한 체내 지속성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 제조 방법은 중심 기억 T 세포의 비율이 매우 높은 활성화 림프구를 제조할 수 있다.

본 발명의 제조 방법은 혈청의 첨가 없이 활성화 림프구를 제조하여, 생산 원가를 낮추고, 우수한 안전성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 항암제는 우수한 체내 지속성을 나타낼 수 있고, 이에 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 활성화 림프구 내의 세포 표현형을 FACS 분석법을 이용하여 확인한 것이다.
도 2는 활성화 림프구의 항암 효능을 마우스 동물모델에서 확인한 결과로 종양을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 통해 조직학적으로 분석한 사진이다.
도 3은 활성화 림프구 내의 세포 표현형을 FACS 분석법을 이용하여 확인한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 활성화 림프구에 관한 것이다.

본 명세서에서 활성화 림프구는 면역 작동세포(immune effector cell)의 집단으로서, CD3⁺CD56⁺ 세포, CD3⁺CD56^- 세포, CD3^-CD56⁺ 등을 포함하는 이형 세포 집단이다.

본 발명의 활성화 림프구는 CD62L⁺CD44⁺ 세포의 비율이 60% 이상이다. 구체적으로, 상기 CD62L⁺CD44⁺ 세포의 비율이 60% 내지 70%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같이 체내 지속성이 강한 중심 기억 T세포를 다량으로 포함함으로써, 면역 세포 치료제 등으로 활용되는 경우에 우수한 체내 지속성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 활성화 림프구는 여러 표현형을 갖는 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면, CD3⁺CD56⁺, CD3⁺CD56^-, CD3⁺CD8⁺, CD3⁺NKG2D⁺ 등일 수 있다.

구체적인 예를 들면, 본 발명의 활성화 림프구는 CD3⁺CD56⁺ 세포의 비율이 10% 이상, 구체적으로 20% 내지 30%일 수 있고, 보다 구체적으로 20% 내지 25%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

CD3⁺CD56^- 세포의 비율은 예를 들면 60% 이상, 구체적으로 70% 내지 80%일 수 있고, 보다 구체적으로 70% 내지 75%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

CD3⁺CD8⁺ 세포의 비율은 예를 들면 50% 이상, 구체적으로 50% 내지 70%, 보다 구체적으로 60% 내지 70%, 더욱 구체적으로 60% 내지 65%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. CD3⁺CD8⁺ 세포를 상기와 같이 고비율로 포함하는 경우에 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.

CD3⁺NKG2D⁺ 세포의 비율은 예를 들면 50% 이상, 구체적으로 50% 내지 70%일 수 있고, 보다 구체적으로 60% 내지 70%, 더욱 구체적으로 60% 내지 65%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. CD3⁺NKG2D⁺ 세포를 상기와 같이 고비율로 포함하는 경우에 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 활성화 림프구는 말초혈액으로부터 분리된 림프구를 활성화, 증식, 배양하여 얻어진 것일 수 있으며, 구체적으로는 말초혈액에서 분리된 림프구를 항 CD3 항체 및 인터루킨-2를 포함하되, 혈청을 포함하지 않는 배지에서 배양하여 얻어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 전술한 사이토카인 유도 살해세포를 포함하는 항암 면역세포치료제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 면역세포치료제란 체외에서 사람의 혈액 내에 존재하는 면역세포를 대량 증식 및 활성화시켜 다시 본인에게 투여하여 암을 치료하는 항암면역 세포치료제 중의 하나로서 수지상세포 (Dendritic cells)을 이용한 항암 면역세포치료제와 마찬가지로 환자 본인의 면역세포를 활성화하여 체내 면역을 유도하는 개인 맞춤식 항암치료제이다.

