CN109810197B - 用于高效扩增nk的人工抗原递呈细胞及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于高效扩增NK的人工抗原递呈细胞及其构建方法。具体地，本发明涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包括IL‑15、IL‑21和MICA蛋白，以及任选的标签序列和/或信号肽序列。实验结果表明表达本发明融合蛋白的细胞能够很好地诱导NK细胞增殖、分化和活化，制备得到的NK细胞数量多、纯度高、杀伤活性强。本发明将基因串联表达，实现了其1：1的100％表达，同时简化了操作流程且大大降低了时间及人力成本。本发明优化了用于NK细胞人工抗原递呈细胞的构建方法，为以后的NK细胞在肿瘤治疗及预防等中的应用奠定了基础。

Description

用于高效扩增NK的人工抗原递呈细胞及其构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及用于高效扩增NK的人工抗原递呈细胞及其构建方法。

背景技术

自然杀伤(Nature Killer，NK)细胞，是一种自然杀伤细胞，具有以下特征：1、无需特异性抗原识别；2、直接杀伤靶细胞；3、不受MHC限制；4、具有较广的抗瘤谱；5、基本无不良反应。在控制癌症的发生和发展中起着非常重要的作用。其可以通过释放穿孔素/颗粒酶、ADCC效应、Fas/FasL系统及NK细胞毒因子消灭人体内的病毒、细菌以及癌细胞。是人体先天免疫的核心组成部分，它是除T淋巴细胞、B淋巴细胞之外的第三类淋巴细胞。它作为人体第一道防线，能够清除病毒、细菌等有害物质，同时还可以清除衰老、病变及癌变的细胞，从而维持人体的健康。由于以上NK其独特的特点，其在肿瘤免疫治疗中的应用越来越受到重视。在日本，NK细胞不仅广泛用于癌症病人治疗，还应用于亚健康人群，预防癌症发生。因此，如何获得大量的NK细胞成为目前亟待解决的问题。

目前，NK细胞体外扩增培养的方法主要有以下三种：(1)使用IL-2和IL-15等白介素类细胞因子刺激培养的方法，往往需要进行分选，培养成本高，往往出现数量或纯度难以满足实验要求的情况，无法应用于大规模临床研究；(2)利用CD16等抗体进行NK活化后进行扩增培养，在不同批次细胞扩增效率和NK细胞活性上存在较大差异。因此，目前主要还是应用人工抗原递呈细胞。人工抗原递呈细胞(aAPC)是新兴起的一种免疫治疗新策略，是在一定的载体表面表达MHC及共刺激分子、粘附分子的配体或抗体等，模拟天然抗原递呈细胞。而目前，现有的人工抗原递呈细胞并不能很好地扩增或活化NK细胞。

因此本领域急需开发一种用于培养NK细胞的人工抗原递呈细胞及其制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于培养NK细胞的人工抗原递呈细胞及其制备方法。

本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括IL-15、IL-21和MICA蛋白，以及任选的标签序列和/或信号肽序列。

在另一优选例中，所述融合蛋白依次包括IL-15、IL-21和MICA蛋白。

在另一优选例中，所述融合蛋白中，IL-15、IL-21和MICA蛋白串联连接。

在另一优选例中，所述IL-15、IL-21和MICA蛋白之间可以为无或通过连接肽连接。

在另一优选例中，所述连接肽选自下组：柔性肽、刚性肽、2A肽、IRES、或其组合。较佳地，所述连接肽为柔性肽。

在另一优选例中，所述融合蛋白中，所述IL-15、IL-21和MICA蛋白的摩尔比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。

在另一优选例中，所述融合蛋白中，所述IL-15、IL-21和MICA蛋白的摩尔比为1：1：1。

在另一优选例中，所述融合蛋白具有式I所述结构：

L-I1-X1-I2-X2-I3-X3 (I)，

其中，

L为无、或标签序列或信号肽序列；

I1为无或第一连接肽；

X1为IL-15；

I2为无或第二连接肽；

X2为IL-21；

I3为无或第三连接肽；

X3为MICA蛋白；和

“-”表示连接上述各元件的连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述融合蛋白中，X1、X2和X3的位置可互换。

