JP2024023232A - Ｍｕｃ１６特異的キメラ抗原受容体およびそれらの使用 - Google Patents

Ｍｕｃ１６特異的キメラ抗原受容体およびそれらの使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2024023232A
JP2024023232A JP2023189072A JP2023189072A JP2024023232A JP 2024023232 A JP2024023232 A JP 2024023232A JP 2023189072 A JP2023189072 A JP 2023189072A JP 2023189072 A JP2023189072 A JP 2023189072A JP 2024023232 A JP2024023232 A JP 2024023232A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
car
seq
cell
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023189072A
Other languages
English (en)
Inventor
サブゼヴァリ，ヘレン
Sabzevari Helen
アール． シャー，ルトゥル
R Shah Rutul
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Precigen Inc
Original Assignee
Precigen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Precigen Inc filed Critical Precigen Inc
Publication of JP2024023232A publication Critical patent/JP2024023232A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464469—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/46447—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/17—Hinge-spacer domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

【課題】がん治療のための抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体からのｓｃＦｖを含有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸を提供する。【解決手段】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、前記ＣＡＲが、（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および、（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、単離核酸を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１８年６月４日
に出願された米国特許仮出願第６２／６８０，２９７号明細書の利益を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて、電子的に提出され、参照によりその全体
において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１９年５月２３日に作成された
前記ＡＳＣＩＩコピーは、５０４７１＿７１５＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、３
３１，８８０バイトのサイズである。
キメラポリペプチドなど、組換えポリペプチドは、研究、診断、製造、および治療応用
に役立っている。ＣＡＲなど、抗原結合性ポリペプチドを発現する改変エフェクター細胞
は、感染症、自己免疫障害、およびがんなどの疾患および障害の処置に有用である。
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特
許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれることが指し示された場
合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、ＣＡＲが
、（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイ
ン；（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン
；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、単離核酸が提示される。一部
の実施形態では、ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインは：（ａ）配列番号１、３、５、７、９
、１２、および１４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１
１、１３、および１５に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、
または１００％の同一性を有するポリペプチド；および（ｃ）配列番号２７～５７に示さ
れるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有
するポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。
一部の実施形態では、ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインは、配列番号２７～５７に示され
るアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有す
るポリペプチドである。一部の実施形態では、ストークドメインは、配列番号１６のアミ
ノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドである。一部の
実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢを含む。一部の実施形態では、
４－１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列との、少なく
とも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９
％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、共刺激
シグナル伝達ドメインはＣＤ２８を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８の共刺激シグナ
ル伝達ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一
性を有するポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号２６のアミノ酸
配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施
形態では、本明細書で提示される単離核酸は、トランケート型表皮増殖因子受容体をさら
に含みうる。一部の実施形態では、トランケート型表皮増殖因子受容体は、ＨＥＲ１ｔで
あり、配列番号６５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、
９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポ
リペプチドを含む。一部の実施形態では、トランケート型表皮増殖因子受容体は、ＨＥＲ
１ｔ－１であり、配列番号６６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性
を有するポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列との、少
なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書では、骨格ならびに（１）ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ－１、またはこれらの機能
的な変異体のうちの少なくとも１つを含むトランケート型表皮増殖因子受容体；（２）サ
イトカイン；および（３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むベク
ターであって、ＣＡＲが（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）ストークドメイン
；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激
シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、ベクタ
ーが提示される。
一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５またはＩＬ－１２である。一部の実
施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非
ウイルスベクターである。一部の実施形態では、トランケート型表皮増殖因子受容体は、
配列番号６５または配列番号６６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一
性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５は、膜結合ＩＬ－１５
である。一部の実施形態では、膜結合ＩＬ－１５は、配列番号１６１をコードするヌクレ
オチド配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるベクターのうちのいずれかは、自己切断型
トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドをコードするヌクレオ
チド配列をさらに含みうる。一部の実施形態では、骨格はＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔ
ｙトランスポゾンＤＮＡプラスミドまたはｐＦＵＧＷである。一部の実施形態では、本明
細書で提示されるベクターのうちのいずれかは、プロモーターをさらに含みうる。一部の
実施形態では、プロモーターは、ｈＥＦ１ａ１である。一部の実施形態では、ＭＵＣ１６
抗原結合性ドメインは：（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１２、および１４に示され
るアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有す
るポリペプチド；（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１１、１３、および１５に示さ
れるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有
するポリペプチド；および（ｃ）配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少
なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６
％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドのうちの少
なくとも１つを含む。一部の実施形態では、ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインは、配列番号
２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１０
０％の同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ストークドメインは、
配列番号１６のアミノ酸配列との少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチ
ドを含む。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢを含む。一
部の実施形態では、４－１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２２のアミノ
酸配列との少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８を含む。一部の実施形
態では、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列との、
少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ
３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％
、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または
１００％の同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドを含む。一部の実施形態では、各ベクタ
ーは発現プラスミドを含む。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉ
ｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。
本明細書では、本明細書で提示されるヌクレオチドのうちのいずれかを含む免疫エフェ
クター細胞が提示される。本明細書では、（１）細胞タグ（２）ＩＬ－１５および（３）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫エフェクター細胞であって、ＣＡＲが（ａ）ＭＵ
Ｃ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４
－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ
）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、免疫エフェクター細胞が提示される。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５は、膜結合ＩＬ－１５である。一部の実施形態では、
膜結合ＩＬ－１５は、配列番号１６１のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、
細胞タグは、ＨＥＲ１ｔを含み、ＨＥＲ１ｔは、配列番号６５のポリペプチド配列を含む
。一部の実施形態では、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔ－１を含み、ＨＥＲ１ｔ－１は、配列番
号６６のポリペプチド配列を含む。
本明細書では、本明細書で記載されるベクターのうちのいずれかを含む免疫エフェクタ
ー細胞が提示される。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）
細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、または調節性Ｔ細胞である。一部の実施形態で
は、ＣＡＲは、配列番号２７～５７のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。
本明細書では、それを必要とするヒト対象において標的細胞集団または組織にＴ細胞媒
介性免疫応答を刺激するための方法であって、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された
有効量の細胞をヒト対象に投与するステップを含み、ＣＡＲが（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合
性ドメイン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４－１ＢＢもしく
はＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナ
ル伝達ドメイン；および（ｆ）トランケート型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔ）を含む
、方法が提示される。一部の実施形態では、ヒトは、卵巣がんおよび乳がんのうちの少な
くとも１つを伴うと診断されている。一部の実施形態では、卵巣がんまたは乳がんは、再
発性または不応性の卵巣がんまたは乳がんである。
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、ＣＡＲが
、（ａ）配列番号１～１５または２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも
１つを伴うＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を伴うス
トークドメイン；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を伴うＣＤ２８を含む共刺激シグナ
ル伝達ドメイン；（ｄ）配列番号６５のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔおよび配列番号６
６のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔ－１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ；お
よび（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を伴うＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む
、単離核酸が提示される。
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、ＣＡＲが
、（ａ）配列番号１～１５または２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも
１つを伴うＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を伴うス
トークドメイン；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を伴う４－１ＢＢを含む共刺激シグ
ナル伝達ドメイン；（ｄ）配列番号６５のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔおよび配列番号
６６のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔ－１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ；
および（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を伴うＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含
む、単離核酸が提示される。
本明細書では、本明細書で記載される１または複数のポリヌクレオチドのいずれかを含
むベクターが提示される。一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、
レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウ
イルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。一部の実施
形態では、ベクターは、複数のベクターである。
本明細書では、免疫エフェクター細胞においてＣＡＲを発現するための系であって、本
明細書で提示される単離核酸をコードする１または複数のベクターを含む系が提示される
。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。一部の
実施形態では、本明細書で提示される系は、少なくとも１つのさらなる遺伝子をコードす
る核酸をさらに含みうる。一部の実施形態では、さらなる遺伝子は、サイトカインを含む
。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２
１、ならびにＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαの融合体のうちの少なくとも１つを含む。
一部の実施形態では、サイトカインは、分泌形態にある。一部の実施形態では、サイトカ
インは、膜結合形態にある。一部の実施形態では、系は、１つのベクターを含む。一部の
実施形態では、１または複数のベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベ
クター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは
、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。一部の実施形態では、本明細
書で提示される系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含みう
る。一部の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、ＳＢ１
１、ＳＢ１００Ｘ、またはＳＢ１１０である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細
胞は哺乳動物細胞である。
本明細書では、免疫エフェクター細胞においてＣＡＲを発現する方法であって、免疫エ
フェクター細胞を本明細書で記載される系と接触させるステップを含む方法が提示される
。
本明細書では、操作Ｔ細胞の増殖および／または生存を刺激する方法であって、（ａ）
細胞試料を、対象から得るステップであって、試料がＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を含む
、ステップ；（ｂ）細胞に、請求項１から３４および４７から５２のいずれか一項で提示
される単離核酸をコードする１または複数のベクター、ならびにトランスポザーゼをコー
ドするベクターをトランスフェクトし、操作ＭＵＣ１６ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団をもた
らすステップ；（ｃ）および、任意選択で、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を２日間
またはそれ以下の間、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて培養するステップを含む方法が提示される
。
一部の実施形態では、操作Ｔ細胞の増殖および／または生存を刺激する方法は、細胞に
、サイトカインをコードするベクターをトランスフェクトするステップをさらに含みうる
。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαを含む融合タ
ンパク質である。一部の実施形態では、１または複数のベクターは、レンチウイルスベク
ター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では
、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。一部
の実施形態では、方法は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含
みうる。一部の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、Ｓ
Ｂ１１、ＳＢ１００ＸまたはＳＢ１１０である。
本明細書では、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、有効量の
操作Ｔ細胞の１または複数の用量を対象に投与するステップを含み、操作Ｔ細胞がＭＵＣ
１６ ＣＡＲおよび膜結合ＩＬ－１５を含む、方法が提示される。一部の実施形態では、
有効量の操作Ｔ細胞の第１の用量が、腹腔内に投与される。一部の実施形態では、有効量
の操作Ｔ細胞の第２の用量が、静脈内に投与される。一部の実施形態では、がんは卵巣が
んである。一部の実施形態では、がんは乳がんである。一部の実施形態では、ＭＵＣ１６
ＣＡＲは、配列番号９５～１０７、１１９～１４９、または１９４～１９５に示される
配列のうちのいずれか１つによってコードされる。一部の実施形態では、膜結合ＩＬ－１
５は、配列番号１６１によってコードされる。一部の実施形態では、操作Ｔ細胞の有効量
は、１ｋｇ当たり少なくとも１０２個の細胞である。一部の実施形態では、操作Ｔ細胞の
有効量は、１ｋｇ当たり少なくとも１０４個の細胞である。一部の実施形態では、操作Ｔ
細胞の有効量は、１ｋｇ当たり少なくとも１０５個の細胞である。
図面の簡単な説明
本開示の特徴は、特に、付属の特許請求の範囲において明示されている。本開示の特徴
および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、例示的な実施形態を
明示する、以下の詳細な記載および付属の図面を参照することにより得られるであろう。
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系についての概略的描示を示す図である。ＭＵＣ１６ ＣＡＲおよび膜結合ＩＬ１５（ｍｂＩＬ１５）トランスポゾンなどのサイトカインをコードするＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ由来ＤＮＡプラスミド、ならびにＳＢトランスポザーゼをコードするＤＮＡプラスミドは、例えば電気穿孔法によって、免疫エフェクター細胞へと送達する。操作免疫エフェクター細胞は、本明細書で記載されるＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ）法下で製造されうる。ある特定の場合には、ＭＵＣ１６ ＣＡＲおよび／またはサイトカインは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける条件付けアブレーションのために、細胞タグまたはキルタグと共に共発現されうる。 遺伝子スイッチ構成要素を伴う異なる構成での、ＭＵＣ１６ ＣＡＲおよびサイトカインのための例示的な遺伝子発現カセットを描示する図である。 異なるストーク長を有するＭＵＣ１６ ＣＡＲの例示を描示する図である。 ＣＡＲ、ｍｂＩＬ１５およびＨＥＲ１ｔ１トランス遺伝子の発現を示す図である。Ｔ細胞に、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１またはＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１トランスポゾンおよびＳＢトランスポザーゼをヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後１日目において、トランス遺伝子の発現を測定した。細胞は、ＣＤ３＋生細胞についてゲートをかけられた。示したデータは、３人の健常なドナーからの平均±ＳＥＭである。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ８アルファヒンジ領域由来の異なるスペーサー長のＭＵＣ１６ ＣＡＲの発現を示す図である。ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、健常なドナーのＴ細胞（ドナー番号Ｄ１３３０９８）においてＳＢ系プラスミドの電気穿孔法によって作出した。週に１回の刺激により、ＭＵＣ１６ｔを発現するＡａＰＣを用いた共培養により、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡＲ－Ｔ細胞を数的に拡大増殖させた。ＣＡＲの発現は、ヌクレオフェクション後１日目および８日目においてマルチパラメーターのフローサイトメトリーによって測定した。試験物は表６に列挙する。 ＣＤ８アルファヒンジ領域由来の異なるスペーサー長のＭＵＣ１６ ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を示す図である。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、健常なドナーのＴ細胞（ドナー番号Ｄ１３２５５２）においてＳＢ系プラスミドの電気穿孔法によって作出した。週に１回の刺激により、ＭＵＣ１６ｔを発現するＡａＰＣを用いた共培養により、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡＲ－Ｔ細胞を数的に拡大増殖させた。ＣＡＲの発現は、ヌクレオフェクション後１日目および８日目においてマルチパラメーターのフローサイトメトリーによって測定した。試験物は表７に列挙する。 ＭＵＣ１６ ＣＡＲ発現のウェスタンブロット解析を示す図である。ＭＵＣ１６ ＣＡＲ発現は、マウス抗ヒトＣＤ３ζ抗体での染色によって測定した。レーン１：タンパク質マーカー；レーン２：ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞；および３：ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞。 ｍｂＩＬ１５発現のウェスタンブロット解析を示す図である。ｍｂＩＬ１５発現は、抗ＩＬ－１５抗体での染色によって測定した。レーン１：タンパク質マーカー；レーン２：ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞およびレーン３：ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞。 ＨＥＲ１ｔ１発現のウェスタンブロット解析を示す図である。ＨＥＲ１ｔ１発現は、免疫沈降法後、ウェスタンブロットによって測定した。レーン１：ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞；レーン２：ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞；レーン３：細胞溶解物を含まない免疫沈降対照；レーン４：Ａ４３１細胞株溶解物；およびレーン５：タンパク質マーカー。 試験した様々な腫瘍細胞株におけるＭＵＣ１６発現のフローサイトメトリー解析を示す図である。 ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的細胞傷害性を示す図である。変動させたＥ：Ｔ比での様々な腫瘍細胞株に対する、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞およびＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞の細胞傷害性。対照ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は陰性対照として利用した。３人のドナーからの３連のウェルの平均±ＳＥＭを示す。 様々な腫瘍細胞株を用いた共培養時のＭＵＣ１６－ＣＡＲ Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示す図である。３人の健常なドナーのＴ細胞を使用して作出されたＣＡＲ－Ｔ細胞を、７日間、１：１のＥ：Ｔ比で指定された腫瘍細胞株を用いて共培養した。３人のドナーからの３連のウェルの平均±ＳＥＭを示す。 ルシフェラーゼアッセイでのＭＵＣ１６－ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を示す図である。２人の健常なドナーのＴ細胞から作出されたＣＡＲ－Ｔ細胞を、腫瘍細胞株を用いて培養した。試験物は表８に列挙する。 ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるｍｂＩＬ１５の生物学的機能を示す図である。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、３人の健常なドナーのＴ細胞から作出した。抗原および外因性サイトカインの非存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養におけるＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞およびＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞の存続。各記号は、個々のドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞を表す。３人のドナーからの平均±ＳＥＭを示す。 ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるｍｂＩＬ１５の生物学的機能を示す図である。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、３人の健常なドナーのＴ細胞から作出した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を示す。各記号は、個々のドナーＣＡＲ－Ｔ細胞を表す。３人のドナーからの平均±ＳＥＭを示す。 ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるｍｂＩＬ１５の生物学的機能を示す図である。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、３人の健常なドナーのＴ細胞から作出した。ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞のメモリーマーカー解析を示す。各記号は、個々のドナーＣＡＲ－Ｔ細胞を表す。３人のドナーからの平均±ＳＥＭを示す。 細胞外サイトカインの非存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭＵＣ１６－ＣＡＲ－Ｔ細胞の存続を示す図である。３人の健常なドナーのＴ細胞由来のＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞およびＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞を、２週間、細胞外サイトカインの存在下または非存在下で培養した。サイトカインと共に培養したＴ細胞の分画として、サイトカイン無しで培養した生存Ｔ細胞をグラフ化した。示したデータは、３人のドナーからの平均±ＳＥＭである。 ＨＥＲ１ｔ１を共発現しているＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のセツキシマブ媒介ＡＤＣＣ活性（細胞傷害性％として表される；ｙ軸）を示す図である。同種ＮＫ細胞は、１０：１のＥ：Ｔ比でエフェクター細胞として使用した。セツキシマブは、ＨＥＲ１ｔ１を発現するＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞に対して特異的細胞傷害性を示した。示したデータは、平均±ＳＥＭである。 ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（ＩＶＩＳ）イメージングによって測定されたＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６腫瘍量の定量的解析を示す図である。ＮＳＧマウス（群当たりＮ＝５～７匹のマウス）に、０日目に、ｉ．ｐ．注射によってＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６腫瘍細胞株を投与した。腫瘍保有マウスを、単回のｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．注射によって、異なるＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ処置で処置し、腫瘍量を、一連の処置を介してＩＶＩＳによって定量した。示したデータは、平均±ＳＥＭである。矢印は、ＣＡＲ－Ｔ投与の日を表す。 ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（ＩＶＩＳ）イメージングによって測定されたＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６腫瘍量の定量的解析を示す図である。ＮＳＧマウス（群当たりＮ＝５～７匹のマウス）に、０日目に、ｉ．ｐ．注射によってＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６腫瘍細胞株を投与した。腫瘍保有マウスを、腫瘍細胞投与後５日目に、単回のｉ．ｐ．注射によって異なるＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ処置で処置し、腫瘍量を、一連の処置を介してＩＶＩＳによって定量した。示したデータは、平均±ＳＥＭである。 処置された腫瘍保有ＮＳＧマウスの血液中でのＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の定量を示す図である。ＮＳＧマウス（群当たりＮ＝５～７匹のマウス）に、ｉ．ｐ．注射によってＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６腫瘍細胞株を投与した。腫瘍保有マウスを、腫瘍細胞投与後５日目に、単回のｉ．ｐ．注射によって異なるＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ処置で処置し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、マウス血液試料中のＣＤ８＋ ＨＥＲ１ｔ１＋（図１８Ａ）およびＣＤ４＋ＨＥＲ１ｔ１＋（図１８Ｂ）Ｔ細胞の測定を介して定量した（ｍＬの血液当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞の数；ｙ軸）。示したデータは、平均±ＳＥＭである；各時点で、ｎ＝５～７匹のマウス。 同上。 ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（ＩＶＩＳ）イメージングによって測定されたＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６腫瘍量の定量的解析を示す図である。ＮＳＧマウス（群当たりＮ＝５匹のマウス）に、０日目に、ｉ．ｐ．注射によってＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６腫瘍細胞株を投与した。腫瘍保有マウスを、腫瘍細胞投与後５日目に、単回のｉ．ｐ．注射によって３つの異なる用量のうちの１つのＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置し、腫瘍量を、一連の処置を介してＩＶＩＳによって定量化した。試験物は表９に列挙する。示したデータは、平均±ＳＥＭである。 ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（ＩＶＩＳ）イメージングによって測定されたＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６腫瘍量の定量的解析を示す図である。ＮＳＧマウス（群当たりＮ＝５匹のマウス）に、０日目に、ｉ．ｐ．注射によってＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６腫瘍細胞株を投与した。腫瘍保有マウスを、腫瘍細胞投与後５日目に、単回のｉ．ｐ．注射によって３つの異なる用量のうちの１つのＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置し、腫瘍量を、一連の処置を介してＩＶＩＳによって定量した。試験物は表９に列挙する。示したデータは、平均±ＳＥＭである。
発明の詳細な説明
以下の記載および例は、本発明の実施形態について、詳細に例示する。本発明は、本明
細書で記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして、変動しうること
を理解されたい。当業者は、本発明には、多数の変動および改変がなされ、これらは、そ
の範囲内に包含されることを認識するであろう。
全ての用語は、それらが、当業者により理解される通りに理解されることを意図する。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学
用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有
する。
本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される主
題を限定するものと見なすべきではない。
本発明の多様な特色は、単一の実施形態の文脈で記載しうるが、特色はまた、個別に提
示される場合もあり、任意の適切な組合せで提示される場合もある。逆に、本明細書では
、明確さのために、本発明を、個別の実施形態の文脈で記載しうるが、本発明はまた、単
一の実施形態でも、実施することができる。
以下の定義は、当技術分野における定義を補完し、本出願へと方向付けられ、いかなる
関連または非関連の案件、例えば、共同所有される、いかなる特許または出願にも帰属し
ない。本明細書で記載される方法および材料と、同様または同等である、任意の方法およ
び材料を、本開示の試験の実施において使用しうるが、本明細書では、好ましい材料およ
び方法について記載する。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態
について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するもので
はない。
本出願では、そうでないことが別段に言明されない限りにおいて、単数形の使用は、複
数形を含む。本明細書で使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されな
い限りにおいて、単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、および「その」は、複数の
指示対象を含むことに注意しなければならない。本出願では、そうでないことが言明され
ない限りにおいて、「または」の使用は、「および／または」を意味する。さらに、「～
を含むこと」という用語のほか、「～を含む（include）」、「～を含む（includes）」
、および「含まれた」など、他の形態の使用は、限定的ではない。
本明細書における、「一部の実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または
「他の実施形態」への言及は、実施形態との関連で記載される、特定の特色、構造、また
は特徴が、本発明の、少なくとも一部の実施形態には含まれるが、全ての実施形態には、
必ずしも含まれないことを意味する。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「～を含むこと（comprising）」（「～を
含む（comprise）」および「～を含む（comprises）」など、「～を含むこと（comprisin
g）」の任意の形態）、「～を有すること」（「～を有する（have）」および「～を有す
る（has）」など、「～を有すること」の任意の形態）、「～を含むこと（including）」
（「～を含む（include）」および「～を含む（includes）」など、「～を含むこと（inc
luding）」の任意の形態）、または「～を含有すること」（「～を含有する（contain）
」および「～を含有する（contains）」など、「～を含有すること」の任意の形態）とい
う語は、包含的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されていない要素または方
法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法
または組成物に関して実施することが可能であり、この逆も成り立つことが想定される。
さらに、本発明の組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。
本明細書で使用される基準数値との関係における「約」という用語およびその文法的等
価物は、数値自体およびその数値から±１０％の範囲の値を含みうる。例えば、「約１０
」の量は、１０および９～１１の任意の量を含む。例えば、基準数値との関係における「
約」という用語はまた、値±この値から１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、
３％、２％、または１％の範囲も含む。
「単離」により、その天然環境からの核酸の摘出を意味する。「精製」により、所与の
核酸が、天然から摘出されたもの（ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む）であれ、合成さ
れたもの（ｃＤＮＡを含む）であれ、かつ／または検査室条件下で増幅されたのであれ、
純度が増大しており、この場合、「純度」とは、相対的用語であり、「絶対純度」ではな
いことを意味する。一方、核酸およびタンパク質は、希釈剤またはアジュバントと共に製
剤化される場合があるが、実際的な目的では、単離されているものとしうることを理解さ
れたい。例えば、核酸は、細胞への導入のために使用する場合、許容可能な担体または希
釈剤と混合することが典型的である。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、リボ
ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドのポリ
マー形態を指す。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、この用語は、二
本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、三重鎖ＤＮＡのほか、二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ
も含む。この用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドのメチル化および／またはキャッピ
ングによる修飾形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含みうる。用語はまた、
天然のものではないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドのほか、ヌクレオチド類似体を
含む分子を含むことも意図する。
「ポリペプチド（polypeptide）」とは、「ポリペプチド（polypeptides）」および「
タンパク質（protein(s)）」という用語と交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマー
を指す。「成熟タンパク質」とは、全長タンパク質であり、任意選択で、グリコシル化ま
たは所与の細胞内環境内のタンパク質に典型的な他の修飾を含むタンパク質である。
核酸および／または核酸配列は、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配
列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および／またはタンパク質配列は、それ
らのコードＤＮＡが、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する
場合、相同である。相同な分子は、相同体と称する場合がある。例えば、本明細書で記載
される、任意の天然タンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発法により修飾すること
ができる。発現させると、この突然変異核酸は、元の核酸によりコードされるタンパク質
と相同なポリペプチドをコードする。相同性は一般に、２つまたはこれを超える核酸また
はタンパク質（またはこれらの配列）の間の配列同一性から推定される。相同性を確立す
るのに有用な配列の間の同一性の、正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質と共に
変動するが、少なくとも２５％の配列同一性を使用して、相同性を確立する。高レベルの
配列同一性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５
％、もしくは９９％、またはこれを超える配列同一性もまた、相同性を確立するのに使用
することができる。
ポリペプチドの、２つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、「同一」または
「配列同一性」という用語は、指定された比較域にわたり、最大の照応関係についてアラ
イメントされた場合に同じである、２つの配列内の残基を指す。実施形態の１つのクラス
では、本明細書のポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳ
ＴＰ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア
）により測定される通り、基準ポリペプチドまたはこの断片と少なくとも８０％、８５％
、９０％、９８％の９９％、または１００％同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸
に照らして記載することもでき、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使
用する、ＢＬＡＳＴＮ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメ
ントソフトウェア）により測定される通り、基準核酸またはこの断片と５０％、６０％、
７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％、または１００％同一であり
うる。１つの分子が、大型の分子に対して、ある特定の百分率の配列同一性を有するとい
う場合、これは、２つの分子が最適にアライメントされれば、小型の分子内の、百分率の
残基は、２つの分子が最適にアライメントされた順序に従い、大型の分子内にマッチ残基
を見出すことを意味する。
「トランスポゾン」または「転移性エレメント」（ＴＥ）とは、ゲノム内のその位置を
変化させ、場合によって、突然変異を創出または保存し、細胞のゲノムサイズを変更する
、ベクターＤＮＡ配列である。転移は、ＴＥの重複を結果としてもたらすことが多い。ク
ラスＩのＴＥは、２段階でコピーされる：まず、クラスＩのＴＥは、ＤＮＡからＲＮＡへ
と転写され、次いで、産生されたＲＮＡは、ＤＮＡへと逆転写される。次いで、この、コ
ピーされたＤＮＡは、ゲノム内の新たな位置へと挿入される。逆転写ステップは、ＴＥ自
身によりコードされうる、逆転写酵素により触媒される。レトロトランスポゾンの特徴は
、ＨＩＶなどのレトロウイルスと同様である。クラスＩＩのＴＥによるカットアンドペー
スト転移機構は、ＲＮＡ中間体を伴わない。転移は、いくつかのトランスポザーゼ酵素に
より触媒される。あるトランスポザーゼは、ＤＮＡ内の任意の標的部位に非特異的に結合
するのに対し、他のトランスポザーゼは、特異的ＤＮＡ配列標的に結合する。トランスポ
ザーゼは、標的部位において、互い違いの（staggered）切断をもたらす結果として、５
’側または３’側における、一本鎖のＤＮＡ突出（粘着（sticky）末端）をもたらす。こ
のステップは、ＤＮＡトランスポゾンを切り出し、次いで、ＤＮＡトランスポゾンは、新
たな標的部位へとライゲーションされるが、この過程は、ギャップを埋めるＤＮＡポリメ
ラーゼの活性と、糖リン酸骨格をつなぎ合わせるＤＮＡリガーゼの活性とを伴う。これは
、標的部位の重複を結果としてもたらす。ＤＮＡトランスポゾンの挿入部位は、標的ＤＮ
Ａ内が互い違いに切断され、ＤＮＡポリメラーゼにより埋められることにより創出されう
る短い直接的なリピート、ならびにそれらに続く、トランスポザーゼによるＴＥの切出し
に重要な一連の逆位リピートにより同定されうる。細胞周期のＳ期において、ドナー部位
は既に複製されているが、標的部位はまだ複製されていない場合に転移が生じるとカット
アンドペーストＴＥは重複される。転移は、クラスＩ ＴＥおよびクラスＩＩ ＴＥのい
ずれにおいても、「自律型」または「非自律型」として分類することができる。自律型Ｔ
Ｅが、それ自身で移動しうるのに対し、非自律型ＴＥは、移動するのに、別のＴＥの存在
を必要とする。これは、非自律型ＴＥが、トランスポザーゼ（クラスＩＩの場合）または
逆転写酵素（クラスＩの場合）を欠くためであることが多い。
「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機
構または複製性転移機構による、トランスポゾンの、ゲノムの別の部分への移動を触媒す
る酵素を指す。一部の実施形態では、トランスポザーゼの触媒活性を用いて、遺伝子を、
ベクターからゲノムへと移動させることができる。
本明細書で開示または想定される核酸配列およびベクターは、細胞へと、「トランスフ
ェクション」、「形質転換」、「ヌクレオフェクション」または「形質導入」により導入
することができる。本明細書で使用される「トランスフェクション」、「形質転換」、ま
たは「形質導入」とは、物理的方法または化学的方法を使用することによる、１または複
数の外因性ポリヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。当技術分野では、多くのトラ
ンスフェクション法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿法（例えば、
Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expr
ession Protocols, Humana Press (1991)を参照されたい）；ＤＥＡＥ－デキストラン法
；電気穿孔法；カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法；タングステン粒子
促進型遺伝子銃法（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990));リン酸ストロンチウム共
沈殿法（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）；およびヌクレオフェ
クション（Trompeter et al., J. Immunol. Methods 274:245-256 (2003)）を含む。ファ
ージベクターまたはウイルスベクターは、それらの多くが市販されている、適切なパッケ
ージング細胞内で、感染性粒子を増殖させた後で、宿主細胞へと導入することができる。
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す
。プロモーターは、ＤＮＡの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、
上流に（センス鎖の５’側領域に向かって）位置する。あるプロモーターが、細胞内の全
ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、
誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。
「プロモーター活性」という用語は、その活性が測定されるプロモーターに作動可能に
連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザ
ンブロット解析により、産生されるＲＮＡ転写物の量を決定することにより、直接的に測
定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列など、連結された核酸
配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接的に測定することもできる
。
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子
または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。
誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、
組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。
誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プ
ロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性
プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。一実施形
態では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部である。
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結
された核酸配列の転写を増大させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコー
ド領域から、何キロベースも離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、ＤＮＡ
のメチル化パターン、またはＤＮＡ構造の変化を媒介しうる。当技術分野では、様々な異
なる供給源に由来する、多数のエンハンサーが周知であり、クローニングされたポリヌク
レオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である（例え
ば、ＡＴＣＣなどの寄託先のほか、他の商業的供給源または個人的供給源から）。プロモ
ーター（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなど）を含む、多数のポリヌクレオチドは
また、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流に位置する場合もあ
り、この中に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もある。「Ｉｇエンハンサー
」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座内にマップされるエンハンサー領域に
由来するエンハンサーエレメント（このようなエンハンサーは、例えば、重鎖（ミュー）
５’側エンハンサー、軽鎖（カッパ）５’側エンハンサー、カッパイントロンエンハンサ
ーおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに３’側エンハンサーを含む）を指す（
一般に、Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New Y
ork (1993), pages 353-363、および米国特許第５，８８５，８２７号明細書を参照され
たい）。
本明細書で使用される「コード配列」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドのセグメントを指す。領域または配列には、５’末端の近傍では、開始コドンが結合し
、３’末端の近傍では、終止コドンが結合する。コード配列はまた、オープンリーディン
グフレームと称することもできる。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、ＤＮＡセグメントの、別のＤＮ
Ａセグメントへの、物理的な連結および／または機能的な連結であって、セグメントが、
それらの意図される方式で機能することを可能とするような連結を指す。遺伝子産物をコ
ードするＤＮＡ配列は、それが、例えば、プロモーター、エンハンサー、および／または
サイレンサーなどの調節配列に、ＤＮＡ配列の転写のモジュレーションを、直接的または
間接的に可能とする方式で連結されている場合に、調節配列に作動可能に連結されている
。例えば、ＤＮＡ配列は、それが、プロモーターの転写開始部位に対して、下流において
、転写開始部位に対して、適正なリーディングフレーム内で、プロモーターへとライゲー
ションされており、ＤＮＡ配列を通して、転写の伸長が進行することを可能とする場合に
、プロモーターに作動可能に連結されている。エンハンサーまたはサイレンサーは、それ
が、それぞれ、ＤＮＡ配列の転写を増加または減少させるように、ＤＮＡ配列へとライゲ
ーションされている場合に、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されて
いる。エンハンサーおよびサイレンサーは、ＤＮＡ配列のコード領域の上流に位置する場
