CN112533957A - Muc16特异性嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于癌症疗法的嵌合抗原受体(CAR)，更具体地，包含来自抗MUC16单克隆抗体的scFv的CAR。提供了包含此类CAR的免疫效应细胞，以及治疗增生性病症的方法。

Description

MUC16特异性嵌合抗原受体及其用途
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序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。创建于2019年5月23日的所述ASCII副本被命名为50471-715_201_SL.txt，大小为331,880个字节。
背景技术
重组多肽，如嵌合多肽，对于研究、诊断、制造和治疗应用而言是有价值的。表达抗原结合多肽如CAR的经修饰的效应细胞可用于治疗疾病和病症，如感染性疾病、自身免疫性病症和癌症。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
发明内容
本文提供了一种分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中所述CAR包含(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；和(e)CD3ζ信号传导域。在一些实施方案中，所述MUC16抗原结合域包含以下至少一种：(a)与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、12和14所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；(b)与SEQ IDNO:2、4、6、8、10、11、13和15所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和(c)与SEQ ID NO:27-57所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述MUC16抗原结合域是与SEQ ID NO:27-57所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述茎结构域是与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导域包含4-1BB。在一些实施方案中，4-1BB的共刺激信号传导域包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导域包含CD28。在一些实施方案中，CD28的共刺激信号传导域包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述CD3ζ信号传导域包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的分离的核酸可以进一步包含截短的表皮生长因子受体。在一些实施方案中，所述截短的表皮生长因子受体是HER1t，并且包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述截短的表皮生长因子受体是HER1t-1，并且包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述CAR包含与SEQ ID NO:27-57所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
本文提供了一种载体，其包含骨架和编码以下部分的核酸序列：(1)截短的表皮生长因子受体，其包含HER1t、HER1t-1或其功能变体中的至少一种；(2)细胞因子；和(3)嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；和(e)CD3ζ信号传导域。
在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-15或IL-12。在一些实施方案中，所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些实施方案中，所述截短的表皮生长因子受体包含与SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述IL-15是膜结合的IL-15。在一些实施方案中，膜结合的IL-15包含编码SEQ ID NO:161的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的任何载体可以进一步包含编码自切割Thoseaasigna病毒(T2A)肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述骨架是Sleeping Beauty转座子DNA质粒或pFUGW。在一些实施方案中，本文提供的任何载体可以进一步包含启动子。在一些实施方案中，所述启动子是hEF1a1。在一些实施方案中，所述MUC16抗原结合域包含以下至少一种：(a)与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、12和14所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；(b)与SEQID NO:2、4、6、8、10、11、13和15所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和(c)与SEQ ID NO:27-57所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述MUC16抗原结合域是与SEQ IDNO:27-57所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述茎结构域包含与SEQ IDNO:16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导域包含4-1BB。在一些实施方案中，4-1BB的共刺激信号传导域包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述共刺激信号传导域包含CD28。在一些实施方案中，CD28的共刺激信号传导域包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述CD3ζ信号传导域包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述载体包含质粒。在一些实施方案中，每个载体包含表达质粒。在一些实施方案中，所述非病毒载体是Sleeping Beauty转座子。
本文提供了一种免疫效应细胞，其包含本文提供的任何核苷酸。本文提供了一种免疫效应细胞，其包含(1)细胞标签，(2)IL-15，和(3)嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；和(e)CD3ζ信号传导域。
在一些实施方案中，所述IL-15是膜结合的IL-15。在一些实施方案中，所述膜结合的IL-15包含SEQ ID NO:161的多肽序列。在一些实施方案中，所述细胞标签包含HER1t，并且所述HER1t包含SEQ ID NO:65的多肽序列。在一些实施方案中，所述细胞标签包含HER1t-1，并且所述HER1t-1包含SEQ ID NO:66的多肽序列。
本文提供了一种免疫效应细胞，其包含本文描述的任何载体。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或调节性T细胞。在一些实施方案中，所述CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO:27-57中的至少一个。
本文提供了一种在有需要的人类受试者中刺激针对靶细胞群体或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括向所述人类受试者施用有效量的经遗传修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含：(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；(e)CD3ζ信号传导域；和(f)截短的表皮生长因子受体(HER1t)。在一些实施方案中，所述人已被诊断出患有卵巢癌和乳腺癌中的至少一种。在一些实施方案中，所述卵巢癌或乳腺癌是复发性或难治性卵巢癌或乳腺癌。
本文提供了一种分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中所述CAR包含：(a)具有SEQ ID NO:1-15或27-57所示氨基酸序列中的至少一个的MUC16抗原结合域；(b)具有SEQID NO:16的氨基酸序列的茎结构域；(c)包含具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CD28的共刺激信号传导域；(d)HER1标签，其包含具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HER1t和具有SEQID NO:66的氨基酸序列的HER1t-1中的至少一个；和(e)具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CD3ζ信号传导域。
本文提供了一种分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中所述CAR包含：(a)具有SEQ ID NO:1-15或27-57所示氨基酸序列中的至少一个的MUC16抗原结合域；(b)具有SEQID NO:16的氨基酸序列的茎结构域；(c)包含具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的4-1BB的共刺激信号传导域；(d)HER1标签，其包含具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HER1t和具有SEQID NO:66的氨基酸序列的HER1t-1中的至少一个；(e)具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CD3ζ信号传导域。
本文提供了一种载体，其包含本文描述的任何一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些实施方案中，所述非病毒载体是Sleeping Beauty转座子。在一些实施方案中，所述载体是多个载体。
本文提供了一种用于在免疫效应细胞中表达CAR的系统，该系统包含一种或多种编码本文提供的分离的核酸的载体。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，本文提供的系统可以进一步包含编码至少一种另外的基因的核酸。在一些实施方案中，所述另外的基因包括细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-21以及IL-15与IL-15Rα的融合体中的至少一种。在一些实施方案中，所述细胞因子为分泌形式。在一些实施方案中，所述细胞因子为膜结合形式。在一些实施方案中，所述系统包含一种载体。在一些实施方案中，所述一种或多种载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些实施方案中，所述非病毒载体是SleepingBeauty转座子。在一些实施方案中，本文提供的系统可以进一步包含Sleeping Beauty转座酶。在一些实施方案中，所述Sleeping Beauty转座酶是SB11、SB100X或SB110。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞是哺乳动物细胞。
本文提供了一种在免疫效应细胞中表达CAR的方法，其包括使所述免疫效应细胞与本文描述的系统接触。
本文提供了一种刺激工程化T细胞的增殖和/或存活的方法，其包括：(a)从受试者获得细胞样品，该样品包含T细胞或T细胞祖细胞；(b)用一种或多种编码权利要求1-34和47-52中任一项提供的分离的核酸的载体和编码转座酶的载体转染所述细胞，以提供工程化的表达MUC16 CAR的T细胞群体；(c)以及任选地，将MUC16 CAR T细胞群体离体培养2天或更短。
在一些实施方案中，所述刺激工程化T细胞的增殖和/或存活的方法可以进一步包括用编码细胞因子的载体转染所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞因子是包含IL-15和IL-15Rα的融合蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些实施方案中，所述非病毒载体是Sleeping Beauty转座子。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括Sleeping Beauty转座酶。在一些实施方案中，所述Sleeping Beauty转座酶是SB11、SB100X或SB110。
本文提供了一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用一剂或多剂有效量的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞包含MUC16 CAR和膜结合的IL-15。在一些实施方案中，第一剂有效量的工程化T细胞经腹膜内施用。在一些实施方案中，第二剂有效量的工程化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，所述MUC16 CAR由SEQ ID NO:95-107、119-149或194-195所示的任一种序列编码。在一些实施方案中，所述膜结合的IL-15由SEQID NO:161编码。在一些实施方案中，工程化T细胞的有效量为至少102个细胞/kg。在一些实施方案中，工程化T细胞的有效量为至少104个细胞/kg。在一些实施方案中，工程化T细胞的有效量为至少105个细胞/kg。
附图说明
在所附权利要求书中具体阐述了本发明的特征。通过参考以下对利用本公开的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本公开的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1是Sleeping Beauty转座子系统的示例性示意图。例如，通过电穿孔，将Sleeping Beauty衍生的编码MUC16 CAR和细胞因子的DNA质粒(如膜结合IL15(mbIL15)转座子)和编码SB转座酶的DNA质粒递送到免疫效应细胞中。工程化免疫效应细胞可以根据本文所述的照护点方法来制备。在某些情况下，MUC16 CAR和/或细胞因子可以与细胞或杀伤标签共表达以进行条件性体内消融。
图2描绘了具有基因开关组件的不同构型的MUC16 CAR和细胞因子的示例性基因表达盒。
图3描绘了具有不同茎长的MUC16 CAR的图示。
图4显示了CAR、mbIL15和HER1t1转基因的表达。用MUC16-3 CAR-HER1t1或MUC16-3CAR-mbIL15-HER1t1转座子和SB转座酶对T细胞进行核转染。在核转染后第1天测量转基因的表达。将细胞圈选(gate)为活CD3+细胞。显示的数据是来自三个健康供体的平均值±SEM。
图5显示了由CD8α铰链区衍生的不同间隔区长度的MUC16CAR在CAR-T细胞中的表达。通过在健康供体T细胞(供体#D133098)中对SB系统质粒进行电穿孔来生成MUC16 CAR-T细胞。通过每周一次刺激，通过与表达MUC16t的AaPC共培养，对CAR-T细胞进行数量上的离体扩充。在核转染后第1天和第8天，通过多参数流式细胞术测量CAR的表达。测试物在表6中列出。
图6显示了CAR-T细胞，其表达由CD8α铰链区衍生的不同间隔区长度的MUC16 CAR。通过在健康供体T细胞(供体#D132552)中对SB系统质粒进行电穿孔来生成CAR-T细胞。通过每周一次刺激，通过与表达MUC16t的AaPC共培养，对CAR-T细胞进行数量上的离体扩充。在核转染后第1天和第8天，通过多参数流式细胞术测量CAR的表达。测试物在表7中列出。
图7显示了MUC16 CAR表达的Western印迹分析。通过用小鼠抗人CD3ζ抗体染色来测量MUC16 CAR表达。泳道1：蛋白质标准；泳道2：MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞；3：MUC16-3CAR-mbIL15-HER1t1T细胞。
图8显示了mbIL15表达的Western印迹分析。通过用抗IL-15抗体染色来测量mbIL15表达。泳道1：蛋白质标准；泳道2：MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞；泳道3：MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞。
图9显示了HER1t1表达的Western印迹分析。通过免疫沉淀法及随后的Western印迹法测量HER1t1表达。泳道1：MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞；泳道2：MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞；泳道3：无裂解物免疫沉淀对照；泳道4：A431细胞系裂解物；泳道5：蛋白质标准。
图10A显示了在测试的各种肿瘤细胞系中MUC16表达的流式细胞术分析。
图10B显示了MUC16 CAR-T细胞的特异性细胞毒性。在不同的E:T比的情况下，MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞和MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞对多种肿瘤细胞系的细胞毒性。对照CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞用作阴性对照。显示了来自3个供体的一式三份孔的平均值±SEM。
图11显示了在与各种肿瘤细胞系共培养后，MUC16 CAR-T细胞的细胞因子产生。将使用三个健康供体的T细胞生成的CAR-T细胞与指定的肿瘤细胞系以1:1的E:T比共培养7天。显示了来自3个供体的一式三份孔的平均值±SEM。
图12显示了MUC16 CAR-T细胞在萤光素酶测定中的细胞毒性。由两个健康供体的T细胞生成的CAR-T细胞与肿瘤细胞系一起培养。测试物在表8中列出。
图13A显示了mbIL15在MUC16 CAR-T细胞中的生物学功能。CAR-T细胞由三个健康供体的T细胞生成。在不存在抗原和外源细胞因子的情况下，在体外培养中，MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞和MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞的持久性。每个符号代表单个供体CAR-T细胞。显示了来自三个供体的平均值±SEM。
图13B显示了mbIL15在MUC16 CAR-T细胞中的生物学功能。CAR-T细胞由三个健康供体的T细胞生成。显示了CAR-T细胞的增殖。每个符号代表单个供体CAR-T细胞。显示了来自三个供体的平均值±SEM。
图13C显示了mbIL15在MUC16 CAR-T细胞中的生物学功能。CAR-T细胞由三个健康供体的T细胞生成。显示了MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞的记忆标志物分析。每个符号代表单个供体CAR-T细胞。显示了来自三个供体的平均值±SEM。
图14显示了在不存在外源细胞因子的情况下，MUC16 CAR-T细胞的体外持久性。在存在或不存在外源细胞因子的情况下，将来自三个健康供体T细胞的MUC16-2 CAR-HER1t1T细胞和MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞培养2周。作为含有细胞因子的培养中的T细胞的分数，对没有细胞因子的培养中的活T细胞进行了作图。显示的数据是来自三个供体的平均值±SEM。
图15显示了共表达HER1t1的MUC16 CAR-T细胞的西妥昔单抗介导的ADCC活性(以％细胞毒性表示；y轴)。同种异体NK细胞作为效应细胞以10:1的E:T比使用。西妥昔单抗对表达HER1t1的MUC16CAR-T细胞显示出特异性细胞毒性。显示的数据是平均值±SEM。
图16显示了如通过体内生物发光(IVIS)成像所测量的，SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤负荷的定量分析。在第0天，通过腹膜内注射向NSG小鼠(每组N＝5-7只小鼠)施用SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤细胞系。通过单次腹膜内注射或静脉内注射，用不同的MUC16 CAR-T治疗处理荷瘤小鼠，并在治疗过程中通过IVIS对肿瘤负荷进行定量。显示的数据是平均值±SEM。箭头表示CAR-T施用天数。
图17显示了如通过体内生物发光(IVIS)成像所测量的，SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤负荷的定量分析。在第0天，通过腹膜内注射向NSG小鼠(每组N＝5-7只小鼠)施用SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤细胞系。在施用肿瘤细胞五天后，通过单次腹膜内注射，用不同的MUC16 CAR-T治疗处理荷瘤小鼠，并在治疗过程中通过IVIS对肿瘤负荷进行定量。显示的数据是平均值±SEM。
图18A和图18B显示了在治疗的荷瘤NSG小鼠的血液中，MUC16CAR-T细胞的定量。通过腹膜内注射向NSG小鼠(每组N＝5-7只小鼠)施用SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤细胞系。在施用肿瘤细胞五天后，通过单次腹膜内注射，用不同的MUC16 CAR-T治疗处理荷瘤小鼠，并通过测量小鼠血液样品中的CD8+HER1t1+(图18A)和CD4+HER1t1+(图18B)T细胞对CAR-T细胞进行定量(每毫升血液中的CAR-T细胞数；y轴)。显示的数据是平均值±SEM；每个时间点n＝5-7只小鼠。
图19显示了如通过体内生物发光(IVIS)成像所测量的，SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤负荷的定量分析。在第0天，通过腹膜内注射向NSG小鼠(每组N＝5只小鼠)施用SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤细胞系。在施用肿瘤细胞五天后，通过单次腹膜内注射，用三个不同剂量之一的MUC16-2 CAR-T细胞处理荷瘤小鼠，并在治疗过程中通过IVIS对肿瘤负荷进行定量。测试物在表9中列出。显示的数据是平均值±SEM。
图20显示了如通过体内生物发光(IVIS)成像所测量的，SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤负荷的定量分析。在第0天，通过腹膜内注射向NSG小鼠(每组N＝5只小鼠)施用SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤细胞系。在施用肿瘤细胞五天后，通过单次腹膜内注射，用三个不同剂量之一的MUC16-3 CAR-T细胞处理荷瘤小鼠，并在治疗过程中通过IVIS对肿瘤负荷进行定量。测试物在表9中列出。显示的数据是平均值±SEM。
具体实施方式
以下描述和实施例详细阐明了本发明的实施方案。应当理解，本发明不限于本文所述的特定实施方案，因此可以变化。本领域技术人员将会认识到，本发明存在许多变化和修改，这些均涵盖在其范围内。
所有术语旨在被理解成它们将被本领域技术人员所理解的那样。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
本文所用的章节标题仅用于组织编排的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
尽管本发明的各个特征可以在单个实施方案的语境中描述，但是这些特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的语境中描述本发明，但是本发明也可以在单个实施方案中实现。
以下定义补充了本领域中的定义，并且针对本申请，并且不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。本文描述了优选的材料和方法，但是与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可以在测试本公开内容的实践中使用。因此，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并非旨在限制。
在本申请中，除非另有特别说明，否则单数形式的使用包括复数形式。必须指出，除非上下文另有明确说明，否则如本说明书中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式如“包含”、“含有”和“具有”的使用不是限制性的。
本说明书中提及“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”意指与该实施方案相关描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。
如在本说明书和权利要求书中所用的，词语“包含”(和任何形式的包含)、“具有”(和任何形式的具有)、“包括”(和任何形式的包括)或“含有”(和任何形式的含有)是包含性的或开放式的，并不排除其他未列举的要素或方法步骤。可以想到，本说明书中讨论的任何实施方案可以采用本发明的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用来实现本发明的方法。
如本文所用的，关于参考数值的术语“约”及其语法等同语可包括该数值本身和该数值加或减10％的值的范围。例如，“约10”的量包括10以及9至11的任何量。例如，关于参考数值的术语“约”还可以包括该数值加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数值范围。
所谓“分离的”是指将核酸从其天然环境中取出。所谓“纯化的”是指给定的核酸，无论是从自然界中取出的(包括基因组DNA和mRNA)还是在实验室条件下合成(包括cDNA)和/或扩增的，其纯度得到提高，其中“纯度”是一个相对的术语，而不是“绝对纯度”。然而，应该理解，核酸和蛋白质可以与稀释剂或佐剂一起配制，而出于实际目的仍然是分离的。例如，当用于引入细胞中时，核酸通常与可接受的载体或稀释剂混合。
如本文所用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”是指任何长度的核苷酸——核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸——的聚合形式。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA、三链DNA以及双链和单链RNA。它还包括修饰形式(例如通过甲基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。该术语还意在包括包含非天然存在的核苷酸或合成核苷酸以及核苷酸类似物的分子。
“多肽”与术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。“成熟蛋白质”是全长的并且任选地包含在给定细胞环境中对蛋白质而言典型的糖基化或其他修饰的蛋白质。
当核酸和/或核酸序列天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，它们是“同源的”。当蛋白质和/或蛋白质序列的编码DNA天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，这些蛋白质和/或蛋白质序列是同源的。同源分子可称为同源物。例如，如本文所述的任何天然存在的蛋白质均可以通过任何可用的诱变方法进行修饰。当表达时，该诱变的核酸编码的多肽与原始核酸编码的蛋白质同源。通常从两种或更多种核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列同一性推断同源性。可用于确立同源性的序列间精确同一性百分比随所讨论的核酸和蛋白质而变化，但是常规使用低至25％的序列同一性来确立同源性。更高水平的序列同一性，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高，也可用来确立同源性。
在两个核酸序列或多肽的氨基酸序列的语境中，如本文所用的术语“相同的”或“序列同一性”，是指在指定的比较窗口上，两个序列中的残基在为了获得最大对应性而对齐时相同。在一类实施方案中，本文的多肽与参考多肽或其片段至少80％、85％、90％、98％、99％或100％相同，例如，如通过BLASTP(或CLUSTAL，或任何其他可用的比对软件)使用默认参数来测定的。类似地，核酸也可以参考起始核酸来描述，例如，它们可以与参考核酸或其片段50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、98％、99％或100％相同，例如，如通过BLASTN(或CLUSTAL，或任何其他可用的比对软件)使用默认参数来测定的。当描述一个分子与较大分子具有一定百分比的序列同一性时，这意味着当两个分子最佳对齐时，根据两个分子最佳对齐的顺序，较小分子中所述百分比的残基在较大分子中找到匹配残基。
“转座子”或“转座因子”(TE)是可以改变其在基因组内的位置的载体DNA序列，其有时产生或逆转突变并改变细胞的基因组大小。转座经常导致TE的复制。I类TE在两个阶段中拷贝：首先，它们从DNA转录为RNA，然后所产生的RNA被逆转录为DNA。然后，拷贝的DNA插入基因组的新位置。逆转录步骤由逆转录酶催化，该逆转录酶可以由TE本身编码。逆转录转座子的特征类似于逆转录病毒，如HIV。II类TE的剪切-粘贴转座机制不涉及RNA中间体。转座由几种转座酶催化。一些转座酶非特异性地结合DNA中的任何靶位点，而其他转座酶结合特定的DNA序列靶标。转座酶在靶位点处进行交错剪切，从而产生单链5’或3’DNA突出端(粘端)。该步骤切下DNA转座子，然后将其连接到新的靶位点；该过程涉及补平缺口的DNA聚合酶和封闭糖-磷酸骨架的DNA连接酶的活性。这导致靶位点的复制。DNA转座子的插入位点可以通过短的定向重复序列(其可以通过在靶DNA中交错剪切并通过DNA聚合酶补平而产生)和随后的对转座酶切除TE至关重要的一系列反向重复序列来鉴定。如果当在细胞周期的S期中供体位点已被复制但靶位点尚未复制时发生剪切-粘贴TE的转座，则该剪切-粘贴TE可以被复制。在I类和II类TE中，转座可被分为“自主的”或“非自主的”。自主TE可以自己移动，而非自主TE的移动需要存在另一TE。这通常是因为非自主TE缺乏转座酶(对于II类)或逆转录酶(对于I类)。
“转座酶”是指结合至转座子末端并通过剪切-粘贴机制或复制转座机制催化转座子移动到基因组另一部分的酶。在一些实施方案中，转座酶的催化活性可用来将基因从载体移动到基因组。
可以通过“转染”、“转化”、“核转染”或“转导”将本文公开或考虑的核酸序列和载体引入细胞中。如本文所用的，“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞中。许多转染技术是本领域已知的，并且包括例如磷酸钙DNA共沉淀(参见，例如，Murray E.J.(编著),Methods in Molecular Biology,Vol.7,Gene Transfer and Expression Protocols,Humana Press(1991))；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))；和核转染(Trompeter等人,J.Immunol.Methods 274:245-256(2003))。在合适的包装细胞中生长感染性颗粒后，可将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞中，其中许多包装细胞可商购获得。
“启动子”是指启动编码序列转录的多核苷酸区域。启动子位于基因的转录起始位点附近，位于DNA的同一链和上游(朝向有义链的5’区)。一些启动子是组成型的，因为它们在细胞中在所有情况下都具有活性，而其他启动子响应于特定刺激被调节变得具有活性，例如诱导型启动子。
术语“启动子活性”是指与正被测量活性的启动子可操作地连接的核苷酸序列的表达程度。启动子活性可以通过确定产生的RNA转录物的量直接测定(例如通过Northern印迹分析)，或通过确定由所连接的核酸序列(如与启动子连接的报道核酸序列)编码的产物的量间接测定。
如本文所用的“诱导型启动子”是指通过转录调节物(例如，生物或非生物因素)的存在或不存在而诱导活性的启动子。诱导型启动子是有用的，因为与它们可操作连接的基因的表达可以在生物体的某些发育阶段或在特定组织中打开或关闭。诱导型启动子的实例是醇调节的启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子、发病机理调节的启动子、温度调节的启动子和光调节的启动子。在一个实施方案中，诱导型启动子是遗传开关的部分。
如本文所用的术语“增强子”是指增加例如与其可操作地连接的核酸序列的转录的DNA序列。增强子可以位于远离核酸序列编码区的数千碱基处，并且可以介导调节因子的结合、DNA甲基化的模式或DNA结构的改变。来自多种不同来源的大量增强子是本领域公知的，并且可作为克隆的多核苷酸(来自诸如ATCC等保藏中心以及其他商业或个体来源)或在克隆的多核苷酸内获得。许多包含启动子(如常用的CMV启动子)的多核苷酸也包含增强子序列。增强子可位于编码序列的上游、内部或下游。术语“Ig增强子”是指衍生自定位于免疫球蛋白(Ig)基因座内的增强子区域的增强子元件(这样的增强子包括例如重链(μ)5’增强子、轻链(κ)5’增强子、κ和μ内含增强子和3’增强子)(一般性地参见Paul W.E.(编著),Fundamental Immunology,第3版,Raven Press,New York(1993),第353-363页；以及美国专利5,885,827)。
如本文所用的“编码序列”是指编码多肽的多核苷酸区段。该区域或序列由5'端附近的起始密码子和3'端附近的终止密码子来界定。编码序列也可以被称为开放阅读框。
如本文所用的“可操作地连接的”是指DNA区段与另一DNA区段的物理和/或功能连接，从而允许这些区段以其预期方式起作用。当编码基因产物的DNA序列与调节序列如启动子、增强子和/或沉默子以某种方式连接，使得允许直接或间接调节该DNA序列的转录时，该DNA序列与调节序列可操作地连接。例如，当DNA序列与启动子在启动子的转录起始位点下游连接，与该转录起始位点符合正确的阅读框架，并允许转录延伸通过该DNA序列进行时，该DNA序列与该启动子可操作地连接。当增强子或沉默子以某种方式连接到编码基因产物的DNA序列上，从而分别增加或减少该DNA序列的转录时，该增强子或沉默子与该DNA序列可操作地连接。增强子和沉默子可位于DNA序列的编码区的上游、下游或嵌入其中。如果信号序列被表达为参与多肽分泌的前蛋白质，则该信号序列的DNA与编码该多肽的DNA可操作地连接。DNA序列与调节序列的连接通常通过在合适的限制位点连接或通过使用本领域技术人员已知的限制性内切核酸酶插入该序列中的衔接子或连接体来完成。
术语“转录调节物”是指这样的生化元件，其在某些环境条件下用来阻止或抑制启动子驱动的DNA序列的转录(例如，阻遏物或核抑制蛋白)，或者在某些环境条件下用来允许或刺激启动子驱动的DNA序列的转录(例如，诱导物或增强子)。
术语“诱导”是指相对于一定的基础转录水平，由转录调节物引起的核酸序列转录、启动子活性和/或表达的增加。
“靶”基因或“异源”基因或“目的基因(GOI)”是指通过基因转移引入宿主细胞中的基因。
如本文所用的“重组酶”是指可以促进在限定位点之间的位点特异性重组的一组酶，其中这些位点在单个DNA分子上物理分离，或者这些位点位于单独的DNA分子上。所定义的重组位点的DNA序列不一定是相同的。重组的起始取决于蛋白质-DNA相互作用，在该组内有大量蛋白质催化噬菌体整合和切除(例如，λ整合酶、.φC31)、循环质粒的解离(例如，Tn3、gamma delta、Cre、Flp)、用于表达替代基因的DNA反转(例如，Hin、Gln、Pin)、发育期间基因的装配(例如，鱼腥藻(Anabaena)固氮基因)和转座(例如，IS607转座子)。基于进化和机制相关性，大多数位点特异性重组酶属于两个家族之一。它们是.λ整合酶家族或酪氨酸重组酶(例如Cre、Flp、Xer D)和解离酶(resolvase)/整合酶家族或丝氨酸重组酶家族(例如，φC31、TP901-1、Tn3、gamma delta)。
“重组附着位点”是被本文所述的重组酶识别的特定多核苷酸序列。通常，涉及两个不同的位点(称为“互补位点”)，一个存在于靶核酸(例如，真核生物或原核生物的染色体或附加体)中，另一个存在于待整合至目标重组位点的核酸上。本文使用术语“attB”和“attP”，它们分别是指最初来自细菌靶标和噬菌体供体的附着(或重组)位点，尽管针对特定酶的重组位点可能具有不同的名称。重组位点通常包括由核心或间隔区隔开的左臂和右臂。因此，attB重组位点由BOB'组成，其中B和B'分别是左臂和右臂，而O是核心区。类似地，attP是POP'，其中P和P'是臂，而O是核心区。在attB与attP位点之间重组并且核酸同时整合到靶标上时，整合DNA侧翼的重组位点被称为“attL”和“attR”。使用上述术语，attL和attR位点因此分别由BOP'和POB'组成。在本文的一些表示中，省略“O”，并且例如将attB和attP分别表示为BB'和PP'。
“表达载体”或“载体”是任何遗传元件，例如质粒、染色体、病毒、转座子，其表现为细胞内多核苷酸复制的自主单元(即能够在其自身控制下复制)或通过插入宿主细胞染色体中而能够复制，其已附接有另一多核苷酸区段，以便实现所附接的区段的复制和/或表达。合适的载体包括但不限于质粒、转座子、噬菌体和粘粒。载体可含有实现载体连接或插入所需宿主细胞中以及实现附接区段的表达所必需的多核苷酸序列。这样的序列根据宿主生物体而不同；它们包括实现转录的启动子序列、增加转录的增强子序列、核糖体结合位点序列以及转录和翻译终止序列。或者，表达载体可以能够直接表达其中编码的核酸序列产物，而无需载体连接或整合到宿主细胞DNA序列中。
载体还可以包含“选择标记基因”。如本文所用的，术语“选择标记基因”是指在相应选择剂的存在下允许表达核酸序列的细胞被特异性选择或排除的核酸序列。合适的选择标记基因是本领域已知的，并描述于例如国际专利申请公开WO 1992/08796和WO 1994/28143；Wigler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:3567(1980)；O’Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1527(1981)；Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072(1981)；Colberre-Garapin等人,J.Mol.Biol.,150:1(1981)；Santerre等人,Gene,30:147(1984)；Kent等人,Science,237:901-903(1987)；Wigler等人,Cell,11:223(1977)；Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:2026(1962)；Lowy等人,Cell,22:817(1980)；和美国专利5,122,464和5,770,359。
在一些实施方案中，所述载体是“附加型表达载体”或“附加体”，其能够在宿主细胞中复制，并且在适当选择压力的存在下作为DNA的染色体外区段存在于宿主细胞内(参见，例如，Conese等人,Gene Therapy,11:1735-1742(2004))。代表性的可商购的附加型表达载体包括但不限于利用EB核抗原1(EBNA1)和EB病毒(EBV)复制起点(oriP)的附加型质粒。来自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)的载体pREP4、pCEP4、pREP7和pcDNA3.1以及来自Stratagene(La Jolla,Calif.)的pBK-CMV代表了使用T-抗原和SV40复制起点来代替EBNA1和oriP的附加型载体的非限制性实例。
“癌细胞”是指经历了如先前所述的多步骤肿瘤进展的早期、中间或晚期阶段的细胞(Pitot等人,Fundamentals of Oncology,15-28(1978))。这包括处于肿瘤进展的早期、中期和晚期阶段的细胞，包括“肿瘤前”细胞(即“增生”细胞和发育不良的细胞)，以及处于发育不良细胞的肿瘤进展晚期的赘生性细胞。
“转移性”癌细胞是指从原发癌部位(即，最初由正常、增生或发育不良的细胞形成癌细胞的位置)移位到原发部位以外的部位的癌细胞，移位的癌细胞在后一部位驻留并增殖。
“癌症”是指可能是转移性的或者可能不是转移性的多个癌细胞，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、食管癌、口腔癌、舌癌、牙龈癌、皮肤癌(例如黑素瘤、基底细胞癌、卡波西肉瘤等)、肌肉癌、心脏癌、肝癌、支气管癌、软骨癌、骨癌、睾丸癌、肾癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、骨髓癌、淋巴瘤癌、脾癌、胸腺癌、甲状腺癌、脑癌、神经元癌、间皮瘤、胆囊癌、眼癌(例如角膜癌、葡萄膜癌、脉络膜癌、黄斑癌、玻璃体液癌等)、关节癌(如滑膜癌)、胶质母细胞瘤、淋巴瘤和白血病。
MUC16
MUC16也被称为CA-125(癌抗原125、肿瘤抗原125或碳水化合物抗原125)或粘蛋白16，是糖蛋白的粘蛋白家族的成员。已经表明，MUC16通过几种不同的机制在促进肿瘤发生和肿瘤增殖中起作用。针对MUC16的基于抗体的方法成功率极低。因此，需要其他治疗策略。
MUC16是一种大的碳水化合物抗原，也称为CA-125。MUC16由位于人类19号染色体上的MUC16基因编码。MUC16是包含3个结构域的高度糖基化的多结构域I型跨膜蛋白。C末端结构域包含多个具有自蛋白水解活性的细胞外SEA(海胆精子蛋白、肠激酶和聚集蛋白)模块。SEA在跨膜(TM)域的附近有两个蛋白水解位点。被称为CA-125的切割的大结构域在酸性pH下释放到循环中。CA-125通常用作卵巢癌的疾病生物标志物。高度保守的截短的细胞外膜束缚的蛋白质结构域被称为MUCl6ecto结构域。鉴定出一种MUC16抗体，其特异性结合保留在肿瘤细胞表面上的MUC16的胞外域。目的细胞(如癌细胞)的“MUC16过表达”是指与对照细胞(如非癌细胞、正常细胞等)相比，目的细胞表达的MUC16蛋白和/或mRNA的水平更高。
嵌合抗原受体
在本文所述的实施方案中，CAR可包含用于靶标识别的细胞外抗体衍生的单链可变域(scFv)，其中该scFv可通过柔性连接体连接至跨膜域和/或细胞内信号传导域，后者例如包括用于T细胞激活的CD3ζ。在正常情况下，当T细胞在体内被激活时，它们会收到原发性抗原诱导的TCR信号，以及来自CD28的继发性共刺激信号传导，CD28诱导细胞因子(即IL-2和IL-21)的产生，细胞因子然后以自分泌/旁分泌方式反馈到信号回路中。这样，CAR可包括信号传导域，例如CD28胞质信号传导域或其他共刺激分子信号传导域，如4-1BB信号传导域。嵌合CD28的共刺激通过上调抗凋亡分子和产生IL-2以及扩充源自外周血单核细胞(PBMC)的T细胞来改善T细胞的持久性。
在一个实施方案中，CAR是衍生自对MUC16的各个表位具有特异性的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)例如与跨膜域和CD3-ζ胞内域融合的融合体。此类分子响应于其靶标被scFv识别而导致ζ信号的传输。
在实施方案中，CAR可具有胞外域(细胞外)、跨膜域和胞内域(细胞内)。在CAR胞外域的一个实施方案中，信号肽将新生蛋白质引导至内质网内。例如，将受体糖基化并锚定在细胞膜中时就是这样。想到任何真核信号肽序列都是功能性的。通常，使用天然连接至最氨基末端组分的信号肽(例如，在具有轻链-连接体-重链方向的scFv中，使用轻链的天然信号)。在实施方案中，信号肽是GM-CSFRa(SEQ ID NO:58)或IgK(SEQ ID NO:59)。可以使用的其他信号肽包括来自CD8alpha和CD28的信号肽。
抗原识别域可以是scFv。然而，也可以有替代选择。想到来自天然T细胞受体(TCR)α和β单链的抗原识别域，因为它们具有简单的胞外域(例如CD4胞外域)以及其他识别组件，如连接的例如细胞因子(导致识别带有细胞因子受体的细胞)。几乎任何以高亲和力结合给定靶标的物质，例如病毒相关抗原，可以用作抗原识别区。
通常，CAR以二聚化形式存在，并表达为连接细胞外scFv(与VL连接的VH)区域、茎结构域、跨膜域和细胞内信号传导基序的融合蛋白。第一代CAR的胞内域仅通过CD3-ζ信号传导诱导T细胞活化。第二代CAR通过CD3-ζ和CD28或其他胞内域如4-1BB或OX40提供激活信号传导。第三代CAR通过三种信号传导基序如CD28、4-1BB或OX40的含CD3-ζ的组合激活T细胞。
在实施方案中，本发明提供了包含胞外域、跨膜域和细胞内信号传导域的嵌合抗原受体(CAR)。在实施方案中，胞外域包含靶标特异性结合元件，后者也被称为抗原结合部分或scFv和茎结构域。在实施方案中，细胞内信号传导域或细胞质信号传导域包含共刺激信号传导区和ζ链部分。
共刺激信号传导区是指CAR的一部分，其包含共刺激分子的细胞内信号传导域。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。
在实施方案中，在CAR的胞外域与跨膜域之间，并入茎结构域或茎区。如本文所用的，术语“茎结构域”或“茎区”通常是指任何寡核苷酸或多肽，其起到将跨膜域连接到scFv或多肽链中的胞质域的作用。茎结构域可包括柔性铰链如Fc铰链和可选的一个或两个Fc恒定域。在一些情况下，茎区包含来自IgG1的铰链区。在备选的情况下，茎区包含免疫球蛋白的CH2CH3区和可选的CD3的部分。在一些情况下，茎区包含CD8α铰链区(SEQ ID NO:196)、IgG4-Fc 12氨基酸铰链区(ESKYGPPCPPCP)或IgG4铰链区，如WO/2016/073755所述。
在其他实施方案中，在CAR的胞外域与跨膜域之间，并入间隔区。间隔区可包含茎区和茎延伸区，如图3所示。在一个实施方案中，间隔区可以包括单个茎区。在另一个实施方案中，间隔区可包含茎区(表示为“s”)和在本文中表示为“s-n”的茎延伸区。例如，间隔区可以包含一(1)个茎区和s'-n，其中n可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在进一步的实施方案中，茎区可以经由连接体连接至茎延伸区s'-n。
跨膜域可以来自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。合适的跨膜域可包括T细胞受体的α、β或ζ链的跨膜区；或来自CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜区。或者，跨膜域可以是合成的，并且可以包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，在合成跨膜域的一个或两个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，在一些实施方案中，长度为2至10个氨基酸的短寡核苷酸或多肽连接体可以在CAR的跨膜域与胞质信号传导域之间形成连接。在一些实施方案中，连接体是甘氨酸-丝氨酸连接体。在一些实施方案中，跨膜域包含CD8α跨膜域或CD3ζ跨膜域。在一些实施方案中，跨膜域包含CD8α跨膜域。在其他实施方案中，跨膜域包含CD3ζ跨膜域。
胞内域可包含一个或多个共刺激结构域。示例性共刺激结构域包括但不限于CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)、CD3ζ或其片段或组合。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、OX40(CD134)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD8、CD28、4-1BB(CD137)、DAP10、DAP12或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD28、4-1BB(CD137)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD28和4-1BB(CD137)或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD28和OX40(CD134)或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD8和CD28或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD28或其片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域4-1BB(CD137)或其片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域OX40(CD134)或其片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD8或其片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含至少一个共刺激结构域DAP10或其片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含至少一个共刺激结构域DAP12或其片段。
本公开的CAR的细胞内信号传导域(也称为细胞质结构域)负责激活已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应物功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导域”是指蛋白质的一部分，其转导效应物功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导域，但在许多情况下不必使用整条链。在使用细胞内信号传导域的截短部分时，可以使用这样的截短部分代替完整的链，只要它转导效应物功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导域意味着包括足以转导效应物功能信号的细胞内信号传导域的任何截短部分。在一些实施方案中，胞内域进一步包含用于T细胞活化的信号传导域。在一些情况下，用于T细胞活化的信号传导域包含来源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的结构域。在一些情况下，用于T细胞活化的信号传导域包含来源于CD3ζ的结构域。
在实施方案中，本文提供了一种分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中所述CAR包含(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；(e)CD3ζ信号传导域；和可选的(f)截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t1)。
编码本文所述的CAR的功能部分的核酸序列包括在本发明的范围内。功能部分包括，例如，CAR的那些部分，其保留与亲本CAR相似程度、相同程度或更高程度的识别靶细胞或检测、治疗或预防疾病的能力。关于编码亲本CAR的核酸序列，编码CAR的功能部分的核酸序列可编码构成亲本CAR的例如约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多的蛋白质。
在实施方案中，所述CAR在该部分的氨基或羧基末端或在两个末端包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸在亲本CAR的氨基酸序列中未发现。理想地，所述另外的氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，例如，识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更理想地，与亲本CAR的生物活性相比，所述另外的氨基酸增强了CAR的生物活性。
如本文所用的，术语“功能变体”是指这样的多肽或蛋白质，其与参考多肽具有较高或显著的序列同一性或相似性，并且保留其作为变体的参照多肽的生物活性。功能变体包括，例如，本文所述CAR(亲本CAR)的那些变体，其保留与亲本CAR相似程度、相同程度或更高程度的识别靶细胞的能力。关于编码亲本CAR的核酸序列，编码CAR的功能变体的核酸序列可以与编码亲本CAR的核酸序列例如约10％相同、约25％相同、约30％相同、约50％相同、约65％相同、约80％相同、约90％相同、约95％相同或约99％相同。
本文所述的CAR包括(包括其功能部分及其功能变体)糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、例如通过二硫键环化，或转化为酸加成盐和/或任选地二聚化或聚合或缀合。
抗原结合部分
在实施方案中，本文描述的CAR包含靶标特异性结合元件，其另外被称为抗原结合部分。在实施方案中，通过工程改造与细胞上的抗原特异性结合的所需抗原结合部分，将本文所述的CAR工程改造为靶向目的抗原。
在实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对MUC16是特异性的(MUC16 CAR)。当在细胞表面上表达时，MUC16特异性CAR将T细胞的特异性重定向至人MUC16。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scFv)，后者包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或Whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗MUC16抗体的轻链可变域(VL)和重链可变域(VH)。在实施方案中，该scFv是MUC16-1 scFv、MUC16-2 scFv、MUC16-3 scFv、MUC16-4scFv、MUC16-5 scFv、MUC16-6 scFv或MUC16-7 scFv。在实施方案中，该scFv是人源化的。在一些实施方案中，抗原结合部分可包含定向连接的VH和VL，例如，从N末端到C末端、VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:1、3、5、7、9、12和14所示的任一种氨基酸序列(MUC16 VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:4、6、8、10、11、13和15所示的任一种氨基酸序列(MUC16 VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分VL(SEQ ID NO:1、3、5、7、9、12或14)和VH(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、11或15)以及Gly-Ser连接体(SEQ ID NO:83或SEQ IDNO:197)或该连接体的功能变体。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:27-57所示的任一种氨基酸序列(VH、VL和连接体)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:2氨基酸序列(MUC16-1 VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:1氨基酸序列(MUC16-1 VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:4氨基酸序列(MUC16-2 VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:3氨基酸序列(MUC16-2 VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:6氨基酸序列(MUC16-3 VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:5氨基酸序列(MUC16-3 VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:8氨基酸序列(MUC16-4 VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:7氨基酸序列(MUC16-4 VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:10氨基酸序列(MUC16-5 VH-L)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:11氨基酸序列(MUC16-5 VH-F)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:9氨基酸序列(MUC16-5 VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:13氨基酸序列(MUC16-6 VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:12氨基酸序列(MUC16-6 VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:15氨基酸序列(MUC16-7 VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO:14氨基酸序列(MUC16-7 VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。
在实施方案中，抗原结合部分具有与SEQ ID NO:58氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的GM-CSFRa信号肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:27氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:28氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:29氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:30氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:31氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:32氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:33氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:34氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:35氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:36氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:37氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:38氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:39氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:40氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:41氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:42氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:43氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:44氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:45氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:46氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:47氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:48氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:49氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:50氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:51氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:52氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:53氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:54氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:55氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:56氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO:57氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
茎结构域
在实施方案中，本发明的MUC16 CAR包含茎结构域，该茎结构域在抗原结合部分与T细胞膜之间提供分隔。在实施方案中，茎结构域建立了最佳效应物-靶标膜间距离。在实施方案中，茎结构域为抗原结合域提供了柔性，以达到其靶标。在一个实施方案中，茎结构域是CD8α铰链结构域。
在实施方案中，CD8α铰链结构域包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
间隔区
在其他实施方案中，在CAR的胞外域与跨膜域之间，并入间隔区。如本文所述，间隔区可包含茎区和茎延伸区，如图3所示。在一个实施方案中，间隔区可以包括单个茎区。在另一个实施方案中，间隔区可包含茎区(表示为“s”)和在本文中表示为“s-n”的茎延伸区。例如，间隔区可以包含一(1)个茎区和s'-n，其中n可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在进一步的实施方案中，茎区可以经由连接体连接至茎延伸区s'-n。如本文所述的连接体可包括，例如，GSG连接体(SEQ ID NO:85)、SGSG连接体(SEQID NO:86)、(G4S)3连接体(SEQ ID NO:83)、(G4S)4连接体(SEQ ID NO:200)和/或Whitlow连接体。
在一个实施方案中，茎区和茎延伸区可以从天然或合成来源的多肽衍生或设计。茎区和/或茎延伸区可包含来源于细胞表面蛋白质或其衍生物或变体的铰链结构域。在一些实施方案中，茎区和/或茎延伸区可包含来源于CD28或CD8α(CD8α)的铰链结构域。在一些实施方案中，茎区和茎延伸区中的每一个可以来源于CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、CTLA-4铰链结构域、LNGFR胞外域、IgG1铰链、IgG4铰链和CH2-CH3结构域中的至少一个。茎区和茎延伸区可以单独地来源于CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、CTLA-4铰链结构域、LNGFR胞外域、IgG1铰链、IgG4铰链或CH2-CH3结构域的任何组合。例如，茎区可以来源于CD8α铰链结构域，而至少一个茎延伸区可以来源于CD28铰链结构域，从而产生杂合间隔区。再例如，茎区可以来源于IgG1铰链或IgG4铰链，而至少一个茎延伸区可以来源于IgG的CH2-CH3结构域。
在某些实施方案中，茎区可包含一个或多个二聚化位点，以形成同二聚化或异二聚化的嵌合多肽。在其他实施方案中，茎区或一个或多个茎延伸区可包含完全消除二聚化位点的突变。在一些实施方案中，茎延伸区与茎区相比可以至少少一个二聚化位点。例如，如果茎区包含两个二聚化位点，则茎延伸区可以包含一个或零个二聚化位点。再例如，如果茎区包含一个二聚化位点，则茎延伸区可以包含零个二聚化位点。在一些实例中，茎延伸区缺少二聚化位点。
在本文公开的实施方案的一些方面，本发明抗原结合多肽的茎区包含与CD8铰链结构域具有至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列。CD8α铰链结构域可包含与SEQ ID NO:16所示序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高同一性的多肽序列。在一些情况下，茎延伸区包含与SEQ ID NO:16所示序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高同一性的多肽序列。在一些情况下，茎延伸区包含与SEQ ID NO:108所示序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高同一性的核苷酸序列。在一些实例中，茎区和茎延伸区可以一起包含与SEQ IDNO:16所示序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高同一性的多核苷酸序列。
跨膜域
在实施方案中，所述CAR包含与CAR茎结构域的胞外域融合的跨膜域。在一个实施方案中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜域。在实施方案中，跨膜域是跨膜的疏水性α螺旋。
跨膜域可以来自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中特别使用的跨膜区可以衍生自(即，至少包含其跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。或者，跨膜域可以是合成的，在这种情况下，其将包含主要为疏水性的残基，如亮氨酸和缬氨酸。在实施方案中，在合成跨膜域的每个末端会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，在实施方案中长度为2至10个氨基酸的短寡核苷酸或多肽连接体可以在CAR的跨膜域与细胞质信号传导域之间形成连接。在实施方案中，该连接体是甘氨酸-丝氨酸连接体。
在实施方案中，本文所述的CAR中的跨膜域是CD8α跨膜域。在实施方案中，CD8α跨膜域包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在实施方案中，本文所述的CAR中的跨膜域是CD28跨膜域。在实施方案中，CD28跨膜域包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
细胞质结构域(共刺激结构域和信号传导域)
本文所述的CAR的细胞质结构域，也称为细胞内信号传导域，负责激活已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应物功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导域”是指蛋白质的一部分，其转导效应物功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导域，但在许多情况下不必使用整条链。在使用细胞内信号传导域的截短部分时，可以使用这样的截短部分代替完整的链，只要它转导效应物功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导域意味着包括足以转导效应物功能信号的细胞内信号传导域的任何截短部分。
供本文所述的CAR使用的细胞内信号传导域的实例可包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列，它们协同作用以在抗原-受体接合后启动信号转导，并且包括这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。
仅通过TCR生成的信号通常不足以完全激活T细胞，而是还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可以由两种不同类别的细胞质信号传导序列来介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的序列(初级细胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的序列(次级细胞质信号传导序列)。
初级细胞质信号传导序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可包含信号传导基序，后者被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
在本发明中特别使用的含ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcR、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些序列。在实施方案中，本文所述的CAR中的细胞质信号传导分子包含衍生自CD3ζ的细胞质信号传导序列。
在实施方案中，可以将CAR的细胞质结构域设计为本身包含CD3-ζ信号传导域，或者与在本文所述CAR的背景下有用的其他任何所需细胞质结构域组合。例如，CAR的细胞质结构域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指CAR的一部分，其包含共刺激分子的胞内域。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。这类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、DAP10、DAP12以及与CD83特异性结合的配体等。在实施方案中，共刺激分子可以一起使用，例如CD28和4-1BB或CD28和OX40。因此，虽然本发明主要以4-1BB和CD28作为共刺激信号传导元件为例，但是其他共刺激元件也在本发明的范围内。
本文所述CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以以随机或指定顺序彼此连接。任选地，长度为2至10个氨基酸的短寡核苷酸或多肽连接体可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的连接体。
在一个实施方案中，细胞质结构域包含CD3-ζ的信号传导域和CD28的信号传导域。在另一个实施方案中，细胞质结构域包含CD3-ζ的信号传导域和4-1BB的信号传导域。在又一个实施方案中，细胞质结构域包含CD3-ζ的信号传导域以及CD28和4-1BB的信号传导域。
