KR20160066837A - 안정성 높은 자연살해세포의 효율적인 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 안정성이 높은 자연살해세포의 효율적인 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 자연살해세포의 증식율 및 세포독성을 안정하게 유지할 수 있는 배양조건 확립으로, 효율적으로 자연살해세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 안정성 높은 자연살해세포의 효율적인 제조방법은 자연살해세포의 증식을 안정적으로 유지하며, 고순도 및 저비용으로 자연살해세포를 대량생산할 수 있으므로, 세포치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 안정성이 높은 자연살해세포의 효율적인 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 혈소판 용해물(platelet lysate)을 포함하는 배지를 이용하여 자연살해세포의 증식율 및 세포살상능(cytotoxicity)을 안정하게 유지하면서, 효율적으로 자연살해세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
암의 전이와 재발 방지 및 말기암 환자들의 생존기간을 연장시키는 치료법으로 환자의 면역기능을 이용한 면역치료(immunotherapy)법이 관심을 받고 있다. 최근, 항원에 특정한 키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptors, CARs)를 발현하는 유전자 변형 T 세포를 이용한 면역 치료법은 암 치료의 희망적인 접근법으로 인식되고 있다. 하지만 T 세포는 타인의 것을 사용하였을 경우 MHC 제한(Major histocompatability complex restriction)을 받아 심각한 이식편대숙주병 (graft-versus-host disease, GVHD)를 유발할 수 있으므로 세포치료제의 상업화를 위해서는 동종으로 사용가능하며 대량 생산 및 동결이 가능한 자연살해 (natural killer, 자연살해세포) 세포의 사용이 훨씬 유용하다.
자연살해세포는 말초혈 림프구(peripheral blood lymphocyte)의 약 10~15% 정도를 차지하는 선천성 면역반응에 중요한 역할을 하는 림프구계 세포로 알려져 있다. 자연살해세포는 T 세포와 다르게 MHC 비제한적인 방식으로 타겟(target)을 인지하는데, NKG2D, NCR(NKp30, NKp44, NKp46)과 같은 활성 수용체(Activating receptors)가 KIR나 CD94/NKG2A와 같은 억제 수용체와 경쟁하여 활성을 나타내고 종양 타겟을 제거한다. 자연살해세포는 항바이러스, 항-GvH, 항암 효능을 발휘할 수 있지만, 특히 sarcoma, myeloma, carcinoma, lymphomas, leukemia를 포함하는 악성 종양을 직접적으로 죽이거나 수지상 세포(dendritic cell, DC) 활성 또는 종양 특이적인 세포독성 T 임파구(cytotoxic t lymphocyte, CTL)을 유도하여 적응(adaptive) 면역 활성에 기여하여 종양화되거나 종양화가 진행되는 이상 세포를 제거하는 역할을 수행한다.
자연살해세포의 항암 효능은 동종 조혈모세포 이식을 통해 입증되었고 T 세포 제거 조혈모세포 이식에서도 공여자 자연살해세포가 잔존하는 미세 종양을 억제함을 확인하였다. 또한 공여자 자연살해세포의 GVT(graft-versus-tumor) 효과가 공여자와 수여자간에 KIR(killer cell immunoglobulin-like receptors)-MHC 불일치 시에 유의성 있게 증가되므로, 동종 자연살해세포의 사용은 암환자 자신의 기능이 약화된 자가 자연살해세포를 활용하는 것보다 훨씬 효과적이다. 이러한 자연살해세포의 암이나 감염성 질환의 치료제로서의 가능성에도 불구하고, 정상인의 체내에 존재하는 대부분의 자연살해세포는 비활성화 상태(resting state)로 존재하고 암환자의 체내에 존재하는 자연살해세포의 경우 암세포의 면역회피기전에 의해 기능의 결함이 존재한다. 실제로 자연살해세포를 치료제로 이용하기 위해서는 종양을 인지하고 파괴할 수 있는 활성화된 자연살해세포가 필요하기 때문에 정상혈액 혹은 환자혈액으로부터 체외 확장 배양을 통해 자연살해세포를 활성화시키는 것은 매우 중요하다. 또한 체내에 존재하는 자연살해세포 수는 한정되어 있으므로, 항암효능을 충분히 발휘할 수 있는 양의 자연살해세포를 대량으로 생산하고 동결하는 기술의 개발이 필수적이다.