合もあり、この下流に位置する場合もあり、この中に埋め込まれている場合もある。シグ
ナル配列が、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、シグナ
ル配列のＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。ＤＮ
Ａ配列の、調節配列への連結は、典型的に、適切な制限部位におけるライゲーションによ
り、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列内に挿入された、ア
ダプターまたはリンカーを介して達せられる。
「転写調節因子」という用語は、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ
配列の転写を防止もしくは阻害するように作用する生化学的エレメント（例えば、リプレ
ッサータンパク質または核阻害性タンパク質）、または、ある特定の環境条件下で、プロ
モーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を可能とするか、もしくは刺激するように作用する生化
学的エレメント（例えば、インデューサーまたはエンハンサー）を指す。
「誘導」という用語は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモー
ターの活性、および／またはプロモーターの発現の、何らかの転写基礎レベルと比べた上
昇を指す。
「標的」遺伝子または「異種」遺伝子または「目的の遺伝子（ＧＯＩ）」とは、遺伝子
導入により宿主細胞へと導入される遺伝子を指す。
本明細書で使用される「リコンビナーゼ」とは、規定された部位の間の部位特異的組換
えを容易としうる酵素群であって、部位が、単一のＤＮＡ分子上で物理的に隔てられてい
るか、または部位が、別個のＤＮＡ分子上に存在する、酵素群を指す。規定された組換え
部位のＤＮＡ配列は、必ずしも同一ではない。組換えの開始は、タンパク質－ＤＮＡ間相
互作用に依存し、酵素群内には、ファージの組込みおよび切出し（例えば、λインテグラ
ーゼ、ΦＣ３１）、環状プラスミドの切断（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（例えば、Ｔｎ３、
ガンマデルタ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ）、代替的遺伝子の発現のためのＤＮＡの反転（例えば、
Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｐｉｎ）、発生時における遺伝子（例えば、アナベナ属（Anabaena）に
よる窒素固定遺伝子）のアセンブリ、および転移（例えば、ＩＳ６０７トランスポゾン）
を触媒する、多数のタンパク質が存在する。大半の部位特異的リコンビナーゼは、進化的
類縁性および機構的類縁性に基づき、２つのファミリーのうちの１つに収まる。これらは
、λインテグラーゼファミリーまたはチロシンリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ
、ＸｅｒＤ）、およびレゾルバーゼ／インテグラーゼファミリー、またはセリンリコンビ
ナーゼファミリー（例えば、ΦＣ３１、ＴＰ９０１－１、Ｔｎ３、ガンマデルタ）である
。
「組換え接合部位」とは、本明細書で記載されるリコンビナーゼ酵素により認識される
、特異的ポリヌクレオチド配列である。典型的に、１つの部位が、標的核酸（例えば、真
核生物または原核生物の染色体またはエピソーム）内に存在し、別の部位が、標的組換え
部位において統合される核酸上に存在する、２つの異なる部位（「相補的部位」と称する
）が関与する。本明細書では、それぞれ、細菌標的およびファージドナーに由来する、接
合（または組換え）部位を指す、「ａｔｔＢ」および「ａｔｔＰ」という用語が使用され
るが、特定の酵素のための組換え部位は、異なる名称を有しうる。組換え部位は、典型的
に、コア領域またはスペーサー領域により隔てられた、左側アームおよび右側アームを含
む。したがって、ａｔｔＢ組換え部位は、ＢＯＢ’［配列中、ＢおよびＢ’は、それぞれ
、左側アームおよび右側アームであり、Ｏは、コア領域である］からなる。同様に、ａｔ
ｔＰとは、ＰＯＰ’［配列中、ＰおよびＰ’は、アームであり、Ｏは、ここでもまた、コ
ア領域である］である。ａｔｔＢ部位と、ａｔｔＰ部位との組換え時、および標的におけ
る、同時の核酸の組込み時に、組み込まれるＤＮＡを挟む組換え部位を、「ａｔｔＬ」お
よび「ａｔｔＲ」と称する。したがって、上記の用語法を使用する、ａｔｔＬ部位および
ａｔｔＲ部位は、それぞれ、ＢＯＰ’およびＰＯＢ’からなる。本明細書における一部の
表示では、「Ｏ」を省き、ａｔｔＢおよびａｔｔＰを、例えば、それぞれ、ＢＢ’および
ＰＰ’と呼ぶ。
「発現ベクター」または「ベクター」とは、細胞内のポリヌクレオチドの複製の自律的
単位として挙動する（すなわち、それ自身の制御下における複製が可能である）か、また
は宿主細胞の染色体への挿入により複製が可能となる、任意の遺伝子エレメント、例えば
、プラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであって、接合させたセグメントの複
製および／または発現をもたらすように、それへと、別のポリヌクレオチドセグメントを
接合させた遺伝子エレメントである。適切なベクターは、プラスミド、トランスポゾン、
バクテリオファージ、およびコスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターは、所望
の宿主細胞中へのベクターのライゲーションまたは挿入を実施し、接合させたセグメント
の発現を実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を含有しうる。このような配列は、宿
主生物に応じて異なり、転写を実施するプロモーター配列、転写を増加させるエンハンサ
ー配列、リボソーム結合性部位の配列、および転写翻訳終結配列を含む。代替的に、発現
ベクターは、ベクターの、宿主細胞のＤＮＡ配列へのライゲーションまたは組込みを伴わ
ずに、その中でコードされる核酸配列の産物を、直接発現させることが可能でありうる。
ベクターはまた、「選択用マーカー遺伝子」も含みうる。本明細書で使用される「選択
用マーカー遺伝子」という用語は、核酸配列を発現する細胞を、対応する選択用薬剤の存
在下で、これと順方向または逆方向に、特異的に選択することを可能とする核酸配列を指
す。当技術分野では、適切な選択用マーカー遺伝子が公知であり、例えば、国際特許出願
公開第１９９２／０８７９６号パンフレットおよび同第１９９４／２８１４３号パンフレ
ット、Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980)、O’Hare et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)、Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 78: 2072 (1981)、Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981
)、Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)、Kent et al., Science, 237: 901-903 (19
87)、Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977)、Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 48: 2026 (1962)、Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980)、ならびに米国特
許第５，１２２，４６４号明細書および同第５，７７０，３５９号明細書において記載さ
れている。
一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することが可能であり、適切な選
択的圧の存在下で、宿主細胞内のＤＮＡの染色体外セグメントとして存続する、「エピソ
ーム発現ベクター」または「エピソーム」である（例えば、Conese et al., Gene Therap
y, 11:1735-1742 (2004)を参照されたい）。代表的な、市販のエピソーム発現ベクターは
、エプスタイン－バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）およびエプスタイン－バーウイルス（ＥＢ
Ｖ）複製起点（ｏｒｉＰ）を用いるエピソームプラスミドを含むがこれらに限定されない
。ベクターである、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１およびＳｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＢＫ－ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰ
の代わりに、Ｔ抗原およびＳＶ４０の複製起点を使用する、エピソームベクターの非限定
的な例を表す。
「がん細胞」とは、既に記載されている通り、多段階腫瘍進行の初期、中期または末期
を経る細胞を指す（Pitot et al., Fundamentals of Oncology, 15-28 (1978)）。これは
、「前がん」細胞を含む、腫瘍進行の初期、中期および末期にある細胞（すなわち、「過
形成」細胞および異形成細胞）、および異形成細胞の腫瘍進行の末期にある腫瘍細胞を含
む。
「転移性」がん細胞とは、がんの原発部位（すなわち、正常、過形成または異形成細胞
からがん細胞が最初に形成された位置）から、原発部位以外の部位へと移動したがん細胞
を指し、その部位において、移動したがん細胞が留まりかつ増殖する。
「がん」とは、卵巣がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、子宮頸がん、膵臓がん、大腸
がん、胃がん、食道がん、口腔がん、舌がん、歯肉がん、皮膚がん（例えば、メラノーマ
、基底細胞癌、カポジ肉腫等）、筋肉がん、心臓がん、肝臓がん、気管支がん、軟骨がん
、骨がん、精巣がん、腎臓がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、骨髄がん、リンパ
腫がん、脾臓がん、胸腺がん、甲状腺がん、脳がん、神経がん、中皮腫、胆嚢がん、眼が
ん（例えば、角膜のがん、ブドウ膜のがん、脈絡膜のがん、斑のがん、硝子体液がん等）
、関節がん（滑膜がんなど）、神経膠芽腫、リンパ腫、および白血病などの、転移性であ
ってもなくてもよい複数のがん細胞を指す。
ＭＵＣ１６
ＣＡ－１２５（がん抗原１２５、腫瘍抗原１２５、または炭水化物抗原１２５）または
ムチン１６としてもまた公知の、ＭＵＣ１６は、糖タンパク質のムチンファミリーのメン
バーである。ＭＵＣ１６は、いくつかの異なるメカニズムによって、腫瘍形成および腫瘍
増殖の進行に役割を果たすことが示されている。ＭＵＣ１６に対する抗体ベースの手法は
、非常にわずかにしか成功していない。したがって、他の処置戦略が必要である。
ＭＵＣ１６は、ＣＡ１２５としても公知の、大炭水化物抗原である。ＭＵＣ１６は、ヒ
ト１９番染色体に位置するＭＵＣ１６遺伝子によってコードされる。ＭＵＣ１６は、３つ
のドメインを含む、高グリコシル化多ドメインＩ型膜貫通タンパク質である。Ｃ末端ドメ
インは、自己タンパク質分解活性を有する複数の細胞外ＳＥＡ（ウニ精巣タンパク質、エ
ンテロキナーゼ、およびアグリン）モジュールを含有する。ＳＥＡは、膜貫通（ＴＭ）ド
メインの近傍に２つのタンパク分解性の部位を持つ。ＣＡ－１２５と称される大きな切断
されたドメインは、酸性ｐＨで循環に放出される。ＣＡ－１２５は、卵巣がんの疾患バイ
オマーカーとして一般に使用される。高度に保存されたトランケート型細胞外膜はＭＵＣ
１６エクトドメインと呼ばれるタンパク質ドメインを係留する。ＭＵＣ１６抗体は、腫瘍
細胞表面に保持されるＭＵＣ１６のエクトドメインに特異的に結合することが同定された
。対象の細胞（がん細胞など）による「ＭＵＣ１６の過剰発現」は、対照細胞（例えば非
癌細胞、正常細胞等）と比較して高レベルの、対象の細胞によって発現されるＭＵＣ１６
タンパク質および／またはｍＲＮＡを指す。
キメラ抗原受容体
本明細書で記載される実施形態では、ＣＡＲは、標的認識のための細胞外抗体由来一本
鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）を含んでもよく、ｓｃＦｖは、膜貫通ドメインおよび／また
は、例えば、Ｔ細胞活性化のためのＣＤ３ζを含む細胞内シグナル伝達ドメインに可撓性
リンカーによって連結されうる。通常、Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで活性化されるとき、そ
れらは一次抗原誘導ＴＣＲシグナル伝達を、サイトカイン（すなわち、ＩＬ－２およびＩ
Ｌ－２１）の産生を誘導し、次いでオートクライン／パラクライン様式でシグナル伝達ル
ープへとフィードバックするＣＤ２８からの二次共刺激シグナル伝達と共に受け取る。こ
のようにして、ＣＡＲは、シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達
ドメイン、または４－１ＢＢシグナル伝達ドメインなどの他の共刺激分子シグナル伝達ド
メインを含みうる。キメラＣＤ２８共刺激は、抗アポトーシス分子の上方制御およびＩＬ
－２の産生、ならびに、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のＴ細胞の拡大増殖によってＴ
細胞の存続を改善する。
一実施形態では、ＭＵＣ１６の様々なエピトープに特異的なモノクローナル抗体由来の
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体であり、例えば、膜貫通ドメインおよびＣＤゼータの
エンドドメインに融合させる。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答
するゼータシグナルの伝達をもたらす。
ある実施形態では、ＣＡＲはエクトドメイン（細胞外）、膜貫通ドメインおよびエンド
ドメイン（細胞内）を有しうる。ＣＡＲエクトドメインの一実施形態では、シグナルペプ
チドは、新生タンパク質を小胞体へと方向付ける。これは、受容体が、例えばグリコシル
化され、細胞膜に係留された場合である。任意の真核生物のシグナルペプチド配列は、機
能性であると予想される。一般に、元々ほとんどの構成要素のアミノ末端に結合されるシ
グナルペプチドが使用される（例えば、軽鎖－リンカー－重鎖の方向性をもったｓｃＦｖ
では、軽鎖の天然のシグナルが使用される）。複数の実施形態では、シグナルペプチドは
、ＧＭ－ＣＳＦＲａ（配列番号５８）またはＩｇＫ（配列番号５９）である。使用されう
る他のシグナルペプチドは、ＣＤ８アルファおよびＣＤ２８由来のシグナルペプチドを含
む。
抗原認識ドメインは、ｓｃＦｖでありうる。しかし、代替物であってもよい。天然のＴ
細胞受容体（ＴＣＲ）アルファおよびベータ単鎖由来の抗原認識ドメインは単一のエクト
ドメイン（例えばＣＤ４エクトドメイン）ならびに連結された、例えばサイトカイン（サ
イトカイン受容体を保有する細胞の認識をもたらす）などの他の認識構成要素を有すると
予想される。例えば、ウイルス関連抗原などの所与の標的を、高親和性で結合するほとん
ど何でも抗原認識領域として使用されうる。
一般に、ＣＡＲは二量体形態で存在し、細胞外ｓｃＦｖ（ＶＬに連結されたＶＨ）領域
、ストークドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達モチーフに連結する融
合タンパク質として発現される。第１世代のＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ３－ζシグ
ナル伝達のみを介してＴ細胞活性化を誘導する。第２世代のＣＡＲは、ＣＤ３－ζおよび
ＣＤ２８、または４－１ＢＢもしくはＯＸ４０などの他のエンドドメインを介するシグナ
ル伝達の活性化をもたらす。第３世代のＣＡＲは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、またはＯＸ４
０などの３つのシグナル伝達モチーフのＣＤ－３ζを含有する組合せを介してＴ細胞を活
性化する。
複数の実施形態では、本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグ
ナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。複数の実施形態では、
細胞外ドメインは、そうでなければ抗原結合性部分またはｓｃＦｖおよびストークドメイ
ンと称する、標的特異的結合エレメントを含む。複数の実施形態では、細胞内シグナル伝
達ドメインまたはそうでなければ細胞質シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達領
域およびゼータ鎖部分を含む。
共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの
部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効果的な応答に必要な抗原受容体以
外の細胞表面分子またはそれらのリガンドである。
複数の実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインと、膜貫通ドメインの間に、ストークド
メインまたはストーク領域が組み込まれる。本明細書で使用される「ストークドメイン」
または「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインをｓｃＦｖまたはポリペ
プチド鎖の細胞質ドメインのいずれかに連結させるように機能する任意のオリゴヌクレオ
チド－またはポリペプチドを意味する。ストークドメインは、Ｆｃヒンジなどの可撓性ヒ
ンジおよび任意選択で、Ｆｃの１または２つの定常ドメインを含みうる。一部の場合には
、ストーク領域は、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域を含む。代替的な場合に、ストーク領域は
、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域および任意選択で、ＣＤ３の部分を含む。場合によ
って、ストーク領域は、国際公開第２０１６／０７３７５５号パンフレットにおいて記載
されている、ＣＤ８αヒンジ領域、ＩｇＧ４－Ｆｃ１２アミノ酸ヒンジ領域（ＥＳＫＹＧ
ＰＰＣＰＰＣＰ）（配列番号１９６）、またはＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。
他の実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインと、膜貫通ドメインの間に、スペーサーが
組み込まれる。スペーサーは、図３に描示されるストーク領域およびストーク伸長領域を
含みうる。一実施形態では、スペーサーは、単一のストーク領域を含みうる。別の実施形
態では、スペーサーは、ストーク領域（「ｓ」として示される）および本明細書では「ｓ
－ｎ」として示されるストーク伸長領域を含みうる。例えば、スペーサーは、１つのスト
ーク領域、および、ｎが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、
１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であってよい、ｓ’－ｎを含み
うる。さらなる実施形態では、ストーク領域を、リンカーを介して、ストーク伸長領域ｓ
’－ｎへと連結することができる。
膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、合成供給源に由来する場合もあ
る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タン
パク質に由来しうる。適切な膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体の、アルファ鎖、ベータ鎖
、またはゼータ鎖の膜貫通領域を含む場合もあり、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３
ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８アルファ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３
３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１
５４に由来する膜貫通領域を含む場合もある。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の場合
もあり、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含みうる。一部の実施形態では、合成
膜貫通ドメインの、一方または両方の末端では、フェニルアラニン、トリプトファン、お
よびバリンのトリプレットが見出される。任意選択で、一部の実施形態では、２～１０ア
ミノ酸の間の長さである、短いオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリペプチドリンカー
は、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成しうる
。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンリンカーである。一部の実施形態
では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む
。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。他の実施形
態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。
細胞内ドメインは、１または複数の共刺激ドメインを含みうる。例示的な共刺激ドメイ
ンは、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０
、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３－ゼータまたはこれらの断片もしくは組
合せを含むがこれらに限定されない。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、Ｃ
Ｄ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ
１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺
激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合
によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３
７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択
される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを
含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（
ＣＤ１３７）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２またはこれらの断片もしくは組合せから選択され
る共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む
。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）
、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは
複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載され
るＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこ
れらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ド
メインであるＣＤ２８およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらのそれぞれの断片を
含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ８およ
びＣＤ２８、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載され
るＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８、またはこの断片を含む。場合によって、本
明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、または
この断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである
ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載される
ＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ８、またはこの断片を含む。一部の場合には、本明
細書で記載されるＣＡＲは、少なくとも１つの、共刺激ドメインであるＤＡＰ１０、また
はこの断片を含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、少なくとも１つの
、共刺激ドメインであるＤＡＰ１２、またはこの断片を含む。
本開示のＣＡＲの、細胞質ドメインとしてまた公知の細胞内シグナル伝達ドメインは、
ＣＡＲを入れた免疫細胞の正常エフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化の一因
となる。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化機能を指す。Ｔ細胞のエフェク
ター機能は、例えば、細胞溶解活性の場合もあり、サイトカインの分泌を含むヘルパー活
性の場合もある。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェク
ター機能シグナルを伝達し、特化機能を実施するように、細胞を方向付ける、タンパク質
の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全体が用いられうるが、多くの場合
、鎖全体を使用することは必要でない。細胞内シグナル伝達ドメインの、トランケートさ
れた部分を使用し、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、このようなトラ
ンケートされた部分を、無傷鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シ
グナル伝達ドメインという用語とは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、
細胞内シグナル伝達ドメインの、任意のトランケートされた部分を含むことが意図される
。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメイン
をさらに含む。場合によって、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼ
ータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、
ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄに由来するドメインを含
む。場合によって、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する
ドメインを含む。
複数の実施形態では、本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核
酸であって、ＣＡＲが、（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）ストークドメイン
；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激
シグナル伝達ドメイン；（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン；および任意選択で、
（ｆ）トランケート型ヒト表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ１）を含む
、単離核酸が提示される。
本明細書で記載されるＣＡＲの機能的部分をコードする核酸配列が、本発明の範囲内に
含まれる。機能的部分は、例えば、親ＣＡＲと同様の程度、これと同程度、またはこれよ
り高い程度に、標的細胞を認識する、または疾患を検出する、処置する、もしくは予防す
る能力を保持するＣＡＲのその一部を包含する。親ＣＡＲをコードする核酸配列に関して
、ＣＡＲの機能的部分をコードする核酸配列は、親ＣＡＲのうちの、例えば、約１０％、
２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはこれを超える親ＣＡ
Ｒを含むタンパク質をコードしうる。
複数の実施形態では、ＣＡＲは、部分のアミノ末端もしくはカルボキシル末端、または
両方の末端に追加のアミノ酸を含有し、その追加のアミノ酸は親ＣＡＲのアミノ酸配列に
は見出されない。望ましくは、追加のアミノ酸は、機能的部分の生物学的活性、例えば、
標的細胞の認識、がんの検出、がんの処置または予防等と干渉しない。より望ましくは、
親ＣＡＲの生物学的活性と比較して、追加のアミノ酸はＣＡＲの生物学的活性を増強する
。
本明細書で使用される「機能的変異体」という用語は、基準ポリペプチドに対する、実
質的または著名な配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドまたはタンパク質を
指し、それがその変異体である、基準ポリペプチドの生物学的活性を保持する。機能的変
異体は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の変異体であって、標的細胞
を、親ＣＡＲと同様の程度、これと同程度、またはこれより高い程度に認識する能力を保
持する変異体を包含する。親ＣＡＲをコードする核酸配列に照らして、ＣＡＲの機能的変
異体をコードする核酸配列は、親ＣＡＲをコードする核酸配列と、例えば、約１０％同一
、約２５％同一、約３０％同一、約５０％同一、約６５％同一、約８０％同一、約９０％
同一、約９５％同一、または約９９％同一でありうる。
本明細書で記載されるＣＡＲ（機能的部分およびこれらの機能的変異体を含む）は、グ
リコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、例えば
、ジスルフィド架橋を介する環化、または酸付加塩への転換および／または任意選択で、
二量体化または多量体化、またはコンジュゲート化を含む。
抗原結合性部分
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、そうでなければ、抗原結合性部
分と称する、標的特異的結合エレメントを含む。複数の実施形態では、細胞上の抗原に特
異的に結合する、所望の抗原結合性部分を操作することにより、目的の抗原をターゲティ
ングするように、本明細書で記載されるＣＡＲを操作する。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＭＵＣ１６に
特異的である（ＭＵＣ１６ ＣＡＲ）。ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現す
ると、Ｔ細胞の特異性を、ヒトＭＵＣ１６へとリダイレクトする。複数の実施形態では、
抗原結合性ドメインは、標的抗原特異的な、抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体の、可変ド
メイン軽鎖（ＶＬ）および可変ドメイン重鎖（ＶＨ）であって、グリシン－セリンリンカ
ーまたはホイットローリンカーなどの可撓性リンカーにより接続されたＶＬおよびＶＨを
含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＭＵＣ１６－
１ ｓｃＦｖ、ＭＵＣ１６－２ ｓｃＦｖ、ＭＵＣ１６－３ ｓｃＦｖ、ＭＵＣ１６－４
ｓｃＦｖ、ＭＵＣ１６－５ ｓｃＦｖ、ＭＵＣ１６－６ ｓｃＦｖ、またはＭＵＣ１６
－７ ｓｃＦｖである。複数の実施形態では、ｓｃＦｖはヒト化されている。一部の実施
形態では、抗原結合性部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ－リンカー－ＶＬま
たはＶＬ－リンカー－ＶＨと方向性をもって連結されたＶＨおよびＶＬを含みうる。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１、３、５、７、９、
１２、および１４（ＭＵＣ１６ ＶＬ）に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つと
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部
分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２、４、６、８、１０
、１１、１３、および１５（ＭＵＣ１６ ＶＨ）に示されるアミノ酸配列のうちのいずれ
か１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原
結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列
番号８３または配列番号１９７）またはリンカーの機能的変異体を伴う、抗原結合性部分
ＶＬ（配列番号１、３、５、７、９、１２、または１４）およびＶＨ（配列番号２、４、
６、８、１０、１１、１３、または１５）を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２５～５７（ＶＨ、Ｖ
Ｌ、およびリンカー）に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つとの、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２（ＭＵＣ１６－１
ＶＨ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１（ＭＵＣ１６－１
ＶＬ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４（ＭＵＣ１６－２
ＶＨ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３（ＭＵＣ１６－２
ＶＬ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号６（ＭＵＣ１６－３
ＶＨ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５（ＭＵＣ１６－３
ＶＬ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号８（ＭＵＣ１６－４
ＶＨ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号７（ＭＵＣ１６－４
ＶＬ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１０（ＭＵＣ１６－５
ＶＨ－Ｌ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポ
リペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１１（ＭＵＣ１６－５
ＶＨ－Ｆ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポ
リペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号９（ＭＵＣ１６－５
ＶＬ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１３（ＭＵＣ１６－６
ＶＨ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペ
プチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１２（ＭＵＣ１６－６
ＶＬ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペ
プチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１５（ＭＵＣ１６－７
ＶＨ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペ
プチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１４（ＭＵＣ１６－７
ＶＬ）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペ
プチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、抗原結合性部分は、配列番号５８のアミノ酸配列との、少なくと
も９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
、または１００％の同一性を有する、ＧＭ－ＣＳＦＲａシグナルペプチドを有する。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２７のアミノ酸配列と
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２８のアミノ酸配列との、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるＣＡＲは、配列番号２９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３０のアミノ酸配列と
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３１のアミノ酸配列と
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３２のアミノ酸配列との、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるＣＡＲは、配列番号３３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３４のアミノ酸配列と
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３５のアミノ酸配列との、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるＣＡＲは、配列番号３６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３７のアミノ酸配列と
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３８のアミノ酸配列との、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるＣＡＲは、配列番号３９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４０のアミノ酸配列と
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４１のアミノ酸配列との、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるＣＡＲは、配列番号４２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４３のアミノ酸配列と
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４４のアミノ酸配列との、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるＣＡＲは、配列番号４５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４６のアミノ酸配列と
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４７のアミノ酸配列との、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるＣＡＲは、配列番号４８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４９のアミノ酸配列と
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５０のアミノ酸配列との、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるＣＡＲは、配列番号５１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５２のアミノ酸配列と
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５３のアミノ酸配列との、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるＣＡＲは、配列番号５４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５５のアミノ酸配列と
の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５６のアミノ酸配列との、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるＣＡＲは、配列番号５７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
ストークドメイン
複数の実施形態では、本発明のＭＵＣ１６ ＣＡＲは、抗原結合性部分と、Ｔ細胞膜と
の間の分離をもたらすストークドメインを含む。複数の実施形態では、ストークドメイン
は、最適なエフェクター－標的膜間距離を確立する。複数の実施形態では、ストークドメ
インは、その標的に到達するように抗原結合性ドメインに可撓性をもたらす。一実施形態
では、ストークドメインは、ＣＤ８アルファヒンジドメインである。
複数の実施形態では、ＣＤ８アルファヒンジドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列
との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。
スペーサー
他の実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとの間に、スペーサー
が組み込まれる。本明細書で記載されるように、スペーサーは、図３で描示されるストー
ク領域およびストーク伸長領域を含みうる。一実施形態では、スペーサーは、単一のスト
ーク領域を含みうる。別の実施形態では、スペーサーは、ストーク領域（「ｓ」として示
される）および本明細書では「ｓ－ｎ’」として示されるストーク伸長領域を含みうる。
例えば、スペーサーは、１つのストーク領域、および、ｎが０、１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または
２０であってよい、ｓ’－ｎを含みうる。さらなる実施形態では、ストーク領域を、リン
カーを介して、ストーク伸長領域ｓ’－ｎへと連結することができる。本明細書で記載さ
れるリンカーは、例えば、ＧＳＧリンカー（配列番号８５）、ＳＧＳＧリンカー（配列番
号８６）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号８３）、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２
００）、および／またはホイットローリンカーを含みうる。
一実施形態では、ストーク領域およびストーク伸長領域は、天然起源のポリペプチドに
由来または指定される場合もあり、合成起源のポリペプチドに由来または指定される場合
もある。ストーク領域および／またはストーク伸長領域は、細胞表面タンパク質またはこ
れらの誘導体もしくは変異体に由来するヒンジドメインを含みうる。一部の実施形態では
、ストーク領域および／またはストーク伸長領域は、ＣＤ２８またはＣＤ８アルファ（Ｃ
Ｄ８α）に由来するヒンジドメインを含みうる。一部の実施形態では、各ストーク領域お
よびストーク伸長領域は、ＣＤ８アルファヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、Ｃ
ＴＬＡ－４ヒンジドメイン、ＬＮＧＦＲ細胞外ドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒン
ジ、およびＣＨ２－ＣＨ３ドメインのうちの少なくとも１つに由来しうる。ストーク領域
およびストーク伸長領域は、ＣＤ８アルファヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、
ＣＴＬＡ－４、ＬＮＧＦＲ細胞外ドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、またはＣ
Ｈ２－ＣＨ３ドメインのうちの任意の組合せに個別に由来しうる。例としては、ストーク
領域は、ＣＤ８アルファヒンジドメインに由来してもよく、少なくとも１つのストーク伸
長領域は、ＣＤ２８ヒンジドメインに由来してもよく、したがってハイブリッドスペーサ
ーを生じる。別の例としては、ストーク領域は、ＩｇＧ１ヒンジまたはＩｇＧ４ヒンジに
由来してもよく、少なくとも１つのストーク伸長領域は、ＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメイ
ンに由来してもよい。
ある特定の実施形態では、ストーク領域は、１または複数の二量体化部位を含み、ホモ
またはヘテロ二量体化キメラポリペプチドを形成しうる。他の実施形態では、ストーク領
域または１もしくは複数のストーク伸長領域は、二量体化部位を完全に消失する変異を含
有しうる。一部の実施形態では、ストーク伸長領域は、ストーク領域と比較して少なくと
も１つ少ない二量体化部位を含有しうる。例えば、ストーク領域が２つの二量体化部位を
含む場合、ストーク伸長領域は１または０の二量体化部位を含みうる。別の例としては、
ストーク領域が１つの二量体化部位を含む場合、ストーク伸長領域はゼロの二量体化部位
を含みうる。一部の例では、ストーク伸長領域は、二量体化部位を欠損する。
本明細書で開示される実施形態の一部の態様では、対象抗原結合ポリペプチドのストー
ク領域は、ＣＤ８アルファヒンジドメインに対する、少なくとも約６５％、７０％、７５
％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれを超える同一性を伴う配列を含
む。ＣＤ８アルファヒンジドメインは、配列番号１６に示される配列に対する、少なくと
も６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれを超え
る同一性を伴うポリペプチド配列を含みうる。場合によって、ストーク伸長領域は、配列
番号１６に示される配列に対する、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９５％、またはこれを超える同一性を伴うポリペプチド配列を含む。場合によ
って、ストーク伸長領域は、配列番号１０８に示される配列に対する、少なくとも６５％
、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはこれを超える同一性を伴う
ヌクレオチド配列を含む。一部の例では、ストーク領域およびストーク伸長領域は、配列
番号１６に示される配列に対する、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９５％、またはこれを超える同一性を伴うポリヌクレオチド配列を共に含みう
る。
膜貫通ドメイン
複数の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲストークドメインの細胞外ドメインに融合され
る膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲのドメインの１つと天然では会合する
膜貫通ドメインが使用される。複数の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜を貫通する疎
水性アルファヘリックスである。
膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、合成供給源に由来する場合もあ
る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タン
パク質に由来しうる。本発明で特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体の、アルファ
鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ
５、ＣＤ８アルファ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、Ｃ
Ｄ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来する（すなわち、これら
の少なくとも膜貫通領域を含む）場合もある。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の場合
もあり、この場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を優先的に含む。複数の実施
形態では、合成膜貫通ドメインの各端では、フェニルアラニン、トリプトファン、および
バリンのトリプレットが見出される。任意選択で、複数の実施形態では、２～１０アミノ
酸の間の長さである、短いオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、
ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成しうる。複
数の実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンリンカーである。
複数の実施形態は、本明細書で記載されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファ
膜貫通ドメインである。複数の実施形態では、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインは、配列番
号２０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチド
を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫
通ドメインである。複数の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号２１のア
ミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチドを含む。
細胞質ドメイン（共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメイン）
本明細書で記載されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインとしてまた公知の細胞質ド
メインは、ＣＡＲを入れた免疫細胞の正常エフェクター機能のうちの少なくとも１つの活
性化の一因となる。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化機能を指す。Ｔ細胞
のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性の場合もあり、サイトカインの分泌を含む
ヘルパー活性の場合もある。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は
、エフェクター機能シグナルを伝達し、特化機能を実施するように、細胞を方向付ける、
タンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全体が用いられうるが、
多くの場合、鎖全体を使用することは必要ではない。細胞内シグナル伝達ドメインの、ト
ランケートされた部分を使用し、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、こ
のようなトランケートされた部分を、無傷鎖の代わりに使用することができる。したがっ
て、細胞内シグナル伝達ドメインという用語とは、エフェクター機能シグナルを伝達する
のに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの、任意のトランケートされた部分を含むこと
が意図される。
本明細書で記載されるＣＡＲでの使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗
原受容体結合後にシグナル伝達を開始するのに共に作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およ
び共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体および同じ
機能的能力を有する任意の合成配列を含みうる。
ＴＣＲ単独を介して生成されるシグナルは、通常、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分で
あり、二次シグナルまたは共刺激シグナルもまた必要である。したがって、Ｔ細胞活性化
は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されうる：ＴＣＲを介し
て抗原依存的な一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および抗原非
依存的な方法で二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすように作用するもの（二次
細胞質シグナル伝達配列）。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激する方法、または阻害する方法のいずれかでＴＣ
Ｒ複合体の一次活性化を制御する。刺激する方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列
は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知の、シグナル伝
達モチーフを含有しうる。
本発明での特定の使用のための、一次細胞質シグナル伝達配列を含有する、ＩＴＡＭの
例は、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ
３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄ由来のも
のを含む。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの細胞質シグナル伝達分子
は、ＣＤ３ゼータ由来の細胞質シグナル伝達配列を含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、それ自体により、または本明細書で
記載されるＣＡＲの文脈において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて
、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含むように指定されうる。例えば、ＣＡＲの細
胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含みうる。共刺激
シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激
分子は、抗原に対するリンパ球の十分な応答に必要な、抗原受容体またはそれらのリガン
ド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ
（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関
連抗原－１（ＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＤＡ
Ｐ１０、ＤＡＰ１２、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンド等を含む。複数の実施
形態では、共刺激分子が共に使用されうる、例えば、ＣＤ２８と４－１ＢＢまたはＣＤ２
８とＯＸ４０。したがって、本発明は、共刺激シグナル伝達エレメントとして主に４－１
ＢＢとＣＤ２８によって例示されるが、他の共刺激エレメントも本発明の範囲内である。
本明細書で記載されるＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は
ランダムな順序または特定の順序で互いに連結されうる。任意選択で、２～１０アミノ酸
の間の長さである、短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーは、連結を形成しう
る。グリシン－セリン対は、特定の適切なリンカーをもたらす。
一実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ
２８のシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼー
タのシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。さらに別の
実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインならびにＣＤ２
８および４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの細胞質ドメインは、４－１ＢＢのシグ
ナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含み、４－１ＢＢのシグ
ナル伝達ドメインは、配列番号２２のポリペプチド配列との、少なくとも９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％
の同一性を有する、ポリペプチド配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、
配列番号２６の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ポリペプチ
ド配列を含む。
一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ２８のシグナ
ル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含むようにデザインされ、
ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号２３のポリペプチド配列との、少なくとも
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、
または１００％の同一性を有する、ポリペプチド配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝
達ドメインは、配列番号２６のポリペプチド配列との、少なくとも９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一
性を有する、ポリペプチド配列を含む。
一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの細胞質ドメインは、４－１ＢＢのシグ
ナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含み、４－１ＢＢのシグ
ナル伝達ドメインは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナ
ル伝達ドメインは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む。
さらなる遺伝子エレメント
細胞療法は、ヒト疾患の処置のために、極めて有望であるが、細胞自体またはそれらの
トランス遺伝子産物に由来する著明な毒性は、臨床的探索を妨げている。本明細書で記載
される、複数の実施形態では、哺乳動物対象、例えば、ヒトへと輸注された、本明細書で