본 발명의 조성물은 전술한 사이토카인 유도 살해세포를 포함함으로써 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있으며, 특히 중심 기억 T세포를 다량으로 포함함으로써, 우수한 체내 지속성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 조성물의 예방 또는 치료 대상인 암은 예를 들면 췌장암, 위암, 유방암, 악성 폐신생물, 난소암, 뇌신생물, 담관암, 결장직장암, 담낭암, 직장암, 악성흑색종, 자궁경부암, 담관암, 결장암, 전이성 위암, 교모세포종, 신장암, 십이지장 신생물, 침샘 신생물, 식도암, 자궁내막암, 부비강암, 소장암종, 유잉육종, 자궁육종, 바터팽대의 악성 신생물, 전립샘암, 전립선 신생물, 골육종, 다형교모세포종, 별아교세포종, 자궁암, 흉선종, 내분비 신생물, 연부조직암, 뇌간교종, 재발 난소암, 혀신생물, 지방육종, 신경섬유종, 신경내분비 암종, 방광암, 악성 신생물, 림프종, 피부 신경내분비암종, 부신암, 횡문근 육종, 신생물, 자궁 평활근종, 전이성 유방암, 간암, 반지세포암종 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들면 1x10⁹ 내지 2x10¹⁰ 세포가 포함된 조성물을 투여할 수 있고, 그 용량은 예를 들면 100ml 내지 1000ml, 구체적으로 100ml 내지 300ml일 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 CD62L⁺CD44⁺ 세포의 비율이 60% 이상인 활성화 림프구의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 말초혈액에서 분리된 림프구를 항 CD3 항체 및 인터루킨-2를 포함하되, 혈청을 포함하지 않는 배지에서 배양하는 단계;를 포함한다.

말초혈액은 자가말초혈액일 수 있다.

필요에 따라 말초혈액을 원심분리하여 상층의 혈장층을 제거하고 분리한 단핵구층으로부터 림프구를 얻을 수 있다.

림프구를 항 CD3 항체 및 인터루킨-2를 포함하되, 혈청을 포함하지 않는 배지에서 배양한다.

림프구를 항 CD3 항체 및 인터루킨-2를 포함하는 배지에서 배양함으로써 림프구를 활성화, 증식시킬 수 있다.

항 CD3 항체의 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 0.1㎍/ml 내지 100㎍/ml 일 수 있고, 구체적으로는 1㎍/ml 내지 10㎍/ml일 수 있다.

항 CD3 항체는 배양 플라스크에 코팅되어 제공되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

인터루킨-2의 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 50U/ml 내지 500U/ml일 수 있고, 구체적으로는 100U/ml 내지 300U/ml일 수 있다.

본 발명에 따른 배지는 혈청을 포함하지 않는다. 혈청을 포함하지 않는 배지에서 배양함으로써 중심 기억 T 세포의 비율을 크게 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 배지는 그 외 림프구 배양을 위해 통상 사용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들면 L-글루타민(L-Glutamine), 페놀레드(phenol red), 2'-디옥시구아노신(2'-Deoxyguanosine), 2'디옥시아데노신(2'-Deoxyadenosine), 2'-디옥시사이티딘 HCl(2'-Deoxycytidine HCl), 아데노신(Adenosine), 아스코르브산(Ascorbic Acid), 비오틴(Biotin), 염화칼슘 (수화물)(Calcium Chloride(CaCl₂) (anhyd.), 염화콜린(Choline chloride), 사이티딘(Cytidine), D-판토텐산칼슘(D-Calcium pantothenate), 엽산(Folic Acid), 글라이신(Glycine), 구아노신(Guanosine), L-알라닌(L-Alanine), L-아르기닌(L-Arginine), L-아스파라긴-H₂O(L-Asparagine-H₂O), L-아스파르트산(L-Aspartic acid), L-시스테인 하이드로클로라이드-H₂O(L-Cysteine hydrochloride-H₂O), L-시스테인 2HCl(L-Cystine 2HCl), L-글루탐산(L-Glutamic Acid), L-글루타민(L-Glutamine), L-히스티딘(L-Histidine), L-이소류신(L-Isoleucine), L-류신(L-Leucine), L-라이신(L-Lysine), L-메티오닌(L-Methionine), L-페닐알라닌(L-Phenylalanine), L-프롤린(L-Proline), L-세린(L-Serine), L-트레오닌(L-Threonine), L-트립토판(L-Tryptophan), L-타이로신 이나트륨염(L-Tyrosine disodium salt), L-발린(L-Valine), 황산마그네슘 (수화물)(Magnesium Sulfate (MgSO₄)) (anhyd.), 나이아신아마이드(Niacinamide), 염화칼륨(Potassium Chloride (KCl)), 피리독살하이드로클로라이드(Pyridoxal hydrochloride), 리보플라빈(Riboflavin), 중탄산나트륨(Sodium Bicarbonate (NaHCO₃)), 염화나트륨(Sodium Chloride (NaCl)), 제일인산나트륨 수화물(Sodium Phosphate monobasic (NaH₂PO₄-H₂O)), 티아민 하이드로클로라이드(Thiamine hydrochloride), 티미딘(Thymidine), 우리딘(Uridine), 비타민 B12(Vitamin B12), i-이노시톨(i-Inositol) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