자연살해세포의 체외 확장 배양에는 PBMC, CD3- 세포, CD3-CD56+ 세포, CD56+ 세포 등이 원료 세포로 사용되며, 자연살해세포 증식 인자로 IL-2, IL-12, IL-15, IL-21등의 싸이토카인들과 LPS (Goodier et al., J. Immunol. 165(1):139-147, 2000), CD3을 자극하는 OKT-3 항체(Condiotti et al., Experimental Hematol. 29(1):104-113, 2001)를 이용하고 있다. 하지만 상기에서 언급된 증식인자만으로는 자연살해세포 세포를 3~10 배 정도 증식시킬 수 있으며, 충분한 증식이 어려우므로 몇몇 연구에서 여러가지 형태의 지지세포(feeder cell)로 사용하여 자연살해세포를 증폭시키고자 하였다. 백혈병 세포주인 CTV-1의 사용에서는 증식의 개선이 거의 없었으며 (North et al., J. Immunol. 178(1):85-94, 2007), EBV-LCL을 사용하여 21일간 배양한 것은 평균 490배 정도 증식된 것으로 보고된 바 있다(Berg et al., Cytotherapy, 11(3):341-355, 2009). K562 세포주에 4-1 BBL과 막 고정된(membrane-bound) IL-15를 발현시킨 인공 항원제시세포(artificial APC(antigen presenting cell))를 사용하여 7일~3주간 배양한 결과, 평균 90~209배 증가되었다(Fujisaki et al., Cancer Res. 69(9):4010-4017, 2009). MICA, 4-1BBL, 그리고 IL-15를 K562 세포주에 발현시켜 3주간 배양하여 평균 350배 증식시켰다는 보고도 있으며(Gong et al., Tissue Antigens, 76(6):467-475, 2010), K562 세포주에 막 고정된 IL-21을 발현시켜 7일 간격으로 재자극하며 3주간 배양하여 평균 21,000배 증식시켰다는 보고도 있다(Denman et al., PlosOne, 7(1):e30264, 2012). 최근에 KL-1(human T lymphoblast)과 EBV-transformed B 세포를 지지세포로 이용하여 PBMC를 14일 배양하여 평균 740배 자연살해세포 세포의 증식을 유도하기도 하였다(Lim et al., Cancer Res., 73(8):2598-6607, 2013).
한편, 현재 고순도의 자연살해세포 배양 및 증식을 위해서는 CellGro 배지(CellGenix, Freiburg, Germany)가 배양배지로 주로 사용되고 있지만, 매우 고가여서, 세포치료제의 상업적인 생산을 위해서는 적절하지 않다. 또한, 기존의 자연살해세포 배양 및 증식 방법은 CellGro 배지에 추가적으로 자가혈장을 포함시켜 사용하고 있는 상황으로, 자연살해세포 배양을 위한 자가혈장의 사용은 세포 증식의 효율을 높여주지만 자가혈장의 공급량에 한계가 있어, 역시 세포치료제의 상업적인 생산을 위해서는 적절하지 않다.