在另一优选例中，所述L为信号肽，较佳地为来自MICA蛋白的信号肽。

在另一优选例中，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第1-23位所示。

在另一优选例中，所述IL-15为人IL-15、鼠IL-15、或兔IL-15。

在另一优选例中，所述IL-21为人IL-21、鼠IL-21、或兔IL-21。

在另一优选例中，所述IL-15的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第33-146位所示。

在另一优选例中，所述IL-21的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第156-288位所示。

在另一优选例中，所述MICA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第298-663位所示。

在另一优选例中，所述I1为无。

在另一优选例中，所述I2为无。

在另一优选例中，所述I3为无。

在另一优选例中，所述I1、I2和I3各自独立地选自下组：柔性肽、刚性肽、2A肽、IRES、或其组合。

在另一优选例中，所述I1、I2和I3均为不具有自剪接功能的连接肽。

在另一优选例中，所述I1、I2和I3各自独立地为柔性肽。

在另一优选例中，所述柔性肽为非免疫原性的，并且在各元件之间产生足够的空间距离，使相互之间的位阻效应降至最低。

在另一优选例中，所述柔性肽接头含有两个或多个选自甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)和苏氨酸(T)的氨基酸。

在另一优选例中，所述柔性肽包括一个(GmX)n序列，其中X是丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、或缬氨酸(V)；m和n是整数；m是1、2、3或4；并且n是1、2、3、4、5、6或7。较佳地，X为丝氨酸(S)。

在另一优选例中，所述柔性肽为GS连接肽。

在另一优选例中，所述柔性肽由一个或多个(例如，1-20个，1-18个，或1-16个)甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)组成的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述柔性肽具有以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循环单元组合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。

在另一优选例中，所述柔性肽选自下组的序列：GSGGSGGSG(SEQ ID NO.:3)或GGGGS(SEQ ID NO.:4)。

在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥85％，更优选地≥90％，更优选地≥95％，最优选地≥97％的同源性)且保留所述特性的多肽；

(C)将SEQ ID NO:2中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述特性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述融合蛋白具有以下特性：

a)诱导免疫细胞(如NK细胞)增殖、分化和活化；和/或

b)提高免疫细胞(如NK细胞)的杀伤活性。

本发明第二方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:2所示融合蛋白的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与(b)所示序列的同源性≥75％(较佳地≥80％)的多核苷酸；

(d)如(b)所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的多核苷酸编码的产物中，所述IL-15、IL-21和MICA蛋白的摩尔比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)，较佳地为1：1：1。

在另一优选例中，所述的多核苷酸中，所述IL-15、IL-21和MICA的编码序列通过连接序列串联连接。

在另一优选例中，所述连接序列编码的连接肽不具有自剪接功能，较佳地为柔性肽。

本发明还提供了一种表达盒，所述表达盒用于表达本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述表达盒从从5’端-3’端具有式II结构：

Z0-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 (II)

式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z0为启动子，较佳地为CMV启动子；

Z1为无或信号肽编码序列；

Z2为无或第一连接肽编码序列；

Z3为IL-15编码序列；

Z4为无或第二连接肽编码序列；

Z5为IL-21编码序列；

Z6为无或第三连接肽编码序列；和

Z7为MICA蛋白编码序列。

在另一优选例中，所述表达盒表达的IL-15、IL-21和MICA蛋白的摩尔比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)，较佳地为1：1：1。

在另一优选例中，所述第一连接肽编码序列、第二连接肽编码序列、第三连接肽编码序列编码的连接肽为柔性肽。

本发明第三方面，提供了一种载体，所述载体包括本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA、RNA。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有本发明第二方面所述的多核苷酸的载体。

在另一优选例中，所述载体用于表达本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述载体用于表达所述IL-15、IL-21和MICA蛋白，且表达的IL-15、IL-21和MICA蛋白的摩尔比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)，较佳地为1：1：1。

在另一优选例中，所述载体含有用于表达本发明第一方面所述的融合蛋白的表达盒。

本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达本发明第一方面所述的融合蛋白；和/或

所述宿主细胞基因组中整合有外源的本发明第二方面所述的多核苷酸；和/或

所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体。

在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞是人细胞或非人哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞是抗原递呈细胞，较佳地为人工抗原递呈细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞为K562细胞。