시판되는 제품의 예시로는 LONZA사의 X-Vivo 15 배지와 GIBCO의 α-MEM 배지를 들 수 있으며, 이를 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 두 배지를 혼합하여 사용하는 경우의 구체적인 예를 들자면, 그 혼합비는 1:9 내지 9:1일 수 있고, 보다 구체적으로는 3:7 내지 7:3일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

필요에 따라 상기 배양은 여러 단계로 수행될 수 있다. 예를 들어, 1단계 또는 2단계 이상으로 수행될 수 있다.

2단계 이상으로 수행되는 경우, 예를 들면 1단계에서 배양된 림프구를 분리해 내고, 2단계에서 이를 새로운 배지로 옮겨 배양할 수 있다.

2단계 이상으로 수행되는 경우, 1단계 배지는 항 CD3 항체 및 인터루킨-2를 포함하고, 2단계 배지는 인터루킨-2를 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로는 1단계 배지는 항 CD3 항체 및 인터루킨-2를 포함하고, 2단계 배지는 인터루킨-2를 포함하되, 항 CD3 항체는 포함하지 않을 수 있다.

항 CD3 항체, 인터루킨-2는 전술한 범위 내의 농도로 포함될 수 있으며, 앞서 예시한 배지를 사용할 수 있다.

배양은 일반적인 세포배양방법, 예를 들면 CO₂ 인큐베이터 내에서 행해질 수 있다. CO₂ 농도는 예를 들면 1 내지 10%, 구체적으로는 3 내지 7% 일 수 있고, 온도는 30 내지 40℃, 구체적으로 35 내지 38℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양은 림프구가 충분히 활성, 증식할 때까지 수행될 수 있으며 예를 들면 10일 내지 30일, 구체적으로 12일 내지 21일간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양 효율 개선을 위해, 배양 동안 세포 수 증가에 맞추어 배지를 추가해주는 것이 바람직하다. 배지 추가의 주기는 배양액의 열화 방지를 위해 예를 들면 1 내지 10일, 구체적으로 1 내지 7일에 1회씩 추가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이후 필요에 따라 배지를 원심분리하여 상층액을 제거하여 활성화 림프구를 분리할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 활성화 림프구를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 암의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 췌장암, 위암, 유방암, 악성 폐신생물, 난소암, 뇌신생물, 담관암, 결장직장암, 담낭암, 직장암, 악성흑색종, 자궁경부암, 담관암, 결장암, 전이성 위암, 교모세포종, 신장암, 십이지장 신생물, 침샘 신생물, 식도암, 자궁내막암, 부비강암, 소장암종, 유잉육종, 자궁육종, 바터팽대의 악성 신생물, 전립샘암, 전립선 신생물, 골육종, 다형교모세포종, 별아교세포종, 자궁암, 흉선종, 내분비 신생물, 연부조직암, 뇌간교종, 재발 난소암, 혀신생물, 지방육종, 신경섬유종, 신경내분비 암종, 방광암, 악성 신생물, 림프종, 피부 신경내분비암종, 부신암, 횡문근 육종, 신생물, 자궁 평활근종, 전이성 유방암, 간암 및 반지세포암종으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있고, 구체적으로는 간암, 신장암, 췌장암, 악성흑색종, 전립샘암 및 대장암로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 앞서 예시한 다양한 담체, 부형제, 희석제 등을 포함할 수 있으며, 일 구현예에 따르면 식염수를 포함할 수 있고, 구체적으로는 활성화 림프구, 식염수, 사람 혈청 알부민을 포함하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 상기 성분들로 이루어진 것일 수 있다.