이에, 본 발명자들은 높은 세포 살상능을 가지는 자연살해세포를 안정하고, 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 세포 증식인자로 혈소판 용해물(platelet lysate)을 자가혈장을 대신하여 배양배지에 포함하고, CellGro 배지 이외의 일반배지에 알부민을 추가하여 배양할 경우, 자연살해세포의 증식 및 세포살상능이 안정적으로 유지된다는 점을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 고가의 배지 및 공급에 한계가 있는 자가혈장을 포함하지 않는 새로운 배지 조성 및 최적의 배양조건의 확립을 통해 자연살해세포를 안정하고, 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈소판 용해물과 선택적으로 알부민을 추가로 포함하는 배지에서 원료세포와 지지세포를 함께 배양함으로써 자연살해세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 혈소판 용해물을 포함하는 배지에 원료세포와 지지세포를 1:2~1:10의 비율로 부유시켜 배양하는 단계;
(b) 혈소판 용해물을 포함하는 배지에 상기 (a) 단계에서 수득된 원료세포와 지지세포를 1:2~1:10의 비율로 부유시켜 재자극하고 배양하는 단계; 및
(c) 배양된 세포를 회수하는 단계;
를 포함하는 자연살해세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 자연살해세포 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 안정성 높은 자연살해세포의 효율적인 제조방법은 자연살해세포의 증식을 안정적으로 유지하며, 고순도 및 저비용으로 효율적으로 자연살해세포를 대량생산할 수 있으므로, 세포치료제의 상업적인 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 배양환경 변화에 따른 자연살해세포 세포의 증식 효율을 나타낸 결과이다. (a) 개체 1, (b) 개체 2, (c) 개체 3에서 Bag과 플라스크 배양환경에 따른 증식, 세포독성 및 표현형을 비교하였다.
도 2는 배지 선택에 따른 자연살해세포 세포의 증식 효율을 나타낸 결과이다(기존배지: 1% 자가혈장을 포함하는 CellGro 배지, 개발배지: 1% 자가혈장 및 0.4% 인간 알부민을 포함하는 DMEM 배지).
(a) 개체 1, (b) 개체 2, (c) 개체 3, (d) 개체 4에서 기존배지와 개발배지에 따른 증식, 세포독성 및 표현형을 비교하였다.
도 3은 배지 성분에 따른 자연살해세포 세포의 증식 효율을 나타낸 결과이다(AP: 0-12일까지 1% 자가혈장을 포함하는 CellGro 배지에서 배양, 12-21일까지 1% 자가혈장 및 0.4% 인간 알부민을 포함하는 DMEM 배지에서 배양; PL: 0-12일까지 1% 자가혈장을 포함하는 CellGro 배지에서 배양, 12-21일까지 1% 혈소판 용해물 및 0.4% 인간 알부민을 포함하는 DMEM 배지에서 배양).
도 2는 배지 선택에 따른 자연살해세포 세포의 증식 효율을 나타낸 결과이다(기존배지: 1% 자가혈장을 포함하는 CellGro 배지, 개발배지: 1% 자가혈장 및 0.4% 인간 알부민을 포함하는 DMEM 배지).
(a) 개체 1, (b) 개체 2, (c) 개체 3, (d) 개체 4에서 기존배지와 개발배지에 따른 증식, 세포독성 및 표현형을 비교하였다.
도 3은 배지 성분에 따른 자연살해세포 세포의 증식 효율을 나타낸 결과이다(AP: 0-12일까지 1% 자가혈장을 포함하는 CellGro 배지에서 배양, 12-21일까지 1% 자가혈장 및 0.4% 인간 알부민을 포함하는 DMEM 배지에서 배양; PL: 0-12일까지 1% 자가혈장을 포함하는 CellGro 배지에서 배양, 12-21일까지 1% 혈소판 용해물 및 0.4% 인간 알부민을 포함하는 DMEM 배지에서 배양).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 배양기 및 배지 조건을 최적화하여, 불안정한 자연살해세포(Natural Killer Cell, 또는 NK 세포)의 증식 조건을 안정적으로 유지시킴으로써, 자연살해세포의 증식 효율 증가 및 세포 순도 유지를 확인하였다. 특히, 본 발명에서는 세포 증식인자로 혈소판 용해물(platelet lysate)을 포함하고, 선택적으로 알부민을 추가로 사용할 경우, 자연살해세포의 증식 및 세포살상능이 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서
(a) 혈소판 용해물을 포함하는 배지에 원료세포와 지지세포를 1:2~1:10의 비율로 부유시켜 배양하는 단계;
(b) 혈소판 용해물을 포함하는 배지에 상기 (a) 단계에서 수득된 원료세포와 지지세포를 1:2~1:10의 비율로 부유시켜 재자극하고 배양하는 단계; 및
(c) 배양된 세포를 회수하는 단계;
를 포함하는 자연살해세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 자연살해세포 세포의 제조를 위한 배지, 즉 기본 배지로는 DMEM 배지, AIM-V 배지, RPMI1640 배지 또는 XVIVO 20 등이 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 DMEM 배지가 사용될 수 있다.
