JP2024023232A - Muc16特異的キメラ抗原受容体およびそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】がん治療のための抗MUC16モノクローナル抗体からのscFvを含有するキメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核酸を提供する。【解決手段】キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核酸であって、前記CARが、(a)MUC16抗原結合性ドメイン;(b)ストークドメイン;(c)膜貫通ドメイン;(d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;および、(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む、単離核酸を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、2018年6月4日
に出願された米国特許仮出願第62/680,297号明細書の利益を主張する。
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットにおいて、電子的に提出され、参照によりその全体
において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2019年5月23日に作成された
前記ASCIIコピーは、50471_715_601_SL.txtと名付けられ、3
31,880バイトのサイズである。
キメラポリペプチドなど、組換えポリペプチドは、研究、診断、製造、および治療応用
に役立っている。CARなど、抗原結合性ポリペプチドを発現する改変エフェクター細胞
は、感染症、自己免疫障害、およびがんなどの疾患および障害の処置に有用である。
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特
許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれることが指し示された場
合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書では、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核酸であって、CARが
、(a)MUC16抗原結合性ドメイン;(b)ストークドメイン;(c)膜貫通ドメイ
ン;(d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン
;および(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む、単離核酸が提示される。一部
の実施形態では、MUC16抗原結合性ドメインは:(a)配列番号1、3、5、7、9
、12、および14に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有するポリペプチド;(b)配列番号2、4、6、8、10、1
1、13、および15に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、
または100%の同一性を有するポリペプチド;および(c)配列番号27~57に示さ
れるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、9
3%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有
するポリペプチドのうちの少なくとも1つを含む。
一部の実施形態では、MUC16抗原結合性ドメインは、配列番号27~57に示され
るアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93
%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有す
るポリペプチドである。一部の実施形態では、ストークドメインは、配列番号16のアミ
ノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドである。一部の
実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは4-1BBを含む。一部の実施形態では、
4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号22のアミノ酸配列との、少なく
とも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99
%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、共刺激
シグナル伝達ドメインはCD28を含む。一部の実施形態では、CD28の共刺激シグナ
ル伝達ドメインは、配列番号23のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92
%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一
性を有するポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、CD3ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号26のアミノ酸
配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97
%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施
形態では、本明細書で提示される単離核酸は、トランケート型表皮増殖因子受容体をさら
に含みうる。一部の実施形態では、トランケート型表皮増殖因子受容体は、HER1tで
あり、配列番号65のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポ
リペプチドを含む。一部の実施形態では、トランケート型表皮増殖因子受容体は、HER
1t-1であり、配列番号66のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%
、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性
を有するポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、CARは、配列番号27~57に示されるアミノ酸配列との、少
なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書では、骨格ならびに(1)HER1t、HER1t-1、またはこれらの機能
的な変異体のうちの少なくとも1つを含むトランケート型表皮増殖因子受容体;(2)サ
イトカイン;および(3)キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸配列を含むベク
ターであって、CARが(a)MUC16抗原結合性ドメイン;(b)ストークドメイン
;(c)膜貫通ドメイン;(d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激
シグナル伝達ドメイン;および(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む、ベクタ
ーが提示される。
一部の実施形態では、サイトカインは、IL-15またはIL-12である。一部の実
施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非
ウイルスベクターである。一部の実施形態では、トランケート型表皮増殖因子受容体は、
配列番号65または配列番号66のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92
%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一
性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、IL-15は、膜結合IL-15
である。一部の実施形態では、膜結合IL-15は、配列番号161をコードするヌクレ
オチド配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるベクターのうちのいずれかは、自己切断型
トセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス(T2A)ペプチドをコードするヌクレオ
チド配列をさらに含みうる。一部の実施形態では、骨格はSleeping Beaut
yトランスポゾンDNAプラスミドまたはpFUGWである。一部の実施形態では、本明
細書で提示されるベクターのうちのいずれかは、プロモーターをさらに含みうる。一部の
実施形態では、プロモーターは、hEF1a1である。一部の実施形態では、MUC16
抗原結合性ドメインは:(a)配列番号1、3、5、7、9、12、および14に示され
るアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93
%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有す
るポリペプチド;(b)配列番号2、4、6、8、10、11、13、および15に示さ
れるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、9
3%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有
するポリペプチド;および(c)配列番号27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少
なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96
%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドのうちの少
なくとも1つを含む。一部の実施形態では、MUC16抗原結合性ドメインは、配列番号
27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、9
1%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または10
0%の同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ストークドメインは、
配列番号16のアミノ酸配列との少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチ
ドを含む。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BBを含む。一
部の実施形態では、4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号22のアミノ
酸配列との少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97
%、98%、99%、または100%の同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28を含む。一部の実施形
態では、CD28の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号23のアミノ酸配列との、
少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%
、99%、または100%の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、CD
3ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号26のアミノ酸配列との、少なくとも90%
、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または
100%の同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドを含む。一部の実施形態では、各ベクタ