記載されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞は、それらの使用から、毒性が生じる場合
は、このような免疫エフェクター細胞の効果を調節するために、枯渇させることができる
。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、ＭＵＣ１６特異的キメ
ラ抗原受容体に加えて、第２の遺伝子もまた、本明細書で記載される、操作免疫エフェク
ター細胞へと導入される。第２の遺伝子は、効果的に、ＭＵＣ１６ ＣＡＲまたはＭＵＣ
１６ ＣＡＲ／ｍｂＩＬ－１５を含有する細胞の枯渇を可能とする、「キルスイッチ」で
ある。ある特定の実施形態では、「キルスイッチ」とは、ＨＥＲ１またはＣＤ２０の、少
なくとも１つの抗体結合性エピトープまたはその機能的断片と、任意選択で、シグナルポ
リペプチド配列またはその断片とを含むＨＥＲ１ポリペプチドまたはＣＤ２０ポリペプチ
ドを含むＨＥＲ１タグまたはＣＤ２０タグである。
ある特定の実施形態では、第２の遺伝子は、表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１）またはこ
の断片もしくは変異体である、ＨＥＲ１タグである。複数の実施形態では、第２の遺伝子
は、トランケート型ヒト表皮増殖因子受容体１（例えば、ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ１
）である、ＨＥＲ１タグである。場合によって、第２の遺伝子は、ヒトトランケート型ヒ
ト表皮増殖因子受容体１の変異体である。複数の実施形態では、ＨＥＲ１、ＨＥＲ１ｔ、
およびＨＥＲ１ｔ１のうちの少なくとも１つは、ＦＤＡにより承認されているセツキシマ
ブ、またはＨＥＲ１、ＨＥＲ１ｔ、および／もしくはＨＥＲ１ｔ１を認識する任意の抗体
の投与を介して、輸注されたＣＡＲ－Ｔ細胞の枯渇を可能にすることにより、安全性機構
をもたらす。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ遺伝子は、配列番号６５の核酸配列との、
少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％、または１００％の同一性を有する、ヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態
では、ＨＥＲ１ｔ１遺伝子は、配列番号６６の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％
の同一性を有する、ヌクレオチド配列を含む。トランケート型ＨＥＲ１配列、例えば、Ｈ
ＥＲ１ｔおよびＨＥＲ１ｔ１は、セツキシマブの、受容体への結合を無傷に保ちながら、
ＥＧＦリガンドへの結合、ＥＧＦＲのホモ二量体化およびヘテロ二量体化、ならびにＥＧ
ＦＲ媒介性シグナル伝達の潜在的可能性を消失させる（Ferguson, K., 2008. A structur
e-based view of Epidermal Growth Factor Receptor regulation. Annu Rev Biophys, V
olume 37, pp. 353-373）。
さらなる実施形態では、本発明の、治療用のＭＵＣ１６に特異的なキメラ抗原受容体に
加えて、導入される第２の遺伝子は、ＣＤ２０タグである。場合によって、ＣＤ２０タグ
は、全長ＣＤ２０ポリペプチド、またはトランケート型ＣＤ２０ポリペプチド（ＣＤ２０
ｔ－１）である。場合によって、ＣＤ２０タグ、例えば、ＣＤ２０またはＣＤ２０ｔ－１
はまた、ＦＤＡにより承認されているリツキシマブ療法の投与を介して、輸注されたＣＡ
Ｒ－Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構も可能とする。ある特定の実施形
態では、ＣＤ２０タグは、配列番号３６の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、
９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を
有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２０タグは、ＣＤ２０
ｔ－１タグであり、配列番号６の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、
９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポ
リペプチド配列を有する。一部の実施形態では、ＣＤ２０タグは、配列番号１６０の核酸
配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ＣＤ２０
遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＣＤ２０タグは、配列番号１６０の
核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ＣＤ
２０ｔ－１遺伝子によってコードされる。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを含むＣＡＲベクターは、配列番号
１５９の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む全長
ＣＤ２０タグをさらに含む。
複数の実施形態では、キルタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ－１、ＣＤ２０、ま
たはＣＤ２０ｔ－１タグをコードする遺伝子を、ＭＵＣ１６ ＣＡＲへと、インフレーム
の、３’端に、例えば、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチ
ドであるがこれらに限定されない、自己切断型ペプチドを介して、遺伝子融合させる。複
数の実施形態では、Ｔ２Ａペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列との、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
複数の実施形態では、キルタグ遺伝子を、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ遺伝子とインフレームで
、レンチウイルスプラスミド骨格へとクローニングする。他の実施形態では、キルタグを
、別個のレンチウイルスベクターへとクローニングする。他の実施形態では、両方の遺伝
子を、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターへとクローニングする。
さらに他の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ－１、ＣＤ２０またはＣＤ２０ｔ－１
などのキルタグを、別個のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターへと
クローニングする。ある特定の実施形態では、キルタグは、シグナルペプチド、例えば、
ＧＭ－ＣＳＦＲａシグナルペプチドを有し、この場合、ＧＭーＣＳＦＲａシグナルペプチ
ドは、配列番号５８のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。あ
る特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号５９の核酸配列と、少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の同一性を有する、ＩｇＫ配列である。場合によって、シグナルペプチドは
、ＩｇＥ、ＣＤ８α変異体およびこれらの断片から選択することができる。
本明細書で記載されるＣＡＲおよびキルタグをコードする例示的な遺伝子発現カセット
が図１および図２に示される。
例示的なＣＡＲのオープンリーディングフレーム
本明細書で記載される方法および組成物によって包含される例示的なＣＡＲおよびヒト
ＭＵＣ１６受容体のオープンリーディングフレームは、表１に列挙する：
複数の実施形態では、本明細書では、ＣＡＲをコードする単離核酸であって、ＣＡＲが
、配列番号３～４または配列番号５～６のアミノ酸との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有するポリペプチドを含む、単離核酸が提示される。
「ＭＵＣ１６－２ ｓｃＦｖ」を伴って表１に列挙された実施形態の各々では、ＣＡＲ
抗原結合性部分は、配列番号３～４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同
一性を有するポリペプチドを含む、ＭＵＣ１６－２ ｓｃＦｖである。複数の実施形態で
は、ＭＵＣ１６－３ ｓｃＦｖは、配列番号５８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％
、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または
１００％の同一性を有するＧＭ－ＣＳＦＲａシグナルペプチドを有する。
「ＣＤ８ａ」を伴う表１の実施形態の各々では、ＣＡＲの膜貫通領域は、配列番号２０
のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、
ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインを含み、ストークドメインは、配列番号１６のアミノ酸配
列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ８ａである
。
「ＣＤ２８ｍ」を伴う表１の実施形態の各々では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番
号２１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を
伴うＣＤ２８を含む。
「Ｔ２Ａ」を伴う表１の実施形態の各々では、ＣＡＲのＯＲＦは、単一のベクターから
の複数の遺伝子産物の産生を可能にする、自己切断型トセア・アシグナ（Thosea asigna
）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドを含む。複数の実施形態では、Ｔ２Ａペプチドは、配列番
号７２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を
有する。
「ＨＥＲ１ｔ」を伴う表１の実施形態では、ＣＡＲのＯＲＦは、ＦＤＡにより承認され
ているセツキシマブ療法の投与を介して、輸注されたＣＡＲ－Ｔ細胞の枯渇を可能にする
ことにより、安全性機構をもたらす、トランケート型ヒト上皮増殖因子受容体１（ＨＥＲ
１ｔ）を含む。本明細書で記載されるＨＥＲ１ｔ遺伝子は、配列番号６５のアミノ酸配列
との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含みうる。表１に
、そうでないことが記されない限りにおいて、ＨＥＲ１ｔタグは、ＧＭ－ＣＳＦＲａシグ
ナルペプチド（「ＧＭ－ＣＳＦＲｓｐ」）（配列番号５８）を有する。ある特定の実施形
態では、ＨＥＲ１ｔは、別のタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ－１と置換されうる。本明細書で
記載されるＨＥＲ１ｔ－１遺伝子は、配列番号６６のアミノ酸配列との、少なくとも９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、また
は１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含みうる。「ＩｇＫｓｐ」を伴う表１の
実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号５９のアミノ酸配列との、少なくとも９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、また
は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＫである。
「４－１ＢＢ」を伴う表１の実施形態では、ＣＡＲのＯＲＦは、配列番号２２のアミノ
酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する共刺
激分子を含む。
「ＦＬ ＣＤ２０」を伴う表１の実施形態では、ＣＡＲのＯＲＦは、配列番号６７のア
ミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、
全長ＣＤ２０タグを含む。ＣＤ２０は、ＦＤＡにより承認されているセツキシマブ療法の
投与を介して、輸注されたＣＡＲ－Ｔ細胞の枯渇を可能にすることにより、安全性機構を
もたらす。他の実施形態では、ＦＬ ＣＤ２０は、配列番号６８のアミノ酸配列との、少
なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むＣＤ２０ｔ－１によっ
て置換されうる。
表１のある特定の実施形態では、ＣＡＲのＯＲＦは、遺伝子転写のための、誘導性プロ
モーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガ
ンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳ
ＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプ
チドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。一部の実施形態では
、ＣＡＲのＯＲＦおよび遺伝子スイッチ構成要素は、図１～２で描示されるように構成さ
れうる。
サイトカイン
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、サイトカインを含むが、限定さ
れない、１または複数のさらなる治療剤と共に対象に投与される。場合によって、サイト
カインは、少なくとも１つのケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホ
カイン、腫瘍壊死因子、またはこれらの変異体もしくは組合せを含む。場合によって、サ
イトカインは、インターロイキンである。場合によって、インターロイキンは、ＩＬ－１
、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９
、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－
１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、Ｉ
Ｌ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９
、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ならびにこれらの機能的な変異体
および断片のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、サイトカインは、膜結
合型の場合もあり、分泌型の場合もある。複数の実施形態では、サイトカインは、可溶性
ＩＬ－１５、可溶性ＩＬ－１５／可溶性ＩＬ－１５Ｒα複合体（例えば、ＡＬＴ－８０３
）である。ある特定の場合では、インターロイキンは、膜結合型ＩＬ－１５（ｍｂＩＬ－
１５）またはＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαの融合体を含みうる。一部の実施形態では、ｍ
ｂＩＬ－１５は、本明細書で記載される改変免疫エフェクター細胞を用いて共発現させう
る、膜結合型キメラＩＬ－１５である。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ－１５は、全長Ｉ
Ｌ－１５Ｒα、またはこれらの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させた
、全長ＩＬ－１５（例えば、天然ＩＬ－１５ポリペプチド）、またはこれらの断片もしく
は変異体を含む。場合によって、ＩＬ－１５を、ＩＬ－１５Ｒαへと、リンカーを介して
、間接的に連結する。場合によって、ｍｂＩＬ－１５は、Hurton et al., “Tethered IL
-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-
specific T cells,” PNAS 2016において記載されている通りである。場合によって、サ
イトカインは、ＣＡＲと同じ免疫エフェクター細胞で発現させる。
さらなる実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞
は、膜結合型ＩＬ－１５（「ｍＩＬ－１５またはｍｂＩＬ－１５」）を発現する。本発明
の態様では、ｍｂＩＬ－１５は、ＩＬ－１５と、ＩＬ－１５Ｒαの間の融合タンパク質を
含む。さらなる実施形態では、ｍｂＩＬ－１５は、配列番号６９のアミノ酸配列との、少
なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の場合では、Ｃ
ＡＲおよびサイトカインは、別個のベクターで発現させる。特定の場合では、ベクターは
、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａ
ｕｔｙトランスポゾンでありうる。
一部の実施形態では、ｍｂＩＬ－１５は、本明細書で記載されるＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１
ｔ－１、ＣＤ２０ｔ－１、またはＣＤ２０などの細胞タグと共に発現される。ｍｂＩＬ－
１５は、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ－１、ＣＤ２０ｔ－１、またはＣＤ２０と共にインフレ
ームで発現されうる。
一部の実施形態では、ｍｂＩＬ－１５は、遺伝子転写のための誘導性プロモーターの制
御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの、リガンド誘導
性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣ
Ｈ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによ
る、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
別の態様では、インターロイキンは、ＩＬ－１２を含みうる。一部の実施形態では、Ｉ
Ｌ－１２は、単鎖ＩＬ－１２（ｓｃＩＬ－１２）、プロテアーゼ感受性ＩＬ－１２、不安
定化ＩＬ－１２、膜結合型ＩＬ－１２、挿入ＩＬ－１２である。一部の場合には、ＩＬ－
１２変異体は、それらの全てが、参照によりそれらの全体において組み込まれる、国際公
開第２０１５／０９５２４９号パンフレット、国際公開第２０１６／０４８９０３号パン
フレット、国際公開第２０１７／０６２９５３号パンフレットにおいて記載されている通
りである。
一部の実施形態では、上記で記載したサイトカインは、遺伝子転写のための誘導性プロ
モーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチのリ
ガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯ
ＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペ
プチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
遺伝子スイッチ
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチド、リガンド誘導性遺伝子スイッチポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリペプチドおよび／またはポリ
ヌクレオチドを組み込む方法および系が提示される。「遺伝子スイッチ」という用語は、
プロモーターと関連する応答エレメントの組合せを指し、例えば、１または複数のリガン
ドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターを組み込んだ遺伝子の発現をモジュレ
ートする、エクジソン受容体（ＥｃＲ）ベースの系を指す。緊密に調節された誘導性遺伝
子発現系または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールのタンパク質の作
製、細胞ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的なゲノミクス、な
らびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形質の調節など、
多様な適用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘導性異種遺伝子
発現系を含みうる。
ＥｃＲベースの遺伝子スイッチの初期形は、キイロショウジョウバエ（Drosophila mel
anogaster）ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）ポリペプチドおよびマウス（Mus musculus）ＲＸＲ（
ＭｍＲＸＲ）ポリペプチドを使用し、これらの受容体が、ステロイドであるポナステロン
Ａの存在下で、哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウスにおいて、レポーター遺
伝子をトランス活性化させることを示した（Christopherson et al., 1992；No et al.,
1996）。その後、Suhr et al., 1998は、非ステロイド系のエクジソンアゴニストである
テブフェノジドが、外因性ヘテロ二量体パートナーの非存在下で、カイコ（Bombyx mori
）ＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）を介して、哺乳動物細胞内のレポーター遺伝子の、高レベルのト
ランス活性化を誘導することを示した。
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書（国際公開第９７／３８１
１７号パンフレット）およびＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９９／０８３８１号明細書
（国際公開第９９／５８１５５号パンフレット）は、外因性遺伝子の発現をモジュレート
するための方法であって、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構
築物が、それに対するリガンドの存在下で、かつ、任意選択で、サイレントパートナーと
して作用することが可能な受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して、遺
伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む、第２のＤＮＡ構築物により活性化する方法
について開示している。この例では、エクジソン受容体を、キイロショウジョウバエ（Dr
osophila melanogaster）から単離した。典型的に、このような系は、最適の活性化をも
たらすために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在
を必要とする。哺乳動物細胞内では、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、哺乳動物レチ
ノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と、ヘテロ二量体化し、これにより、標的遺伝子または異種遺
伝子の発現を、リガンド依存的に調節するのに使用することが可能である。ＰＣＴ国際特
許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書（国際公開第９９／０２６８３号パンフレ
ット）は、カイコガであるカイコ（Bombyx mori）から単離されたエクジソン受容体が、
外因性の二量体パートナーを必要とせずに、哺乳動物系内で機能的であることについて開
示している。
米国特許第６，２６５，１７３号明細書は、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファ
ミリーの多様なメンバーを、遺伝子発現系における使用のための、ＵＳＰの、少なくとも
二量体化ドメインを含むキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ウルトラ
スピラクル受容体（ＵＳＰ）またはこの断片と組み合わせうることについて開示している
。米国特許第５，８８０，３３３号明細書は、植物において使用された、キイロショウジ
ョウバエ（Drosophila melanogaster）のＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）に
よるヘテロ二量体系であって、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメインが、
２つの異なるハイブリッドタンパク質上に位置する、ヘテロ二量体系について開示してい
る。これらの場合の各々では、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメイン（Ｐ
ＣＴ国際特許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書における通りに、天然のＥｃＲ
として、またはＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書における通り
に、修飾ＥｃＲとして）を、単一の分子へと組み込み、ＵＳＰまたはＲＸＲである、他の
ヘテロ二量体パートナーを、それらの天然状態において使用した。
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第０１／０９０５号明細書は、トランス活性化ドメイン
と、ＤＮＡ結合ドメインとを２つの異なるタンパク質上に置くことにより互いから隔てた
、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系が、リガンドの非存在下で、バックグラ
ウンド活性の大幅な低減を結果としてもたらし、リガンドの存在下で、バックグラウンド
を上回る活性の著明な増大を結果としてもたらすことについて開示している。この２ハイ
ブリッド系は、ＰＣＴ出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書およびＰＣＴ出願／米
国出願第９８／１４２１５号明細書の出願において開示されている、２つの系と比較して
、著明に改善された誘導性遺伝子発現モジュレーション系である。２ハイブリッド系は、
ＤＮＡ結合性ドメインが、遺伝子上のＤＮＡ結合性部位に結合すると、トランス活性化ド
メインが、プロモーターを、より効果的に活性化させるように、相互作用タンパク質の対
が、転写活性化ドメインを、ＤＮＡ結合性ドメインに対して、より好適な位置に置く能力
を利用すると考えられる（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号明細書を参照された
い）。２ハイブリッド遺伝子発現系は、核内受容体ポリペプチドへと融合させたＤＮＡ結
合性ドメインをコードする、第１の遺伝子発現カセット、および異なる核内受容体ポリペ
プチドへと融合させたトランス活性化ドメインをコードする、第２の遺伝子発現カセット
である、２つの遺伝子発現カセットを含む。リガンドの存在下では、第１のポリペプチド
の、第２のポリペプチドとの相互作用を促進するコンフォメーション変化が誘導され、こ
れにより、ＤＮＡ結合性ドメインと、トランス活性化ドメインとの二量体化が結果として
もたらされると考えられる。ＤＮＡ結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは、２
つの異なる分子上に存在するので、リガンドの非存在下では、バックグラウンド活性が、
大幅に低減される。
２ハイブリッド系のある特定の修飾はまた、ステロイド性リガンド、例えば、ポナステ
ロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較した場合に、非ス
テロイド性リガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する感受性の改善ももたらした。
すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイド性リガンドは、低リガンド濃度で、
より大きな遺伝子転写活性をもたらした。さらに、２ハイブリッド系は、非修飾ＲＸＲを
切り替えパートナーとして使用する場合に生じうる、ＲＸＲの過剰発現に起因する一部の
副作用も回避する。好ましい２ハイブリッド系では、ＥｃＲまたはＲＸＲの、天然のＤＮ
Ａ結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは除去され、結果として、これらのハイ
ブリッド分子は、細胞内に存在する、他のステロイドホルモン受容体との相互作用の可能
性を低下させ、これにより、副作用の低減を結果としてもたらす。
エクジソン受容体（ＥｃＲ）とは、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、
サブファミリー１、群Ｈ（本明細書では、「群Ｈ核内受容体」と称する）へと分類される
。各群のメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメイン内で、４０～６０％のアミノ酸同一性
を共有する（Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Recepto
r Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163）。エクジソン受容体に加えて、この核内受容体
サブファミリー１、群Ｈの他のメンバーは、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容
体１（ＯＲ－１）、ステロイドホルモン核内受容体１（ＮＥＲ－１）、ＲＸＲ相互作用性
タンパク質１５（ＲＩＰ－１５）、肝臓ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受
容体様タンパク質（ＲＬＤ－１）、肝臓ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓ｘ受容体α（ＬＸＲα
）、ファルネソイドｘ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用性タンパク質１４（ＲＩＰ－１
４）、およびファルネソール受容体（ＨＲＲ－１）を含む。
場合によって、誘導性プロモーター（「ＩＰ」）は、Ｉｎｔｒｅｘｏｎ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ製のＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド
誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチであり
うる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において
組み込まれる、ＰＣＴ／米国出願第２００１／００９０５０号明細書（国際公開第２００
１／０７０８１６号パンフレット）；米国特許第７，０９１，０３８号明細書；同第７，
７７６，５８７号明細書；同第７，８０７，４１７号明細書；同第８，２０２，７１８号
明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００１／０３０６０８号明細書（国際公開第２００２／０
２９０７５号パンフレット）；米国特許第８，１０５，８２５号明細書；同第８，１６８
，４２６号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３５号明細書（国際公開第２
００２／０６６６１３号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，２００号明
細書（米国公開第２０１２０１６７２３９号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／０
０５７０６号明細書（国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット）；米国特許第
７，５３１，３２６号明細書；同第８，２３６，５５６号明細書；同第８，５９８，４０
９号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０９０号明細書（国際公開第２００２
／０６６６１２号パンフレット）；米国特許第８，７１５，９５９号明細書（米国公開第
２００６０１００４１６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３４号明細
書（国際公開第２００３／０２７２６６号パンフレット）；米国特許第７，６０１，５０
８号明細書；同第７，８２９，６７６号明細書；同第７，９１９，２６９号明細書；同第
８，０３０，０６７号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０８号明細書（国
際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，
１９２号明細書（米国公開第２０１１０２１２５２８号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２
００２／００５０２６号明細書（国際公開第２００３／０２７２８９号パンフレット）；
米国特許第７，５６３，８７９号明細書；同第８，０２１，８７８号明細書；同第８，４
９７，０９３号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００５／０１５０８９号明細書（国際公開
第２００５／１０８６１７号パンフレット）；米国特許第７，９３５，５１０号明細書；
同第８，０７６，４５４号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１２７０号明細書
（国際公開第２００９／０４５３７０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４
１，０１８号明細書（米国公開第２００９０１３６４６５号明細書）；ＰＣＴ／米国出願
第２００８／０１１５６３号明細書（国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット
）；米国特許出願公開第１２／２４７，７３８号明細書（米国公開第２００９０１２３４
４１号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００９／００５５１０号明細書（国際公開第２０
１０／０４２１８９号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／１２３，１２９号明細
書（米国公開第２０１１０２６８７６６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１１／０２
９６８２号明細書（国際公開第２０１１／１１９７７３号パンフレット）；米国特許出願
公開第１３／６３６，４７３号明細書（米国公開第２０１３０１９５８００号明細書）；
ＰＣＴ／米国出願第２０１２／０２７５１５号明細書（国際公開第２０１２／１２２０２
５号パンフレット）；および米国特許第９，４０２，９１９号明細書において記載されて
いる系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しうるが
、これらに限定されない。
宿主細胞内の、ＣＡＲおよび／またはサイトカインの発現をモジュレートするための系
であって、本明細書で開示される遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを含む系が提示される。本明細書では、遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺
伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、遺伝子スイッチポリ
ペプチドが、（ａ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメ
イン（ＤＢＤ）を含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）核内受容体リ
ガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイ
ッチポリペプチドを含み；第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチ
ポリペプチドとが、リンカーにより接続されている、ポリヌクレオチドが提示される。一
部の実施形態では、リンカーは、２Ａリンカー、ＧＳＧ－２Ａリンカー、ＧＳＧリンカー
（配列番号８５）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号８６）、フューリンリンク変異体および
これらの誘導体からなる群から選択される、切断可能リンカー配列またはリボソームスキ
ッピングリンカー配列である。ある特定の実施形態では、２Ａリンカーは、ｐ２Ａリンカ
ー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、またはＥ２Ａリンカーである。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）は、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ ＤＢ
Ｄ）、ＬｅｘＡ ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体スー
パーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少な
くとも１つを含む。場合によって、トランス活性化ドメインは、ＶＰ１６トランス活性化
ドメインおよびＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの少なくとも１つを
含む。他の場合には、核内受容体リガンド結合性ドメインは、エクジソン受容体（ＥｃＲ
）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ－１、ステロイドホルモン核内受容
体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質－１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホ
ルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、
受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール（famesol）受容体のうちの少
なくとも１つを含む。一部の実施形態では、核内受容体リガンド結合性ドメインは、配列
番号９１および９２のエクジソン受容体ポリペプチド配列由来である。一部の実施形態で
は、核内受容体リガンド結合性ドメインは、配列番号９１および９２のエクジソン受容体
ポリペプチド配列由来である。
さらに別の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドは、ＥｃＲ核内受容体リ
ガンド結合性ドメインへと融合させたＧＡＬ４ ＤＢＤを含み、第２の遺伝子スイッチポ
リペプチドは、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融
合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む。場合によって、第１の遺伝子スイッチ
ポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されてお
り、リンカーは、２Ａリンカー、ＧＳＧ－２Ａリンカー、ＧＳＧリンカー（配列番号８５
）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号８６）、フューリンリンク変異体およびこれらの誘導体
のうちの１または複数から選択される。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる
、２つまたはこれを超えるポリペプチドは、リンカーポリペプチドをコードする介在配列
により隔てることができる。ある特定の場合では、リンカーは、易切断性リンカーである
。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性リンカーポリペプチドにより連
結された融合タンパク質として発現される。ある特定の実施形態では、易切断性リンカー
ポリペプチドは、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、２Ａ、ＧＳＧ－ｐ２Ａ、ＧＳＧリンカー
（配列番号８５）、およびフューリンリンク変異体のうちの、任意の１または複数であり
うる。ある特定の実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号７２～８６または１
９７～１９９を含む。
場合によって、ウイルス２Ａ配列が使用されうる。２Ａエレメントは、５～１００塩基
対を有するＩＲＥＳより短くなりうる。場合によって、２Ａ配列は、５、１０、１５、２
０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５
、９０、または１００ヌクレオチドの長さを有しうる。２Ａを連結された遺伝子は、単一
のオープンリーディングフレーム内で発現させることができ、「自己切断」は、２Ａポリ
ペプチドＣ末端の、最後の２つのアミノ酸であるＧ－Ｐ間で、共翻訳的に生じることが可
能であり、等量の共発現タンパク質をもたらす。
ウイルス２Ａ配列は、約２０アミノ酸でありうる。場合によって、ウイルス２Ａ配列は
、コンセンサスモチーフである、Ａｓｐ－Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ
－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（配列番号２０１）を含有しうる。コンセンサスモチーフ配列は、共翻
訳的に作用しうる。例えば、グリシン残基とプロリン残基との、正常なペプチド結合の形
成を防止することができ、これは、リボソームスキッピングおよび新生ポリペプチドの切
断を結果としてもたらしうる。この効果は、等モルレベルで、複数の遺伝子をもたらしう
る。
２Ａペプチドは、単一のオープンリーディングフレーム内の、複数のタンパク質の、そ
の後、リボソームスキッピング機構を介して、個別のポリペプチドへと切断されうる、ポ
リペプチドへの翻訳を可能としうる（Funston, Kallioinen et al. 2008）。一部の実施
形態では、２Ａ配列は、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、
およびＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ、ならびにこれらの任意の組合せを含みうる。
場合によって、ベクターは、ＩＲＥＳ配列および２Ａリンカー配列を含みうる。他の場
合には、２Ａペプチドと連結された、複数の遺伝子の発現は、２Ａペプチドに前置された
スペーサー配列（ＧＳＧ（配列番号８５））により容易とすることができる。場合によっ
て、構築物は、スペーサー、リンカー、アダプター、プロモーター、またはこれらの組合
せを組み合わせうる。例えば、構築物は、異なる２Ａペプチドと共に、スペーサー（ＳＧ
ＳＧ（配列番号８６）またはＧＳＧ（配列番号８５））およびフューリンリンカー（Ｒ－
Ａ－Ｋ－Ｒ（配列番号８１））切断部位を有しうる。スペーサーは、Ｉ－ＣｅｕＩ（Ceui
）でありうる。場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは
、疎水性などの化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少な
くとも２つのリンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。他の場合には、複数のリ
ンカーを、ベクター内で使用することができる。例えば、目的の遺伝子は、少なくとも２
つのリンカーにより隔てることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる
、２つまたはこれを超えるポリペプチドは、リンカーポリペプチドをコードする介在配列
により隔てることができる。ある特定の場合には、リンカーは、易切断性リンカーである
。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性介在リンカーポリペプチドによ
り連結された、融合タンパク質として発現する。ある特定の実施形態では、易切断性リン
カーポリペプチドは、配列番号７２～８６または１９７～１９９で記載されるフューリン
リンク、ｆｍｄｖ、ｐ２ａ、ＧＳＧ－ｐ２ａ、および／またはｆｐ２ａのうちの、任意の
１つまたは２つでありうる。
一部の実施形態では、リンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチド内で用いる
ことができる。リンカーは、可撓性リンカー、非可撓性リンカー、ｉｎ ｖｉｖｏ切断可
能リンカー、またはこれらの任意の組合せでありうる。場合によって、リンカーは、機能
的ドメインを、併せて連結する（可撓性リンカーおよび非可撓性リンカーの場合のように
）場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏ切断可能リンカーの場合のように、遊離の機能的ドメイン
を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて放出する場合もある。
リンカーは、生物学的活性を改善し、発現収率を増大させることから、所望の薬物動態
を達成しうる。リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエー
テル（thioesther）も含みうる。
場合によって、本明細書で記載されるリンカー配列は、可撓性リンカーを含みうる。可
撓性リンカーは、接合されるドメインが、ある程度の移動または相互作用を必要とする場
合に適用することができる。可撓性リンカーは、小型、非極性（例えば、Ｇｌｙ）、また
は極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）のアミノ酸から構成されうる。可撓性リンカーは
、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基の連なりから主になる配列（「ＧＳ」リンカー）を有しう
る。可撓性リンカーの例は、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎの配列（配
列番号１９７）を有しうる。コピー数である「ｎ」を調整することにより、この例示的Ｇ
Ｓリンカーの長さを最適化して、機能的ドメインの適切な分離を達成することもでき、必
要なドメイン間相互作用を維持することもできる。ＧＳリンカーのほかに、他の可撓性リ
ンカーも、組換え融合タンパク質に用いることができる。場合によって、可撓性リンカー
はまた、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合もあるが
、可撓性を維持するように、ＴｈｒおよびＡｌａなど、さらなるアミノ酸を含有する場合
もある。他の場合には、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性アミノ酸を使用して、可溶性を改
善することができる。
本明細書で記載されるリンカー配列に含まれる可撓性リンカーは、良好な可撓性および
可溶性をもたらすように、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に
富む場合がある。可撓性リンカーは、ある特定の移動または相互作用が、融合タンパク質
ドメインに所望される場合に適切でありうる。加えて、可撓性リンカーは、非可撓性構造
を有さない場合もあるが、機能的ドメイン間の距離を保持する、受動的リンカーとして用
いられる場合もある。可撓性リンカーの長さを調整して、適正なフォールディングを可能
とすることもでき、融合タンパク質の最適な生物学的活性を可能とすることもできる。
本明細書で記載されるリンカーは、場合によって、非可撓性リンカーをさらに含みうる
。非可撓性リンカーを用いて、ポリペプチドのドメイン間で、一定の距離を維持すること
ができる。非可撓性リンカーの例は、少数を挙げれば、アルファヘリックス形成リンカー
、Ｐｒｏに富む配列、（ＸＰ）ｎ、Ｘ－Ｐｒｏ骨格、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２～５
）（配列番号２０２）でありうる。非可撓性リンカーは、場合によって、αヘリックス構
造を取ることにより、または複数のＰｒｏ残基を含有することにより、比較的剛直な構造
を呈しうる。
本明細書で記載されるリンカーは、場合によって、切断されうる。他の場合に、リンカ
ーは、切断されない。切断されないリンカーは、ｉｎ ｖｉｖｏ過程またはｅｘ ｖｉｖ
ｏ過程を通して１つの分子として作用するように、機能的ドメインを、共有結合的に、一
体に接合しうる。リンカーはまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても切断されうる。切断可能リ
ンカーは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、遊離の機能的ドメインを放出させるように導入する
ことができる。切断可能リンカーは、少数を挙げれば、還元試薬、プロテアーゼの存在に
より切断することができる。例えば、ジスルフィド結合の還元を用いて、切断可能リンカ
ーを作製することができる。ジスルフィドリンカーの場合、グルタチオンなど、チオール
とのジスルフィド交換を介する切断イベントが、切断をもたらしうるであろう。他の場合
には、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、組換え融合タンパク質内のリンカーの切断はまた、ｉｎ
ｖｉｖｏの、病理学的状態（例えば、がんまたは炎症）下、特異的な細胞内または組織
内で発現する場合もあり、ある特定の細胞区画内に拘束される場合もあるプロテアーゼに
よっても実行されうる。場合によって、切断可能リンカーは、切断のターゲティングを可
能としうる。例えば、多くのプロテアーゼの特異性は、拘束区画内のリンカーの緩徐な切
断をもたらしうる。切断可能リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、ま
たはチオエーテルも含みうる。例えば、ヒドラゾンは、血清中の安定性を付与しうる。他
の場合には、ヒドラゾンは、酸性区画内の切断を可能としうる。酸性区画は、最大で７の
ｐＨを有しうる。リンカーはまた、チオエーテルも含みうる。チオエーテルは、非還元性
でありうる。チオエーテルは、細胞内タンパク質分解のためにデザインすることができる
。
ある特定の実施形態では、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、配列番号８２と、少なく
とも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９
０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含む。あ
る特定の実施形態では、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合
タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数
である。ある特定の場合には、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。場合によって
、ｆｍｄｖをコードするＯＲＦは、配列番号１７３の配列を含むか、またはこれからなる
。ある特定の実施形態では、ｆｍｄｖをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７３
と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８
５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは、「ｐ２ａ」リンカーでありうる。ある
特定の実施形態では、ｐ２ａポリペプチドは、配列番号７５と、少なくとも約４５％、５
０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９
７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含みうる。ある特定の実施
形態では、ｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連
結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数でありうる。場
合によって、ｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態では、ｐ２ａ
をコードするＯＲＦは、配列番号１６７の配列を含むか、またはこれからなる。ある特定
の場合には、ｐ２ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６７と、少なくとも４
５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９
５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、または少なくともほぼこ
れらの比率で同一でありうる。
場合によって、リンカーポリペプチドは、「ＧＳＧ－ｐ２ａ」リンカーでありうる。あ
る特定の実施形態では、ＧＳＧ－ｐ２ａリンカーポリペプチドは、配列番号７６と、少な
くとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含みう
る。ある特定の実施形態では、ＧＳＧ－ｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれ
を超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの
１または複数でありうる。場合によって、ＧＳＧ－ｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリ
ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされう
る。ＧＳＧ ｐ２ａをコードするＯＲＦは、配列番号１６８の配列を含みうる。場合によ
って、ＧＳＧ－ｐ２ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６８と、少なくとも
４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、または少なくともほぼ
これらの比率で同一でありうる。
リンカーポリペプチドは、本明細書で提示される「ｆｐ２ａ」リンカーでありうる。あ
る特定の実施形態では、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、配列番号７７と、少なくとも
約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％
、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含みうる。あ
る特定の場合には、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タン
パク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数であ
りうる。場合によって、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態
では、ｆｐ２ａリンカーをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６９と、少なくと
も４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％
、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、または少なくともほ
ぼこれらの比率同一でありうる。
場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性など
の化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも２つの
リンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。配列は、配列番号７２～配列番号８６
、または配列番号１９７～配列番号１９９の配列と、４５％、５０％、５５％、６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％、または１００％同一でありうるか、またはほぼこれらの比率で同一でありうる。
他の場合には、複数のリンカーを、ベクター内で使用することができる。例えば、本明細
書で記載される、目的の遺伝子と、１または複数の遺伝子スイッチポリペプチド配列とは
、少なくとも２つのリンカーにより隔てることができる。場合によって、遺伝子は、２つ
、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または最大で１０のリンカーにより隔て
ることができる。
リンカーは、操作リンカーでありうる。リンカーをデザインする方法は、コンピュータ
計算による方法でありうる。場合によって、コンピュータ計算による方法は、グラフ法を
含みうる。コンピュータ計算法を使用して、データベースから導出された三次元ペプチド
構造のライブラリーから、適切なペプチドを検索することができる。例えば、Ｂｒｏｏｋ
ｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）を使用して、リンカーの選
択されたアミノ酸の間の間隔の距離を測ることができる。
一部の実施形態では、フューリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドを含むポリペプ
チド構築物をコードするポリヌクレオチドが提供されるが、この場合、フューリンポリペ
プチドおよび２Ａポリペプチドが、少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含むポリペプチド
リンカーにより接続されている。場合によって、少なくとも３つの疎水性アミノ酸は、グ
リシン（Ｇｌｙ）（Ｇ）、アラニン（Ａｌａ）（Ａ）、バリン（Ｖａｌ）（Ｖ）、ロイシ
ン（Ｌｅｕ）（Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）（Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ）（Ｐ）、フェ
ニルアラニン（Ｐｈｅ）（Ｆ）、メチオニン（Ｍｅｔ）（Ｍ）、トリプトファン（Ｔｒｐ
）（Ｗ）からなるリストから選択される。場合によって、ポリペプチドリンカーはまた、
１または複数のＧＳリンカー配列、例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号２０３）、（ＳＧ）ｎ
（配列番号２０４）、（ＧＳＧ）ｎ（配列番号１９８）、および（ＳＧＳＧ）ｎ（配列番
号１９９）［配列中、ｎは、０～１５の任意の数でありうる］も含みうる。
ポリペプチド構築物の発現の改善を得る方法であって、第１の機能的ポリペプチドおよ
び第２の機能的ポリペプチドを含む前記ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチ
ドを用意するステップであって、前記第１の機能的ポリペプチドと、第２の機能的ポリペ
プチドとが、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号２０５）との、少なくとも６０％の同一性を伴う
配列を含むリンカーポリペプチドにより接続されている、ステップと；宿主細胞内で、前
記ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、ポリペプチド構築物の発現の、配列
ＡＰＶＫＱ（配列番号２０５）との、少なくとも６０％の同一性を伴う配列を含むリンカ
ーポリペプチドを有さない、対応するポリペプチド構築物と比較した改善を結果としても
たらすステップとを含む方法が提供される。
他の場合には、リンカーは、ＩＲＥＳでありうる。本明細書で使用される「内部リボソ