本发明第五方面，提供了一种人工抗原递呈细胞，所述人工抗原递呈细胞表达有本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述人工抗原递呈细胞的细胞膜上表达有本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述人工抗原递呈细胞是离体。

在另一优选例中，所述人工抗原递呈细胞是自体或异体的。

在另一优选例中，所述人工抗原递呈细胞来自人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述人工抗原递呈细胞为K562细胞。

本发明第六方面，提供了本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体或本发明第五方面所述的人工抗原递呈细胞的用途，用于(a)培养NK细胞；和/或(b)制备用于培养NK细胞的制剂。

在另一优选例中，所述培养为体外培养。

本发明第七方面，提供了一种培养方法，包括步骤：

(1)提供一待培养的NK细胞或PBMC细胞；和

(2)在培养基中，将所述NK细胞或PBMC细胞与本发明第一方面所述的融合蛋白、或本发明第四方面所述的宿主细胞、或本发明第五方面所述的人工抗原递呈细胞接触并进行培养，从而得到经培养的NK细胞或PBMC细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞或人工抗原递呈细胞为经过辐照的细胞。

在另一优选例中，所述方法还包括：在步骤(2)之前，对本发明第一方面所述的融合蛋白、或本发明第四方面所述的宿主细胞、或本发明第五方面所述的人工抗原递呈细胞。

在另一优选例中，所述辐射剂量为100-300Gy，更佳地150-250Gy。

在另一优选例中，所述培养基中含有血浆，较佳地含有2％-10％(v/v)血浆，更佳地含有4％-6％血浆，按培养基总体积计。

在另一优选例中，所述血浆为自体血浆。

在另一优选例中，所述培养基中还含有IL-2。

在另一优选例中，所述IL-2的终浓度为500-1500IU/mL，较佳地为900-1100IU/mL。

在另一优选例中，所述PBMC细胞与宿主细胞或人工抗原递呈细胞的数量比为10:1-1:10，较佳地5:1-1:5，更佳地2:1-1:2，更佳地1:1。

在另一优选例中，所述NK细胞与宿主细胞或人工抗原递呈细胞的数量比为10:1-1:10，较佳地5:1-1:5，更佳地2:1-1:2，更佳地1:1。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述培养的时间为14-21天。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(3)将步骤(2)中经培养的NK细胞或PBMC细胞再次与与本发明第一方面所述的融合蛋白、或本发明第四方面所述的宿主细胞、或本发明第五方面所述的人工抗原递呈细胞接触并进行培养，得到经二次培养的NK细胞或PBMC细胞。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述PBMC细胞与宿主细胞或人工抗原递呈细胞的数量比为1:1-1:10，较佳地1:2-1:4。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述NK细胞与宿主细胞或人工抗原递呈细胞的数量比为1:1-1:10，较佳地1:2-1:4。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(4)从培养后的体系中分离所述的经培养的NK细胞或PBMC细胞。

本发明还提供了一种NK细胞，所述NK细胞通过本发明第七方面所述的培养方法得到的。

本发明第八方面，提供了一种制备本发明第四方面所述的宿主细胞的方法，所述方法包括步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入宿主细胞内，从而获得所述宿主细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞为人工抗原递呈细胞。

本发明还提供了一种制剂，所述制剂包含：本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体或本发明第五方面所述的人工抗原递呈细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

本发明还提供了一种用于制备本发明第四方面所述的宿主细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的核酸序列，所述核酸序列含有用于表达本发明第一方面所述的融合蛋白的表达盒。

本发明还提供了一种制备如本发明第一方面所述融合蛋白的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明第一方面所述的融合蛋白；和分离所述融合蛋白。

在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了mIl-15-IL-21-MICA的结构示意图。

图2显示了分选扩大培养后mIl-15-IL-21-MICA K562流式检测结果。

图3显示了NK细胞对K562及肿瘤细胞杀伤活性分析。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现本发明包含IL-15、IL-21和MICA蛋白的融合蛋白以及表达本发明融合蛋白的细胞能够很好地诱导NK细胞增殖、分化和活化，制备得到的NK细胞数量多、纯度高、杀伤活性强。