在一个实施方案中，本文所述的CAR中的细胞质结构域包含4-1BB的信号传导域和CD3-ζ的信号传导域，其中4-1BB的信号传导域包含与SEQ ID NO:22的多肽序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列，并且CD3-ζ的信号传导域包含与SEQ ID NO:26的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，本文所述的CAR中的细胞质结构域被设计为包含CD28的信号传导域和CD3-ζ的信号传导域，其中CD28的信号传导域包含与SEQ ID NO:23的多肽序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列，并且CD3-ζ的信号传导域包含与SEQ ID NO:26的多肽序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，本文所述的CAR中的细胞质结构域包含4-1BB的信号传导域和CD3-ζ的信号传导域，其中4-1BB的信号传导域包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，并且CD3-ζ的信号传导域包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
其他遗传元件
尽管细胞疗法对于人类疾病的治疗具有很大的前景，但细胞本身或其转基因产物带来的显著毒性阻碍了临床研究。在本文所述的实施方案中，可以消除已经输注到哺乳动物受试者例如人中的包含本文所述CAR的免疫效应细胞，以便调节这类免疫效应细胞的效果，如果它们的使用会产生毒性的话。因此，在某些实施方案中，除了本文所述的治疗性MUC16特异性嵌合抗原受体外，还将第二基因引入本文所述的工程化免疫效应细胞中。第二基因实际上是“杀伤开关”，其允许消耗含有MUC16 CAR或MUC16 CAR/mbIL-15的细胞。在某些实施方案中，“杀伤开关”是包含HER1多肽或CD20多肽的HER1标签或CD20标签，所述多肽至少包含HER1或CD20的抗体结合表位或其功能片段，和可选的信号多肽序列或其片段。
在某些实施方案中，第二基因是HER1标签，其为表皮生长因子受体(HER1)或其片段或变体。在实施方案中，第二基因是HER1标签，其为截短的人表皮生长因子受体1(例如HER1t或HER1t1)。在一些情况下，第二基因是截短的人表皮生长因子受体1的变体。在实施方案中，HER1、HER1t和HER1t1中的至少一种通过允许通过施用FDA批准的西妥昔单抗或识别HER1、HER1t和/或HER1t1的任何抗体来消耗输注的CAR-T细胞而提供安全性机制。在实施方案中，HER1t基因包含与SEQ ID NO:65的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t1基因包含与SEQ ID NO:66的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。截短的HER1序列，例如HER1t和HER1t1，消除了EGFR配体结合、EGFR的同源和异源二聚化以及EGFR介导的信号传导的可能性，同时保持西妥昔单抗与受体完整结合(Ferguson,K.,2008.A structure-based view of Epidermal GrowthFactor Receptor regulation.Annu Rev Biophys,Volume 37,pp.353-373)。
在进一步的实施方案中，除了本发明的治疗性MUC16特异性嵌合抗原受体外，引入的第二基因还有CD20标签。在一些情况下，该CD20标签是全长CD20多肽或截短的CD20多肽(CD20t-1)。在一些情况下，该CD20标签，例如CD20或CD20t-1，还通过允许通过施用FDA批准的利妥昔单抗疗法消耗输注的CAR-T细胞而提供安全性机制。在某些实施方案中，该CD20标签具有与SEQ ID NO:36的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，该CD20标签是CD20t-1标签，并且具有与SEQ ID NO:68的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，该CD20标签由CD20基因编码，该CD20基因包含与SEQ ID NO:160的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，该CD20标签由CD20t-1基因编码，该CD20t-1基因包含与SEQ ID NO:160的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在实施方案中，包含本文所述CAR的CAR载体进一步包含全长CD20标签，后者包含与SEQ ID NO:159的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。
在实施方案中，编码杀伤标签如HER1t、HER1t-1、CD20或CD20t-1标签的基因通过采用自切割肽，例如但不限于Thosea asigna病毒(T2A)肽，与MUC16 CAR在3'端符合读框地遗传融合。在实施方案中，该T2A肽具有与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，将杀伤标签基因克隆到慢病毒质粒骨架中，与MUC16 CAR基因符合读框。在其他实施方案中，将杀伤标签克隆到单独的慢病毒载体中。在其他实施方案中，将这两种基因都克隆到Sleeping Beauty转座子载体中。在另外其他的实施方案中，将杀伤标签如HER1t、HER1t-1、CD20或CD20t-1克隆到单独的Sleeping Beauty转座子载体中。在某些实施方案中，该杀伤标签具有信号肽，例如GM-CSFRa信号肽，其中该GM-CSFRa信号肽与SEQID NO:58的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在某些实施方案中，该信号肽是IgK，其具有与SEQ ID NO:59的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些情况下，该信号肽可选自IgE和CD8α变体及其片段。
图1和图2显示了编码本文所述的CAR和杀伤标签的示例性基因表达盒。
示例性CAR开放阅读框
表1中是本文所述方法和组合物所涵盖的示例性CAR和人MUC16受体开放阅读框：
表1.
Figure BDA0002934516290000371
Figure BDA0002934516290000381
在实施方案中，本文提供了一种分离的编码CAR的核酸，其中该CAR包含与SEQ IDNO:3-4或SEQ ID NO:5-6的氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在表1中列出的具有“MUC16-2 scFv”的每个实施方案中，CAR抗原结合部分是MMUC16-2 scFv，其包含与SEQ ID NO:3-4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在实施方案中，MUC16-3 scFv具有与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的GM-CSFRa信号肽。
在表1中带有“CD8a”的每个实施方案中，CAR的跨膜区包含CD8α跨膜域，后者包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，并且茎结构域是CD8a，后者包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在表1中带有“CD28m”的每个实施方案中，CAR的胞内域包含CD28，后者具有与SEQID NO:21的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在表1中带有“T2A”的每个实施方案中，CAR ORF包含自切割Thosea asigna病毒(T2A)肽，其允许从单个载体产生多个基因产物。在实施方案中，该T2A肽具有与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在表1中带有“HER1t”的实施方案中，CAR ORF包含截短的人表皮生长因子受体1(HER1t)，其通过允许通过施用FDA批准的西妥昔单抗疗法消耗输注的CAR-T细胞而提供安全性机制。如本文所述的HER1t基因可包含与SEQ ID NO:65氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。除非在表1中另有说明，否则HER1t标签具有GM-CSFRa信号肽(“GM-CSFRsp”)(SEQ ID NO:58)。在某些实施方案中，HER1t可被另一种标签例如HER1t-1取代。如本文所述的HER1t-1基因可包含与SEQ ID NO:66氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在表1中带有“IgKsp”的实施方案中，信号肽是IgK，其具有与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在表1中带有“4-1BB”的实施方案中，CAR ORF包含共刺激分子，后者具有与SEQ IDNO:22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。
在表1中带有“FL CD20”的实施方案中，CAR ORF包含全长CD20标签，后者具有与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。CD20通过允许通过施用FDA批准的利妥昔单抗疗法消耗输注的CAR-T细胞而提供安全性机制。在其他实施方案中，FL CD20可被CD20t-1取代，后者包含与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。
在表1中的某些实施方案中，CAR ORF可以在用于基因转录的诱导型启动子的控制下。在一个方面，诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况下，诱导型启动子可以是小分子配体诱导型基于双多肽蜕皮素受体的基因开关，如
Figure BDA0002934516290000401
基因开关。在一些实施方案中，可以如图1-2所示配置CAR ORF和基因开关组件。
细胞因子
在一些实施方案中，将本文所述的CAR与一种或多种另外的治疗剂一起施用于受试者，所述另外的治疗剂包括但不限于细胞因子。在一些情况下，该细胞因子包括至少一种趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子或其变体或组合。在一些情况下，该细胞因子是白介素。在一些情况下，该白介素是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33及其功能变体和片段中的至少一种。在一些实施方案中，该细胞因子可以是膜结合的或分泌的。在实施方案中，该细胞因子是可溶性IL-15、可溶性IL-15/IL-15Rα复合物(例如，ALT-803)。在某些情况下，该白介素可包含膜结合的IL-15(mbIL-15)或IL-15与IL-15Rα的融合体。在一些实施方案中，mbIL-15是膜结合的嵌合IL-15，其可以与本文所述的经修饰的免疫效应细胞共表达。在一些实施方案中，该mbIL-15包含与全长IL-15Rα、其功能片段或变体符合读框地融合的全长IL-15(例如，天然IL-15多肽)或其片段或变体。在一些情况下，该IL-15通过连接体与IL-15Rα间接连接。在一些情况下，该mbIL-15如Hurton等人,“TetheredIL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset intumor-specific T cells,”PNAS 2016所述。在一些情况下，该细胞因子与CAR在相同的免疫效应细胞中表达。
在进一步的实施方案中，表达本文所述的CAR的免疫效应细胞表达膜结合的IL-15(“mIL-15或mbIL-15”)。在本发明的方面，该mbIL-15包含IL-15与IL-15Rα之间的融合蛋白。在进一步的实施方案中，该mbIL-15包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些情况下，CAR和细胞因子在单独的载体中表达。在特定情况下，所述载体可以是慢病毒载体、逆转录病毒载体或Sleeping Beauty转座子。
在一些实施方案中，mbIL-15与细胞标签如本文所述的HER1t、HER-1t-1、CD20t-1或CD20一起表达。mbIL-15可以与HER1t、HER-1t-1、CD20t-1或CD20符合读框地表达。
在一些实施方案中，mbIL-15可以在用于基因转录的诱导型启动子的控制下。在一个方面，诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况下，诱导型启动子可以是小分子配体诱导型基于双多肽蜕皮素受体的基因开关，如
Figure BDA0002934516290000411
基因开关。
在另一方面，白介素可包括IL-12。在一些实施方案中，该IL-12是单链IL-12(scIL-12)、蛋白酶敏感的IL-12、去稳定的IL-12、膜结合的IL-12、嵌入型IL-12。在一些情况下，IL-12变体如WO2015/095249、WO2016/048903、WO2017/062953中描述，其全部通过引用并入本文。
在一些实施方案中，以上描述的细胞因子可以在用于基因转录的诱导型启动子的控制下。在一个方面，诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况下，诱导型启动子可以是小分子配体诱导型基于双多肽蜕皮素受体的基因开关，如
Figure BDA0002934516290000412
基因开关。
基因开关
本文提供了基因开关多肽，编码配体诱导型基因开关多肽的多核苷酸，以及包含这些多肽和/或多核苷酸的方法和系统。术语“基因开关”是指与启动子关联的应答元件例如与基于蜕皮素受体(EcR)的系统的组合，其在一种或多种配体的存在下，调节并入了应答元件和启动子的基因的表达。紧密调节的诱导型基因表达系统或基因开关可用于各种应用，如基因疗法、细胞中的大规模蛋白质生产、基于细胞的高通量筛选试验、功能基因组学以及转基因植物和动物中性状的调节。这类诱导型基因表达系统可包括配体诱导型异源基因表达系统。
早期形式的基于EcR的基因开关使用黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)EcR(DmEcR)和小鼠(Mus musculus)RXR(MmRXR)多肽，并且显示这些受体在类固醇、百日青蜕皮酮A的存在下在哺乳动物细胞系和转基因小鼠中反式激活报道基因(Christopherson等人,1992；No等人,1996)。后来，Suhr等人,1998表明非甾类蜕皮素激动剂虫酰肼在不存在外源异二聚体配偶体的情况下通过家蚕(Bombyx mori)EcR(BmEcR)在哺乳动物细胞中诱导报道基因的高水平反式激活。
国际专利申请PCT/US97/05330(WO 97/38117)和PCT/US99/08381(WO99/58155)公开了调节外源基因表达的方法，其中包含外源基因和蜕皮素应答元件的DNA构建体被包含蜕皮素受体的第二DNA构建体激活，该蜕皮素受体在其配体的存在下，任选地在能够充当沉默配偶体的受体的存在下，与蜕皮素应答元件结合以诱导基因表达。在该实例中，蜕皮素受体是从黑腹果蝇中分离的。通常，此类系统需要存在沉默配偶体，优选类视黄醇X受体(RXR)，以提供最佳激活。在哺乳动物细胞中，昆虫蜕皮素受体(EcR)能够与哺乳动物类视黄醇X受体(RXR)异二聚化，从而用于以配体依赖性方式调节靶基因或异源基因的表达。国际专利申请PCT/US98/14215(WO 99/02683)披露，从蚕蛾家蚕中分离的蜕皮素受体在哺乳动物系统中是功能性的，不需要外源二聚体配偶体。
美国专利6,265,173披露，类固醇/甲状腺超家族受体的各个成员可以与黑腹果蝇超螺旋受体(USP)或其至少包含USP二聚化结构域的片段相组合，以用于基因表达系统。美国专利5,880,333公开了在植物中使用的黑腹果蝇EcR和超螺旋(USP)异二聚体系统，其中反式激活域和DNA结合域位于两个不同的杂合蛋白上。在这些情况中的每一种中，反式激活域和DNA结合域(如国际专利申请PCT/US98/14215中的天然EcR或国际专利申请PCT/US97/05330中的修饰的EcR)并入单个分子中，并且其他异二聚体配偶体(USP或RXR)以其天然状态使用。
国际专利申请PCT/US01/0905公开了基于蜕皮素受体的诱导型基因表达系统，其中反式激活域和DNA结合域通过将它们置于两个不同的蛋白质上而彼此分离，导致在不存在配体的情况下背景活性大大降低，而在配体的存在下，活性比背景显著增加。与申请PCT/US97/05330和PCT/US98/14215中公开的两种系统相比，这种双杂交系统是显著改进的诱导型基因表达调节系统。据认为，这种双杂交系统利用了一对相互作用蛋白质的以下能力：它们使转录激活域相对于DNA结合域处于更有利的位置，使得当DNA结合域与基因上的DNA结合位点结合时，反式激活域更有效地激活启动子(参见，例如，美国专利5,283,173)。这种双杂交基因表达系统包含两个基因表达盒；第一个编码与核受体多肽融合的DNA结合域，第二个编码与不同的核受体多肽融合的反式激活域。在配体的存在下，认为诱导了构象变化，这促进第一多肽与第二多肽的相互作用，从而导致DNA结合域与反式激活域的二聚化。由于DNA结合域和反式激活域位于两个不同的分子上，因此在不存在配体的情况下，背景活性大大降低。
与甾类配体(例如，百日青蜕皮酮A(“PonA”)或幕黎甾酮A(“MurA”)相比，所述双杂交系统的某些修饰还可以提供对非甾类配体(例如，二酰基肼)的改善的敏感性。也就是说，与类固醇相比，非甾类配体在较低的配体浓度下提供较高的基因转录活性。此外，所述双杂交系统避免了由于当使用未修饰的RXR作为开关配偶体时可能发生的RXR过表达而导致的一些副作用。在优选的双杂交系统中，消除了EcR或RXR的天然DNA结合域和反式激活域，因此，这些杂合分子与细胞中存在的其他类固醇激素受体相互作用的机会较少，从而导致副作用降低。
蜕皮素受体(EcR)是核受体超家族的成员，并且被分类为亚家族1，H组(在本文中称为“H组核受体”)。每组的成员在E(配体结合)结构域中具有40-60％的氨基酸同一性(Laudet等人,A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily,1999；Cell 97:161-163)。除蜕皮素受体外，该核受体亚家族1，H组的其他成员还包括：遍在受体(UR)、孤儿受体1(OR-1)、类固醇激素核受体1(NER-1)、RXR相互作用蛋白-15(RIP-15)、肝x受体β(LXRβ)、类固醇激素受体样蛋白(RLD-1)、肝x受体(LXR)、肝x受体(LXRα)、类法尼醇x受体(FXR)、受体相互作用蛋白质14(RIP-14)和法尼醇受体(HRR-1)。
在一些情况下，诱导型启动子(“IP”)可以是小分子配体诱导型基于双多肽蜕皮素受体的基因开关，如Intrexon Corporation的
Figure BDA0002934516290000441
基因开关。在一些情况下，基因开关可以选自基于蜕皮素的受体组分，如在但不限于以下所述的任何系统中所描述的：PCT/US2001/009050(WO 2001/070816)；美国专利7,091,038；7,776,587；7,807,417；8,202,718；PCT/US2001/030608(WO 2002/029075)；美国专利8,105,825；8,168,426；PCT/1J52002/005235(WO 2002/066613)；美国申请10/468,200(美国公开20120167239)；PCT/US2002/005706(WO 2002/066614)；美国专利7,531,326；8,236,556；8,598,409；PCT/U52002/005090(WO 2002/066612)；美国专利8,715,959(美国公开20060100416)；PCT/US2002/005234(WO 2003/027266)；美国专利7,601,508；7,829,676；7,919,269；8,030,067；PCT/U52002/005708(WO 2002/066615)；美国申请10/468,192(美国公开20110212528)；PCT/US2002/005026(WO 2003/027289)；美国专利7,563,879；8,021,878；8,497,093；PCT/US2005/015089(WO 2005/108617)；美国专利7,935,510；8,076,454；PCT/U52008/011270(WO 2009/045370)；美国申请12/241,018(美国公开20090136465)；PCT/US2008/011563(WO 2009/048560)；美国申请12/247,738(美国公开20090123441)；PCT/US2009/005510(WO 2010/042189)；美国申请13/123,129(美国公开20110268766)；PCT/US2011/029682(WO 2011/119773)；美国申请13/636,473(美国公开20130195800)；PCT/US2012/027515(WO 2012/122025)；和美国专利9,402,919；其中每一个均通过引用整体并入。
提供了用于调节宿主细胞中的CAR和/或细胞因子表达的系统，其包含表达本文公开的基因开关多肽的多核苷酸。本文进一步提供了编码用于基因表达的配体诱导型控制的基因开关多肽的多核苷酸，其中所述基因开关多肽包含(a)第一基因开关多肽，其包含与核受体配体结合域融合的DNA结合域(DBD)；和(b)第二基因开关多肽，其包含与核受体配体结合域融合的反式激活域；其中第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一些实施方案中，所述连接体是可切割的或核糖体跳跃连接体序列，其选自2A、GSG-2A、GSG连接体(SEQ ID NO:85)、SGSG连接体(SEQ ID NO:86)、furinlink变体及其衍生物。在某些实施方案中，该2A连接体是p2A连接体、T2A连接体、F2A连接体或E2A连接体。
在一些实施方案中，DNA结合域(DBD)包含GAL4(GAL4 DBD)、LexA DBD、转录因子DBD、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员DBD、细菌LacZ DBD和酵母DBD中的至少一种。在一些情况下，反式激活域包含VP16反式激活域和B42酸性激活物反式激活域中的至少一种。在其他情况下，核受体配体结合域包含蜕皮素受体(EcR)、遍在受体、孤儿受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、法尼醇X受体、受体相互作用蛋白14和famesol受体中的至少一种。在一些实施方案中，核受体配体结合域衍生自SEQ ID NO:91和92的蜕皮素受体多肽序列。
在又一个实施方案中，第一基因开关多肽包含与EcR核受体配体结合域融合的GAL4 DBD，第二基因开关多肽包含与类视黄醇受体X(RXR)核受体配体结合域融合的VP16反式激活域。在一些情况下，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接，该序列选自2A、GSG-2A、GSG连接体(SEQ ID NO:85)、SGSG连接体(SEQ ID NO:86)、furinlink变体及其衍生物。
在某些实施方案中，由本文所述的多核苷酸编码的两个或更多个多肽可以被编码连接体多肽的间插序列隔开。在某些情况下，该连接体是易切割的连接体。在一些实施方案中，目的多肽被表达为通过易切割的连接体多肽连接的融合蛋白。在某些实施方案中，易切割的连接体多肽可以是以下任何一种或多种：F/T2A、T2A、p2A、2A、GSG-p2A、GSG连接体(SEQID NO:85)和furinlink变体。在某些实施方案中，该连接体多肽包含SEQ ID NO:72-86或197-199。
在一些情况下，可以使用病毒2A序列。2A元件可以比IRES更短，其具有5至100个碱基对。在一些情况下，2A序列可以在长度上具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或100个核苷酸。2A连接的基因可以在一个单开放阅读框中表达，并且“自切割”可以共翻译地发生在2A多肽的C-末端处的最后两个氨基酸GP之间，产生等量的共表达的蛋白质。
病毒2A序列可以是约20个氨基酸。在一些情况下，病毒2A序列可以含有共有基序Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:201)。共有基序序列可以共翻译地起作用。例如，可以防止在甘氨酸与脯氨酸残基之间形成正常的肽键，其可以导致核糖体跳跃和新生多肽的切割。这种效应可以产生等摩尔水平的多种基因。
2A肽可允许将多个蛋白质在单个开放阅读框中翻译成多肽，该多肽随后可通过核糖体跳跃机制(Funston,Kallioinen等人2008)“切割”成单个多肽。在一些实施方案中，2A序列可包括：F/T2A、T2A、p2A、2A、T2A、E2A、F2A和BmCPV2A、BmIFV2A及其任何组合。
在一些情况下，载体可包含IRES序列和2A连接体序列。在其他情况下，用2A肽连接的多个基因的表达可以通过2A肽之前的间隔区序列(GSG(SEQ ID NO:85))来促进。在一些情况下，构建体可以组合间隔区、连接体、衔接子、启动子或其组合。例如，构建体可以具有带有不同2A肽的间隔区(SGSG(SEQ ID NO:86)或GSG(SEQ ID NO:85))和弗林蛋白酶连接体(R-A-K-R(SEQ ID NO:81))切割位点。间隔区可以是I-Ceui。在一些情况下，可以对连接体进行工程化。例如，可以将连接体设计为包含化学特性，如疏水性。在一些情况下，至少两个连接体序列可以产生相同的蛋白质。在其他情况下，可以在载体中使用多个连接体。例如，目的基因可以被至少两个连接体隔开。
在某些实施方案中，由本文所述的多核苷酸编码的两个或更多个多肽可以被编码连接体多肽的间插序列隔开。在某些情况下，该连接体是易切割的连接体。在一些实施方案中，目的多肽被表达为通过易切割的连接体多肽连接的融合蛋白。在某些实施方案中，易切割的连接体多肽可以是以下任何一种或两种：SEQ ID NO:72-86或197-199中所述的Furinlink、fmdv、p2a、GSG-p2a和/或fp2a。
在一些实施方案中，连接体可在本文所述的多核苷酸中使用。连接体可以是柔性连接体、刚性连接体、体内可切割连接体或其任何组合。在一些情况下，连接体可以将功能域连接在一起(如在柔性和刚性连接体中)或在体内释放游离功能域，如同在体内可切割连接体中那样。
连接体可以改善生物学活性、增加表达产率和实现理想的药代动力学谱。连接体还可以包含腙、肽、二硫键或硫醚(thioesther)。
在一些情况下，本文所述的连接体序列可以包括柔性连接体。当连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时，可以应用柔性连接体。柔性连接体可以由小的非极性(例如，Gly)或极性(例如，Ser或Thr)氨基酸组成。柔性连接体可以具有主要由Gly和Ser残基(“GS”连接体)段组成的序列。柔性连接体的实例可以具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQID NO:197)的序列。通过调整拷贝数“n”，可以优化该示例性GS连接体的长度以实现功能域的适当隔离或维持必需的结构域间相互作用。除GS连接体外，其他柔性连接体也可用于重组融合蛋白。在一些情况下，柔性连接体也可以富含小氨基酸或极性氨基酸如Gly和Ser，但可以含有另外的氨基酸如Thr和Ala以维持柔性。在其他情况下，可以使用极性氨基酸如Lys和Glu来提高溶解度。
包含在本文所述连接体序列中的柔性连接体可以富含小氨基酸或极性氨基酸，如Gly和Ser，以提供良好的柔性和溶解度。当融合蛋白结构域需要特定的移动或相互作用时，柔性连接体可能是合适的选择。另外，虽然在一些情况下柔性连接体没有刚性结构，但它们可以用作惰性连接体以保持功能域之间的距离。可以调节柔性连接体的长度以允许适当折叠或实现融合蛋白的最佳生物活性。
在一些情况下，本文所述的连接体可以进一步包括刚性连接体。刚性连接体可以用来维持多肽结构域之间的固定距离。刚性连接体的实例可以是(举几个例子来说)：α-螺旋形成连接体、富含Pro的序列、(XP)n、X-Pro骨架、A(EAAAK)nA(n＝2-5)(SEQ ID NO:202)。在一些情况下，刚性连接体可以通过采用α-螺旋结构或通过包含多个Pro残基来表现出相对僵硬的结构。
在一些情况下，本文所述的连接体可以是可切割的。在其他情况下，连接体是不可切割的。不可切割的连接体可将功能域共价连接在一起，以在整个体内过程或体外过程中充当一个分子。连接体还可以是体内可切割的。可以引入可切割的连接体，以在体内释放游离的功能域。举几个例子来说，可通过还原试剂、蛋白酶的存在来切割可切割的连接体。例如，可以利用二硫键的还原来产生可切割的连接体。在二硫键连接体的情况下，通过与硫醇如谷胱甘肽的二硫键交换的切割事件可以产生切割。在其他情况下，重组融合蛋白中连接体的体内切割也可以通过蛋白酶进行，该蛋白酶可在病理条件(例如癌症或炎症)下于特定细胞或组织中体内表达或约束于某些细胞区室内。在一些情况下，可切割的连接体可允许靶向切割。例如，许多蛋白酶的特异性可以在约束区室中提供较慢的连接体切割。可切割的连接体还可以包含腙、肽、二硫键或硫醚(thioesther)。例如，腙可以赋予血清稳定性。在其他情况下，腙可以允许在酸性区室中切割。酸性区室可具有最高为7的pH。连接体还可以包含硫醚。硫醚可以是不可还原的。硫醚可以被设计用于细胞内蛋白水解降解。
在某些实施方案中，fmdv连接体多肽包含可以与SEQ ID NO:82至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些实施方案中，fmdv连接体多肽是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在某些情况下，fmdv连接体多肽可由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。在一些情况下，编码fmdv的ORF包含SEQ ID NO:173的序列或由之组成。在某些实施方案中，编码fmdv的多核苷酸与SEQ ID NO:173至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些情况下，连接体多肽可以是“p2a”连接体。在某些实施方案中，p2a多肽可包含与SEQ ID NO:75可能至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些实施方案中，p2a连接体多肽可以是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，p2a连接体多肽可由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。在某些实施方案中，编码p2a的ORF包含SEQ ID NO:167的序列或由之组成。在某些情况下，编码p2a的多核苷酸与SEQ ID NO:167可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些情况下，连接体多肽可以是“GSG-P2a”连接体。在某些实施方案中，GSG-p2a连接体多肽可包含与SEQ ID NO:76可能至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些实施方案中，GSG-p2a连接体多肽可以是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，GSG-p2a连接体多肽可由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。编码GSGp2a的ORF可包含SEQ ID NO:168的序列。在一些情况下，编码GSG-p2a的多核苷酸与SEQ IDNO:168可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
连接体多肽可以是本文提供的“fp2a”连接体。在某些实施方案中，fp2a连接体多肽可包含与SEQ ID NO:77可能至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些情况下，fp2a连接体多肽可以是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，fp2a连接体多肽可由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。在某些实施方案中，编码fp2a连接体的多核苷酸与SEQ ID NO:169可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些情况下，可以对连接体进行工程化。例如，可以将连接体设计为包含化学特性，如疏水性。在一些情况下，至少两个连接体序列可以产生相同的蛋白质。序列与SEQ IDNO:72至SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:197至SEQ ID NO:199的序列可以或可以大约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在其他情况下，可以在载体中使用多个连接体。例如，目的基因和一个或多个本文所述的基因开关多肽序列可被至少两个连接体隔开。在一些情况下，基因可被2、3、4、5、6、7、8、9个或最多10个连接体隔开。
连接体可以是工程化的连接体。设计连接体的方法可以是计算的。在一些情况下，计算方法可以包括图形技术。可以使用计算方法从源自数据库的三维肽结构文库中搜索合适的肽。例如，可以使用Brookhaven Protein Data Bank(PDB)跨越连接体的选定氨基酸之间的空间距离。
在一些实施方案中是编码包含弗林蛋白酶多肽和2A多肽的多肽构建体的多核苷酸，其中弗林蛋白酶多肽和2A多肽通过包含至少三个疏水性氨基酸的多肽连接体连接。在一些情况下，至少三个疏水性氨基酸选自由甘氨酸(Gly)(G)、丙氨酸(Ala)(A)、缬氨酸(Val)(V)、亮氨酸(Leu)(L)、异亮氨酸(Ile)(I)、脯氨酸(Pro)(P)、苯丙氨酸(Phe)(F)、甲硫氨酸(Met)(M)、色氨酸(Trp)(W)组成的列表。在一些情况下，多肽连接体还可包含一个或多个GS连接体序列，例如(GS)n(SEQ ID NO:203)、(SG)n(SEQ ID NO:204)、(GSG)n(SEQ IDNO:198)和(SGSG)n(SEQ ID NO:199)，其中n可以是零至十五的任何数字。
提供了获得多肽构建体的改进表达的方法，该方法包括：提供编码包含第一功能性多肽和第二功能性多肽的所述多肽构建体的多核苷酸，其中所述第一功能性多肽和第二功能性多肽通过连接体多肽连接，该连接体多肽包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:205)具有至少60％同一性的序列；以及在宿主细胞中表达所述多核苷酸，其中与不具有包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:205)具有至少60％同一性的序列的连接体多肽的相应多肽构建体相比，所述表达导致多肽构建体的改进表达。
在其他情况下，连接体可以是IRES。如本文所用的术语“内部核糖体进入位点(IRES)”可旨在表示内部核糖体进入位点。在包含IRES序列的载体中，第一基因可以通过具有其自身5'-UTR的帽依赖性核糖体扫描机制进行翻译，而后续基因的翻译可以通过以帽非依赖性方式直接将核糖体募集至IRES来完成。IRES序列可以允许真核核糖体结合并在不与5'加帽端结合的情况下开始翻译。IRES序列可以允许从一个转录物表达多个基因(Mountford和Smith 1995)。
示例性IRES序列可见于SEQ ID NO:192和193中。在某些情况下，编码2xRbm3 IRES的多核苷酸与SEQ ID NO:192可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在某些情况下，编码EMCV IRES的多核苷酸与SEQ ID NO:193可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中是用于调节宿主细胞中CAR和细胞因子的表达的系统，其包含含有编码第一多肽的第一多核苷酸的第一基因表达盒；包含含有编码第二多肽的第二多核苷酸的第二基因表达盒；和配体；其中第一和第二多肽包含以下一个或多个：(i)反式激活域；(ii)DNA结合域；和(iii)配体结合域；(iv)CAR；(vi)细胞因子，和/或(vii)细胞标签，使得在所述配体的存在下宿主细胞与第一基因表达盒和第二基因表达盒接触后，所述CAR和细胞因子在宿主细胞中表达。在一些情况下，该CAR是MUC16 CAR，而该细胞因子是mbIL-15。在一些情况下，MUC16 CAR、mbIL-15与一种细胞标签共表达。在一些情况下，MUC16 CAR和mbIL-15各自与细胞标签共表达。在其他情况下，MUC16CAR与细胞标签一起表达，而mbIL-15与第二细胞标签一起表达。基因表达盒的示例性构型在图1和图2中描绘。在其他情况下，该CAR是MUC16 CAR，而该细胞因子是IL-12。在一些情况下，MUC16 CAR、IL-12与一种细胞标签共表达。在一些情况下，MUC16 CAR和IL-12各自与细胞标签共表达。在其他情况下，MUC16CAR与细胞标签一起表达，而IL-12与第二细胞标签一起表达。
在一些实施方案中是用于调节宿主细胞中CAR和细胞因子的表达的系统，其包含含有编码第一多肽的第一多核苷酸的第一基因表达盒；包含含有编码第二多肽的第二多核苷酸的第二基因表达盒；和配体；其中第一多肽包含以下一个或多个：(i)反式激活域；(ii)DNA结合域；和(iii)配体结合域，并且第二多肽包含以下一个或多个；(i)CAR；(ii)细胞因子，和/或(iii)细胞标签，使得在所述配体的存在下宿主细胞与第一基因表达盒和第二基因表达盒接触后，所述CAR和/或细胞因子在宿主细胞中表达。在一些情况下，该CAR是MUC16CAR，而该细胞因子是mbIL-15。在一些情况下，MUC16 CAR和mbIL-15各自与细胞标签共表达。在其他情况下，MUC16 CAR与第一细胞标签一起表达，而mbIL-15与第二细胞标签一起表达。
用于调节宿主细胞中MUC16 CAR和细胞因子表达的系统的示例性构型在图1-2中描绘。在一些实施方案中，使用病毒或基于病毒的系统将基因表达盒引入免疫效应细胞中。如本文所述的非基于病毒的递送系统的实例包括SB11转座子系统、SB100X转座子系统、SB110转座子系统、piggyBac转座子系统。在一个实施方案中，使用一个或多个SleepingBeauty转座子将基因表达盒引入免疫效应细胞中。
图1中描绘了编码MUC16 CAR、细胞因子(如mbIL-15或IL-12)和细胞标签的组成型表达的基因表达盒的示例性实施方案。图1a-b描绘了各种构型的MUC16 CAR、mblL-15和细胞标签的示例性基因表达盒设计。在该实施方案中，使用一个Sleeping Beauty转座子将基因表达盒引入免疫效应细胞中。图1c-d描绘了基因表达盒构型，其中MUC16CAR可以在一个基因表达盒中，并且mbIL-15和细胞标签在第二基因表达盒中。在该实施方案中，使用一个或多个Sleeping Beauty转座子将基因表达盒引入免疫效应细胞中。
图2中描绘了编码MUC16 CAR、细胞因子(如mbIL-15)和/或细胞标签的诱导型表达的基因表达盒的示例性实施方案。图2a-d描绘了在诱导型启动子控制下各种构型的MUC16CAR、mblL-15和细胞标签的示例性基因表达盒设计。图2e是编码如本文所述的基因开关多肽的基因表达盒的示例性实施方案。在该实施方案中，使用一个或多个Sleeping Beauty转座子将基因表达盒引入免疫效应细胞中。
配体
在一些实施方案中，用于诱导型基因开关调节的配体可以选自但不限于以下任一种：N-[(1R)-1-(1,1-二甲基乙基)丁基]-N'-(2-乙基-3-甲氧基苯甲酰基)-3,5-二甲基苯并酰肼(也称为veledimex)、(2S,3R,5R,9R,10R,13R,14S,17R)-17-[(2S,3R)-3,6-二羟基-6-甲基庚烷-2-基]-2,3,14-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊并[a]菲-6-酮；N'-(3,5-二甲基苯甲酰基)-N'-[(3R)-2,2-二甲基-3-己烷基]-2-乙基-3-甲氧基苯并酰肼；5-甲基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸N′-(3,5-二甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸N′-(3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3,5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-甲基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸N′-(3,5-二甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸N′-(3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3,5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2,3-二氢-苯并[1,4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；2-甲氧基-烟酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3,5-二甲基-苯甲酸N-(2,2-二甲基-1-苯基-丙基)-N′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；和3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼。
在一些情况下，用于基于蜕皮素受体的诱导型基因开关调节的剂量调节的控制的配体可以选自但不限于以下任一种：蜕皮类固醇(如蜕皮素、20-羟基蜕皮酮、百日青蜕皮酮A、幕黎甾酮A等)、9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、N,N’-二酰基肼，如美国专利6,013,836、5,117,057、5,530,028和5,378,726以及美国公开申请2005/0209283和2006/0020146所公开的那些；噁二唑啉，如美国公开申请2004/0171651中所述；二苯甲酰基烷基氰基肼，如在欧洲申请461,809中所公开的那些；N-烷基-N,N’-二芳酰基肼，如在美国专利5,225,443中所公开的那些；N-酰基-N-烷基羰基肼，如在欧洲申请234,994中所公开的那些；N-芳酰基-N-烷基-N’-芳酰基肼，如美国专利4,985,461中所述的那些；氨基酮，如美国公开申请2004/0049037中所述的那些；以上每一个均通过引用并入本文，以及其他类似材料，包括3,5-二叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈巴苷、氧化固醇、22(R)羟基胆甾醇、24(S)羟基胆甾醇、25-环氧胆甾醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆甾醇-3-硫酸酯(ECHS)、7-酮基胆甾醇-3-硫酸酯、framesol、胆汁酸、1,1-二膦酸酯、保幼激素III等。可用于本公开的二酰基肼配体的实例包括RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N’-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼-)、RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)。参见，例如，序列号为12/155,111的美国专利申请和PCT申请PCT/US2008/006757，以上两者均通过引用整体并入本文。
非基于病毒的递送系统
还可以使用非基于病毒的递送系统如“Sleeping Beauty(SB)转座子系统”将编码本文所述CAR的核酸引入免疫效应细胞中，该Sleeping Beauty转座子系统是指一种合成的DNA转座子系统，用于将DNA序列引入脊椎动物的染色体中。示例性的SB转座子系统例如在美国专利第6,489,458和8,227,432中描述，并且在图3中示出。Sleeping Beauty转座子系统包含Sleeping Beauty(SB)转座酶和SB转座子。如本文所用的，Sleeping Beauty转座子系统可包含Sleeping Beauty转座酶多肽以及保持活性的衍生物、变体和/或片段，以及保持活性的Sleeping Beauty转座子多核苷酸、衍生物、变体和/或片段。在某些实施方案中，Sleeping Beauty转座酶作为mRNA提供。在一些方面，该mRNA编码SB10、SB11、SB100x或SB110转座酶。在一些方面，该mRNA包含帽和多聚-A尾。
DNA转座子以简单的剪切-粘贴方式从一个DNA位点易位到另一DNA位点。转座是一个精确的过程，其中限定的DNA片段从一个DNA分子切下并移动到相同或不同DNA分子或基因组中的另一位点。与其他Tc1/mariner型转座酶一样，SB转座酶将转座子插入接受体DNA序列中的TA二核苷酸碱基对中。插入位点可以在相同DNA分子中的其他地方，或在另一DNA分子(或染色体)中。在哺乳动物基因组(包括人基因组)中大约有2亿个TA位点。TA插入位点在转座子整合过程中重复。这种TA序列的重复是转座的标志，并用于确定一些实验中的机理。转座酶可以在转座子内编码，或者转座酶可以由另一来源提供，在该情况下，转座子成为非自主元件。非自主转座子作为遗传工具最有用，因为在插入后它们不能独立地继续切除和重新插入。SB转座子被设想用作非病毒载体，用于将基因引入脊椎动物的基因组中和基因疗法。简言之，Sleeping Beauty(SB)系统(Hackett等人,Mol Ther 18:674-83,(2010))适用于对免疫效应细胞进行遗传修饰(Cooper等人,Blood 105:1622-31,(2005))。在一个实施方案中，这包括两个步骤：(i)表达SB转座子(即，嵌合抗原受体(CAR)，用于重定向T细胞特异性(Jin等人,Gene Ther 18:849-56,(2011)；Kebriaei等人,Hum Gene Ther23:444-50,(2012))和SB转座酶的DNA质粒的电转移，以及(ii)稳定表达整合体的T细胞在来源于K562细胞系的设计者人工抗原呈递细胞(AaPC)(也称为AaPC(活化和扩增细胞))上的增殖和扩充。在另一个实施方案中，取消了第二步(ii)，并且将经遗传修饰的T细胞冷冻保存或立即输注到患者体内。
在一个实施方案中，SB转座子系统于例如Hudecek等人,Critical Reviews inBiochemistry and Molecular Biology,52:4,355-380(2017)、Singh等人,Cancer Res(8):68(2008).2008年4月15日和Maiti等人,J Immunother.36(2):112–123(2013)中描述，其通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，MUC16 CAR和mbIL-15在转座子DNA质粒载体中编码，而SB转座酶在单独的载体中编码。在某些实施方案中，本文所述的MUC16 CAR在转座子DNA质粒载体中编码，mb-IL15在第二转座子DNA质粒载体中编码，而SB转座酶在第三DNA质粒载体中编码。在一些实施方案中，CAR与杀伤标签，例如HER1t、HER1t1、CD20或CD20t-1一起编码。在一些实施方案中，mbIL-15与杀伤标签，例如HER1t、HER1t1、CD20或CD20t-1一起编码。
在实施方案中，MUC16 CAR可以与mbIL-15和来自转座子DNA质粒载体的细胞标签共表达。在进一步的实施方案中，MUC16 CAR可以在诱导型启动子的控制下。在另一个实施方案中，mbIL-15可以在诱导型启动子的控制下。在一个方面，诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况下，诱导型启动子可以是小分子配体诱导型基于双多肽蜕皮素受体的基因开关，如
Figure BDA0002934516290000571
基因开关。在某些实施方案中，可以在一个、两个或多个转座子中配置MUC16 CAR、mbIL-15和杀伤标签。图2描述了在诱导型启动子控制下的MUC16 CAR或mbIL15的示例性构型。
在实施方案中，使用SB11转座子系统、SB100X转座子系统、SB110转座子系统，piggyBac转座子系统(参见，例如，美国专利9,228,180，Wilson等人,“PiggyBacTransposon-mediated Gene Transfer in Human Cells,”Molecular Therapy 15:139-145(2007)，其通过引用整体并入本文)和/或piggyBat转座子系统(参见，例如，Mitra等人,“Functional characterization of piggyBat from the bat Myotis lucifugusunveils an active mammalian DNA transposon,”Proc.Natl.Acad.Sci USA 110:234-239(2013))将MUC16 CAR和其他遗传元件递送至细胞。另外的转座酶和转座子系统在美国专利7,148,203、8,227,432、美国专利公开2011/0117072、Mates等人,Nat Genet,41(6):753-61(2009).doi:10.1038/ng.343.2009年5月3日电子发表,Gene Ther.,18(9):849-56(2011).doi:10.1038/gt.2011.40.2011年3月31日电子发表以及Ivics等人,Cell.91(4):501-10,(1997)中提供，其各自通过引用整体并入本文。
在其他实施方案中，可通过重组酶和整合表达载体将MUC16CAR和其他遗传元件，如细胞因子、mbIL-15和/或HER1t/HER1t1/CD20/CD20t-1标签整合到免疫效应细胞的DNA中。这类载体可以随机整合到宿主细胞的DNA中，或者可以包括重组位点以实现表达载体与宿主细胞染色体之间的特定重组。此类整合表达载体可利用宿主细胞染色体的内源表达控制序列来实现所需蛋白质的表达。在一些实施方案中，通过在供体多核苷酸上存在与整合位点侧翼序列同源的序列来促进靶向整合。例如，使用本文所述的供体多核苷酸的靶向整合可以按照常规转染技术实现，例如，用来通过同源重组产生基因敲除或敲入的技术。在其他实施方案中，通过在供体多核苷酸上存在与整合位点侧翼序列同源的序列，以及通过在位点特异性重组酶的存在下使细胞与供体多核苷酸接触，来促进靶向整合。所谓位点特异性重组酶，或者简称为重组酶，意指催化其相容的重组位点之间的保守位点特异性重组的多肽。如本文所用的，位点特异性重组酶包括天然多肽以及保留活性的衍生物、变体和/或片段，以及编码保留活性的重组酶的天然多核苷酸、衍生物、变体和/或片段。
可以在引入靶向载体之前、同时或之后将重组酶引入靶细胞中。重组酶可以作为蛋白质直接引入细胞中，例如，使用脂质体、包被的颗粒或显微注射。或者，可以使用合适的表达载体将编码重组酶的多核苷酸(DNA或信使RNA)引入细胞中。上述靶向载体组分可用于构建含有编码感兴趣的重组酶的序列的表达盒。然而，重组酶的表达可以以其他方式调节，例如，通过将重组酶的表达置于可调节启动子(即，可以选择性地诱导或抑制其表达的启动子)的控制下。
重组酶可以来自融合酶或解离酶家族。整合酶重组酶家族具有超过一百个成员，并且包括例如FLP、Cre和λ整合酶。整合酶家族，也称为酪氨酸家族或λ整合酶家族，使用催化酪氨酸的羟基对DNA的磷酸二酯键进行亲核攻击。通常，酪氨酸家族的成员最初在DNA上形成切口，后来形成双链断裂。酪氨酸家族整合酶的实例包括Cre、FLP、SSV1和lambda(λ)整合酶。在解离酶家族(也称为丝氨酸重组酶家族)中，保守的丝氨酸残基与DNA靶位点形成共价连接(Grindley,等人,(2006)Ann Rev Biochem 16:16)。
在一个实施方案中，重组酶是分离的多核苷酸序列，其包含编码重组酶的核酸序列，该重组酶选自SPβc2重组酶、SF370.1重组酶、Bxb1重组酶、A118重组酶和φRv1重组酶。丝氨酸重组酶的实例在美国专利9,034,652中详细描述，其通过引用整体并入本文。
用于实施本发明的重组酶可以如前所述重组产生或纯化。具有所需重组酶活性的多肽可通过蛋白质硫酸铵沉淀、纯化领域中已知的方法纯化至所需纯度水平，包括但不限于大小分级分离、亲和色谱法、HPLC、离子交换色谱法、肝素琼脂糖亲和色谱法(例如，Thorpe&Smith,Proc.Nat.Acad.Sci.95:5505-5510,1998)。
在一个实施方案中，可以将重组酶引入真核细胞中，该真核细胞含有通过任何合适的方法需要重组的重组附着位点。例如通过显微注射或其他方法将功能性蛋白质引入细胞中的方法是本领域熟知的。纯化的重组酶蛋白质的引入确保了蛋白质及其功能的短暂存在，这通常是优选的实施方案。或者，编码重组酶的基因可以被包括在用于转化细胞的表达载体中，其中编码重组酶的多核苷酸与介导多核苷酸在真核细胞中表达的启动子可操作地连接。还可以通过编码重组酶多肽的信使RNA将该重组酶多肽引入真核细胞中。通常优选重组酶仅存在将核酸片段插入被修饰的基因组中所必需的时间。因此，预计缺乏与大多数表达载体相关的持久性并非不利的。可以在引入外源目的多核苷酸之前、之后或同时将重组酶基因引入细胞中。在一个实施方案中，重组酶基因存在于携带待插入的多核苷酸的载体内；重组酶基因甚至可以被包括在多核苷酸内。
在一个实施方案中，用于位点特异性重组的方法包括提供第一重组位点和第二重组位点；使第一和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，导致重组位点之间的重组，其中该重组酶多肽可介导第一与第二重组位点之间的重组，第一重组位点是attP或attB，第二重组位点是attB或attP，并且该重组酶选自单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)噬菌体重组酶、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attB时，第二重组附着位点是attP，并且当第一重组附着位点是attP时，第二重组附着位点是attB。
进一步的实施方案提供将位点特异性重组酶引入其基因组将被修饰的细胞中。一个实施方案涉及用于在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，其包括提供包含第一重组附着位点和第二重组附着位点的真核细胞；使第一和第二重组附着位点与原核重组酶多肽接触，导致在重组附着位点之间的重组，其中该重组酶多肽可介导在第一与第二重组附着位点之间的重组，第一重组附着位点是噬菌体基因组重组附着位点(attP)或细菌基因组重组附着位点(attB)，第二重组附着位点是attB或attP，并且该重组酶选自单核细胞增生李斯特菌噬菌体重组酶、酿脓链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attB时，第二重组附着位点是attP，并且当第一重组附着位点是attP时，第二重组附着位点是attB。在一个实施方案中，该重组酶选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SPβc2重组酶、φRv1重组酶和Bxb1重组酶。在一个实施方案中，该重组导致整合。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞中的方法是哪一种，为了确认宿主细胞中存在重组DNA序列，可以进行多种试验。这类试验包括，例如，本领域技术人员公知的“分子生物学”试验，如Southern和Northern印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”试验，如检测是否存在特定肽，例如通过免疫学手段(ELISA和Western印迹法)或通过本文所述的用于鉴别落入本发明范围内的肽或蛋白质或核酸的试验。
基于病毒的递送系统
本文还提供了基于病毒的递送系统，其中插入了本发明的核酸。代表性的病毒表达载体包括但不限于基于腺病毒的载体(例如，可从Crucell,Inc.(Leiden,TheNetherlands)获得的基于腺病毒的Per.C6系统)、基于慢病毒的载体(例如，来自LifeTechnologies(Carlsbad,Calif.)的基于慢病毒的pLPI)和逆转录病毒载体(例如，pFB-ERV加pCFB-EGSH)、疱疹病毒。在一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为其允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体比衍生自致癌逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有额外优势，因为其可以转导非增殖细胞如肝细胞。慢病毒载体还具有低免疫原性的额外优势。通常来说，并且在实施方案中，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利6,326,193)。
在实施方案中，提供了一种慢病毒载体，其包含骨架和编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中该CAR包含(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；(e)CD3ζ信号传导域。任选地，该载体进一步包含编码截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t1)、CD20t-1或全长CD20的核酸。
在一些情况下，提供了一种包含骨架和核酸序列的载体，该核酸序列编码(1)截短的表皮生长因子受体，例如HER1t或HERt-1或其功能变体；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；和(e)CD3ζ信号传导域。
在一些情况下，提供了一种包含骨架和核酸序列的载体，该核酸序列编码(1)全长CD20、截短的CD20或其功能变体，和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；和(e)CD3ζ信号传导域。
在实施方案中，将编码MUC16特异性CAR的核酸克隆到包含慢病毒骨架组分的载体中。示例性的骨架组分包括但不限于pFUGW和pSMPUW。pFUGW慢病毒载体骨架是一种自灭活(SIN)慢病毒载体骨架，并且去除了不必要的HIV-1病毒序列，从而导致发生瘤形成、有害突变和感染性颗粒再生的可能性降低。在实施方案中，编码MUC16 CAR的载体还在单个构建体中编码mbIL-15。在实施方案中，将MUC16 CAR和mbIL-15编码在两个单独的慢病毒载体上。在一些实施方案中，mbIL-15与截短的表皮生长因子受体标签一起表达。在实施方案中，MUC16 CAR可以与mbIL-15和来自单个慢病毒载体的细胞标签共表达。在进一步的实施方案中，MUC16 CAR可以在诱导型启动子的控制下。在另一个实施方案中，mbIL-15可以在诱导型启动子的控制下。在一个方面，诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况下，诱导型启动子可以是小分子配体诱导型基于双多肽蜕皮素受体的基因开关，如
Figure BDA0002934516290000611
基因开关。
在一个实施方案中，本文所述的MUC16 CAR包含抗MUC16 scFv、人CD8铰链和跨膜域，以及人4-1BB和CD3ζ信号传导域。在另一个实施方案中，本发明的MUC16 CAR包含抗MUC16 scFv、人CD8铰链和跨膜域，人4-1BB和CD3ζ信号传导域，和任选地，截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)标签。其他合适的载体包括整合表达载体，其可以随机整合到宿主细胞的DNA中，或者可以包括重组位点以实现表达载体与宿主细胞染色体之间的特异性重组。此类整合表达载体可利用宿主细胞染色体的内源表达控制序列来实现所需蛋白质的表达。以位点特异性方式整合的载体的实例包括，例如，来自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)的flp-in系统的组分(例如，pcDNATM5/FRT)，或例如可见于来自Stratagene(LaJolla,Calif.)的pExchange-6核心载体中的cre-lox系统。随机整合到宿主细胞染色体中的载体的实例包括，例如，来自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)的pcDNA3.1(当在没有T-抗原的情况下引入时)和来自Promega(Madison,Wis.)的pCI或pFN10A(ACT)FLEXITM。额外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。尽管最近已示出许多启动子也包含在起始位点下游的功能元件，但通常这些启动子元件位于起始位点上游30-110bp的区域。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至相隔50bp。似乎单个元件可以协同或独立地起作用以激活转录，这取决于启动子。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。
合适的启动子的另一实例是人延伸生长因子1α1(hEF1a1)。在实施方案中，包含本文所述的CAR的载体构建体包含hEF1a1功能变体。
然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应局限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被考虑为先前描述的本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，其能够开启可操作地连接的多核苷酸序列的表达(当需要这样的表达时)，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。在一个方面，诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况下，诱导型启动子可以是小分子配体诱导型基于双多肽蜕皮素受体的基因开关，如
Figure BDA0002934516290000631
基因开关。
为了评估本文所述的CAR或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可含有选择标记基因或报道基因或两者，以便于从试图通过病毒载体或非病毒载体来转染或感染的细胞群体中鉴别和选择表达细胞。在其他方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择标记和报道基因都可以侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素抗性基因如新霉素抗性基因(neo)和氨苄青霉素抗性基因等。在一些实施方案中，截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)标签可用作选择标记基因。
报道基因可用于鉴定潜在转染的细胞和评价调节序列的功能。通常，报道基因是不存在于接受体生物体或组织中且不由其表达的基因，其编码多肽，该多肽的表达通过一些易于检测的性质(例如酶活性)表现。在将DNA引入接受体细胞后的合适时间测定报道基因的表达。合适的报道基因包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,FEBS Letters 479:79-82(2000))。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或商购获得。通常，示出报道基因最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴别为启动子。这样的启动子区可以与报道基因连接，并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在实施方案中，本文所述的病毒载体可包含驱动转基因表达的hEF1a1启动子、增强转录的牛生长激素多聚A序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)以及来源于pFUGW质粒的LTR序列。
将基因引入细胞中以及使基因在细胞中表达的方法是公知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，如哺乳动物细胞、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物方式将表达载体转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞例如免疫效应细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见，例如，Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001))。在实施方案中，用于将多核苷酸引入宿主细胞的方法是磷酸钙转染或聚乙烯亚胺(PEI)转染。在一些实施方案中，用于将多核苷酸引入宿主细胞中的方法是电穿孔。
用于将目的多核苷酸引入宿主细胞例如免疫效应细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入哺乳动物细胞(例如人细胞)中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。
在利用病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。脂质制剂可以用于将核酸引入宿主细胞中(在体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子附接于脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于在溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“折叠”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪小液滴，以及含有长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,Mo.获得；双十六烷基磷酸酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)获得；胆固醇(“Chol”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。使用氯仿作为唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其包括通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征可以在于具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，多层脂质体自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,Glycobiology 5:505-10(1991))。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。
包含MUC16 CAR和载体的细胞
本文提供了表达本文所述的CAR的工程细胞。在某些实施方案中，本文所述的工程细胞是免疫效应细胞。在实施方案中，本文提供了一种免疫效应细胞，其包含含有骨架和核酸序列的载体，该核酸序列编码(1)截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t1)，和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；和(e)CD3ζ信号传导域。
在某些实施方案中是包含嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞，其中该CAR包含(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；(e)CD3ζ信号传导域；和(f)截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t1)。
在实施方案中，本文提供了一种免疫效应细胞，其包含(1)用作杀伤开关、选择标记、生物标志物或其组合的细胞标签，和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；和(e)CD3ζ信号传导域。在实施方案中，该细胞标签是HER1t、HER1t1、CD20t-1或CD20。
在实施方案中，免疫效应细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。在实施方案中，当MUC16抗原结合域与MUC16结合时，该细胞表现出抗肿瘤活性。
经修饰的免疫效应细胞
提供了经修饰以表达一种或多种本文所述的异源基因或多肽的免疫效应细胞。提供了经修饰以表达本文所述的MUC16 CAR以及HER1t、HER1t1、CD20和CD20t-1标签中的至少一种的免疫效应细胞。在一些情况下，提供了经修饰以表达MUC16 CAR、mbIL-15以及本文公开的HER1t、HER1t1、CD20和CD20t-1标签中的至少一种的免疫效应细胞。
如本文所用的“T细胞”或“T淋巴细胞”是在细胞介导的免疫中起重要作用的一种类型的淋巴细胞。它们与其他淋巴细胞如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的区别可在于在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，经修饰的免疫效应细胞是包含T细胞和/或自然杀伤细胞的经修饰的免疫细胞。T细胞或T淋巴细胞是参与细胞介导的免疫的白细胞亚型。示例性T细胞包括T辅助细胞、细胞毒性T细胞、TH17细胞、记忆性干细胞样T细胞(TSCM)、幼稚T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、调节性T细胞或自然杀伤T细胞。
T辅助细胞(TH细胞)在免疫过程中协助其他白细胞，该免疫过程包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化。在一些情况下，由于CD4糖蛋白在细胞表面上的表达，TH细胞被称为CD4+ T细胞。辅助性T细胞在通过MHC II类分子呈递肽抗原时被活化，该MHC II类分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。辅助性T细胞一旦被活化，就迅速分裂并分泌出被称为细胞因子的小蛋白质，该细胞因子调节或协助主动免疫应答。这些细胞可以分化成几种亚型中的一种，包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH，这些亚型分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自APC的信号传导将T细胞引导至特定的亚型。
细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还参与移植排斥。这些细胞也被称为CD8+ T细胞，因为其在表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与MHC I类分子缔合的抗原而识别它们的靶标，该MHC I类分子存在于所有有核细胞的表面上。通过IL-10、腺苷和由调节性T细胞分泌的其他分子，CD8+细胞可以被灭活至无反应状态，从而防止自身免疫性疾病。