본 발명에서의 "지지세포(feeder cell, 배양보조세포라고도 한다)"는 분열증식하는 능력은 없지만 대사활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 자연살해세포 세포의 증식을 돕는 세포를 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 지지세포로는 유전자가 도입된 동물 세포주(cell line)나 각종 사이토카인이나 화합물이 처리된 말초혈 백혈구 세포(PBL), 자기 또는 타인의 말초혈 백혈구 세포(PBL), T-세포, B-세포(B-cell), 또는 단핵구(monocyte) 등이 있으며, 바람직하게는 불활성화된 자기 말초혈 단핵구 세포(PBMC)가 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용가능한 것으로 알려진 다른 지지세포들도 본 발명의 목적에 부합하는 제한 없이 사용가능함은 당연한 것이다. 상기 지지세포로 이용되는 자기 말초혈 단핵구 세포는 불활성화시켜 사용함으로써 안전성을 확보할 수 있다 불활성화시키는 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들어 감마선(gamma-ray)을 조사하는 방법이 사용될 수 있다. 이와 같이 불활성화된 지지세포는 분리된 T-세포를 포함한다. 본 발명과 같이 지지 세포를 사용하는 증식 방법은 자연살해세포 세포를 순수 분리한 후 증식시키는 방법으로, 이후에도 계속 순수 자연살해세포 세포만 증식하게 된다는 장점이 있다.
발명의 용어 "원료세포(seed cell)"는 적절한 배양을 통해 자연살해세포로 증식될 수 있는 세포를 의미하며, 바람직하게는 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포) 및 분리된 자연살해세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 사용될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니며, 특히 바람직하게는 CD3(+) 세포가 제거된 PBMC (CD3(-) PBMC)가 사용될 수 있다.
본 발명은 자가혈장을 대체하여 혈소판 용해물을 사용한다는 점에 한 측면에서의 기술적 특징이 있다. 기존의 자가혈장을 사용한 자연살해세포 세포 배양은 증식 효율을 높여주지만, 공급량의 한계로 인해 자연살해세포 세포 대량 생산에는 어려움이 있다. 본 발명은 자연살해세포 세포 배양하여 제조함에 있어서, 혈소판 용해물로 혈장을 대체하는 방법을 제시하였다.
본 발명에 따른 자연살해세포의 제조방법에 있어, 배지 내에는 혈소판 용해물이 0.1~5%(w/v), 바람직하게는 0.5~3%(w/v), 가장 바람직하게는 1~2%(w/v) 포함될 수 있다. 또한, 혈소판 용해물의 배지 내 함량은 배양 기간에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 총 21일에 걸쳐 자연살해세포를 배양할 경우, 0~12일 동안의 배양에는 1~3%(w/v)의 혈소판 용해물이 포함될 수 있으며, 12-21일 배양에는 0.5~2%(w/v)의 혈소판 용해물이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 자연살해세포의 제조방법에 있어, 배지 내에는 추가적으로 알부민이 포함될 수 있다. 알부민은 사람 알부민이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 배지 내에는 알부민이 0.1~2%(w/v), 바람직하게는 0.2~1%(w/v), 가장 바람직하게는 0.3~0.5%(w/v) 포함될 수 있다.
혈소판 용해물과 알부민은 10:1~0.5:1, 바람직하게는 7:1~1:1, 가장 바람직하게는 5:1~2.5:1의 함량비로 포함될 수 있다.