ーは発現プラスミドを含む。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、Sleepi
ng Beautyトランスポゾンである。
本明細書では、本明細書で提示されるヌクレオチドのうちのいずれかを含む免疫エフェ
クター細胞が提示される。本明細書では、(1)細胞タグ(2)IL-15および(3)
キメラ抗原受容体(CAR)を含む免疫エフェクター細胞であって、CARが(a)MU
C16抗原結合性ドメイン;(b)ストークドメイン;(c)膜貫通ドメイン;(d)4
-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;および(e
)CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む、免疫エフェクター細胞が提示される。
一部の実施形態では、IL-15は、膜結合IL-15である。一部の実施形態では、
膜結合IL-15は、配列番号161のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、
細胞タグは、HER1tを含み、HER1tは、配列番号65のポリペプチド配列を含む
。一部の実施形態では、細胞タグは、HER1t-1を含み、HER1t-1は、配列番
号66のポリペプチド配列を含む。
本明細書では、本明細書で記載されるベクターのうちのいずれかを含む免疫エフェクタ
ー細胞が提示される。一部の実施形態では、細胞は、T細胞、ナチュラルキラー(NK)
細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、または調節性T細胞である。一部の実施形態で
は、CARは、配列番号27~57のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを含む。
本明細書では、それを必要とするヒト対象において標的細胞集団または組織にT細胞媒
介性免疫応答を刺激するための方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された
有効量の細胞をヒト対象に投与するステップを含み、CARが(a)MUC16抗原結合
性ドメイン;(b)ストークドメイン;(c)膜貫通ドメイン;(d)4-1BBもしく
はCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;(e)CD3ゼータシグナ
ル伝達ドメイン;および(f)トランケート型表皮増殖因子受容体(HER1t)を含む
、方法が提示される。一部の実施形態では、ヒトは、卵巣がんおよび乳がんのうちの少な
くとも1つを伴うと診断されている。一部の実施形態では、卵巣がんまたは乳がんは、再
発性または不応性の卵巣がんまたは乳がんである。
本明細書では、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核酸であって、CARが
、(a)配列番号1~15または27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも
1つを伴うMUC16抗原結合性ドメイン;(b)配列番号16のアミノ酸配列を伴うス
トークドメイン;(c)配列番号23のアミノ酸配列を伴うCD28を含む共刺激シグナ
ル伝達ドメイン;(d)配列番号65のアミノ酸配列を伴うHER1tおよび配列番号6
6のアミノ酸配列を伴うHER1t-1のうちの少なくとも1つを含むHER1タグ;お
よび(e)配列番号26のアミノ酸配列を伴うCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む
、単離核酸が提示される。
本明細書では、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核酸であって、CARが
、(a)配列番号1~15または27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも
1つを伴うMUC16抗原結合性ドメイン;(b)配列番号16のアミノ酸配列を伴うス
トークドメイン;(c)配列番号23のアミノ酸配列を伴う4-1BBを含む共刺激シグ
ナル伝達ドメイン;(d)配列番号65のアミノ酸配列を伴うHER1tおよび配列番号
66のアミノ酸配列を伴うHER1t-1のうちの少なくとも1つを含むHER1タグ;
および(e)配列番号26のアミノ酸配列を伴うCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含
む、単離核酸が提示される。
本明細書では、本明細書で記載される1または複数のポリヌクレオチドのいずれかを含
むベクターが提示される。一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、
レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウ
イルスベクターは、Sleeping Beautyトランスポゾンである。一部の実施
形態では、ベクターは、複数のベクターである。
本明細書では、免疫エフェクター細胞においてCARを発現するための系であって、本
明細書で提示される単離核酸をコードする1または複数のベクターを含む系が提示される
。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、T細胞またはNK細胞である。一部の
実施形態では、本明細書で提示される系は、少なくとも1つのさらなる遺伝子をコードす
る核酸をさらに含みうる。一部の実施形態では、さらなる遺伝子は、サイトカインを含む
。一部の実施形態では、サイトカインは、IL-2、IL-15、IL-12、IL-2
1、ならびにIL-15およびIL-15Rαの融合体のうちの少なくとも1つを含む。
一部の実施形態では、サイトカインは、分泌形態にある。一部の実施形態では、サイトカ
インは、膜結合形態にある。一部の実施形態では、系は、1つのベクターを含む。一部の
実施形態では、1または複数のベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベ
クター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは
、Sleeping Beautyトランスポゾンである。一部の実施形態では、本明細
書で提示される系は、Sleeping Beautyトランスポザーゼをさらに含みう
る。一部の実施形態では、Sleeping Beautyトランスポザーゼは、SB1
1、SB100X、またはSB110である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細
胞は哺乳動物細胞である。
本明細書では、免疫エフェクター細胞においてCARを発現する方法であって、免疫エ
フェクター細胞を本明細書で記載される系と接触させるステップを含む方法が提示される
本明細書では、操作T細胞の増殖および/または生存を刺激する方法であって、(a)
細胞試料を、対象から得るステップであって、試料がT細胞またはT細胞前駆細胞を含む
、ステップ;(b)細胞に、請求項1から34および47から52のいずれか一項で提示
される単離核酸をコードする1または複数のベクター、ならびにトランスポザーゼをコー
ドするベクターをトランスフェクトし、操作MUC16 CAR発現T細胞の集団をもた
らすステップ;(c)および、任意選択で、MUC16 CAR T細胞の集団を2日間
またはそれ以下の間、ex vivoにおいて培養するステップを含む方法が提示される
一部の実施形態では、操作T細胞の増殖および/または生存を刺激する方法は、細胞に
、サイトカインをコードするベクターをトランスフェクトするステップをさらに含みうる
。一部の実施形態では、サイトカインは、IL-15およびIL-15Rαを含む融合タ
ンパク質である。一部の実施形態では、1または複数のベクターは、レンチウイルスベク
ター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では
、非ウイルスベクターは、Sleeping Beautyトランスポゾンである。一部
の実施形態では、方法は、Sleeping Beautyトランスポザーゼをさらに含
みうる。一部の実施形態では、Sleeping Beautyトランスポザーゼは、S
B11、SB100XまたはSB110である。
本明細書では、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、有効量の
操作T細胞の1または複数の用量を対象に投与するステップを含み、操作T細胞がMUC
16 CARおよび膜結合IL-15を含む、方法が提示される。一部の実施形態では、
有効量の操作T細胞の第1の用量が、腹腔内に投与される。一部の実施形態では、有効量
の操作T細胞の第2の用量が、静脈内に投与される。一部の実施形態では、がんは卵巣が
んである。一部の実施形態では、がんは乳がんである。一部の実施形態では、MUC16
CARは、配列番号95~107、119~149、または194~195に示される
配列のうちのいずれか1つによってコードされる。一部の実施形態では、膜結合IL-1
5は、配列番号161によってコードされる。一部の実施形態では、操作T細胞の有効量
は、1kg当たり少なくとも10個の細胞である。一部の実施形態では、操作T細胞の
有効量は、1kg当たり少なくとも10個の細胞である。一部の実施形態では、操作T
細胞の有効量は、1kg当たり少なくとも10個の細胞である。
図面の簡単な説明
本開示の特徴は、特に、付属の特許請求の範囲において明示されている。本開示の特徴
および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、例示的な実施形態を
明示する、以下の詳細な記載および付属の図面を参照することにより得られるであろう。
Sleeping Beautyトランスポゾン系についての概略的描示を示す図である。MUC16 CARおよび膜結合IL15(mbIL15)トランスポゾンなどのサイトカインをコードするSleeping Beauty由来DNAプラスミド、ならびにSBトランスポザーゼをコードするDNAプラスミドは、例えば電気穿孔法によって、免疫エフェクター細胞へと送達する。操作免疫エフェクター細胞は、本明細書で記載されるPOC(point-of-care)法下で製造されうる。ある特定の場合には、MUC16 CARおよび/またはサイトカインは、in vivoにおける条件付けアブレーションのために、細胞タグまたはキルタグと共に共発現されうる。 遺伝子スイッチ構成要素を伴う異なる構成での、MUC16 CARおよびサイトカインのための例示的な遺伝子発現カセットを描示する図である。 異なるストーク長を有するMUC16 CARの例示を描示する図である。 CAR、mbIL15およびHER1t1トランス遺伝子の発現を示す図である。T細胞に、MUC16-3 CAR-HER1t1またはMUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1トランスポゾンおよびSBトランスポザーゼをヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後1日目において、トランス遺伝子の発現を測定した。細胞は、CD3生細胞についてゲートをかけられた。示したデータは、3人の健常なドナーからの平均±SEMである。 CAR-T細胞におけるCD8アルファヒンジ領域由来の異なるスペーサー長のMUC16 CARの発現を示す図である。MUC16 CAR-T細胞は、健常なドナーのT細胞(ドナー番号D133098)においてSB系プラスミドの電気穿孔法によって作出した。週に1回の刺激により、MUC16tを発現するAaPCを用いた共培養により、ex vivoにおいてCAR-T細胞を数的に拡大増殖させた。CARの発現は、ヌクレオフェクション後1日目および8日目においてマルチパラメーターのフローサイトメトリーによって測定した。試験物は表6に列挙する。 CD8アルファヒンジ領域由来の異なるスペーサー長のMUC16 CARを発現するCAR-T細胞を示す図である。CAR-T細胞は、健常なドナーのT細胞(ドナー番号D132552)においてSB系プラスミドの電気穿孔法によって作出した。週に1回の刺激により、MUC16tを発現するAaPCを用いた共培養により、ex vivoにおいてCAR-T細胞を数的に拡大増殖させた。CARの発現は、ヌクレオフェクション後1日目および8日目においてマルチパラメーターのフローサイトメトリーによって測定した。試験物は表7に列挙する。 MUC16 CAR発現のウェスタンブロット解析を示す図である。