记忆T细胞是在感染消退后长期持续存在的抗原特异性T细胞的一个亚群。其在重新暴露于其同源抗原后迅速扩充成大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对以往感染的“记忆”。记忆T细胞包括以下亚型：干细胞记忆性T细胞(TSCM)、中枢记忆性T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞可以表达细胞表面蛋白质CD45RO、CD45RA和/或CCR7。
调节性T细胞(Treg细胞)，以前称为抑制性T细胞，在维持免疫耐受性中起作用。其主要作用是在免疫反应结束时停止T细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺中的阴性选择过程的自身反应性T细胞。
自然杀伤T细胞(NKT细胞)将先天免疫系统与适应性免疫系统联系起来。与识别由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞不同，NKT细胞识别由被称为CD1d的分子呈递的糖脂抗原。一旦被活化，这些细胞可以执行属于Th细胞和Tc细胞的功能(即，细胞因子产生和细胞溶解/细胞杀伤分子的释放)。它们还能够识别并消除一些肿瘤细胞和感染疱疹病毒的细胞。
自然杀伤(NK)细胞是先天免疫系统的一种类型的细胞毒性淋巴细胞。在一些情况下，NK细胞提供针对病毒感染和/或肿瘤形成的第一线防御。NK细胞可检测被感染细胞或癌细胞上呈递的MHC，从而触发细胞因子释放，随后诱导裂解和凋亡。NK细胞可以在不存在抗体和/或MHC的情况下进一步检测应激的细胞，从而允许快速免疫应答。
经修饰的免疫效应细胞剂量
在一些实施方案中，将一定量的经修饰的免疫效应细胞施用于有需要的受试者，并且基于功效和诱导细胞因子相关毒性的潜力来确定该量。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约102至约109个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约103至约109个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约104至约109个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约105至约109个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约105至约108个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约105至约107个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约106至约109个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约106至约108个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约107至约109个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约105至约106个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约106至约107个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约107至约108个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约108至约109个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约109个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约108个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约107个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约106个经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞的量包含约105个经修饰的免疫效应细胞/kg。
在一些实施方案中，是作为MUC16特异性CAR-T细胞的CAR-T细胞。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约102至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约103至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约104至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约105至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约105至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约105至约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约106至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约106至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约107至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约105至约106个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约106至约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约107至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约108至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约106个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约105个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约104个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约103个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，MUC16特异性CAR-T细胞的量包含约102个CAR-T细胞/kg。
免疫效应细胞来源
在某些方面，本文所述的实施方案包括制备和/或扩充抗原特异性重定向免疫效应细胞(例如，T细胞、Treg、NK细胞或NK T细胞)的方法，其包括用含有编码CAR的DNA(或RNA)构建体的表达载体转染细胞，然后任选地用饲养细胞、重组抗原或针对受体的抗体刺激细胞，以使细胞增殖。在某些方面，经工程化以表达CAR的细胞(或细胞群体)是干细胞、iPS细胞、由iPS细胞分化的T细胞、免疫效应细胞或这些细胞的前体。
免疫效应细胞的来源可包括同种异体来源和自体来源。在一些情况下，免疫效应细胞可以从干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)分化。因此，根据实施方案的用于工程化的细胞可以从脐带血、外周血、人胚胎干细胞或iPSC中分离。例如，可以将同种异体T细胞修饰成包括嵌合抗原受体(并且任选地缺乏功能性TCR)。在一些方面，免疫效应细胞是原代人T细胞，如来源于人外周血单核细胞(PBMC)的T细胞。PBMC可以从外周血中收集，或者在用G-CSF(粒细胞集落刺激因子)刺激后从骨髓收集，或从脐带血收集。在一个方面，该免疫效应细胞是全T(Pan T)细胞。在(例如，用CAR表达构建体)转染或转导后，可以立即输注细胞或者可以冷冻保存细胞。在某些方面，在转染或转导后，可以将细胞保存在可包括IL-2和/或IL-21的细胞因子浴中，直到准备输注为止。在某些方面，在转染后，细胞可以在基因转移到细胞后的约1、2、3、4、5天或更多天内作为本体群体离体增殖数天、数周或数月。在另一方面，在转染后，将转染体克隆，并将表现出存在单个整合的或附加体保持的表达盒或质粒以及嵌合抗原受体的表达的克隆离体扩充。选择用于扩充的克隆表现出特异性识别和裂解表达抗原的靶细胞的能力。可以通过用IL-2或结合共同γ链的其他细胞因子(例如IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)刺激来扩充重组T细胞。可以通过用人工抗原呈递细胞刺激来扩充重组T细胞。重组T细胞可以在人工抗原呈递细胞上扩充，或者用与T细胞表面上的CD3交联的抗体如OKT3扩充。可以使用基于磁珠的分离方法和/或荧光激活细胞分选技术进一步选择重组T细胞的亚组，并将其进一步与AaPC一起培养。在另一方面，可以冷冻保存经遗传修饰的细胞。
T细胞还可以从许多来源获得，包括骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域可获得的任何数目的T细胞系。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何技术如
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分离，从采集自受试者的血液单位获得T细胞。在实施方案中，来自个体的循环血液的细胞通过单采血液成分术获得。单采产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中，以用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代实施方案中，洗涤溶液缺少钙，并且可能缺少镁或者可能缺少许多(即便不是全部)二价阳离子。在没有钙的情况下的初始激活步骤导致放大的激活。本领域普通技术人员将会容易理解，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如根据制造商的说明使用半自动“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液，如无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其他含有或不含缓冲液的盐水溶液中。或者，可以去除单采样品中的不需要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在另一实施方案中，通过裂解红细胞并消耗单核细胞(例如，通过
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梯度离心或通过逆流离心淘洗)，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+ T细胞。在另一个实施方案中，CD14+细胞从T细胞群体中消耗。例如，在一个实施方案中，通过与抗-CD3/抗-CD28(即，3x28)缀合的珠子(如
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M-450 CD3/CD28T)一起孵育足够用于所需T细胞的阳性选择的时间段来分离T细胞。在一个实施方案中，该时间段是约30分钟。在进一步的实施方案中，该时间段的范围为30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在进一步的实施方案中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又一实施方案中，该时间段是10至24小时。在一个实施方案中，孵育时间段是24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间(如24小时)可以增加细胞产率。可以在T细胞与其他细胞类型相比较少的任何情况下，例如在从肿瘤组织或免疫受损的个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的情况下使用更长的孵育时间来分离T细胞。进一步地，使用更长的孵育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠子结合的时间，和/或通过增加或减少珠子与T细胞(如本文进一步描述的)的比值，可以在培养开始时或在该过程中的其他时间点优先选择或排除某T细胞亚群。此外，通过增加或减少珠子或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比值，可以在培养起始时或在其他所需时间点优先选择或排除某T细胞亚群。技术人员将会认识到，在本发明的背景下也可以使用多轮选择。在某些实施方案中，可能需要执行选择程序并在激活和扩充过程中使用“未选择的”细胞。也可使“未选择的”细胞经历进一步轮次的选择。
T细胞群体通过阴性选择的富集可以用针对阴性选择的细胞的特有表面标志物的抗体组合来完成。一种方法是经由负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫粘附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施方案中，T调节细胞被抗CD25缀合的珠子或其他类似的选择方法消耗。
为了通过阳性或阴性选择分离所需的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠子)的浓度。在某些实施方案中，可能需要显著降低珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、35000万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产率、细胞活化和细胞扩充增加。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能较弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)或者来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群体可能具有治疗价值并且将是需要获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+ T细胞。
在相关的实施方案中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒，如珠子)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小。这选择表达大量待与颗粒结合的所需抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一个实施方案中，使用的细胞浓度是5x106/ml。在其他实施方案中，使用的浓度可以是约1x105/ml至1x106/ml以及其间的任何整数值。
在其他实施方案中，细胞可以在2-10℃或室温下以变化的速度在旋转器上孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可在洗涤步骤后冷冻。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并在这种情况下将会是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1℃的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他受控冷冻方法以及在-20℃下或液氮中的不受控的速冻。在某些实施方案中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在使用本发明的方法活化之前使其在室温下静置1小时。
在某些实施方案中还提供了在可能需要如本文所述的经扩充细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产品。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩充细胞的来源，并且分离和冷冻所需的细胞如T细胞，以供随后在T细胞疗法中用于将受益于T细胞疗法的任何数目的疾病或病况，例如本文所述的疾病或病况。在一个实施方案中，血液样品或单采物取自大体健康的受试者。在某些实施方案中，血液样品或单采物取自大体健康的受试者，该受试者有发展出疾病的风险但尚未发展出该疾病，并且感兴趣的细胞被分离并冷冻以供随后使用。在某些实施方案中，T细胞可以扩充、冷冻并在随后使用。在某些实施方案中，在任何治疗之前，在诊断如本文所述的特定疾病之后的较短时间内从患者收集样品。在进一步的实施方案中，在任何数目的相关治疗方式前，从受试者的血液样品或单采物中分离细胞，该治疗方式包括但不限于采用诸如以下的药剂的治疗：那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化疗、放射、诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸酯和FK506等免疫抑制剂、抗体或其他免疫清除剂，如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228和辐射。这些药物抑制钙依赖性的磷酸酶——钙依赖磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,(1991)；Henderson等人,Immun 73:316-321,(1991)；Bierer等人,Curr.Opin.Immun 5:763-773,(1993))。在进一步的实施方案中，为患者分离细胞并将其冷冻，以供随后与骨髓或干细胞移植、使用化学治疗剂如氟达拉滨的T细胞消融疗法、外照射放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH结合使用(例如，在其之前、同时或之后)。在另一实施方案中，细胞预先分离并且可被冷冻以供随后用于在B细胞消融疗法(如与CD20反应的药剂，例如利妥昔单抗)之后的治疗。
在本发明的进一步的实施方案中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗特别是用损害免疫系统的药物治疗之后，在该治疗后不久且在患者通常将从治疗中恢复的时期中，所获得的T细胞的质量可能是最佳的或改善的，因为其有离体扩充的能力。同样地，在使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可以处于植入和体内扩充增强的优选状态。因此，在本发明的背景下考虑在该恢复期中收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。进一步地，在某些实施方案中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调节方案可用于在受试者体内产生这样的条件，其中特别细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩充是有利的，尤其是在疗法后限定的时间窗口内。说明性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。
T细胞的活化和扩充
无论是在T细胞工程化以表达本文所述的CAR之前还是之后，通常可以使用例如美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041以及美国专利申请公开号20060121005中描述的方法激活并扩充T细胞。
通常，本文所述的T细胞通过与表面接触来扩充，该表面上附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂以及刺激细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可以如本文所述刺激T细胞群体，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶C激活剂接触(例如，苔藓抑制素)。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，采用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3，B-T3，XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，其可以与本领域公知的其他方法一样使用(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,(1998)；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,(1999)；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,(1999))。
在某些实施方案中，T细胞的主要刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到相同表面(即，“顺式”排列)或不同表面(即“反式”排列)。或者，可以将一种药剂偶联到表面而另一药剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的药剂结合到细胞表面，并且提供主要激活信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些实施方案中，两种药剂可以都在溶液中。在另一实施方案中，药剂可以是可溶形式，并然后交联至表面，如表达Fc受体的细胞或将会与该药剂结合的抗体或其他结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开20040101519和20060034810中的预期用于活化和扩增本发明的T细胞的人工抗原呈递细胞(APC)。
在一个实施方案中，将两种药剂固定在珠子上(固定在相同的珠子上，即“顺式”，或者固定在不同的珠子上，即“反式”)。例如，提供主要激活信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种药剂以相等的分子量共同固定到相同的珠子。在一个实施方案中，用于CD4+ T细胞扩充和T细胞生长的与珠子结合的每种抗体使用1:1的比值。在本发明的某些方面，使用这样的与珠子结合的抗CD3抗体:抗CD28抗体比，使得与使用1:1的比值观察到的扩充相比，观察到T细胞扩充增加。在一个特定的实施方案中，与使用1:1的比值观察到的扩充相比，观察到约1倍至约3倍的增加。在一个实施方案中，与珠子结合的CD3抗体:CD28抗体的比值范围为100:1至1:100以及其间的所有整数值。在本发明的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28比小于1。在本发明的某些实施方案中，与珠子结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比值大于2:1。在一个特定的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:100的CD3:CD28比。在另一实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:75的CD3:CD28比。在进一步的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:50的CD3:CD28比。在另一的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:30的CD3:CD28比。在实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:10的CD3:CD28比。在另一实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:3的CD3:CD28比。在又一实施方案中，与珠子结合的抗体使用3:1的CD3:CD28比。
从1:500至500:1以及其间的任何整数值的颗粒与细胞的比值可用于刺激T细胞或其他靶细胞。本领域普通技术人员可以容易理解，颗粒与细胞的比值可以取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，大小较小的珠子只能结合少量细胞，而较大的珠子可以结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比值范围为1:100至100:1以及其间的任何整数值，并且在进一步的实施方案中，该比值包括1:9至9:1以及其间的任何整数值，也可用于刺激T细胞。如上所述，抗CD3和抗CD28偶联的颗粒与T细胞的导致T细胞刺激的比值可以变化，但是某些值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个比值是T细胞/颗粒为至少1:1。在一个实施方案中，使用1:1或更小的颗粒:细胞比。在一个特定的实施方案中，颗粒:细胞比为1:5。在进一步的实施方案中，颗粒:细胞比可以根据刺激的天数而变化。例如，在一个实施方案中，颗粒:细胞比在第一天为1:1至10:1，并且之后每天或每隔一天将额外的颗粒添加到细胞，持续至多10天，最终比值为1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定实施方案中，颗粒:细胞比在刺激的第一天为1:1，并且在刺激的第三天和第五天被调整为1:5。在另一实施方案中，每天或每隔一天添加颗粒，直至第一天的最终比值为1:1，并且在刺激的第三天和第五天的最终比值为1:5。在另一实施方案中，颗粒:细胞比在刺激的第一天为2:1，并且在刺激的第三天和第五天被调整为1:10。在另一实施方案中，每天或每隔一天添加颗粒，直至第一天的最终比值为1:1，并且在刺激的第三天和第五天的最终比值为1:10。本领域技术人员将会理解，多种其他比值可适用于本发明。特别地，比值将根据粒度和细胞大小和类型而变化。
在本文所述的进一步的实施方案中，将免疫效应细胞如T细胞与药剂包被的珠子组合，然后将珠子和细胞分离，随后培养细胞。在替代实施方案中，在培养之前，不分离药剂包被的珠子和细胞，而是将其一起培养。在进一步的实施方案中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠子和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
举例来说，可通过使抗CD3和抗CD28所附接至的顺磁珠(3x28个珠子)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠子(例如，比值为1:1的
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M-450 CD3/CD28 T顺磁珠，或来自Miltenyi Biotec的
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MicroBeads)在缓冲液例如PBS(无二价阳离子，如钙和镁)中混合。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常罕见并且仅构成0.01％的样品，或者整个样品(即100％)可包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数都在本发明的情况的范围内。在某些实施方案中，可能需要显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、35000万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产率、细胞活化和细胞扩充增加。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能较弱低表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。这样的细胞群体可能具有治疗价值，并且在某些实施方案中希望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+ T细胞。
在本文所述的一个实施方案中，可以将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何整数小时的值。在另一实施方案中，可将混合物培养21天。在本发明的一个实施方案中，将珠子和T细胞一起培养约8天。在另一实施方案中，将珠子和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括可含有增殖和生存所必需的因子的适当培养基(例如，基本必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，该因子包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知用于细胞生长的其他任何添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)以及还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适量血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使T细胞生长和扩充的量的细胞因子的RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包含在实验培养物中，而不包含在待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特性。例如，典型的血液或单采的外周血单核细胞产品具有大于细胞毒性T细胞群体或抑制性T细胞群体(TC，CD8+)的辅助T细胞群体(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩充T细胞产生T细胞群体，该T细胞群体在约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，该T细胞群体包含越来越多的TC细胞群体。因此，根据治疗目的，向受试者输注主要由TH细胞构成的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已经分离了TC细胞的抗原特异性亚组，则将该亚组扩充到更大程度可能是有益的。
进一步地，除了CD4和CD8标志物之外，其他表型标志物显著变化，但在很大程度上，在细胞扩充过程中该变化可再现。因此，这样的再现性使得能够针对特定目的定制激活的T细胞产物。
在一些情况下，将实施方案的免疫效应细胞(例如，T细胞)与活化和增殖细胞(AaPC)共培养，以帮助细胞扩充。AaPC也可称为人工抗原呈递细胞(APC)。例如，抗原呈递细胞(APC)可用于制备实施方案的治疗组合物和细胞疗法产品。在一个方面，AaPC可以是遗传修饰的K562细胞。关于抗原呈递系统的制备和使用的一般指导，参见例如美国专利6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662；美国专利申请公开2009/0017000和2009/0004142；以及国际公开WO2007/103009，其各自通过引用并入本文。在实施方案的又一方面，培养遗传修饰的CAR细胞包括在刺激表达CAR的免疫效应细胞扩充的树突细胞或活化和增殖细胞(AaPC)的存在下培养遗传修饰的CAR细胞。在更进一步的方面，AaPC包含在AaPC表面上表达的CAR结合多肽或TCR结合抗体或其片段。在一些情况下，AaPC可以包括激活或共刺激T细胞的其他分子。在一些情况下，其他分子可以包括膜结合的Cγ细胞因子。在更进一步的方面，AaPC被灭活或辐射，或已经过测试并证实不含感染性物质。在更进一步的方面，在AaPC的存在下培养遗传修饰的CAR细胞包括在包含可溶性细胞因子如IL-15、IL-21和/或IL-2的培养基中培养遗传修饰的CAR细胞。细胞可以以约10:1至约1:10、约3:1至约1:5、约1:1至约1:3(免疫效应细胞比AaPC)或其中可导出的任何范围的比值来培养。例如，T细胞和AaPC的共培养物可以是约1:1、约1:2或约1:3的比值。
在一个方面，AaPC可以表达CD137L。在一些方面，AaPC可以进一步表达CAR细胞所靶向的抗原，例如MUC16(全长、截短或其任何变体)。在其他方面，AaPC可以进一步表达CD64、CD86或mIL15。在某些方面，AaPC可以表达至少一种抗CD3抗体克隆，例如OKT3和/或UCHT1。在一个方面，AaPC可以被灭活(例如，辐射)。在一个方面，AaPC可能已经过测试并证实不含感染性物质。用于产生这样的AaPC的方法是本领域已知的。在一个方面，将CAR修饰的T细胞群体与AaPC一起培养可以包括以约10:1至约1:10、约3:1至约1:5、约1:1至约1:3(T细胞比AaPC)或其中可导出的任何范围的比值培养细胞。例如，T细胞和AaPC的共培养物可以是约1:1、约1:2或约1:3的比值。在一个方面，培养步骤可以进一步包括用氨基二膦酸盐(例如唑来膦酸)培养。
在一个方面，将遗传修饰的CAR细胞群体立即输注到受试者体内或冷冻保存。在另一方面，遗传修饰的CAR细胞群体在输注到受试者体内之前置于细胞因子浴中。在进一步的方面，培养和/或刺激遗传修饰的CAR细胞群体不超过1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63或70天。在实施方案中，刺激包括遗传修饰的CAR T细胞与AaPC的共培养，以促进CAR阳性T细胞的生长。在另一方面，刺激遗传修饰的CAR细胞群体不超过：1X刺激、2X刺激、3X刺激、4X刺激、5X刺激、5X刺激、6X刺激、7X刺激、8X刺激、9X刺激或10X刺激。在一些情况下，遗传修饰的细胞不在AaPC的存在下离体培养。在一些具体情况下，实施方案的方法进一步包括在转染和/或培养步骤后富集细胞群体中的表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)。富集可包括荧光激活细胞分选(FACS)，以针对CAR表达细胞进行分选。在进一步的方面，针对表达CAR的细胞的分选包括使用CAR结合抗体。富集还可包括CD56+细胞的消耗。在实施方案的又一方面，所述方法进一步包括冷冻保存遗传修饰的CAR细胞群体的样品。
在一些情况下，将AaPC与最佳长度的肽一起孵育，该最佳长度允许肽直接结合MHC分子而无需额外处理。或者，细胞可以表达感兴趣的抗原(即，在不依赖MHC的抗原识别的情况下)。此外，在一些情况下，APC可以表达抗体，该抗体与特定CAR多肽结合或与一般的CAR多肽结合(例如，通用活化和增殖细胞(uAPC))。这样的方法公开于WO/2014/190273中，其通过引用并入本文。除了肽-MHC分子或感兴趣的抗原之外，AaPC系统还可包含至少一种外源辅助分子。可以采用任何合适数目的辅助分子和辅助分子的组合。辅助分子可选自诸如共刺激分子和粘附分子等辅助分子。示例性的共刺激分子包括CD70和B7.1(B7.1以前称为B7，并且也称为CD80)，除其他分子外，它们还与T细胞表面上的CD28和/或CTLA-4分子结合，从而影响例如T细胞扩增、Th1分化、短期T细胞存活和细胞因子分泌，如白介素(IL)-2。粘附分子可包括碳水化合物结合糖蛋白如选择蛋白、跨膜结合糖蛋白如整联蛋白、钙依赖性蛋白质如钙黏着蛋白，以及单次跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白如细胞间粘附分子(ICAM)，其促进例如细胞与细胞或细胞与基质的接触。示例性粘附分子包括LFA-3和ICAM，如ICAM-1。用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂例示于例如美国专利6,225,042、6,355,479和6,362,001中，其通过引用并入本文。
选择成为AaPC的细胞优选在细胞内抗原加工、细胞内肽运输和/或细胞内MHC I类或II类分子-肽负载方面存在缺陷，或者是变温的(即，相较于哺乳动物细胞系对温度攻击的敏感性更低)，或具有缺陷和变温性质二者。优选地，选择成为AaPC的细胞还缺乏表达被引入细胞中的外源性MHC I类或II类分子和辅助分子组分的至少一种内源性对应物(例如，如上所述的内源性MHC I类或II类分子和/或内源性辅助分子)的能力。此外，AaPC优选地保留细胞在其修饰以生成AaPC之前所具有的缺陷和变温性质。示例性AaPC由与抗原加工(TAP)缺陷型细胞系如昆虫细胞系相关的转运蛋白构成或衍生。示例性的变温昆虫细胞系是果蝇细胞系，如Schneider 2细胞系(参见例如，Schneider 1972，美国专利6,225,042、6,355,479和6,362,001中提供了用于Schneider 2细胞的制备、生长和培养的说明性方法)。
在一个实施方案中，还使AaPC经历冻融循环。在示例性的冻融循环中，可以通过使容纳AaPC的合适容器与适量的液氮、固体二氧化碳(即干冰)或类似的低温材料接触来冷冻AaPC，使得冷冻迅速发生。然后通过将AaPC从低温材料中取出并暴露于室温条件下，或者通过促进解冻过程(其中采用温水浴或温暖的手来缩短解冻时间)来解冻冷冻的APC。此外，可以将AaPC冷冻并在解冻之前储存一段延长的时间。也可以将冷冻的AaPC解冻，随后在进一步使用前冻干。优选地，可能对冻融程序产生不利影响的防腐剂，如二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)和其他防腐剂不存在于含有经历冻融循环的AaPC的培养基中，或例如通过将AaPC转移到基本上不含这样的防腐剂的培养基中而基本上去除。
在进一步的实施方案中，相对于AaPC的异种核酸和内源核酸可以通过交联而灭活，使得在灭活后基本上不发生细胞生长、复制或核酸表达。在一个实施方案中，AaPC在外源性MHC和辅助分子表达、这些分子在AaPC表面上呈递，以及所呈递的MHC分子负载选定的一种或多种肽之后的某一点处灭活。因此，这样的灭活且负载选定肽的AaPC虽然基本上不能增殖或复制，但保留了选定的肽呈递功能。优选地，交联还产生基本上不含污染微生物(如细菌和病毒)的AaPC，而基本上不降低AaPC的抗原呈递细胞功能。因此，交联保持了重要的AaPC功能，同时有助于减轻对使用AaPC开发的细胞疗法产品的安全性的担忧。对于与交联和AaPC相关的方法，参见例如美国专利申请公开20090017000，其通过引用并入本文。
在某些实施方案中，进一步提供了工程化抗原呈递细胞(APC)。例如，如上所述，这样的细胞可用来使免疫效应细胞离体增殖。在进一步的方面，工程化APC本身可以施用于患者，由此在体内刺激免疫效应细胞的扩充。实施方案的工程化APC本身可用作治疗剂。在其他实施方案中，工程化APC可以用作治疗剂，其可以刺激对靶抗原特异的内源性免疫效应细胞的活化和/或增加对靶抗原特异的过继转移免疫效应细胞的活性或持久性。
如本文所用的，术语“工程化APC”是指包含至少第一转基因的细胞，其中第一转基因编码HLA。这样的工程化APC可以进一步包含用于表达抗原的第二转基因，使得抗原与HLA复合呈递在APC表面。在一些方面，工程化APC可以是呈递抗原的细胞类型(例如，树突细胞)。在进一步的方面，工程化APC可以由通常不呈递抗原的细胞类型如T细胞或T细胞祖细胞(称为“T-APC”)产生。因此，在一些方面，实施方案的工程化APC包含编码靶抗原的第一转基因和编码人白细胞抗原(HLA)的第二转基因，使得HLA与靶抗原的表位复合地在工程化APC的表面上表达。在某些具体方面，在工程化APC中表达的HLA是HLA-A2。
在一些方面，实施方案的工程化APC可以进一步包含编码共刺激分子的至少第三转基因。共刺激分子可以是共刺激细胞因子，其可以是膜结合的Cγ细胞因子。在某些方面，共刺激细胞因子是IL-15，如膜结合的IL-15。在一些进一步的方面，工程化APC可包含经编辑的(删除的)基因。例如，可以编辑抑制基因，如PD-1、LIM-3、CTLA-4或TCR以减少或消除该基因的表达。实施方案的工程化APC可以进一步包含编码任何感兴趣的靶抗原的转基因。
照护点
在本公开的一个实施方案中，本文所述的免疫效应细胞在照护点场所处被修饰。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞也被称为工程化T细胞。在一些情况下，照护点场所位于需要治疗的受试者附近的医院或设施(例如，医疗设施)。受试者经历单采血液成分术，并且外周血单核细胞(PBMC)或PBMC亚群可以例如通过淘洗或Ficoll分离来富集。富集的PBMC或PBMC亚群可以在进一步处理之前在任何合适的冷冻保存溶液中冷冻保存。在一种情况下，使用含有人血清白蛋白的缓冲溶液进行淘洗过程。可通过本文所述的选择方法分离免疫效应细胞，如T细胞。在一种情况下，T细胞的选择方法包括对T细胞上的CD3具有特异性的珠子或对T细胞上的CD4和CD8具有特异性的珠子。在一种情况下，该珠子可以是顺磁珠子。收获的免疫效应细胞可以在修饰前在任何合适的冷冻保存溶液中冷冻保存。免疫效应细胞在输注前可以解冻长达24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。解冻的细胞在修饰前可以置于细胞培养缓冲液，例如补充有胎牛血清(FBS)或人血清AB的细胞培养缓冲液(例如RPMI)中，或置于包含诸如IL-2和IL-21等细胞因子的缓冲液中。另一方面，可以立即修饰收获的免疫效应细胞而不需要冷冻保存。
在一些情况下，通过将嵌合受体、一种或多种细胞标签和/或细胞因子工程化/引入免疫效应细胞中然后快速输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在一些情况下，免疫效应细胞的来源可包括同种异体和自体来源。在一种情况下，免疫效应细胞可以是T细胞或NK细胞。在一种情况下，嵌合受体可以是MUC16 CAR。在另一种情况下，细胞因子可以是mbIL-15。在一种情况下，该mbIL-15是SEQ ID NO:69，或其变体或片段。在又一种情况下，mbIL-15的表达由本文所述的配体诱导型基因开关表达系统来调节。例如，可以将诸如veledimex的配体递送至受试者以调节mbIL-15的表达。在另一种情况下，该细胞因子可以是IL-12。在又一种情况下，IL-12的表达由本文所述的配体诱导型基因开关表达系统来调节。例如，可以将诸如veledimex的配体递送至受试者以调节IL-12的表达。
另一方面，以5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg提供veledimex。在另一方面，提供较低剂量的veledimex，例如，0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg或20mg。在一个实施方案中，在输注经修饰的免疫效应细胞之前0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天将veledimex施用于受试者。在另一个实施方案中，大约每12小时一次、大约每24小时一次、大约每36小时一次或大约每48小时一次向受试者施用veledimex，在输注经修饰的免疫效应细胞后持续一段有效的时间。在一个实施方案中，施用veledimex的有效时间段为约：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天。在其他实施方案中，可以在休息期之后、休药期之后或当受试者经历复发时再次施用veledimex。
在某些情况下，当观察到对受试者的不利影响或不需要治疗时，可以例如通过西妥昔单抗激活细胞标签，以用于条件性体内消融包含本文所述的细胞标签如截短的表皮生长因子受体标签的经修饰的免疫效应细胞。
在一些实施方案中，此类免疫效应细胞通过电穿孔用图1-2描述的构建体来修饰。在一种情况下，用电穿孔仪如Lonza的NucleofectorTM电穿孔仪进行电穿孔。在其他实施方案中，包含上述构建体的载体是非病毒或病毒载体。在一种情况下，非病毒载体包括Sleeping Beauty转座子-转座酶系统。在一种情况下，使用特定序列对免疫效应细胞进行电穿孔。例如，免疫效应细胞可以用一个转座子进行电穿孔，然后用编码转座酶的DNA，接着用第二个转座子进行电穿孔。在另一种情况下，免疫效应细胞可以同时用所有转座子和转座酶进行电穿孔。在另一种情况下，免疫效应细胞可以用转座酶进行电穿孔，然后用两个转座子或一次一个转座子进行电穿孔。在进行连续电穿孔时，免疫效应细胞可以在下一个电穿孔步骤之前休息一段时间。
在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞不经历增殖和激活步骤。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞不经历孵育或培养步骤(例如离体增殖)。在某些情况下，经修饰的免疫效应细胞在输注之前置于包含IL-2和IL-21的缓冲液中。在其他情况下，经修饰的免疫效应细胞在输注之前置于或静置在细胞培养缓冲液，例如补充有胎牛血清(FBS)的细胞培养缓冲液(例如RPMI)中。在输注之前，可以收获经修饰的免疫效应细胞，洗涤，并在盐水缓冲液中配制以准备输注到受试者体内。
在一种情况下，受试者在输注前已进行淋巴细胞消耗。在其他情况下，不需要淋巴细胞消耗，而是将经修饰的免疫效应细胞快速输注到受试者体内。示例性淋巴细胞消耗方案在以下表2和表3中列出：
表2.方案1
Figure BDA0002934516290000861
Figure BDA0002934516290000871
表3.方案2
D-6 加入/IV补水
D-5 氟达拉滨30mg/m2，环磷酰胺500mg/m2
D-4 氟达拉滨30mg/m2，环磷酰胺500mg/m2
D-3 氟达拉滨30mg/m2 IV，环磷酰胺500mg/m2
D-2 REST
D-1 REST
D0 T细胞输注
在另一种情况下，受试者经历最小的淋巴细胞消耗。本文中的最小的淋巴细胞消耗是指减少的淋巴细胞消耗方案，使得受试者可以在淋巴细胞消耗方案后1天、2天或3天内输注。在一种情况下，减少的淋巴细胞消耗方案可包括较低剂量的氟达拉滨和/或环磷酰胺。在另一种情况下，减少的淋巴细胞消耗方案可以包括缩短的淋巴细胞消化期，例如1天或2天。
在一个实施方案中，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入所述免疫效应细胞中然后快速输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在其他情况下，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入所述细胞中，然后在至少0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50小时内输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在其他情况下，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入免疫效应细胞中，然后在0天、<1天、<2天、<3天、<4天、<5天、<6天或<7天内输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。
在一些实施方案中，将一定量的经修饰的效应细胞施用于有需要的受试者，并且基于功效和诱导细胞因子相关毒性的潜力来确定该量。在另一个实施方案中，经修饰的效应细胞是CAR+和CD3+细胞。在一些情况下，经修饰的效应细胞的量包含约104至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的效应细胞的量包含约104至约105个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的效应细胞的量包含约105至约106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的效应细胞的量包含约106至约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的效应细胞的量包含>104但≤105个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的效应细胞的量包含>105但≤106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，经修饰的效应细胞的量包含>106但≤107个经修饰的效应细胞/kg。
在一个实施方案中，修饰的免疫效应细胞通过直接向肿瘤组织的区域递送而靶向癌症。例如，在卵巢癌中，可以将修饰的免疫效应细胞腹膜内(IP)递送至腹部或腹膜腔。可以通过放置用于递送化疗药物的端口或预先存在的端口来进行这种IP递送。修饰的免疫效应细胞的区域递送的其他方法可以包括导管输注到切除术腔中、超声引导的肿瘤内注射、肝动脉输注或胸膜内递送。
在一个实施方案中，有需要的受试者可以用通过IP递送的第一剂量的经修饰的免疫效应细胞开始治疗，然后是通过IV递送的第二剂量的经修饰的免疫效应细胞。在另一个实施方案中，第二剂量的修饰的免疫效应细胞之后可以是可以通过IV或IP递送的后续剂量。在一个实施方案中，第一和第二或进一步的后续剂量之间的持续时间可以是约：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天。在一个实施方案中，第一和第二或进一步的后续剂量之间的持续时间可以是约：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个月。在另一个实施方案中，第一和第二或进一步的后续剂量之间的持续时间可以是约：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
在另一个实施方案中，可以将导管置于肿瘤或转移部位，以进一步施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个剂量的修饰的免疫效应细胞。在一些情况下，修饰的效应细胞的剂量可包含约102至约109个修饰的效应细胞/kg。在观察到毒性的情况下，修饰的效应细胞的剂量可以包含约102至约105个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的剂量可以开始于约102个修饰的效应细胞/kg，并且后续剂量可以增加至约：104、105、106、107、108或109个修饰的效应细胞/kg。
在其他实施方案中，刺激工程化细胞的增殖和/或存活的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一个实施方案中，转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签和有效地将所述一种或多种多核苷酸整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一个实施方案中，转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将所述一种或多种多核苷酸有效整合到人的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一个实施方案中，所述基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域。在一些实施方案中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。
在一种情况下，体内增殖工程化细胞的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一个实施方案中，转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签和有效地将所述一种或多种多核苷酸整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一个实施方案中，转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将所述一种或多种多核苷酸有效整合到人的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一个实施方案中，所述基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域。在一些实施方案中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。
在另一个实施方案中，增强工程化细胞在有需要的受试者中的体内持久性的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一些情况下，一个或多个转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签和有效地将DNA整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一些情况下，一种或多种转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将DNA有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一些情况下，所述基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。
在另一个实施方案中，治疗患有实体瘤的受试者的方法包括从受试者获得细胞样品，用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该样品的细胞，并将工程化细胞群体施用于该受试者。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。在一些情况下，一种或多种转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签和将DNA有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶。在一些情况下，所述一个或多个转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将DNA有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶。在一些情况下，基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一些情况下，通过电穿孔转染细胞。在一些情况下，编码基因开关多肽的多核苷酸由启动子调节。在一些情况下，该启动子是组织特异性启动子或EF1A启动子或其功能变体。在一些情况下，该组织特异性启动子包含T细胞特异性应答元件或NFAT应答元件。在一些情况下，该细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15R的融合体或IL-15变体中的至少一种。在一些情况下，该细胞因子是分泌形式。在一些情况下，该细胞因子是膜结合形式。在一些情况下，所述细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞或T细胞祖细胞。在一些情况下，将细胞施用于受试者(例如通过向受试者输注工程化细胞)。在一些情况下，该方法进一步包括施用有效量的配体(例如veledimex)以诱导细胞因子的表达。在一些情况下，所述CAR能够至少结合MUC-16。在一些情况下，转座酶是鲑鱼型Tc1样转座酶。在一些情况下，转座酶是SB11或SB100x转座酶。在其他情况下，转座酶是PiggyBac。在一些情况下，细胞标签包含HER1截短变体或CD20截短变体中的至少一种。
治疗应用
在本文所述的实施方案中，是用Sleeping Beauty转座子和Sleeping Beauty转座酶转导的免疫效应细胞(例如，T细胞)。例如，一个或多个Sleeping Beauty转座子可包括CAR，该CAR组合了MUC16的抗原识别域与CD8α铰链及其变体的茎结构域，CD3-ζ、CD28、4-1BB或其任意组合的胞内域，以及CD3ζ的胞内域，一个或多个细胞标签，一种或多种细胞因子，以及可选的本文所述基因开关系统的组分。因此，在一些情况下，转导的T细胞可以引发CAR介导的T细胞应答。
在本文所述的实施方案中，提供了使用CAR将原代T细胞的特异性重定向至MUC16表面抗原的应用。因此，本发明还提供了一种在哺乳动物中刺激T细胞介导的对靶细胞群体或组织的免疫应答的方法，其包括向哺乳动物施用表达CAR的T细胞的步骤，其中该CAR包含与MUC16特异性相互作用的结合部分、茎结构域、包含例如人CD3ζ的胞内域的ζ链部分以及共刺激信号传导区。
在一个实施方案中，本公开包括一种细胞疗法，其中T细胞被遗传修饰为表达本发明的MUC1-6特异性CAR，并且将CAR T细胞输注到有需要的接受者。输注的细胞能够杀死接受者中过表达MUC16的细胞。与抗体疗法不同，本文所述的CAR T细胞能够在体内复制，从而导致长期持久性，这可导致对肿瘤细胞的持续作用。
本发明另外提供了一种在受试者中检测包括MUC16过表达的疾病的方法，其包括：a)提供i)来自受试者的样品，和ii)任何一种或多种本文所述的抗体或其抗原结合片段，b)在使抗体与其抗原特异性结合的条件下使该样品与该抗体接触，以及c)与缺乏疾病的对照样品相比，检测该抗体与样品的结合水平增加，从而检测受试者中的疾病。在一个实施方案中，该疾病是癌症。在优选的实施方案中，该癌症选自卵巢癌和乳腺癌。尽管无意限制检测方法，但在一个实施方案中，检测抗体与样品的结合是免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光激活细胞分选(FACS)、Western印迹法、免疫沉淀和/或放射照相成像。
本文还提供了一种治疗包括MUC16过表达的疾病的方法，其包括向患有该疾病的受试者施用治疗有效量的任何一种或多种本文所述的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，该疾病是癌症，例如卵巢癌和乳腺癌。
在一个实施方案中，本文所述的MUC16 CAR T细胞可经历稳定的体内T细胞扩充，并可持续延长的时间长度。在另一个实施方案中，本文所述的CAR T细胞可以进化成特定的记忆T细胞，后者可以是重新激活的。
本文所述的CAR修饰的T细胞还可以用作一种类型的疫苗，用于哺乳动物的离体免疫和/或体内治疗。在实施方案中，该哺乳动物是人。关于离体免疫，在将免疫效应细胞施用于哺乳动物之前，在体外发生至少一个以下事件：i)细胞扩充，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)细胞的冷冻保存。
离体程序是公知的，下面将更全面地进行讨论。简言之，从哺乳动物(例如人)分离细胞，并用表达本文公开的CAR的载体进行遗传修饰(即体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞施用于哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人，并且CAR修饰的细胞相对于接受者可以是自体的。或者，所述细胞对于接受者而言可以是同种异体的、同基因的或异种的。
离体扩充造血干细胞和祖细胞的程序在美国专利5,199,942(通过引用并入本文)中描述，并且可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于任何特定的细胞离体扩充方法。简言之，T细胞的离体培养和扩充包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体中收集哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)离体扩充这类细胞。除了美国专利5,199,942中描述的细胞生长因子外，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体也可用于细胞的培养和扩充。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗外，本发明还提供了用于体内免疫以在患者体内引发针对抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述激活并扩充的细胞可用于治疗和预防在免疫受损的个体中出现的疾病。特别是，本发明的CAR修饰的T细胞用于治疗MUC16恶性肿瘤，例如MUC16。在某些实施方案中，本发明的细胞用于治疗有发生MUC16的风险的患者。因此，用于治疗或预防MUC16的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的CAR修饰的T细胞。在实施方案中，如本文所述激活并扩充的细胞可用于治疗MUC16。
简言之，本文所述的药物组合物可包含本文所述的靶细胞群体，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。这类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在实施方案中，本发明的组合物被配制用于静脉内给药。
本文所述的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。给药量和给药频率将取决于诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重程度等因素，尽管适当的剂量可取决于临床试验。
当指示“免疫学有效量”或“治疗量”时，待施用的本文所述组合物的精确量可以由医生考虑年龄、体重以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定。通常可以规定，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重、105至106个细胞/kg体重的剂量施用，包括这些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术来施用所述细胞(参见，例如，Rosenberg等人,NewEng.J.of Med.319:1676,(1988))。通过监测患者的疾病指征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
在某些实施方案中，可能希望向受试者施用活化的T细胞，随后抽血(或进行单采血液成分术)，从中激活T细胞，并向该患者重新输注这些活化并扩充的T细胞。该过程可以每数周进行多次。在某些实施方案中，可以从10cc至400cc的抽取血液激活T细胞。在某些实施方案中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽取血液激活T细胞。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案可以用来选出某些T细胞群体。在另一个实施方案中，可能希望在通过放射或化学疗法对患者进行淋巴消耗后，施用本发明组合物的活化的T细胞。
本文所述的组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。本文所述的组合物可以经皮下、皮内、瘤内、结内(intranodally)、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。在一个实施方案中，通过皮内或皮下注射将本发明的T细胞组合物施用至患者。在另一个实施方案中，通过静脉内注射施用本发明的MUC16 CAR-T细胞组合物。可将T细胞的成分直接注射到淋巴结或原发肿瘤或转移部位。
将要施用于患者的上述治疗的剂量将随所治疗的病况的确切性质和该治疗的接受者而变化。可以根据本领域公认的实践来进行用于人类给药的剂量的增减。例如，上述治疗的剂量可以在1×104个CAR+细胞/kg至5×106个CAR+细胞/kg的范围内。示例性剂量可以是1×102个CAR+细胞/kg、1×103个CAR+细胞/kg、1×104个CAR+细胞/kg、1×105个CAR+细胞/kg、3×105个CAR+细胞/kg、1×106个CAR+细胞/kg、5×106个CAR+细胞/kg、1×107个CAR+细胞/kg、1×108个CAR+细胞/kg或1×109个CAR+细胞/kg。对于成人或儿童患者，可以相应地调整适当的剂量。
或者，施用于哺乳动物(例如人)的免疫效应细胞的典型量例如可以在一百、一千、一万、一百万至一千亿个细胞的范围内；然而，低于或高于该示例性范围的量也在本发明的范围内。例如，本发明宿主细胞的剂量可以是约100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或上述值中的任意两个所限定的范围)、约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或上述值中的任意两个所限定的范围)、约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞或上述值中的任意两个所限定的范围)。
可以通过定期评估接受治疗的患者来监测治疗或预防功效。对于持续数天或更长的重复给药，视情况而定，重复进行治疗直至出现所需的疾病症状抑制。然而，其他剂量方案也可能是有用的，并且在本发明的范围内。可通过单次团注施用组合物、通过多次团注施用组合物或通过连续输注施用组合物来递送所需剂量。
包含表达所公开的核酸序列的免疫效应细胞的组合物，或包含这些核酸序列的载体，可以与一种或多种可以共同施用于哺乳动物的另外的治疗剂一起施用。所谓“共同施用”是指在时间上足够接近地施用一种或多种另外的治疗剂，以及包含本发明宿主细胞或本发明载体的组合物，以增强一种或多种另外的治疗剂的作用，反之亦然。就此而言，包含本文所述的免疫效应细胞或本文所述的载体的组合物可以与一种或多种另外的治疗剂同时施用，或者可以首先施用该组合物，然后施用一种或多种另外的治疗剂，反之亦然。或者，包含所公开的免疫效应细胞或本文所述的载体的组合物以及一种或多种另外的治疗剂可以同时施用。
可以包含在包含本发明宿主细胞和/或本发明载体的组合物中(或包含在试剂盒中)或与之共同施用的治疗剂的实例是白介素、细胞因子、干扰素、佐剂和化疗剂。在实施方案中，所述另外的治疗剂是IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β、TNF-α、生长因子和hGH，人Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10的配体。
“消泡剂”减少加工过程中的起泡，这种起泡可以造成水性分散体的凝聚、成品膜中的气泡或通常受损的加工。示例性的消泡剂包括硅乳剂或失水山梨醇倍半油酸酯(sorbitan sesquoleate)。
“抗氧化剂”包括例如丁羟甲苯(BHT)、抗坏血酸钠、抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠和生育酚。在某些实施方案中，如需要，抗氧化剂增强化学稳定性。
本文所述的制剂可受益于抗氧化剂、金属螯合剂、含巯基的化合物和其他普通稳定剂。这类稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油；(b)约0.1％至约1％w/v甲硫氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v一硫代甘油，(d)约1mM至约10mM EDTA，(e)约0.01％至约2％w/v抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨醇酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v聚山梨醇酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸葡聚糖，(k)环糊精，(l)多硫酸戊聚糖酯和其他类肝素类，(m)二价阳离子，如镁和锌；或(n)其组合。
“粘合剂”赋予粘结性质，并且包括例如藻酸及其盐；纤维素衍生物，如羧甲基纤维素、甲基纤维素(例如
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)、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如
Figure BDA0002934516290000972
)、乙基纤维素(例如
Figure BDA0002934516290000974
)和微晶纤维素(例如
Figure BDA0002934516290000973
)；微晶右旋糖；直链淀粉；硅酸镁铝；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯聚吡咯烷酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶、糊精、糖，如蔗糖(例如
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)、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇(例如
Figure BDA0002934516290000976
)和乳糖；天然或合成树胶，如阿拉伯胶、黄蓍胶、茄替胶、车前籽胶、聚乙烯吡咯烷酮(例如
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CL、
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CL、
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XL-10)、落叶松阿拉伯半乳聚糖、
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聚乙二醇、蜡、藻酸钠等。
“载剂”或“载剂材料”包括任何在制药学中常用的赋形剂，并且应根据与本文公开的化合物如依鲁替尼和抗癌剂化合物的相容性以及所需剂型的释放谱性质而选择。示例性的载剂材料包括，例如，粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。药学上相容的载剂材料可包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:MackPublishing Company,1995)，Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975，Liberman,H.A.和Lachman,L.编,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980，以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第七版(LippincottWilliams&Wilkins1999)。
“分散剂”和/或“粘度调节剂”包括通过液体介质或造粒方法或混合方法控制药物的扩散和均匀性的材料。在一些实施方案中，这些药剂还有助于包被或侵蚀基质的有效性。示例性扩散促进剂/分散剂包括例如亲水性聚合物、电解质、
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60或80、PEG、聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商品名为
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)和基于碳水化合物的分散剂，如羟丙基纤维素(例如，HPC、HPC-SL和HPC-L)、羟丙基甲基纤维素(例如，HPMC K100、HPMC K4M、HPMC K15M和HPMC K100M)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯(HPMCAS)、非结晶纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚聚合物与环氧乙烷和甲醛(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，
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和
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它们是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；以及泊洛沙胺(例如，Tetronic
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也称为Poloxamine
Figure BDA0002934516290000986