사람 혈청 알부민은 식염수에 포함되어 제공될 수 있고, 구체적으로 0.5% 내지 3%, 보다 구체적으로 1% 사람 혈청 알부민일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

1. 활성화 림프구의 제조

(1) 채혈과 림프구의 분리

본 발명에서 사용된 활성화 림프구는 환자의 자가말초혈액 20~70mL을 채취하여 제조를 시작한다. 채취된 혈액은 250mL 시험관으로 옮긴 후 RPMI1640와 1:2의 비율로 3배 희석한 뒤, Ficoll-paque가 분주되어있는 50mL 시험관에 희석한 혈액 30~40mL을 층이 섞이지 않게 분주하고 회전수 2,000rpm으로 실온에서 20분간 원심분리를 실시한다.

상층의 혈장층을 림프구 층의 세포가 빨려 들어가지 않도록 서서히 제거한 후 분리된 단핵구 층을 50mL 시험관에 옮긴다. 분리된 단핵구 층을 RPMI1640과 1:2로 3배 희석한 뒤, 회전수 2,000rpm으로 실온에서 5분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 모아진 세포를 풀어준다.

(2) 림프구 배양

(1)에서 분리한 림프구를 IC-MXFT(X-vivo 15) 50mL에 풀어주고 항 CD3 항체가 바닥면적 225cm²에 코팅된 플라스크에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양을 개시한다.

인터루킨-2의 경우 배양이 종료되는 시점까지 100U/ml 내지 300U/ml의 농도로 유지한다.

배양 3일째, 배양 중인 플라스크를 꺼내 현미경으로 세포를 육안 확인 후 세포농도의 증가에 따라 IC-MXFT(X-vivo 15)를 50mL 넣어주고 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양한다.

배양 4일째, 배양 중인 플라스크를 꺼내 현미경으로 세포를 육안 확인 후 세포농도의 증가에 따라 IC-MXFT(X-vivo 15)를 150mL 넣어주고 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양한다.

(3) 림프구 배양 (Bag 공정)

배양 5~8일째, 배양 중인 플라스크를 꺼내 플라스크 측면에 손으로 충격을 주어 바닥에 붙은 세포를 떼어낸다. 750ml의 IC-MXFT(X-vivo 15)가 들어있는 Bag을 준비하고 syringe port를 열어서 70%의 에탄올로 소독한 후, 60mL Lock 타입 주사기를 연결한다. 주사기를 이용하여 플라스크에 배양된 세포를 배지와 함께 옮긴 후, Bag과 주사기를 분리한다. Bag용 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 폐쇄계 배양을 시작한다.

(4) 림프구 배양 (Split 공정)

Bag내 배양 3~8일 후 1000ml의 IC-MXFT(X-vivo 15)가 들어있는 배지와 세포를 배양하고 있는 Bag의 양쪽 라인을 무균연결장치를 사용하여 접합한다. 각 배양 용기에 동일한 양이 들어가도록 균등 분할하여 무균접합기를 이용해 두 Bag을 분리 접합 시킨다. 이 후 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 폐쇄계 배양을 3일 이상 배양한다.

(5) 오염 및 성능의 확인

세포를 수집하기 전 배양중인 제품의 시험 샘플을 채취해 제품의 오염과 성능을 확인한다.