MUC16 CAR発現は、マウス抗ヒトCD3ζ抗体での染色によって測定した。レーン1:タンパク質マーカー;レーン2:MUC16-3 CAR-HER1t1 T細胞;および3:MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞。 mbIL15発現のウェスタンブロット解析を示す図である。mbIL15発現は、抗IL-15抗体での染色によって測定した。レーン1:タンパク質マーカー;レーン2:MUC16-3 CAR-HER1t1 T細胞およびレーン3:MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞。 HER1t1発現のウェスタンブロット解析を示す図である。HER1t1発現は、免疫沈降法後、ウェスタンブロットによって測定した。レーン1:MUC16-3 CAR-HER1t1 T細胞;レーン2:MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞;レーン3:細胞溶解物を含まない免疫沈降対照;レーン4:A431細胞株溶解物;およびレーン5:タンパク質マーカー。 試験した様々な腫瘍細胞株におけるMUC16発現のフローサイトメトリー解析を示す図である。 MUC16 CAR-T細胞の特異的細胞傷害性を示す図である。変動させたE:T比での様々な腫瘍細胞株に対する、MUC16-3 CAR-HER1t1 T細胞およびMUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞の細胞傷害性。対照CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞は陰性対照として利用した。3人のドナーからの3連のウェルの平均±SEMを示す。 様々な腫瘍細胞株を用いた共培養時のMUC16-CAR T細胞によるサイトカイン産生を示す図である。3人の健常なドナーのT細胞を使用して作出されたCAR-T細胞を、7日間、1:1のE:T比で指定された腫瘍細胞株を用いて共培養した。3人のドナーからの3連のウェルの平均±SEMを示す。 ルシフェラーゼアッセイでのMUC16-CAR-T細胞の細胞傷害性を示す図である。2人の健常なドナーのT細胞から作出されたCAR-T細胞を、腫瘍細胞株を用いて培養した。試験物は表8に列挙する。 MUC16 CAR-T細胞におけるmbIL15の生物学的機能を示す図である。CAR-T細胞は、3人の健常なドナーのT細胞から作出した。抗原および外因性サイトカインの非存在下でのin vitro培養におけるMUC16-3 CAR-HER1t1 T細胞およびMUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞の存続。各記号は、個々のドナーのCAR-T細胞を表す。3人のドナーからの平均±SEMを示す。 MUC16 CAR-T細胞におけるmbIL15の生物学的機能を示す図である。CAR-T細胞は、3人の健常なドナーのT細胞から作出した。CAR-T細胞の増殖を示す。各記号は、個々のドナーCAR-T細胞を表す。3人のドナーからの平均±SEMを示す。 MUC16 CAR-T細胞におけるmbIL15の生物学的機能を示す図である。CAR-T細胞は、3人の健常なドナーのT細胞から作出した。MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞のメモリーマーカー解析を示す。各記号は、個々のドナーCAR-T細胞を表す。3人のドナーからの平均±SEMを示す。 細胞外サイトカインの非存在下でのin vitroにおけるMUC16-CAR-T細胞の存続を示す図である。3人の健常なドナーのT細胞由来のMUC16-2 CAR-HER1t1 T細胞およびMUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞を、2週間、細胞外サイトカインの存在下または非存在下で培養した。サイトカインと共に培養したT細胞の分画として、サイトカイン無しで培養した生存T細胞をグラフ化した。示したデータは、3人のドナーからの平均±SEMである。 HER1t1を共発現しているMUC16 CAR-T細胞のセツキシマブ媒介ADCC活性(細胞傷害性%として表される;y軸)を示す図である。同種NK細胞は、10:1のE:T比でエフェクター細胞として使用した。セツキシマブは、HER1t1を発現するMUC16 CAR-T細胞に対して特異的細胞傷害性を示した。示したデータは、平均±SEMである。 in vivo生物発光(IVIS)イメージングによって測定されたSKOV3-fLUC-MUC16腫瘍量の定量的解析を示す図である。NSGマウス(群当たりN=5~7匹のマウス)に、0日目に、i.p.注射によってSKOV3-fLUC-MUC16腫瘍細胞株を投与した。腫瘍保有マウスを、単回のi.p.またはi.v.注射によって、異なるMUC16 CAR-T処置で処置し、腫瘍量を、一連の処置を介してIVISによって定量した。示したデータは、平均±SEMである。矢印は、CAR-T投与の日を表す。 in vivo生物発光(IVIS)イメージングによって測定されたSKOV3-fLUC-MUC16腫瘍量の定量的解析を示す図である。NSGマウス(群当たりN=5~7匹のマウス)に、0日目に、i.p.注射によってSKOV3-fLUC-MUC16腫瘍細胞株を投与した。腫瘍保有マウスを、腫瘍細胞投与後5日目に、単回のi.p.注射によって異なるMUC16 CAR-T処置で処置し、腫瘍量を、一連の処置を介してIVISによって定量した。示したデータは、平均±SEMである。 処置された腫瘍保有NSGマウスの血液中でのMUC16 CAR-T細胞の定量を示す図である。NSGマウス(群当たりN=5~7匹のマウス)に、i.p.注射によってSKOV3-fLUC-MUC16腫瘍細胞株を投与した。腫瘍保有マウスを、腫瘍細胞投与後5日目に、単回のi.p.注射によって異なるMUC16 CAR-T処置で処置し、CAR-T細胞を、マウス血液試料中のCD8 HER1t1(図18A)およびCD4HER1t1(図18B)T細胞の測定を介して定量した(mLの血液当たりのCAR-T細胞の数;y軸)。示したデータは、平均±SEMである;各時点で、n=5~7匹のマウス。 同上。 in vivo生物発光(IVIS)イメージングによって測定されたSKOV3-fLUC-MUC16腫瘍量の定量的解析を示す図である。NSGマウス(群当たりN=5匹のマウス)に、0日目に、i.p.注射によってSKOV3-fLUC-MUC16腫瘍細胞株を投与した。腫瘍保有マウスを、腫瘍細胞投与後5日目に、単回のi.p.注射によって3つの異なる用量のうちの1つのMUC16-2 CAR-T細胞で処置し、腫瘍量を、一連の処置を介してIVISによって定量化した。試験物は表9に列挙する。示したデータは、平均±SEMである。 in vivo生物発光(IVIS)イメージングによって測定されたSKOV3-fLUC-MUC16腫瘍量の定量的解析を示す図である。NSGマウス(群当たりN=5匹のマウス)に、0日目に、i.p.注射によってSKOV3-fLUC-MUC16腫瘍細胞株を投与した。腫瘍保有マウスを、腫瘍細胞投与後5日目に、単回のi.p.注射によって3つの異なる用量のうちの1つのMUC16-3 CAR-T細胞で処置し、腫瘍量を、一連の処置を介してIVISによって定量した。試験物は表9に列挙する。示したデータは、平均±SEMである。
発明の詳細な説明
以下の記載および例は、本発明の実施形態について、詳細に例示する。本発明は、本明
細書で記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして、変動しうること
を理解されたい。当業者は、本発明には、多数の変動および改変がなされ、これらは、そ
の範囲内に包含されることを認識するであろう。
全ての用語は、それらが、当業者により理解される通りに理解されることを意図する。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学
用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有
する。
本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される主
題を限定するものと見なすべきではない。
本発明の多様な特色は、単一の実施形態の文脈で記載しうるが、特色はまた、個別に提
示される場合もあり、任意の適切な組合せで提示される場合もある。逆に、本明細書では
、明確さのために、本発明を、個別の実施形態の文脈で記載しうるが、本発明はまた、単
一の実施形態でも、実施することができる。
以下の定義は、当技術分野における定義を補完し、本出願へと方向付けられ、いかなる
関連または非関連の案件、例えば、共同所有される、いかなる特許または出願にも帰属し
ない。本明細書で記載される方法および材料と、同様または同等である、任意の方法およ
び材料を、本開示の試験の実施において使用しうるが、本明細書では、好ましい材料およ
び方法について記載する。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態
について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するもので
はない。
本出願では、そうでないことが別段に言明されない限りにおいて、単数形の使用は、複
数形を含む。本明細書で使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されな
い限りにおいて、単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、および「その」は、複数の
指示対象を含むことに注意しなければならない。本出願では、そうでないことが言明され
ない限りにおいて、「または」の使用は、「および/または」を意味する。さらに、「~
を含むこと」という用語のほか、「~を含む(include)」、「~を含む(includes)」
、および「含まれた」など、他の形態の使用は、限定的ではない。
本明細書における、「一部の実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または
「他の実施形態」への言及は、実施形態との関連で記載される、特定の特色、構造、また
は特徴が、本発明の、少なくとも一部の実施形態には含まれるが、全ての実施形態には、
必ずしも含まれないことを意味する。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「~を含むこと(comprising)」(「~を
含む(comprise)」および「~を含む(comprises)」など、「~を含むこと(comprisin
g)」の任意の形態)、「~を有すること」(「~を有する(have)」および「~を有す
る(has)」など、「~を有すること」の任意の形態)、「~を含むこと(including)」
(「~を含む(include)」および「~を含む(includes)」など、「~を含むこと(inc
luding)」の任意の形態)、または「~を含有すること」(「~を含有する(contain)
」および「~を含有する(contains)」など、「~を含有すること」の任意の形態)とい
う語は、包含的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されていない要素または方
法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法
または組成物に関して実施することが可能であり、この逆も成り立つことが想定される。
さらに、本発明の組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。
本明細書で使用される基準数値との関係における「約」という用語およびその文法的等
価物は、数値自体およびその数値から±10%の範囲の値を含みうる。例えば、「約10
」の量は、10および9~11の任意の量を含む。例えば、基準数値との関係における「
約」という用語はまた、値±この値から10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、
3%、2%、または1%の範囲も含む。
「単離」により、その天然環境からの核酸の摘出を意味する。「精製」により、所与の
核酸が、天然から摘出されたもの(ゲノムDNAおよびmRNAを含む)であれ、合成さ
れたもの(cDNAを含む)であれ、かつ/または検査室条件下で増幅されたのであれ、
純度が増大しており、この場合、「純度」とは、相対的用語であり、「絶対純度」ではな