ーム進入部位（ＩＲＥＳ）」という用語は、内部リボソーム進入部位を意味することが意
図されうる。ＩＲＥＳ配列を含むベクター内では、第１の遺伝子が、その独自の５’－Ｕ
ＴＲを伴う機構である、キャップ依存性のリボソーム走査により翻訳されうるのに対し、
後続の遺伝子の翻訳は、リボソームの、ＩＲＥＳへの直接的な動員により、キャップ非依
存的に達せられうる。ＩＲＥＳ配列は、真核リボソームが結合し、５’キャップ末端に結
合せずに、翻訳を開始することを可能としうる。ＩＲＥＳ配列は、１つの転写物からの、
複数の遺伝子の発現を可能としうる（Mountford and Smith 1995）。
例示的なＩＲＥＳ配列は、配列番号１９２および１９３に見出されうる。ある特定の場
合では、２ｘＲｂｍ３ ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１９２と、
少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうるか
、またはほぼこれらの比率で同一でありうる。ある特定の場合では、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１９３と、少なくとも４５％、５０％、５５
％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％、または１００％同一でありうるか、またはほぼこれらの比率で同一
でありうる。
一部の実施形態では、宿主細胞内の、ＣＡＲおよびサイトカインの発現をモジュレート
するための系であって、第１のポリペプチドをコードする、第１のポリヌクレオチドを含
む、第１の遺伝子発現カセット；第２のポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオ
チドを含む、第２の遺伝子発現カセット；およびリガンドを含み、宿主細胞を、リガンド
の存在下で、第１の遺伝子発現カセットおよび第２の遺伝子発現カセットと接触させると
、ＣＡＲおよびサイトカインが、宿主細胞内で発現するように、第１のポリペプチドおよ
び第２のポリペプチドが、（ｉ）トランス活性化ドメイン；（ｉｉ）ＤＮＡ結合性ドメイ
ン；および（ｉｉｉ）リガンド結合性ドメイン；（ｉｖ）ＣＡＲ；（ｖｉ）サイトカイン
、および／または（ｖｉｉ）細胞タグのうちの１または複数を含む系が提供される。場合
によって、ＣＡＲは、ＭＵＣ１６ ＣＡＲであり、サイトカインはｍｂＩＬ－１５である
。場合によって、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ－１５は、１つの細胞タグと共に共発現
する。ＭＵＣ１６ ＣＡＲおよびｍｂＩＬ－１５は、それぞれ細胞タグと共に共発現する
。他の場合には、ＭＵＣ１６ ＣＡＲは、細胞タグと共に発現し、ｍｂＩＬ－１５は、第
２の細胞タグと共に発現する。遺伝子発現カセットの例示的な構成を、図１および図２に
描示する。他の場合には、ＣＡＲはＭＵＣ１６ ＣＡＲであり、サイトカインはＩＬ－１
２である。場合によって、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ、ＩＬ－１２は、１つの細胞タグと共に共
発現する。場合によって、ＭＵＣ１６ ＣＡＲおよびＩＬ－１２は、それぞれ細胞タグと
共に共発現する。他の場合には、ＭＵＣ１６ ＣＡＲは、細胞タグと共に発現し、ＩＬ－
１２は、第２の細胞タグと共に発現する。
一部の実施形態では、宿主細胞内の、ＣＡＲおよびサイトカインの発現をモジュレート
するための系であって、第１のポリペプチドをコードする、第１のポリヌクレオチドを含
む、第１の遺伝子発現カセット；第２のポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオ
チドを含む、第２の遺伝子発現カセット；およびリガンドを含み、宿主細胞を、リガンド
の存在下で、第１の遺伝子発現カセットおよび第２の遺伝子発現カセットと接触させると
、ＣＡＲおよび／またはサイトカインが、宿主細胞内で発現するように、第１のポリペプ
チドが、（ｉ）トランス活性化ドメイン；（ｉｉ）ＤＮＡ結合性ドメイン；および（ｉｉ
ｉ）リガンド結合性ドメインのうちの１または複数を含み、第２のポリペプチドが、（ｉ
）ＣＡＲ；（ｉｉ）サイトカイン、および／または（ｉｉｉ）細胞タグのうちの１または
複数を含む系が提供される。場合によって、ＣＡＲは、ＭＵＣ１６ ＣＡＲであり、サイ
トカインはｍｂＩＬ－１５である。場合によって、ＭＵＣ１６ ＣＡＲおよびｍｂＩＬ－
１５は、それぞれ細胞タグと共に共発現する。他の場合には、ＭＵＣ１６ ＣＡＲは、第
１の細胞タグと共に発現し、ｍｂＩＬ－１５は、第２の細胞タグと共に発現する。
宿主細胞内の、ＭＵＣ１６ ＣＡＲおよびサイトカインの発現をモジュレートするため
の系の例示的な構成を、図１～２に描示する。一部の実施形態では、遺伝子発現カセット
はウイルス系またはウイルスベースの系を使用して、免疫エフェクター細胞へと導入され
る。本明細書で記載される非ウイルスベースの送達系の例は、ＳＢ１１トランスポゾン系
、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、ＳＢ１１０トランスポゾン系、ｐｉｇｇｙＢａｃトラ
ンスポゾン系を含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、１または複数のＳｌｅｅ
ｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンで免疫エフェクター細胞へと導入される。
ＭＵＣ１６ ＣＡＲ、サイトカイン（ｍｂＩＬ－１５またはＩＬ－１２など）、および
細胞タグの構成的な発現をコードする遺伝子発現カセットの例示的な実施形態が、図１に
描示される。図１ａ～ｂは、多様な構成のＭＵＣ１６ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ－１５、および
細胞タグをデザインする例示的な遺伝子発現カセットを描示する。この実施形態では、遺
伝子発現カセットを、１つのＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンで免疫エフ
ェクター細胞へと導入する。図１ｃ～ｄは、ＭＵＣ１６ ＣＡＲが１つの遺伝子発現カセ
ット内にあってよく、ｍｂＩＬ－１５および細胞タグが第２の遺伝子発現カセット内にあ
る、遺伝子発現カセット構成を描示する。この実施形態では、遺伝子発現カセットを、１
または複数のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンで免疫エフェクター細胞へ
と導入する。
ＭＵＣ１６ ＣＡＲ、サイトカイン（ｍｂＩＬ－１５など）、および／または細胞タグ
の誘導性発現をコードする遺伝子発現カセットの例示的な実施形態が、図２に描示される
。図２ａ～ｄは、誘導性プロモーターの制御下での、多様な構成のＭＵＣ１６ ＣＡＲ、
ｍｂＩＬ－１５、および細胞タグをデザインする例示的な遺伝子発現カセットを描示する
。図２ｅは、本明細書で記載される遺伝子スイッチポリペプチドをコードする遺伝子発現
カセットの例示的な実施形態である。この実施形態では、遺伝子発現カセットを、１また
は複数のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンで免疫エフェクター細胞へと導
入する。
リガンド
一部の実施形態では、誘導性遺伝子スイッチの調節のために使用されるリガンドは、以
下：Ｎ－［（１Ｒ）－１－（１，１－ジメチルエチル）ブチル］－Ｎ’－（２－エチル－
３－メトキシベンゾイル）－３，５－ジメチルベンゾヒドラジド（ベレジメクスともまた
称する）、（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－［（
２Ｓ，３Ｒ）－３，６－ジヒドロキシ－６－メチルヘプタン－２－イル］－２，３，１４
－トリヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１
６，１７－デカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－６－オン；Ｎ’－（
３，５－ジメチルベンゾイル）－Ｎ’－［（３Ｒ）－２，２－ジメチル－３－ヘキサニル
］－２－エチル－３－メトキシベンゾヒドラジド；５－メチル－２，３－ジヒドロ－ベン
ゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（３，５－ジメチル－ベンゾイル）－Ｎ
’－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－ヒドラジド；５－メチル－２，３－
ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（３，５－ジメトキシ－
４－メチル－ベンゾイル）－Ｎ’－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－ヒド
ラジド；５－メチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸
Ｎ’－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３，５－ジメチル－ベンゾイル）－
ヒドラジド；５－メチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボ
ン酸Ｎ’－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３，５－ジメトキシ－４－メチ
ル－ベンゾイル）－ヒドラジド；５－エチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオ
キシン－６－カルボン酸Ｎ’－（３，５－ジメチル－ベンゾイル）－Ｎ’－（１－エチル
－２，２－ジメチル－プロピル）－ヒドラジド；５－エチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ
［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（３，５－ジメトキシ－４－メチル－ベン
ゾイル）－Ｎ’－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－ヒドラジド；５－エチ
ル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（１－ｔｅ
ｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３，５－ジメチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；５－
エチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（１－
ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３，５－ジメトキシ－４－メチル－ベンゾイル）
－ヒドラジド；３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロ
ピル）－Ｎ’－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメ
トキシ－４－メチル－安息香酸Ｎ－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－Ｎ’
－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメチル－安息香
酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾ
イル）－ヒドラジド；３，５－ジメトキシ－４－メチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－
ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；３
，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－Ｎ’－（
２－エチル－３－メトキシ－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメトキシ－４－メチ
ル－安息香酸Ｎ－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－Ｎ’－（２－エチル－
３－メトキシ－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅ
ｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（２－エチル－３－メトキシ－ベンゾイル）－ヒドラジ
ド；３，５－ジメトキシ－４－メチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）
－Ｎ’－（２－エチル－３－メトキシ－ベンゾイル）－ヒドラジド；２－メトキシ－ニコ
チン酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ペンチル）－Ｎ’－（４－エチル－ベンゾイル）－
ヒドラジド；３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（２，２－ジメチル－１－フェニル－プロ
ピル）－Ｎ’－（４－エチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメチル－安息香酸
Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ペンチル）－Ｎ’－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾ
イル）－ヒドラジド；および３，５－ジメトキシ－４－メチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅ
ｒｔ－ブチル－ペンチル）－Ｎ’－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾイル）－ヒドラ
ジドのうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。
場合によって、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子スイッチの、用量調節性制御の
ために使用されるリガンドは、エクジソン、２０－ヒドロキシエクジソン、ポナステロン
Ａ、ムリステロンＡなどのｅｃｄｙステロイド、９－ｃｉｓ－レチノイン酸、レチノイン
酸の合成類似体、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０
１３，８３６号明細書；同第５，１１７，０５７号明細書；同第５，５３０，０２８号明
細書；および同第５，３７８，７２６号明細書、ならびに米国出願公開第２００５／０２
０９２８３号明細書および同第２００６／００２０１４６号明細書において開示されてい
るＮ，Ｎ’－ジアシルヒドラジンなどのＮ，Ｎ’－ジアシルヒドラジン；米国出願公開第
２００４／０１７１６５１号明細書において記載されているオキサゾリン；欧州出願第４
６１，８０９号明細書において開示されているジベンゾイルアルキルシアノヒドラジンな
どのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号明細書に
おいて開示されているＮ－アルキル－Ｎ，Ｎ’－ジアロイルヒドラジンなどのＮ－アルキ
ル－Ｎ，Ｎ’－ジアロイルヒドラジン；欧州出願第２３４，９９４号明細書において開示
されているＮ－アシル－Ｎ－アルキルカルボニルヒドラジンなどのＮ－アシル－Ｎ－アル
キルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号明細書において記載されて
いるＮ－アロイル－Ｎ－アルキル－Ｎ’－アロイルヒドラジンなどのＮ－アロイル－Ｎ－
アルキル－Ｎ’－アロイルヒドラジン；米国出願公開第２００４／００４９０３７号明細
書において記載されているアルニドケトンなどのアルニドケトン；３，５－ジ－ｔｅｒｔ
－ブチル－４－ヒドロキシ－Ｎ－イソブチル－ベンズアミド、８－Ｏ－アセチルハルパジ
ド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコ
レステロール、２５－エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５－アルファ－６－
アルファ－エポキシコレステロール－３－スルフェート（sulfate）（ＥＣＨＳ）、７－
ケトコレステロール－３－スルフェート（sulfate）、フラメゾール、胆汁酸、１，１－
ビホスホネート（biphosphonate）エステル、若年性ホルモンＩＩＩなどを含む、他の類
似の材料のうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。本開示において有用
なジアシルヒドラジンリガンドの例は、ＲＧ－１１５８１９（３，５－ジメチル－安息香
酸Ｎ－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－Ｎ’－（２－メチル－３－メトキ
シ－ベンゾイル）－ヒドラジド）、ＲＧ－１１５９３２（（Ｒ）－３，５－ジメチル－安
息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（２－エチル－３－メトキシ－ベ
ンゾイル）－ヒドラジド-）、およびＲＧ－１１５８３０（３，５－ジメチル－安息香酸
Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（２－エチル－３－メトキシ－ベンゾイ
ル）－ヒドラジド）を含む。例えば、それらのいずれもが参照によりそれらの全体におい
て本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／１５５，１１１号明細書およびＰＣＴ
出願／米国出願第２００８／００６７５７号明細書を参照されたい。
非ウイルスベースの送達系
本発明で記載されるＣＡＲをコードする核酸はまた、ＤＮＡ配列を、脊椎動物の染色体
へと導入するための、合成ＤＮＡトランスポゾン系を指す、「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａ
ｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン系」など、非ウイルスベースの送達系を使用して、免疫エ
フェクター細胞へと導入することもできる。例示的なＳＢトランスポゾン系は、例えば、
米国特許第６，４８９，４５８号明細書および同第８，２２７，４３２号明細書において
記載され、図３に描示されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は
、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼおよびＳＢトランスポゾン
を含む。本明細書で使用する、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、Ｓ
ｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼポリペプチドならびに活性を保持する誘
導体、変異体および／または断片、およびＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾ
ンポリヌクレオチド、活性を保持する誘導体、変異体および／または断片を含みうる。あ
る特定の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、ｍＲＮＡ
として提供される。一部の態様では、ｍＲＮＡは、ＳＢ１０、ＳＢ１１、ＳＢ１１０ｘ、
またはＳＢ１１０トランスポザーゼをコードする。一部の態様では、ｍＲＮＡは、キャッ
プおよびポリＡテールを含む。
ＤＮＡトランスポゾンは、１つのＤＮＡ部位から、別のＤＮＡ部位へと、単純なカット
アンドペースト方式で転座する。転移は、規定されたＤＮＡセグメントを、１つのＤＮＡ
分子から切り出し、同じＤＮＡ分子内もしくはゲノム内、または異なるＤＮＡ分子内もし
くはゲノム内の別の部位へと移動させる、正確な過程である。他のＴｃ１／ｍａｒｉｎｅ
ｒ型トランスポザーゼと同様、ＳＢトランスポザーゼも、トランスポゾンを、レシピエン
トＤＮＡ配列内の、ＴＡジヌクレオチド塩基対へと挿入する。挿入部位は、同じＤＮＡ分
子内の別の部位の場合もあり、別のＤＮＡ分子（または染色体）内の場合もある。ヒトゲ
ノムを含む哺乳動物ゲノムには、約２億カ所のＴＡ部位が存在する。ＴＡ挿入部位は、ト
ランスポゾン組込みの過程において、重複される。このＴＡ配列の重複は、転移の顕著な
特徴であり、一部の実験では、機構を確認するのに使用される。トランスポザーゼは、ト
ランスポゾン内でコードされる場合もあり、トランスポザーゼは、別の供給源により供給
される場合もあり、この場合、トランスポゾンは、非自立型エレメントとなる。非自律型
トランスポゾンは、挿入の後、独立では切出しおよび再挿入を行いえないため、遺伝子ツ
ールとして最も有用である。ＳＢトランスポゾンは、脊椎動物のゲノムへの遺伝子の導入
および遺伝子治療のための非ウイルスベクターとして使用することが想定されている。略
述すると、免疫エフェクター細胞を遺伝子改変するように、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕ
ｔｙ（ＳＢ）系（Hackett et al., Mol Ther 18:674-83, (2010)）を適合させた（Cooper
et al., Blood 105:1622-31, (2005)）。一実施形態では、２つのステップ：（ｉ）Ｔ細
胞の特異性をリダイレクトするためのＳＢトランスポゾン［すなわち、キメラ抗原受容体
（ＣＡＲ）］およびＳＢトランスポザーゼを発現するＤＮＡプラスミドのエレクトロトラ
ンスファー（Jin et al., Gene Ther 18:849-56, (2011)、Kebriaei et al., Hum Gene T
her 23:444-50, (2012)）、ならびに（ｉｉ）Ｋ５６２細胞株に由来するデザイナー人工
抗原提示細胞（ＡａＰＣ）（ＡａＰＣ（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｐａｇａ
ｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ）としてもまた公知である）に接する形での、組込み配列を安定的に
発現するＴ細胞の繁殖および拡大増殖を伴った。別の実施形態では、第２のステップ（ｉ
ｉ）は省略し、遺伝子改変されたＴ細胞は凍結保存するか、または患者へとすぐに輸注す
る。
一実施形態では、ＳＢトランスポゾン系は、例えば、参照によりそれらの全体において
本明細書に組み込まれる、Hudecek et al., Critical Reviews in Biochemistry and Mol
ecular Biology, 52:4, 355-380 (2017)、Singh et al., Cancer Res (8):68 (2008). Ap
ril 15, 2008およびMaiti et al., J Immunother. 36(2): 112-123 (2013)において記載
されている。
ある特定の実施形態では、ＭＵＣ１６ ＣＡＲおよびｍｂＩＬ－１５は、トランスポゾ
ンＤＮＡプラスミドベクター内でコードされ、ＳＢトランスポザーゼは、別個のベクター
内でコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるＭＵＣ１６ ＣＡＲ
は、トランスポゾンＤＮＡプラスミドベクター内でコードされ、ｍｂＩＬ－１５は、第２
のトランスポゾンＤＮＡプラスミドベクター内でコードされ、ＳＢトランスポザーゼは、
第３のＤＮＡプラスミドベクター内でコードされる。一部の実施形態では、ＣＡＲは、キ
ルタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＣＤ２０、またはＣＤ２０ｔ－１と共にコ
ードされる。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ－１５は、キルタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ、
ＨＥＲ１ｔ１、ＣＤ２０、またはＣＤ２０ｔ－１と共にコードされる。
複数の実施形態では、ＭＵＣ１６ ＣＡＲは、トランスポゾンＤＮＡプラスミドベクタ
ーから、ｍｂＩＬ－１５および細胞タグと共に共発現させうる。さらなる実施形態では、
ＭＵＣ１６ ＣＡＲは、誘導性プロモーターの制御下にありうる。別の実施形態では、ｍ
ｂＩＬ－１５は、誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモー
ターは、遺伝子スイッチの、リガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘
導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リ
ガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチ
でありうる。ある特定の実施形態では、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ－１５、およびキ
ルタグは、１、２、またはそれを超えるトランスポゾン内に構成されうる。誘導性プロモ
ーターの制御下にあるＭＵＣ１６ ＣＡＲまたはｍｂＩＬ－１５の例示的な構成は、図２
に描示される。
複数の実施形態では、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、Ｓ
Ｂ１１０トランスポゾン系、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系（例えば、参照によりそ
の全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第９，２２８，１８０号明細書、Wils
on et al, “PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells,” Molecul
ar Therapy 15:139-145 (2007)を参照されたい）、および／またはｐｉｇｇｙＢａｔトラ
ンスポゾン系（例えば、Mitra et al., “Functional characterization of piggyBat fr
om the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon,” Proc.
Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013)を参照されたい）を使用して、ＭＵＣ１６ Ｃ
ＡＲおよび他の遺伝子エレメントを、細胞へと送達する。さらなるトランスポザーゼおよ
びトランスポゾン系については、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書
に組み込まれる、米国特許第７，１４８，２０３号明細書、同第８，２２７，４３２号明
細書、米国特許公開第２０１１／０１１７０７２号明細書、Mates et al., Nat Genet, 4
1(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 2009 May 3, Gene Ther., 18(9):849-
56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Mar 31 およびIvics et al., Cell. 9
1(4):501-10, (1997)において提示されている。
他の実施形態では、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ、およびサイトカイン、ｍｂＩＬ－１５および
／またはＨＥＲ１ｔ／ＨＥＲ１ｔ１／ＣＤ２０／ＣＤ２０ｔ－１タグなど、他の遺伝子エ
レメントが、リコンビナーゼおよび組込み用発現ベクターを介して免疫エフェクター細胞
のＤＮＡへと組み込まれうる。このようなベクターは、宿主細胞のＤＮＡへと、ランダム
に組み込まれる場合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能
とする組換え部位を含む場合もある。このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染
色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。一部の実
施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な
配列の存在により、組込みのターゲティングを促進する。例えば、本明細書で記載される
ドナーポリヌクレオチドを使用する、組込みのターゲティングは、従来のトランスフェク
ション法、例えば、相同組換えにより、遺伝子のノックアウトまたはノックインを創出す
るのに使用される技法に従い達成することができる。他の実施形態では、ドナーポリヌク
レオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在、および部位特異
的リコンビナーゼの存在下で、細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることの両方
により、組込みのターゲティングを促進する。部位特異的リコンビナーゼ、または、単に
、リコンビナーゼとは、その適合性の組換え部位の間の、保存的な部位特異的組換えを触
媒するポリペプチドを意味する。本明細書で使用される部位特異的リコンビナーゼは、天
然ポリペプチドのほか、活性を保持する誘導体、変異体、および／または断片、ならびに
天然ポリヌクレオチオド、活性を保持するリコンビナーゼをコードする誘導体、変異体、
および／または断片を含む。
リコンビナーゼは、標的細胞へと、ターゲティングベクターの導入の前に導入すること
もでき、これと共時的に導入することもでき、この後で導入することもできる。リコンビ
ナーゼは、例えば、リポソーム、粒子のコーティング、またはマイクロインジェクション
を使用して、細胞へと、タンパク質として直接導入することができる。代替的に、適切な
発現ベクターを使用して、リコンビナーゼをコードするＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮ
Ａである、ポリヌクレオチドを、細胞へと導入することもできる。上記で記載したターゲ
ティングベクターの構成要素は、目的のリコンビナーゼをコードする配列を含有する発現
カセットの構築において有用である。しかし、リコンビナーゼの発現は、他の方式で、例
えば、リコンビナーゼの発現を、調節可能なプロモーター（すなわち、その発現を選択的
に誘導または抑制しうるプロモーター）の制御下に置くことにより調節することもできる
。
リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーまたはリゾルバーゼファミリーに由来し
うる。リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーは、１００を超えるメンバーを有し、
例えば、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、およびラムダインテグラーゼを含む。インテグラーゼファミリ
ーはまた、チロシンファミリーまたはラムダインテグラーゼファミリーとも称し、ＤＮＡ
のホスホジエステル結合に対する求核攻撃のために、チロシンの触媒性ヒドロキシル基を
使用する。典型的に、チロシンファミリーのメンバーはまず、ＤＮＡにニックを入れ、こ
れにより、その後、二重鎖切断を形成する。チロシンファミリーインテグラーゼの例は、
Ｃｒｅインテグラーゼ、ＦＬＰインテグラーゼ、ＳＳＶ１インテグラーゼ、およびラムダ
（λ）インテグラーゼを含む。セリンリコンビナーゼファミリーとしてもまた公知の、リ
ゾルバーゼファミリーでは、保存性セリン残基が、ＤＮＡ標的部位への共有結合性連結を
形成する（Grindley, et al., (2006) Ann Rev Biochem 16:16）。
一実施形態では、リコンビナーゼは、ＳＰβｃ２リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコ
ンビナーゼ、Ｂｘｂ１リコンビナーゼ、Ａ１１８リコンビナーゼ、およびΦＲｖ１リコン
ビナーゼからなる群から選択されるリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む、単離ポ
リヌクレオチド配列である。セリンリコンビナーゼの例については、参照によりその全体
において本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０３４，６５２号明細書において詳細
に記載されている。
本発明の実施における使用のためのリコンビナーゼは、組換えにより作製することもで
き、既に記載されている通りに精製することもできる。所望のリコンビナーゼ活性を有す
るポリペプチドは、当技術分野で公知の方法であって、タンパク質の硫酸アンモニウム沈
殿の方法、サイズ分画、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロ
マトグラフィー、ヘパリンアガロースアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Thor
pe & Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. 95:5505-5510, 1998）を含むがこれらに限定されな
いタンパク質精製の方法により、所望の純度まで精製することができる。
一実施形態では、リコンビナーゼを、任意の適切な方法による組換えが所望される組換
え接合部位を含有する真核細胞へと導入することができる。当技術分野では、例えば、マ
イクロインジェクションまたは他の方法により、機能的タンパク質を、細胞へと導入する
方法が周知である。精製リコンビナーゼタンパク質の導入は、タンパク質の一過性の存在
、およびその機能を確保するが、これは、好ましい実施形態であることが多い。代替的に
、リコンビナーゼをコードする遺伝子は、細胞を形質転換するのに使用される発現ベクタ
ーであって、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを、真核細胞内のポリヌクレ
オチドの発現を媒介するプロモーターに作動可能に連結した、発現ベクター内に含まれう
る。リコンビナーゼポリペプチドはまた、リコンビナーゼポリペプチドをコードするメッ
センジャーＲＮＡによっても、真核細胞へと導入することができる。リコンビナーゼは、
核酸断片の、改変されるゲノムへの挿入に必要であるような時間の間だけ存在することが
一般に好ましい。したがって、大半の発現ベクターと関連する永続性の欠如は、有害では
ないと予測される。リコンビナーゼ遺伝子を、目的の外因性ポリヌクレオチドの導入の前
に導入することもでき、これと同時に導入することもでき、この後で導入することもでき
る。一実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、挿入されるポリヌクレオチドを保有する
ベクター内に存在し、リコンビナーゼ遺伝子はなお、ポリヌクレオチド内にも、組み入れ
ることができる。他の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子を、トランスジェニックの真
核生物へと導入する。リコンビナーゼを、構成的に、あるいは細胞特異的プロモーター、
組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、細胞小器官特異的プロモーター、ま
たは低分子誘導性プロモーターもしくは低分子抑制性プロモーター下で発現させる、トラ
ンスジェニック細胞またはトランスジェニック動物を作製することができる。リコンビナ
ーゼはまた、他のペプチド、タンパク質、核局在化シグナルペプチド、シグナルペプチド
、または細胞小器官特異的シグナルペプチド（例えば、ミトコンドリア内またはクロロプ
ラスト内の組換えを容易とする、ミトコンドリアまたはクロロプラストにおけるトランジ
ットペプチド）との融合タンパク質としても発現させることができる。
一実施形態では、部位特異的組換えのための方法は、第１の組換え部位および第２の組
換え部位を用意するステップと、第１の組換え部位および第２の組換え部位を、原核細胞
のリコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え部位の間の組換えをもた
らすステップとを含み、リコンビナーゼポリペプチドは、第１の組換え部位と、第２の組
換え部位との組換えを媒介することが可能であり、第１の組換え部位は、ａｔｔＰまたは
ａｔｔＢであり、第２の組換え部位は、ａｔｔＢまたはａｔｔＰであり、第１の組換え接
合部位が、ａｔｔＢである場合、第２の組換え接合部位は、ａｔｔＰであり、第１の組換
え接合部位が、ａｔｔＰである場合、第２の組換え接合部位は、ａｔｔＢであるという条
件で、リコンビナーゼは、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）の
ファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のファージリコンビ
ナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）のファージリコンビナーゼ、結核菌（Mycobacteri
um tuberculosis）のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegm
atis）のファージリコンビナーゼからなる群から選択される。
さらなる実施形態は、部位特異的リコンビナーゼの、ゲノムが改変される細胞への導入
を提供する。一実施形態は、真核細胞内の部位特異的組換えを得るための方法であって、
第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を含む真核細胞を用意するステップと
、第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を、原核細胞のリコンビナーゼポリ
ペプチドと接触させる結果として、組換え接合部位の間の組換えをもたらすステップとを
含み、リコンビナーゼポリペプチドが、第１の組換え接合部位と、第２の組換え接合部位
との組換えを媒介することが可能であり、第１の組換え接合部位が、ファージゲノムの組
換え接合部位（ａｔｔＰ）、または細菌ゲノムの組換え接合部位（ａｔｔＢ）であり、第
２の組換え接合部位が、ａｔｔＢまたはａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔ
ｔＢである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、
ａｔｔＰである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＢであるという条件で、リコンビ
ナーゼが、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のファージリコン
ビナーゼ、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のファージリコンビナーゼ、枯草菌
（Bacillus subtilis）のファージリコンビナーゼ、結核菌（Mycobacterium tuberculosi
s）のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）のファー
ジリコンビナーゼからなる群から選択される、方法に関する。ある実施形態では、リコン
ビナーゼは、Ａ１１８リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコンビナーゼ、ＳＰβｃ２リコ
ンビナーゼ、ΦＲｖ１リコンビナーゼ、およびＢｘｂ１リコンビナーゼからなる群から選
択される。一実施形態では、組換えは、組込みを結果としてもたらす。
外因性核酸を、宿主細胞へと導入するのに使用される方法にかかわらず、宿主細胞内の
組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。こ
のようなアッセイは、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣ
ＲおよびＰＣＲなど、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段
（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）、またはペプチドもしくはタンパク質もしくは
核酸を同定するための、本明細書で記載されるアッセイであって、本発明の範囲内に収ま
るアッセイにより、特定のペプチドの有無を検出するアッセイなどの「生化学的」アッセ
イを含む。
ウイルスベースの送達系
本明細書ではまた、本発明の核酸を挿入したウイルスのベースの送達系も提供する。代
表的なウイルス発現ベクターは、アデノウイルスベースのベクター（例えば、Ｃｒｕｃｅ
ｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている、アデノ
ウイルスベースのＰｅｒ．Ｃ６系）、レンチウイルスベースのベクター（例えば、Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製の、レンチウイル
スベースのｐＬＰＩ）、およびレトロウイルスベクター（例えば、ｐＣＦＢ－ＥＧＳＨを
付加したｐＦＢ－ＥＲＶ）、ヘルペスウイルスを含むがこれらに限定されない。ある実施
形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレ
トロウイルスに由来するベクターは、トランス遺伝子の、娘細胞における、長期にわたる
、安定的な組込みおよびその繁殖を可能とするので、長期にわたる遺伝子導入を達成する
のに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質
導入しうるという点で、マウス白血病ウイルスなど、がんレトロウイルスに由来するベク
ターに優る追加の利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低免疫原性という追加
の利点も有する。一般に、かつ、複数の実施形態では、適切なベクターは、少なくとも１
つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアー
ゼ部位、および１または複数の選択用マーカー（例えば、国際公開第０１／９６５８４号
パンフレット、国際公開第０１／２９０５８号パンフレット、および米国特許第６，３２
６，１９３号明細書）を含有する。
複数の実施形態では、骨格ならびにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列
を含むレンチウイルスベクターであって、ＣＡＲが、（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイ
ン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２
８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ド
メインを含む、レンチウイルスベクターが提示される。任意選択で、ベクターは、トラン
ケート型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ）、ＣＤ２０ｔ－１または全
長ＣＤ２０をコードする核酸をさらに含む。
場合によって、骨格ならびに（１）トランケート型表皮増殖因子受容体、例えば、ＨＥ
Ｒ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ－１またはこれらの機能的な変異体；および（２）キメラ抗原受
容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むベクターであって、ＣＡＲが、（ａ）ＭＵＣ
１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４－
１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）
ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、ベクターが提示される。
場合によって、骨格ならびに（１）全長ＣＤ２０、トランケート型ＣＤ２０またはこれ
らの機能的な変異体；および（２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を
含むベクターであって、ＣＡＲが、（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）ストー
クドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を
含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含
む、ベクターが提示される。
複数の実施形態では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲをコードする核酸が、レンチウイルの骨
格構成成分を含むベクターへとクローニングされる。例示的な骨格構成成分は、ｐＦＵＧ
Ｗ、およびｐＳＭＰＵＷを含むがこれらに限定されない。ｐＦＵＧＷレンチウイルスベク
ター骨格は自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター骨格であり、不必要なＨＩＶ
－１ウイルス配列が除去され、腫瘍の発生、有害な変異、および感染性粒子の再生のため
の潜在的可能性の低下を結果としてもたらす。複数の実施形態では、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ
をコードするベクターはまた、単一の構築物内のｍｂＩＬ－１５もコードする。複数の実
施形態では、ＭＵＣ１６ ＣＡＲおよびｍｂＩＬ－１５は、２つの別個のレンチウイルス
ベクター上にコードされる。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ－１５は、トランケート型表
皮増殖因子受容体タグと共に発現される。複数の実施形態では、ＭＵＣ１６ ＣＡＲは、
単一のレンチウイルスベクター由来のｍｂＩＬ－１５および細胞タグと共に共発現されう
る。さらなる実施形態では、ＭＵＣ１６ ＣＡＲは、誘導性プロモーターの制御下にあり
うる。別の実施形態では、ｍｂＩＬ－１５は、誘導性プロモーターの制御下にありうる。
一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターであり
うる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子
スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体
ベースの遺伝子スイッチでありうる。
一実施形態では、本明細書で記載される、ＭＵＣ１６ ＣＡＲは、抗ＭＵＣ１６ ｓｃ
Ｆｖ、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにヒト４－１ＢＢおよびＣＤ３ゼ
ータシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、本発明のＭＵＣ１６ ＣＡＲは、
抗ＭＵＣ１６ ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ヒト４－１ＢＢおよ
びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインおよび、任意選択で、トランケート型表皮増殖因子
受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ－１）タグを含む。他の適切なベクターは、組込み
用発現ベクターを含み、これは宿主細胞のＤＮＡへと、ランダムに組み込まれる場合もあ
り、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含む
場合もある。このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配
列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。部位特異的に組み込むベクターの
例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）（例えば、ｐ
ｃＤＮＡ（商標）５／ＦＲＴ）製のｆｌｐ－ｉｎ系、またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ
Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＥｘｃｈａｎｇｅ－６ Ｃｏｒｅ Ｖｅｃｔｏｒｓに
おいて見出されうるｃｒｅ－ｌｏｘ系などのｃｒｅ－ｌｏｘ系の構成要素を含む。宿主細
胞染色体へとランダムに組み込まれるベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（
Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ抗原の非存在下で導入され
る場合）、およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）製のｐＣＩまたはｐＦＮ
１０Ａ（ＡＣＴ）ＦＬＥＸＩ（商標）を含む。さらなるプロモーターエレメント、例えば
、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的に、プロモーターエレメントは、
開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、多数のプロモーターは、開始部
位の下流にも、機能的なエレメントを含有することが近年示されている。エレメントが、
互いに対して逆位であるか、または移動している場合にも、プロモーター機能が保存され
るように、プロモーターエレメントの間のスペーシングは、柔軟であることが多い。チミ
ジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が減衰し始める前に、プロモーターエレメ
ントの間のスペーシングが、５０ｂｐの距離まで増大する場合がある。個別のエレメント
は、転写を活性化させるように、プロモーターに応じて、共作動的に機能する場合もあり
、独立に機能する場合もあると考えられる。
適切なプロモーターの１つの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期プロモータ
ー配列である。このプロモーター配列は、それへと作動的に連結された、任意のポリヌク
レオチド配列の、高レベルの発現を駆動することが可能である、強力な構成的プロモータ
ー配列である。
適切なプロモーターの別の例は、ヒト伸長成長因子１アルファ１（ｈＥＦ１ａ１）であ
る。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを含むベクター構築物は、ｈＥＦ
１ａ１機能的変異体を含む。
しかし、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（
ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒ
ｅｐｅａｔ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモータ
ー、エプスタイン－バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター
、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、
およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子
プロモーターを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用
することができる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されないものと
する。誘導性プロモーターもまた、既に記載される通り、本発明の一部として想定される
。誘導性プロモーターの使用は、このような発現が所望される場合に、それが作動的に連
結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されない場合に
、発現をオフにすることが可能な分子スイッチをもたらす。誘導性プロモーターの例は、
メタロチオネイン（metallothionine）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター
、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むがこれらに
限定されない。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチのリガンド誘導性プ
ロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（
登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、
エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
本明細書で記載されるＣＡＲまたはこの部分の発現を評価するために、細胞へと導入さ
れる発現ベクターはまた、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを介してトランス
フェクトまたは感染させることが求められる細胞集団からの、発現細胞の同定および選択
を容易とする、選択用マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはこれらの両方も含
有しうる。他の態様では、選択用マーカーは、別個のＤＮＡ片上に保有され、共トランス
フェクション手順で使用さる場合もある。選択用マーカーおよびレポーター遺伝子のいず
れも、宿主細胞内の発現を可能とするように、適切な調節配列で挟むことができる。有用
な選択用マーカーは、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）およびアンピシリン耐
性遺伝子などの抗生剤耐性遺伝子を含む。一部の実施形態では、トランケート型表皮増殖
因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ－１）タグを、選択用マーカー遺伝子として使
用することができる。
レポーター遺伝子を、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定し、調節配列の
機能性について査定するために使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は、レ
シピエントの生物または組織において存在しないか、またはこれらにより発現せず、その
発現が、何らかの、容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペ
プチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡを、レシピエント細胞へと導入した後の適切な
時点において、レポーター遺伝子の発現についてアッセイする。適切なレポーター遺伝子
は、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タン
パク質遺伝子（例えば、Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000)）を含む。適
切な発現系が周知であり、公知の技法を使用して調製することもでき、市販品を購入する
こともできる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、最小の５’側フラ
ンキング領域を伴う構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター
領域は、レポーター遺伝子へと連結することができ、薬剤を、プロモーター駆動型転写を
モジュレートする能力について査定するのに使用することができる。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるウイルスベクターは、トランス遺伝子の発
現を駆動するｈＥＦ１ａ１プロモーター、転写を増強するウシ成長ホルモンポリＡ配列、
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のほか、ｐＦＵＧＷプラ
スミドに由来するＬＴＲ配列を含む。
遺伝子を細胞へと導入し発現させる方法が周知である。発現ベクターの文脈では、ベク
ターを、当技術分野における任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌
細胞、酵母細胞、または昆虫細胞へと、たやすく導入することができる。例えば、発現ベ
クターは、宿主細胞へと、物理的手段により導入することもでき、化学的手段により導入
することもでき、生物学的手段により導入することもできる。
ポリヌクレオチドを、宿主細胞、例えば免疫エフェクター細胞へと導入するための物理
的方法は、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、遺伝子銃法、マイクロインジ
ェクション法、電気穿孔法などを含む。当技術分野では、ベクターおよび／または外因性
核酸を含む細胞を作製するための方法が周知である。例えば、Sambrook et al. (Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))
を参照されたい。複数の実施形態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するため
の方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
トランスフェクションである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの宿主細胞への導
入のための方法は、電気穿孔法である。
目的のポリヌクレオチドを、宿主細胞、例えば、免疫エフェクター細胞へと導入するた
めの生物学的方法は、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベク
ターと、とりわけ、レトロウイルスベクターとは、遺伝子を、哺乳動物細胞、例えば、ヒ
ト細胞へと挿入するための、最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクタ
ーは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、
およびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号
明細書および同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための化学的手段は、高分子複合体、ナノ
カプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミ
セル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系を含む。ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける、送達媒体としての使用のための、例示的なコロイ
ド状系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
ウイルス送達系を用いる場合、例示的な送達媒体は、リポソームである。核酸の、宿主
細胞への導入（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける）の
ために、脂質製剤が使用されうる。別の態様では、核酸は、脂質と会合させることができ
る。脂質と会合させた核酸は、リポソームの脂質二重層内に散在する、水性のリポソーム
内部に封入することもでき、リポソームおよびオリゴヌクレオチドのいずれとも会合する
連結分子を介して、リポソームへと接合させることもでき、リポソーム内に取り込むこと
もでき、リポソームと複合体化させることもでき、脂質を含有する溶液中に分散させるこ
ともでき、脂質と混合することもでき、脂質と組み合わせることもでき、脂質中の懸濁液
として含有することもでき、ミセルと共に含有するかもしくは複合体化させることもでき
、または他の形で脂質と会合させることもできる。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発
現ベクターに関連する組成物は、溶液中の、任意の特定の構造に限定されない。例えば、
組成物は、ミセルとしての二重層構造内に存在する場合もあり、「コラプシング」構造を