(5)-1: 세포 수집 3일 전, 세포 육안시험을 실시한 후 채취 전 세포가 골고루 섞이도록 배양액을 흔들어 준다.

(5)-2: 세포 수집 1일 전 또는 당일, 세포 육안시험을 실시한 후 채취 전 세포가 골고루 섞이도록 배양액을 흔들어 준다. 세포 배양 중인 Bag의 Syringe port를 먼저 소독한 후 주사기로 세포배양액을 일부 채취하여 각 시험(D, E)에 의뢰한다.

A: 무균시험

B: 마이코플라스마 부정시험

C: 외래성 바이러스 부정시험

D: 확인시험 및 순도시험

E: 역가시험

(6) 세포 수집

배양 12 ~ 21일에 배양을 종료하고 Bag 하나의 세포 배양액 1,000ml을 250ml 시험관 4개에 옮긴다. 이 때 배양백의 수집 라인을 70% 에탄올로 소독한 후 가위로 자른다.

회전속도 2,000rpm 으로 실온에서 5분간 원심분리하여 세포를 모은 후, 상층액을 제거 한 뒤 vortex를 이용해 세포를 잘 풀어준다. 나머지 Bag도 동일한 시험관 4개에 세포 배양액을 모아 상동의 조건에서 원심분리를 한 뒤, 상층액을 제거하고 세포를 잘 풀어준다.

사람혈청알부민과 생리식염수를 섞어 0.1% 사람혈청알부민 용액을 만든 후, 시험관에 있는 세포를 1회차 세척한다.

회전속도 2,000rpm으로 실온에서 5분간 원심분리하여 세포를 모은 후 상층액을 깨끗이 제거한 뒤, vortex를 이용해 세포를 풀어준다.

0.1% 사람혈청알부민 용액으로 2회차 세척 후 회전속도 2,000rpm으로 실온에서 원심분리하여 세포를 모은 후 상층액을 깨끗이 제거한 뒤 vortex를 이용해 세포를 풀어준다.

사람혈청알부민과 생리식염수를 섞어 1% 사람혈청알부민 용액을 만든다.

모아진 세포를 1% 사람혈청알부민 용액에 부유시킨 뒤, 골고루 혼합한다. 검체 중 일부를 채취하여 각 시험(A~D)에 의뢰한다.

완제품 충전백의 라인을 70% 에탄올로 소독한 후 잘라서 50mL 주사기와 연결한 후 세포부유액을 완제품 충전백에 충전한다. 완제품 충전백의 라인은 입구로부터 1cm 위치에서 3번 밀봉한 후 두번째 밀봉 부분을 잘라주어 최종적으로 활성화 림프구를 완성하였다.

A: 총 세포 수 측정시험 및 세포 생존율시험

B: 무균시험

C: 엔도톡신시험

D: 마이코플라스마 검출시험

2. 총 세포 수 측정시험 및 세포 생존율 시험

제조가 완료된 조성물에서 20㎕를 채취하여 count solution 0.98mL에 혼합한다. 혼합 용액 10㎕와 트리판 블루 용액(Gibco, 미국) 20㎕를 혼합하여 잘 섞어준 후 헤모사이토미터와 커버글라스를 준비한다. 헤모사이토미터와 커버 글라스 사이에 혼합용액을 10㎕ 넣고 광학현미경으로 트리판블루로 염색된 세포(죽은 세포)와 염색되지 않은 세포의 수(살아있는 세포)를 센다. 헤모사이토미터에서 3개 칸에 있는 세포 수를 세서 mL당 세포 수와 세포 생존율을 계산한다.

3. 제조된 활성화 림프구의 세포 표현형 분석

사이토카인 유도 살해세포와 중심 기억 T 세포의 분포 정도를 확인하기 위하여, 배양 완료된 세포의 샘플을 일부 채취하여 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)로 분석하였다.