いことを意味する。一方、核酸およびタンパク質は、希釈剤またはアジュバントと共に製
剤化される場合があるが、実際的な目的では、単離されているものとしうることを理解さ
れたい。例えば、核酸は、細胞への導入のために使用する場合、許容可能な担体または希
釈剤と混合することが典型的である。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、リボ
ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドのポリ
マー形態を指す。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、この用語は、二
本鎖DNAおよび一本鎖DNA、三重鎖DNAのほか、二本鎖RNAおよび一本鎖RNA
も含む。この用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドのメチル化および/またはキャッピ
ングによる修飾形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含みうる。用語はまた、
天然のものではないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドのほか、ヌクレオチド類似体を
含む分子を含むことも意図する。
「ポリペプチド(polypeptide)」とは、「ポリペプチド(polypeptides)」および「
タンパク質(protein(s))」という用語と交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマー
を指す。「成熟タンパク質」とは、全長タンパク質であり、任意選択で、グリコシル化ま
たは所与の細胞内環境内のタンパク質に典型的な他の修飾を含むタンパク質である。
核酸および/または核酸配列は、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配
列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および/またはタンパク質配列は、それ
らのコードDNAが、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する
場合、相同である。相同な分子は、相同体と称する場合がある。例えば、本明細書で記載
される、任意の天然タンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発法により修飾すること
ができる。発現させると、この突然変異核酸は、元の核酸によりコードされるタンパク質
と相同なポリペプチドをコードする。相同性は一般に、2つまたはこれを超える核酸また
はタンパク質(またはこれらの配列)の間の配列同一性から推定される。相同性を確立す
るのに有用な配列の間の同一性の、正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質と共に
変動するが、少なくとも25%の配列同一性を使用して、相同性を確立する。高レベルの
配列同一性、例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95
%、もしくは99%、またはこれを超える配列同一性もまた、相同性を確立するのに使用
することができる。
ポリペプチドの、2つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、「同一」または
「配列同一性」という用語は、指定された比較域にわたり、最大の照応関係についてアラ
イメントされた場合に同じである、2つの配列内の残基を指す。実施形態の1つのクラス
では、本明細書のポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、BLAS
TP(もしくはCLUSTAL、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア
)により測定される通り、基準ポリペプチドまたはこの断片と少なくとも80%、85%
、90%、98%の99%、または100%同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸
に照らして記載することもでき、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使
用する、BLASTN(もしくはCLUSTAL、または他の任意の利用可能なアライメ
ントソフトウェア)により測定される通り、基準核酸またはこの断片と50%、60%、
70%、75%、80%、85%、90%、98%、99%、または100%同一であり
うる。1つの分子が、大型の分子に対して、ある特定の百分率の配列同一性を有するとい
う場合、これは、2つの分子が最適にアライメントされれば、小型の分子内の、百分率の
残基は、2つの分子が最適にアライメントされた順序に従い、大型の分子内にマッチ残基
を見出すことを意味する。
「トランスポゾン」または「転移性エレメント」(TE)とは、ゲノム内のその位置を
変化させ、場合によって、突然変異を創出または保存し、細胞のゲノムサイズを変更する
、ベクターDNA配列である。転移は、TEの重複を結果としてもたらすことが多い。ク
ラスIのTEは、2段階でコピーされる:まず、クラスIのTEは、DNAからRNAへ
と転写され、次いで、産生されたRNAは、DNAへと逆転写される。次いで、この、コ
ピーされたDNAは、ゲノム内の新たな位置へと挿入される。逆転写ステップは、TE自
身によりコードされうる、逆転写酵素により触媒される。レトロトランスポゾンの特徴は
、HIVなどのレトロウイルスと同様である。クラスIIのTEによるカットアンドペー
スト転移機構は、RNA中間体を伴わない。転移は、いくつかのトランスポザーゼ酵素に
より触媒される。あるトランスポザーゼは、DNA内の任意の標的部位に非特異的に結合
するのに対し、他のトランスポザーゼは、特異的DNA配列標的に結合する。トランスポ
ザーゼは、標的部位において、互い違いの(staggered)切断をもたらす結果として、5
’側または3’側における、一本鎖のDNA突出(粘着(sticky)末端)をもたらす。こ
のステップは、DNAトランスポゾンを切り出し、次いで、DNAトランスポゾンは、新
たな標的部位へとライゲーションされるが、この過程は、ギャップを埋めるDNAポリメ
ラーゼの活性と、糖リン酸骨格をつなぎ合わせるDNAリガーゼの活性とを伴う。これは
、標的部位の重複を結果としてもたらす。DNAトランスポゾンの挿入部位は、標的DN
A内が互い違いに切断され、DNAポリメラーゼにより埋められることにより創出されう
る短い直接的なリピート、ならびにそれらに続く、トランスポザーゼによるTEの切出し
に重要な一連の逆位リピートにより同定されうる。細胞周期のS期において、ドナー部位
は既に複製されているが、標的部位はまだ複製されていない場合に転移が生じるとカット
アンドペーストTEは重複される。転移は、クラスI TEおよびクラスII TEのい
ずれにおいても、「自律型」または「非自律型」として分類することができる。自律型T
Eが、それ自身で移動しうるのに対し、非自律型TEは、移動するのに、別のTEの存在
を必要とする。これは、非自律型TEが、トランスポザーゼ(クラスIIの場合)または
逆転写酵素(クラスIの場合)を欠くためであることが多い。
「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機
構または複製性転移機構による、トランスポゾンの、ゲノムの別の部分への移動を触媒す
る酵素を指す。一部の実施形態では、トランスポザーゼの触媒活性を用いて、遺伝子を、
ベクターからゲノムへと移動させることができる。
本明細書で開示または想定される核酸配列およびベクターは、細胞へと、「トランスフ
ェクション」、「形質転換」、「ヌクレオフェクション」または「形質導入」により導入
することができる。本明細書で使用される「トランスフェクション」、「形質転換」、ま
たは「形質導入」とは、物理的方法または化学的方法を使用することによる、1または複
数の外因性ポリヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。当技術分野では、多くのトラ
ンスフェクション法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムDNA共沈殿法(例えば、
Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expr
ession Protocols, Humana Press (1991)を参照されたい);DEAE-デキストラン法
;電気穿孔法;カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法;タングステン粒子
促進型遺伝子銃法(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990));リン酸ストロンチウム共
沈殿法(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987));およびヌクレオフェ
クション(Trompeter et al., J. Immunol. Methods 274:245-256 (2003))を含む。ファ
ージベクターまたはウイルスベクターは、それらの多くが市販されている、適切なパッケ
ージング細胞内で、感染性粒子を増殖させた後で、宿主細胞へと導入することができる。
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す
。プロモーターは、DNAの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、
上流に(センス鎖の5’側領域に向かって)位置する。あるプロモーターが、細胞内の全
ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、
誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。
「プロモーター活性」という用語は、その活性が測定されるプロモーターに作動可能に
連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザ
ンブロット解析により、産生されるRNA転写物の量を決定することにより、直接的に測
定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列など、連結された核酸
配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接的に測定することもできる
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子
または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。
誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、
組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。
誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プ
ロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性
プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。一実施形
態では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部である。
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結
された核酸配列の転写を増大させるDNA配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコー
ド領域から、何キロベースも離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、DNA
のメチル化パターン、またはDNA構造の変化を媒介しうる。当技術分野では、様々な異
なる供給源に由来する、多数のエンハンサーが周知であり、クローニングされたポリヌク
レオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である(例え