伴う二重層構造内に存在する場合もある。組成物はまた、単に、溶液中に散在させること
もでき、おそらく、サイズまたは形状が均質ではない凝集物を形成しうる。脂質とは、天
然脂質の場合もあり、合成脂質の場合もある、脂肪性物質である。例えば、脂質は、天然
では、細胞質内で発生する脂肪性液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素、ならびに脂肪酸、ア
ルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなど、それらの誘導体を含有す
る化合物のクラスを含む。
使用に適する脂質は、市販元から購入することができる。例えば、ジミリスチルホスフ
ァチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から購入す
ることができ、ジセチルリン酸（「ＤＣＰ」）は、Ｋ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）から購入することができ、コレステロール（「Ｃｈ
ｏｌ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから購入することができ、ジミリス
チルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐ
ｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）から購入するこ
とができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約－２０℃
で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりたやすく蒸発するので、唯一
の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、封入された脂質の二重層または脂凝集物
の作出により形成される、様々な単一の脂質媒体および多層性脂質媒体を包含する、一般
的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒質を伴う小胞構造
を有するものとして特徴づけることができる。多層性リポソームは、水性媒質により分離
された複数の脂質層を有する。多層性リポソームは、リン脂質を、過剰量の水溶液中に懸
濁させると、自発的に形成される。脂質成分は、閉止構造を形成する前に、自己転移を経
、脂質二重層の間に、水および溶解させた溶質を取り込む（Ghosh et al., Glycobiology
5: 505-10 (1991)）。しかし、溶液中に通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物も
また、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取る場合もあり、脂質分子による不均
質の凝集物として存在する場合もある。また、リポフェクタミン－核酸複合体も想定され
る。
ＭＵＣ１６ ＣＡＲおよびベクターを含む細胞
本明細書では、本明細書で記載されるＣＡＲを発現する操作細胞が提示される。ある特
定の実施形態では、本明細書で記載される操作細胞は、免疫エフェクター細胞である。複
数の実施形態では、本明細書では、骨格ならびに（１）トランケート型表皮増殖因子受容
体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ１）および（２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコード
する核酸配列を含むベクターを含む免疫エフェクター細胞であって、ＣＡＲが（ａ）ＭＵ
Ｃ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４
－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ
）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、免疫エフェクター細胞が提示される。
ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫エフェクター細胞で
あって、ＣＡＲが（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ
）膜貫通ドメイン；（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナ
ル伝達ドメイン；（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン；および（ｆ）トランケート
型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ１）を含む、免疫エフェクター細胞
が提示される。
複数の実施形態では、本明細書では、（１）キルスイッチとして使用するための細胞タ
グ、選択マーカー、バイオマーカー、またはこれらの組合せ、および（２）キメラ抗原受
容体（ＣＡＲ）を含む免疫エフェクター細胞であって、ＣＡＲが（ａ）ＭＵＣ１６抗原結
合性ドメイン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４－１ＢＢもし
くはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼー
タシグナル伝達ドメインを含む、免疫エフェクター細胞が提示される。複数の実施形態で
は、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＣＤ２０ｔ－１またはＣＤ２０である。
複数の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細
胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、および調節性Ｔ細胞である。複数の実施形態では
、細胞は、ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインがＭＵＣ１６に結合する場合、抗腫瘍活性を示
す。
改変免疫エフェクター細胞
本明細書で記載される、１または複数の異種遺伝子またはポリペプチドを発現するよう
に改変された免疫エフェクター細胞が提示される。本明細書で記載されるＭＵＣ１６ Ｃ
ＡＲおよびＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＣＤ２０、およびＣＤ２０ｔ－１タグのうちの少
なくとも１つを発現するように改変された免疫エフェクター細胞が提示される。場合によ
ってＭＵＣ１６ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ－１５ｍおよび本明細書で開示されるＨＥＲ１ｔ、Ｈ
ＥＲ１ｔ１、ＣＤ２０、およびＣＤ２０ｔ－１タグのうちの少なくとも１つを発現するよ
うに改変された免疫エフェクター細胞が提示される。
本明細書で使用される「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」とは、細胞媒介性免疫において
、中心的な役割を果たす、リンパ球の種類である。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、
細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞
（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球と区別されうる。
一部の実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞および／またはナチュラル
キラー細胞を含む改変免疫細胞である。Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫に関
与する白血球の亜型である。例示的なＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔ
Ｈ１７細胞、ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞
、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞を含む。
「ヘルパーＴ細胞」（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の、血漿細胞およびメモリーＢ細胞への成
熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫過程において、
他の白血球を支援する。場合によって、ＴＨ細胞は、細胞表面上のＣＤ４糖タンパク質の
発現のために、ＣＤ４＋ Ｔ細胞として公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（
ＡＰＣ）の表面上で発現する、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原を提示される
と、活性化する。活性化すると、ヘルパーＴ細胞は、急速に分裂し、活性の免疫応答を調
節するか、またはこれらを支援する、サイトカインと呼ばれる、小型のタンパク質を分泌
する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨを含
む、いくつかの亜型であって、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を
容易とする、いくつかの亜型のうちの１つへと分化しうる。ＡＰＣからのシグナル伝達は
、Ｔ細胞を、特定の亜型へと方向付ける。
「細胞傷害性Ｔ細胞」（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞
を破壊し、また、移植片拒絶にも関与している。これらの細胞はまた、それらの表面上に
おいて、ＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋ Ｔ細胞としても公知である。こ
れらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩ分子と会合する抗原
に結合することにより、それらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌される、ＩＬ
－１０、アデノシン、および他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態へと不
活化される場合があり、これにより、自己免疫疾患を防止する。
「メモリーＴ細胞」は、感染が消失した後で、長期にわたり存続する、抗原特異的Ｔ細
胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、それらのコグネイト抗原へと再曝露されると
、多数のエフェクターＴ細胞へと急速に拡大増殖し、これにより、免疫系に、過去の感染
に対する「メモリー」をもたらす。メモリーＴ細胞は、亜型：ステムセルメモリーＴ細胞
（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種類のエフェクターメ
モリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋細
胞の場合もあり、ＣＤ８＋細胞の場合もある。メモリーＴ細胞は、細胞表面タンパク質で
ある、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、および／またはＣＣＲ７を発現しうる。
かつては、サプレッサーＴ細胞として公知であった、「調節性Ｔ細胞」（Ｔｒｅｇ細胞
）は、免疫寛容の維持において役割を果たす。調節性Ｔ細胞の主要な役割は、Ｔ細胞媒介
性免疫を遮断して、免疫反応を終了させ、胸腺内の陰性選択過程を回避した自己反応性Ｔ
細胞を抑制することである。
「ナチュラルキラーＴ細胞」（ＮＫＴ細胞）は、適応免疫系を、自然免疫系と橋渡しす
る。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を認識する従来
のＴ細胞と異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原
を認識する。活性化すると、これらの細胞は、Ｔｈ細胞およびＴｃ細胞の両方に帰せられ
た機能（すなわち、サイトカインの産生および細胞溶解性／細胞殺滅分子の放出）を果た
しうる。ＮＫＴ細胞はまた、一部の腫瘍細胞およびヘルペスウイルスに感染した細胞を認
識し、これらを消失させることも可能である。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とは、自然免疫系の、細胞傷害性リンパ球の種類である
。場合によって、ＮＫ細胞は、ウイルス感染および／または腫瘍形成に対する、最前線の
防御をもたらす。ＮＫ細胞は、感染細胞上またはがん性細胞上に提示されたＭＨＣを検出
することが可能であり、サイトカイン放出を誘発し、その後、溶解およびアポトーシスを
誘導する。ＮＫ細胞はさらに、抗体および／またはＭＨＣの非存在下で、ストレス細胞を
検出することが可能であり、これにより、迅速な免疫応答を可能とする。
改変免疫エフェクター細胞の用量
一部の実施形態では、ある量の改変免疫エフェクター細胞を、それを必要とする対象へ
と投与するが、量は、サイトカインと関連する傷害作用を誘導する有効性および潜在的可
能性に基づき決定する。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たり
の改変免疫エフェクター細胞約１０２～約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフ
ェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０３～約１０９個を
含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェ
クター細胞約１０４～約１０９個を含む。場合によって、場合によって、改変免疫エフェ
クター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０５～約１０９個を含
む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェク
ター細胞約１０５～約１０８個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は
、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０５～約１０７個を含む。場合によって
、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０６
～約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの
改変免疫エフェクター細胞約１０６～約１０８個を含む。場合によって、改変免疫エフェ
クター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０７～約１０９個を含
む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェク
ター細胞約１０５～約１０６個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は
、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０６～約１０７個を含む。場合によって
、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０７
～約１０８個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの
改変免疫エフェクター細胞約１０８～約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェ
クター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０９個を含む。場合に
よって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約
１０８個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変
免疫エフェクター細胞約１０７個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量
は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０６個を含む。場合によって、改変免
疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０５個を含む
。
一部の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞である。場
合によって、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約
１０２～約１０９個を含む。場合によって、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１
ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０３～約１０９個を含む。場合によって、ＭＵＣ１６特
異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０４～約１０９個を含む
。場合によって、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細
胞約１０５～約１０９個を含む。場合によって、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は
、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０５～約１０８個を含む。場合によって、ＭＵＣ１
６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０５～約１０７個を
含む。場合によって、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－
Ｔ細胞約１０６～約１０９個を含む。場合によって、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の
量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０６～約１０８個を含む。場合によって、ＭＵ
Ｃ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０７～約１０９
個を含む。場合によって、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡ
Ｒ－Ｔ細胞約１０５～約１０６個を含む。場合によって、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細
胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０６～約１０７個を含む。場合によって、
ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０７～約１
０８個を含む。場合によって、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりの
ＣＡＲ－Ｔ細胞約１０８～約１０９個を含む。一部の場合には、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ
－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０９個を含む。一部の場合には、Ｍ
ＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０８個を含む
。一部の場合には、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ
細胞約１０７個を含む。一部の場合には、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋ
ｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０６個を含む。一部の場合には、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ
－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０５個を含む。一部の場合には、Ｍ
ＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０４個を含む
。一部の場合には、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ
細胞約１０３個を含む。一部の場合には、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、１ｋ
ｇ当たりのＣＡＲ－Ｔ細胞約１０２個を含む。
免疫エフェクター細胞の供給源
ある特定の態様では、本明細書で記載される実施形態は、リダイレクトされた、抗原特
異的免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ Ｔ
細胞）を作り出し、かつ／またはこれを拡大増殖させる方法であって、細胞に、ＣＡＲを
コードするＤＮＡ（またはＲＮＡ）構築物を含有する発現ベクターによりトランスフェク
トし、次いで、任意選択で、細胞を、フィーダー細胞、組換え抗原、または受容体に対す
る抗体で刺激して、細胞を増殖させるステップを含む方法を含む。ある特定の態様では、
ＣＡＲを発現するように操作された細胞（または細胞集団）は、肝細胞、ｉＰＳ細胞、ｉ
ＰＳ細胞から分化したＴ細胞、免疫エフェクター細胞、またはこれらの細胞の前駆細胞で
ある。
免疫エフェクター細胞の供給源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。場
合によって、免疫エフェクター細胞は、幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から
分化させることもできる。したがって、実施形態に従い操作するための細胞は、臍帯血、
末梢血、ヒト胚性幹細胞、またはｉＰＳＣから単離することができる。例えば、同種Ｔ細
胞は、キメラ抗原受容体を含むように（そして、任意選択で、機能的なＴＣＲを欠くよう
に）改変することができる。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核
細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＴ細胞などの初代ヒトＴ細胞である。ＰＢＭＣは、末梢血か
ら回収することもでき、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）による刺激の後で、骨髄
または臍帯血から回収することもできる。一態様では、免疫エフェクター細胞は汎Ｔ細胞
である。トランスフェクションまたは形質導入（例えば、ＣＡＲ発現構築物の）の後、細
胞を、速やかに輸注することもでき、凍結保存することもできる。ある特定の態様では、
トランスフェクションまたは形質導入の後、細胞は、輸注の準備ができるまでＩＬ－２お
よび／またはＩＬ－２１を含みうるサイトカインバス内で保存されうる。ある特定の態様
では、トランスフェクションの後、細胞は、細胞への遺伝子導入後、約１、２、３、４、
５日間またはこれを超える日数以内に、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、バルク集団として、数
日間、数週間、または数カ月間にわたり繁殖させることができる。さらなる態様では、ト
ランスフェクションの後、トランスフェクト細胞を、クローニングし、組み込まれるか、
またはエピソーム内に維持された、単一の発現カセットまたはプラスミドの存在、および
キメラ抗原受容体の発現を裏付けるクローンを、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させる
。拡大増殖のために選択されたクローンは、抗原を発現する標的細胞を特異的に認識し、
溶解させる能力を裏付ける。組換えＴ細胞は、ＩＬ－２または共通のガンマ鎖に結合する
他のサイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、および他
のサイトカイン）を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えＴ細胞は、人工
抗原提示細胞を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えＴ細胞は、人工抗原
提示細胞に接する形で拡大増殖させることもでき、Ｔ細胞表面上のＣＤ３を架橋する、Ｏ
ＫＴ３などの抗体により拡大増殖させることもできる。組換えＴ細胞のサブセットは、磁
気ビーズベースの単離法および／または蛍光活性化細胞分取技術の使用により、さらに選
択することができ、ＡａＰＣと共にさらに培養することができる。さらなる態様では、遺
伝子改変細胞は、凍結保存することができる。
Ｔ細胞はまた、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹
水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の供給源からも得ることができる。本発明
の、ある特定の実施形態では、当技術分野において入手可能な、任意の数のＴ細胞株を使
用することができる。本開示の、ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（登
録商標）分離など、当業者に公知の、任意の数の技法を使用して、対象から回収された血
液単位から得ることができる。複数の実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞は、
アフェレーシスにより得る。アフェレーシス生成物は、典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球
、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。一実施形
態では、アフェレーシスにより回収された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を、
その語における加工ステップのために、適切な緩衝液中または培地中に入れる。本発明の
一実施形態では、細胞を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な実施形
態では、洗浄液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠く場合もあり、全てではないが
、多くの二価カチオンを欠く場合もある。カルシウムの非存在下における初期活性化ステ
ップは、活性化の強化をもたらす。当業者がたやすく理解する通り、洗浄ステップは、製
造元の指示書に従い、半自動式「フロースルー」型遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９
９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃ
ｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用することなど、当業者に公知の方法により達する
ことができる。洗浄の後、細胞を、例えば、Ｃａ２＋非含有ＰＢＳ、Ｍｇ２＋非含有ＰＢ
Ｓ、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ、または緩衝液を伴うかもしくは伴わない、他の生理食塩
液溶液など、様々な生体適合性の緩衝液中に再懸濁させることができる。代替的に、アフ
ェレーシス試料の、所望されない構成要素を除去し、細胞を、培養培地中に、直接再懸濁
させることもできる。
別の実施形態では、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配を介する遠心分離、また
は対向流遠心溶出により、赤血球を溶解させ、単球を枯渇させることにより、Ｔ細胞を、
末梢血リンパ球から単離する。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５Ｒ
Ａ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞など、Ｔ細胞の特異的亜集団も、陽性選択法または陰
性選択法により、さらに単離することができる。別の実施形態では、ＣＤ１４＋細胞は、
Ｔ細胞集団から枯渇される。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（
登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち
、３×２８）コンジュゲートビーズを伴う、所望のＴ細胞陽性選択に十分な時間にわたる
インキュベーションにより単離する。一実施形態では、時間は、約３０分間である。さら
なる実施形態では、時間は、３０分間～３６時間、またはこれより長い時間、およびこれ
らの間の任意の整数値の時間の範囲である。さらなる実施形態では、時間は、少なくとも
１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の実施形態では、時間は、１０～２
４時間である。一実施形態では、インキュベーション時間は、２４時間である。白血病を
伴う患者からのＴ細胞の単離ための、２４時間など、長いインキュベーション時間の使用
は、細胞収率を増大させうる。腫瘍組織または免疫障害個体から、腫瘍浸潤リンパ球（Ｔ
ＩＬ）を単離する状況など、Ｔ細胞が、他の細胞型と比較して少数である、任意の状況に
おいては、より長いインキュベーション時間を使用してＴ細胞を単離することができる。
さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕捉効率も増加させ
うる。したがって、単に、時間を短くするかまたは長くすることにより、Ｔ細胞を、ＣＤ
３／ＣＤ２８ビーズに結合させることが可能となり、かつ／またはビーズの、Ｔ細胞に対
する比（本明細書で、さらに記載される通り）を増加もしくは減少させることにより、Ｔ
細胞の亜集団を、培養の開始時、もしくは工程中の他の時点において、優先的に、陽性も
しくは陰性に選択することができる。加えて、ビーズ上または他の表面上の、抗ＣＤ３お
よび／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を
、培養の開始時、または他の所望の時点において、優先的に、陽性または陰性に選択する
ことができる。当業者は、本発明の文脈では、複数ラウンドにわたる選択もまた、使用し
うることを認識するであろう。ある特定の実施形態では、選択手順を実施し、「選択され
なかった」細胞を、活性化工程および拡大増殖工程において使用することも所望でありう
る。「選択されなかった」細胞はまた、さらなるラウンドにわたる選択にかけることもで
きる。
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを指向
する抗体の組合せにより達することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に存
在する細胞表面マーカーを指向する、モノクローナル抗体のカクテルを使用する、細胞分
取および／または陰性の磁気免疫接着もしくはフローサイトメトリーを介する選択である
。例えば、ＣＤ４＋細胞を、陰性選択により濃縮するために、モノクローナル抗体カクテ
ルは、典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣ
Ｄ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、典型的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、
ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を、濃縮また
は陽性選択することが所望でありうる。代替的に、ある特定の実施形態では、調節性Ｔ細
胞を、抗ＣＤ２５コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択法により枯渇させることが
できる。
陽性選択または陰性選択により、所望の細胞集団を単離するために、細胞の濃度および
表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変動させることができる。ある特定の実施形態では
、ビーズと細胞とを、併せて混合する容量を著明に減少させて（すなわち、細胞の濃度を
増加させて）、細胞とビーズとの最大の接触を確保することが所望でありうる。例えば、
一実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞２０億個の濃度を使用する。一実施形態では、１ｍ
ｌ当たりの細胞１０億個の濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞
１億個を超えるものを使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０００万
、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５０
０万、または５０００万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、１ｍｌ当た
りの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個
の細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万また
は１億５０００万個の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、
および細胞の拡大増殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、
ＣＤ２８陰性Ｔ細胞、または多くの腫瘍細胞（すなわち、白血病性血液、腫瘍組織など）
が存在する試料に由来する細胞など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、よ
り効率的な捕捉を可能とする。このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり
、得ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８の発現が通常低度で
ある、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
関連する実施形態では、低濃度の細胞を使用することが所望でありうる。Ｔ細胞と表面
（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を、著明に希釈することにより、粒子と細胞と
の相互作用を最小化する。これは、粒子に結合する、高量の所望の抗原を発現する細胞を
選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度のＣＤ８
＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一実施形態では、使用される細胞濃度は、１ｍｌ当た
りの細胞５×１０６個である。他の実施形態では、使用される濃度は、１ｍｌ当たりの細
胞約１×１０５個～１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個、およびこれらの間の任意の整数値
でありうる。
他の実施形態では、細胞は、速度を変動させて、２～１０℃または室温で、長さを変動
させる時間にわたり、ロテーター上でインキュベートすることができる。
刺激されるＴ細胞はまた、洗浄ステップの後で、凍結させることもできる。血漿および
血小板を除去する洗浄ステップの後で、細胞を、凍結用溶液中に懸濁させることができる
。当技術分野では、多くの凍結用溶液および凍結パラメータが公知であり、この文脈でも
有用であろうが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯおよび８％のヒト血清アルブミンを含
有するＰＢＳ、もしくは１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％
のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、もしくは３１
．２５％のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％
のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清
アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯ、または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓ
ｍａｌｙｔｅ Ａを含有する、他の適切な細胞凍結用培地の使用を伴い、次いで、細胞を
、１分間当たり１℃の速度で、－８０℃へと凍結させ、液体窒素保管タンクの蒸気相中で
保存する。制御型凍結の他の方法を使用しうるほか、－２０℃または液体窒素中における
速やかな非制御型凍結も使用しうる。ある特定の実施形態では、凍結保存された細胞を、
本明細書で記載される通りに、融解させ、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化の前に
、室温で、１時間にわたり休眠させる。
ある特定の実施形態ではまた、本明細書で記載される、拡張細胞が必要とされうる時点
より前の時期における、血液試料またはアフェレーシス生成物の、対象からの回収も提示
される。したがって、拡大増殖させる細胞の供給源は、任意の必要な時点において回収す
ることができ、Ｔ細胞など、所望の細胞を、本明細書で記載されるＴ細胞療法などのＴ細
胞療法から利益を得る、任意の数の疾患または状態のためのＴ細胞療法におけるその後の
使用のために、単離し、凍結させることができる。一実施形態では、血液試料またはアフ
ェレーシスを、一般に、健常対象から採取する。ある特定の実施形態では、血液試料また
はアフェレーシスを、一般に、疾患を発症する危険性があるが、疾患をいまだ発症してい
ない健常対象から採取し、目的の細胞を、その後の使用のために単離し、凍結させる。あ
る特定の実施形態では、Ｔ細胞を、その後の時点において、拡大増殖させ、凍結させ、使
用することができる。ある特定の実施形態では、試料を、患者から、本明細書で記載され
る特定の疾患についての診断の直後であるが、任意の処置の前において回収する。さらな
る実施形態では、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放
射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およ
びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサ
ン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ス
テロイド、ＦＲ９０１２２８、および照射など、他の免疫除去剤などの薬剤による処置を
含むがこれらに限定されない、任意の数の妥当な処置モダリティーの前に、対象に由来す
る血液試料またはアフェレーシスから単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホス
ファターゼである、カルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害するか
、または、増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマ
イシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, (1991)、Henderson et al., Immun 73:316-32
1, (1991)、Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, (1993)）。さらなる実施形
態では、細胞を、患者のために単離し、骨髄移植または幹細胞移植、フルダラビンなどの
化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３も
しくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法を伴う（例えば、この前に、
これと同時に、またはこの後で）その後の使用のために凍結させる。別の実施形態では、
細胞を、あらかじめ単離し、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、ＲｉｔｕｘａｎなどのＢ
細胞除去療法の後における処置のためのその後の使用のために凍結させることができる。
本発明の、さらなる実施形態では、Ｔ細胞を、処置後における患者から直接得る。この
点で、ある特定のがん処置、特に、免疫系を損なう薬物による処置の後であって、患者が
通常、処置から回復する期間中の、処置の直後である、処置の後において、得られるＴ細
胞お品質は、最適でありうるか、またはｅｘ ｖｉｖｏにおいて拡大増殖するそれらの能
力について改善されうることが観察されている。同様に、本明細書で記載される方法を使
用する、ｅｘ ｖｉｖｏにおける操作の後、これらの細胞は、生着の延長、およびｉｎ
ｖｉｖｏにおける拡大増殖に好ましい状態でありうる。したがって、本発明の文脈内では
、この回復期において、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系列の細胞を含む血液細胞を
回収することが想定される。さらに、ある特定の実施形態では、動員（例えば、ＧＭ－Ｃ
ＳＦによる動員）レジメンおよびコンディショニングレジメンを使用して、対象において
、とりわけ、治療後における規定された時間窓において、特定の細胞型の再増殖、再循環
、再生、および／またはぞうが好適となる条件を創出することができる。例示的な細胞型
は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞を含む。
Ｔ細胞の活性化および拡大増殖
本明細書に記載されるＣＡＲを発現するようにＴ細胞を操作する前であれ後であれ、Ｔ
細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０
５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同
第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６
８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同
第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８
４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同
第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；および米国特許出願
公開第２００６０１２１００５号明細書において記載されている方法を使用して活性化さ
せ、拡大増殖させることができる。
一般に、本明細書で記載されるＴ細胞を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体と関連するシグナルを
刺激する薬剤、およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを接合させた表面
と接触させることにより拡大増殖させる。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書で記載される通
り、表面上に固定化させた、抗ＣＤ３抗体、もしくはこの抗原結合性断片、または抗ＣＤ
２抗体との接触、あるいはカルシウムイオノフォアを伴う、タンパク質キナーゼＣ活性化
因子（例えば、ブリオスタチン）との接触などにより刺激することができる。Ｔ細胞表面
上のアクセサリー分子を共刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用
する。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ
３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋
Ｔ細胞の増殖を刺激するには、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることがで
きる。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、
Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を含み、当技術分野で一般に公知の他の方法と同様に
使用することができる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, (1998)、Haa
nen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, (1999)、Garland et al., J. Immunol Met
h. 227(1-2):53-63, (1999)）。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞のための一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、
異なるプロトコールによりもたらされる。例えば、各シグナルをもたらす薬剤は、溶液中
とする場合もあり、表面へとカップリングさせる場合もある。表面へとカップリングさせ
る場合、薬剤は、同じ表面へとカップリングさせることもでき（すなわち、「シス」構成
）、別個の表面へとカップリングさせることもできる（すなわち、「トランス」構成）。
代替的に、１つの薬剤を、表面へとカップリングさせ、他の薬剤を、溶液中とすることも
できる。一実施形態では、共刺激シグナルをもたらす薬剤を、細胞表面に結合させ、一次
活性化シグナルをもたらす薬剤を、溶液とするか、または表面へとカップリングさせる。
ある特定の実施形態では、いずれの薬剤も、溶液中とする。別の実施形態では、薬剤は、
可溶性形態であることが可能であり、次いで、Ｆｃ受容体もしくは抗体、または薬剤に結
合する他の結合剤を発現する細胞などの表面へと架橋される。この点で、本発明における
、Ｔ細胞の活性化および拡大増殖における使用のために想定される人工抗原提示細胞（ａ
ＡＰＣ）については、例えば、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書およ
び同２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
一実施形態では、２つの薬剤を、同じビーズ上に、すなわち、「シス」であるか、また
は別個のビーズへと、すなわち、「トランス」である、ビーズ上に固定化させる。例を目
的として述べると、一次活性化シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはこの抗原
結合性断片であり、共刺激シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはこの抗原結
合性断片であり、両方の薬剤を、等分子量で、同じビーズへと、共固定化させる。一実施
形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大増殖およびＴ細胞の増殖のために、ビーズへと結合させ
た各抗体の、１：１の比を使用する。本発明のある特定の態様では、ビーズへと結合させ
た抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を、１：１の比を使用して観察される拡大増殖と比較した
、Ｔ細胞の拡大増殖の増大が観察されるように使用する。特定の一実施形態では、１：１
の比を使用して観察される拡大増殖と比較した、約１～約３倍の増大が観察される。一実
施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１～１：１０
０、およびこれらの間の全ての整数値の範囲である。本発明の一態様では、抗ＣＤ３抗体
より多くの抗ＣＤ２８抗体を、粒子へと結合させる、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は
、１未満である。本発明のある特定の実施形態では、抗ＣＤ２８抗体の、ビーズへと結合
させた抗ＣＤ３に対する比は、２：１を超える。特定の一実施形態では、ビーズへと結合
させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：１００の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと
結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：７５の比を使用する。さらなる実施形態では、ビー
ズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：５０の比を使用する。別の実施形態では、ビ
ーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：３０の比を使用する。複数の実施形態では
、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：１０の比を使用する。別の実施形態で
は、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：３の比を使用する。さらに別の実施
形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、３：１の比を使用する。
１：５００～５００：１、およびこれらの間の任意の整数値である、粒子の、細胞に対
する比を使用して、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激することができる。当業者がたやす
く理解しうる通り、粒子の、細胞に対する比は、標的細胞と比べた粒子サイズに依存しう
る。例えば、小型サイズのビーズが、少数の細胞だけに結合しうるのに対し、大型のビー
ズは、多くの細胞に結合しうるであろう。ある特定の実施形態では、細胞の、粒子に対す
る比は、１：１００～１００：１、およびこれらの間の任意の整数値の範囲であり、さら
なる実施形態では、比は、１：９～９：１、およびこれらの間の任意の整数値を含み、こ
れらもまた、Ｔ細胞を刺激するのに使用しうる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８カップリング粒子
の、Ｔ細胞に対する比であって、Ｔ細胞の刺激を結果としてもたらす比は、上記で言及し
た通り、変動しうるが、ある特定の値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、
１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：
２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０
：１、および１５：１を含み、１つの比は、少なくとも１：１のＴ粒子の、細胞に対する
比（at least 1:1 particles per T cell）である。一実施形態では、１：１またはこれ
未満の、粒子の、細胞に対する比を使用する。特定の一実施形態では、粒子：細胞比は、
１：５である。さらなる実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、刺激日に応じて変動
しうる。例えば、一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、１日目には、１：１～１
０：１であり、さらなる粒子を、細胞へと、その後、最長１０日間にわたり、毎日または
隔日で追加し、最終的な比を１：１～１：１０とする（追加日における細胞カウントに基
づく）。特定の一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、第１の刺激日には、１：１
であり、第３の刺激日および第５の刺激日には、１：５へと調整される。別の実施形態で
は、粒子を、１日目における、１：１の最終比、ならびに第３の刺激日および第５の刺激
日における１：５へと、毎日または隔日で追加する。別の実施形態では、粒子の、細胞に
対する比は、第１の刺激日には、２：１であり、第３の刺激日および第５の刺激日には、
１：１０へと調整される。別の実施形態では、粒子を、１日目における、１：１の最終比
、ならびに第３の刺激日および第５の刺激日における１：１０へと、毎日または隔日で追
加する。当業者は、様々な他の比も、本発明における使用に適しうることを理解するであ
ろう。特に、比は、粒子のサイズ、ならびに細胞のサイズおよび種類に応じて変動するで
あろう。
本明細書に記載されるさらなる実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞を、
薬剤コーティングビーズと組み合わせ、その後、ビーズと細胞とを分離し、次いで、細胞
を培養する。代替的な実施形態では、培養の前に、薬剤コーティングビーズと、細胞とを
分離せず、併せて培養する。さらなる実施形態では、ビーズおよび細胞を、まず、磁力な
どの力を適用することにより濃縮する結果として、細胞表面マーカーのライゲーションの
増加をもたらし、これにより、細胞の刺激を誘導する
例を目的として述べると、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を接合させた常磁性ビーズ（３×
２８ビーズ）を、Ｔ細胞に接触させることにより、細胞表面タンパク質をライゲーション
させることができる。一実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞１０４～１０９個）と、ビ
ーズ（例えば、比を１：１とする、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３
／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のＭＡＣＳ（登
録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）とを、緩衝液中、例えば、ＰＢＳ（カルシウムおよびマ
グネシウムなどの二価カチオンを伴わない）中で組み合わせる。ここでもまた、当業者は
、任意の細胞濃度を使用しうることをたやすく理解することができる。例えば、標的細胞
は、試料中で極めて稀であり、試料のうちの０．０１％だけを含む場合もあり、全試料（
すなわち、１００％）が、目的の標的細胞を含む場合もある。したがって、任意の細胞数
が、本発明の文脈内にある。ある特定の実施形態では、粒子と細胞とを、併せて混合する
容量を著明に減少させて（すなわち、細胞の濃度を増大させて）、細胞と粒子との最大の
接触を確保することが所望でありうる。例えば、一実施形態では、約１ｍｌ当たりの細胞
２０億個の濃度を使用する。別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億個を超えるもの
を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０００万、１５００万、２０
００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５００
０万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万
、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞濃度を使用す
る。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個
の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、および細胞の拡大増
殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞
など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、より効率的な捕捉を可能とする。
ある特定の実施形態では、このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得
ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８の発現が通常低度である
、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
本明細書に記載される一実施形態では、混合物を、数時間（約３時間）～約１４日間ま
たはこれらの間の任意の整数値時間にわたり培養することができる。別の実施形態では、
混合物を、２１日間にわたり培養することができる。本発明の一実施形態では、ビーズお
よびＴ細胞を、併せて、約８日間にわたり培養する。別の実施形態では、ビーズおよびＴ
細胞を、併せて、２～３日間にわたり培養する。Ｔ細胞の培養期間が、６０日間またはこ
れを超えるように、数サイクルにわたる刺激もまた、所望でありうる。Ｔ細胞の培養に適
切な条件は、増殖および生存に必要な因子であって、血清（例えば、ウシ胎仔血清または
ヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－４
、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、およびＴ
ＮＦ－アルファ、または当業者に公知である、細胞の増殖のための、他の任意の添加剤を
含む因子を含有しうる、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０
、またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための、他の添加剤
は、界面活性剤、プラズマネート、およびＮ－アセチルシステインおよび２－メルカプト
エタノールなどの還元剤を含むがこれらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ １６４０、
ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、アルファ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５およ
びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ、アミノ酸の添加、ピルビン酸ナトリウム、
ならびにビタミン、無血清もしくは適量の血清（または血漿）の補充、または規定された
セットのホルモン、ならびに／あるいはＴ細胞の増殖および拡大増殖に十分な量のサイト
カインを含みうる。抗生剤、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養
物に限り組み入れ、対象へと輸注される細胞培養物には組み入れない。標的細胞は、増殖
を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例え
ば、空気＋５％のＣＯ２）下で維持する。
変動させる刺激時間へと曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈しうる。例えば、典型的
な血液生成物またはアファレーシスされた末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害性Ｔ細胞集
団またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より多くのヘルパーＴ細胞集団（Ｔ
Ｈ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３受容体およびＣＤ２８受容体を刺激することによる、ｅ
ｘ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の拡大増殖は、約８～９日目の前には、主にＴＨ細胞からな
るが、約８～９日目の後では、ますます多くのＴＣ細胞の集団を含むＴ細胞の集団をもた
らす。したがって、処置の目的に応じて、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を輸注
することも、有利でありうる。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットを単離した場合