它是由将环氧丙烷和环氧乙烷依次添加至乙二胺而得到的四官能嵌段共聚物(BASF Corporation,Parsippany,N.J.))、聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630)、聚乙二醇例如可具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量的聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、树胶如黄蓍树胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原树胶)、糖、纤维素制品如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(PVA)、藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂如纤维素或三乙基纤维素也可用作分散剂。在脂质体分散体和自乳化分散体中特别有用的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、来自蛋类的天然磷脂酰胆碱、来自蛋类的天然磷脂酰甘油、胆固醇和豆蔻酸异丙酯。
一种或多种蚀解促进剂与一种或多种扩散促进剂的组合也可以在本发明的组合物中使用。
术语“稀释剂”是指用来在递送前稀释感兴趣的化合物的化学化合物。稀释剂也可用来稳定化合物，因为它们可提供更稳定的环境。本领域中利用溶解于经缓冲的溶液(其也可以提供pH控制或维持)中的盐作为稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲的盐水溶液。在某些实施方案中，稀释剂增加组合物的体积，以便于压缩或者产生用于均匀掺合以供胶囊填充的足够体积。这类化合物包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素如
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磷酸氢钙、磷酸二钙二水合物；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖，如
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(Amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、基于蔗糖的稀释剂、糖果糖；一碱式硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂(dextrate)；水解谷物固体、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。
“填充剂”包括诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等化合物。
“润滑剂”和“助流剂”是防止、减少或抑制材料粘附或摩擦的化合物。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，烃如矿物油，或氢化植物油如氢化大豆油
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高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐，如铝、钙、镁、锌盐，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，
Figure BDA0002934516290000994
硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如，PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM，油酸钠，苯甲酸钠，山萮酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠，胶体二氧化硅如SyloidTM，
Figure BDA0002934516290000995
淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性剂，等等。
“增塑剂”是用来软化微胶囊化材料或膜包衣以使其更不易碎的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350和PEG 800、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三醋精。在一些实施方案中，增塑剂也可用作分散剂或润湿剂。
“增溶剂”包括诸如三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、丙二醇、二甲基异山梨醇等化合物。
“稳定剂”包括诸如任何抗氧化剂、缓冲液、酸、防腐剂等化合物。
“悬浮剂”包括诸如聚乙烯吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、聚乙二醇(例如，聚乙二醇可具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、羟乙基纤维素、藻酸钠、树胶如黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原树胶)、糖、纤维素如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等化合物。
“表面活性剂”包括诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或80、三醋精、维生素ETPGS、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(polaxomer)、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物如
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(BASF)等化合物。一些其他表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇(octoxynol)10、辛苯昔醇40。在一些实施方案中，可包含表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。
“粘度增强剂”包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
“润湿剂”包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、吐温80、维生素E TPGS、铵盐等化合物。
试剂盒和组合物
本公开的一个方面涉及试剂盒和组合物，其包括第一载体，该第一载体包括编码本发明的MUC16特异性CAR的编码区和可选的出于安全原因而包括的基因，例如HER1t或HER1t-1及其功能变体，或CD20或CD20t-1，及其功能变体。该试剂盒和组合物可以进一步包括细胞因子。在另一方面，该试剂盒和组合物可包括
Figure BDA0002934516290001011
基因开关组件。这些试剂盒和组合物可包括多个载体，每个载体编码不同的蛋白质或蛋白质子集。这些载体可以是病毒载体、非病毒载体、附加型载体或整合载体。在一些实施方案中，所述载体是转座子，例如Sleeping Beauty转座子。
在一些实施方案中，所述试剂盒和组合物不仅包括载体，而且还包括细胞和试剂，如白介素、细胞因子、白介素和化疗剂、佐剂、湿润剂或乳化剂。在一实施方案中，所述细胞是T细胞。在一个实施方案中，所述试剂盒和组合物包括IL-2。在一个实施方案中，所述试剂盒和组合物包括IL-21。在一个实施方案中，所述试剂盒和组合物包括Bcl-2、STAT3或STAT5抑制剂。在实施方案中，该试剂盒包括IL-15或mbIL-15。
在某些实施方案中，本文公开了与一种或多种本文所述的方法一起使用的试剂盒和制品。这样的试剂盒包括载具、包装或容器，该容器被区室化为容纳一个或多个容器如小瓶、管等，每个容器包含在本文描述的方法中使用的一个单独元件。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，该容器由多种材料如玻璃或塑料形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、袋、容器、瓶子，和任何适于选定制剂和预期给药和治疗模式的包装材料。
例如，容器包含CAR-T细胞(例如，本文所述的MUC16特异性CAR-T细胞)，并且任选地还包含本文公开的细胞因子和/或化疗剂。这样的试剂盒任选地包含关于其在本文所述方法中的使用的标识性描述或标签或说明书。
试剂盒一般包括列出了内容物的标签和/或使用说明书，以及带有使用说明的包装插页。一般也包括一套说明书。
在一些实施方案中，标签处于容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当构成标签的字母、数字或其他字符附着、模制或蚀刻在容器本身上时，标签处于容器上；当标签存在于也容纳容器的接纳器或载具内(例如作为包装插页)时，标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用来指示内容物将用于特定的治疗性应用。标签还指示内容物的使用说明，例如在本文所述方法中的使用说明。
实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明性目的，而并非限制本文提供的权利要求书的范围。
实施例1.使用Sleeping Beauty系统对T细胞的核转染
为了生成遗传修饰的T细胞，将冷冻保存的全T细胞解冻，洗涤，并重悬于预先温热的补充有FBS和Glutamax的不含酚红的RPMI 1640培养基(R20培养基)中，并置于具有5％CO2的37℃潮湿培养箱中。对细胞进行计数，离心，并重悬于核转染缓冲液中。为了生成CAR-T细胞，对于每个含有指定数目的T细胞的核转染皿，将总共15μg包含CAR构建体的转座子质粒与5μg编码SB转座酶的质粒合并(通常为每皿5-40x106)。使用Amaxa 2b Nucleofection装置或4D Nucleofector(Lonza，Walkersville，MD)实现T细胞的电穿孔。电穿孔后，将每个皿中的内容物转移至预温的R20培养基中，并置于37℃的培养箱中。采集每个T细胞培养物的样品进行流式细胞分析，以在适用时在指定时间点表征CAR、HER1t和mbIL-15表达。对于某些实验，对CAR+ T细胞进行量上的离体扩充，以进一步表征。对于生成的CAR+ T细胞的离体数量扩充，将T细胞与活化和增殖细胞(AaPC)进一步共培养。简言之，将源自工程改造为表达CD86、41BBL、mbIL15以及截短MUC16(MUC16t)抗原的K562细胞系的经辐射的AaPC与CAR+ T细胞在含有IL-21和IL-2的完全培养基中共培养，以供随后每周添加AaPC。
在电穿孔后第1天以及每次分别使用HiLyteTM Fluor 647-缀合的重组MUC16t-Fc融合蛋白或AF647标记的蛋白-L、藻红蛋白(PE)缀合的西妥昔单抗和异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗IL-15和抗IL-15RA抗体进行AaPC刺激之前，对CAR、HER1t1和mbIL15表达进行流式细胞术分析。
实施例2.MUC16 CAR-T细胞的生成
如实施例1所述，通过SB系统质粒的电穿孔生成表达MUC16-2CAR的CAR-T细胞。通过将编码MUC16-2 CAR和HER1t1的SB转座子质粒以及SB11转座酶质粒电穿孔到人T细胞中，生成MUC16-2 CAR-HER1t1 T细胞。通过将(1)编码MUC16-2 CAR、mbIL15和HER1t1的SB转座子质粒以及(2)SB11转座酶质粒电穿孔到人T细胞中，生成MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞。在核转染后第1天使用多参数流式细胞术对CAR、mbIL15和HER1t1的表达进行定量。
表4显示了转染效率，这是在核转染后第1天，使用表达MUC16-2 CAR和HER1t1基因(MUC16-2 CAR-HER1t1 T细胞)或MUC16-2CAR、mbIL15和HER1t1(MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞)的转座子对SB系统质粒进行核转染后，根据不同供体T细胞中表达转基因的细胞的百分比来测量的。将细胞圈选在活CD3+群体上。
表4.根据CAR表达测定的转染效率。
Figure BDA0002934516290001041
如实施例1所示，通过SB系统质粒的电穿孔生成表达MUC16-3CAR的CAR-T细胞。通过将编码MUC16-3 CAR和HER1t1的SB转座子质粒以及SB11转座酶质粒电穿孔到人T细胞中，生成MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞。通过将编码MUC16-3 CAR、mbIL15和HER1t1的SB转座子质粒以及SB11转座酶质粒电穿孔到人T细胞中，生成MUC16-3CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞。在核转染后第1天使用多参数流式细胞术对CAR、mbIL15和HER1t1的表达进行定量。
如图4所示，用MUC16-3-HER1t1或MUC16-3-mbIL15-HER1t1质粒进行核转染的T细胞表达转基因，如在核转染后过夜孵育后根据HER1t1表达所证实的。表5中示出了来自每个供体的各个数据点。
表5.根据HER1t1表达测量的转染效率
Figure BDA0002934516290001042
实施例3.具有不同间隔区长度的MUC16 CAR
如实施例1所述，通过在健康供体T细胞(供体#D133098)中对SB系统质粒进行电穿孔，生成表达衍生自CD8α铰链区的不同间隔区长度的MUC16 CAR的CAR-T细胞。如实施例1所述，通过每周一次刺激，通过与表达MUC16t的AaPC共培养，对CAR-T细胞进行数量上的离体扩充。在核转染后第1天和第8天，通过多参数流式细胞术测量CAR的表达。所评价的CAR-T测试物在表6中列出。图5显示了关于不同MUC16 CAR-T细胞的MUC16 CAR表达的流式细胞术数据。将细胞圈选(gate)在活CD3+细胞上。如图5中所示，根据MUC16 scFv和用于构建CAR分子的间隔区，在基因转移后一天观察到不同程度的MUC16 CAR表达。在将CAR+T细胞与MUC16t+AaPC系在体外共培养时，观察到CAR+T细胞的富集。对于来源于供体#D133098的MUC16CAR-T细胞，对于MUC16-2 CAR使用CD8a(3x)间隔区，而对于MUC16-7 CAR使用CD8a(2x)间隔区，在电穿孔后第1天到第8天观察到更好的CAR+T细胞富集。
表6.在图5中使用的MUC16 CAR构建体
编号 CAR构建体的描述
1 MUC16-1 CD8a.CD28ζCAR-HER1t1
2 MUC16-1 CD8a.4-1BBζCAR-HER1t1
3 MUC16-2 CD8a.4-1BBζCAR-HER1t1
4 MUC16-2 CD8a(2x).4-1BBζCAR-HER1t1
5 MUC16-2 CD8a(3x).4-1BBζCAR-HER1t1
6 MUC16-6 CD8a.4-1BBζCAR-HER1t1
7 MUC16-7 CD8a.4-1BBζCAR-HER1t1
8 MUC16-7 CD8a(2x).4-1BBζCAR-HER1t1
9 MUC16-7 CD8a(3x).4-1BBζCAR-HER1t1
10 MUC16-4 CD8a.4-1BBζCAR-HER1t1
11 MUC16-4 CD8a(2x).4-1BBζCAR-HER1t1
12 MUC16-4 CD8a(3x).4-1BBζCAR-HER1t1
通过在健康供体T细胞(供体#D132552)中对SB系统质粒进行电穿孔，生成表达具有衍生自CD8α铰链区的不同间隔区的MUC16-3 CAR的MUC16-3 CAR-HER1t1和MUC16-3-mbIL15-HER1t1 T细胞。如先前所述，通过每周一次刺激，通过与表达MUC16t的AaPC共培养，对CAR-T细胞进行数量上的离体扩充。在核转染后第1天和第8天，通过采用多参数流式细胞术的MUC16-Fc蛋白染色，测量MUC16-3 CAR的表达。所评价的CAR-T构建体在表7中列出。图6显示了关于不同MUC16-3 CAR-T细胞的MUC16-3 CAR表达的流式细胞术数据。如图6所示，根据用于构建CAR分子的间隔区，观察到基因转移后一天不同程度的MUC16 CAR表达。根据用于构建CAR分子的间隔区，在将CAR+T细胞与MUC16t+AaPC系在体外共培养后，观察到基因转移后8天不同程度的CAR+T细胞的富集。
表7.在图6中使用的MUC16 CAR构建体
Figure BDA0002934516290001061
实施例4.Western印迹法
通过在含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀测定中重悬细胞沉淀物来生成T细胞裂解物。从细胞提取物中分离出澄清的裂解物，并冷冻保存。进行二辛可宁酸(BCA)测定，以确定总蛋白质浓度并用于样品间的归一化。通过还原条件下的电泳分析总共10μg蛋白质样品。将凝胶中的蛋白质材料转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将转移的蛋白质膜封闭，然后在摇动平台上与第一抗体——小鼠抗人CD3ζ或抗IL-15抗体一起孵育。在添加适当的辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体之前，洗涤该膜。使用化学发光(ECL)检测准备印迹。Western印迹的图像在FluorChemTM E Imager系统上捕获。
为了检测HER1t1，进行了免疫沉淀方法，随后进行Western印迹分析。分析了另外的对照，其包括A431细胞裂解物(阳性对照)和免疫沉淀对照(无裂解物的免疫沉淀；阴性对照)。将凝胶中的蛋白质物质转移到PVDF膜上。将转移的蛋白质膜封闭，然后与第一抗体——小鼠抗人EGFR抗体一起孵育。在添加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠抗体之前，洗涤该膜。Western印迹的图像在FluorChemTM E成像仪上捕获。
图7-9显示了使用MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞和MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞裂解物的Western印迹图像。如图7所示，在MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞和MUC16-3CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞裂解物中均检测到MUC16-3 CAR条带。还检测到较低分子量的天然CD3ζ条带，如CAR-T细胞裂解液所预期的。如图8所示，仅在共表达mbIL15的MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞的裂解物中检测到mbIL15蛋白表达(图8)。图9显示了MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞和MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞中预期分子量约为40kDa的HER1t1的表达。总之，这些数据证明，可以使用SB系统生成表达MUC16 CAR、mbIL15和HER1t的T细胞。
实施例5.MUC16-3 CAR-T细胞的细胞毒性
使用发光细胞活力测定确定T细胞的细胞毒活性。使用如上所述生成的CAR+ T细胞评估MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1细胞的特异性细胞毒性。评估MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1、对照MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞和非MUC16对照CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞的MUC16 CAR、HER1t1和mbIL-15表达。根据HER1t1的表达鉴定效应CAR-T细胞。用卵巢细胞系——异位表达MUC16t的SKVO3(SKOV3-MUC16t)，不表达MUC16的SKVO3亲本系，自然表达MUC16的OVCAR3，和MUC16阴性细胞系A549，来评价不同的效:靶(E:T)比。将来自细胞培养物的上清液在-80℃下保存，直至细胞因子分析。使用下式确定细胞毒性百分比：
Figure BDA0002934516290001081
通过比较不同E:T比的各肿瘤细胞系的细胞毒活性，证明了由三个健康供体T细胞生成的MUC16-3 CAR-T细胞对表达MUC16的肿瘤靶标的特异性细胞毒性。表达对照CAR的CAR-T细胞用作阴性对照。图10A显示了MUC16t仅由SKOV3-MUC16t肿瘤细胞表达。将效应物CAR-T细胞(基于HER1t1细胞表达进行归一化)与靶肿瘤细胞以不同的E:T比共培养。如图10B所示，MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞(缺少mbIL15)和MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1均显示出对SKOV3-MUC16t和OVCAR3肿瘤细胞系的类似的剂量依赖性细胞毒性。然而，只有MUC16-3CAR-mbIL15-HER1t1在较高的E:T比时杀死OVCAR3。MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1对OVCAR3细胞的选择性杀伤提示修饰的T细胞中T细胞的活化增强。未从仅有标记的靶细胞的培养物中检测到背景信号。此外，MUC16特异性CAR-T细胞没有杀死MUC16t阴性肿瘤细胞系(SKOV3和A549)，并且用对照CAR-mbIL15-HER1t T细胞没有观察到任何肿瘤细胞系的杀死。综上，这些结果表明，MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1特异性介导了表达MUC 16的肿瘤细胞系的杀伤。
实施例6.MUC16-3 CAR-T细胞的细胞因子产生
使用针对包括IFNγ和粒酶B在内的细胞因子产生的定制多分析试剂盒，筛选来自实施例5的细胞毒性测定的培养上清液。
通过检查与表达MUC16和不表达MUC16的以及表达MUC16的肿瘤细胞系共培养后的细胞因子分泌，进一步研究了MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞(缺少mbIL15)和MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞对表达MUC16的肿瘤细胞的重定向特异性。在这些研究中，在与肿瘤细胞系共培养后，以1:1的E:T细胞比评估了来自3个不同供体的MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞的细胞因子产生。如图11所示，仅在表达MUC16t的肿瘤细胞系中观察到促炎细胞因子水平升高。此外，与测试不含mbIL15的MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞后观察到的水平相比，在MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T中mbIL15的表达导致低细胞因子产生。这些数据表明，MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞对表达MUC16的肿瘤细胞表现出特异性的细胞毒性功能，并表明mbIL15的共表达可以减少促炎细胞因子的产生，而不会损害MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1的细胞毒性作用。
实施例7.MUC16 CAR-T细胞的特异性
使用萤光素酶测定确定T细胞的细胞毒活性。通过将SB系统质粒电穿孔到两个健康供体的T细胞(D326782和D132552)中，产生了MUC16 CAR-T细胞(表8)以及对照CAR-T细胞，并如实施例1所述，通过与AaPC的离体共培养进行数量上的扩充。在一式三份的孔中使用SKOV3-MUC16t、OVCAR3和MUC16阴性A549细胞系作为靶细胞，以不同的E:T比评估细胞毒性。使用如先前所述的公式确定细胞毒性百分比。
表8.在图12中使用的MUC16 CAR构建体
Figure BDA0002934516290001091
如图12所示，共表达mbIL15和HER1t1的MUC16 CAR-T细胞以浓度依赖性方式表现出对MUC16+肿瘤细胞系的特异性细胞毒性。测试的MUC16 CAR-T细胞均未显示对MUC16阴性肿瘤细胞系A549的明显细胞毒性。与所示从健康供体T细胞产生的CAR-T细胞中的CD8a间隔区相比，具有CD8a(2x)间隔区的MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1细胞表现出更高的对MUC16+肿瘤细胞系的特异性细胞毒性。
实施例8.表达mbIL15的MUC16 CAR-T细胞的持久性和自主增殖的缺乏
为了评估mbIL15对CAR-T细胞持久性的影响，将MUC16-3 CAR--HER1t1 T和MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞用CellTraceTM Violet标记，并与自体PBMC共培养。将共培养物保持14天。在细胞培养期间，评估细胞样品以测量活力，并进行流式细胞术染色以评估CAR T细胞和记忆表型。通过稀释染料确定增殖。
细胞持久性评估显示，两周后，MUC16-3 CAR-HER1t(缺少mbIL15)在培养中未能持续，并且在第14天，在缺乏细胞因子的培养物中仅检测到MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞(图13A)，这表明mbIL15在改善CAR-T细胞持久性中的作用。对自主增殖潜力的评估表明，尽管在第14天检测到MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞，但它们不能进行增殖，子细胞的缺失证明了这一点(图13B)。此外，与第-1天相比，在第14天，持久的MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞显示出记忆样或静止状态样T细胞群体的富集，如根据较高的CD45RA+/CD45RO+细胞水平所确定的(图13C)。
通过将SB系统质粒电穿孔到三个健康供体的T细胞中，生成了MUC16-2 CAR-HER1t1 T细胞(缺少mbIL15表达)和MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞。通过每周用AaPC刺激对CAR-T细胞进行数量上的离体扩充。将CAR-T细胞在无外源细胞因子的培养基中培养2周。计算培养物中活T细胞占起始细胞数的分数，以显示持久性。
如图14所示，表达mbIL15的MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞可在撤出细胞因子后第15天在离体培养物中保持，而缺乏mbIL15表达的MUC16-2 CAR-HER1t1 T细胞在不存在细胞因子的情况下则无法存活超过7天。
这些数据显示，当mbIL15与CAR共表达时，MUC16 CAR-T细胞的持久性得到改善。
实施例9.ADCC测定
在ADCC测定中使用自体自然杀伤(NK)细胞作为效应细胞。在该测定中，使用离体扩充的MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1细胞用作靶细胞。在10μg/mL西妥昔单抗或利妥昔单抗的存在下或在没有抗体的情况下，将效应细胞和靶细胞共培养物设置为10:1的E:T比。在共培养后使用流式细胞术评估活力。为了确定CAR+ T细胞的％ADCC，通过与起始CAR+T细胞群体比较来确定标记的CD3+细胞的损失分数。
图15表明，当将西妥昔单抗加入培养物中时，通过ADCC有效地消除了从三个不同健康供体的T细胞生成的MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞。向培养物中添加抗CD20利妥昔单抗(非特异性对照)显示出低细胞毒性背景水平，证明西妥昔单抗介导的CAR-T细胞的ADCC具有特异性。显示的数据是平均值+/-SEM。
实施例10.MUC16-2 CAR-T细胞在卵巢癌体内模型中的功能评价
将SKOV3-fLUC-MUC16腹膜内施用到NSG小鼠中(第0天)。在第6天，将通过IVIS成像确认已建立肿瘤负荷的小鼠随机分组(每组n＝5-7只小鼠)，以接受单次腹膜内注射：盐水(HBSS)，MUC16-2 CAR-HER1t1 T细胞(2x106个细胞/小鼠)，MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞(2x106个细胞/小鼠)，或单次静脉内注射MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞(2x106个细胞/小鼠)。通过在CAR-T细胞给予后每3-4天进行体内生物发光(IVIS)成像以评估肿瘤负荷，评价对肿瘤生长的有效性。在CAR T细胞施用后每周至少2-3次，通过评估体重和在整个研究期间进行的临床观察，评价总体安全性。
如图16所示，单次腹膜内或静脉内注射MUC16-2 CAR-T细胞可有效消除了小鼠中的SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤。与腹膜内输注相比，静脉内注射的CAR-T细胞的抗肿瘤反应被延迟。
实施例11.MUC16-3 CAR-T细胞在卵巢癌体内模型中的功能评价
在第0天将SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤细胞腹膜内施用到NSG小鼠中。在第5天，将建立有肿瘤负荷(通过IVIS成像确认)的小鼠随机分组(每组n＝5-7只小鼠)，以接受单次腹膜内注射：盐水(HBSS)，MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞(2x106个细胞/小鼠)，或MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞(2x106个细胞/小鼠)。通过在CAR-T细胞给予后每3-4天进行体内生物发光(IVIS)成像以评估肿瘤负荷，评价对肿瘤生长的有效性。每周一次收集EDTA中的全血样品，并进行多参数流式细胞术，以评价MUC16 CAR T细胞的持久性、扩充并确定不同的T细胞亚组。分析血浆样品中的人细胞因子作为T细胞活性的指标。在CAR T细胞施用后每周至少2-3次，通过评估体重和在整个研究期间进行的临床观察，评价总体安全性。
如图17所示，与盐水对照处理组相比，向荷有表达MUC16的SKOV-3肿瘤的NSG小鼠腹膜内施用MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞导致肿瘤负荷显著降低(总通量值降低>3log)。与缺乏mbIL15表达的MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞相比，MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞中mbIL15的共表达导致显著更高的肿瘤负荷减少。
MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞在体内显示出增强的持久性和扩充，这得到以下结果的证明：与MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞相比，血液中表达HER1t1的T细胞数目增加。此外，CD4+和CD8+CAR-T细胞均表现出体内扩充和持久性。参见图18A-B。
实施例12.MUC16 CAR-T细胞在卵巢癌体内模型中的剂量反应
在第0天将SKOV3-fLUC-MUC16腹膜内施用到NSG小鼠中。在第6天，将已建立肿瘤负荷(通过IVIS成像确认)的小鼠随机分组(每组n＝5只小鼠)，以接受单次腹膜内注射：盐水(HBSS)，三种不同剂量的MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞(1x105、5x105或1x106个细胞/小鼠)，和MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞(1x105、5x105或1x106个细胞/小鼠)，或单剂量的MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞(1x106个细胞/小鼠)。MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞、MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞和MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞均来源于单个供体，并在不到2天内制备。通过在CAR-T细胞给予后每3-4天进行体内生物发光(IVIS)成像以评估肿瘤负荷，评价对肿瘤生长的有效性。
如图19-20中所示，MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞和MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞在小鼠中均表现出CAR-T剂量依赖性SKOV3-fLUC-MUC16肿瘤细胞的消除。与1x106个CAR-T细胞/小鼠剂量的缺少mbIL15的MUC16-3 CAR-HER1t1 T细胞相比，即使在1x105个CAR-T细胞/小鼠剂量下，MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T细胞也表现出有效的抗肿瘤反应。
表9.在图19和图20中使用的测试物的描述
组号 测试物
1 盐水(HBSS)
5 MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1(1E05 CAR-T/小鼠)
6 MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1(5E05 CAR-T/小鼠)
7 MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1(1E06 CAR-T/小鼠)
8 MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1(1E05 CAR-T/小鼠)
9 MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1(5E05 CAR-T/小鼠)
10 MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1(1E06 CAR-T/小鼠)
11 MUC16-3 CAR-HER1t1(1E06 CAR-T/小鼠)
实施例13.抗MUC16单克隆抗体的结合亲和力
使用Biacore 3000通过表面等离子体共振(SPR)分析评估了各种抗MUCl6单克隆抗体(mAb)的结合亲和力。通过将各自的轻链和重链质粒瞬时转染到HEK-293细胞中，生成了抗MUC16 mAb。将抗MUC16 mAb的可变区与小鼠恒定链区融合，以生成嵌合的小鼠IgG1mAb。将与人Fc区融合的截短的MUC16固定在传感器芯片CM5上。在溶液相中注入不同浓度的mAb，并使用BIAevaluation分析数据以计算mAb的KD。
表10.三种抗MUC16 mAb的亲和力。
Figure BDA0002934516290001141
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语以及任何缩略词具有与本发明领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
虽然本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本公开内容的情况下现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，本文所述实施方案的各种替代方案，或者此处描述的这些实施方案或方面中的一个或多个的组合，可用于实施本公开内容。旨在以所附权利要求书限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
序列
表11中提供了本文提供的实施方案中包括的某些序列的代表性列表。
表11.示例性序列
Figure BDA0002934516290001151
Figure BDA0002934516290001161
Figure BDA0002934516290001171
Figure BDA0002934516290001181
Figure BDA0002934516290001191
Figure BDA0002934516290001201
Figure BDA0002934516290001211
Figure BDA0002934516290001221
Figure BDA0002934516290001231
Figure BDA0002934516290001241
Figure BDA0002934516290001251
Figure BDA0002934516290001261
Figure BDA0002934516290001271
Figure BDA0002934516290001281
Figure BDA0002934516290001291
Figure BDA0002934516290001301
Figure BDA0002934516290001311
Figure BDA0002934516290001321
Figure BDA0002934516290001331
Figure BDA0002934516290001341
Figure BDA0002934516290001351
Figure BDA0002934516290001361
Figure BDA0002934516290001371
Figure BDA0002934516290001381
Figure BDA0002934516290001391
Figure BDA0002934516290001401
Figure BDA0002934516290001411
Figure BDA0002934516290001421
Figure BDA0002934516290001431
Figure BDA0002934516290001441
Figure BDA0002934516290001451
Figure BDA0002934516290001461
Figure BDA0002934516290001471
Figure BDA0002934516290001481
Figure BDA0002934516290001491
Figure BDA0002934516290001501
Figure BDA0002934516290001511
Figure BDA0002934516290001521
Figure BDA0002934516290001531
Figure BDA0002934516290001541
Figure BDA0002934516290001551
Figure BDA0002934516290001561
Figure BDA0002934516290001571
Figure BDA0002934516290001581
Figure BDA0002934516290001591
Figure BDA0002934516290001601
Figure BDA0002934516290001611
Figure BDA0002934516290001621
Figure BDA0002934516290001631
Figure BDA0002934516290001641
Figure BDA0002934516290001651
Figure BDA0002934516290001661
Figure BDA0002934516290001671
Figure BDA0002934516290001681
Figure BDA0002934516290001691
Figure BDA0002934516290001701
Figure BDA0002934516290001711
Figure BDA0002934516290001721
Figure BDA0002934516290001731
Figure BDA0002934516290001741
Figure BDA0002934516290001751
Figure BDA0002934516290001761
Figure BDA0002934516290001771
Figure BDA0002934516290001781
Figure BDA0002934516290001791
Figure BDA0002934516290001801
Figure BDA0002934516290001811
Figure BDA0002934516290001821
Figure BDA0002934516290001831
Figure BDA0002934516290001841
Figure BDA0002934516290001851
Figure BDA0002934516290001861
Figure BDA0002934516290001871
Figure BDA0002934516290001881
Figure BDA0002934516290001891
Figure BDA0002934516290001901
Figure BDA0002934516290001911
序列表
<110> 英特拉克森公司
<120> MUC16特异性嵌合抗原受体及其用途
<130> 50471-715.601
<140> PCT/US2019/035384
<141> 2019-06-04
<150> 62/680,297
<151> 2018-06-04
<160> 205
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 1
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105 110
Arg
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 2
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
65 70 75 80
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 3
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 4
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr His Leu Gln
65 70 75 80
Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 5
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 6
Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Phe Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu Ile His Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Ala Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Thr Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 8
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu His Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 9
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu Ile His Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Thr Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 10
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 13
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Ala Phe Cys Asp Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 14
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Ala Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 16
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 17
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 17
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys
35 40 45
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
50 55 60
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
65 70 75 80
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
85 90
<210> 18
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 18
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys
35 40 45
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
50 55 60
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala
65 70 75 80
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro
85 90 95
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
100 105 110
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
115 120 125
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
130 135 140
<210> 19
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 19
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
1 5 10 15
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly
20 25 30
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr
35 40 45
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
50 55 60
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
65 70 75 80
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr
85 90 95
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
100 105 110
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
115 120 125
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro
130 135 140
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
145 150 155 160
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
165 170 175
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
180 185
<210> 20
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 20
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
20 25
<210> 21
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 21
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 22
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 22
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 23
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 23
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 24
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 24
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 25
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 25
Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala
1 5 10 15
Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu
20 25 30
Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg
35 40 45
Pro Tyr Tyr Lys
50
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 26
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 27
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 27
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
65 70 75 80
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu
165 170 175
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe
225 230 235 240
Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
290 295 300
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
305 310 315 320
Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
325 330 335
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
340 345 350
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
355 360 365
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
370 375 380
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
385 390 395 400
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
405 410 415
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
420 425 430
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
435 440 445
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
450 455 460
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475
<210> 28
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 28
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
65 70 75 80
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu
165 170 175
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe
225 230 235 240
Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
305 310 315 320
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
325 330 335
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
340 345 350
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
355 360 365
Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
370 375 380
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
385 390 395 400
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
405 410 415
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
420 425 430
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
435 440 445
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
450 455 460
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
465 470 475 480
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
485 490 495
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
500 505 510
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520 525
<210> 29
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 29
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
65 70 75 80
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu
165 170 175
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe
225 230 235 240
Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
305 310 315 320
Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
325 330 335
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
340 345 350
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
370 375 380
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
385 390 395 400
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
405 410 415
His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
420 425 430
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
435 440 445
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
450 455 460
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
465 470 475 480
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
485 490 495
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
500 505 510
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
515 520 525
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
530 535 540
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
545 550 555 560
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
565 570
<210> 30
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 30
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Val Asn Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Arg Asp Ile Asn Asn Phe Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
130 135 140
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His Tyr
165 170 175
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met
180 185 190
Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
195 200 205
Asn Arg Ile Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu
210 215 220
Lys Phe Asp Phe Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val
225 230 235 240
Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
245 250 255
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
260 265 270
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
275 280 285
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
290 295 300
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
305 310 315 320
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys
325 330 335
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
340 345 350
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
355 360 365
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
370 375 380
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
385 390 395 400
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
405 410 415
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
420 425 430
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
435 440 445
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
450 455 460
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
465 470 475 480
Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 31
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 31
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser
130 135 140
Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser
180 185 190
Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr
195 200 205
Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
275 280 285
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
290 295 300
Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
305 310 315 320
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
325 330 335
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
340 345 350
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
355 360 365
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
370 375 380
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
385 390 395 400
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
405 410 415
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
420 425 430
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
435 440 445
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 32
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 32
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser
130 135 140
Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser
180 185 190
Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr
195 200 205
Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340 345 350
Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
355 360 365
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
370 375 380
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 33
<211> 557
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 33
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser
130 135 140
Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser
180 185 190
Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr
195 200 205
Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
325 330 335
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
340 345 350
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
355 360 365
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
370 375 380
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
385 390 395 400
His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
405 410 415
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
420 425 430
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
435 440 445
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
450 455 460
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
465 470 475 480
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
485 490 495
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
500 505 510
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
515 520 525
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
530 535 540
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550 555
<210> 34
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 34
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
65 70 75 80
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu
165 170 175
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe
225 230 235 240
Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
290 295 300
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
305 310 315 320
Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp
325 330 335
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
340 345 350
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
355 360 365
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
370 375 380
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
385 390 395 400
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
405 410 415
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
420 425 430
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