此外，在制备时，通常需要同时表达两个以上的基因来修饰K562，目前有两种方案：1)在载体的构建时使用2A肽或IRES连接，往往很难实现目的基因达到1：1的100％表达。2)要么就是逐个表达，在第一个基因成功表达的细胞株上再修饰第二个基因，比较繁琐，制备周期较长。

而本发明意外地发现，将编码各元件的基因串联表达，在实现了其1：1的100％表达的同时，仍保持了融合蛋白中各元件的生物活性，并且简化了操作流程且大大降低了时间及人力成本，只需要一次转染，一次筛选即可。本发明优化了用于NK细胞人工抗原递呈细胞的构建方法，为以后的NK细胞在肿瘤治疗及预防等中的应用奠定了基础。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

人工抗原递呈细胞

在本发明中，所述人工抗原递呈细胞(aAPC)是新兴起的一种免疫治疗新策略，是在一定的载体表面表达MHC及共刺激分子、粘附分子的配体或抗体等，模拟天然抗原递呈细胞。通过aAPC，能够显著减少细胞因子的加入，与此同时，众多研究小组己经从不同侧面证实了aAPC是在体外有效扩增抗原特异性T细胞、NK细胞的强有力工具，增强并保持其杀伤肿瘤细胞的毒性作用，具有简化操作流程、重复性好、成本低的优点，为肿瘤或慢性感染性疾病的过继细胞免疫治疗提供了新方法，并已应用于临床，产生令人鼓舞的应用前景。

本发明提供了一种人工抗原递呈细胞，所述人工抗原递呈细胞表达有本发明第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述人工抗原递呈细胞为K562细胞。

NK细胞

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。在自身免疫性疾病中，NK细胞失衡(减少)是导致自身免疫病发病的重要机制，NK细胞减少导致其非特异性抑制B细胞分泌抗体的功能降低。而NK92细胞是目前唯一被FDA批准临床试验的细胞系，细胞毒能力很强，杀伤肿瘤细胞后生存时间短，体外易于扩增，绝大多数接受治疗的患者并没有对NK92-MI细胞产生排斥，没有移植物抗宿主反应的危险。

融合蛋白

如本文所用，术语“融合蛋白”、“本发明融合蛋白”、“活性多肽”和“本发明的多肽”具有相同的含义，均具有本发明第一方面所述的结构。本发明的所述融合蛋白表达后，会穿过细胞膜并定位在细胞膜上。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO.:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:2所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAGSGGSGGSGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGSGGSGGSGQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSGSGGSGGSGEPHSLRYNLTVLSGDGSVQSGFLAEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETEEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAAAAAAIFVIIIFYVCCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA*(SEQ ID NO.:2)

其中，第1-23位是来自MICA蛋白的信号肽；第24-32位是第一连接肽；第33-146位是IL-15；第147-155位是第二连接肽；第148-288位是IL-21；第289-297位是第三连接肽；第298-662位是MICA蛋白。

编码序列

本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:2所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ IDNO.:2所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

在本发明较佳的实施方式中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:1所示。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明融合蛋白的功能。