ば、ATCCなどの寄託先のほか、他の商業的供給源または個人的供給源から)。プロモ
ーター(一般に使用されるCMVプロモーターなど)を含む、多数のポリヌクレオチドは
また、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流に位置する場合もあ
り、この中に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もある。「Igエンハンサー
」という用語は、免疫グロブリン(Ig)遺伝子座内にマップされるエンハンサー領域に
由来するエンハンサーエレメント(このようなエンハンサーは、例えば、重鎖(ミュー)
5’側エンハンサー、軽鎖(カッパ)5’側エンハンサー、カッパイントロンエンハンサ
ーおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに3’側エンハンサーを含む)を指す(
一般に、Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New Y
ork (1993), pages 353-363、および米国特許第5,885,827号明細書を参照され
たい)。
本明細書で使用される「コード配列」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドのセグメントを指す。領域または配列には、5’末端の近傍では、開始コドンが結合し
、3’末端の近傍では、終止コドンが結合する。コード配列はまた、オープンリーディン
グフレームと称することもできる。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、DNAセグメントの、別のDN
Aセグメントへの、物理的な連結および/または機能的な連結であって、セグメントが、
それらの意図される方式で機能することを可能とするような連結を指す。遺伝子産物をコ
ードするDNA配列は、それが、例えば、プロモーター、エンハンサー、および/または
サイレンサーなどの調節配列に、DNA配列の転写のモジュレーションを、直接的または
間接的に可能とする方式で連結されている場合に、調節配列に作動可能に連結されている
。例えば、DNA配列は、それが、プロモーターの転写開始部位に対して、下流において
、転写開始部位に対して、適正なリーディングフレーム内で、プロモーターへとライゲー
ションされており、DNA配列を通して、転写の伸長が進行することを可能とする場合に
、プロモーターに作動可能に連結されている。エンハンサーまたはサイレンサーは、それ
が、それぞれ、DNA配列の転写を増加または減少させるように、DNA配列へとライゲ
ーションされている場合に、遺伝子産物をコードするDNA配列に作動可能に連結されて
いる。エンハンサーおよびサイレンサーは、DNA配列のコード領域の上流に位置する場
合もあり、この下流に位置する場合もあり、この中に埋め込まれている場合もある。シグ
ナル配列が、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、シグナ
ル配列のDNAは、ポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結されている。DN
A配列の、調節配列への連結は、典型的に、適切な制限部位におけるライゲーションによ
り、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列内に挿入された、ア
ダプターまたはリンカーを介して達せられる。
「転写調節因子」という用語は、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性DNA
配列の転写を防止もしくは阻害するように作用する生化学的エレメント(例えば、リプレ
ッサータンパク質または核阻害性タンパク質)、または、ある特定の環境条件下で、プロ
モーター駆動性DNA配列の転写を可能とするか、もしくは刺激するように作用する生化
学的エレメント(例えば、インデューサーまたはエンハンサー)を指す。
「誘導」という用語は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモー
ターの活性、および/またはプロモーターの発現の、何らかの転写基礎レベルと比べた上
昇を指す。
「標的」遺伝子または「異種」遺伝子または「目的の遺伝子(GOI)」とは、遺伝子
導入により宿主細胞へと導入される遺伝子を指す。
本明細書で使用される「リコンビナーゼ」とは、規定された部位の間の部位特異的組換
えを容易としうる酵素群であって、部位が、単一のDNA分子上で物理的に隔てられてい
るか、または部位が、別個のDNA分子上に存在する、酵素群を指す。規定された組換え
部位のDNA配列は、必ずしも同一ではない。組換えの開始は、タンパク質-DNA間相
互作用に依存し、酵素群内には、ファージの組込みおよび切出し(例えば、λインテグラ
ーゼ、ΦC31)、環状プラスミドの切断(resolution)(例えば、Tn3、
ガンマデルタ、Cre、Flp)、代替的遺伝子の発現のためのDNAの反転(例えば、
Hin、Gin、Pin)、発生時における遺伝子(例えば、アナベナ属(Anabaena)に
よる窒素固定遺伝子)のアセンブリ、および転移(例えば、IS607トランスポゾン)
を触媒する、多数のタンパク質が存在する。大半の部位特異的リコンビナーゼは、進化的
類縁性および機構的類縁性に基づき、2つのファミリーのうちの1つに収まる。これらは
、λインテグラーゼファミリーまたはチロシンリコンビナーゼ(例えば、Cre、Flp
、XerD)、およびレゾルバーゼ/インテグラーゼファミリー、またはセリンリコンビ
ナーゼファミリー(例えば、ΦC31、TP901-1、Tn3、ガンマデルタ)である
「組換え接合部位」とは、本明細書で記載されるリコンビナーゼ酵素により認識される
、特異的ポリヌクレオチド配列である。典型的に、1つの部位が、標的核酸(例えば、真
核生物または原核生物の染色体またはエピソーム)内に存在し、別の部位が、標的組換え
部位において統合される核酸上に存在する、2つの異なる部位(「相補的部位」と称する
)が関与する。本明細書では、それぞれ、細菌標的およびファージドナーに由来する、接
合(または組換え)部位を指す、「attB」および「attP」という用語が使用され
るが、特定の酵素のための組換え部位は、異なる名称を有しうる。組換え部位は、典型的
に、コア領域またはスペーサー領域により隔てられた、左側アームおよび右側アームを含
む。したがって、attB組換え部位は、BOB’[配列中、BおよびB’は、それぞれ
、左側アームおよび右側アームであり、Oは、コア領域である]からなる。同様に、at
tPとは、POP’[配列中、PおよびP’は、アームであり、Oは、ここでもまた、コ
ア領域である]である。attB部位と、attP部位との組換え時、および標的におけ
る、同時の核酸の組込み時に、組み込まれるDNAを挟む組換え部位を、「attL」お
よび「attR」と称する。したがって、上記の用語法を使用する、attL部位および
attR部位は、それぞれ、BOP’およびPOB’からなる。本明細書における一部の
表示では、「O」を省き、attBおよびattPを、例えば、それぞれ、BB’および
PP’と呼ぶ。
「発現ベクター」または「ベクター」とは、細胞内のポリヌクレオチドの複製の自律的
単位として挙動する(すなわち、それ自身の制御下における複製が可能である)か、また
は宿主細胞の染色体への挿入により複製が可能となる、任意の遺伝子エレメント、例えば
、プラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであって、接合させたセグメントの複
製および/または発現をもたらすように、それへと、別のポリヌクレオチドセグメントを
接合させた遺伝子エレメントである。適切なベクターは、プラスミド、トランスポゾン、
バクテリオファージ、およびコスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターは、所望
の宿主細胞中へのベクターのライゲーションまたは挿入を実施し、接合させたセグメント
の発現を実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を含有しうる。このような配列は、宿
主生物に応じて異なり、転写を実施するプロモーター配列、転写を増加させるエンハンサ
ー配列、リボソーム結合性部位の配列、および転写翻訳終結配列を含む。代替的に、発現
ベクターは、ベクターの、宿主細胞のDNA配列へのライゲーションまたは組込みを伴わ
ずに、その中でコードされる核酸配列の産物を、直接発現させることが可能でありうる。
ベクターはまた、「選択用マーカー遺伝子」も含みうる。本明細書で使用される「選択
用マーカー遺伝子」という用語は、核酸配列を発現する細胞を、対応する選択用薬剤の存
在下で、これと順方向または逆方向に、特異的に選択することを可能とする核酸配列を指
す。当技術分野では、適切な選択用マーカー遺伝子が公知であり、例えば、国際特許出願
公開第1992/08796号パンフレットおよび同第1994/28143号パンフレ
ット、Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980)、O’Hare et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)、Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 78: 2072 (1981)、Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981
)、Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)、Kent et al., Science, 237: 901-903 (19
87)、Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977)、Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 48: 2026 (1962)、Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980)、ならびに米国特
許第5,122,464号明細書および同第5,770,359号明細書において記載さ
れている。
一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することが可能であり、適切な選
択的圧の存在下で、宿主細胞内のDNAの染色体外セグメントとして存続する、「エピソ
ーム発現ベクター」または「エピソーム」である(例えば、Conese et al., Gene Therap
y, 11:1735-1742 (2004)を参照されたい)。代表的な、市販のエピソーム発現ベクターは
、エプスタイン-バー核抗原1(EBNA1)およびエプスタイン-バーウイルス(EB
V)複製起点(oriP)を用いるエピソームプラスミドを含むがこれらに限定されない
。ベクターである、pREP4、pCEP4、pREP7、ならびにInvitroge
n(Carlsbad、Calif.)製のpcDNA3.1およびStratagen
e(LaJolla、Calif.)製のpBK-CMVは、EBNA1およびoriP
の代わりに、T抗原およびSV40の複製起点を使用する、エピソームベクターの非限定
的な例を表す。
「がん細胞」とは、既に記載されている通り、多段階腫瘍進行の初期、中期または末期
を経る細胞を指す(Pitot et al., Fundamentals of Oncology, 15-28 (1978))。これは
、「前がん」細胞を含む、腫瘍進行の初期、中期および末期にある細胞(すなわち、「過
形成」細胞および異形成細胞)、および異形成細胞の腫瘍進行の末期にある腫瘍細胞を含
む。
「転移性」がん細胞とは、がんの原発部位(すなわち、正常、過形成または異形成細胞
からがん細胞が最初に形成された位置)から、原発部位以外の部位へと移動したがん細胞
を指し、その部位において、移動したがん細胞が留まりかつ増殖する。
「がん」とは、卵巣がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、子宮頸がん、膵臓がん、大腸
がん、胃がん、食道がん、口腔がん、舌がん、歯肉がん、皮膚がん(例えば、メラノーマ
、基底細胞癌、カポジ肉腫等)、筋肉がん、心臓がん、肝臓がん、気管支がん、軟骨がん
、骨がん、精巣がん、腎臓がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、骨髄がん、リンパ