435 440 445
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
450 455 460
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475
<210> 35
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 35
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
65 70 75 80
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu
165 170 175
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe
225 230 235 240
Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
305 310 315 320
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
325 330 335
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
340 345 350
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
355 360 365
Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr
370 375 380
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385 390 395 400
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
405 410 415
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
420 425 430
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
435 440 445
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
450 455 460
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
465 470 475 480
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
485 490 495
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
500 505 510
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520 525
<210> 36
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 36
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
65 70 75 80
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu
165 170 175
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe
225 230 235 240
Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
305 310 315 320
Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
325 330 335
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
340 345 350
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
370 375 380
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
385 390 395 400
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
405 410 415
His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met
420 425 430
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
435 440 445
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
450 455 460
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
465 470 475 480
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
485 490 495
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
545 550 555 560
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
565 570
<210> 37
<211> 520
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 37
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
65 70 75 80
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu
165 170 175
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe
225 230 235 240
Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
290 295 300
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
305 310 315 320
Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp
325 330 335
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340 345 350
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg
355 360 365
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
420 425 430
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
485 490 495
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
500 505 510
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520
<210> 38
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 38
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
65 70 75 80
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu
165 170 175
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe
225 230 235 240
Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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325 330 335
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Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
355 360 365
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385 390 395 400
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
450 455 460
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
465 470 475 480
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
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500 505 510
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Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
545 550 555 560
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
565
<210> 39
<211> 614
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 39
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
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Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
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Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
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Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu
165 170 175
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
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195 200 205
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Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
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260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
370 375 380
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
610
<210> 40
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 40
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
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225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
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260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
290 295 300
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
305 310 315 320
Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp
325 330 335
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
340 345 350
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
355 360 365
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
370 375 380
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
385 390 395 400
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
405 410 415
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
420 425 430
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
435 440 445
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
450 455 460
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475
<210> 41
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 41
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
195 200 205
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
305 310 315 320
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
325 330 335
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
340 345 350
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
355 360 365
Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr
370 375 380
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
385 390 395 400
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
405 410 415
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
420 425 430
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
435 440 445
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
450 455 460
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
465 470 475 480
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
485 490 495
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
500 505 510
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520 525
<210> 42
<211> 403
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 42
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
195 200 205
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Ser Lys Arg Ser Arg
245 250 255
Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
260 265 270
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
275 280 285
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
290 295 300
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
305 310 315 320
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
325 330 335
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
340 345 350
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
355 360 365
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
370 375 380
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
385 390 395 400
Pro Pro Arg
<210> 43
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 43
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
195 200 205
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Ser Lys Arg Ser Arg
245 250 255
Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
260 265 270
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
275 280 285
Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
290 295 300
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
305 310 315 320
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
325 330 335
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
340 345 350
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
355 360 365
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
370 375 380
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
385 390 395 400
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
405 410 415
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
420 425 430
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
435 440 445
<210> 44
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 44
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
195 200 205
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
305 310 315 320
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
325 330 335
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
340 345 350
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
355 360 365
Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr
370 375 380
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
385 390 395 400
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly
405 410 415
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
420 425 430
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
435 440 445
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
450 455 460
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
465 470 475 480
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
485 490 495
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
500 505 510
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
515 520 525
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
530 535 540
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
545 550 555 560
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
565
<210> 45
<211> 614
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 45
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Val Gln
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu
195 200 205
Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
305 310 315 320
Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
325 330 335
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
340 345 350
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
370 375 380
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
385 390 395 400
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
405 410 415
His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met
420 425 430
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
435 440 445
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg
450 455 460
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
465 470 475 480
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
485 490 495
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
500 505 510
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
515 520 525
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
530 535 540
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
545 550 555 560
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
565 570 575
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
580 585 590
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
595 600 605
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
610
<210> 46
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 46
Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
130 135 140
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
145 150 155 160
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
165 170 175
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
195 200 205
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
210 215 220
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
275 280 285
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
290 295 300
Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp
305 310 315 320
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
325 330 335
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
340 345 350
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
355 360 365
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
370 375 380
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
385 390 395 400
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
405 410 415
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
420 425 430
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
435 440 445
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 47
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 47
Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
130 135 140
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
145 150 155 160
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
165 170 175
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
195 200 205
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
210 215 220
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340 345 350
Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr
355 360 365
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
370 375 380
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
385 390 395 400
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
420 425 430
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
435 440 445
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
450 455 460
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
465 470 475 480
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
485 490 495
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 48
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 48
Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
130 135 140
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
145 150 155 160
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
165 170 175
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
195 200 205
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
210 215 220
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
325 330 335
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
340 345 350
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
355 360 365
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
370 375 380
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
385 390 395 400
His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met
405 410 415
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
420 425 430
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
435 440 445
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
450 455 460
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
465 470 475 480
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
485 490 495
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
500 505 510
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
515 520 525
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
530 535 540
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550 555
<210> 49
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 49
Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
130 135 140
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
145 150 155 160
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
165 170 175
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
195 200 205
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
210 215 220
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
275 280 285
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
290 295 300
Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp
305 310 315 320
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
325 330 335
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg
340 345 350
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
355 360 365
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
370 375 380
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
385 390 395 400
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
420 425 430
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
435 440 445
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
450 455 460
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
465 470 475 480
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
485 490 495
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 50
<211> 551
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 50
Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
130 135 140
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
145 150 155 160
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
165 170 175
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
195 200 205
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
210 215 220
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340 345 350
Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr
355 360 365
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
370 375 380
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly
385 390 395 400
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
405 410 415
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
420 425 430
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
435 440 445
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
450 455 460
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
465 470 475 480
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
485 490 495
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
500 505 510
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
515 520 525
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
530 535 540
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550
<210> 51
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 51
Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
130 135 140
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
145 150 155 160
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
165 170 175
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
195 200 205
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
210 215 220
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
325 330 335
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
340 345 350
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
355 360 365
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
370 375 380
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
385 390 395 400
His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met
405 410 415
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
420 425 430
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg
435 440 445
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
450 455 460
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
465 470 475 480
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
485 490 495
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
500 505 510
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
515 520 525
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
530 535 540
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
545 550 555 560
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
565 570 575
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
580 585 590
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
595
<210> 52
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 52
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser
130 135 140
Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser
180 185 190
Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr
195 200 205
Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
275 280 285
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
290 295 300
Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp
305 310 315 320
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
325 330 335
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
340 345 350
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
355 360 365
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
370 375 380
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
385 390 395 400
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
405 410 415
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
420 425 430
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
435 440 445
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 53
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 53
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser
130 135 140
Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser
180 185 190
Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr
195 200 205
Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340 345 350
Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr
355 360 365
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
370 375 380
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
385 390 395 400
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
420 425 430
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
435 440 445
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
450 455 460
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
465 470 475 480
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
485 490 495
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 54
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 54
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser
130 135 140
Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser
180 185 190
Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr
195 200 205
Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
325 330 335
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
340 345 350
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
355 360 365
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
370 375 380
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
385 390 395 400
His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met
405 410 415
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
420 425 430
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
435 440 445
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
450 455 460
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
465 470 475 480
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
485 490 495
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
500 505 510
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
515 520 525
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
530 535 540
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550 555
<210> 55
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 55
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser
130 135 140
Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser
180 185 190
Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr
195 200 205
Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
275 280 285
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
290 295 300
Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp
305 310 315 320
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
325 330 335
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg
340 345 350
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
355 360 365
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
370 375 380
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
385 390 395 400
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
420 425 430
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
435 440 445
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
450 455 460
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
465 470 475 480
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
485 490 495
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 56
<211> 551
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 56
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser
130 135 140
Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser
180 185 190
Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr
195 200 205
Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340 345 350
Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr
355 360 365
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
370 375 380
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly
385 390 395 400
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
405 410 415
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
420 425 430
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
435 440 445
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
450 455 460
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
465 470 475 480
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
485 490 495
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
500 505 510
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
515 520 525
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
530 535 540
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550
<210> 57
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 57
Asp Ile Lys Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Val Asn Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser
130 135 140
Val Thr Gly Tyr Ser Ile Val Ser His Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Ser
180 185 190
Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Phe Asp Phe Val Thr
195 200 205
Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Val Asp Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro
225 230 235 240
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
245 250 255
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
260 265 270
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
325 330 335
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
340 345 350
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
355 360 365
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
370 375 380
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
385 390 395 400
His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met
405 410 415
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
420 425 430
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg
435 440 445
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
450 455 460
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
465 470 475 480
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
485 490 495
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
500 505 510
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
515 520 525
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
530 535 540
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
545 550 555 560
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
565 570 575
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
580 585 590
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
595
<210> 58
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 58
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 59
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 59
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly
20
<210> 60
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 60
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser
<210> 61
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 61
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 62
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 62
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Ala
20
<210> 63
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 63
Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser
20
<210> 64
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 64
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala
20 25
<210> 65
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 65
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 66
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 66
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
210 215 220
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
225 230 235 240
Lys Arg Ser
<210> 67
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 67
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 68
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 68
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu
260
<210> 69
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 69
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp
20 25 30
Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp
35 40 45
Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu
50 55 60
Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr
65 70 75 80
Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly
85 90 95
Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys
100 105 110
Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe
115 120 125
Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Ile Thr
145 150 155 160
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
165 170 175
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
180 185 190
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
195 200 205
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
210 215 220
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu
245 250 255
Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala
260 265 270
Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr
275 280 285
Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser
290 295 300
Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln
305 310 315 320
Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile
325 330 335
Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu
340 345 350
Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu
355 360 365
Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg
370 375 380
Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
385 390 395
<210> 70
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 70
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 71
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 71
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr
100 105 110
Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro
115 120 125
Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr
130 135 140
Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser
145 150 155 160
His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val
165 170 175
Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser
180 185 190
Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser
195 200 205
Val Glu Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser
210 215 220
Ser Arg Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
225 230 235
<210> 72
<211> 18
<212> PRT
<213> Thosea asigna病毒
<400> 72
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 73
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 73
Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 74
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 74
Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 75
<211> 19
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒1
<400> 75
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 76
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 76
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 77
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 77
Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
1 5 10 15
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25 30
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> 马鼻炎A病毒
<400> 78
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 79
<211> 22
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 79
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 80
Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly
1 5
<210> 81
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 81
Arg Ala Lys Arg
1
<210> 82
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 82
Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu
1 5 10 15
Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 83
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 84
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 84
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 85
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 85
Gly Ser Gly
1
<210> 86
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 86
Ser Gly Ser Gly
1
<210> 87
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 87
Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala
20 25 30
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser
35 40 45
Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu
50 55 60
Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly
65 70 75 80
Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
85
<210> 88
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 88
Glu Met Pro Val Asp Arg Ile Leu Glu Ala Glu Leu Ala Val Glu Gln
1 5 10 15
Lys Ser Asp Gln Gly Val Glu Gly Pro Gly Gly Thr Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Ser Ser Pro Asn Asp Pro Val Thr Asn Ile Cys Gln Ala Ala Asp Lys
35 40 45
Gln Leu Phe Thr Leu Val Glu Trp Ala Lys Arg Ile Pro His Phe Ser
50 55 60
Ser Leu Pro Leu Asp Asp Gln Val Ile Leu Leu Arg Ala Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Leu Leu Ile Ala Ser Phe Ser His Arg Ser Ile Asp Val Arg Asp
85 90 95
Gly Ile Leu Leu Ala Thr Gly Leu His Val His Arg Asn Ser Ala His
100 105 110
Ser Ala Gly Val Gly Ala Ile Phe Asp Arg Val Leu Thr Glu Leu Val
115 120 125
Ser Lys Met Arg Asp Met Arg Met Asp Lys Thr Glu Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Arg Ala Ile Ile Leu Phe Asn Pro Glu Val Arg Gly Leu Lys Ser Ala
145 150 155 160
Gln Glu Val Glu Leu Leu Arg Glu Lys Val Tyr Ala Ala Leu Glu Glu
165 170 175
Tyr Thr Arg Thr Thr His Pro Asp Glu Pro Gly Arg Phe Ala Lys Leu
180 185 190
Leu Leu Arg Leu Pro Ser Leu Arg Ser Ile Gly Leu Lys Cys Leu Glu
195 200 205
His Leu Phe Phe Phe Arg Leu Ile Gly Asp Val Pro Ile Asp Thr Phe
210 215 220
Leu Met Glu Met Leu Glu Ser Pro Ser Asp Ser
225 230 235
<210> 89
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 89
Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala
20 25 30
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser
35 40 45
Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu
50 55 60
Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly
65 70 75 80
Ile Asp Glu Tyr Gly Gly Glu Phe Glu Met Pro Val Asp Arg Ile Leu
85 90 95
Glu Ala Glu Leu Ala Val Glu Gln Lys Ser Asp Gln Gly Val Glu Gly
100 105 110
Pro Gly Gly Thr Gly Gly Ser Gly Ser Ser Pro Asn Asp Pro Val Thr
115 120 125
Asn Ile Cys Gln Ala Ala Asp Lys Gln Leu Phe Thr Leu Val Glu Trp
130 135 140
Ala Lys Arg Ile Pro His Phe Ser Ser Leu Pro Leu Asp Asp Gln Val
145 150 155 160
Ile Leu Leu Arg Ala Gly Trp Asn Glu Leu Leu Ile Ala Ser Phe Ser
165 170 175
His Arg Ser Ile Asp Val Arg Asp Gly Ile Leu Leu Ala Thr Gly Leu
180 185 190
His Val His Arg Asn Ser Ala His Ser Ala Gly Val Gly Ala Ile Phe
195 200 205
Asp Arg Val Leu Thr Glu Leu Val Ser Lys Met Arg Asp Met Arg Met
210 215 220
Asp Lys Thr Glu Leu Gly Cys Leu Arg Ala Ile Ile Leu Phe Asn Pro
225 230 235 240
Glu Val Arg Gly Leu Lys Ser Ala Gln Glu Val Glu Leu Leu Arg Glu
245 250 255
Lys Val Tyr Ala Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Arg Thr Thr His Pro Asp
260 265 270
Glu Pro Gly Arg Phe Ala Lys Leu Leu Leu Arg Leu Pro Ser Leu Arg
275 280 285
Ser Ile Gly Leu Lys Cys Leu Glu His Leu Phe Phe Phe Arg Leu Ile
290 295 300
Gly Asp Val Pro Ile Asp Thr Phe Leu Met Glu Met Leu Glu Ser Pro
305 310 315 320
Ser Asp Ser
<210> 90
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 90
Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu
1 5 10 15
Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu
20 25 30
Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro
35 40 45
Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu
50 55 60
Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile
65 70 75 80
Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu
85 90 95
Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala
100 105 110
Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser
115 120 125
Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu
130 135 140
Thr Val Ser Pro Glu Phe
145 150
<210> 91
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 91
Ile Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu Thr Gln Cys Ala Met Lys Arg
1 5 10 15
Lys Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu Lys Asp Lys Leu Pro Val Ser Thr
20 25 30
Thr Thr Val Asp Asp His Met Pro Pro Ile Met Gln Cys Glu Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Glu Ala Ala Arg Ile His Glu Val Val Pro Arg Phe Leu Ser
50 55 60
Asp Lys Leu Leu Val Thr Asn Arg Gln Lys Asn Ile Pro Gln Leu Thr
65 70 75 80
Ala Asn Gln Gln Phe Leu Ile Ala Arg Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly
85 90 95
Tyr Glu Gln Pro Ser Asp Glu Asp Leu Lys Arg Ile Thr Gln Thr Trp
100 105 110
Gln Gln Ala Asp Asp Glu Asn Glu Glu Ser Asp Thr Pro Phe Arg Gln
115 120 125
Ile Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala
130 135 140
Lys Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Ile Ser Gln Pro Asp Gln Ile Thr
145 150 155 160
Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Val Ala Arg
165 170 175
Arg Tyr Asp Ala Ala Ser Asp Ser Ile Leu Phe Ala Asn Asn Gln Ala
180 185 190
Tyr Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys Ala Gly Met Ala Glu Val Ile Glu
195 200 205
Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Cys Met Tyr Ser Met Ala Leu Asp Asn
210 215 220
Ile His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Val Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro
225 230 235 240
Gly Leu Glu Gln Pro Gln Leu Val Glu Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Leu
245 250 255
Asn Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Gln Leu Ser Gly Ser Ala Arg
260 265 270
Ser Ser Val Ile Tyr Gly Lys Ile Leu Ser Ile Leu Ser Glu Leu Arg
275 280 285
Thr Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn Met Cys Ile Ser Leu Lys Leu Lys
290 295 300
Asn Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val Ala Asp
305 310 315 320
Met Ser His Thr Gln Pro Pro Pro Ile Leu Glu Ser Pro Thr Asn Leu
325 330 335
<210> 92
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 92
Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu Thr Gln Cys Ala Met Lys Arg Lys
1 5 10 15
Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu Lys Asp Lys Leu Pro Val Ser Thr Thr
20 25 30
Thr Val Asp Asp His Met Pro Pro Ile Met Gln Cys Glu Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Glu Ala Ala Arg Ile His Glu Val Val Pro Arg Phe Leu Ser Asp
50 55 60
Lys Leu Leu Val Thr Asn Arg Gln Lys Asn Ile Pro Gln Leu Thr Ala
65 70 75 80
Asn Gln Gln Phe Leu Ile Ala Arg Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly Tyr
85 90 95
Glu Gln Pro Ser Asp Glu Asp Leu Lys Arg Ile Thr Gln Thr Trp Gln
100 105 110
Gln Ala Asp Asp Glu Asn Glu Glu Ser Asp Thr Pro Phe Arg Gln Ile
115 120 125
Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys
130 135 140
Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Ile Ser Gln Pro Asp Gln Ile Thr Leu
145 150 155 160
Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Val Ala Arg Arg
165 170 175
Tyr Asp Ala Ala Ser Asp Ser Ile Leu Phe Ala Asn Asn Gln Ala Tyr
180 185 190
Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys Ala Gly Met Ala Glu Val Ile Glu Asp
195 200 205
Leu Leu His Phe Cys Arg Cys Met Tyr Ser Met Ala Leu Asp Asn Ile
210 215 220
His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Val Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly
225 230 235 240
Leu Glu Gln Pro Gln Leu Val Glu Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Leu Asn
245 250 255
Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Gln Leu Ser Gly Ser Ala Arg Ser
260 265 270
Ser Val Ile Tyr Gly Lys Ile Leu Ser Ile Leu Ser Glu Leu Arg Thr
275 280 285
Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn Met Cys Ile Ser Leu Lys Leu Lys Asn
290 295 300
Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val Ala Asp Met
305 310 315 320
Ser His Thr Gln Pro Pro Pro Ile Leu Glu Ser Pro Thr Asn Leu
325 330 335
<210> 93
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 93
Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu
1 5 10 15
Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu
20 25 30
Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro
35 40 45
Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu
50 55 60
Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile
65 70 75 80
Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu
85 90 95
Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala
100 105 110
Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser
115 120 125
Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu
130 135 140
Thr Val Ser Pro Glu Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Cys Val Val Pro
145 150 155 160
Glu Thr Gln Cys Ala Met Lys Arg Lys Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu
165 170 175
Lys Asp Lys Leu Pro Val Ser Thr Thr Thr Val Asp Asp His Met Pro
180 185 190
Pro Ile Met Gln Cys Glu Pro Pro Pro Pro Glu Ala Ala Arg Ile His
195 200 205
Glu Val Val Pro Arg Phe Leu Ser Asp Lys Leu Leu Val Thr Asn Arg
210 215 220
Gln Lys Asn Ile Pro Gln Leu Thr Ala Asn Gln Gln Phe Leu Ile Ala
225 230 235 240
Arg Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Asp Glu Asp
245 250 255
Leu Lys Arg Ile Thr Gln Thr Trp Gln Gln Ala Asp Asp Glu Asn Glu
260 265 270
Glu Ser Asp Thr Pro Phe Arg Gln Ile Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr
275 280 285
Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys
290 295 300
Ile Ser Gln Pro Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu
305 310 315 320
Val Met Met Leu Arg Val Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Ala Ser Asp Ser
325 330 335
Ile Leu Phe Ala Asn Asn Gln Ala Tyr Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys
340 345 350
Ala Gly Met Ala Glu Val Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Cys
355 360 365
Met Tyr Ser Met Ala Leu Asp Asn Ile His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala
370 375 380
Val Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu Glu Gln Pro Gln Leu Val
385 390 395 400
Glu Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Leu Asn Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu
405 410 415
Asn Gln Leu Ser Gly Ser Ala Arg Ser Ser Val Ile Tyr Gly Lys Ile
420 425 430
Leu Ser Ile Leu Ser Glu Leu Arg Thr Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn
435 440 445
Met Cys Ile Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu
450 455 460
Glu Glu Ile Trp Asp Val Ala Asp Met Ser His Thr Gln Pro Pro Pro
465 470 475 480
Ile Leu Glu Ser Pro Thr Asn Leu
485
<210> 94
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 94
Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu
1 5 10 15
Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu
20 25 30
Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro
35 40 45
Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu
50 55 60
Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile
65 70 75 80
Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu
85 90 95
Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala
100 105 110
Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser
115 120 125
Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu
130 135 140
Thr Val Ser Pro Glu Phe Pro Gly Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu
145 150 155 160
Thr Gln Cys Ala Met Lys Arg Lys Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu Lys
165 170 175
Asp Lys Leu Pro Val Ser Thr Thr Thr Val Asp Asp His Met Pro Pro
180 185 190
Ile Met Gln Cys Glu Pro Pro Pro Pro Glu Ala Ala Arg Ile His Glu
195 200 205
Val Val Pro Arg Phe Leu Ser Asp Lys Leu Leu Val Thr Asn Arg Gln
210 215 220
Lys Asn Ile Pro Gln Leu Thr Ala Asn Gln Gln Phe Leu Ile Ala Arg
225 230 235 240
Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Asp Glu Asp Leu
245 250 255
Lys Arg Ile Thr Gln Thr Trp Gln Gln Ala Asp Asp Glu Asn Glu Glu
260 265 270
Ser Asp Thr Pro Phe Arg Gln Ile Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr Val
275 280 285
Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Ile
290 295 300
Ser Gln Pro Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val
305 310 315 320
Met Met Leu Arg Val Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Ala Ser Asp Ser Ile
325 330 335
Leu Phe Ala Asn Asn Gln Ala Tyr Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys Ala
340 345 350
Gly Met Ala Glu Val Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Cys Met
355 360 365
Tyr Ser Met Ala Leu Asp Asn Ile His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Val
370 375 380
Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu Glu Gln Pro Gln Leu Val Glu
385 390 395 400
Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Leu Asn Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn
405 410 415
Gln Leu Ser Gly Ser Ala Arg Ser Ser Val Ile Tyr Gly Lys Ile Leu
420 425 430
Ser Ile Leu Ser Glu Leu Arg Thr Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn Met
435 440 445
Cys Ile Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu Glu
450 455 460
Glu Ile Trp Asp Val Ala Asp Met Ser His Thr Gln Pro Pro Pro Ile
465 470 475 480
Leu Glu Ser Pro Thr Asn Leu
485
<210> 95
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 95
gacatcgagc tgacacagag cccatctagc ctggctgtgt ctgccggcga gaaagtgacc 60
atgagctgca agagcagcca gagcctgctg aacagccgga ccagaaagaa tcagctggcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccaatctcct gagctgctga tctactgggc cagcacaaga 180
cagagcggcg tgcccgatag attcacagga tctggcagcg gcaccgactt caccctgaca 240
atcagttctg tgcaggccga ggacctggcc gtgtactact gtcagcagag ctacaacctg 300
ctgaccttcg gacccggcac caagctggaa gtgaagaga 339
<210> 96
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 96
gtgaagctgc aagagtccgg cggaggcttt gtgaagcctg gcggctctct gaaagtgtcc 60
tgtgccgcca gcggcttcac ctttagcagc tacgccatga gctgggtccg actgagccct 120
gagatgagac tggaatgggt cgccaccatc agtagcgcag gcggctacat cttctacagc 180
gactctgtgc agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cctgcacctc 240
cagatgggca gtctgagaag cggcgatacc gccatgtact actgcgccag acaaggcttc 300
ggcaactacg gcgactacta tgccatggat tactggggcc agggcaccac cgtgacagtc 360
tcttct 366
<210> 97
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 97
gacatcgagc tgacacagag cccatctagc ctggctgtgt ctgccggcga gaaagtgacc 60
atgagctgca agagcagcca gagcctgctg aacagccgga ccagaaagaa tcagctggcc 120
tggtatcagc agaaaaccgg acagagcccc gagctgctga tctactgggc cagcacaaga 180
cagagcggcg tgcccgatag attcacagga tctggcagcg gcaccgactt caccctgaca 240
atcagttctg tgcaggccga ggacctggcc gtgtactact gtcagcagag ctacaacctg 300
ctgaccttcg gacccggcac caagctggaa atcaagaga 339
<210> 98
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 98
gtgaagctgg aagagtccgg cggaggcttt gtgaagcctg gcggaagcct gaagatcagc 60
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagaaac tacgccatga gctgggtccg actgagcccc 120
gagatgagac tggaatgggt cgccacaatc agcagcgcag gcggctacat cttctacagc 180
gatagcgtgc agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cctgcacctc 240
cagatgggca gtctgagatc tggcgacacc gccatgtact actgcgccag acaaggcttc 300
ggcaactacg gcgactacta tgccatggat tactggggcc agggcaccac cgtgacagtc 360
tcttct 366
<210> 99
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 99
gacatcaaga tggctcagtc cccttctagc gtgaatgctt cgctagggga gcgtgtgacc 60
atcacatgta aagcatcacg cgacataaat aatttccttt cctggtttca tcagaaaccg 120
ggcaagtcgc ctaagacgct gatttacaga gcaaatcggt tggtagatgg agtgccaagc 180
agattcagcg ggagcggaag tggacaggat tatagcttca ctatttcatc cctggaatac 240
gaggacgtag gtatctatta ttgcctccag tatggcgatc tttacacatt tggtgggggg 300
actaagctgg agattaag 318
<210> 100
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 100
gacgtgcaac ttctggagag cgggccaggg ctagtcaggc cctcccagtc gctttcactg 60
acttgcagtg tgaccggtta ctctattgtg agtcactact attggaactg gattcggcag 120
ttcccaggca acaaactgga atggatgggg tacatatctt ccgatggctc gaatgaatat 180
aacccatcat tgaaaaatcg tatttccatc agtctggata cgagtaaaaa ccagtttttc 240
ctcaaattcg atttcgtgac tacagcagat actgccacat acttctgtgt acgaggtgtc 300
gattattggg gacagggcac aacgctgacc gtaagttct 339
<210> 101
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 101
gacatccaga tgacccagag cagcagcttc ctgagcgtgt cccttggcgg cagagtgacc 60
atcacctgta aagccagcga cctgatccac aactggctgg cctggtatca gcagaagcct 120
ggcaacgctc ccagactgct gattagcggc gccacctctc tggaaacagg cgtgccaagc 180
agattttccg gcagcggctc cggcaacgac tacacactgt ctattgccag cctgcagacc 240
gaggatgccg ccacctatta ctgccagcag tactggacca cacctttcac ctttggcagc 300
ggcaccaagc tggaaatcaa g 321
<210> 102
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 102
gacgttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaatc ctagccagag cctgagcctg 60
acatgtaccg tgaccggcta cagcatcacc aacgactacg cctggaactg gatcagacag 120
ttccccggca acaagctgga atggatgggc tacatcaact acagcggcta caccacctac 180
aatcccagcc tgaagtcccg gatctccatc accagagaca ccagcaagaa ccagttcttc 240
ctgcacctga acagcgtgac caccgaggat accgccacct actactgcgc tagatgggat 300
ggcggcctga catattgggg ccagggaaca ctggtcaccg tgtctgct 348
<210> 103
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 103
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca aggccagcga cctgatccac aactggctgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatcagcggc gccaccagcc tggagaccgg cgtgcccagc 180
aggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactggacca cccccttcac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gagg 324
<210> 104
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 104
gacatcgtgc tgacacagag ccctgccatc atgtctgcca gcctcggcga gcgagtgacc 60
atgacatgta cagccagcag cagcgtgtcc agcagctacc tgcattggta tcagcagaag 120
cccggcagca gccccaagct gtggatctac agcacaagca atctggccag cggcgtgcca 180
ggcagatttt ctggttctgg cagcggcacc agctacagcc tgacaatcag cagcatggaa 240
gccgaggatg ccgccaccta ctactgccac cagtaccaca gaagccccta cacctttggc 300
ggaggcacca aggtggaaat caagcgg 327
<210> 105
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 105
gaggttcagc tgcagcagtc tggcgccgaa cttgtgaaac ctggcgcctc tgtgaagctg 60
agctgtaccg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt caagcagagg 120
cctgagcagg gcctcgaatg gatcggaaga gtggatcccg ccaacggcaa caccaaatac 180
gaccccaagt tccagggcaa agccacactg accgccgaca cctctagcaa cacagcctac 240
ctgcagctgt ccagcctgac ctctgaagat accgccgtgt acttctgcgt gcgggactac 300
tacggccata cctacggctt cgccttctgc gaccaaggca caaccctgac agtgtctgct 360
<210> 106
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 106
gacatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60
atcacctgta cagccagcag cagcgtgtcc agcagctacc tgcattggta tcagcagaag 120
cccggcaagg cccctaagct gctgatctac agcaccagca atctggccag cggcgtgcca 180
agcagatttt ctggctctgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatatc tagcctgcag 240
cctgaggact tcgccaccta ctactgccac cagtaccaca gaagccccta cacctttggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcgg 327
<210> 107
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 107
gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcttgtgccg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt ccgacaggcc 120
cctggcaaag gacttgagtg ggttggaaga gtggaccccg ccaacggcaa caccaaatac 180
gaccccaagt tccagggcag attcaccatc agcgccgaca ccagcaagaa caccgcctac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgcgt gcgggattac 300
tacggccata cctacggctt cgccttttgg ggccagggca cactggttac cgttagctct 360
<210> 108
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 108
aagcccacca ccacccctgc ccctagacct ccaaccccag cccctacaat cgccagccag 60
cccctgagcc tgaggcccga agcctgtaga cctgccgctg gcggagccgt gcacaccaga 120
ggcctggatt tcgcctgcga c 141
<210> 109
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 109
aaacctacta caactcctgc cccccggcct cctacaccag ctcctactat cgcctcccag 60
ccactcagtc tcagacccga ggcttctagg ccagcggccg gaggcgcggt ccacacccgc 120
gggctggact ttgcatccga taagcccacc accacccctg cccctagacc tccaacccca 180
gcccctacaa tcgccagcca gcccctgagc ctgaggcccg aagcctgtag acctgccgct 240
ggcggagccg tgcacaccag aggcctggat ttcgcctgcg ac 282
<210> 110
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 110
aagcctacca ccacccccgc acctcgtcct ccaacccctg cacctacgat tgccagtcag 60
cctctttcac tgcggcctga ggccagcaga ccagctgccg gcggtgccgt ccatacaaga 120
ggactggact tcgcgtccga taaacctact accactccag ccccaaggcc cccaacccca 180
gcaccgacta tcgcatcaca gcctttgtca ctgcgtcctg aagccagccg gccagctgca 240
gggggggccg tccacacaag gggactcgac tttgcgagtg ataagcccac caccacccct 300
gcccctagac ctccaacccc agcccctaca atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc 360
gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc 420
gac 423
<210> 111
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 111
aagcctacca ccacccccgc acctcgtcct ccaacccctg cacctacgat tgccagtcag 60
cctctttcac tgcggcctga ggccagcaga ccagctgccg gcggtgccgt ccatacaaga 120
ggactggact tcgcgtccga taaacctact accactccag ccccaaggcc cccaacccca 180
gcaccgacta tcgcatcaca gcctttgtca ctgcgtcctg aagccagccg gccagctgca 240
gggggggccg tccacacaag gggactcgac tttgcgagtg ataaacctac tacaactcct 300
gccccccggc ctcctacacc agctcctact atcgcctccc agccactcag tctcagaccc 360
gaggcttcta ggccagcggc cggaggcgcg gtccacaccc gcgggctgga ctttgcatcc 420
gataagccca ccaccacccc tgcccctaga cctccaaccc cagcccctac aatcgccagc 480
cagcccctga gcctgaggcc cgaagcctgt agacctgccg ctggcggagc cgtgcacacc 540
agaggcctgg atttcgcctg cgac 564
<210> 112
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 112
atctacatct gggcccctct ggccggcacc tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtcatc 60
accctgtact gcaaccaccg gaat 84
<210> 113
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 113
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 114
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 114
aagagaggcc ggaagaaact gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60
accacccagg aagaggacgg ctgcagctgc cggttccccg aggaagagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 115
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 115
aggagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc ccggaggcct 60
ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gcccctccca gggacttcgc cgcctaccgg 120
agc 123
<210> 116
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 116
ctgtgcgcac gcccacgccg cagccccgcc caagaagatg gcaaagtcta catcaacatg 60
ccaggcaggg gc 72
<210> 117
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 117
tacttcctgg gccggctggt ccctcggggg cgaggggctg cggaggcagc gacccggaaa 60
cagcgtatca ctgagaccga gtcgccttat caggagctcc agggtcagag gtcggatgtc 120
tacagcgacc tcaacacaca gaggccgtat tacaaa 156
<210> 118
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 118
cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 120
cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
cggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 336
<210> 119
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 119
gtgaagctgg aagagtccgg cggaggcttt gtgaagcctg gcggaagcct gaagatcagc 60
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagaaac tacgccatga gctgggtccg actgagcccc 120
gagatgagac tggaatgggt cgccacaatc agcagcgcag gcggctacat cttctacagc 180
gatagcgtgc agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cctgcacctc 240
cagatgggca gtctgagatc tggcgacacc gccatgtact actgcgccag acaaggcttc 300
ggcaactacg gcgactacta tgccatggat tactggggcc agggcaccac cgtgacagtc 360
tcttctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgacatcgag 420
ctgacacaga gcccatctag cctggctgtg tctgccggcg agaaagtgac catgagctgc 480
aagagcagcc agagcctgct gaacagccgg accagaaaga atcagctggc ctggtatcag 540
cagaaaaccg gacagagccc cgagctgctg atctactggg ccagcacaag acagagcggc 600
gtgcccgata gattcacagg atctggcagc ggcaccgact tcaccctgac aatcagttct 660
gtgcaggccg aggacctggc cgtgtactac tgtcagcaga gctacaacct gctgaccttc 720
ggacccggca ccaagctgga aatcaagaga aagcccacca ccacccctgc ccctagacct 780
ccaaccccag cccctacaat cgccagccag cccctgagcc tgaggcccga agcctgtaga 840
cctgccgctg gcggagccgt gcacaccaga ggcctggatt tcgcctgcga catctacatc 900
tgggcccctc tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtcat caccctgtac 960
tgcaaccacc ggaataagag aggccggaag aaactgctgt acatcttcaa gcagcccttc 1020
atgcggcccg tgcagaccac ccaggaagag gacggctgca gctgccggtt ccccgaggaa 1080
gaggaaggcg gctgcgaact gcgggtgaag ttcagccgga gcgccgacgc ccctgcctac 1140
cagcagggcc agaaccagct gtacaacgag ctgaacctgg gccggaggga ggagtacgac 1200
gtgctggaca agcggagagg ccgggaccct gagatgggcg gcaagccccg gagaaagaac 1260
cctcaggagg gcctgtataa cgaactgcag aaagacaaga tggccgaggc ctacagcgag 1320
atcggcatga agggcgagcg gcggaggggc aagggccacg acggcctgta ccagggcctg 1380
agcaccgcca ccaaggatac ctacgacgcc ctgcacatgc aggccctgcc ccccaga 1437
<210> 120
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 120
gtgaagctgg aagagtccgg cggaggcttt gtgaagcctg gcggaagcct gaagatcagc 60
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagaaac tacgccatga gctgggtccg actgagcccc 120
gagatgagac tggaatgggt cgccacaatc agcagcgcag gcggctacat cttctacagc 180
gatagcgtgc agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cctgcacctc 240
cagatgggca gtctgagatc tggcgacacc gccatgtact actgcgccag acaaggcttc 300
ggcaactacg gcgactacta tgccatggat tactggggcc agggcaccac cgtgacagtc 360
tcttctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgacatcgag 420
ctgacacaga gcccatctag cctggctgtg tctgccggcg agaaagtgac catgagctgc 480
aagagcagcc agagcctgct gaacagccgg accagaaaga atcagctggc ctggtatcag 540
cagaaaaccg gacagagccc cgagctgctg atctactggg ccagcacaag acagagcggc 600
gtgcccgata gattcacagg atctggcagc ggcaccgact tcaccctgac aatcagttct 660
gtgcaggccg aggacctggc cgtgtactac tgtcagcaga gctacaacct gctgaccttc 720
ggacccggca ccaagctgga aatcaagaga aaacctacta caactcctgc cccccggcct 780
cctacaccag ctcctactat cgcctcccag ccactcagtc tcagacccga ggcttctagg 840
ccagcggccg gaggcgcggt ccacacccgc gggctggact ttgcatccga taagcccacc 900
accacccctg cccctagacc tccaacccca gcccctacaa tcgccagcca gcccctgagc 960
ctgaggcccg aagcctgtag acctgccgct ggcggagccg tgcacaccag aggcctggat 1020
ttcgcctgcg acatctacat ctgggcccct ctggccggca cctgtggcgt gctgctgctg 1080
agcctggtca tcaccctgta ctgcaaccac cggaataaga gaggccggaa gaaactgctg 1140
tacatcttca agcagccctt catgcggccc gtgcagacca cccaggaaga ggacggctgc 1200
agctgccggt tccccgagga agaggaaggc ggctgcgaac tgcgggtgaa gttcagccgg 1260
agcgccgacg cccctgccta ccagcagggc cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg 1320
ggccggaggg aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gccgggaccc tgagatgggc 1380
ggcaagcccc ggagaaagaa ccctcaggag ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag 1440
atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgagc ggcggagggg caagggccac 1500
gacggcctgt accagggcct gagcaccgcc accaaggata cctacgacgc cctgcacatg 1560
caggccctgc cccccaga 1578
<210> 121
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 121
gtgaagctgg aagagtccgg cggaggcttt gtgaagcctg gcggaagcct gaagatcagc 60
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagaaac tacgccatga gctgggtccg actgagcccc 120
gagatgagac tggaatgggt cgccacaatc agcagcgcag gcggctacat cttctacagc 180
gatagcgtgc agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cctgcacctc 240
cagatgggca gtctgagatc tggcgacacc gccatgtact actgcgccag acaaggcttc 300
ggcaactacg gcgactacta tgccatggat tactggggcc agggcaccac cgtgacagtc 360
tcttctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgacatcgag 420
ctgacacaga gcccatctag cctggctgtg tctgccggcg agaaagtgac catgagctgc 480
aagagcagcc agagcctgct gaacagccgg accagaaaga atcagctggc ctggtatcag 540
cagaaaaccg gacagagccc cgagctgctg atctactggg ccagcacaag acagagcggc 600
gtgcccgata gattcacagg atctggcagc ggcaccgact tcaccctgac aatcagttct 660
gtgcaggccg aggacctggc cgtgtactac tgtcagcaga gctacaacct gctgaccttc 720
ggacccggca ccaagctgga aatcaagaga aagcctacca ccacccccgc acctcgtcct 780
ccaacccctg cacctacgat tgccagtcag cctctttcac tgcggcctga ggccagcaga 840
ccagctgccg gcggtgccgt ccatacaaga ggactggact tcgcgtccga taaacctact 900
accactccag ccccaaggcc cccaacccca gcaccgacta tcgcatcaca gcctttgtca 960
ctgcgtcctg aagccagccg gccagctgca gggggggccg tccacacaag gggactcgac 1020
tttgcgagtg ataagcccac caccacccct gcccctagac ctccaacccc agcccctaca 1080
atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc 1140
gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc tctggccggc 1200
acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtc atcaccctgt actgcaacca ccggaataag 1260
agaggccgga agaaactgct gtacatcttc aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagacc 1320
acccaggaag aggacggctg cagctgccgg ttccccgagg aagaggaagg cggctgcgaa 1380
ctgcgggtga agttcagccg gagcgccgac gcccctgcct accagcaggg ccagaaccag 1440
ctgtacaacg agctgaacct gggccggagg gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1500
ggccgggacc ctgagatggg cggcaagccc cggagaaaga accctcagga gggcctgtat 1560
aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag 1620
cggcggaggg gcaagggcca cgacggcctg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggat 1680
acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg ccccccaga 1719
<210> 122
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 122
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca tcaagatggc tcagtcccct tctagcgtga atgcttcgct aggggagcgt 120
gtgaccatca catgtaaagc atcacgcgac ataaataatt tcctttcctg gtttcatcag 180
aaaccgggca agtcgcctaa gacgctgatt tacagagcaa atcggttggt agatggagtg 240
ccaagcagat tcagcgggag cggaagtgga caggattata gcttcactat ttcatccctg 300
gaatacgagg acgtaggtat ctattattgc ctccagtatg gcgatcttta cacatttggt 360
ggggggacta agctggagat taagggcgga ggcggaagcg gaggcggagg ctccggcgga 420
ggcggaagcg acgtgcaact tctggagagc gggccagggc tagtcaggcc ctcccagtcg 480
ctttcactga cttgcagtgt gaccggttac tctattgtga gtcactacta ttggaactgg 540
attcggcagt tcccaggcaa caaactggaa tggatggggt acatatcttc cgatggctcg 600
aatgaatata acccatcatt gaaaaatcgt atttccatca gtctggatac gagtaaaaac 660
cagtttttcc tcaaattcga tttcgtgact acagcagata ctgccacata cttctgtgta 720
cgaggtgtcg attattgggg acagggcaca acgctgaccg taagttctaa gcccaccacc 780
acccctgccc ctagacctcc aaccccagcc cctacaatcg ccagccagcc cctgagcctg 840
aggcccgaag cctgtagacc tgccgctggc ggagccgtgc acaccagagg cctggatttc 900
gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct gtggcgtgct gctgctgagc 960
ctggtcatca ccctgtactg caaccaccgg aataagagag gccggaagaa actgctgtac 1020
atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg cagaccaccc aggaagagga cggctgcagc 1080
tgccggttcc ccgaggaaga ggaaggcggc tgcgaactgc gggtgaagtt cagccggagc 1140
gccgacgccc ctgcctacca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1200
cggagggagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggcc gggaccctga gatgggcggc 1260
aagccccgga gaaagaaccc tcaggagggc ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg 1320
gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcggc ggaggggcaa gggccacgac 1380
ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggatacct acgacgccct gcacatgcag 1440
gccctgcccc ccaga 1455
<210> 123
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 123
gacatcaaga tggctcagtc cccttctagc gtgaatgctt cgctagggga gcgtgtgacc 60
atcacatgta aagcatcacg cgacataaat aatttccttt cctggtttca tcagaaaccg 120
ggcaagtcgc ctaagacgct gatttacaga gcaaatcggt tggtagatgg agtgccaagc 180
agattcagcg ggagcggaag tggacaggat tatagcttca ctatttcatc cctggaatac 240
gaggacgtag gtatctatta ttgcctccag tatggcgatc tttacacatt tggtgggggg 300
actaagctgg agattaaggg cggaggcgga agcggaggcg gaggctccgg cggaggcgga 360
agcgacgtgc aacttctgga gagcgggcca gggctagtca ggccctccca gtcgctttca 420
ctgacttgca gtgtgaccgg ttactctatt gtgagtcact actattggaa ctggattcgg 480
cagttcccag gcaacaaact ggaatggatg gggtacatat cttccgatgg ctcgaatgaa 540
tataacccat cattgaaaaa tcgtatttcc atcagtctgg atacgagtaa aaaccagttt 600
ttcctcaaat tcgatttcgt gactacagca gatactgcca catacttctg tgtacgaggt 660
gtcgattatt ggggacaggg cacaacgctg accgtaagtt ctaagcccac caccacccct 720
gcccctagac ctccaacccc agcccctaca atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc 780
gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc 840