编码本发明的融合蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

ATGGGGCTGGGCCCGGTCTTCCTGCTTCTGGCTGGCATCTTCCCTTTTGCACCTCCGGGAGCTGCTGCTGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGAGCCCCACAGTCTTCGTTATAACCTCACGGTGCTGTCCGGGGATGGATCTGTGCAGTCAGGGTTTCTCGCTGAGGTACATCTGGATGGTCAGCCCTTCCTGCGCTGTGACAGGCAGAAATGCAGGGCAAAGCCCCAGGGACAGTGGGCAGAAGATGTCCTGGGAAATAAGACATGGGACAGAGAGACCAGGGACTTGACAGGGAACGGAAAGGACCTCAGGATGACCCTGGCTCATATCAAGGACCAGAAAGAAGGCTTGCATTCCCTCCAGGAGATTAGGGTCTGTGAGATCCATGAAGACAACAGCACCAGGAGCTCCCAGCATTTCTACTACGATGGGGAGCTCTTCCTCTCCCAAAACCTGGAGACTGAGGAATGGACAATGCCCCAGTCCTCCAGAGCTCAGACCTTGGCCATGAACGTCAGGAATTTCTTGAAGGAAGATGCCATGAAGACCAAGACACACTATCACGCTATGCATGCAGACTGCCTGCAGGAACTACGGCGATATCTAAAATCCGGCGTAGTCCTGAGGAGAACAGTGCCCCCCATGGTGAATGTCACCCGCAGCGAGGCCTCAGAGGGCAACATTACCGTGACATGCAGGGCTTCTGGCTTCTATCCCTGGAATATCACACTGAGCTGGCGTCAGGATGGGGTATCTTTGAGCCACGACACCCAGCAGTGGGGGGATGTCCTGCCTGATGGGAATGGAACCTACCAGACCTGGGTGGCCACCAGGATTTGCCAAGGAGAGGAGCAGAGGTTCACCTGCTACATGGAACACAGCGGGAATCACAGCACTCACCCTGTGCCCTCTGGGAAAGTGCTGGTGCTTCAGAGTCATTGGCAGACATTCCATGTTTCTGCTGTTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTATTTTTGTTATTATTATTTTCTACGTCTGTTGTTGTAAGAAGAAAACATCAGCTGCAGAGGGTCCAGAGCTCGTGAGCCTGCAGGTCCTGGATCAACACCCAGTTGGGACGAGTGACCACAGGGATGCCACACAGCTCGGATTTCAGCCTCTGATGTCAGATCTTGGGTCCACTGGCTCCACTGAGGGCGCCTAG(SEQ ID NO.:1)

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术在所述NK细胞上表达本发明融合蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的NK细胞。一般来说包括步骤：将本发明所述的第一表达盒和/或第二表达盒转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择抗原递呈细胞为宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

载体

本发明还提供了含有本发明多核苷酸的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常通过可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

所述表达盒或核酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，该表达盒或核酸序可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBSLetters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物(如人T细胞)、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

构建及培养方法

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种用于高效扩增NK的人工抗原递呈细胞的体外构建的方法，解决了修饰基因很难实现目的基因达到1：1的100％表达的问题，同时简化了操作流程且大大降低了时间及人力成本。

在一个优选的实施方式中，所述方法如本发明第八方面所述。

本发明还提供可一种高效扩增NK细胞的培养方法，所述培养方法如本发明第七方面所述。

在一个具体实施方式中，本发明提供了一种NK细胞的高效制备方法，包括如下步骤：

1)使用慢病毒转染系统将串联基因IL-15-IL-21-MICA转染到K562细胞，进行基因表达筛选，对基因成功表达的细胞进行扩增及辐照，辐照剂量为200Gy.则辐照后的K562细胞作为制备NK细胞的饲养细胞；

2)将从外周血分离得到的PBMC，用培养液重悬后，与上述修饰辐照后的K562以1：1的比例混合进行培养，并在培养液中加入终浓度为1000IU/mL的IL-2进行培养，记为第0天。

3)在第7天，再次添加灭活的K562细胞进行二次刺激；

4)持续扩大培养至第14天，收获细胞，完成NK细胞的制备。

作为优选的，本发明所述的步骤1)中串联基因Il-15-IL-21-MICA核苷酸序列为：SEQ ID NO.:1。

并且，所述的步骤1)中筛选后的K562细胞的辐照剂量为200Gy。

并且，所述的步骤2)中辐照后K562与PBMC的比例为1：1。

并且，所述的步骤2)中IL-2的终浓度为1000IU/mL。

并且，所述的步骤3)中K562添加量为原PBMC数目的1-4倍。

与现有技术相比，本发明的有益结果是：

本发明构建的融合蛋白包含IL-15、IL-21和MICA蛋白，以及表达本发明融合蛋白的细胞能够很好地诱导NK细胞增殖、分化和活化，制备得到的NK细胞数量多、纯度高、杀伤活性强。

此外，本发明将基因串联表达，实现了其1：1的100％表达，同时简化了操作流程且大大降低了时间及人力成本，只需要一次转染，一次筛选即可。本发明优化了用于NK细胞人工抗原递呈细胞的构建方法，为以后的NK细胞在肿瘤治疗及预防等中的应用奠定了基础。

本发明的技术方案，具有如下有益效果：

1.本发明构建的融合蛋白包含IL-15、IL-21和MICA蛋白，以及表达本发明融合蛋白的细胞能够很好地诱导NK细胞增殖、分化和活化，制备得到的NK细胞数量多、纯度高、杀伤活性强，后期分离纯化简单，质量稳定性好。