腫がん、脾臓がん、胸腺がん、甲状腺がん、脳がん、神経がん、中皮腫、胆嚢がん、眼が
ん(例えば、角膜のがん、ブドウ膜のがん、脈絡膜のがん、斑のがん、硝子体液がん等)
、関節がん(滑膜がんなど)、神経膠芽腫、リンパ腫、および白血病などの、転移性であ
ってもなくてもよい複数のがん細胞を指す。
MUC16
CA-125(がん抗原125、腫瘍抗原125、または炭水化物抗原125)または
ムチン16としてもまた公知の、MUC16は、糖タンパク質のムチンファミリーのメン
バーである。MUC16は、いくつかの異なるメカニズムによって、腫瘍形成および腫瘍
増殖の進行に役割を果たすことが示されている。MUC16に対する抗体ベースの手法は
、非常にわずかにしか成功していない。したがって、他の処置戦略が必要である。
MUC16は、CA125としても公知の、大炭水化物抗原である。MUC16は、ヒ
ト19番染色体に位置するMUC16遺伝子によってコードされる。MUC16は、3つ
のドメインを含む、高グリコシル化多ドメインI型膜貫通タンパク質である。C末端ドメ
インは、自己タンパク質分解活性を有する複数の細胞外SEA(ウニ精巣タンパク質、エ
ンテロキナーゼ、およびアグリン)モジュールを含有する。SEAは、膜貫通(TM)ド
メインの近傍に2つのタンパク分解性の部位を持つ。CA-125と称される大きな切断
されたドメインは、酸性pHで循環に放出される。CA-125は、卵巣がんの疾患バイ
オマーカーとして一般に使用される。高度に保存されたトランケート型細胞外膜はMUC
16エクトドメインと呼ばれるタンパク質ドメインを係留する。MUC16抗体は、腫瘍
細胞表面に保持されるMUC16のエクトドメインに特異的に結合することが同定された
。対象の細胞(がん細胞など)による「MUC16の過剰発現」は、対照細胞(例えば非
癌細胞、正常細胞等)と比較して高レベルの、対象の細胞によって発現されるMUC16
タンパク質および/またはmRNAを指す。
キメラ抗原受容体
本明細書で記載される実施形態では、CARは、標的認識のための細胞外抗体由来一本
鎖可変ドメイン(scFv)を含んでもよく、scFvは、膜貫通ドメインおよび/また
は、例えば、T細胞活性化のためのCD3ζを含む細胞内シグナル伝達ドメインに可撓性
リンカーによって連結されうる。通常、T細胞がin vivoで活性化されるとき、そ
れらは一次抗原誘導TCRシグナル伝達を、サイトカイン(すなわち、IL-2およびI
L-21)の産生を誘導し、次いでオートクライン/パラクライン様式でシグナル伝達ル
ープへとフィードバックするCD28からの二次共刺激シグナル伝達と共に受け取る。こ
のようにして、CARは、シグナル伝達ドメイン、例えば、CD28細胞質シグナル伝達
ドメイン、または4-1BBシグナル伝達ドメインなどの他の共刺激分子シグナル伝達ド
メインを含みうる。キメラCD28共刺激は、抗アポトーシス分子の上方制御およびIL
-2の産生、ならびに、末梢血単核細胞(PBMC)由来のT細胞の拡大増殖によってT
細胞の存続を改善する。
一実施形態では、MUC16の様々なエピトープに特異的なモノクローナル抗体由来の
単鎖可変断片(scFv)の融合体であり、例えば、膜貫通ドメインおよびCDゼータの
エンドドメインに融合させる。そのような分子は、その標的のscFvによる認識に応答
するゼータシグナルの伝達をもたらす。
ある実施形態では、CARはエクトドメイン(細胞外)、膜貫通ドメインおよびエンド
ドメイン(細胞内)を有しうる。CARエクトドメインの一実施形態では、シグナルペプ
チドは、新生タンパク質を小胞体へと方向付ける。これは、受容体が、例えばグリコシル
化され、細胞膜に係留された場合である。任意の真核生物のシグナルペプチド配列は、機
能性であると予想される。一般に、元々ほとんどの構成要素のアミノ末端に結合されるシ
グナルペプチドが使用される(例えば、軽鎖-リンカー-重鎖の方向性をもったscFv
では、軽鎖の天然のシグナルが使用される)。複数の実施形態では、シグナルペプチドは
、GM-CSFRa(配列番号58)またはIgK(配列番号59)である。使用されう
る他のシグナルペプチドは、CD8アルファおよびCD28由来のシグナルペプチドを含
む。
抗原認識ドメインは、scFvでありうる。しかし、代替物であってもよい。天然のT
細胞受容体(TCR)アルファおよびベータ単鎖由来の抗原認識ドメインは単一のエクト
ドメイン(例えばCD4エクトドメイン)ならびに連結された、例えばサイトカイン(サ
イトカイン受容体を保有する細胞の認識をもたらす)などの他の認識構成要素を有すると
予想される。例えば、ウイルス関連抗原などの所与の標的を、高親和性で結合するほとん
ど何でも抗原認識領域として使用されうる。
一般に、CARは二量体形態で存在し、細胞外scFv(VLに連結されたVH)領域
、ストークドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達モチーフに連結する融
合タンパク質として発現される。第1世代のCARのエンドドメインは、CD3-ζシグ
ナル伝達のみを介してT細胞活性化を誘導する。第2世代のCARは、CD3-ζおよび
CD28、または4-1BBもしくはOX40などの他のエンドドメインを介するシグナ
ル伝達の活性化をもたらす。第3世代のCARは、CD28、4-1BB、またはOX4
0などの3つのシグナル伝達モチーフのCD-3ζを含有する組合せを介してT細胞を活
性化する。
複数の実施形態では、本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグ
ナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。複数の実施形態では、
細胞外ドメインは、そうでなければ抗原結合性部分またはscFvおよびストークドメイ
ンと称する、標的特異的結合エレメントを含む。複数の実施形態では、細胞内シグナル伝
達ドメインまたはそうでなければ細胞質シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達領
域およびゼータ鎖部分を含む。
共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARの
部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効果的な応答に必要な抗原受容体以
外の細胞表面分子またはそれらのリガンドである。
複数の実施形態では、CARの細胞外ドメインと、膜貫通ドメインの間に、ストークド
メインまたはストーク領域が組み込まれる。本明細書で使用される「ストークドメイン」
または「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインをscFvまたはポリペ
プチド鎖の細胞質ドメインのいずれかに連結させるように機能する任意のオリゴヌクレオ
チド-またはポリペプチドを意味する。ストークドメインは、Fcヒンジなどの可撓性ヒ
ンジおよび任意選択で、Fcの1または2つの定常ドメインを含みうる。一部の場合には
、ストーク領域は、IgG1由来のヒンジ領域を含む。代替的な場合に、ストーク領域は
、免疫グロブリンのCH2CH3領域および任意選択で、CD3の部分を含む。場合によ
って、ストーク領域は、国際公開第2016/073755号パンフレットにおいて記載
されている、CD8αヒンジ領域、IgG4-Fc12アミノ酸ヒンジ領域(ESKYG
PPCPPCP)(配列番号196)、またはIgG4ヒンジ領域を含む。
他の実施形態では、CARの細胞外ドメインと、膜貫通ドメインの間に、スペーサーが
組み込まれる。スペーサーは、図3に描示されるストーク領域およびストーク伸長領域を
含みうる。一実施形態では、スペーサーは、単一のストーク領域を含みうる。別の実施形
態では、スペーサーは、ストーク領域(「s」として示される)および本明細書では「s
-n」として示されるストーク伸長領域を含みうる。例えば、スペーサーは、1つのスト
ーク領域、および、nが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、または20であってよい、s’-nを含み
うる。さらなる実施形態では、ストーク領域を、リンカーを介して、ストーク伸長領域s
’-nへと連結することができる。
膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、合成供給源に由来する場合もあ
る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タン
パク質に由来しうる。適切な膜貫通ドメインは、T細胞受容体の、アルファ鎖、ベータ鎖
、またはゼータ鎖の膜貫通領域を含む場合もあり、CD28、CD3イプシロン、CD3
ζ、CD45、CD4、CD5、CD8アルファ、CD9、CD16、CD22、CD3
3、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、またはCD1
54に由来する膜貫通領域を含む場合もある。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の場合
もあり、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含みうる。一部の実施形態では、合成
膜貫通ドメインの、一方または両方の末端では、フェニルアラニン、トリプトファン、お
よびバリンのトリプレットが見出される。任意選択で、一部の実施形態では、2~10ア
ミノ酸の間の長さである、短いオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリペプチドリンカー
は、CARの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成しうる
。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン-セリンリンカーである。一部の実施形態
では、膜貫通ドメインは、CD8α膜貫通ドメインまたはCD3ζ膜貫通ドメインを含む
。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8α膜貫通ドメインを含む。他の実施形
態では、膜貫通ドメインは、CD3ζ膜貫通ドメインを含む。
細胞内ドメインは、1または複数の共刺激ドメインを含みうる。例示的な共刺激ドメイ
ンは、CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10
、DAP12、OX40(CD134)、CD3-ゼータまたはこれらの断片もしくは組
合せを含むがこれらに限定されない。場合によって、本明細書で記載されるCARは、C
D8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP
12、OX40(CD134)、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺
激ドメインのうちの1もしくは複数、または2つもしくはこれを超えるものを含む。場合
によって、本明細書で記載されるCARは、CD27、CD28、4-1BB(CD13
7)、ICOS、OX40(CD134)、またはこれらの断片もしくは組合せから選択
される共刺激ドメインのうちの1もしくは複数、または2つもしくはこれを超えるものを
含む。場合によって、本明細書で記載されるCARは、CD8、CD28、4-1BB(
CD137)、DAP10、DAP12またはこれらの断片もしくは組合せから選択され
る共刺激ドメインのうちの1もしくは複数、または2つもしくはこれを超えるものを含む
。場合によって、本明細書で記載されるCARは、CD28、4-1BB(CD137)
、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの1もしくは
複数、または2つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載され
るCARは、共刺激ドメインであるCD28および4-1BB(CD137)、またはこ
れらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるCARは、共刺激ド
メインであるCD28およびOX40(CD134)、またはこれらのそれぞれの断片を
含む。場合によって、本明細書で記載されるCARは、共刺激ドメインであるCD8およ
びCD28、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載され