상기 (a) 단계에서 배양은 2 내지 10 일간, (b) 단계에서 배양은 2 내지 15일간 수행되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 (a) 및 (b) 단계의 배양은 동일한 배양기 또는 상이한 배양기에서 수행될 수 있으며, 또한, (a) 및 (b) 단계의 배양은 동일한 배지 또는 상이한 배지에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 배지에는 추가적으로 항-CD3 항체와 사이토카인이 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 자연살해세포의 제조방법에 있어. 항-CD3 항체의 배지 내 농도는 0.1~1,000 ng/ml, 바람직하게는 1~100 ng/ml, 더욱 바람직하게는 5~20 ng/ml이며, 사이토카인의 배지 내 농도는 10~2,000 IU, 바람직하게는, 100~1,000 IU, 더욱 바람직하게는 약 200~700 IU이다.
본 발명에서의 "항-CD3 항체"란, T 세포 수용체(TCR)과 결합하여 항원인식복합체를 형성하는 분자군인 CD3 항원에 특이적으로 결합하는 항체로, CD3 분자는 TCR과 결합하여 항원인식신호를 세포 내에 전달하는 역할을 담당한다. 본 발명에서 사용가능한 항-CD3 항체는 CD3에 결합하는 특성을 가지는 항체라면 제한 없이 이용가능하며, OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 배지에 포함될 수 있는 사이토카인은 인터루킨 류에서 선택된하나 이상인 것이 바람직한데, 인터루킨은 림프구나 단구 및 대식세포 등 면역담당 세포가 생산하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로 본 발명에서 사용가능한 인터루킨으로는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18) 및 인터루킨-21(IL-21)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하며, 특히 IL-2를 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 사이토카인도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한없이 이용 가능함은 자명한 것이다.
또한, 보다 많은 자연살해세포를 수득하기 위하여 본 발명에서는 지지세포를 이용한 자연살해세포의 재자극 및 배양을 반복 수행할 수 있다. 구체적인 일 실시예로서, 본 발명은 지지세포로 자연살해세포를 재자극하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 재자극은 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에서의 '자극'이란 지지세포 등을 첨가하여 자연살해세포의 증식을 유도하는 것을 의미하며, 항-CD3 항체가 함께 사용될 수도 있다.
본 발명에서의 '재자극'은 일정 배양 시간이 경과한 후, 배지에 지지세포 및/또는 항-CD3 항체를 다시 첨가하여 자연살해세포 증식을 재유도하는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 자연살해세포의 자극 기간은 배양 0일째 시작하여 7일 간격으로 자극하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포의 수득은 마지막 자극 후 14일째 수득하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이 또한 제한되는 것은 아니다. 따라서, 자연살해세포의 배양 기간은 14일 이상인 것이 바람직하며, 재자극시에는 21일 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에 따라 배양된 자연살해세포는 동결이 가능하고 다시 해동할 경우에도 세포의 기능이 손상되지 않으며, 기존의 PBMC를 지지세포로 사용하여 배양한 경우보다 NKp44, NKp46과 같은 활성화 수용체(activating receptor)의 발현이 높아 종양 세포주에 대한 살해능 및 싸이토카인 분비능이 증가하므로, 탁월한 항암 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 임상 적용이 가능한 다량의 활성화된 자연살해세포를 이용하여 종양치료에 유효한 세포치료제를 제조할 수 있다.
0일과 7일에 불활성화된 PBMC로 자연살해세포 세포를 자극하였으며, 0-5일 배양에는 100mm 플레이트를 사용하고, 5-12일 배양에는 G-REX100 플라스크를 사용하였다. 배양 12일에 배양 백(bag)으로 세포를 옮겨 21일까지 배양하였다.
본 발명에서는 혈액 원료에 따라 증식 효율의 차이가 크고, 배양환경에 민감하게 반응하는 자연살해세포 세포의 대량생산을 위해, 불안정한 자연살해세포 세포의 증식 조건을 안정적으로 유지할 수 있는 배양조건을 확립하였다. 본 발명의 배양을 위해 사용될 수 있는 배양기는 T-플라스크, dish 플레이트, 일회용 세포배양 백(disposable cell culture bag), G-Rex 플라스크, 플레이트, 생물반응기(bioreactor) 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 G-Rex 플라스크를 사용한다.