、このサブセットを、より大きな程度で拡大増殖させることが有益でありうる。
さらに、ＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、著明
に変動するが、大部分は、細胞拡大増殖工程の経過中において、再現可能な形で変動する
。したがって、このような再現性は、特殊な目的のためのＴ細胞生成物の活性化を調整す
る能力を可能とする。
場合によって、実施形態の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を、ＡａＰＣ （
ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）と共に共培養して
、細胞の拡大増殖を支援する。ＡａＰＣはまた、人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）と称する
こともできる。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、実施形態の治療用組成物および細胞
療法用生成物の調製において有用である。一態様では、ＡａＰＣは、遺伝子改変されたＫ
５６２細胞でありうる。抗原提示系の調製および使用に関する、一般的な指針については
、例えば、それらの各々が参照により組み込まれる、米国特許第６，２２５，０４２号明
細書、同第６，３５５，４７９号明細書、同第６，３６２，００１号明細書、および同第
６，７９０，６６２号明細書、米国特許出願公開第２００９／００１７０００号明細書お
よび同第２００９／０００４１４２号明細書、ならびに国際公開第２００７／１０３００
９号パンフレットを参照されたい。実施形態についてのなおさらなる態様では、遺伝子改
変されたＣＡＲ細胞の培養は、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の拡大増殖を刺激
する、樹状細胞またはＡａＰＣ （ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉ
ｎｇ ｃｅｌｌ）の存在下で、遺伝子改変されたＣＡＲ細胞を培養することを含む。なお
さらなる態様では、ＡａＰＣは、ＡａＰＣの表面上で発現したＣＡＲ結合性抗体またはこ
の断片を含む。ＡａＰＣは、場合によって、Ｔ細胞を活性化させるかまたは共刺激する、
さらなる分子を含みうる。さらなる分子は、場合によって、膜結合型Ｃγサイトカインを
含みうる。なおまださらなる態様では、ＡａＰＣは、不活化させているかもしくは照射さ
れているか、または感染性物質について調べられ、これを含まないことが確認されている
。なおさらなる態様では、ＡａＰＣの存在下における遺伝子改変されたＣＡＲ細胞の培養
は、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、および／またはＩＬ－２などの可溶性サイトカインを含む
培地中で、遺伝子改変されたＣＡＲ細胞を培養することを含む。細胞を、約１０：１～約
１：１０、約３：１～約１：５、約１：１～約１：３（免疫エフェクター細胞対ＡａＰＣ
）、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養することができる。例えば、Ｔ細胞
およびＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比でありうる。
一態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ１３７Ｌを発現しうる。一部の態様では、ＡａＰＣは、
ＣＡＲ細胞によってターゲティングされる抗原、例えば、ＭＵＣ１６（全長、トランケー
ト型、またはこれらの任意の変異体）をさらに発現しうる。他の態様では、ＡａＰＣは、
ＣＤ６４、ＣＤ８６、またはｍＩＬ１５をさらに発現しうる。ある特定の態様では、Ａａ
ＰＣは、例えば、ＯＫＴ３および／またはＵＣＨＴ１など、少なくとも１つの抗ＣＤ３抗
体クローンを発現しうる。一態様では、ＡａＰＣを不活化して（例えば、照射して）、そ
れらの増殖可能性を消失させることができる。一態様では、ＡａＰＣは、感染性物質につ
いて調べられ、これを含まないことが確認されている場合がある。当技術分野では、この
ようなＡａＰＣを作製するための方法が公知である。一態様では、ＡａＰＣを伴うＣＡＲ
改変Ｔ細胞集団の培養は、細胞を、約１０：１～約１：１０、約３：１～約１：５、約１
：１～約１：３（Ｔ細胞対ＡａＰＣ）、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養
することを含みうる。例えば、Ｔ細胞およびＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２ま
たは約１：３の比でありうる。一態様では、培養するステップは、アミノビスホスホネー
ト（例えば、ゾレドロン酸）と共に培養することをさらに含みうる。
一態様では、遺伝子改変ＣＡＲ細胞の集団は、対象へと速やかに輸注される、または凍
結保存される。別の態様では、遺伝子改変ＣＡＲ細胞の集団は、対象への輸注の前に、サ
イトカインバス内で保存される。さらなる態様では、遺伝子改変ＣＡＲ細胞の集団は、１
、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５ ４２日間、４９、５６、６３、ま
たは７０日間以内で、培養および／または刺激される。ある実施形態では、刺激は、ＣＡ
Ｒ陽性Ｔ細胞の増殖を促進するように、遺伝子改変ＣＡＲ Ｔ細胞のＡａＰＣとの共培養
を含む。別の態様では、遺伝子改変されたＣＡＲ細胞の集団を、刺激１回、刺激２回、刺
激３回、刺激４回、刺激５回、刺激５回、刺激６回、刺激７回、刺激８回、刺激９回、ま
たは刺激１０回を超えない回数にわたり刺激する。場合によって、遺伝子改変された細胞
を、ＡａＰＣの存在下にあるｅｘ ｖｉｖｏでは培養しない。一部の特殊な場合には、実
施形態の方法は、トランスフェクションステップおよび／または培養するステップの後で
、細胞集団を、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）について濃縮
するステップをさらに含む。濃縮するステップは、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）して
、ＣＡＲを発現する細胞について分取することを含みうる。さらなる態様では、ＣＡＲを
発現する細胞について分取することは、ＣＡＲ結合性抗体の使用を含む。濃縮するステッ
プはまた、ＣＤ５６＋細胞の枯渇も含みうる。実施形態についての、なおまださらなる態
様では、方法は、遺伝子改変されたＣＡＲ細胞の集団についての凍結保存試料をさらに含
む。
場合によって、ＡａＰＣを、さらなるプロセシングを伴わずに、ペプチドの、ＭＨＣ分
子との直接的な結合を可能とする、最適な長さのペプチドと共にインキュベートする。代
替的に、細胞は、目的の抗原（すなわち、ＭＨＣ非依存型の抗原認識の場合）を発現しう
る。さらに、場合によって、ＡＰＣは、特異的なＣＡＲポリペプチドまたは一般的なＣＡ
Ｒポリペプチド（例えば、ｕＡａＰＣ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａ
ｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）に結合する抗体を発現しうる。このような方
法については、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１９０２７３
号パンフレットにおいて開示されている。ペプチド－ＭＨＣ分子または目的の抗原に加え
て、ＡａＰＣ系はまた、少なくとも１つの外因性支援分子も含みうる。任意の適切な数お
よび組合せの支援分子を利用することができる。支援分子は、共刺激分子および接着分子
などの支援分子から選択することができる。例示的な共刺激分子は、ＣＤ７０およびＢ７
．１（Ｂ７．１は、かつては、Ｂ７として公知であり、また、ＣＤ８０としても公知であ
った）を含み、これらは、とりわけ、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８分子および／またはＣＴ
ＬＡ－４分子に結合し、これにより、例えば、Ｔ細胞の拡大増殖、Ｔｈ１の分化、短期的
なＴ細胞の生存、およびインターロイキン（ＩＬ）２など、サイトカインの分泌に影響を
及ぼす。接着分子は、セレクチンなどの炭水化物結合性糖タンパク質、インテグリンなど
の膜貫通結合生糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、および例
えば、細胞間または細胞－マトリックス間の接触を促進する、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ
）などの、１回膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質を含みうる
。例示的な接着分子は、ＬＦＡ－３およびＩＣＡＭ－１などのＩＣＡＭ、を含む。共刺激
分子および接着分子を含む、例示的な支援分子の選択、クローニング、調製、および発現
に有用な技法、方法、および試薬については、例えば、参照により本明細書に組み込まれ
る、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、および
同第６，３６２，００１号明細書において例示されている。
ＡａＰＣとなるように選択される細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞
内ペプチドトラフィッキング、および／またはＭＨＣクラスＩ分子もしくはクラスＩＩ分
子の細胞内ペプチドローディングを欠損させているか、あるいは。変温性（すなわち、哺
乳動物細胞株より、温度刺激に対する感受性が小さい）であるか、あるいは欠損および変
温特性の両方を有する。好ましくは、ＡａＰＣとなるように選択される細胞はまた、細胞
へと導入される、外因性のＭＨＣクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子、および支援分子の
構成要素に対する、少なくとも１つの内因性対応物（例えば、内因性のＭＨＣクラスＩ分
子もしくはクラスＩＩ分子、および／または上記で記載した内因性支援分子）を発現する
能力も欠く。さらに、ＡａＰＣは、ＡａＰＣを作出するための、それらの改変の前に、細
胞が保有していた欠損および変温特性を保持することが好ましい。例示的なＡａＰＣは、
昆虫細胞株など、ＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ
ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）欠損細胞株を構成するか、またはこれに由来す
る。例示的な変温性昆虫細胞株は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２細胞株などのショウジョウバ
エ（Drosophila）属細胞株（例えば、Schneider 1972を参照されたい）である。Ｓｃｈｎ
ｅｉｄｅｒ ２細胞の調製、増殖、および培養のための例示的な方法は、米国特許第６，
２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、および同第６，３６２，０
０１号明細書において提示されている。
一実施形態ではまた、ＡａＰＣを、凍結融解サイクルにもかける。例示的な凍結融解サ
イクルでは、凍結が、迅速に生じるように、ＡａＰＣを含有する、適切なレセプタクルを
、適量の液体窒素、固体二酸化炭素（すなわち、ドライアイス）、または同様の低温材料
と接触させることにより、ＡａＰＣを凍結させることができる。次いで、凍結させたＡＰ
Ｃを、ＡａＰＣの、低温材料からの摘出、および周囲の室温条件への曝露により、または
微温水浴もしくは手の温熱を利用して、融解時間の短縮を促進する、促進融解工程により
融解させる。加えて、融解の前に、ＡａＰＣを、凍結させ、長ｆ時間にわたり保存するこ
とができる。凍結させたＡａＰＣはまた、融解させ、次いで、さらなる使用の前に、凍結
乾燥させることもできる。好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）、および他の保存剤など、凍結融解手順に有害な影響を及ぼしう
る保存剤は、凍結融解サイクルを経るＡａＰＣを含有する培地には非含有とするか、また
はこのような保存剤を本質的に欠く培地へのＡａＰＣの導入などにより、本質的に除去す
る。
さらなる実施形態では、不活化の後で、細胞の増殖、複製、または核酸の発現が本質的
に生じないように、異種核酸およびＡａＰＣに内因性の核酸を、架橋により不活化させる
ことができる。一実施形態では、ＡａＰＣを、外因性ＭＨＣおよび支援分子の発現、この
ような分子の、ＡａＰＣ表面上の提示、ならびに提示されたＭＨＣ分子への、選択された
、１または複数のペプチドのローディングの後の時点において不活化させる。したがって
、このような、選択されたペプチドをロードした不活化ＡａＰＣは、増殖または複製が本
質的に不可能とされているが、選択されたペプチドの提示機能は保持する。好ましくは、
架橋はまた、ＡａＰＣの抗原提示細胞機能を、実質的に低下させずに、細菌およびウイル
スなどの汚染微生物を本質的に含まない、ＡａＰＣももたらす。したがって、架橋は、Ａ
ａＰＣを使用して開発される細胞療法製品の安全性に関する懸念を軽減する一助となる一
方、重要なＡａＰＣ機能を維持する。架橋およびＡａＰＣに関する方法については、例え
ば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９００１７０００号
明細書を参照されたい。
ある特定の実施形態では、操作抗原提示細胞（ＡＰＣ）がさらに提供される。ｅｘ ｖ
ｉｖｏにおいて、免疫エフェクター細胞を繁殖させるのに、このような細胞を、例えば、
上記で記載した通りに使用することができる。さらなる態様では、操作ＡＰＣ自体を、患
者へと投与し、これにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫エフェクター細胞の拡大増殖を
刺激することができる。実施形態の操作ＡＰＣ自体を、治療剤として使用することができ
る。他の実施形態では、操作ＡＰＣを、標的抗原に特異的な内因性免疫エフェクター細胞
の活性化を刺激し、かつ／または標的抗原に特異的な、養子導入された免疫エフェクター
細胞の活性を増加させるか、もしくは存続を延長しうる治療剤として使用することができ
る。
本明細書で使用される「操作ＡＰＣ」という用語は、少なくとも第１のトランス遺伝子
を含み、第１のトランス遺伝子が、ＨＬＡをコードする細胞を指す。このような操作ＡＰ
Ｃは、抗原が、ＨＬＡと複合したＡＰＣの表面上に提示されるように、抗原の発現のため
の第２のトランス遺伝子をさらに含みうる。一部の態様では、操作ＡＰＣは、抗原を提示
した細胞型（例えば、樹状細胞）でありうる。さらなる態様では、操作ＡＰＣは、Ｔ細胞
またはＴ細胞の前駆細胞など、通常、抗原を提示しない細胞型（「Ｔ－ＡＰＣ」と称する
）から作製することができる。したがって、一部の態様では、実施形態の操作ＡＰＣは、
ＨＬＡが、標的抗原のエピトープと複合した操作ＡＰＣの表面上で発現するように、標的
抗原をコードする第１のトランス遺伝子と、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする第２
のトランス遺伝子とを含む。ある特定の具体的な態様では、操作ＡＰＣ内で発現するＨＬ
Ａは、ＨＬＡ－Ａ２である。
一部の態様では、実施形態の操作ＡＰＣは、共刺激分子をコードする、少なくとも第３
のトランス遺伝子をさらに含みうる。共刺激分子は、膜結合型Ｃγサイトカインでありう
る、共刺激サイトカインでありうる。ある特定の態様では、共刺激サイトカインは、膜結
合型ＩＬ－１５などのＩＬ－１５である。一部のさらなる態様では、操作ＡＰＣは、編集
（または欠失）遺伝子を含みうる。例えば、ＰＤ－１、ＬＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、また
はＴＣＲなどの阻害性遺伝子は、遺伝子の発現を低減するかまたは消失させるように編集
することができる。実施形態の操作ＡＰＣは、任意の目的の標的抗原をコードするトラン
ス遺伝子をさらに含みうる。
ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ）
本開示の一実施形態では、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞を、ＰＯＣ（ｐ
ｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ）施設で改変する。場合によって、改変免疫エフェクター細胞
はまた、操作Ｔ細胞とも呼ばれる。場合によって、ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ
）施設は、処置を必要とする対象の近隣の病院または機関（例えば、医療機関）にある。
対象は、アファレーシスを受け、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＰＢＭＣのサブ集団
は、例えば、湿式分級またはＦｉｃｏｌｌ分離により濃縮することができる。濃縮された
ＰＢＭＣまたはＰＢＭＣのサブ集団は、さらなるプロセシングの前に任意の適切な凍結保
存用溶液中で凍結保存することができる。１つの場合には、ヒト血清アルブミンを含有す
る緩衝液を使用して、湿式分級工程を実施する。Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、
本明細書で記載される選択法により単離することができる。１つの場合には、Ｔ細胞につ
いての選択法は、Ｔ細胞上のＣＤ３に特異的なビーズまたはＣＤ４およびＣＤ８に特異的
なビーズを含む。１つの場合には、ビーズは、常磁性ビーズでありうる。採取された免疫
エフェクター細胞は、改変の前に、任意の適切な凍結保存用溶液中で凍結保存することが
できる。免疫エフェクター細胞は、輸注に先立ち、最大で２４時間、３６時間、４８時間
、７２時間、または９６時間にわたり融解させることができる。融解させた細胞は、改変
の前に、細胞培養緩衝液、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）もしくはヒト血清ＡＢを補充
した細胞培養緩衝液（例えば、ＲＰＭＩ）、またはＩＬ－２およびＩＬ－２１などのサイ
トカインを含む緩衝液に入れることができる。別の態様では、採取された免疫エフェクタ
ー細胞は、凍結保存を必要とせずに、速やかに改変することができる。
場合によって、キメラ受容体、１もしくは複数の細胞タグ、および／またはサイトカイ
ンを、免疫エフェクター細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改
変し、次いで、対象へと、迅速に輸注する。場合によって、免疫エフェクター細胞の供給
源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。１つの場合には、免疫エフェクタ
ー細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞でありうる。１つの場合には、キメラ受容体は、ＭＵＣ
１６ ＣＡＲでありうる。別の場合には、サイトカインは、ｍｂＩＬ－１５でありうる。
１つの場合には、ｍｂＩＬ－１５は、配列番号６９のｍｂＩＬ－１５、またはこの変異体
もしくは断片である。さらに別の場合には、ｍｂＩＬ－１５の発現は、本明細書で記載さ
れる、リガンド誘導性遺伝子スイッチ発現系によりモジュレートされる。例えば、ベレジ
メクスなどのリガンドは、ｍｂＩＬ－１５の発現をモジュレートするように対象へと送達
されうる。別の場合では、サイトカインは、ＩＬ－１２でありうる。さらに別の場合では
、ＩＬ－１２の発現は、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチ発現系によ
りモジュレートされる。例えば、ベレジメクスなどのリガンドを、対象へと送達して、Ｉ
Ｌ－１２の発現をモジュレートすることができる。
別の態様では、ベレジメクスを、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、
４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、または１００ｍｇで施
す。さらなる態様では、低用量のベレジメクスを、例えば、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ
、１０ｍｇ、１５ｍｇ、または２０ｍｇで施す。一実施形態では、ベレジメクスを、改変
免疫エフェクター細胞を輸注する０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日前に、対象へ
と投与する。さらなる実施形態では、ベレジメクスを、改変免疫エフェクター細胞の輸注
後、有効期間にわたり、約１２時間ごとに１回、約２４時間ごとに１回、約３６時間ごと
に１回、または約４８時間ごとに１回、対象へと投与する。一実施形態では、ベレジメク
ス投与のための有効期間は、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６
、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、
３０日間である。他の実施形態では、休薬期間後の休眠期間の後、または対象が、再発を
被る場合に、ベレジメクスを再投与することができる。
対象に対する副作用が観察されるか、または処置が必要とされない、ある特定の場合に
は、例えば、セツキシマブを介して、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、改変免疫エフェクター細
胞の、条件付けアブレーションのために、本明細書で記載されるトランケート型表皮増殖
因子受容体タグなどの細胞タグを含む細胞タグを活性化させることができる。
一部の実施形態では、このような免疫エフェクター細胞を、図１～２Ｂに記載される構
築物により、電気穿孔を介して改変する。１つの場合には、電気穿孔を、Ｌｏｎｚａ製の
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）電気穿孔器などの電気穿孔器により実施する。他の実
施形態では、上述の構築物を含むベクターは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクタ
ーである。１つの場合には、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙト
ランスポゾン－トランスポザーゼ系を含む。１つの場合には、特異的配列を使用して、免
疫エフェクター細胞に電気穿孔する。例えば、免疫エフェクター細胞に、１つのトランス
ポゾンに続く、トランスポザーゼをコードするＤＮＡに続く、第２のトランスポゾンを電
気穿孔することができる。別の場合には、免疫エフェクター細胞に、全てのトランスポゾ
ンと、トランスポザーゼとを、同時に電気穿孔することができる。別の場合には、免疫エ
フェクター細胞に、トランスポザーゼに続き、両方のトランスポゾンまたは１つのトラン
スポゾンを、同時に電気穿孔することができる。逐次的な電気穿孔を経ながら、免疫エフ
ェクター細胞を、次の電気穿孔ステップの前に、ある時間にわたり、休眠させることがで
きる。
場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、繁殖ステップおよび活性化ステップを経
ない。場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、インキュベーションステップまたは
培養ステップ（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏにおける繁殖）を経ない。ある特定の場合には、
輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、ＩＬ－２およびＩＬ２１を含む緩衝液に入れ
る。他の場合には、輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、細胞培養緩衝液、例えば
、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した細胞培養緩衝液（例えば、ＲＰＭＩ）に入れるか、
またはこの中で休眠させる。輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、採取し、洗浄し
、生理食塩緩衝液中で、対象への輸注のための調製物に製剤化することができる。
１つの場合には、輸注の前に、対象を、リンパ枯渇させている。他の場合には、リンパ
枯渇は、必要とされず、改変免疫エフェクター細胞は、対象へと、迅速に、輸注される。
例示的なリンパ枯渇レジメンを、下記の表４および５に一覧する。
さらなる場合には、対象は、最小リンパ枯渇を受ける。本明細書における最小リンパ枯
渇とは、リンパ枯渇レジメン後１日、２日、または３日以内に対象に輸注しうるような、
低減型リンパ枯渇プロトコールを指す。１つの場合には、低減型リンパ枯渇プロトコール
は、低用量のフルダラビンおよび／またはシクロホスファミドを含みうる。別の場合には
、低減型リンパ枯渇プロトコールは、短期間、例えば、１日間または２日間にわたるリン
パ枯渇を含みうる。
一実施形態では、キメラ受容体およびサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作
／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、対象へと、迅速に輸注
する。他の場合には、キメラ受容体およびサイトカインを、細胞へと操作／導入すること
により、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、少なくとも０、０．５、１、２、３、
４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１
９、２０、２１、２２、２３，２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２
、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、
４６、４７、４８、４９、または５０時間以内に、対象へと輸注する。他の場合には、キ
メラ受容体およびサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作／導入することにより
、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、０日間、＜１日間、＜２日間、＜３日間、＜
４日間、＜５日間、＜６日間、または＜７日間以内に、対象へと輸注する。
一部の実施形態では、ある量の改変エフェクター細胞を、それを必要とする対象へと投
与し、その量を、有効性およびサイトカイン関連毒性を誘導する潜在的可能性に基づき決
定する。別の実施形態では、改変エフェクター細胞は、ＣＡＲ＋細胞およびＣＤ３＋細胞
である。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター
細胞約１０４～約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ
当たりの改変エフェクター細胞約１０４～約１０５個を含む。場合によって、改変エフェ
クター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５～約１０６個を含む。
場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１
０６～約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの
改変エフェクター細胞＞１０４個、かつ、≦約１０５個を含む。場合によって、改変エフ
ェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞＞１０５個、かつ、≦約１０
６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェク
ター細胞＞１０６個、かつ、≦約１０７個を含む。
一実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、直接腫瘍組織への局所送達を介してが
んをターゲティングする。例えば、卵巣がんでは、改変免疫エフェクター細胞は、腹部ま
たは腹膜腔へと腹腔内（ＩＰ）に送達されうる。このようなＩＰ送達は、化学療法薬の送
達のために設置されたポートまたは既存のポートを介して実施されうる。改変免疫エフェ
クター細胞の局所送達の他の方法は、切除腔へのカテーテル輸注、超音波誘導腫瘍内投与
、冠動脈輸注、または胸膜内送達を含みうる。
一実施形態では、それを必要とする対象は、ＩＰを介して送達される第１の用量の改変
免疫エフェクター細胞により、続いてＩＶを介して送達される第２の用量の改変免疫エフ
ェクター細胞により治療を開始することができる。さらなる実施形態では、第２の用量の
改変免疫エフェクター細胞は、ＩＶまたはＩＰを介して送達されうる次の用量へと続きう
る。一実施形態では、第１の用量および第２用量またはさらなる続く用量の間の期間は、
約：０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、
１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２
９、３０日でありうる。一実施形態では、第１の用量および第２の用量またはさらなる続
く用量の間の期間は、約：０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、
２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６カ月であり
うる。別の実施形態では、第１の用量および第２の用量またはさらなる続く用量の間の期
間は、約：０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年でありうる。
別の実施形態では、カテーテルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０用量の
改変免疫エフェクター細胞のさらなる投与のための腫瘍または転移部位に置かれうる。場
合によって、改変エフェクター細胞の用量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１
０２～約１０９個を含みうる。毒性が観察される場合、改変エフェクター細胞の用量は、
１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０２～約１０５個を含みうる。場合によって、
改変エフェクター細胞の用量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０２個で開始
することができ、続く用量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約：１０４、１０５
、１０６、１０７、１０８、または１０９個まで増加することができる。
他の実施形態では、操作細胞の増殖および／または生存を刺激する方法は、細胞試料を
、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、
１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップとを含む。一実施形態
では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の
細胞タグ、および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込
んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形
態では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数
の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、
および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作
細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、遺
伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合さ
せたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第
２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、
第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチ
ポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されてい
る。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
１つの場合には、操作細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける繁殖の方法は、細胞試料を、対象
から得るステップと、細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１また
は複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップを含む。一実施形態では、ト
ランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ
、および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操
作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、
トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タ
グ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドおよび前記
１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団
をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、遺伝子スイッ
チポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ
結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受
容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝
子スイッチポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチ
ドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。１つの
場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
別の実施形態では、それを必要とする対象の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける操作細胞の存続
を増強する方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、１または
複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトする
ステップとを含む。場合によって、１または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体
（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、およびＤＮＡを、前記細胞のゲノ
ムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする
。場合によって、１または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイ
トカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子
スイッチポリペプチド、およびＤＮＡを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の
集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、遺伝子スイッ
チポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ
結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受
容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝
子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子ス
イッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。１つの場合には、操作細胞の
、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。１つの場合には、操作細胞の、対
象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
別の実施形態では、充実性腫瘍を伴う対象を処置する方法は、細胞試料を、対象から得
るステップと、試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポ
リヌクレオチドをトランスフェクトするステップと、操作細胞の集団を、対象へと投与す
るステップとを含む。１つの場合には、リンパ枯渇は、操作細胞の対象への投与前に必要
ではない。場合によって１または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、およびＤＮＡを細胞のゲノムへと組み込むの
に有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、１または複数のトランスポゾン
は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカイ
ンのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、およびＤＮＡを、細胞の
ゲノムへと組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、遺伝子ス
イッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤ
ＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核
内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の
遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝
子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。場合によって、細胞は、
電気穿孔を介してトランスフェクトされる。場合によって、遺伝子スイッチポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターによりモジュレートされる。場合によっ
て、プロモーターは、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこ
れらの機能的な変異体である。場合によって、組織特異的プロモーターは、Ｔ細胞特異的
応答エレメントまたはＮＦＡＴ応答エレメントを含む。場合によって、サイトカインは、
ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒ
α、またはＩＬ－１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む。場合によって、サ
イトカインは、分泌形態にある。場合によって、サイトカインは、膜結合形態にある。場
合によって、細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、またはＴ細胞前駆細胞である。場
合によって、細胞は、対象へと（例えば、対象に、操作細胞を輸注することにより）投与
される。場合によって、方法は、有効量のリガンド（例えば、ベレジメクス）を投与して
、サイトカインの発現を誘導するステップをさらに含む。場合によって、ＣＡＲは、少な
くともＭＵＣ－１６に結合することが可能である。場合によって、トランスポザーゼは、
サケ科型Ｔｃ１様トランスポザーゼである。場合によって、トランスポザーゼは、ＳＢ１
１またはＳＢ１００ｘトランスポザーゼである。他の場合には、トランスポザーゼは、Ｐ
ｉｇｇｙＢａｃである。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１トランケート型変異体また
はＣＤ２０トランケート型変異体のうちの少なくとも１つを含む。
治療適用
本明細書で記載される複数の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランス
ポゾンおよびＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼにより形質導入された、
免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）が提示される。例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂ
ｅａｕｔｙトランスポゾンまたはトランスポゾンは、本明細書で記載されるように、ＭＵ
Ｃ１６の抗原認識ドメインをＣＤ８アルファヒンジおよびこれらの変異体のストークドメ
イン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４－１ＢＢの細胞内ドメイン、またはこれらの任意の組
合せ、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン、１または複数の細胞タグ、１または複数のサ
イトカイン、ならびに任意選択で、遺伝子スイッチ系の構成要素と組み合わせる、ＣＡＲ
を含みうる。したがって、一部の場合には、形質導入したＴ細胞は、ＣＡＲ媒介性Ｔ細胞
応答を誘発しうる。
本明細書で記載される複数の実施形態では、初代Ｔ細胞の特異性をＭＵＣ１６表面抗原
へとリダイレクトするＣＡＲの使用が提示される。したがって、本発明はまた、Ｔ細胞媒
介性免疫応答を刺激し、哺乳動物において細胞集団または組織をターゲティングするため
の方法であって、ＣＡＲを発現する哺乳動物のＴ細胞へと投与するステップを含み、ＣＡ
Ｒが、ＭＵＣ１６、ストークドメイン、例えば、ヒトＣＤ３ゼータの細胞内ドメイン、お
よび共刺激シグナル伝達領域を含むゼータ鎖部分と特異的に相互作用する結合性部分を含
む、方法も提示する。
一実施形態では、本開示は、Ｔ細胞が遺伝子改変され、本発明のＭＵＣ１６特異的ＣＡ
Ｒを発現し、ＣＡＲ Ｔ細胞が、それを必要とするレシピエントに輸注される細胞療法を
含む。輸注された細胞は、レシピエント内でＭＵＣ１６を過剰発現する細胞を死滅させる
ことができる。抗体療法とは異なり、本明細書で記載されるＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖ
ｉｖｏで複製することができ、腫瘍細胞への持続作用をもたらしうる長期にわたる存続を
結果としてもたらすことができる。
本発明は、対象においてＭＵＣ１６の過剰発現を含む疾患を検出するための方法であっ
て、ａ）本明細書で記載される、ｉ）対象からの試料、およびｉｉ）抗体、またはこれら
の抗原結合断片のうちの任意の１または複数を用意するステップ、ｂ）抗体のその抗原と
の特異的結合のための条件下で、試料を抗体と接触させるステップ、およびｃ）疾患を持
たない対照試料と比較して増加したレベルの、試料に対する抗体の結合を検出し、それに
より、対象における疾患を検出するステップを含む方法がさらに提示される。一実施形態
では、疾患はがんである。好ましい実施形態では、がんは、卵巣がんおよび乳がんからな
る群から選択される。検出の方法を限定することを意図しないが、一実施形態では、試料
への抗体の結合を検出するステップは、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法、および
／または放射線画像撮影法である。
本明細書では、ＭＵＣ１６の過剰発現を含む疾患を処置する方法であって、本明細書で
記載される治療有効量の抗体、またはこれらの抗原結合断片のうちの任意の１または複数
を、疾患を有する対象に投与するステップを含む方法も提示される。一実施形態では、疾
患は、卵巣がんおよび乳がんにより例示されるがんである。
一実施形態では、本明細書で記載されるＭＵＣ１６ ＣＡＲ Ｔ細胞は、強固なｉｎ
ｖｉｖｏにおけるＴ細胞拡大増殖を経ることができ、延長した時間存続することができる
。別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲ Ｔ細胞は、再活性化されうる特定の
メモリーＴ細胞へと進化しうる。
本明細書で記載されるＣＡＲ改変Ｔ細胞はまた、哺乳動物におけるｅｘ ｖｉｖｏにお
ける免疫および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける療法のためのワクチンの型としても寄与
しうる。複数の実施形態では、哺乳動物はヒトである。ｅｘ ｖｉｖｏにおける免疫に関
して、免疫エフェクター細胞を哺乳動物へと投与するステップの前に、以下のうちの少な
くとも１つがｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生じる：ｉ）細胞の拡大増殖、ｉｉ）ＣＡＲをコ
ードする核酸の細胞への導入、および／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存。
Ｅｘ ｖｉｖｏにおける手順は周知であり、以下により完全に議論される。略述すると
、細胞は哺乳動物（例えば、ヒト）から単離され、本明細書で開示されるＣＡＲを発現す
るベクターにより遺伝子改変される（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入またはトラ
ンスフェクトされる）。ＣＡＲ改変細胞は、哺乳動物のレシピエントに投与され、治療効
果をもたらすことができる。哺乳動物のレシピエントは、ヒトの場合があり、ＣＡＲ改変
細胞は、レシピエントに対して自家でありうる。あるいは、細胞は、レシピエントに対し
て同種、同質、または異種でありうる。
造血幹細胞および前駆細胞のｅｘ ｖｉｖｏにおける拡大増殖の手順は、参照により本
明細書に組み込まれる米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載され、本発明の細胞
に適用されうる。他の適切な方法が当技術分野で公知であり、したがって、本発明は、細
胞のｅｘ ｖｉｖｏでの拡大増殖の任意の特定の方法に限定されない。略述すると、ｅｘ
ｖｉｖｏにおける培養およびＴ細胞の拡大増殖は、（１）末梢血採取または骨髄移植片
からの哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞を回収するステップ、および
（２）そのような細胞をｅｘ ｖｉｖｏにおいて拡大増殖するステップを含む。米国特許
第５，１９９，９４２号明細書に記載される細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ
－１、ＩＬ－３およびｃ－ｋｉｔリガンドなどの他の因子が、細胞の培養および拡大増殖
のために使用されうる。
ｅｘ ｖｉｖｏにおける免疫に関して、細胞ベースのワクチンを使用することに加えて
、本発明はまた、患者において抗原を指向する免疫応答を誘発するｉｎ ｖｉｖｏにおけ
る免疫のための組成物および方法も提供する。
一般に、本明細書で記載されるように活性化および拡大された細胞は、免疫無防備状態
の個体において生じる疾患の処置および予防に利用されうる。特に、本発明のＣＡＲ改変
Ｔ細胞は、ＭＵＣ１６悪性腫瘍、例えばＭＵＣ１６などの処置で使用される。ある特定の
実施形態では、本発明の細胞は、ＭＵＣ１６を発症するリスクのある患者の処置に使用さ
れる。したがって、ＭＵＣ１６の処置または予防のための方法は、治療有効量の本発明の
ＣＡＲ改変Ｔ細胞を、それを必要とする対象へと投与するステップを含む。複数の実施形
態では、本明細書で記載されるように活性化および拡大された細胞は、ＭＵＣ１６の処置
に利用されうる。
略述すると、本明細書で記載される医薬組成物は、本明細書で記載される標的細胞集団
を、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と
組み合わせて含みうる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩
液などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトー
ルなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤
；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミ
ニウム）；および保存剤を含みうる。複数の実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投
与のために製剤化される。
本明細書で記載される医薬組成物は、処置される（または予防される）疾患に適切な方
法で投与されうる。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型および
重症度などの因子により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定されうる。
「免疫学的有効量」、または「治療量」が示される場合、投与される、本明細書で記載
される組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、および状態の個体差を考慮して
、医師により決定されうる。一般に、本明細書で記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、
これらの範囲内の全ての整数値を含む、ｋｇ体重当たり１０４～１０９個の細胞、ｋｇ体
重当たり１０５～１０６個の細胞の投与量で投与されうる。Ｔ細胞組成物はまた、これら
の投与量で複数回投与されうる。細胞は、免疫療法で一般的に公知の輸注技術を使用する
ことにより投与されうる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676,
(1988)を参照されたい）。特定の患者のための最適な投与量および投与レジメンは、患者
の疾患の徴候をモニタリングし、それにより処置を調整することにより、医薬の当業者に
より容易に決定されうる。
ある特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、次いで血液を再び採血し（ま
たは、アフェレーシスを実施し）、それ由来のＴ細胞を活性化し、これらの活性化および
拡大Ｔ細胞をこの患者に再輸注することが所望されうる。このプロセスは、数週間ごとに
複数回実行されうる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血
から活性化されうる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃ
ｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血から
活性化されうる。理論に縛られはしないが、この複数回の採血／複数回の再輸注プロトコ
ールを使用することは、Ｔ細胞の特定の集団を選択するのに寄与しうる。別の実施形態で
は、放射線または化学療法のいずれかを介して、患者のリンパ枯渇後に対象組成物の活性
化Ｔ細胞を投与することが所望されうる。
本明細書で記載される組成物の投与は、エアゾル吸入、注射、摂取、輸注、移植（impl
antation）、または移植（transplantation）を含む、任意の便利な方法で実行されうる
。本明細書で記載される組成物は、患者の皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、
静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に投与されうる。一実施形態では、本発明
のＴ細胞組成物は、皮内注射または皮下注射により患者へと投与される。別の実施形態で
は、本発明のＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射により、投与される。
Ｔ細胞の組成物は、リンパ節、または原発性腫瘍もしくは転移の部位へと直接注射されう
る。
患者へと投与される上記の処置の投与量は、処置される状態の正確な性質および処置の
レシピエントによって変わるであろう。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当技
術分野で承認された実行に従って実施されうる。例えば、上記処置の用量は、１ｋｇ当た
りのＣＡＲ＋細胞１×１０４個～１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞５×１０６個の範囲であり
うる。例示的な用量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞１×１０２個、１ｋｇ当たりのＣＡ
Ｒ＋細胞１×１０３個、１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞１×１０４個、１ｋｇ当たりのＣＡ
Ｒ＋細胞１×１０５個、１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞３×１０５個、１ｋｇ当たりのＣＡ
Ｒ＋細胞１×１０６個、１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞５×１０６個、１ｋｇ当たりのＣＡ
Ｒ＋細胞１×１０７個、１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞１×１０８個、または１ｋｇ当たり
のＣＡＲ＋細胞１×１０９個でありうる。適切な用量は、成人か小児患者かによって調整
されうる。
代替的に、哺乳動物（例えば、ヒト）へと投与される免疫エフェクター細胞の典型的な
量は、例えば、１００、１０００、１万、１００万～１０００億個の細胞の範囲でありう
るが、この例示的な範囲を下回るまたは上回る量も本発明の範囲内である。例えば本発明
の宿主細胞の用量は、約１００万～約５００億個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、
約２５００万個の細胞、約５億個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２０
０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞、または前述の値の任意の２つ
によって規定される範囲）、約１０００万～約１０００億個の細胞（例えば、約２０００
万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約
７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細
胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細
胞、または前述の値の任意の２つによって規定される範囲）、約１億個の細胞～約５００
億個の細胞（例えば、約１億２０００万個の細胞、約２億５０００万個の細胞、約３億５
０００万個の細胞、約４億５０００万個の細胞、約６億５０００万個の細胞、約８億個の
細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞、
または前述の値の任意の２つによって規定される範囲）でありうる。
治療有効性または予防有効性は、処置される患者の周期的な評価によりモニターされう
る。数日間またはそれ以上にわたる繰り返し投与のため、状態に応じて、処置は、疾患症
状の所望の抑制が生じるまで繰り返される。しかし、他の投与レジメンが有用である場合
もあり、本発明の範囲内である。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与により、組
成物の複数回ボーラス投与により、または組成物の連続輸注投与により、送達されうる。
本開示の核酸配列を発現する免疫エフェクター細胞を含む組成物、またはこれらの核酸
配列を含むベクターは、１または複数のさらなる治療剤と共に投与することができ、哺乳
動物へと共投与することができる。「共投与」により、１または複数のさらなる治療剤お
よび本発明の宿主細胞を含む組成物または本発明のベクターを十分に近い時間に投与して
、１または複数のさらなる治療剤の効果を増強すること、またはその逆を意味する。この
点について、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞を含む組成物または本明細書で
記載されるベクターは、１または複数のさらなる治療剤と同時に投与される場合もあり、
１番目に投与され、２番目に１または複数のさらなる治療剤が投与される場合もあり、ま
たはその逆の場合もある。代替的に、開示された免疫エフェクター細胞を含む組成物また
は本明細書で記載されるベクター、および１または複数のさらなる治療剤は同時に投与さ
れうる。
本発明の宿主細胞および／または本発明のベクターを含む組成物に含まれうる、または
組成物と共に共投与されうる（またはキットに含まれる）治療剤の例は、インターロイキ
ン、サイトカイン、インターフェロン、アジュバント、および化学療法剤である。複数の
実施形態では、さらなる治療剤は、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－ガンマ
、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＬＴ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、増殖因子
、およびｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬ
Ｒ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、およびＴＬＲ１０のリガンドである。
「消泡剤」は、加工時における発泡であって、水性分散液の凝固、薄膜完成品中の気泡
を結果としてもたらすか、または、一般に、加工を損なう発泡を低減する。例示的な抗発
泡剤は、シリコンエマルジョン（ｓｉｌｉｃｏｎ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）またはセスキオレ
イン酸（sesquoleate）ソルビタンを含む。
「抗酸化剤」は、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸ナ
トリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびトコフェロールを含む。あ
る特定の実施形態では、抗酸化剤は、必要とされる場合、化学的安定性を増強する。
本明細書で記載される製剤は、抗酸化剤、金属キレート化剤、チオールを含有する化合
物、および他の一般的な安定化剤から利益を得る場合がある。このような安定化剤の例は
、（ａ）約０．５％～約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％～約１％ｗ／ｖの
メチオニン、（ｃ）約０．１％～約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ
～約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％～約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）
０．００３％～約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％～約０．
０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）硫酸デ
キストラン、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ポリ硫酸ペントサン、および他のヘパリ
ノイド、（ｍ）マグネシウムおよび亜鉛などの二価カチオン、または（ｎ）これらの組合
せを含むがこれらに限定されない。
「結合剤」は、凝集性の性質を付与し、例えば、アルギン酸およびその塩；カルボキシ