음성 대조군 항체로 IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG-APC를 준비하고 실험군 항체로 항 CD3-FITC, 항 CD8-PE, 항 CD56-APC, 항 CD62L-FITC, 항 CD44-PE, 항 NKG2D-PE, 항 CD8-APC를 준비한다. 완충용액은 albumin이 0.5% 함유된 인산염완충용액으로 사용한다.

배양이 완료된 활성화 림프구의 세포 수를 측정하고 적절한 개수의 세포를 준비한다. 회전수 1,600rpm으로 실온에서 4분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 0.5x10⁷cells/mL이 되도록 완충용액을 넣어준다. 5mL 시험관을 준비한 후 0.5x10⁷cells/mL의 세포부유액을 각각 100㎕씩 넣고 대조군 항체와 실험군 항체를 넣는다. 잘 섞어준 후 암소 상태로 상온에서 30분 동안 반응시킨다. 30분 경과 후 완충용액 1mL을 첨가하고 회전수 1,600rpm으로 상온에서 4분간 원심분리한다. 상층액 제거 후 완충용액을 500㎕씩 넣어준 후 유세포분석기로 세포 표현형을 분석한다.

4. 제조된 활성화 림프구의 세포 독성(역가) 분석

역가는 세포독성검사의 일종인 "LDH cytotoxicity assay"에 따라 시험한다.

Target cell의 총 세포 수를 구한다. V-bottom 96-well plate의 Target cell LDH release를 측정하는 well에 배지 50㎕를 넣는다. Target cell은 target cell LDH release를 측정하는 well과 effector cell과의 반응을 알아보는 well에 2x10⁴cells/well씩 나누어 분주한다. Effector cell과 target cell(E/T)의 비율이 30:1 이므로 effector cell(검체)을 effector cell의 30배수가 되도록 넣고 배지량을 맞춰주기 위해서 target cell이 들어가지 않은 well에는 배지 50㎕를 첨가한다. 배지 자체에 의한 흡광도 증가의 배제를 위해 음성대조군은 배지 100㎕만 넣은 8well을 준비한다. 양성대조군, 음성대조군, 세포 독성(역가) 측정을 위한 모든 검체가 준비된 V-bottom 96well plate를 회전수 250g로 4분간 원심분리 실시 후 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 배양한다. 세포가 모두 lysis되었을 때의 흡광도 값을 확인하기 위해 반응시간이 끝나기 45분전 양성대조군으로 target만 넣은 4well에 lysis solution(9% Triton X-100)을 10㎕ 넣어서 준비한다. 4시간 후 회전속도 250g로 4분간 원심분리 후 상층액만 각각의 well에서 50㎕씩 따서 flat-bottom 96 well plate의 각각의 well로 옮긴다. 배지를 옮겨준 모든 well에 reaction solution (Diaphorase/NAD/INT)을 50㎕씩 분주한 후 호일로 감싸 실온에서 30분간 반응시킨다. 30분 반응이 끝난 후 각각의 well에 stop solution(1M acetic acid)을 50㎕씩 넣고 분광광도계(Bio-rad, 미국 또는 동등이상)로 490nm에서 흡광도를 측정한다.

5. 제조된 활성화 림프구의 항암 효능 평가 항목, 평가 방법 및 동물모델의 준비

Human glioblastoma cancer (U87MG)에 대한 항암 효과 규명

동물모델 제작 및 시험물질 투여

누드 마우스(Nude mouse)는 구입 후, 약 1주일동안 순화한 후 사용하였다. Human glioblastoma cancer인 U87MG 세포는 누드마우스에 2Х10⁵/5㎕의 농도로 두개 내에 주사하였으며 암세포 이식 1일 후, 활성화 림프구를 누드마우스의 꼬리정맥으로 매주 1회씩 총 4회 주사하였다.

종양 성장에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 조성물 투여 5주 후 종양 크기와 무게 측정 및 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 통해 조직학적 분석을 수행하였다.