2.本发明将基因串联表达，实现了其1：1的100％表达，同时简化了操作流程且大大降低了时间及人力成本。本发明制备方法工艺简单、成本低、产量高，适合大规模生产。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

1.饲养细胞的构建步骤如下：

(1)载体构建

将基因合成的串联基因Il-15-IL-21-MICA核苷酸片段(SEQ ID NO.:1)通过酶切转化连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体(如图1所示)。载体转化Stbl3大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得目的载体。

(2)慢病毒制备

基于Lipofectamine2000转染试剂和pLP1、pLP2、pLP/VSVG、pLVX-shRNA四质粒系统的慢病毒包装方案，采用即时转染法，准备的P10-P12的293FT(人胚肾细胞)细胞用于慢病毒包装，pLP1、pLP2、pLP/VSVG摩尔比为1:2:1，四质粒用量约为20ug，且各质粒浓度>0.5ug/ul。采用10cm细胞培养板转染，转染培养基为12ml，Lipofectamine2000用量为40ul，包装质粒混合液配制：pLP1(4.62ug)、pLP2(4.35ug)、pLP/VSVG(3.03ug)。转染6小时候更换为完全培养基，培养48或72小时后，使用20％蔗糖垫层超速离心方法从含病毒的上清液中浓缩纯化慢病毒颗粒。超速离心条件是：130000g，2h，分装冻存在-80°冰箱。

(3)IL-15-IL-21-MICA-K562细胞制备

将K562细胞密度调整至1×105个/ml，按体积比(病毒浓缩液：培养基＝1:5-10)添加病毒浓缩液，同时添加polybrene 8ug/ml。24小时后，将细胞离心，使用正常培养基培养K562细胞.72h后进行流式分选。将得到的阳性细胞进行扩大培养。培养后进行流式鉴定，鉴定目的基因均表达后，对扩大培养后的细胞进行细胞辐照，辐照剂量为200Gy。辐照后进行分装冻存。

2.NK细胞培养

(1)PBMC分离及自体血清制备

使用Ficoll分离人血中的PBMC，并使用X-VIVO15培养基将PBMC的浓度调整至约1×10⁶个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清并于4℃储存备用。

(2)NK细胞活化培养

将制作好的PBMC(4.4×10⁷)，按1x106的密度接种在T75培养瓶内，混匀的细胞悬液加入到培养瓶内，加入上述预处理好的mIL-15-IL-21-MICA-K562细胞、自体血浆5％。放入CO₂培养箱内进行培养。在培养第7天，补加IL-15-IL-21-MICA-K562细胞，并进行补液。

在NK细胞培养期间，每天观察细胞状态，一般进行隔天补液，补加已经添加IL-2的X-VIVO15培养基，IL-2的终浓度为1000IU/mL。使细胞浓度维持在1×10⁶。在培养第14天后，收集的细胞即为NK细胞。

实施例2

为了更好的说明，在实施例中设置了实验组及对照组。对照组是使用未进行基因修饰的K562，其他培养条件及处理条件一致。对这两组细胞进行观察及检测。

检测结果如下：

1.在培养的第0、14、21天对实验组和对照组细胞进行计数。同时，在细胞培养第14、21天时，对实验组及对照组培养的细胞进行细胞免疫表型测定分析检测。使用CD3及CD56的流式抗体与PBS洗好的实验组及对照组细胞进行孵育，孵育条件为：4℃，30min。然后使用PBS进行清洗2次。将处理好的细胞进行上机检测。结果如表1和图2所示：实验组细胞扩增倍数远远大于对照组:在培养14天时，实验组的细胞总数就达到2.52×10⁹个(见表1)，细胞总数扩增60倍；在培养第18天时，实验组的细胞总数就达到3.7×10⁹个(见表1)，细胞总数扩增84倍。结果表明：使用实施例1中的方法，所获得的NK细胞数目多、增殖快，可以满足临床需求。

表1诱导分化不同阶段NK细胞的免疫表型分析比较

2.为了检测细胞的纯度，在细胞检测结果显示：实验组中在第14、18天的NK纯度为80.69％、84.66％，而对照组中对应时间的NK纯度为44.22％、48.20％(见表1)。结果表明实验组的NK纯度要远高于对照组。