メチルセルロース、メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセ
ルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標））、エチルセルロース（例えば、Ｅｔｈｏ
ｃｅｌ（登録商標））、および結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））な
どのセルロース誘導体；微晶質デキストロース；アミロース；ケイ酸マグネシウムアルミ
ニウム；多糖酸；ベントナイト；ゼラチン；ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマ
ー；クロスポビドン；ポビドン；デンプン；アルファデンプン；トラガント、デキストリ
ン、スクロース（例えば、Ｄｉｐａｃ（登録商標））、グルコース、デキストロース、糖
蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール（例えば、Ｘｙｌｉｔａｂ（登録商標）
）、およびラクトースなどの糖；アカシア、トラガント、ガッティガム、イサポールハス
クの粘液、ポリビニルピロリドン（例えば、Ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ（登録商標）ＣＬ、Ｋ
ｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＣＬ、Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）ＸＬ－１０）
、カラマツ由来のアラビノガラクタン（arabogalactan）、Ｖｅｅｇｕｍ商標）、ポリエ
チレングリコール、蝋、アルギン酸ナトリウムなどの天然ガムまたは合成ガムを含む。
「担体」または「担体材料」は、医薬中で一般に使用される任意の賦形剤を含み、イブ
ルチニブおよび抗がん剤の化合物など、本明細書で開示される化合物との適合性、ならび
に所望の剤形の放出プロファイル特性に基づき選択されるものとする。例示的な担体材料
は、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢
剤、保湿剤、希釈剤などを含む。「薬学的に適合性の担体材料」は、アカシア、ゼラチン
、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、カルシウム乳酸、マルトデキス
トリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステ
ロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、ダイズレシチン、タウロコー
ル酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム
、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラ
ギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファデンプンなどを含みうるがこれらに
限定されない。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteent
h Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)、Hoover, John E., Remington’s
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975、Liberm
an, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New
York, N.Y., 1980、およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, S
eventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)を参照されたい。
「分散剤」および／または「粘性モジュレーティング剤」は、液体培地または顆粒化法
またブレンド法を介して、薬物の拡散および均質性を制御する材料を含む。一部の実施形
態では、これらの薬剤はまた、コーティングマトリックスまたはエローディングマトリッ
クスの有効性も促進する。例示的な拡散促進剤／分散剤は、例えば、親水性ポリマー、電
解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ＰＥＧ、ポリビ
ニルピロリドン（ＰＶＰ；市販品では、Ｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）として公知である
）、ａｎｄ例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、お
よびＨＰＣ－Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ Ｋ１００
、ＨＰＭＣ Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ Ｋ１５Ｍ、およびＨＰＭＣ Ｋ１００Ｍ）、カルボキシ
メチルセルロースナトリウム（carboxymethylcellulose sodium）、メチルセルロース、
ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭ
ＣＡＳ）、非晶質セルロースなど、炭水化物ベースの分散剤、ケイ酸マグネシウムアルミ
ニウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／
酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、酸化エチレンおよびホルムアルデヒドを伴う、４－
（１，１，３，３－テトラメチルブチル）－フェノールポリマー（チロキサポールとして
もまた公知である）、ポロキサマー（例えば、酸化エチレンと、酸化プロピレンとのブロ
ックコポリマーである、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ６８（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ
Ｆ８８（登録商標）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ１０８（登録商標））；およびポ
ロキサミン（例えば、酸化プロピレンおよび酸化エチレンの、エチレンジアミンへの逐次
的付加から導出される四官能性ブロックコポリマーである、Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ ９０
８（登録商標）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．
）としてもまた公知のＴｅｔｒｏｎｉｃ ９０８（登録商標））、ポリビニルピロリドン
Ｋ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニル
ピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ－６３０）、ポリ
エチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００～約６０００、また
は約３３５０～約４０００、または約７０００～約５４００の分子量を有しうる）、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン
酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キ
サンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポ
リソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン
、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアル
コール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、キトサン、およびこれらの組合せを含む。セルロース
またはトリエチルセルロースなどの可塑化剤もまた、分散剤として使用することができる
。特に、リポソーム分散液中および自己乳化分散液中で有用な分散剤は、ジミリストイル
ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然
ホスファチジルグリセロール、コレステロール、およびイソプロピルミリスチン酸である
。
１または複数のエロージョン促進剤の、１または複数の拡散促進剤との組合せもまた、
本組成物中で使用することができる。
「希釈剤」という用語は、送達の前に、目的の化合物を希釈するのに使用される化合物
を指す。希釈剤はまた、より安定的な環境をもたらしうるため、化合物を安定化させるの
にも使用することができる。当技術分野では、緩衝液中に溶解させた塩（これはまた、ｐ
Ｈの制御または維持ももたらしうる）を、リン酸緩衝生理食塩液溶液を含むがこれらに限
定されない希釈剤として用いる。ある特定の実施形態では、希釈剤は、組成物のバルクを
増大させて、圧縮を容易とするか、またはカプセルの充填のための均質なブレンドに十分
なバルクを創出する。このような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトー
ル、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの結晶セルロース；
二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸
カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；アルファデンプン、Ｄｉ－Ｐａｃ（
登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースベースの
希釈剤、粉砂糖；一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カル
シウム三水和物、デキストレート（dextrate）；加水分解シリアル固形、アミロース；粉
末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；
イノシトール、ベントナイトなどを含む。
「充填剤」は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カル
シウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、セルロース 粉末、デキストロース、デキス
トレート（dextrate）、デキストラン、デンプン、アルファデンプン、スクロース、キシ
リトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレン
グリコールなどの化合物を含む。
「滑沢剤」および「流動促進剤」とは、材料の接着または摩擦を防止、低減、または阻
害する化合物である。例示的な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、滑
石、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱物油などの炭化水素、または水素化ダイズ油（Ｓ
ｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの水素化植物油、高脂肪酸、ならびにアルミニウム、
カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、それらのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属
塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、滑石、蝋、Ｓｔｅａｒｏｗ
ｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、ナトリウム酢酸、塩化ナトリウム、ロ
イシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ－４０００）、またはＣａｒｂｏｗａ
ｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、ナトリウムオレイン酸、安息香酸ナ
トリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムま
たはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）、Ｃａｂ－Ｏ－Ｓｉｌ（登録商標）
などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活
性剤などを含む。
「可塑化剤」とは、マイクロカプセル化材料を軟化させるのに使用される化合物、また
はマイクロカプセル化材料の脆性を低下させるフィルムコーティングである。適切な可塑
化剤は、例えば、ＰＥＧ ３００、ＰＥＧ ４００、ＰＥＧ ６００、ＰＥＧ １４５０
、ＰＥＧ ３３５０、およびＰＥＧ ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン
酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、およびトリアセチンを
含む。一部の実施形態では、可塑化剤はまた、分散剤または保湿剤としても機能しうる。
「可溶化剤」は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸
エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、ビタミンＥ
ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリ
ドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルシクロデキストリン、エタノール、ｎ－ブタノール、イソプロピルアルコール、コレス
テロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００～６００、グリコフロール、トランス
クトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
「安定化剤」は、任意の抗酸化薬剤、緩衝液、酸、保存剤などの化合物を含む。
「懸濁剤」は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビ
ニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３
０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（
例えば、ポリエチレングリコールは、約３００～約６０００、または約３３５０～約４０
００、または約７０００～約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロー
スナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸
酢酸ヒドロキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、
アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどの
ガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナト
リウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリソルベ
ート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラ
ウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドンなどの化合物を含む。
「界面活性剤」は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（docusate）、Ｔ
ｗｅｅｎ ６０またはＴｗｅｅｎ ８０、トリアセチン、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、モノオ
レイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート（
ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）、ポロキサマー、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリン、酸化
エチレンと酸化プロピレンとのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（Ｂ
ＡＳＦ）などの化合物を含む。他の一部の界面活性剤は、ポリオキシエチレングリセリン
脂肪酸エステルおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油；な
らびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、
オクトキシノール１０、オクトキシノール４０を含む。一部の実施形態では、界面活性剤
は、物理的安定性を増強するか、または他の目的で、組み入れることができる。
「粘性増強剤」は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステ
アリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチル
セルロース、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、
およびこれらの組合せを含む。
「保湿剤」は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレイン酸
、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオ
キシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムド
クセート（docusate）、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムド
クセート（doccusate）、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ ８０、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ア
ンモニウム塩などの化合物を含む。
キットおよび組成物
本開示の一態様は、本発明のＭＵＣ１６特異的ＣＡＲおよび任意選択で、安全性のため
、例えばＨＥＲ１ｔもしくはＨＥＲ１ｔ－１およびこれらの機能的変異体、またはＣＤ２
０もしくはＣＤ２０ｔ－１、およびこれらの機能的変異体を含む遺伝子をコードするコー
ド領域を含む、第１のベクターを含む、キットおよび組成物に関する。キットおよび組成
物は、サイトカインをさらに含みうる。別の態様では、キットおよび組成物は、ＲＨＥＯ
ＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチ構成要素を含みうる。これらのキットおよび組
成物は、それぞれ異なるタンパク質またはタンパク質のサブセットをコードする、複数の
ベクターを含みうる。これらのベクターは、ウイルス、非ウイルス、エピソーム、または
組込みでありうる。一部の実施形態では、ベクターは、トランスポゾン、例えばＳｌｅｅ
ｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。
一部の実施形態では、キットおよび組成物は、ベクターだけでなく、細胞および、イン
ターロイキン、サイトカイン、インターロイキンおよび化学療法剤、アジュバント、湿潤
剤、または乳化剤などの薬剤も含む。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。一実施形
態では、キットおよび組成物は、ＩＬ－２を含む。一実施形態では、キットおよび組成物
は、ＩＬ－２１を含む。一実施形態では、キットおよび組成物は、Ｂｃｌ－２、ＳＴＡＴ
３またはＳＴＡＴ５阻害剤を含む。複数の実施形態では、キットは、ＩＬ－１５、または
ｍｂＩＬ－１５を含む。
本明細書の、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、１または複数の方法に
よる使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験
管など、１または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法におい
て使用される個別のエレメントのうち１つを含む容器を受容するように区画化されたキャ
リングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイア
ル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチッ
クなど、様々な材料から形成されている。
本明細書で提示される製品は、パッケージング材料を含有する。医薬パッケージング材
料の例は、ブリスターパック、ボトル、試験管、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択さ
れる製剤と、意図される投与方式および処置方式とに適する、任意のパッケージング材料
を含むがこれらに限定されない。
例えば、容器は、ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、本明細書に記載されるＭＵＣ１６特異的Ｃ
ＡＲ－Ｔ細胞）と、任意選択で、加えて、本明細書で開示されるサイトカインおよび／ま
たは化学療法剤とを含む。このようなキットは、任意選択で、本明細書で記載される方法
におけるその使用に関する記載または表示または指示書の内容確認を含む。
キットは、典型的に、内容物を列挙する表示、および／または使用のための指示書、な
らびに使用のための指示書を伴う添付文書を含む。典型的に、指示書のセットもまた、組
み入れられると予想される。
一部の実施形態では、表示は、容器上に貼付されているか、または容器に付随する。一
実施形態では、表示を形成する文字、数、または他の記号が、容器自体へと接着されてい
るか、鋳造されているか、またはエッチングされている場合、表示は容器上に貼付されて
おり、表示はまた、容器を保持する、レセプタクルまたはキャリングケース内に、例えば
、パッケージ添付文書として存在する場合、容器に付随する。一実施形態では、表示は、
内容物が、具体的な治療適用に使用されるものであることを指し示すのに使用される。表
示はまた、内容物の、本明細書で記載される方法などにおける使用のための指示も指し示
す。
これらの例は、例示的な目的だけで提示されるものであり、本明細書で提示される特許
請求の範囲を限定しようとするものではない。
[実施例１]
Ｔ細胞への、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ系のヌクレオフェクション
遺伝子改変Ｔ細胞を作るため、凍結保存された汎Ｔ細胞を融解させ、洗浄し、あらかじ
め温めた、ＦＢＳおよびＧｌｕｔａｍａｘを補充したフェノールレッドフリーＲＰＭＩ
１６４０培地（Ｒ２０培地）で再懸濁し、３７℃で５％ＣＯ２の加湿したインキュベータ
ー内に置いた。細胞をカウントし、遠心分離し、ヌクレオフェクション緩衝液中に再懸濁
した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を作るため、特定の数のＴ細胞（典型的には、キュベット当たり５
～４０×１０６個の範囲）反応を含有する各ヌクレオフェクションキュベット用に、ＣＡ
Ｒ構築物を含む合計で１５μｇのトランスポゾンプラスミドを、ＳＢトランスポザーゼを
コードする５μｇのプラスミドと組み合わせた。Ｔ細胞の電気穿孔法は、Ａｍｅｘａ ２
ｂヌクレオフェクション装置または４Ｄヌクレオフェクター（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒ
ｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して達せられた。電気穿孔法後、各キュベットからの内容物
は、あらかじめ温めたＲ２０培地に移し、３７℃のインキュベーター内に置いた。各Ｔ細
胞培養の試料は、フローサイトメトリー解析のために採取し、特定の時点で適用可能なＣ
ＡＲ、ＨＥＲ１ｔ、およびｍｂＩＬ－１５の発現を特徴づけた。ある特定の実験のため、
ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、さらに特徴づけるために、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、数的に拡大増殖
させた。作出されたＣＡＲ＋Ｔ細胞の、ｅｘ ｖｉｖｏにおける、数的な拡大のため、Ｔ
細胞を、さらに、ＡａＰＣ（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ
ｃｅｌｌ）と共に共培養させた。略述すると、トランケート型ＭＵＣ１６（ＭＵＣ１６ｔ
）抗原と一緒にＣＤ８６、４１ＢＢＬ、ｍｂＩＬ１５を発現するように操作されたＫ５６
２細胞系由来の照射されたＡａＰＣを、続く毎週のＡａＰＣ添加のため、ＩＬ－２１およ
びＩＬ－２を伴う完全培地中でＣＡＲ＋Ｔ細胞と共に共培養させた。
ＣＡＲ、ＨＥＲ１ｔ１、およびｍｂＩＬ１５の発現のフローサイトメトリー解析を、電
気穿孔法後１日目、およびそれぞれ、ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲ
ート組換えＭＵＣ１６ｔ－Ｆｃ融合タンパク質またはＡＦ６４７で標識したＰｒｏｔｅｉ
ｎ－Ｌ、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートセツキシマブおよび蛍光イソチオシア
ネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ＩＬ－１５および抗ＩＬ－１５ＲＡ抗体を使用する
、各ＡａＰＣ刺激の前に、実施した。
[実施例２]
ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の作出
ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、実施例１に記載されるＳＢ系プ
ラスミドの電気穿孔法により作出した。ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞
は、ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔ１をコードするＳＢトランスポゾンプラス
ミド、ならびにＳＢ１１トランスポザーゼプラスミドの、ヒトＴ細胞への電気穿孔法によ
り作出した。ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は、（１）
ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ１５、およびＨＥＲ１ｔ１をコードするＳＢトランス
ポゾンプラスミド、ならびに（２）ＳＢ１１トランスポザーゼプラスミドの、ヒトＴ細胞
への電気穿孔法により作出した。ＣＡＲ、ｍｂＩＬ１５、およびＨＥＲ１ｔ１の発現は、
ヌクレオフェクション後１日目において、マルチパラメーターのフローサイトメトリーを
使用して定量した。
表４は、ヌクレオフェクション後１日目において、ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲおよびＨＥ
Ｒ１ｔ１遺伝子（ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞）またはＭＵＣ１６－
２ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ１５およびＨＥＲ１ｔ１（ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５
－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞）を発現するトランスポゾンを使用する、ＳＢ系プラスミドのヌ
クレオフェクション後の異なるドナーＴ細胞において、トランス遺伝子を発現する細胞の
％により測定された、トランスフェクション効率を示す。細胞は、ＣＤ３＋生集団につい
て、ゲートをかけられた。
ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、実施例１に示されるＳＢ系プラ
スミドの電気穿孔法により作出した。ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は
、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔ１をコードするＳＢトランスポゾンプラスミ
ド、ならびにＳＢ１１トランスポザーゼプラスミドの、ヒトＴ細胞への電気穿孔法により
作出した。ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は、ＭＵＣ１
６－３ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ１５、およびＨＥＲ１ｔ１をコードするＳＢトランスポゾンプ
ラスミド、ならびにＳＢ１１トランスポザーゼプラスミドの、ヒトＴ細胞への電気穿孔法
により作出した。ＣＡＲ、ｍｂＩＬ１５、およびＨＥＲ１ｔ１の発現は、ヌクレオフェク
ション後１日目において、マルチパラメーターのフローサイトメトリーを使用して定量し
た。
図４において明らかなように、ＭＵＣ１６－３ ＨＥＲ１ｔ１またはＭＵＣ１６－３－
ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１プラスミドのいずれかによりヌクレオフェクトしたＴ細胞は
、ヌクレオフェクション後、終夜インキュベーションした後のＨＥＲ１ｔ１発現により確
かめられたようにトランス遺伝子を発現する。各ドナーからの個々のデータポイントを、
図５に示す。
[実施例３]
異なるスペーサー長を有するＭＵＣ１６ ＣＡＲ
ＣＤ８アルファヒンジ領域由来の異なるスペーサー長のＭＵＣ１６ ＣＡＲを発現する
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、実施例１に記載されるように、健常なドナーのＴ細胞（ドナー番号Ｄ
１３３０９８）において、ＳＢ系プラスミドの電気穿孔法により作出した。ＣＡＲ－Ｔ細
胞は、実施例１に記載されるように、週に１回の刺激により、ＭＵＣ１６ｔを発現するＡ
ａＰＣと共培養することにより、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、数的に拡大増殖させた。ＣＡ
Ｒの発現は、ヌクレオフェクション後１日目および８日目において、マルチパラメーター
のフローサイトメトリーにより測定した。評価したＣＡＲ－Ｔ試験物を表６に列挙する。
図５は、異なるＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＭＵＣ１６ ＣＡＲ発現のフローサイトメ
トリーデータを示す。細胞は、ＣＤ３＋生細胞についてゲートをかけられた。図５に示す
ように、遺伝子導入後１日目におけるＭＵＣ１６ ＣＡＲ発現の程度の変動は、ＣＡＲ分
子の構築のために利用されるＭＵＣ１６ｓｃＦｖおよびスペーサーに依存して、観察され
た。ＣＡＲ＋Ｔ細胞の濃縮は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＡＲ＋Ｔ細胞のＭＵＣ１６ｔ
＋ＡａＰＣ株との共培養時に観察された。ドナー番号Ｄ１３３０９８由来のＭＵＣ１６
ＣＡＲ－Ｔ細胞については、ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲのＣＤ８ａ（３×）スペーサーを使
用する、およびＭＵＣ１６－７ ＣＡＲのＣＤ８ａ（２×）スペーサーを使用する、電気
穿孔法後１日目～８日目に、ＣＡＲ＋Ｔ細胞のより強い濃縮が観察された。
ＣＤ８アルファヒンジ領域由来の異なるスペーサーを有するＭＵＣ１６－３ ＣＡＲを
発現する、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１およびＭＵＣ１６－３－ｍｂＩＬ１５
－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は、健常なドナーのＴ細胞（ドナー番号Ｄ１３２５５２）におい
てＳＢ系プラスミドの電気穿孔法により作出した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、先に記載されたよ
うに、週に１回の刺激により、ＭＵＣ１６ｔを発現するＡａＰＣと共培養することにより
、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、数的に拡大増殖させた。ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲの発現は、
ヌクレオフェクション後１日目および８日目においてマルチパラメーターのフローサイト
メトリーを使用する、ＭＵＣ１６－Ｆｃタンパク質染色により測定した。評価されたＣＡ
Ｒ－Ｔ構築物を、表７に列挙する。図６は、異なるＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＭ
ＵＣ１６－３ ＣＡＲ発現のフローサイトメトリーデータを示す。図６に示されるように
、遺伝子導入後１日目におけるＭＵＣ１６ ＣＡＲ発現の程度の変動は、ＣＡＲ分子の構
築のために利用されるスペーサーに依存して、観察された。遺伝子導入後８日目における
ＣＡＲ＋Ｔ細胞の濃縮の程度の変動は、ＣＡＲ分子の構築のために利用されるスペーサー
に依存して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＡＲ＋Ｔ細胞のＭＵＣ１６ｔ＋ＡａＰＣ株と
の共培養時に観察された。
[実施例４]
ウェスタンブロット
プロテアーゼ阻害剤を含有する放射性免疫沈降アッセイにおいて細胞ペレットを再懸濁
することにより、Ｔ細胞溶解物を作出した。精製した溶解物を、細胞抽出物から分離し、
凍結保存した。総タンパク質濃度を決定するため、また試料間のノーマライゼーションの
ために、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを実施した。１０μｇのタンパク質試料の全
てを、還元状態下での電気穿孔法によって解析した。ゲルからのタンパク質材料を、フッ
化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜へと転写した。タンパク質が転写された膜は、ブロッキ
ングされ、次いでロッカープレート上で、一次抗体、マウス抗ヒトＣＤ３ζ、または抗Ｉ
Ｌ－１５抗体と、インキュベートされた。膜は、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）標識二次抗体の添加の前に洗浄した。ブロットは、化学発光（ＥＣＬ）検出を使用
して調製した。ウェスタンブロットの画像を、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ（商標）Ｅ Ｉｍａｇ
ｅｒシステム上で捕捉した。
ＨＥＲ１ｔ１の検出のため、ウェスタンブロットの前に免疫沈降法を実施した。Ａ４３
１細胞溶解物（陽性対照）および免疫沈降対照（細胞溶解物無しでの免疫沈降法；陰性対
照）を含む、さらなる対照を解析した。ゲルからのタンパク質材料を、ＰＶＤＦ膜へと転
写した。タンパク質が転写された膜は、ブロッキングされ、次いで、一次抗体、マウス抗
ヒトＥＧＦＲ抗体と、インキュベートされた。膜は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）標識ヤギ抗マウス抗体の添加の前に洗浄した。ウェスタンブロットの画像を、Ｆｌｕ
ｏｒＣｈｅｍ（商標）Ｅ Ｉｍａｇｅｒ上で捕捉した。
図７～９は、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞およびＭＵＣ１６－３
ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞溶解物を使用するウェスタンブロットの画
像を示す。図７に示されるように、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲのバンドは、ＭＵＣ１６－３
ＣＡＲ ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞とＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ
１ Ｔ細胞溶解物の両方で検出された。低分子量の天然ＣＤ３ζのバンドもまた、ＣＡＲ
－Ｔ細胞溶解物から、予測される通りに検出された。図８に示されるように、ｍｂＩＬ１
５タンパク質発現は、ｍｂＩＬ１５を共発現する、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１
５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞からの溶解物においてのみ検出された（図８）。図９は、ＭＵ
Ｃ１６－３ ＣＡＲ ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞およびＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１
５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞における、およそ４０ｋＤａの予測される分子量の、ＨＥＲ１
ｔ１の発現を示す。要約すると、これらのデータは、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ１５
、およびＨＥＲ１ｔを発現するＴ細胞が、ＳＢ系を使用して作出されうることを実証する
。
[実施例５]
ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性
Ｔ細胞の細胞傷害活性は、発光細胞生存率アッセイを使用して決定した。ＭＵＣ１６－
３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１細胞の特異的細胞傷害性は、上記に記載された
ように作出されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用して評価した。ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩ
Ｌ１５－ＨＥＲ１ｔ１、対照ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞、および非
ＭＵＣ１６対照ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ、
ＨＥＲ１ｔ１、およびｍｂＩＬ－１５の発現を評価した。エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞は
、ＨＥＲ１ｔ１の発現によって同定された。異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は、
卵巣細胞株、ＭＵＣ１６ｔを異所発現するＳＫＶＯ３（ＳＫＶＯ３－ＭＵＣ１６ｔ）、Ｍ
ＵＣ１６を発現しないＳＫＶＯ３親株、ＭＵＣ１６を自然発現するＯＶＣＡＲ３、および
ＭＵＣ１６陰性細胞株であるＡ５４９で評価した。細胞培養からの上澄みは、サイトカイ
ン解析まで－８０℃で保存した。細胞傷害性のパーセントは、以下の式を使用して決定し
た：
ＭＵＣ１６発現腫瘍標的に対する、３人の健常なドナーのＴ細胞から作出されたＭＵＣ
１６－３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的細胞傷害性は、変動させたＥ：Ｔ比で、様々な腫瘍細
胞株の細胞傷害活性を比較することにより実証した。対照のＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ
細胞は、陰性対照として使用した。図１０Ａは、ＭＵＣ１６ｔがＳＫＯＶ３－ＭＵＣ１６
ｔ腫瘍細胞によってのみ発現されることを示す。エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞（ＨＥＲ１
ｔ１細胞発現をベースにノーマライズした）は、変動させたＥ：Ｔ比で、標的腫瘍細胞と
共に共培養した。図１０Ｂに示すように、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細
胞（ｍｂＩＬ１５を欠く）とＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１の両
方は、ＳＫＯＶ３－ＭＵＣ１６ｔおよびＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞株に対する類似の用量依存
的細胞傷害性を実証した。しかし、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ
１のみが、高いＥ：Ｔ比で、ＯＶＣＡＲ３を死滅させた。ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂ
ＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１によるＯＶＣＡＲ３細胞の選択的死滅は、改変Ｔ細胞においてＴ
細胞の活性化が増強されたことを示す。標識した標的細胞単独の培養からは、バックグラ
ウンドシグナルは検出されなかった。さらに、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＵ
Ｃ１６ｔｎｅｇ腫瘍細胞株（ＳＫＯＶ３およびＡ５４９）を死滅させず、対照ＣＡＲ－ｍ
ｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ Ｔ細胞では、いずれの腫瘍細胞株の死滅も観察されなかった。
まとめると、これらの結果は、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１が
、ＭＵＣ１６発現腫瘍細胞株の死滅を特異的に媒介することを実証する。
[実施例６]
ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン産生
実施例５の細胞傷害性アッセイからの培養上清は、ＩＦＮγおよびＧｒａｎｚｙｍｅＢ
を含む、サイトカイン産生のため、慣例のマルチ分析キットを使用して、スクリーニング
した。
ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞（ｍｂＩＬ１５を欠く）およびＭＵＣ
１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞のＭＵＣ１６発現腫瘍細胞に向
けてリダイレクトした特異性は、ＭＵＣ１６－非発現およびＭＵＣ１６－発現腫瘍細胞株
との共培養時に、サイトカイン分泌を調べることによってさらに研究された。これらの研
究では、３人の異なるドナーからのＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ
１ Ｔ細胞によるサイトカイン産生を、腫瘍細胞株との共培養後、１：１のＥ：Ｔ細胞比
で評価した。図１１に示すように、炎症促進性サイトカインのレベルの上昇は、ＭＵＣ１
６ｔを発現する腫瘍細胞株によってのみ観察された。さらに、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－
ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ ＴにおけるｍｂＩＬ１５の発現は、ｍｂＩＬ１５を持たな
いＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞の試験後に観察されたレベルと比較し
て低いサイトカイン産生をもたらした。これらのデータは、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍ
ｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞が、ＭＵＣ１６発現腫瘍細胞に対して特異的な細胞傷
害機能を示すことを実証し、ｍｂＩＬ１５の共発現が、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩ
Ｌ１５－ＨＥＲ１ｔ１の細胞傷害作用を損なうことなく、炎症促進性サイトカインの産生
を減少しうることを示した。
[実施例７]
ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性
Ｔ細胞の細胞傷害活性は、ルシフェラーゼアッセイを使用して決定した。対照ＣＡＲ－
Ｔ細胞と共に、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞（表８）は、実施例１に記載されるように、
２人の健常なドナーのＴ細胞（Ｄ３２６７８２およびＤ１３２５５２）への、ＳＢ系プラ
スミドの電気穿孔法によって作出し、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ＡａＰＣとの共培養によ
り数的に拡大増殖させた。細胞傷害性は、３連のウェルで、標的細胞として、ＳＫＯＶ３
－ＭＵＣ１６ｔ、ＯＶＣＡＲ３、およびＭＵＣ１６ｎｅｇＡ５４９細胞株を使用して、異
なるＥ：Ｔ比で評価した。細胞傷害性のパーセントは、上記に記載した式を使用して決定
した。
図１２に示すように、ｍｂＩＬ１５およびＨＥＲ１ｔ１を共発現するＭＵＣ１６ ＣＡ
Ｒ－Ｔ細胞は、濃度依存的な方法で、ＭＵＣ１６＋腫瘍細胞株の特異的細胞傷害性を示し
た。試験したＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれも、ＭＵＣ１６ｎｅｇ腫瘍細胞株であ
るＡ５４９の顕著な細胞傷害性を示さなかった。ＣＤ８ａ（２×）スペーサーを持つＭＵ
Ｃ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１細胞は、健常なドナーのＴ細胞から作
出されたＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ８ａスペーサーと比較して高い、ＭＵＣ１６＋腫瘍
細胞株の特異的細胞傷害性を示した。
[実施例８]
ｍｂＩＬ１５を発現するＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の自己増殖の存続および欠如
ＣＡＲ－Ｔ細胞の存続へのｍｂＩＬ１５の影響を評価するため、ＭＵＣ１６－３ ＣＡ
Ｒ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞およびＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１
Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔで標識し、自己ＰＢＭＣと共に共培
養した。共培養は、１４日間維持した。細胞培養中、細胞試料は、生存率を測定するため
に評価し、ＣＡＲ Ｔ細胞およびメモリー表現型のアセスメントのためのフローサイトメ
トリーのために染色した。増殖は、色素の希釈によって決定した。
細胞存続アセスメントは、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ（ｍｂＩＬ１５を欠く
）が２週間後培養中に存続せず、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１
Ｔ細胞のみが１４日目にサイトカインを欠損する培養中で検出されることを示した（図
１３Ａ）。これは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の存続の改善におけるｍｂＩＬ１５の役割を実証する
。自己増殖の潜在的可能性のアセスメントは、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－
ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞が１４日目に検出されるが、娘細胞の不在により実証されるように
、それらが増殖に失敗することを示した（図１３Ｂ）。さらに、１４日目には、存続ＭＵ
Ｃ１６－３ ＣＡＲｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は、－１日目と比較して高いレ
ベルの、ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ４５ＲＯ＋細胞により決定されるように、メモリー様また
は静止状態様Ｔ細胞集団の濃縮を示した（図１３Ｃ）。
ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞（ｍｂＩＬ１５発現を欠く）およびＭ
ＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は、３人の健常なドナーの
Ｔ細胞への、ＳＢ系プラスミドの電気穿孔法により作出した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、毎週、
ＡａＰＣによる刺激により、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、数的に拡大増殖させた。ＣＡＲ－
Ｔ細胞は、２週間外因性サイトカインを含まない培地中で培養した。開始細胞数の画分と
して、培養中の生存細胞を算出し、存続を示した。
図１４に示すように、ｍｂＩＬ１５を発現する、ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１
５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は、サイトカインの除去後、１５日目に、ｅｘ ｖｉｖｏの培
養において、維持することができたが、ｍｂＩＬ１５発現を欠損する、ＭＵＣ１６－２
ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は、サイトカインの非存在下では、７日を超えては生存し
なかった。
これらのデータは、ｍｂＩＬ１５がＣＡＲと共発現する場合、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ Ｔ
細胞の存続の改善を示す。
[実施例９]
ＡＤＣＣアッセイ
自己ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、ＡＤＣＣアッセイのエフェクター細胞として使
用した。ｅｘ ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させたＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５
－ＨＥＲ１ｔ１細胞を、このアッセイの標的細胞として使用した。エフェクター細胞と標
的細胞の共培養は、１０μｇ／ｍＬのセツキシマブもしくはリツキシマブの存在下または
抗体無しで、１０：１のＥ：Ｔ比に設定した。生存率は、共培養後に、フローサイトメト
リーを使用して評価した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞の、ＡＤＣＣ％を決定するため、標識したＣＤ
３＋細胞の画分の欠如を、最初のＣＡＲ＋Ｔ細胞集団との比較により決定した。
図１５は、３人の異なる健常なドナーのＴ細胞から作出したＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－
ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は、セツキシマブを培養に添加した場合、ＡＤＣＣ
を介して効率的に除去されたことを実証する。抗ＣＤ２０リツキシマブ（非特異的対照）
の培養への添加は、ＣＡＲ－Ｔ細胞のセツキシマブ媒介ＡＤＣＣの特異性を証明する、細
胞傷害性の低いバックグラウンドレベルを示した。示したデータは、平均＋／－ＳＥＭで
ある。
[実施例１０]
卵巣がんのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的評
価
ＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６を、ＮＳＧマウスへとＩＰ投与した（０日目）。６
日目に、ＩＶＩＳイメージングにより確認した定着腫瘍量を有するマウスをランダム化し
（群当たりｎ＝５～７匹のマウス）、生理食塩水（ＨＢＳＳ）、ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ
－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞（マウス当たり２×１０６個の細胞）、ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ
－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞（マウス当たり２×１０６個の細胞）のいずれか
を単回ＩＰ注射、またはＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞
（マウス当たり２×１０６個の細胞）を単回ＩＶ注射した。腫瘍増殖に対する有効性は、
腫瘍量を評価するため、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与後、３～４日ごとに実施したｉｎ ｖｉｖｏ
生物発光（ＩＶＩＳ）イメージングにより評価した。一般的安全性は、ＣＡＲ Ｔ細胞投
与後、１週間当たり最少２～３回で、研究を通して実施された、体重および臨床観察のア
セスメントにより評価した。
図１６に示すように、ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の単回ＩＰまたはＩＶ注射は、
マウスのＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６腫瘍の除去に有効であった。バイアルＩＶ注
射を注射したＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍応答は、ＩＰ輸注と比較して、遅延した。
[実施例１１]
卵巣がんのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的評価
ＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６ｔ腫瘍細胞を、０日目にＮＳＧマウスへとＩＰ投与
した。５日目に、定着腫瘍量を有するマウス（ＩＶＩＳイメージングにより確認した）を
ランダム化し（群当たりｎ＝５～７匹のマウス）、生理食塩水（ＨＢＳＳ）、ＭＵＣ１６
－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞（マウス当たり２×１０６個の細胞）、またはＭＵ
Ｃ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞（マウス当たり２×１０６個
の細胞）のいずれかを単回ＩＰ注射した。腫瘍増殖に対する有効性は、腫瘍量を評価する
ため、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与後、３～４日ごとに実施したｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（ＩＶＩ
Ｓ）イメージングにより評価した。ＥＤＴＡ中の全血試料を１週間当たり１回採血し、異
なるＴ細胞サブセットのＭＵＣ１６ ＣＡＲ Ｔ細胞存続、拡大増殖、および定量の評価
のため、マルチパラメーターのフローサイトメトリーにかけた。血漿試料を、Ｔ細胞活性
の指標として、ヒトサイトカインを解析した。一般的安全性は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与後、
１週間当たり最少２～３回で、研究を通して実施された、体重および臨床観察のアセスメ
ントにより評価した。
図１７に示すように、ＭＵＣ１６を発現するＳＫＯＶ３腫瘍を担持するＮＳＧマウスへ
のＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞のＩＰ投与は、生理食
塩水対照処置群と比較した場合、腫瘍量の顕著な減少をもたらした（＞３ ｌｏｇの全流
束値の減少）。ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞における
、ｍｂＩＬ１５の共発現は、ｍｂＩＬ１５の発現を欠損するＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－Ｈ
ＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞と比較して著しく大きな、腫瘍量の減少と関連した。
ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は、ＭＵＣ１６－３
ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞と比較して増加した、血液中のＨＥＲ１ｔ
１を発現するＴ細胞の数により実証されたようにｉｎ ｖｉｖｏにおける存続および拡大
増殖の増強を示した。さらに、ＣＤ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方
が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて拡大増殖および存続を示した。図１８Ａ～Ｂを参照されたい
。
[実施例１２]
卵巣がんのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の用量応答
ＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６を、０日目に、ＮＳＧマウスへとＩＰ投与した。６
日目に、定着腫瘍量を有するマウス（ＩＶＩＳイメージングにより確認した）をランダム
化し（群当たりｎ＝５匹のマウス）、生理食塩水（ＨＢＳＳ）、３つの異なる用量のＭＵ
Ｃ１６－２ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞（マウス当たり１×１０５、
５×１０５、または１×１０６個の細胞）、およびＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１
５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞（マウス当たり１×１０５、５×１０５、または１×１０６個
の細胞）または単一の用量のＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞（マウス当
たり１×１０６個の細胞）のいずれかを単回ＩＰ注射した。ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ｍ
ｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞、ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞、
およびＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は全て、１人のド
ナー由来であり、２日以内に製造された。腫瘍増殖に対する有効性は、腫瘍量を評価する
ため、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与後、３～４日ごとに実施したｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（ＩＶＩ
Ｓ）イメージングにより評価した。
図１９～２０に示すように、ＭＵＣ１６－２ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１
Ｔ細胞とＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞の両方は、マウ
スにおいてＳＫＯＶ３－ｆＬＵＣ－ＭＵＣ１６腫瘍細胞のＣＡＲ－Ｔ用量依存的除去を示
した。ＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞は、１×１０６個
のＣＡＲ－Ｔ細胞／マウスの用量の、ｍｂＩＬ１５を欠損するＭＵＣ１６－３ ＣＡＲ－
ＨＥＲ１ｔ１ Ｔ細胞と比較して、マウス当たり１×１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞の用量で
、強い抗腫瘍応答を示した。
[実施例１３]
抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体の結合親和性
様々な抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ３