るCARは、共刺激ドメインであるCD28、またはこの断片を含む。場合によって、本
明細書で記載されるCARは、共刺激ドメインである4-1BB(CD137)、または
この断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるCARは、共刺激ドメインである
OX40(CD134)、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載される
CARは、共刺激ドメインであるCD8、またはこの断片を含む。一部の場合には、本明
細書で記載されるCARは、少なくとも1つの、共刺激ドメインであるDAP10、また
はこの断片を含む。一部の場合には、本明細書で記載されるCARは、少なくとも1つの
、共刺激ドメインであるDAP12、またはこの断片を含む。
本開示のCARの、細胞質ドメインとしてまた公知の細胞内シグナル伝達ドメインは、
CARを入れた免疫細胞の正常エフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化の一因
となる。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化機能を指す。T細胞のエフェク
ター機能は、例えば、細胞溶解活性の場合もあり、サイトカインの分泌を含むヘルパー活
性の場合もある。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェク
ター機能シグナルを伝達し、特化機能を実施するように、細胞を方向付ける、タンパク質
の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全体が用いられうるが、多くの場合
、鎖全体を使用することは必要でない。細胞内シグナル伝達ドメインの、トランケートさ
れた部分を使用し、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、このようなトラ
ンケートされた部分を、無傷鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シ
グナル伝達ドメインという用語とは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、
細胞内シグナル伝達ドメインの、任意のトランケートされた部分を含むことが意図される
。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、T細胞活性化のためのシグナル伝達ドメイン
をさらに含む。場合によって、T細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、TCRゼ
ータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、
CD5、CD22、CD79a、CD79b、またはCD66dに由来するドメインを含
む。場合によって、T細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する
ドメインを含む。
複数の実施形態では、本明細書では、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核
酸であって、CARが、(a)MUC16抗原結合性ドメイン;(b)ストークドメイン
;(c)膜貫通ドメイン;(d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激
シグナル伝達ドメイン;(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメイン;および任意選択で、
(f)トランケート型ヒト表皮増殖因子受容体(HER1tまたはHER1t1)を含む
、単離核酸が提示される。
本明細書で記載されるCARの機能的部分をコードする核酸配列が、本発明の範囲内に
含まれる。機能的部分は、例えば、親CARと同様の程度、これと同程度、またはこれよ
り高い程度に、標的細胞を認識する、または疾患を検出する、処置する、もしくは予防す
る能力を保持するCARのその一部を包含する。親CARをコードする核酸配列に関して
、CARの機能的部分をコードする核酸配列は、親CARのうちの、例えば、約10%、
25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%、またはこれを超える親CA
Rを含むタンパク質をコードしうる。
複数の実施形態では、CARは、部分のアミノ末端もしくはカルボキシル末端、または
両方の末端に追加のアミノ酸を含有し、その追加のアミノ酸は親CARのアミノ酸配列に
は見出されない。望ましくは、追加のアミノ酸は、機能的部分の生物学的活性、例えば、
標的細胞の認識、がんの検出、がんの処置または予防等と干渉しない。より望ましくは、
親CARの生物学的活性と比較して、追加のアミノ酸はCARの生物学的活性を増強する
本明細書で使用される「機能的変異体」という用語は、基準ポリペプチドに対する、実
質的または著名な配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドまたはタンパク質を
指し、それがその変異体である、基準ポリペプチドの生物学的活性を保持する。機能的変
異体は、例えば、本明細書で記載されるCAR(親CAR)の変異体であって、標的細胞
を、親CARと同様の程度、これと同程度、またはこれより高い程度に認識する能力を保
持する変異体を包含する。親CARをコードする核酸配列に照らして、CARの機能的変
異体をコードする核酸配列は、親CARをコードする核酸配列と、例えば、約10%同一
、約25%同一、約30%同一、約50%同一、約65%同一、約80%同一、約90%
同一、約95%同一、または約99%同一でありうる。
本明細書で記載されるCAR(機能的部分およびこれらの機能的変異体を含む)は、グ
リコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、N-アシル化、例えば
、ジスルフィド架橋を介する環化、または酸付加塩への転換および/または任意選択で、
二量体化または多量体化、またはコンジュゲート化を含む。
抗原結合性部分
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、そうでなければ、抗原結合性部
分と称する、標的特異的結合エレメントを含む。複数の実施形態では、細胞上の抗原に特
異的に結合する、所望の抗原結合性部分を操作することにより、目的の抗原をターゲティ
ングするように、本明細書で記載されるCARを操作する。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARの抗原結合性部分は、MUC16に
特異的である(MUC16 CAR)。MUC16特異的CARは、細胞表面上で発現す
ると、T細胞の特異性を、ヒトMUC16へとリダイレクトする。複数の実施形態では、
抗原結合性ドメインは、標的抗原特異的な、抗MUC16モノクローナル抗体の、可変ド
メイン軽鎖(VL)および可変ドメイン重鎖(VH)であって、グリシン-セリンリンカ
ーまたはホイットローリンカーなどの可撓性リンカーにより接続されたVLおよびVHを
含む単鎖抗体断片(scFv)を含む。複数の実施形態では、scFvは、MUC16-
1 scFv、MUC16-2 scFv、MUC16-3 scFv、MUC16-4
scFv、MUC16-5 scFv、MUC16-6 scFv、またはMUC16
-7 scFvである。複数の実施形態では、scFvはヒト化されている。一部の実施
形態では、抗原結合性部分は、例えば、N末端からC末端へと、VH-リンカー-VLま
たはVL-リンカー-VHと方向性をもって連結されたVHおよびVLを含みうる。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号1、3、5、7、9、
12、および14(MUC16 VL)に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか1つと
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、VLポリペプチドを含む抗原結合性部
分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号2、4、6、8、10
、11、13、および15(MUC16 VH)に示されるアミノ酸配列のうちのいずれ
か1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、9
7%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VHポリペプチドを含む抗原
結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、Gly-Serリンカー(配列
番号83または配列番号197)またはリンカーの機能的変異体を伴う、抗原結合性部分
VL(配列番号1、3、5、7、9、12、または14)およびVH(配列番号2、4、
6、8、10、11、13、または15)を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号25~57(VH、V
L、およびリンカー)に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか1つとの、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号2(MUC16-1
VH)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VHポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号1(MUC16-1
VL)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VLポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号4(MUC16-2
VH)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VHポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号3(MUC16-2
VL)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VLポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号6(MUC16-3
VH)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VHポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号5(MUC16-3
VL)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VLポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号8(MUC16-4
VH)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VHポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号7(MUC16-4
VL)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VLポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号10(MUC16-5
VH-L)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%
、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VHポ
リペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号11(MUC16-5
VH-F)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%
、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VHポ
リペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号9(MUC16-5