본 발명에 있어서, 배양은 항-CD3 항체가 제거되고, 사이토카인 및 혈소판 용해물이 포함된 배지로 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 원료세포가 증식하면 사이토카인, 혈소판 용해물 및 알부민이 포함된 배지를 추가하여 자연살해세포 밀도를 일정하게 유지하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 배양되어 제조된 세포는 회수 후 배지, 알부민, 덱스트란 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)가 포함된 조성 부유시킨 후, 동결보관할 수 있다. 바람직하게는 50%(v/v) 배양 배지, 20%(v/v) 알부민, 25%(v/v) 덱스트란 및 5%(v/v) DMSO가 포함된 배지에 부유시켜 동결 보관할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 제조된 자연살해세포 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 자연살해세포의 제조방법
1-1: 원료혈액 동결보관 및 원료세포 준비
본 실시예에서는 백혈구제거술(Leukapheresis)한 말초혈을 살린용액(saline solution)으로 1회 세척하고 동결하였다. 10% DMEM, 20% 덱스트란(dextran)이 포함된 자가혈장(autoplasma) 동결배지를 사용하여, 1x108 cells/ml 씩 동결바이알(cryovial)에 분주한 후, CRF를 이용하여 수득된 PBMC를 동결하고 LN2 탱크에 보관하였다.
동결된 PBMC 2 바이알을 해동하고 MACS 버퍼로 1회 세척한 후, 그 중 1 바이알의 세포를 CD3 마이크로비드(microbead)를 세포와 고르게 섞어 냉장에서 20분간 반응시킨다. 반응이 끝난 세포는 MACS 버퍼를 이용하여 1회 세척한 후, 다시 MACS 버퍼에 세포를 희석하고 VarioMACS 장비를 이용하여 CD3(+) 세포를 제거한다. CD3(-) 세포는 CellGro 배지로 1회 세척하고 CellGro 배지로 희석하여, seed 세포를 준비하였다. 남은 1개의 바이알의 PBMC는 2000cGy로 감마선 조사하여 불활성화 시켜 지지세포를 준비하였다.
CD3(-) 세포와 불활성화된 PBMC의 세포수를 측정하고, CD3(-) 세포 1x107과 PBMC 5x107을 최종 20ml이 되도록 1:5 비율로 CellGro 배지에 넣는다. 10ng/ml OKT-3, 500U/ml IL-2 및 1% 자가혈장 혹은 1% 혈소판 용해물이 포함된 20 ml CellGro 배지에 희석한 세포를 100mm 플레이트에서 5일간 배양하였다.
1-2: 플라스크 배양 및 세포 재자극
실시예 1에서 배양한 세포를 G-Rex100 플라스크로 옮겨, 500U/ml의 재조합 IL-2(rhIL-2) 및 1% 자가혈장 혹은 1% 혈소판 용해물이 포함된 30ml CellGro 배지를 첨가하였다.
배양 7일째 세포 재자극을 위해, 동결된 PBMC를 해동하고 살린 용액으로 1회 세척하여, 2000cGy 감마선 조사하여 불활성화시켰다. 플라스크의 세포수를 측정하여, 1.5~3 x 107cell/G-Rex100가 되도록 G-Rex 플라스크에 나누어 분주한 후, 불활성화시킨 PBMC를 G-Rex100 플라스크에 7일 배양한 자연살해세포 세포수의 5배를 추가하였다. 500U/ml의 rhIL-2와 10 ng/ml의 OKT-3, 그리고 1% 자가혈장 혹은 1% 혈소판 용해물을 포함하는 CellGro 배지를 이용하여 G-Rex 플라스크 당 배지 부피는 50 ml로 맞추어 배양하였다.