3.为了进一步检测使用本发明培养的NK的杀伤活力，进行了实验组及对照组的NK细胞杀伤实验，检测了其对K562的杀伤活力。将K562细胞浓度调整为1×10⁴,然后进行铺板，在96孔板中每孔加入100μL。然后按照效应细胞与靶细胞的比为5:1的比例加入效应细胞，即培养第14天的NK细胞。再本实验室中设置对照组，对照组有2组：一组只加靶细胞，另一组只加效应细胞。加完效应细胞后，将96孔板置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养，在培养12h后加入CCK8。然后再次置于培养箱中培养，培养2h后，置于酶标仪测定其在450nm及600nm的吸光度。其中600nm为参比波长。进行吸光度检测。那么NK的杀伤活性＝[1-(实验组OD-效应细胞对照组OD)/靶细胞对照组OD]×100％。检测结果显示：对照组和实验组NK细胞对K562的杀伤率分别为70.32％和89.71％(见图3)。结果表明使用本发明培养的NK细胞具有较高的杀伤活性。

使用本发明制备人工抗原提呈细胞，解决了修饰基因很难实现目的基因达到1：1的100％表达的问题，同时仍保持了融合蛋白中各元件的生物活性，各元件的生物活性没有受到相互干扰，并且简化了操作流程且大大降低了时间及人力成本。使用本方法制备的人工抗原提呈细胞所培养的NK细胞扩增倍数高且纯度高，对肿瘤细胞具有较高的杀伤活性。满足了临床上NK细胞数量大，纯度高的要求。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海尚泰生物技术有限公司

<120> 用于高效扩增NK的人工抗原递呈细胞及其构建方法

<130> P2019-0108

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1989

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60

gctgctgctg gcagcggcgg cagcggcggc agcggcaact gggtgaatgt aataagtgat 120

ttgaaaaaaa ttgaagatct tattcaatct atgcatattg atgctacttt atatacggaa 180

agtgatgttc accccagttg caaagtaaca gcaatgaagt gctttctctt ggagttacaa 240

gttatttcac ttgagtccgg agatgcaagt attcatgata cagtagaaaa tctgatcatc 300

ctagcaaaca acagtttgtc ttctaatggg aatgtaacag aatctggatg caaagaatgt 360

gaggaactgg aggaaaaaaa tattaaagaa tttttgcaga gttttgtaca tattgtccaa 420

atgttcatca acacttctgg cagcggcggc agcggcggca gcggccaagg tcaagatcgc 480

cacatgatta gaatgcgtca acttatagat attgttgatc agctgaaaaa ttatgtgaat 540

gacttggtcc ctgaatttct gccagctcca gaagatgtag agacaaactg tgagtggtca 600

gctttttcct gttttcagaa ggcccaacta aagtcagcaa atacaggaaa caatgaaagg 660

ataatcaatg tatcaattaa aaagctgaag aggaaaccac cttccacaaa tgcagggaga 720

agacagaaac acagactaac atgcccttca tgtgattctt atgagaaaaa accacccaaa 780

gaattcctag aaagattcaa atcacttctc caaaagatga ttcatcagca tctgtcctct 840

agaacacacg gaagtgaaga ttccggcagc ggcggcagcg gcggcagcgg cgagccccac 900

agtcttcgtt ataacctcac ggtgctgtcc ggggatggat ctgtgcagtc agggtttctc 960

gctgaggtac atctggatgg tcagcccttc ctgcgctgtg acaggcagaa atgcagggca 1020

aagccccagg gacagtgggc agaagatgtc ctgggaaata agacatggga cagagagacc 1080

agggacttga cagggaacgg aaaggacctc aggatgaccc tggctcatat caaggaccag 1140

aaagaaggct tgcattccct ccaggagatt agggtctgtg agatccatga agacaacagc 1200

accaggagct cccagcattt ctactacgat ggggagctct tcctctccca aaacctggag 1260

actgaggaat ggacaatgcc ccagtcctcc agagctcaga ccttggccat gaacgtcagg 1320

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tgcctgcagg aactacggcg atatctaaaa tccggcgtag tcctgaggag aacagtgccc 1440