０００を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにより評価した。抗ＭＵＣ１６
ｍＡｂは、それぞれの軽鎖および重鎖プラスミドのＨＥＫ２９３細胞への一過性トランス
フェクションを介して作出した。抗－ＭＵＣ１６ ｍＡｂの可変領域を、マウス定常鎖領
域へと融合させ、キメラマウスＩｇＧ１ ｍＡｂを作出した。ヒトＦｃ領域へと融合させ
たトランケート型ＭＵＣ１６を、センサーチップＣＭ５上に固定した。異なる濃度のｍＡ
ｂを溶液相で注射し、データをＢＩＡ評価を使用して解析し、ｍＡｂのＫＤを算出した。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての技術用語お
よび科学用語および任意の頭字語は、本発明の技術分野の当業者により一般に理解される
意味と同じ意味を有する。
本明細書では、本開示の好ましい実施形態を示し、それらについて記載してきたが、当
業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提示されていることが明らかであ
ろう。今や、本開示から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および
代用に想到するであろう。本明細書で記載される実施形態、またはこれらの実施形態、も
しくはその中で記載される態様のうちの１または複数の組合せに対する、多様な代替物を
、本開示の実施において利用しうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開
示の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造
、ならびにそれらの均等物は、その対象となることが意図される。
配列
表１１では、本明細書で提供される実施形態に含まれる特定の配列の代表的なリストを
提示する。
本明細書では、本開示の好ましい実施形態を示し、それらについて記載してきたが、当業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提示されていることが明らかであろう。今や、本開示から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到するであろう。本明細書で記載される実施形態、またはこれらの実施形態、もしくはその中で記載される態様のうちの１または複数の組合せに対する、多様な代替物を、本開示の実施において利用しうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造、ならびにそれらの均等物は、その対象となることが意図される。

本発明は、以下の態様を含み得る。
［１］
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、前記ＣＡＲが、
（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；
（ｂ）ストークドメイン；
（ｃ）膜貫通ドメイン；
（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および、
（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
を含む、単離核酸。
［２］
前記ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインが、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１２、および１４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１１、１３、および１５に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド；および
（ｃ）配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の単離核酸。
［３］
前記ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインが、配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドである、請求項１または２に記載の単離核酸。
［４］
前記ストークドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドである、請求項１または２に記載の単離核酸。
［５］
前記共刺激シグナル伝達ドメインが４－１ＢＢを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離核酸。
［６］
前記４－１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項５に記載の単離核酸。
［７］
前記共刺激シグナル伝達ドメインがＣＤ２８を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離核酸。
［８］
前記ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項７に記載の単離核酸。
［９］
前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離核酸。
［１０］
トランケート型表皮増殖因子受容体をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離核酸。
［１１］
前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、ＨＥＲ１ｔであり、配列番号６５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１０に記載の単離核酸。
［１２］
前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、ＨＥＲ１ｔ－１であり、配列番号６６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１０に記載の単離核酸。
［１３］
前記ＣＡＲが、配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離核酸。
［１４］
骨格ならびに
（１）ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ－１、またはこれらの機能的な変異体のうちの少なくとも１つを含むトランケート型表皮増殖因子受容体；
（２）サイトカイン；および
（３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
をコードする核酸配列を含むベクターであって、前記ＣＡＲが、
（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；
（ｂ）ストークドメイン；
（ｃ）膜貫通ドメイン；
（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および
（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
を含む、ベクター。
［１５］
前記サイトカインが、ＩＬ－１５またはＩＬ－１２である、請求項１４に記載のベクター。
［１６］
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項１４または１５に記載のベクター。
［１７］
前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、配列番号６５または配列番号６６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１４に記載のベクター。
［１８］
前記ＩＬ－１５が、膜結合ＩＬ－１５である、請求項１５に記載のベクター。
［１９］
膜結合ＩＬ－１５が、配列番号１６１をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載のベクター。
［２０］
自己切断型トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１４から１９のいずれか一項に記載のベクター。
［２１］
前記骨格が、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンＤＮＡプラスミドまたはｐＦＵＧＷである、請求項１４から２０のいずれか一項に記載のベクター。
［２２］
プロモーターをさらに含む、請求項１４から２１のいずれか一項に記載のベクター。
［２３］
前記プロモーターが、ｈＥＦ１ａ１である、請求項２２に記載のベクター。
［２４］
前記ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインが、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１２、および１４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１１、１３、および１５に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド；および
（ｃ）配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４から２３のいずれか一項に記載のベクター。
［２５］
前記ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインが、配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドである、請求項１４から２４のいずれか一項に記載のベクター。
［２６］
前記ストークドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１４から２５のいずれか一項に記載のベクター。
［２７］
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢを含む、請求項１４から２６のいずれか一項に記載のベクター。
［２８］
前記４－１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２７に記載のベクター。
［２９］
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８を含む、請求項１４から２６のいずれか一項に記載のベクター。
［３０］
前記ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載のベクター。
［３１］
前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１４から３０のいずれか一項に記載のベクター。
［３２］
プラスミドを含む、請求項１４から３１のいずれか一項に記載のベクター。
［３３］
各前記ベクターが発現プラスミドを含む、請求項１４から３１に記載のベクター。
［３４］
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項１６に記載のベクター。
［３５］
請求項１から１３のいずれか一項に記載のヌクレオチドを含む、免疫エフェクター細胞。
［３６］
（１）細胞タグ（２）ＩＬ－１５および（３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫エフェクター細胞であって、前記ＣＡＲが、（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、免疫エフェクター細胞。
［３７］
前記ＩＬ－１５が、膜結合ＩＬ－１５である、請求項３６に記載の免疫エフェクター細胞。
［３８］
前記膜結合ＩＬ－１５が、配列番号１６１のポリペプチド配列を含む、請求項３６に記載の免疫エフェクター細胞。
［３９］
前記細胞タグが、ＨＥＲ１ｔを含み、前記ＨＥＲ１ｔが、配列番号６５のポリペプチド配列を含む、請求項３６に記載の免疫エフェクター細胞。
［４０］
前記細胞タグが、ＨＥＲ１ｔ－１を含み、前記ＨＥＲ１ｔ－１が、配列番号６６のポリペプチド配列を含む、請求項３６に記載の免疫エフェクター細胞。
［４１］
請求項１４から３４のいずれか一項に記載のベクターを含む免疫エフェクター細胞。
［４２］
Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、または調節性Ｔ細胞である、請求項３５から４１のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
［４３］
前記ＣＡＲが、配列番号２７～５７のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項３６に記載の免疫エフェクター細胞。
［４４］
それを必要とするヒト対象において標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された有効量の細胞をヒト対象に投与するステップを含み、前記ＣＡＲが、
（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；
（ｂ）ストークドメイン；
（ｃ）膜貫通ドメイン；
（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；
（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン；および
（ｆ）トランケート型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔ）
を含む、方法。
［４５］
前記ヒトが、卵巣がんおよび乳がんのうちの少なくとも１つを伴うと診断されている、請求項４４に記載の方法。
［４６］
前記卵巣がんまたは乳がんが、再発性または不応性の卵巣がんまたは乳がんである、請求項４５に記載の方法。
［４７］
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、前記ＣＡＲが、
（ａ）配列番号１～１５または２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを伴うＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を伴うストークドメイン；
（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を伴うＣＤ２８を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；
（ｄ）配列番号６５のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔおよび配列番号６６のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔ－１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ；および
（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を伴うＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
を含む、単離核酸。
［４８］
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、前記ＣＡＲが、
（ａ）配列番号１～１５または２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを伴うＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を伴うストークドメイン；
（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を伴う４－１ＢＢを含む共刺激シグナル伝達ドメイン；
（ｄ）配列番号６５のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔおよび配列番号６６のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔ－１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ；および
（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を伴うＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
を含む、単離核酸。
［４９］
請求項４７または４８に記載の１または複数のポリヌクレオチドのいずれかを含む、ベクター。
［５０］
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項４９に記載のベクター。
［５１］
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項５０に記載のベクター。
［５２］
複数のベクターである、請求項５１に記載のベクター。
［５３］
免疫エフェクター細胞においてＣＡＲを発現するための系であって、請求項１から１３および４７から４８のいずれか一項で提示される単離核酸をコードする１または複数のベクターを含む系。
［５４］
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項５３に記載の系。
［５５］
少なくとも１つのさらなる遺伝子をコードする核酸をさらに含む、請求項５３または５４に記載の系。
［５６］
前記さらなる遺伝子が、サイトカインを含む、請求項５５に記載の系。
［５７］
前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ならびにＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαの融合体のうちの少なくとも１つを含む、請求項５６に記載の系。
［５８］
前記サイトカインが、分泌形態にある、請求項５６に記載の系。
［５９］
前記サイトカインが、膜結合形態にある、請求項５６に記載の系。
［６０］
１つのベクターを含む、請求項５３から５９のいずれか一項に記載の系。
［６１］
前記１または複数のベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項５３から６０のいずれか一項に記載の系。
［６２］
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項６１に記載の系。
［６３］
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む、請求項６２に記載の系。
［６４］
前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼが、ＳＢ１１、ＳＢ１００Ｘ、またはＳＢ１１０である、請求項６３に記載の系。
［６５］
前記免疫エフェクター細胞が、哺乳動物細胞である、請求項５３から６４のいずれか一項に記載の系。
［６６］
免疫エフェクター細胞においてＣＡＲを発現する方法であって、前記免疫エフェクター細胞を請求項５３から６５のいずれか一項に記載の系と接触させるステップを含む方法。
［６７］
操作Ｔ細胞の増殖および／または生存を刺激する方法であって、
（ａ）細胞の試料を、対象から得るステップであって、前記試料がＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を含む、ステップ；
（ｂ）細胞に、請求項１から１３および４４から４５のいずれか一項で提示される単離核酸をコードする１または複数のベクター、ならびにトランスポザーゼをコードするベクターをトランスフェクトし、操作ＭＵＣ１６ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団をもたらすステップ；
（ｃ）および、任意選択で、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を２日間またはそれ以下の間、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて培養するステップ
を含む方法。
［６８］
細胞に、サイトカインをコードするベクターをトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
［６９］
前記サイトカインが、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαを含む融合タンパク質である、請求項６８に記載の方法。
［７０］
前記１または複数のベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項６７から６９のいずれか一項に記載の方法。
［７１］
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項７０に記載の方法。
［７２］
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
［７３］
前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼが、ＳＢ１１、ＳＢ１００ＸまたはＳＢ１１０である、請求項７２に記載の方法。
［７４］
それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、有効量の操作Ｔ細胞の１または複数の用量を前記対象に投与するステップを含み、前記操作Ｔ細胞がＭＵＣ１６ ＣＡＲおよび膜結合ＩＬ－１５を含む、方法。
［７５］
有効量の操作Ｔ細胞の第１の用量が、腹腔内に投与される、請求項７４に記載の方法。
［７６］
有効量の操作Ｔ細胞の第２の用量が、静脈内に投与される、請求項７５に記載の方法。
［７７］
前記がんが、卵巣がんである、請求項７４に記載の方法。
［７８］
前記がんが、乳がんである、請求項７４に記載の方法。
［７９］
前記ＭＵＣ１６ ＣＡＲが、配列番号９５～１０７、１１９～１４９、または１９４～１９５に示される配列のうちのいずれか１つによってコードされる、請求項７４に記載の方法。
［８０］
前記膜結合ＩＬ－１５が、配列番号１６１によってコードされる、請求項７４に記載の方法。
［８１］
操作Ｔ細胞の有効量が、少なくとも１０ ２ 個の細胞／ｋｇである、請求項７４に記載の方法。
［８２］
操作Ｔ細胞の有効量が、少なくとも１０ ４ 個の細胞／ｋｇである、請求項７４に記載の方法。
［８３］
操作Ｔ細胞の有効量が、少なくとも１０ ５ 個の細胞／ｋｇである、請求項７４に記載の方法。

Claims (83)

  1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、前記ＣＡＲが、
    （ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；
    （ｂ）ストークドメイン；
    （ｃ）膜貫通ドメイン；
    （ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；
    および、
    （ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
    を含む、単離核酸。
  2. 前記ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインが、
    （ａ）配列番号１、３、５、７、９、１２、および１４に示されるアミノ酸配列のうち
    の少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
    ９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド；
    （ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１１、１３、および１５に示されるアミノ酸配
    列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
    ９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチ
    ド；および
    （ｃ）配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少な
    くとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９
    ９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド
    のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の単離核酸。
  3. 前記ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインが、配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列の
    うちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
    ％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドで
    ある、請求項１または２に記載の単離核酸。
  4. 前記ストークドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１
    ％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００
    ％の同一性を有するポリペプチドである、請求項１または２に記載の単離核酸。
  5. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが４－１ＢＢを含む、請求項１から４のいずれか一項
    に記載の単離核酸。
  6. 前記４－１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２２のアミノ酸配列との、
    少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
    、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項５に記載の単離
    核酸。
  7. 前記共刺激シグナル伝達ドメインがＣＤ２８を含む、請求項１から５のいずれか一項に
    記載の単離核酸。
  8. 前記ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列との、少
    なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
    ９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項７に記載の単離核
    酸。
  9. 前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列との、少なく
    とも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９
    ％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１から８のいずれか一
    項に記載の単離核酸。
  10. トランケート型表皮増殖因子受容体をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記
    載の単離核酸。
  11. 前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、ＨＥＲ１ｔであり、配列番号６５のアミノ
    酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
    ７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１
    ０に記載の単離核酸。
  12. 前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、ＨＥＲ１ｔ－１であり、配列番号６６のア
    ミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
    、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求
    項１０に記載の単離核酸。
  13. 前記ＣＡＲが、配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列との、少なくとも９０％、
    ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１
    ００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離核酸。
  14. 骨格ならびに
    （１）ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ－１、またはこれらの機能的な変異体のうちの少なくと
    も１つを含むトランケート型表皮増殖因子受容体；
    （２）サイトカイン；および
    （３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
    をコードする核酸配列を含むベクターであって、前記ＣＡＲが、
    （ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；
    （ｂ）ストークドメイン；
    （ｃ）膜貫通ドメイン；
    （ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン
    ；および
    （ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
    を含む、ベクター。
  15. 前記サイトカインが、ＩＬ－１５またはＩＬ－１２である、請求項１４に記載のベクタ
    ー。
  16. レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである
    、請求項１４または１５に記載のベクター。
  17. 前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、配列番号６５または配列番号６６のアミノ
    酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
    ７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１
    ４に記載のベクター。
  18. 前記ＩＬ－１５が、膜結合ＩＬ－１５である、請求項１５に記載のベクター。
  19. 膜結合ＩＬ－１５が、配列番号１６１をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１
    ８に記載のベクター。
  20. 自己切断型トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドをコード
    するヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１４から１９のいずれか一項に記載のベクタ
    ー。
  21. 前記骨格が、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンＤＮＡプラスミドまたは
    ｐＦＵＧＷである、請求項１４から２０のいずれか一項に記載のベクター。
  22. プロモーターをさらに含む、請求項１４から２１のいずれか一項に記載のベクター。
  23. 前記プロモーターが、ｈＥＦ１ａ１である、請求項２２に記載のベクター。
  24. 前記ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインが、
    （ａ）配列番号１、３、５、７、９、１２、および１４に示されるアミノ酸配列のうちの
    少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
    ６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド；
    （ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１１、１３、および１５に示されるアミノ酸配列
    のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
    ５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド
    ；および
    （ｃ）配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なく
    とも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９
    ％、または１００％の同一性を有するポリペプチド
    のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４から２３のいずれか一項に記載のベクター。
  25. 前記ＭＵＣ１６抗原結合性ドメインが、配列番号２７～５７に示されるアミノ酸配列の
    うちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
    ％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドで
    ある、請求項１４から２４のいずれか一項に記載のベクター。
  26. 前記ストークドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１
    ％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００
    ％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１４から２５のいずれか一項に記載のベ
    クター。
  27. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢを含む、請求項１４から２６のいずれ
    か一項に記載のベクター。
  28. 前記４－１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２２のアミノ酸配列との、
    少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
    、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２７に記載のベクタ
    ー。
  29. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８を含む、請求項１４から２６のいずれか
    一項に記載のベクター。
  30. 前記ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列との、少
    なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
    ９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載のベクター
    。
  31. 前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列との、少なく
    とも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９
    ％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１４から３０のいずれか一
    項に記載のベクター。
  32. プラスミドを含む、請求項１４から３１のいずれか一項に記載のベクター。
  33. 各前記ベクターが発現プラスミドを含む、請求項１４から３１に記載のベクター。
  34. 前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、
    請求項１６に記載のベクター。
  35. 請求項１から１３のいずれか一項に記載のヌクレオチドを含む、免疫エフェクター細胞
    。
  36. （１）細胞タグ（２）ＩＬ－１５および（３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫
    エフェクター細胞であって、前記ＣＡＲが、（ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；（ｂ
    ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、また
    は両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメ
    インを含む、免疫エフェクター細胞。
  37. 前記ＩＬ－１５が、膜結合ＩＬ－１５である、請求項３６に記載の免疫エフェクター細
    胞。
  38. 前記膜結合ＩＬ－１５が、配列番号１６１のポリペプチド配列を含む、請求項３６に記
    載の免疫エフェクター細胞。
  39. 前記細胞タグが、ＨＥＲ１ｔを含み、前記ＨＥＲ１ｔが、配列番号６５のポリペプチド
    配列を含む、請求項３６に記載の免疫エフェクター細胞。
  40. 前記細胞タグが、ＨＥＲ１ｔ－１を含み、前記ＨＥＲ１ｔ－１が、配列番号６６のポリ
    ペプチド配列を含む、請求項３６に記載の免疫エフェクター細胞。
  41. 請求項１４から３４のいずれか一項に記載のベクターを含む免疫エフェクター細胞。
  42. Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、または調
    節性Ｔ細胞である、請求項３５から４１のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
  43. 前記ＣＡＲが、配列番号２７～５７のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、請
    求項３６に記載の免疫エフェクター細胞。
  44. それを必要とするヒト対象において標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫
    応答を刺激するための方法であって、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された有効量の
    細胞をヒト対象に投与するステップを含み、前記ＣＡＲが、
    （ａ）ＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；
    （ｂ）ストークドメイン；
    （ｃ）膜貫通ドメイン；
    （ｄ）４－１ＢＢもしくはＣＤ２８、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；
    （ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン；および
    （ｆ）トランケート型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔ）
    を含む、方法。
  45. 前記ヒトが、卵巣がんおよび乳がんのうちの少なくとも１つを伴うと診断されている、
    請求項４４に記載の方法。
  46. 前記卵巣がんまたは乳がんが、再発性または不応性の卵巣がんまたは乳がんである、請
    求項４５に記載の方法。
  47. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、前記ＣＡＲが、
    （ａ）配列番号１～１５または２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも
    １つを伴うＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；
    （ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を伴うストークドメイン；
    （ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を伴うＣＤ２８を含む共刺激シグナル伝達ドメイン
    ；
    （ｄ）配列番号６５のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔおよび配列番号６６のアミノ酸配
    列を伴うＨＥＲ１ｔ－１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ；および
    （ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を伴うＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
    を含む、単離核酸。
  48. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、前記ＣＡＲが、
    （ａ）配列番号１～１５または２７～５７に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも
    １つを伴うＭＵＣ１６抗原結合性ドメイン；
    （ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を伴うストークドメイン；
    （ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を伴う４－１ＢＢを含む共刺激シグナル伝達ドメイ
    ン；
    （ｄ）配列番号６５のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔおよび配列番号６６のアミノ酸配
    列を伴うＨＥＲ１ｔ－１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ；および
    （ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を伴うＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
    を含む、単離核酸。
  49. 請求項４７または４８に記載の１または複数のポリヌクレオチドのいずれかを含む、ベ
    クター。
  50. レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである
    、請求項４９に記載のベクター。
  51. 前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、
    請求項５０に記載のベクター。
  52. 複数のベクターである、請求項５１に記載のベクター。
  53. 免疫エフェクター細胞においてＣＡＲを発現するための系であって、請求項１から１３
    および４７から４８のいずれか一項で提示される単離核酸をコードする１または複数のベ
    クターを含む系。
  54. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項５３に記載の系。
  55. 少なくとも１つのさらなる遺伝子をコードする核酸をさらに含む、請求項５３または５
    ４に記載の系。
  56. 前記さらなる遺伝子が、サイトカインを含む、請求項５５に記載の系。
  57. 前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ならびにＩＬ
    －１５およびＩＬ－１５Ｒαの融合体のうちの少なくとも１つを含む、請求項５６に記載
    の系。
  58. 前記サイトカインが、分泌形態にある、請求項５６に記載の系。
  59. 前記サイトカインが、膜結合形態にある、請求項５６に記載の系。
  60. １つのベクターを含む、請求項５３から５９のいずれか一項に記載の系。
  61. 前記１または複数のベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、
    または非ウイルスベクターである、請求項５３から６０のいずれか一項に記載の系。
  62. 前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、
    請求項６１に記載の系。
  63. Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む、請求項６２に記載の
    系。
  64. 前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼが、ＳＢ１１、ＳＢ１００Ｘ、
    またはＳＢ１１０である、請求項６３に記載の系。
  65. 前記免疫エフェクター細胞が、哺乳動物細胞である、請求項５３から６４のいずれか一
    項に記載の系。
  66. 免疫エフェクター細胞においてＣＡＲを発現する方法であって、前記免疫エフェクター
    細胞を請求項５３から６５のいずれか一項に記載の系と接触させるステップを含む方法。
  67. 操作Ｔ細胞の増殖および／または生存を刺激する方法であって、
    （ａ）細胞の試料を、対象から得るステップであって、前記試料がＴ細胞またはＴ細胞
    前駆細胞を含む、ステップ；
    （ｂ）細胞に、請求項１から１３および４４から４５のいずれか一項で提示される単離
    核酸をコードする１または複数のベクター、ならびにトランスポザーゼをコードするベク
    ターをトランスフェクトし、操作ＭＵＣ１６ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団をもたらすステッ
    プ；
    （ｃ）および、任意選択で、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を２日間またはそれ以
    下の間、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて培養するステップ
    を含む方法。
  68. 細胞に、サイトカインをコードするベクターをトランスフェクトするステップをさらに
    含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記サイトカインが、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαを含む融合タンパク質である、
    請求項６８に記載の方法。
  70. 前記１または複数のベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、
    または非ウイルスベクターである、請求項６７から６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、
    請求項７０に記載の方法。
  72. Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む、請求項７１に記載の
    方法。
  73. 前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼが、ＳＢ１１、ＳＢ１００Ｘま
    たはＳＢ１１０である、請求項７２に記載の方法。
  74. それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、有効量の操作Ｔ細胞の１
    または複数の用量を前記対象に投与するステップを含み、前記操作Ｔ細胞がＭＵＣ１６
    ＣＡＲおよび膜結合ＩＬ－１５を含む、方法。
  75. 有効量の操作Ｔ細胞の第１の用量が、腹腔内に投与される、請求項７４に記載の方法。
  76. 有効量の操作Ｔ細胞の第２の用量が、静脈内に投与される、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記がんが、卵巣がんである、請求項７４に記載の方法。
  78. 前記がんが、乳がんである、請求項７４に記載の方法。
  79. 前記ＭＵＣ１６ ＣＡＲが、配列番号９５～１０７、１１９～１４９、または１９４～
    １９５に示される配列のうちのいずれか１つによってコードされる、請求項７４に記載の
    方法。
  80. 前記膜結合ＩＬ－１５が、配列番号１６１によってコードされる、請求項７４に記載の
    方法。
  81. 操作Ｔ細胞の有効量が、少なくとも１０２個の細胞／ｋｇである、請求項７４に記載の
    方法。
  82. 操作Ｔ細胞の有効量が、少なくとも１０４個の細胞／ｋｇである、請求項７４に記載の
    方法。
  83. 操作Ｔ細胞の有効量が、少なくとも１０５個の細胞／ｋｇである、請求項７４に記載の
    方法。
JP2023189072A 2018-06-04 2023-11-06 Ｍｕｃ１６特異的キメラ抗原受容体およびそれらの使用 Pending JP2024023232A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862680297P 2018-06-04 2018-06-04
US62/680,297 2018-06-04
PCT/US2019/035384 WO2019236577A2 (en) 2018-06-04 2019-06-04 Muc16 specific chimeric antigen receptors and uses thereof
JP2020567215A JP2021525534A (ja) 2018-06-04 2019-06-04 Ｍｕｃ１６特異的キメラ抗原受容体およびそれらの使用

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020567215A Division JP2021525534A (ja) 2018-06-04 2019-06-04 Ｍｕｃ１６特異的キメラ抗原受容体およびそれらの使用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024023232A true JP2024023232A (ja) 2024-02-21

Family

ID=68764543

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020567215A Pending JP2021525534A (ja) 2018-06-04 2019-06-04 Ｍｕｃ１６特異的キメラ抗原受容体およびそれらの使用
JP2023189072A Pending JP2024023232A (ja) 2018-06-04 2023-11-06 Ｍｕｃ１６特異的キメラ抗原受容体およびそれらの使用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020567215A Pending JP2021525534A (ja) 2018-06-04 2019-06-04 Ｍｕｃ１６特異的キメラ抗原受容体およびそれらの使用

Country Status (11)

Country Link
US (3) US11319380B2 (ja)
EP (1) EP3802615A4 (ja)
JP (2) JP2021525534A (ja)
KR (1) KR20210021493A (ja)
CN (1) CN112533957A (ja)
AU (1) AU2019282620A1 (ja)
CA (1) CA3101641A1 (ja)
IL (1) IL278976A (ja)
SG (1) SG11202011895VA (ja)
WO (1) WO2019236577A2 (ja)
ZA (2) ZA202008065B (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019079486A1 (en) * 2017-10-18 2019-04-25 Intrexon Corporation POLYPEPTIDE COMPOSITIONS COMPRISING SPACERS
US20220332780A1 (en) 2019-09-10 2022-10-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2-il15 fusion proteins for tunable regulation
TW202233662A (zh) * 2020-12-31 2022-09-01 大陸商亘喜生物科技（上海）有限公司 膜融合蛋白及其在免疫細胞中的應用
JP2024504585A (ja) * 2021-01-19 2024-02-01 オブシディアン セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｔ細胞及び腫瘍浸潤リンパ球の拡張のための組成物及び方法
WO2023150562A1 (en) * 2022-02-01 2023-08-10 Alaunos Therapeutics, Inc. Methods for activation and expansion of t cells
CN115819613B (zh) * 2022-05-10 2023-10-20 四川大学华西医院 基于msln前体蛋白构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7202346B2 (en) 2002-07-03 2007-04-10 Immunogen Inc. Antibodies to non-shed Muc1 and Muc16, and uses thereof
AU2006262603B2 (en) 2005-06-20 2011-01-06 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
JP5290276B2 (ja) 2007-05-08 2013-09-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン改変抗ｍｕｃ１６抗体および抗体−薬物結合体
JP2011509650A (ja) 2008-01-11 2011-03-31 株式会社ジーンテクノサイエンス ヒト化抗−α９インテグリン抗体及びその使用
EP4049674A1 (en) * 2009-11-03 2022-08-31 City of Hope Truncated epidermal growth factor receptor (egfrt) for transduced t cell selection
CA3002192C (en) 2010-03-26 2023-03-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antibodies to muc16 and methods of use thereof
ES2831315T3 (es) 2013-04-03 2021-06-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Generación efectiva de células T dirigidas al tumor derivadas de células madre pluripotentes
EP3783098A1 (en) * 2013-05-14 2021-02-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
RU2701341C2 (ru) * 2014-04-03 2019-09-25 Селлектис Cd33-специфические химерные антигенные рецепторы для иммунотерапии рака
KR102612313B1 (ko) 2014-07-21 2023-12-12 노파르티스 아게 인간화 항-bcma 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
ES2904573T3 (es) 2015-03-27 2022-04-05 Univ Southern California Terapia con células T dirigida a LHR para el tratamiento de tumores sólidos
WO2016205176A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
WO2017040945A1 (en) 2015-09-04 2017-03-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immune cell compositions and methods of use
US20190112380A1 (en) * 2016-03-29 2019-04-18 University Of Southern California Chimeric antigen receptors targeting cancer
AU2017279548A1 (en) * 2016-06-08 2018-12-13 Precigen, Inc. Cd33 specific chimeric antigen receptors
ES2951552T3 (es) 2016-07-29 2023-10-23 Juno Therapeutics Inc Polipéptidos inmunomoduladores y composiciones y métodos relacionados
CN107557336B (zh) * 2017-09-15 2020-02-14 山东兴瑞生物科技有限公司 一种抗muc16安全型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019236577A3 (en) 2020-01-16
JP2021525534A (ja) 2021-09-27
CN112533957A (zh) 2021-03-19
WO2019236577A2 (en) 2019-12-12
KR20210021493A (ko) 2021-02-26
CA3101641A1 (en) 2019-12-12
US11976134B2 (en) 2024-05-07
ZA202110780B (en) 2024-04-24
US20190375854A1 (en) 2019-12-12
US11319380B2 (en) 2022-05-03
US20220153866A1 (en) 2022-05-19
IL278976A (en) 2021-01-31
SG11202011895VA (en) 2020-12-30
US20220153867A1 (en) 2022-05-19
EP3802615A4 (en) 2022-04-13
EP3802615A2 (en) 2021-04-14
US11981746B2 (en) 2024-05-14
ZA202008065B (en) 2022-03-30
AU2019282620A1 (en) 2020-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11787848B2 (en) CD33 specific chimeric antigen receptors
US20210177902A1 (en) Ror-1 specific chimeric antigen receptors and uses thereof
US11946054B2 (en) Modulating expression of polypeptides via new gene switch expression systems
JP7262403B2 (ja) 新規の細胞タグの発現
US11976134B2 (en) MUC16 specific chimeric antigen receptors and uses thereof
JP2023153866A (ja) スペーサーを含むポリペプチド組成物
JP2024073449A (ja) Ｒｏｒ－１特異的キメラ抗原受容体およびその使用
RU2795198C2 (ru) Специфичные к muc16 химерные антигенные рецепторы и их применения
EP4382913A2 (en) Modulating expression of polypeptides via new gene switch expression systems

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231205

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20231205