1-3: 백(bag)을 이용한 배양
배양 11-13일째, G-Rex100 플라스크의 세포수를 측정하여 1~1.5 x 108 이하일 경우 1개의 bag으로, 전체 세포수 기준 1.5 x 108 초과 2.5 x 108 이하일 경우 2개의 백으로, 2.5 x 108을 초과할 경우 3개의 백으로 나누어 분리하였다. 세포가 옮겨진 백은 500 U/ml rhIL-2, 1% 자가혈장 혹은 1% 혈소판 용해물이 포함된 CellGro 배지 또는 500 U/ml rhIL-2, 1% 자가혈장 혹은 1% 혈소판 용해물이 포함된 0.4% 알부민/ DMEM 배지 100ml을 첨가하여 배양하였다. 2~3일 후, 세포수를 측정하여 단위 부피당 세포수가 2 x 106/ml 미만일 경우에는 100 ml 배지를 추가하고, 2 x 106/ml 이상일 경우에는 200 ml 배지를 추가하였다. 배지는 500 U/ml rhIL-2, 1% 자가혈장 혹은 1% 혈소판 용해물이 포함된 CellGro 배지 또는 500 U/ml rhIL-2, 1% 자가혈장 혹은 1% 혈소판 용해물이 포함된 0.4% 알부민/ DMEM 배지를 사용하였다.
1-4: 백 분리
배양 16-17일째, 세포수를 측정하고 단위 부피당 세포수를 기준으로 배양 백을 분리하였다. 2 x 106/ml 미만일 경우, 배양 백 분리 없이 배지만 100 ml 추가하였으며, 2 x 106/ml 이상 3 x 106/ml 미만일 경우, 백을 2개로 분리하고 200 ml/bag이 되도록 배지를 추가하였다. 3 x 106/ml 이상 4 x 106/ml 미만일 경우, 백을 3개로 분리하고 200 ml/bag이 되도록 배지 추가하였으며, 4 x 106/ml 이상일 경우, 백을 4개로 분리하고 200 ml/bag이 되도록 배지를 추가하였다. 배지는 500 U/ml IL-2와 1% 자가혈장 혹은 1% 혈소판 용해물이 포함된 CellGro 배지 또는 500 U/ml IL-2와 1% 자가혈장 혹은 1% 혈소판 용해물이 포함된 0.4%알부민/DMEM 배지를 사용하였다. 2~3일 후, 세포수를 측정하여 단위 부피당 세포수가 2 x 106/ml 미만일 경우에는 100 ml 배지를 추가하고, 2 x 106/ml 이상일 경우에는 200 ml 배지를 추가하였다. 배지는 500 U/ml rhIL-2와 1% 자가혈장 혹은 1% 혈소판 용해물이 포함된 CellGro 배지 또는 500 U/ml rhIL-2와 1% 자가혈장 혹은 1% 혈소판 용해물이 포함된 0.4% 알부민/DMEM 배지를 사용하였다.
1-5: 세포 회수
배양 20-21일째, 배양 bag에 들어있는 세포를 500 ml 코니칼튜브(conical tube)로 옮기고, 각 코니칼 튜브는 1500 rpm으로 15분간 원심분리하여 하트만 용액을 이용하여 세포를 세척하고 회수한다. 회수한 세포의 일부는 분석에 사용하고 일부는 50%(v/v) CellGro 배지, 20%(v/v) 알부민, 25%(v/v) 덱스트란, 5%(v/v) DMSO가 포함된 동결배지로 동결 보관하였다.
실시예 2: 자연살해세포의 증식, 살해능, 표현형 분석
2-1: 배양 환경에 따른 비교
실시예 1의 방법에 의해 자연살해세포를 배양함에 있어, 백으로 배양한 군은 배양 초기부터 백을 사용하고, 플라스크로 배양한 군은 0-12일까지 플라스크 용기를 사용하여 배양하였다.
그 결과, 개체 1, 2, 3 모두 백과 플라스크 군에서 표현형의 차이는 없었으며, 세포 독성 또한 차이가 없었으나, 증식율은 플라스크 군에서 현저히 증가하는 것으로 확인되었다(도 1). 따라서, 초기 0-12일 배양에서는 플라스크 용기를 사용하여 자연살해세포의 증식을 증가시킬 수 있다.