cccatggtga atgtcacccg cagcgaggcc tcagagggca acattaccgt gacatgcagg 1500

gcttctggct tctatccctg gaatatcaca ctgagctggc gtcaggatgg ggtatctttg 1560

agccacgaca cccagcagtg gggggatgtc ctgcctgatg ggaatggaac ctaccagacc 1620

tgggtggcca ccaggatttg ccaaggagag gagcagaggt tcacctgcta catggaacac 1680

agcgggaatc acagcactca ccctgtgccc tctgggaaag tgctggtgct tcagagtcat 1740

tggcagacat tccatgtttc tgctgttgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctattttt 1800

gttattatta ttttctacgt ctgttgttgt aagaagaaaa catcagctgc agagggtcca 1860

gagctcgtga gcctgcaggt cctggatcaa cacccagttg ggacgagtga ccacagggat 1920

gccacacagc tcggatttca gcctctgatg tcagatcttg ggtccactgg ctccactgag 1980

ggcgcctag 1989

<210> 2

<211> 662

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Leu Gly Pro Val Phe Leu Leu Leu Ala Gly Ile Phe Pro Phe

1 5 10 15

Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

35 40 45

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

50 55 60

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

65 70 75 80

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

85 90 95

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

100 105 110

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

115 120 125

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

130 135 140

Thr Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gln Gly Gln Asp Arg

145 150 155 160

His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys

165 170 175

Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp

180 185 190

Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala

195 200 205

Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val

210 215 220

Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg

225 230 235 240

Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys

245 250 255

Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys

260 265 270

Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser

275 280 285

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr

290 295 300

Asn Leu Thr Val Leu Ser Gly Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu

305 310 315 320

Ala Glu Val His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln

325 330 335

Lys Cys Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly

340 345 350

Asn Lys Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys

355 360 365

Asp Leu Arg Met Thr Leu Ala His Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu

370 375 380

His Ser Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Asn Ser

385 390 395 400

Thr Arg Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser

405 410 415

Gln Asn Leu Glu Thr Glu Glu Trp Thr Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala

420 425 430

Gln Thr Leu Ala Met Asn Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met

435 440 445

Lys Thr Lys Thr His Tyr His Ala Met His Ala Asp Cys Leu Gln Glu

450 455 460

Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val Val Leu Arg Arg Thr Val Pro

465 470 475 480

Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr

485 490 495

Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser

500 505 510

Trp Arg Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly

515 520 525

Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr

530 535 540

Arg Ile Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His

545 550 555 560

Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val

565 570 575

Leu Gln Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val Ala Ala Ala

580 585 590

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ile Phe Val Ile Ile Ile Phe Tyr Val Cys

595 600 605

Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu Val Ser

610 615 620

Leu Gln Val Leu Asp Gln His Pro Val Gly Thr Ser Asp His Arg Asp

625 630 635 640

Ala Thr Gln Leu Gly Phe Gln Pro Leu Met Ser Asp Leu Gly Ser Thr

645 650 655

Gly Ser Thr Glu Gly Ala

660

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims (11)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

4.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达权利要求1所述的融合蛋白；和/或

所述宿主细胞基因组中整合有外源的权利要求2所述的多核苷酸；和/或

所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体。

6.一种人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述人工抗原递呈细胞表达有权利要求1所述的融合蛋白。

7.权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求4所述的载体或权利要求6所述的人工抗原递呈细胞的用途，其特征在于，用于(a)培养NK细胞；和/或(b)制备用于培养NK细胞的制剂。

8.一种培养方法，其特征在于，包括步骤：

(1)提供一待培养的NK细胞或PBMC细胞；和

(2)在培养基中，将所述NK细胞或PBMC细胞与权利要求1所述的融合蛋白、或权利要求5所述的宿主细胞、或权利要求6所述的人工抗原递呈细胞接触并进行培养，从而得到经培养的NK细胞或PBMC细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞或人工抗原递呈细胞为经过辐照的细胞。

10.一种制剂，其特征在于，所述制剂包含：权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求4所述的载体或权利要求6所述的人工抗原递呈细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

11.一种制备如权利要求1所述融合蛋白的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的融合蛋白；和分离所述融合蛋白。

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