gacatctaca tctgggcccc tctggccggc acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtc 900
atcaccctgt actgcaacca ccggaataag agaggccgga agaaactgct gtacatcttc 960
aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagacc acccaggaag aggacggctg cagctgccgg 1020
ttccccgagg aagaggaagg cggctgcgaa ctgcgggtga agttcagccg gagcgccgac 1080
gcccctgcct accagcaggg ccagaaccag ctgtacaacg agctgaacct gggccggagg 1140
gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga ggccgggacc ctgagatggg cggcaagccc 1200
cggagaaaga accctcagga gggcctgtat aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag 1260
gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag cggcggaggg gcaagggcca cgacggcctg 1320
taccagggcc tgagcaccgc caccaaggat acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg 1380
ccccccaga 1389
<210> 124
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 124
gacatcaaga tggctcagtc cccttctagc gtgaatgctt cgctagggga gcgtgtgacc 60
atcacatgta aagcatcacg cgacataaat aatttccttt cctggtttca tcagaaaccg 120
ggcaagtcgc ctaagacgct gatttacaga gcaaatcggt tggtagatgg agtgccaagc 180
agattcagcg ggagcggaag tggacaggat tatagcttca ctatttcatc cctggaatac 240
gaggacgtag gtatctatta ttgcctccag tatggcgatc tttacacatt tggtgggggg 300
actaagctgg agattaaggg cggaggcgga agcggaggcg gaggctccgg cggaggcgga 360
agcgacgtgc aacttctgga gagcgggcca gggctagtca ggccctccca gtcgctttca 420
ctgacttgca gtgtgaccgg ttactctatt gtgagtcact actattggaa ctggattcgg 480
cagttcccag gcaacaaact ggaatggatg gggtacatat cttccgatgg ctcgaatgaa 540
tataacccat cattgaaaaa tcgtatttcc atcagtctgg atacgagtaa aaaccagttt 600
ttcctcaaat tcgatttcgt gactacagca gatactgcca catacttctg tgtacgaggt 660
gtcgattatt ggggacaggg cacaacgctg accgtaagtt ctaaacctac tacaactcct 720
gccccccggc ctcctacacc agctcctact atcgcctccc agccactcag tctcagaccc 780
gaggcttcta ggccagcggc cggaggcgcg gtccacaccc gcgggctgga ctttgcatcc 840
gataagccca ccaccacccc tgcccctaga cctccaaccc cagcccctac aatcgccagc 900
cagcccctga gcctgaggcc cgaagcctgt agacctgccg ctggcggagc cgtgcacacc 960
agaggcctgg atttcgcctg cgacatctac atctgggccc ctctggccgg cacctgtggc 1020
gtgctgctgc tgagcctggt catcaccctg tactgcaacc accggaataa gagaggccgg 1080
aagaaactgc tgtacatctt caagcagccc ttcatgcggc ccgtgcagac cacccaggaa 1140
gaggacggct gcagctgccg gttccccgag gaagaggaag gcggctgcga actgcgggtg 1200
aagttcagcc ggagcgccga cgcccctgcc taccagcagg gccagaacca gctgtacaac 1260
gagctgaacc tgggccggag ggaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggccgggac 1320
cctgagatgg gcggcaagcc ccggagaaag aaccctcagg agggcctgta taacgaactg 1380
cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggca tgaagggcga gcggcggagg 1440
ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga tacctacgac 1500
gccctgcaca tgcaggccct gccccccaga 1530
<210> 125
<211> 1671
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 125
gacatcaaga tggctcagtc cccttctagc gtgaatgctt cgctagggga gcgtgtgacc 60
atcacatgta aagcatcacg cgacataaat aatttccttt cctggtttca tcagaaaccg 120
ggcaagtcgc ctaagacgct gatttacaga gcaaatcggt tggtagatgg agtgccaagc 180
agattcagcg ggagcggaag tggacaggat tatagcttca ctatttcatc cctggaatac 240
gaggacgtag gtatctatta ttgcctccag tatggcgatc tttacacatt tggtgggggg 300
actaagctgg agattaaggg cggaggcgga agcggaggcg gaggctccgg cggaggcgga 360
agcgacgtgc aacttctgga gagcgggcca gggctagtca ggccctccca gtcgctttca 420
ctgacttgca gtgtgaccgg ttactctatt gtgagtcact actattggaa ctggattcgg 480
cagttcccag gcaacaaact ggaatggatg gggtacatat cttccgatgg ctcgaatgaa 540
tataacccat cattgaaaaa tcgtatttcc atcagtctgg atacgagtaa aaaccagttt 600
ttcctcaaat tcgatttcgt gactacagca gatactgcca catacttctg tgtacgaggt 660
gtcgattatt ggggacaggg cacaacgctg accgtaagtt ctaagcctac caccaccccc 720
gcacctcgtc ctccaacccc tgcacctacg attgccagtc agcctctttc actgcggcct 780
gaggccagca gaccagctgc cggcggtgcc gtccatacaa gaggactgga cttcgcgtcc 840
gataaaccta ctaccactcc agccccaagg cccccaaccc cagcaccgac tatcgcatca 900
cagcctttgt cactgcgtcc tgaagccagc cggccagctg cagggggggc cgtccacaca 960
aggggactcg actttgcgag tgataagccc accaccaccc ctgcccctag acctccaacc 1020
ccagccccta caatcgccag ccagcccctg agcctgaggc ccgaagcctg tagacctgcc 1080
gctggcggag ccgtgcacac cagaggcctg gatttcgcct gcgacatcta catctgggcc 1140
cctctggccg gcacctgtgg cgtgctgctg ctgagcctgg tcatcaccct gtactgcaac 1200
caccggaata agagaggccg gaagaaactg ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgcgg 1260
cccgtgcaga ccacccagga agaggacggc tgcagctgcc ggttccccga ggaagaggaa 1320
ggcggctgcg aactgcgggt gaagttcagc cggagcgccg acgcccctgc ctaccagcag 1380
ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac ctgggccgga gggaggagta cgacgtgctg 1440
gacaagcgga gaggccggga ccctgagatg ggcggcaagc cccggagaaa gaaccctcag 1500
gagggcctgt ataacgaact gcagaaagac aagatggccg aggcctacag cgagatcggc 1560
atgaagggcg agcggcggag gggcaagggc cacgacggcc tgtaccaggg cctgagcacc 1620
gccaccaagg atacctacga cgccctgcac atgcaggccc tgccccccag a 1671
<210> 126
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 126
gtgaagctgg aagagtccgg cggaggcttt gtgaagcctg gcggaagcct gaagatcagc 60
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagaaac tacgccatga gctgggtccg actgagcccc 120
gagatgagac tggaatgggt cgccacaatc agcagcgcag gcggctacat cttctacagc 180
gatagcgtgc agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cctgcacctc 240
cagatgggca gtctgagatc tggcgacacc gccatgtact actgcgccag acaaggcttc 300
ggcaactacg gcgactacta tgccatggat tactggggcc agggcaccac cgtgacagtc 360
tcttctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgacatcgag 420
ctgacacaga gcccatctag cctggctgtg tctgccggcg agaaagtgac catgagctgc 480
aagagcagcc agagcctgct gaacagccgg accagaaaga atcagctggc ctggtatcag 540
cagaaaaccg gacagagccc cgagctgctg atctactggg ccagcacaag acagagcggc 600
gtgcccgata gattcacagg atctggcagc ggcaccgact tcaccctgac aatcagttct 660
gtgcaggccg aggacctggc cgtgtactac tgtcagcaga gctacaacct gctgaccttc 720
ggacccggca ccaagctgga aatcaagaga aagcccacca ccacccctgc ccctagacct 780
ccaaccccag cccctacaat cgccagccag cccctgagcc tgaggcccga agcctgtaga 840
cctgccgctg gcggagccgt gcacaccaga ggcctggatt tcgcctgcga catctacatc 900
tgggcccctc tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtcat caccctgtac 960
tgcaaccacc ggaataggag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 1020
accccccgga ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc tcccagggac 1080
ttcgccgcct accggagccg ggtgaagttc agccggagcg ccgacgcccc tgcctaccag 1140
cagggccaga accagctgta caacgagctg aacctgggcc ggagggagga gtacgacgtg 1200
ctggacaagc ggagaggccg ggaccctgag atgggcggca agccccggag aaagaaccct 1260
caggagggcc tgtataacga actgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1320
ggcatgaagg gcgagcggcg gaggggcaag ggccacgacg gcctgtacca gggcctgagc 1380
accgccacca aggataccta cgacgccctg cacatgcagg ccctgccccc caga 1434
<210> 127
<211> 1575
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 127
gtgaagctgg aagagtccgg cggaggcttt gtgaagcctg gcggaagcct gaagatcagc 60
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagaaac tacgccatga gctgggtccg actgagcccc 120
gagatgagac tggaatgggt cgccacaatc agcagcgcag gcggctacat cttctacagc 180
gatagcgtgc agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cctgcacctc 240
cagatgggca gtctgagatc tggcgacacc gccatgtact actgcgccag acaaggcttc 300
ggcaactacg gcgactacta tgccatggat tactggggcc agggcaccac cgtgacagtc 360
tcttctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgacatcgag 420
ctgacacaga gcccatctag cctggctgtg tctgccggcg agaaagtgac catgagctgc 480
aagagcagcc agagcctgct gaacagccgg accagaaaga atcagctggc ctggtatcag 540
cagaaaaccg gacagagccc cgagctgctg atctactggg ccagcacaag acagagcggc 600
gtgcccgata gattcacagg atctggcagc ggcaccgact tcaccctgac aatcagttct 660
gtgcaggccg aggacctggc cgtgtactac tgtcagcaga gctacaacct gctgaccttc 720
ggacccggca ccaagctgga aatcaagaga aaacctacta caactcctgc cccccggcct 780
cctacaccag ctcctactat cgcctcccag ccactcagtc tcagacccga ggcttctagg 840
ccagcggccg gaggcgcggt ccacacccgc gggctggact ttgcatccga taagcccacc 900
accacccctg cccctagacc tccaacccca gcccctacaa tcgccagcca gcccctgagc 960
ctgaggcccg aagcctgtag acctgccgct ggcggagccg tgcacaccag aggcctggat 1020
ttcgcctgcg acatctacat ctgggcccct ctggccggca cctgtggcgt gctgctgctg 1080
agcctggtca tcaccctgta ctgcaaccac cggaatagga gcaagcggag cagaggcggc 1140
cacagcgact acatgaacat gaccccccgg aggcctggcc ccacccggaa gcactaccag 1200
ccctacgccc ctcccaggga cttcgccgcc taccggagcc gggtgaagtt cagccggagc 1260
gccgacgccc ctgcctacca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1320
cggagggagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggcc gggaccctga gatgggcggc 1380
aagccccgga gaaagaaccc tcaggagggc ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg 1440
gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcggc ggaggggcaa gggccacgac 1500
ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggatacct acgacgccct gcacatgcag 1560
gccctgcccc ccaga 1575
<210> 128
<211> 1716
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 128
gtgaagctgg aagagtccgg cggaggcttt gtgaagcctg gcggaagcct gaagatcagc 60
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagaaac tacgccatga gctgggtccg actgagcccc 120
gagatgagac tggaatgggt cgccacaatc agcagcgcag gcggctacat cttctacagc 180
gatagcgtgc agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cctgcacctc 240
cagatgggca gtctgagatc tggcgacacc gccatgtact actgcgccag acaaggcttc 300
ggcaactacg gcgactacta tgccatggat tactggggcc agggcaccac cgtgacagtc 360
tcttctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgacatcgag 420
ctgacacaga gcccatctag cctggctgtg tctgccggcg agaaagtgac catgagctgc 480
aagagcagcc agagcctgct gaacagccgg accagaaaga atcagctggc ctggtatcag 540
cagaaaaccg gacagagccc cgagctgctg atctactggg ccagcacaag acagagcggc 600
gtgcccgata gattcacagg atctggcagc ggcaccgact tcaccctgac aatcagttct 660
gtgcaggccg aggacctggc cgtgtactac tgtcagcaga gctacaacct gctgaccttc 720
ggacccggca ccaagctgga aatcaagaga aagcctacca ccacccccgc acctcgtcct 780
ccaacccctg cacctacgat tgccagtcag cctctttcac tgcggcctga ggccagcaga 840
ccagctgccg gcggtgccgt ccatacaaga ggactggact tcgcgtccga taaacctact 900
accactccag ccccaaggcc cccaacccca gcaccgacta tcgcatcaca gcctttgtca 960
ctgcgtcctg aagccagccg gccagctgca gggggggccg tccacacaag gggactcgac 1020
tttgcgagtg ataagcccac caccacccct gcccctagac ctccaacccc agcccctaca 1080
atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc 1140
gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc tctggccggc 1200
acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtc atcaccctgt actgcaacca ccggaatagg 1260
agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac tacatgaaca tgaccccccg gaggcctggc 1320
cccacccgga agcactacca gccctacgcc cctcccaggg acttcgccgc ctaccggagc 1380
cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1440
tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 1500
cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataac 1560
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 1620
cggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 1680
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 1716
<210> 129
<211> 1560
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 129
gtgaagctgg aagagtccgg cggaggcttt gtgaagcctg gcggaagcct gaagatcagc 60
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagaaac tacgccatga gctgggtccg actgagcccc 120
gagatgagac tggaatgggt cgccacaatc agcagcgcag gcggctacat cttctacagc 180
gatagcgtgc agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cctgcacctc 240
cagatgggca gtctgagatc tggcgacacc gccatgtact actgcgccag acaaggcttc 300
ggcaactacg gcgactacta tgccatggat tactggggcc agggcaccac cgtgacagtc 360
tcttctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgacatcgag 420
ctgacacaga gcccatctag cctggctgtg tctgccggcg agaaagtgac catgagctgc 480
aagagcagcc agagcctgct gaacagccgg accagaaaga atcagctggc ctggtatcag 540
cagaaaaccg gacagagccc cgagctgctg atctactggg ccagcacaag acagagcggc 600
gtgcccgata gattcacagg atctggcagc ggcaccgact tcaccctgac aatcagttct 660
gtgcaggccg aggacctggc cgtgtactac tgtcagcaga gctacaacct gctgaccttc 720
ggacccggca ccaagctgga aatcaagaga aagcccacca ccacccctgc ccctagacct 780
ccaaccccag cccctacaat cgccagccag cccctgagcc tgaggcccga agcctgtaga 840
cctgccgctg gcggagccgt gcacaccaga ggcctggatt tcgcctgcga catctacatc 900
tgggcccctc tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtcat caccctgtac 960
tgcaaccacc ggaataggag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 1020
accccccgga ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc tcccagggac 1080
ttcgccgcct accggagcaa gagaggccgg aagaaactgc tgtacatctt caagcagccc 1140
ttcatgcggc ccgtgcagac cacccaggaa gaggacggct gcagctgccg gttccccgag 1200
gaagaggaag gcggctgcga actgcgggtg aagttcagcc ggagcgccga cgcccctgcc 1260
taccagcagg gccagaacca gctgtacaac gagctgaacc tgggccggag ggaggagtac 1320
gacgtgctgg acaagcggag aggccgggac cctgagatgg gcggcaagcc ccggagaaag 1380
aaccctcagg agggcctgta taacgaactg cagaaagaca agatggccga ggcctacagc 1440
gagatcggca tgaagggcga gcggcggagg ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc 1500
ctgagcaccg ccaccaagga tacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gccccccaga 1560
<210> 130
<211> 1701
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 130
gtgaagctgg aagagtccgg cggaggcttt gtgaagcctg gcggaagcct gaagatcagc 60
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagaaac tacgccatga gctgggtccg actgagcccc 120
gagatgagac tggaatgggt cgccacaatc agcagcgcag gcggctacat cttctacagc 180
gatagcgtgc agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cctgcacctc 240
cagatgggca gtctgagatc tggcgacacc gccatgtact actgcgccag acaaggcttc 300
ggcaactacg gcgactacta tgccatggat tactggggcc agggcaccac cgtgacagtc 360
tcttctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgacatcgag 420
ctgacacaga gcccatctag cctggctgtg tctgccggcg agaaagtgac catgagctgc 480
aagagcagcc agagcctgct gaacagccgg accagaaaga atcagctggc ctggtatcag 540
cagaaaaccg gacagagccc cgagctgctg atctactggg ccagcacaag acagagcggc 600
gtgcccgata gattcacagg atctggcagc ggcaccgact tcaccctgac aatcagttct 660
gtgcaggccg aggacctggc cgtgtactac tgtcagcaga gctacaacct gctgaccttc 720
ggacccggca ccaagctgga aatcaagaga aaacctacta caactcctgc cccccggcct 780
cctacaccag ctcctactat cgcctcccag ccactcagtc tcagacccga ggcttctagg 840
ccagcggccg gaggcgcggt ccacacccgc gggctggact ttgcatccga taagcccacc 900
accacccctg cccctagacc tccaacccca gcccctacaa tcgccagcca gcccctgagc 960
ctgaggcccg aagcctgtag acctgccgct ggcggagccg tgcacaccag aggcctggat 1020
ttcgcctgcg acatctacat ctgggcccct ctggccggca cctgtggcgt gctgctgctg 1080
agcctggtca tcaccctgta ctgcaaccac cggaatagga gcaagcggag cagaggcggc 1140
cacagcgact acatgaacat gaccccccgg aggcctggcc ccacccggaa gcactaccag 1200
ccctacgccc ctcccaggga cttcgccgcc taccggagca agagaggccg gaagaaactg 1260
ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgcgg cccgtgcaga ccacccagga agaggacggc 1320
tgcagctgcc ggttccccga ggaagaggaa ggcggctgcg aactgcgggt gaagttcagc 1380
cggagcgccg acgcccctgc ctaccagcag ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac 1440
ctgggccgga gggaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggccggga ccctgagatg 1500
ggcggcaagc cccggagaaa gaaccctcag gagggcctgt ataacgaact gcagaaagac 1560
aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcggcggag gggcaagggc 1620
cacgacggcc tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg atacctacga cgccctgcac 1680
atgcaggccc tgccccccag a 1701
<210> 131
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 131
gtgaagctgg aagagtccgg cggaggcttt gtgaagcctg gcggaagcct gaagatcagc 60
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagaaac tacgccatga gctgggtccg actgagcccc 120
gagatgagac tggaatgggt cgccacaatc agcagcgcag gcggctacat cttctacagc 180
gatagcgtgc agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cctgcacctc 240
cagatgggca gtctgagatc tggcgacacc gccatgtact actgcgccag acaaggcttc 300
ggcaactacg gcgactacta tgccatggat tactggggcc agggcaccac cgtgacagtc 360
tcttctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgacatcgag 420
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atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc 1140
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acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtc atcaccctgt actgcaacca ccggaatagg 1260
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gatacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca ga 1842
<210> 132
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 132
gacatcgagc tgacacagag cccatctagc ctggctgtgt ctgccggcga gaaagtgacc 60
atgagctgca agagcagcca gagcctgctg aacagccgga ccagaaagaa tcagctggcc 120
tggtatcagc agaaaaccgg acagagcccc gagctgctga tctactgggc cagcacaaga 180
cagagcggcg tgcccgatag attcacagga tctggcagcg gcaccgactt caccctgaca 240
atcagttctg tgcaggccga ggacctggcc gtgtactact gtcagcagag ctacaacctg 300
ctgaccttcg gacccggcac caagctggaa atcaagagag gtggcggtgg ctcgggcggt 360
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gcaggcggct acatcttcta cagcgatagc gtgcagggca gattcaccat cagccgggac 600
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tactactgcg ccagacaagg cttcggcaac tacggcgact actatgccat ggattactgg 720
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<210> 133
<211> 1575
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 133
gacatcgagc tgacacagag cccatctagc ctggctgtgt ctgccggcga gaaagtgacc 60
atgagctgca agagcagcca gagcctgctg aacagccgga ccagaaagaa tcagctggcc 120
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cagagcggcg tgcccgatag attcacagga tctggcagcg gcaccgactt caccctgaca 240
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ctgaccttcg gacccggcac caagctggaa atcaagagag gtggcggtgg ctcgggcggt 360
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<210> 134
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 134
gacatcgagc tgacacagag cccatctagc ctggctgtgt ctgccggcga gaaagtgacc 60
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tactactgcg ccagacaagg cttcggcaac tacggcgact actatgccat ggattactgg 720
ggccagggca ccaccgtgac agtctcttct aggagcaagc ggagcagagg cggccacagc 780
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<210> 135
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 135
gacatcgagc tgacacagag cccatctagc ctggctgtgt ctgccggcga gaaagtgacc 60
atgagctgca agagcagcca gagcctgctg aacagccgga ccagaaagaa tcagctggcc 120
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gccctgcccc ccaga 1335
<210> 136
<211> 1701
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 136
gacatcgagc tgacacagag cccatctagc ctggctgtgt ctgccggcga gaaagtgacc 60
atgagctgca agagcagcca gagcctgctg aacagccgga ccagaaagaa tcagctggcc 120
tggtatcagc agaaaaccgg acagagcccc gagctgctga tctactgggc cagcacaaga 180
cagagcggcg tgcccgatag attcacagga tctggcagcg gcaccgactt caccctgaca 240
atcagttctg tgcaggccga ggacctggcc gtgtactact gtcagcagag ctacaacctg 300
ctgaccttcg gacccggcac caagctggaa atcaagagag gtggcggtgg ctcgggcggt 360
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tactactgcg ccagacaagg cttcggcaac tacggcgact actatgccat ggattactgg 720
ggccagggca ccaccgtgac agtctcttct aaacctacta caactcctgc cccccggcct 780
cctacaccag ctcctactat cgcctcccag ccactcagtc tcagacccga ggcttctagg 840
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<210> 137
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 137
gacatcgagc tgacacagag cccatctagc ctggctgtgt ctgccggcga gaaagtgacc 60
atgagctgca agagcagcca gagcctgctg aacagccgga ccagaaagaa tcagctggcc 120
tggtatcagc agaaaaccgg acagagcccc gagctgctga tctactgggc cagcacaaga 180
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atcagttctg tgcaggccga ggacctggcc gtgtactact gtcagcagag ctacaacctg 300
ctgaccttcg gacccggcac caagctggaa atcaagagag gtggcggtgg ctcgggcggt 360
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ggccagggca ccaccgtgac agtctcttct aagcctacca ccacccccgc acctcgtcct 780
ccaacccctg cacctacgat tgccagtcag cctctttcac tgcggcctga ggccagcaga 840
ccagctgccg gcggtgccgt ccatacaaga ggactggact tcgcgtccga taaacctact 900
accactccag ccccaaggcc cccaacccca gcaccgacta tcgcatcaca gcctttgtca 960
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cagctgtaca acgagctgaa cctgggccgg agggaggagt acgacgtgct ggacaagcgg 1620
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tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc 1740
gagcggcgga ggggcaaggg ccacgacggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 1800
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<210> 138
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 138
gacgtgcaac ttctggagag cgggccaggg ctagtcaggc cctcccagtc gctttcactg 60
acttgcagtg tgaccggtta ctctattgtg agtcactact attggaactg gattcggcag 120
ttcccaggca acaaactgga atggatgggg tacatatctt ccgatggctc gaatgaatat 180
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ctcaaattcg atttcgtgac tacagcagat actgccacat acttctgtgt acgaggtgtc 300
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ctttcctggt ttcatcagaa accgggcaag tcgcctaaga cgctgattta cagagcaaat 540
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gcccctagac ctccaacccc agcccctaca atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc 780
gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc 840
gacatctaca tctgggcccc tctggccggc acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtc 900
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tacatgaaca tgaccccccg gaggcctggc cccacccgga agcactacca gccctacgcc 1020
cctcccaggg acttcgccgc ctaccggagc cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc 1080
cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag 1140
gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg 1200
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cagggcctga gcaccgccac caaggatacc tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc 1380
cccaga 1386
<210> 139
<211> 1527
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 139
gacgtgcaac ttctggagag cgggccaggg ctagtcaggc cctcccagtc gctttcactg 60
acttgcagtg tgaccggtta ctctattgtg agtcactact attggaactg gattcggcag 120
ttcccaggca acaaactgga atggatgggg tacatatctt ccgatggctc gaatgaatat 180
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ctcaaattcg atttcgtgac tacagcagat actgccacat acttctgtgt acgaggtgtc 300
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ggaggctccg gcggaggcgg aagcgacatc aagatggctc agtccccttc tagcgtgaat 420
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gatctttaca catttggtgg ggggactaag ctggagatta agaaacctac tacaactcct 720
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<210> 140
<211> 1668
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 140
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acttgcagtg tgaccggtta ctctattgtg agtcactact attggaactg gattcggcag 120
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<210> 141
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
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gacgtgcaac ttctggagag cgggccaggg ctagtcaggc cctcccagtc gctttcactg 60
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<210> 142
<211> 1653
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 142
gacgtgcaac ttctggagag cgggccaggg ctagtcaggc cctcccagtc gctttcactg 60
acttgcagtg tgaccggtta ctctattgtg agtcactact attggaactg gattcggcag 120
ttcccaggca acaaactgga atggatgggg tacatatctt ccgatggctc gaatgaatat 180
aacccatcat tgaaaaatcg tatttccatc agtctggata cgagtaaaaa ccagtttttc 240
ctcaaattcg atttcgtgac tacagcagat actgccacat acttctgtgt acgaggtgtc 300
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gccccccggc ctcctacacc agctcctact atcgcctccc agccactcag tctcagaccc 780
gaggcttcta ggccagcggc cggaggcgcg gtccacaccc gcgggctgga ctttgcatcc 840
gataagccca ccaccacccc tgcccctaga cctccaaccc cagcccctac aatcgccagc 900
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gtgctgctgc tgagcctggt catcaccctg tactgcaacc accggaatag gagcaagcgg 1080
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<210> 143
<211> 1794
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 143
gacgtgcaac ttctggagag cgggccaggg ctagtcaggc cctcccagtc gctttcactg 60
acttgcagtg tgaccggtta ctctattgtg agtcactact attggaactg gattcggcag 120
ttcccaggca acaaactgga atggatgggg tacatatctt ccgatggctc gaatgaatat 180
aacccatcat tgaaaaatcg tatttccatc agtctggata cgagtaaaaa ccagtttttc 240
ctcaaattcg atttcgtgac tacagcagat actgccacat acttctgtgt acgaggtgtc 300
gattattggg gacagggcac aacgctgacc gtaagttctg gcggaggcgg aagcggaggc 360
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<210> 144
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 144
gacatcaaga tggctcagtc cccttctagc gtgaatgctt cgctagggga gcgtgtgacc 60
atcacatgta aagcatcacg cgacataaat aatttccttt cctggtttca tcagaaaccg 120
ggcaagtcgc ctaagacgct gatttacaga gcaaatcggt tggtagatgg agtgccaagc 180
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gtcgattatt ggggacaggg cacaacgctg accgtaagtt ctaagcccac caccacccct 720
gcccctagac ctccaacccc agcccctaca atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc 780
gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc 840
gacatctaca tctgggcccc tctggccggc acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtc 900
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<210> 145
<211> 1527
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 145
gacatcaaga tggctcagtc cccttctagc gtgaatgctt cgctagggga gcgtgtgacc 60
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ctgcacatgc aggccctgcc ccccaga 1527
<210> 146
<211> 1668
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 146
gacatcaaga tggctcagtc cccttctagc gtgaatgctt cgctagggga gcgtgtgacc 60
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agattcagcg ggagcggaag tggacaggat tatagcttca ctatttcatc cctggaatac 240
gaggacgtag gtatctatta ttgcctccag tatggcgatc tttacacatt tggtgggggg 300
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cctctggccg gcacctgtgg cgtgctgctg ctgagcctgg tcatcaccct gtactgcaac 1200
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<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 147
gacatcaaga tggctcagtc cccttctagc gtgaatgctt cgctagggga gcgtgtgacc 60
atcacatgta aagcatcacg cgacataaat aatttccttt cctggtttca tcagaaaccg 120
ggcaagtcgc ctaagacgct gatttacaga gcaaatcggt tggtagatgg agtgccaagc 180
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gtcgattatt ggggacaggg cacaacgctg accgtaagtt ctaagcccac caccacccct 720
gcccctagac ctccaacccc agcccctaca atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc 780
gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc 840
gacatctaca tctgggcccc tctggccggc acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtc 900
atcaccctgt actgcaacca ccggaatagg agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac 960
tacatgaaca tgaccccccg gaggcctggc cccacccgga agcactacca gccctacgcc 1020
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ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag accacccagg aagaggacgg ctgcagctgc 1140
cggttccccg aggaagagga aggcggctgc gaactgcggg tgaagttcag ccggagcgcc 1200
gacgcccctg cctaccagca gggccagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggccgg 1260
agggaggagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggccggg accctgagat gggcggcaag 1320
ccccggagaa agaaccctca ggagggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc 1380
gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggcgga ggggcaaggg ccacgacggc 1440
ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gatacctacg acgccctgca catgcaggcc 1500
ctgcccccca ga 1512
<210> 148
<211> 1653
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 148
gacatcaaga tggctcagtc cccttctagc gtgaatgctt cgctagggga gcgtgtgacc 60
atcacatgta aagcatcacg cgacataaat aatttccttt cctggtttca tcagaaaccg 120
ggcaagtcgc ctaagacgct gatttacaga gcaaatcggt tggtagatgg agtgccaagc 180
agattcagcg ggagcggaag tggacaggat tatagcttca ctatttcatc cctggaatac 240
gaggacgtag gtatctatta ttgcctccag tatggcgatc tttacacatt tggtgggggg 300
actaagctgg agattaaggg cggaggcgga agcggaggcg gaggctccgg cggaggcgga 360
agcgacgtgc aacttctgga gagcgggcca gggctagtca ggccctccca gtcgctttca 420
ctgacttgca gtgtgaccgg ttactctatt gtgagtcact actattggaa ctggattcgg 480
cagttcccag gcaacaaact ggaatggatg gggtacatat cttccgatgg ctcgaatgaa 540
tataacccat cattgaaaaa tcgtatttcc atcagtctgg atacgagtaa aaaccagttt 600
ttcctcaaat tcgatttcgt gactacagca gatactgcca catacttctg tgtacgaggt 660
gtcgattatt ggggacaggg cacaacgctg accgtaagtt ctaaacctac tacaactcct 720
gccccccggc ctcctacacc agctcctact atcgcctccc agccactcag tctcagaccc 780
gaggcttcta ggccagcggc cggaggcgcg gtccacaccc gcgggctgga ctttgcatcc 840
gataagccca ccaccacccc tgcccctaga cctccaaccc cagcccctac aatcgccagc 900
cagcccctga gcctgaggcc cgaagcctgt agacctgccg ctggcggagc cgtgcacacc 960
agaggcctgg atttcgcctg cgacatctac atctgggccc ctctggccgg cacctgtggc 1020
gtgctgctgc tgagcctggt catcaccctg tactgcaacc accggaatag gagcaagcgg 1080
agcagaggcg gccacagcga ctacatgaac atgacccccc ggaggcctgg ccccacccgg 1140
aagcactacc agccctacgc ccctcccagg gacttcgccg cctaccggag caagagaggc 1200
cggaagaaac tgctgtacat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca gaccacccag 1260
gaagaggacg gctgcagctg ccggttcccc gaggaagagg aaggcggctg cgaactgcgg 1320
gtgaagttca gccggagcgc cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac 1380
aacgagctga acctgggccg gagggaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg 1440
gaccctgaga tgggcggcaa gccccggaga aagaaccctc aggagggcct gtataacgaa 1500
ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg 1560
aggggcaagg gccacgacgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac 1620
gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc aga 1653
<210> 149
<211> 1794
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 149
gacatcaaga tggctcagtc cccttctagc gtgaatgctt cgctagggga gcgtgtgacc 60
atcacatgta aagcatcacg cgacataaat aatttccttt cctggtttca tcagaaaccg 120
ggcaagtcgc ctaagacgct gatttacaga gcaaatcggt tggtagatgg agtgccaagc 180
agattcagcg ggagcggaag tggacaggat tatagcttca ctatttcatc cctggaatac 240
gaggacgtag gtatctatta ttgcctccag tatggcgatc tttacacatt tggtgggggg 300
actaagctgg agattaaggg cggaggcgga agcggaggcg gaggctccgg cggaggcgga 360
agcgacgtgc aacttctgga gagcgggcca gggctagtca ggccctccca gtcgctttca 420
ctgacttgca gtgtgaccgg ttactctatt gtgagtcact actattggaa ctggattcgg 480
cagttcccag gcaacaaact ggaatggatg gggtacatat cttccgatgg ctcgaatgaa 540
tataacccat cattgaaaaa tcgtatttcc atcagtctgg atacgagtaa aaaccagttt 600
ttcctcaaat tcgatttcgt gactacagca gatactgcca catacttctg tgtacgaggt 660
gtcgattatt ggggacaggg cacaacgctg accgtaagtt ctaagcctac caccaccccc 720
gcacctcgtc ctccaacccc tgcacctacg attgccagtc agcctctttc actgcggcct 780
gaggccagca gaccagctgc cggcggtgcc gtccatacaa gaggactgga cttcgcgtcc 840
gataaaccta ctaccactcc agccccaagg cccccaaccc cagcaccgac tatcgcatca 900
cagcctttgt cactgcgtcc tgaagccagc cggccagctg cagggggggc cgtccacaca 960
aggggactcg actttgcgag tgataagccc accaccaccc ctgcccctag acctccaacc 1020
ccagccccta caatcgccag ccagcccctg agcctgaggc ccgaagcctg tagacctgcc 1080
gctggcggag ccgtgcacac cagaggcctg gatttcgcct gcgacatcta catctgggcc 1140
cctctggccg gcacctgtgg cgtgctgctg ctgagcctgg tcatcaccct gtactgcaac 1200
caccggaata ggagcaagcg gagcagaggc ggccacagcg actacatgaa catgaccccc 1260
cggaggcctg gccccacccg gaagcactac cagccctacg cccctcccag ggacttcgcc 1320
gcctaccgga gcaagagagg ccggaagaaa ctgctgtaca tcttcaagca gcccttcatg 1380
cggcccgtgc agaccaccca ggaagaggac ggctgcagct gccggttccc cgaggaagag 1440
gaaggcggct gcgaactgcg ggtgaagttc agccggagcg ccgacgcccc tgcctaccag 1500
cagggccaga accagctgta caacgagctg aacctgggcc ggagggagga gtacgacgtg 1560
ctggacaagc ggagaggccg ggaccctgag atgggcggca agccccggag aaagaaccct 1620
caggagggcc tgtataacga actgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1680
ggcatgaagg gcgagcggcg gaggggcaag ggccacgacg gcctgtacca gggcctgagc 1740
accgccacca aggataccta cgacgccctg cacatgcagg ccctgccccc caga 1794
<210> 150
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 150
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 151
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 151
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtcccagg atccagtggg 60
<210> 152
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 152
atggattgga cctggattct gtttctggtg gccgctgcca caagagtgca cagc 54
<210> 153
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 153
atggcgctgc ccgtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 154
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 154
atgggcacca gcctcctctg ctggatggcc ctgtgtctcc tgggggcaga tcacgcagat 60
gct 63
<210> 155
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 155
atgaagcgct tcctcttcct cctactcacc atcagcctcc tggttatggt acagatacaa 60
actggactct ca 72
<210> 156
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 156
atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt 60