2-2: 배양 배지에 따른 비교
실시예 1의 방법에 의해 자연살해세포를 배양함에 있어, 기존 배지군은 1% 자가혈장이 포함된 CellGro 배지를 사용하였으며, 개발 배지군은 1% 자가혈장 및 0.4% 알부민이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다.
그 결과, 개체 1, 2, 3, 4 모두 기존 배지군과 개발 배지군에서 표현형의 차이는 없었으나, 세포독성 및 증식율은 개발 배지군이 우수한 것으로 확인되었다(도 2). 따라서, DMEM 배지를 사용하여 자연살해세포의 증식율 및 살해능을 높이고 생산비를 절감할 수 있다.
2-3: 세포 증식인자로 자가혈장과 혈소판 용해물의 비교
실시예 1의 방법에 의해 자연살해세포를 배양함에 있어, 0-12일간 AP와 PL군은 1% 자가혈장이 포함된 CellGro 배지를 사용하였으며, 12-21일간 AP군은 1% 자가혈장 및 0.4% 알부민이 포함된 DMEM 배지, PL군은 1% 혈소판 용해물 및 0.4% 알부민이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다.
그 결과, AP군과 PL군의 증식율, 세포 독성, 표현형에는 모두 차이가 없는 것으로 확인되었다(도3). 따라서, 자연살해세포 배양에서 혈소판 용해물로 혈장을 대체할 수 있으므로, 자연살해세포의 대량 생산에 기여할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (19)
- 다음 단계를 포함하는 자연살해세포의 제조방법:
(a) 혈소판 용해물을 포함하는 배지에 원료세포와 지지세포를 1:2~1:10의 비율로 부유시켜 배양하는 단계;
(b) 혈소판 용해물을 포함하는 배지에 상기 (a) 단계에서 수득된 원료세포와 지지세포를 1:2~1:10의 비율로 부유시켜 재자극하고 배양하는 단계; 및
(c) 배양된 세포를 회수하는 단계.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 또는 (b) 단계의 배지는 DMEM 배지, AIM-V 배지, RPMI1640 배지, 또는 XVIVO 20인 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 또는 (b) 단계의 배지에 추가적으로 알부민이 포함되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 또는 (b) 단계의 배지에 추가적으로 항-CD3 항체 및 사이토카인이 포함되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 항-CD3 항체는 OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 사이토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 또는 (b) 단계의 배지에 혈소판 용해물이 0.1~5 %(w/v)로 포함되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제3항에 있어서,
상기 (a) 또는 (b) 단계의 배지에 알부민이 0.1~2 %(w/v)로 포함되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제3항에 있어서,
상기 (a) 또는 (b) 단계의 배지에 혈소판 용해물과 알부민은 10:1~0.5:1의 함량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 또는 (b) 단계에서의 지지세포는 불활성화된 자기 말초혈 단핵구 세포(PBMC)인 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 또는 (b) 단계에서의 원료세포는 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포) 및 분리된 자연살해세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 수득된 세포를 배양 배지, 알부민, 덱스트란 및 DMSO가 포함된 배지에 부유시켜 동결 보관하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서의 재자극은 2회 이상 반복하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 배양은 2 내지 10 일간, (b) 단계에서 배양은 2 내지 15일간 수행되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서, 원료세포가 증식하면 사이토카인, 혈소판 용해물 및 알부민이 포함된 배지를 추가하여 자연살해세포 밀도를 일정하게 유지하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 또는 (b) 단계에서의 배양은 T-플라스크, dish 플레이트, 일회용 세포 배양 백(disposable cell culture bag), G-Rex 플라스크, 플레이트, 생물반응기(bioreactor)로 구성된 군에서 선택되는 배양기를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
(a) 및 (b) 단계의 배양은 동일한 배지 또는 상이한 배지를 이용하여, 동일한 배양기 또는 상이한 배양기에서 수행하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 자연살해세포.
- 제18항의 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
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