6. 총 세포 수 측정시험 및 세포 생존율 시험 결과

무혈청배지에서 배양한 경우 총 세포 수는 5.2Х10⁹를 나타내었으며, 생존율의 경우 94.9%로 확인되었다. 따라서 소태아혈청을 포함하지 않아도 세포 증식과 생존에는 영향이 없음을 확인하였다.

7. 활성화 림프구의 세포 표현형 분석 결과

1) 상기 실시예 1에 따라 제조된 활성화 림프구의 세포 표현형 분석 결과, 가장 강한 세포 독성을 보이는 CD56⁺ 세포는 전체의 25.5%를 차지하였다. 그 중 MHC 비의존성이면서 CD56⁺을 단독 발현하는 세포군보다 더 높은 증식률과 세포 독성 활성을 가지는 세포인 사이토카인 유도 살해세포인 CD3⁺CD56⁺ 세포군은 전체의 23.8%를 차지하였다.

2) 상기 실시예 1에 따라 제조된 활성화 림프구의 중심 기억 T 세포의 분포를 확인하기 위해 CD62L⁺CD44⁺ 세포군을 확인하였다. 혈청이 포함된 배지를 사용하여 배양한 경우 중심 기억 T 세포의 비율은 21.7%를 차지하였고 무혈청배지를 사용하여 배양한 세포군의 경우에는 65.3%로 혈청이 포함된 배지보다 약 3배 높은 중심 기억 T 세포군의 비율을 보였다. (도 1 참고)

8. 제조된 활성화 림프구의 세포 독성(역가) 분석 결과

무혈청배지에서 제조한 조성물의 역가는 35.9%로 혈청으로 제조한 경우와 동등함을 확인하였다.

9. 제조된 활성화 림프구의 항암 효능 평가 항목, 평가 방법 및 암종별 동물모델 결과

1) 종양 크기 변화

대조군의 경우 종양 크기가 중간값 기준 18.6mm³까지 성장하였으며, 소태아혈청이 포함된 배지로 배양한 조성물을 투여한 경우 9.8mm³로 47%의 성장억제를, 무혈청배지로 배양한 조성물을 투여한 경우 5.0mm³로 73%의 성장억제를 나타내었다.

2) 종양 무게 변화

대조군의 경우 평균 종양 무게는 21.5mg이었으며, 소태아혈청이 포함된 배지로 배양한 조성물을 투여한 경우 11.2mg로 48%의 성장억제를, 무혈청배지로 배양한 조성물을 투여한 경우 6.7mg로 69%의 성장억제를 나타내었다. (표 1, 2 참고)

Group	Tumor mass(mm3)
	Median	Range
Control	18.6	14.5-34.4
소태아혈청	9.8	0.9-24.1
무혈청배지	5.0	4.5-10.6

Group	Mean	S.E.M.	SD
Control	21.5	4.4	8.8
소태아혈청	11.2	5.4	10.8
무혈청배지	6.7	2.0	3.4

3) 조직학적 분석 결과

대조군과 종양 크기 비교 시, 소태아혈청이 포함된 배지로 배양한 조성물과 무혈청배지로 배양한 조성물을 투여하였을 경우 모두 종양의 크기가 줄어든 것을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 실험을 통해 육안으로 확인하였다. (도 2 참고)

Claims (13)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 말초혈액에서 분리된 림프구를 항 CD3 항체 및 인터루킨-2를 포함하되, 혈청 또는 혈청 대체물을 포함하지 않는 배지에서 배양하는 단계;를 포함하고,
   상기 배양은 2단계 이상으로 수행되며,
   1단계 배지는 항 CD3 항체 및 인터루킨-2를 포함하고, 2단계 배지는 인터루킨-2를 포함하고,
   상기 1단계 배지 및 2단계 배지에서 인터루킨-2의 농도는 100 내지 300U/ml인, CD62L⁺CD44⁺ 세포의 비율이 60% 이상인 활성화 림프구의 제조 방법.
   
8. 삭제
9. 청구항 7에 있어서, 상기 항 CD3 항체의 농도는 1㎍/ml 내지 10㎍/ml인, 방법.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제

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