ctgggggtgt cccttggagg tgcc 84
<210> 157
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 157
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660
gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720
cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780
acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 840
ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt 900
gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg ccactgggat ggtgggggcc 960
ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct tcatg 1005
<210> 158
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 158
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctctggtg gcggtggctc gggcggtggt 600
gggtcgggtg gcggcggatc tggtggcggt ggctcgtttt gggtgctggt ggtggttggt 660
ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 720
agtaagagga gc 732
<210> 159
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 159
atgacaacac ccagaaattc agtaaatggg actttcccgg cagagccaat gaaaggccct 60
attgctatgc aatctggtcc aaaaccactc ttcaggagga tgtcttcact ggtgggcccc 120
acgcaaagct tcttcatgag ggaatctaag actttggggg ctgtccagat tatgaatggg 180
ctcttccaca ttgccctggg gggtcttctg atgatcccag cagggatcta tgcacccatc 240
tgtgtgactg tgtggtaccc tctctgggga ggcattatgt atattatttc cggatcactc 300
ctggcagcaa cggagaaaaa ctccaggaag tgtttggtca aaggaaaaat gataatgaat 360
tcattgagcc tctttgctgc catttctgga atgattcttt caatcatgga catacttaat 420
attaaaattt cccatttttt aaaaatggag agtctgaatt ttattagagc tcacacacca 480
tatattaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 540
caatactgtt acagcataca atctctgttc ttgggcattt tgtcagtgat gctgatcttt 600
gccttcttcc aggaacttgt aatagctggc atcgttgaga atgaatggaa aagaacgtgc 660
tccagaccca aatctaacat agttctcctg tcagcagaag aaaaaaaaga acagactatt 720
gaaataaaag aagaagtggt tgggctaact gaaacatctt cccaaccaaa gaatgaagaa 780
gacattgaaa ttattccaat ccaagaagag gaagaagaag aaacagagac gaactttcca 840
gaacctcccc aagatcagga atcctcacca atagaaaatg acagctctcc t 891
<210> 160
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 160
atgaccacac cacggaactc tgtgaatggc accttcccag cagagccaat gaagggacca 60
atcgcaatgc agagcggacc caagcctctg tttcggagaa tgagctccct ggtgggccca 120
acccagtcct tctttatgag agagtctaag acactgggcg ccgtgcagat catgaacgga 180
ctgttccaca tcgccctggg aggactgctg atgatcccag ccggcatcta cgcccctatc 240
tgcgtgaccg tgtggtaccc tctgtggggc ggcatcatgt atatcatctc cggctctctg 300
ctggccgcca cagagaagaa cagcaggaag tgtctggtga agggcaagat gatcatgaat 360
agcctgtccc tgtttgccgc catctctggc atgatcctga gcatcatgga catcctgaac 420
atcaagatca gccacttcct gaagatggag agcctgaact tcatcagagc ccacacccct 480
tacatcaaca tctataattg cgagcctgcc aacccatccg agaagaattc tccaagcaca 540
cagtactgtt attccatcca gtctctgttc ctgggcatcc tgtctgtgat gctgatcttt 600
gccttctttc aggagctggt catcgccggc atcgtggaga acgagtggaa gaggacctgc 660
agccgcccca agtccaatat cgtgctgctg tccgccgagg agaagaagga gcagacaatc 720
gagatcaagg aggaggtggt gggcctgacc gagacatcta gccagcctaa gaatgaggag 780
gatatcgag 789
<210> 161
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 161
atggattgga cctggattct gtttctggtg gccgctgcca caagagtgca cagcaactgg 60
gtgaatgtga tcagcgacct gaagaagatc gaggatctga tccagagcat gcacattgat 120
gccaccctgt acacagaatc tgatgtgcac cctagctgta aagtgaccgc catgaagtgt 180
tttctgctgg agctgcaggt gatttctctg gaaagcggag atgcctctat ccacgacaca 240
gtggagaatc tgatcatcct ggccaacaat agcctgagca gcaatggcaa tgtgacagag 300
tctggctgta aggagtgtga ggagctggag gagaagaaca tcaaggagtt tctgcagagc 360
tttgtgcaca tcgtgcagat gttcatcaat acaagctctg gcggaggatc tggaggaggc 420
ggatctggag gaggaggcag tggaggcgga ggatctggcg gaggatctct gcagattaca 480
tgccctcctc caatgtctgt ggagcacgcc gatatttggg tgaagtccta cagcctgtac 540
agcagagaga gatacatctg caacagcggc tttaagagaa aggccggcac ctcttctctg 600
acagagtgcg tgctgaataa ggccacaaat gtggcccact ggacaacacc tagcctgaag 660
tgcattagag atcctgccct ggtccaccag aggcctgccc ctccatctac agtgacaaca 720
gccggagtga cacctcagcc tgaatctctg agcccttctg gaaaagaacc tgccgccagc 780
tctcctagct ctaataatac cgccgccaca acagccgcca ttgtgcctgg atctcagctg 840
atgcctagca agtctcctag cacaggcaca acagagatca gcagccacga atcttctcac 900
ggaacacctt ctcagaccac cgccaagaat tgggagctga cagcctctgc ctctcaccag 960
cctccaggag tgtatcctca gggccactct gatacaacag tggccatcag cacatctaca 1020
gtgctgctgt gtggactgtc tgccgtgtct ctgctggcct gttacctgaa gtctagacag 1080
acacctcctc tggcctctgt ggagatggag gccatggaag ccctgcctgt gacatgggga 1140
acaagcagca gagatgagga cctggagaat tgttctcacc acctg 1185
<210> 162
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 162
aactgggtga atgtgatcag cgacctgaag aagatcgagg atctgatcca gagcatgcac 60
attgatgcca ccctgtacac agaatctgat gtgcacccta gctgtaaagt gaccgccatg 120
aagtgttttc tgctggagct gcaggtgatt tctctggaaa gcggagatgc ctctatccac 180
gacacagtgg agaatctgat catcctggcc aacaatagcc tgagcagcaa tggcaatgtg 240
acagagtctg gctgtaagga gtgtgaggag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 300
cagagctttg tgcacatcgt gcagatgttc atcaatacaa gc 342
<210> 163
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 163
attacatgcc ctcctccaat gtctgtggag cacgccgata tttgggtgaa gtcctacagc 60
ctgtacagca gagagagata catctgcaac agcggcttta agagaaaggc cggcacctct 120
tctctgacag agtgcgtgct gaataaggcc acaaatgtgg cccactggac aacacctagc 180
ctgaagtgca ttagagatcc tgccctggtc caccagaggc ctgcccctcc atctacagtg 240
acaacagccg gagtgacacc tcagcctgaa tctctgagcc cttctggaaa agaacctgcc 300
gccagctctc ctagctctaa taataccgcc gccacaacag ccgccattgt gcctggatct 360
cagctgatgc ctagcaagtc tcctagcaca ggcacaacag agatcagcag ccacgaatct 420
tctcacggaa caccttctca gaccaccgcc aagaattggg agctgacagc ctctgcctct 480
caccagcctc caggagtgta tcctcagggc cactctgata caacagtggc catcagcaca 540
tctacagtgc tgctgtgtgg actgtctgcc gtgtctctgc tggcctgtta cctgaagtct 600
agacagacac ctcctctggc ctctgtggag atggaggcca tggaagccct gcctgtgaca 660
tggggaacaa gcagcagaga tgaggacctg gagaattgtt ctcaccacct g 711
<210> 164
<211> 54
<212> DNA
<213> Thosea asigna病毒
<400> 164
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54
<210> 165
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 165
agagctaaga ggggaagcgg agagggcaga ggaagtctgc taacatgcgg tgacgtcgag 60
gagaatcctg gacct 75
<210> 166
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 166
agggccaaga ggagtggcag cggcgagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 60
gaggagaatc ccggccct 78
<210> 167
<211> 57
<212> DNA
<213> 猪捷申病毒1
<400> 167
gcaacgaact tctctctcct aaaacaggct ggtgatgtgg aggagaatcc tggtcca 57
<210> 168
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 168
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 169
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 169
cgtgcaaagc gtgcaccggt gaaacaggga agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag 60
caggctggag acgtggagga gaaccctgga cct 93
<210> 170
<211> 60
<212> DNA
<213> 马鼻炎A病毒
<400> 170
cagtgtacta attatgctct cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa ccctggacct 60
<210> 171
<211> 66
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒
<400> 171
gtcaaacaga ccctaaactt tgatctgcta aaactggccg gggatgtgga aagtaatccc 60
ggcccc 66
<210> 172
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 172
cgtgcaaagc gt 12
<210> 173
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 173
agagccaaga gggcaccggt gaaacagact ttgaattttg accttctgaa gttggcagga 60
gacgttgagt ccaaccctgg gccc 84
<210> 174
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 174
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 175
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 175
ggcagcacct ccggcagcgg caagcctggc agcggcgagg gcagcaccaa gggc 54
<210> 176
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 176
ggaagcgga 9
<210> 177
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 177
agtggcagcg gc 12
<210> 178
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 178
ggccccaaga agaaaaggaa ggtggccccc cccaccgacg tgagcctggg cgacgagctg 60
cacctggacg gcgaggacgt ggccatggcc cacgccgacg ccctggacga cttcgacctg 120
gacatgctgg gcgacggcga cagccccggc cccggcttca ccccccacga cagcgccccc 180
tacggcgccc tggacatggc cgacttcgag ttcgagcaga tgttcaccga cgccctgggc 240
atcgacgagt acggcggc 258
<210> 179
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 179
gagatgcccg tggacaggat tctggaggcc gaactcgccg tggagcagaa aagcgaccag 60
ggcgtggagg gccccggcgg aaccggcggc agcggcagca gccccaacga ccccgtgacc 120
aacatctgcc aggccgccga caagcagctg ttcaccctgg tggagtgggc caagaggatt 180
ccccacttca gcagcctgcc cctggacgac caggtgatcc tgctgagggc cggatggaac 240
gagctgctga tcgccagctt cagccacagg agcatcgacg tgagggacgg catcctgctg 300
gccaccggcc tgcacgtcca taggaacagc gcccacagcg ccggagtggg cgccatcttc 360
gacagggtgc tgaccgagct ggtgagcaag atgagggaca tgaggatgga caagaccgag 420
ctgggctgcc tgagggccat catcctgttc aaccccgagg tgaggggcct gaaaagcgcc 480
caggaggtgg agctgctgag ggagaaggtg tacgccgccc tggaggagta caccaggacc 540
acccaccccg acgagcccgg cagattcgcc aagctgctgc tgaggctgcc cagcctgagg 600
agcatcggcc tgaagtgcct ggagcacctg ttcttcttca ggctgatcgg cgacgtgccc 660
atcgacacct tcctgatgga gatgctggag agccccagcg acagc 705
<210> 180
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 180
ggccccaaga agaaaaggaa ggtggccccc cccaccgacg tgagcctggg cgacgagctg 60
cacctggacg gcgaggacgt ggccatggcc cacgccgacg ccctggacga cttcgacctg 120
gacatgctgg gcgacggcga cagccccggc cccggcttca ccccccacga cagcgccccc 180
tacggcgccc tggacatggc cgacttcgag ttcgagcaga tgttcaccga cgccctgggc 240
atcgacgagt acggcggcga attcgagatg cccgtggaca ggattctgga ggccgaactc 300
gccgtggagc agaaaagcga ccagggcgtg gagggccccg gcggaaccgg cggcagcggc 360
agcagcccca acgaccccgt gaccaacatc tgccaggccg ccgacaagca gctgttcacc 420
ctggtggagt gggccaagag gattccccac ttcagcagcc tgcccctgga cgaccaggtg 480
atcctgctga gggccggatg gaacgagctg ctgatcgcca gcttcagcca caggagcatc 540
gacgtgaggg acggcatcct gctggccacc ggcctgcacg tccataggaa cagcgcccac 600
agcgccggag tgggcgccat cttcgacagg gtgctgaccg agctggtgag caagatgagg 660
gacatgagga tggacaagac cgagctgggc tgcctgaggg ccatcatcct gttcaacccc 720
gaggtgaggg gcctgaaaag cgcccaggag gtggagctgc tgagggagaa ggtgtacgcc 780
gccctggagg agtacaccag gaccacccac cccgacgagc ccggcagatt cgccaagctg 840
ctgctgaggc tgcccagcct gaggagcatc ggcctgaagt gcctggagca cctgttcttc 900
ttcaggctga tcggcgacgt gcccatcgac accttcctga tggagatgct ggagagcccc 960
agcgacagc 969
<210> 181
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 181
atgaagctgc tgagcagcat cgagcaggct tgcgacatct gcaggctgaa gaagctgaag 60
tgcagcaagg agaagcccaa gtgcgccaag tgcctgaaga acaactggga gtgcagatac 120
agccccaaga ccaagaggag ccccctgacc agggcccacc tgaccgaggt ggagagcagg 180
ctggagaggc tggagcagct gttcctgctg atcttcccca gggaggacct ggacatgatc 240
ctgaagatgg acagcctgca agacatcaag gccctgctga ccggcctgtt cgtgcaggac 300
aacgtgaaca aggacgccgt gaccgacagg ctggccagcg tggagaccga catgcccctg 360
accctgaggc agcacaggat cagcgccacc agcagcagcg aggagagcag caacaagggc 420
cagaggcagc tgaccgtgag ccccgagttt 450
<210> 182
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 182
atcaggcccg agtgcgtggt gcccgagacc cagtgcgcca tgaaaaggaa ggagaagaag 60
gcccagaagg agaaggacaa gctgcccgtg agcaccacca ccgtcgatga ccacatgccc 120
cccatcatgc agtgcgagcc cccccccccc gaggccgcca ggattcacga ggtcgtgccc 180
aggttcctga gcgacaagct gctggtgacc aacaggcaga agaacatccc ccagctgacc 240
gccaaccagc agttcctgat cgccaggctg atctggtatc aggacggcta cgagcagccc 300
agcgacgagg acctgaaaag gatcacccag acctggcagc aggccgacga cgagaacgag 360
gagagcgaca cccccttcag gcagatcacc gagatgacca tcctgaccgt gcagctgatc 420
gtggagttcg ccaagggcct gcccggattc gccaagatca gccagcccga ccagatcacc 480
ctgctgaagg cttgcagcag cgaggtgatg atgctgaggg tggccaggag gtacgacgcc 540
gccagcgaca gcatcctgtt cgccaacaac caggcttaca ccagggacaa ctacaggaag 600
gctggcatgg ccgaggtgat cgaggacctc ctgcacttct gcagatgtat gtacagcatg 660
gccctggaca acatccacta cgccctgctg accgccgtgg tgatcttcag cgacaggccc 720
ggcctggagc agccccagct ggtggaggag atccagaggt actacctgaa caccctgagg 780
atctacatcc tgaaccagct gagcggcagc gccaggagca gcgtgatcta cggcaagatc 840
ctgagcatcc tgagcgagct gaggaccctg ggaatgcaga acagcaatat gtgtatcagc 900
ctgaagctga agaacaggaa gctgcccccc ttcctggagg agatttggga cgtggccgac 960
atgagccaca cccagccccc ccccatcctg gagagcccca ccaacctg 1008
<210> 183
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 183
cggcctgagt gcgtagtacc cgagactcag tgcgccatga agcggaaaga gaagaaagca 60
cagaaggaga aggacaaact gcctgtcagc acgacgacgg tggacgacca catgccgccc 120
attatgcagt gtgaacctcc acctcctgaa gcagcaagga ttcacgaagt ggtcccaagg 180
tttctctccg acaagctgtt ggtgacaaac cggcagaaaa acatccccca gttgacagcc 240
aaccagcagt tccttatcgc caggctcatc tggtaccagg acgggtacga gcagccttct 300
gatgaagatt tgaagaggat tacgcagacg tggcagcaag cggacgatga aaacgaagag 360
tcggacactc ccttccgcca gatcacagag atgactatcc tcacggtcca acttatcgtg 420
gagttcgcga agggattgcc agggttcgcc aagatctcgc agcctgatca aattacgctg 480
cttaaggctt gctcaagtga ggtaatgatg ctccgagtcg cgcgacgata cgatgcggcc 540
tcagacagta ttctgttcgc gaacaaccaa gcgtacactc gcgacaacta ccgcaaggct 600
ggcatggccg aggtcatcga ggatctactg cacttctgcc ggtgcatgta ctctatggcg 660
ttggacaaca tccattacgc gctgctcacg gctgtcgtca tcttttctga ccggccaggg 720
ttggagcagc cgcaactggt ggaagagatc cagcggtact acctgaatac gctccgcatc 780
tatatcctga accagctgag cgggtcggcg cgttcgtccg tcatatacgg caagatcctc 840
tcaatcctct ctgagctacg cacgctcggc atgcaaaact ccaacatgtg catctccctc 900
aagctcaaga acagaaagct gccgcctttc ctcgaggaga tctgggatgt ggcggacatg 960
tcgcacaccc aaccgccgcc tatcctcgag tcccccacga atctctag 1008
<210> 184
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 184
atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60
tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120
tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180
ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240
ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300
aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360
acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420
caaagacagt tgactgtatc gccggaattc ccggggatcc ggcctgagtg cgtagtaccc 480
gagactcagt gcgccatgaa gcggaaagag aagaaagcac agaaggagaa ggacaaactg 540
cctgtcagca cgacgacggt ggacgaccac atgccgccca ttatgcagtg tgaacctcca 600
cctcctgaag cagcaaggat tcacgaagtg gtcccaaggt ttctctccga caagctgttg 660
gtgacaaacc ggcagaaaaa catcccccag ttgacagcca accagcagtt ccttatcgcc 720
aggctcatct ggtaccagga cgggtacgag cagccttctg atgaagattt gaagaggatt 780
acgcagacgt ggcagcaagc ggacgatgaa aacgaagagt cggacactcc cttccgccag 840
atcacagaga tgactatcct cacggtccaa cttatcgtgg agttcgcgaa gggattgcca 900
gggttcgcca agatctcgca gcctgatcaa attacgctgc ttaaggcttg ctcaagtgag 960
gtaatgatgc tccgagtcgc gcgacgatac gatgcggcct cagacagtat tctgttcgcg 1020
aacaaccaag cgtacactcg cgacaactac cgcaaggctg gcatggccga ggtcatcgag 1080
gatctactgc acttctgccg gtgcatgtac tctatggcgt tggacaacat ccattacgcg 1140
ctgctcacgg ctgtcgtcat cttttctgac cggccagggt tggagcagcc gcaactggtg 1200
gaagagatcc agcggtacta cctgaatacg ctccgcatct atatcctgaa ccagctgagc 1260
gggtcggcgc gttcgtccgt catatacggc aagatcctct caatcctctc tgagctacgc 1320
acgctcggca tgcaaaactc caacatgtgc atctccctca agctcaagaa cagaaagctg 1380
ccgcctttcc tcgaggagat ctgggatgtg gcggacatgt cgcacaccca accgccgcct 1440
atcctcgagt cccccacgaa tctctag 1467
<210> 185
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 185
atgaagctgc tgagcagcat cgagcaggct tgcgacatct gcaggctgaa gaagctgaag 60
tgcagcaagg agaagcccaa gtgcgccaag tgcctgaaga acaactggga gtgcagatac 120
agccccaaga ccaagaggag ccccctgacc agggcccacc tgaccgaggt ggagagcagg 180
ctggagaggc tggagcagct gttcctgctg atcttcccca gggaggacct ggacatgatc 240
ctgaagatgg acagcctgca agacatcaag gccctgctga ccggcctgtt cgtgcaggac 300
aacgtgaaca aggacgccgt gaccgacagg ctggccagcg tggagaccga catgcccctg 360
accctgaggc agcacaggat cagcgccacc agcagcagcg aggagagcag caacaagggc 420
cagaggcagc tgaccgtgag ccccgagttt cccgggcggc ctgagtgcgt agtacccgag 480
actcagtgcg ccatgaagcg gaaagagaag aaagcacaga aggagaagga caaactgcct 540
gtcagcacga cgacggtgga cgaccacatg ccgcccatta tgcagtgtga acctccacct 600
cctgaagcag caaggattca cgaagtggtc ccaaggtttc tctccgacaa gctgttggtg 660
acaaaccggc agaaaaacat cccccagttg acagccaacc agcagttcct tatcgccagg 720
ctcatctggt accaggacgg gtacgagcag ccttctgatg aagatttgaa gaggattacg 780
cagacgtggc agcaagcgga cgatgaaaac gaagagtcgg acactccctt ccgccagatc 840
acagagatga ctatcctcac ggtccaactt atcgtggagt tcgcgaaggg attgccaggg 900
ttcgccaaga tctcgcagcc tgatcaaatt acgctgctta aggcttgctc aagtgaggta 960
atgatgctcc gagtcgcgcg acgatacgat gcggcctcag acagtattct gttcgcgaac 1020
aaccaagcgt acactcgcga caactaccgc aaggctggca tggccgaggt catcgaggat 1080
ctactgcact tctgccggtg catgtactct atggcgttgg acaacatcca ttacgcgctg 1140
ctcacggctg tcgtcatctt ttctgaccgg ccagggttgg agcagccgca actggtggaa 1200
gagatccagc ggtactacct gaatacgctc cgcatctata tcctgaacca gctgagcggg 1260
tcggcgcgtt cgtccgtcat atacggcaag atcctctcaa tcctctctga gctacgcacg 1320
ctcggcatgc aaaactccaa catgtgcatc tccctcaagc tcaagaacag aaagctgccg 1380
cctttcctcg aggagatctg ggatgtggcg gacatgtcgc acacccaacc gccgcctatc 1440
ctcgagtccc ccacgaatct ctag 1464
<210> 186
<211> 244
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 186
gagcgtgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60
gagaagttgg ggggaggggg tcggcgattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acag 244
<210> 187
<211> 148
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：
6位点GAL4-诱导型近端因子结合元件(PFB)序列
<400> 187
attgttcgga gcagtgcggc gcgtttagcg gagtactgtc ctccgatatt aatcggggca 60
gactattccg gggtttaccg gcgcactctc gcccgaactt caccggcggt ctttcgtccg 120
tgctttatcg gggcggatca ctccgaac 148
<210> 188
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 188
aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accctcattc tggagacgga tcccgagccg 60
agtgttttga cctccataga a 81
<210> 189
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 189
cagccgctaa atccaaggta aggtcagaag a 31
<210> 190
<211> 132
<212> DNA
<213> 猿猴病毒 40
<400> 190
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
tatcatgtct gg 132
<210> 191
<211> 275
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：
双向aCA多聚A [双向多聚A] 序列
<400> 191
atcgattaat ctagcggccc tagacgagca gacatgataa gatacattga tgagtttgga 60
caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt 120
gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat 180
tttatgtttc aggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac 240
aaatgtggta aaatccgata agcgtaccta gaggc 275
<210> 192
<211> 73
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：
2xRbm3 IRES序列
<400> 192
actagtttta taatttcttc ttccagaatt tctgacattt tataatttct tcttccagaa 60
gactcacaac ctc 73
<210> 193
<211> 570
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：
EMCV IRES序列
<400> 193
ccccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatc 570
<210> 194
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 194
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg ccagcggcta cagcatcacc aacgactacg cctggaactg ggtgaggcag 120
gcccccggca agggcctgga gtgggtgggc tacatcaact acagcggcta caccacctac 180
aaccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggtgggac 300
ggcggcctga cctactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagc 348
<210> 195
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 195
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg ccagcggcta cagcatcacc aacgactacg cctggaactg ggtgaggcag 120
gcccccggca agggcctgga gtgggtgggc tacatcaact acagcggcta caccacctac 180
aaccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccttctac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggtgggac 300
ggcggcctga cctactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagc 348
<210> 196
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 196
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 197
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 197
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 198
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(45)
<223> 该序列可包含0-15个"Gly Ser Gly" 重复单元
<400> 198
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
35 40 45
<210> 199
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(60)
<223> 该序列可包含0-15个"Ser Gly Ser Gly" 重复单元
<400> 199
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
20 25 30
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
50 55 60
<210> 200
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 200
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 201
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Val或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任意氨基酸
<400> 201
Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 202
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(26)
<223> 该区域可包含2-5个 "Glu Ala Ala Ala Lys" 重复单元
<400> 202
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
20 25
<210> 203
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> 该序列可包含0-15个 "Gly Ser" 重复单元
<400> 203
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
20 25 30
<210> 204
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> 该序列可包含0-15个 "Ser Gly" 重复单元
<400> 204
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
20 25 30
<210> 205
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 205
Ala Pro Val Lys Gln
1 5

Claims (83)

1.一种分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中所述CAR包含
(a)MUC16抗原结合域；
(b)茎结构域；
(c)跨膜域；
(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；和
(e)CD3ζ信号传导域。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述MUC16抗原结合域包含以下至少一种：
(a)与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、12和14所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、11、13和15所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和
(c)与SEQ ID NO:27-57所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的分离的核酸，其中所述MUC16抗原结合域是与SEQ ID NO:27-57所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
4.根据权利要求1或2所述的分离的核酸，其中所述茎结构域是与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的核酸，其中所述共刺激信号传导域包含4-1BB。
6.根据权利要求5所述的分离的核酸，其中4-1BB的共刺激信号传导域包含与SEQ IDNO:22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的核酸，其中所述共刺激信号传导域包含CD28。
8.根据权利要求7所述的分离的核酸，其中CD28的共刺激信号传导域包含与SEQ IDNO:23的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的核酸，其中所述CD3ζ信号传导域包含与SEQID NO:26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的核酸，其进一步包含截短的表皮生长因子受体。
11.根据权利要求10所述的分离的核酸，其中所述截短的表皮生长因子受体是HER1t，并且包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
12.根据权利要求10所述的分离的核酸，其中所述截短的表皮生长因子受体是HER1t-1，并且包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
13.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述CAR包含与SEQ ID NO:27-57所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
14.一种载体，其包含骨架和编码以下部分的核酸序列：
(1)截短的表皮生长因子受体，其包含HER1t、HER1t-1或其功能变体中的至少一种；
(2)细胞因子；和
(3)嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含
(a)MUC16抗原结合域；
(b)茎结构域；
(c)跨膜域；
(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；和
(e)CD3ζ信号传导域。
15.根据权利要求14所述的载体，其中所述细胞因子是IL-15或IL-12。
16.根据权利要求14或15所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
17.根据权利要求14所述的载体，其中所述截短的表皮生长因子受体包含与SEQ IDNO:65或SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
18.根据权利要求15所述的载体，其中所述IL-15是膜结合的IL-15。
19.根据权利要求18所述的载体，其中所述膜结合的IL-15包含编码SEQ ID NO:161的核苷酸序列。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的载体，其进一步包含编码自切割Thoseaasigna病毒(T2A)肽的核苷酸序列。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的载体，其中所述骨架是Sleeping Beauty转座子DNA质粒或pFUGW。
22.根据权利要求14-21中任一项所述的载体，其进一步包含启动子。
23.根据权利要求22所述的载体，其中所述启动子是hEF1a1。
24.根据权利要求14-23中任一项所述的载体，其中所述MUC16抗原结合域包含以下至少一种：
(a)与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、12和14所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、11、13和15所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和
(c)与SEQ ID NO:27-57所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
25.根据权利要求14-24中任一项所述的载体，其中所述MUC16抗原结合域是与SEQ IDNO:27-57所示氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
26.根据权利要求14-25中任一项所述的载体，其中所述茎结构域包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
27.根据权利要求14-26中任一项所述的载体，其中所述共刺激信号传导域包含4-1BB。
28.根据权利要求27所述的载体，其中4-1BB的共刺激信号传导域包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
29.根据权利要求14-26中任一项所述的载体，其中所述共刺激信号传导域包含CD28。
30.根据权利要求29所述的载体，其中CD28的共刺激信号传导域包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
31.根据权利要求14-30中任一项所述的载体，其中所述CD3ζ信号传导域包含与SEQ IDNO:26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
32.根据权利要求14-31中任一项所述的载体，其中所述载体包含质粒。
33.根据权利要求14-31所述的载体，其中每个载体包含表达质粒。
34.根据权利要求16所述的载体，其中所述非病毒载体是Sleeping Beauty转座子。
35.一种免疫效应细胞，其包含权利要求1-13中任一项的核苷酸。
36.一种免疫效应细胞，其包含(1)细胞标签，(2)IL-15，和(3)嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含(a)MUC16抗原结合域；(b)茎结构域；(c)跨膜域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；和(e)CD3ζ信号传导域。
37.根据权利要求36所述的免疫效应细胞，其中所述IL-15是膜结合的IL-15。
38.根据权利要求36所述的免疫效应细胞，其中所述膜结合的IL-15包含SEQ ID NO:161的多肽序列。
39.根据权利要求36所述的免疫效应细胞，其中所述细胞标签包含HER1t，并且所述HER1t包含SEQ ID NO:65的多肽序列。
40.根据权利要求36所述的免疫效应细胞，其中所述细胞标签包含HER1t-1，并且所述HER1t-1包含SEQ ID NO:66的多肽序列。
41.一种免疫效应细胞，其包含权利要求14-34中任一项的载体。
42.根据权利要求35-41中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或调节性T细胞。
43.根据权利要求36所述的免疫效应细胞，其中所述CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO:27-57中的至少一个。
44.一种在有需要的人类受试者中刺激针对靶细胞群体或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括向所述人类受试者施用有效量的经遗传修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含：
(a)MUC16抗原结合域；
(b)茎结构域；
(c)跨膜域；
(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导域；
(e)CD3ζ信号传导域；和
(f)截短的表皮生长因子受体(HER1t)。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述人已被诊断出患有卵巢癌和乳腺癌中的至少一种。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述卵巢癌或乳腺癌是复发性或难治性卵巢癌或乳腺癌。
47.一种分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中所述CAR包含：
(a)具有SEQ ID NO:1-15或27-57所示氨基酸序列中的至少一个的MUC16抗原结合域；
(b)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的茎结构域；
(c)包含具有SEQ ID NO:23氨基酸序列的CD28的共刺激信号传导域；
(d)HER1标签，其包含具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HER1t和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HER1t-1中的至少一个；和
(e)具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CD3ζ信号传导域。
48.一种分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中所述CAR包含：
(a)具有SEQ ID NO:1-15或27-57所示氨基酸序列中的至少一个的MUC16抗原结合域；
(b)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的茎结构域；
(c)包含具有SEQ ID NO:23氨基酸序列的4-1BB的共刺激信号传导域；
(d)HER1标签，其包含具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HER1t和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HER1t-1中的至少一个；和
(e)具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CD3ζ信号传导域。
49.一种载体，其包含权利要求47和48中任一项的任何一个或多个多核苷酸。
50.根据权利要求49所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
51.根据权利要求50所述的载体，其中所述非病毒载体是Sleeping Beauty转座子。
52.根据权利要求51所述的载体，其中所述载体是多个载体。
53.一种用于在免疫效应细胞中表达CAR的系统，该系统包含一种或多种编码权利要求1-13和47-48中任一项提供的分离的核酸的载体。
54.根据权利要求53所述的系统，其中所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。
55.根据权利要求53-54中任一项所述的系统，其进一步包含编码至少一种另外的基因的核酸。
56.根据权利要求55所述的系统，其中所述另外的基因包括细胞因子。
57.根据权利要求56所述的系统，其中所述细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-21以及IL-15与IL-15Rα的融合体中的至少一种。
58.根据权利要求56所述的系统，其中所述细胞因子为分泌形式。
59.根据权利要求56所述的系统，其中所述细胞因子为膜结合形式。
60.根据权利要求53-59中任一项所述的系统，其中所述系统包含一种载体。
61.根据权利要求53-60中任一项所述的系统，其中所述一种或多种载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
62.根据权利要求61所述的系统，其中所述非病毒载体是Sleeping Beauty转座子。
63.根据权利要求62所述的系统，其进一步包含Sleeping Beauty转座酶。
64.根据权利要求63所述的系统，其中所述Sleeping Beauty转座酶是SB11、SB100X或SB110。
65.根据权利要求53-64中任一项所述的系统，其中所述免疫效应细胞是哺乳动物细胞。
66.一种在免疫效应细胞中表达CAR的方法，其包括使所述免疫效应细胞与权利要求53-65中任一项的系统接触。
67.一种刺激工程化T细胞的增殖和/或存活的方法，其包括：
(a)从受试者获得细胞样品，该样品包含T细胞或T细胞祖细胞；
(b)用一种或多种编码权利要求1-13和44-45中任一项提供的分离的核酸的载体和编码转座酶的载体转染所述细胞，以提供工程化的表达MUC16 CAR的T细胞群体；
(c)以及任选地，将MUC16 CAR T细胞群体离体培养2天或更短。
68.根据权利要求67所述的方法，其进一步包括用编码细胞因子的载体转染所述细胞。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述细胞因子是包含IL-15和IL-15Rα的融合蛋白。
70.根据权利要求67-69中任一项所述的方法，其中所述一种或多种载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述非病毒载体是Sleeping Beauty转座子。
72.根据权利要求71所述的方法，其进一步包括Sleeping Beauty转座酶。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述Sleeping Beauty转座酶是SB11、SB100X或SB110。
74.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用一剂或多剂有效量的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞包含MUC16 CAR和膜结合的IL-15。
75.根据权利要求74所述的方法，其中第一剂有效量的工程化T细胞经腹膜内施用。
76.根据权利要求75所述的方法，其中第二剂有效量的工程化T细胞经静脉内施用。
77.根据权利要求74所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
78.根据权利要求74所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
79.根据权利要求74所述的方法，其中所述MUC16 CAR由SEQ ID NO:95-107、119-149或194-195所示的任一种序列编码。
80.根据权利要求74所述的方法，其中所述膜结合的IL-15由SEQ ID NO:161编码。
81.根据权利要求74所述的方法，其中工程化T细胞的有效量为至少102个细胞/kg。
82.根据权利要求74所述的方法，其中工程化T细胞的有效量为至少104个细胞/kg。
83.根据权利要求74所述的方法，其中工程化T细胞的有效量为至少105个细胞/kg。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019079486A1 (en) * 2017-10-18 2019-04-25 Intrexon Corporation POLYPEPTIDE COMPOSITIONS COMPRISING SPACERS
US20220332780A1 (en) 2019-09-10 2022-10-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2-il15 fusion proteins for tunable regulation
TW202233662A (zh) * 2020-12-31 2022-09-01 大陸商亘喜生物科技（上海）有限公司 膜融合蛋白及其在免疫細胞中的應用
JP2024504585A (ja) * 2021-01-19 2024-02-01 オブシディアン セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｔ細胞及び腫瘍浸潤リンパ球の拡張のための組成物及び方法
WO2023150562A1 (en) * 2022-02-01 2023-08-10 Alaunos Therapeutics, Inc. Methods for activation and expansion of t cells
CN115819613B (zh) * 2022-05-10 2023-10-20 四川大学华西医院 基于msln前体蛋白构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017172981A2 (en) * 2016-03-29 2017-10-05 University Of Southern California Chimeric antigen receptors targeting cancer

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7202346B2 (en) 2002-07-03 2007-04-10 Immunogen Inc. Antibodies to non-shed Muc1 and Muc16, and uses thereof
AU2006262603B2 (en) 2005-06-20 2011-01-06 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
JP5290276B2 (ja) 2007-05-08 2013-09-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン改変抗ｍｕｃ１６抗体および抗体−薬物結合体
JP2011509650A (ja) 2008-01-11 2011-03-31 株式会社ジーンテクノサイエンス ヒト化抗−α９インテグリン抗体及びその使用
EP4049674A1 (en) * 2009-11-03 2022-08-31 City of Hope Truncated epidermal growth factor receptor (egfrt) for transduced t cell selection
CA3002192C (en) 2010-03-26 2023-03-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antibodies to muc16 and methods of use thereof
ES2831315T3 (es) 2013-04-03 2021-06-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Generación efectiva de células T dirigidas al tumor derivadas de células madre pluripotentes
EP3783098A1 (en) * 2013-05-14 2021-02-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
RU2701341C2 (ru) * 2014-04-03 2019-09-25 Селлектис Cd33-специфические химерные антигенные рецепторы для иммунотерапии рака
KR102612313B1 (ko) 2014-07-21 2023-12-12 노파르티스 아게 인간화 항-bcma 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
ES2904573T3 (es) 2015-03-27 2022-04-05 Univ Southern California Terapia con células T dirigida a LHR para el tratamiento de tumores sólidos
WO2016205176A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
WO2017040945A1 (en) 2015-09-04 2017-03-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immune cell compositions and methods of use
AU2017279548A1 (en) * 2016-06-08 2018-12-13 Precigen, Inc. Cd33 specific chimeric antigen receptors
ES2951552T3 (es) 2016-07-29 2023-10-23 Juno Therapeutics Inc Polipéptidos inmunomoduladores y composiciones y métodos relacionados
CN107557336B (zh) * 2017-09-15 2020-02-14 山东兴瑞生物科技有限公司 一种抗muc16安全型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017172981A2 (en) * 2016-03-29 2017-10-05 University Of Southern California Chimeric antigen receptors targeting cancer

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LENKA V HURTON等: "Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 113, no. 48, 29 November 2016 (2016-11-29), XP055436232, DOI: 10.1073/pnas.1610544113 *
M HELEN HULS等: "Clinical application of Sleeping Beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify T cells from peripheral and umbilical cord blood", J VIS EXP, vol. 72, 1 February 2013 (2013-02-01) *
MYTHILI KONERU等: "IL-12 secreting tumor-targeted chimeric antigen receptor T cells eradicate ovarian tumors in vivo", ONCOIMMUNOLOGY, vol. 4, no. 3, 23 January 2015 (2015-01-23), pages 1, XP009184024, DOI: 10.4161/2162402X.2014.994446 *
THAPI DHARMA RAO等: "Novel monoclonal antibodies against the proximal (carboxy-terminal) portions of MUC16", APPL IMMUNOHISTOCHEM MOL MORPHOL, vol. 18, no. 5, 18 October 2010 (2010-10-18), XP008163430, DOI: 10.1097/PAI.0b013e3181dbfcd2 *

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Publication number Publication date
WO2019236577A3 (en) 2020-01-16
JP2021525534A (ja) 2021-09-27
WO2019236577A2 (en) 2019-12-12
KR20210021493A (ko) 2021-02-26
CA3101641A1 (en) 2019-12-12
US11976134B2 (en) 2024-05-07
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