VL)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VLポリペプ
チドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号13(MUC16-6
VH)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、9
5%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VHポリペ
プチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号12(MUC16-6
VL)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、9
5%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VLポリペ
プチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号15(MUC16-7
VH)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、9
5%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VHポリペ
プチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号14(MUC16-7
VL)のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、9
5%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、VLポリペ
プチドを含む抗原結合性部分を含む。
複数の実施形態では、抗原結合性部分は、配列番号58のアミノ酸配列との、少なくと
も90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%
、または100%の同一性を有する、GM-CSFRaシグナルペプチドを有する。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号27のアミノ酸配列と
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるCARは、配列番号28のアミノ酸配列との、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるCARは、配列番号29のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号30のアミノ酸配列と
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号31のアミノ酸配列と
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるCARは、配列番号32のアミノ酸配列との、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるCARは、配列番号33のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号34のアミノ酸配列と
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるCARは、配列番号35のアミノ酸配列との、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるCARは、配列番号36のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号37のアミノ酸配列と
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるCARは、配列番号38のアミノ酸配列との、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるCARは、配列番号39のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号40のアミノ酸配列と
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるCARは、配列番号41のアミノ酸配列との、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるCARは、配列番号42のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号43のアミノ酸配列と
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるCARは、配列番号44のアミノ酸配列との、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるCARは、配列番号45のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号46のアミノ酸配列と
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるCARは、配列番号47のアミノ酸配列との、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるCARは、配列番号48のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号49のアミノ酸配列と
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるCARは、配列番号50のアミノ酸配列との、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるCARは、配列番号51のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号52のアミノ酸配列と
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるCARは、配列番号53のアミノ酸配列との、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるCARは、配列番号54のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、配列番号55のアミノ酸配列と
の、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態
では、本明細書で記載されるCARは、配列番号56のアミノ酸配列との、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書で
記載されるCARは、配列番号57のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有する、ポリペプチドを含む。
ストークドメイン
複数の実施形態では、本発明のMUC16 CARは、抗原結合性部分と、T細胞膜と
の間の分離をもたらすストークドメインを含む。複数の実施形態では、ストークドメイン
は、最適なエフェクター-標的膜間距離を確立する。複数の実施形態では、ストークドメ
インは、その標的に到達するように抗原結合性ドメインに可撓性をもたらす。一実施形態
では、ストークドメインは、CD8アルファヒンジドメインである。
複数の実施形態では、CD8アルファヒンジドメインは、配列番号16のアミノ酸配列
との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、
98%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。
スペーサー
他の実施形態では、CARの細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとの間に、スペーサー
が組み込まれる。本明細書で記載されるように、スペーサーは、図3で描示されるストー
ク領域およびストーク伸長領域を含みうる。一実施形態では、スペーサーは、単一のスト
ーク領域を含みうる。別の実施形態では、スペーサーは、ストーク領域(「s」として示
される)および本明細書では「s-n’」として示されるストーク伸長領域を含みうる。
例えば、スペーサーは、1つのストーク領域、および、nが0、1、2、3、4、5、6
、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または
20であってよい、s’-nを含みうる。さらなる実施形態では、ストーク領域を、リン
カーを介して、ストーク伸長領域s’-nへと連結することができる。本明細書で記載さ
れるリンカーは、例えば、GSGリンカー(配列番号85)、SGSGリンカー(配列番
号86)、(G4S)3リンカー(配列番号83)、(G4S)4リンカー(配列番号2
00)、および/またはホイットローリンカーを含みうる。
一実施形態では、ストーク領域およびストーク伸長領域は、天然起源のポリペプチドに
由来または指定される場合もあり、合成起源のポリペプチドに由来または指定される場合
もある。ストーク領域および/またはストーク伸長領域は、細胞表面タンパク質またはこ
れらの誘導体もしくは変異体に由来するヒンジドメインを含みうる。一部の実施形態では
、ストーク領域および/またはストーク伸長領域は、CD28またはCD8アルファ(C
D8α)に由来するヒンジドメインを含みうる。一部の実施形態では、各ストーク領域お
よびストーク伸長領域は、CD8アルファヒンジドメイン、CD28ヒンジドメイン、C
TLA-4ヒンジドメイン、LNGFR細胞外ドメイン、IgG1ヒンジ、IgG4ヒン
ジ、およびCH2-CH3ドメインのうちの少なくとも1つに由来しうる。ストーク領域
およびストーク伸長領域は、CD8アルファヒンジドメイン、CD28ヒンジドメイン、
CTLA-4、LNGFR細胞外ドメイン、IgG1ヒンジ、IgG4ヒンジ、またはC
H2-CH3ドメインのうちの任意の組合せに個別に由来しうる。例としては、ストーク
領域は、CD8アルファヒンジドメインに由来してもよく、少なくとも1つのストーク伸
長領域は、CD28ヒンジドメインに由来してもよく、したがってハイブリッドスペーサ
ーを生じる。別の例としては、ストーク領域は、IgG1ヒンジまたはIgG4ヒンジに
由来してもよく、少なくとも1つのストーク伸長領域は、IgGのCH2-CH3ドメイ
ンに由来してもよい。
ある特定の実施形態では、ストーク領域は、1または複数の二量体化部位を含み、ホモ
またはヘテロ二量体化キメラポリペプチドを形成しうる。他の実施形態では、ストーク領
域または1もしくは複数のストーク伸長領域は、二量体化部位を完全に消失する変異を含
有しうる。一部の実施形態では、ストーク伸長領域は、ストーク領域と比較して少なくと
も1つ少ない二量体化部位を含有しうる。例えば、ストーク領域が2つの二量体化部位を
含む場合、ストーク伸長領域は1または0の二量体化部位を含みうる。別の例としては、
ストーク領域が1つの二量体化部位を含む場合、ストーク伸長領域はゼロの二量体化部位
を含みうる。一部の例では、ストーク伸長領域は、二量体化部位を欠損する。
本明細書で開示される実施形態の一部の態様では、対象抗原結合ポリペプチドのストー
ク領域は、CD8アルファヒンジドメインに対する、少なくとも約65%、70%、75
%、80%、85%、90%、95%、99%またはこれを超える同一性を伴う配列を含
む。CD8アルファヒンジドメインは、配列番号16に示される配列に対する、少なくと
も65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%またはこれを超え
る同一性を伴うポリペプチド配列を含みうる。場合によって、ストーク伸長領域は、配列
番号16に示される配列に対する、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%
、90%、95%、またはこれを超える同一性を伴うポリペプチド配列を含む。場合によ
って、ストーク伸長領域は、配列番号108に示される配列に対する、少なくとも65%
、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはこれを超える同一性を伴う
ヌクレオチド配列を含む。一部の例では、ストーク領域およびストーク伸長領域は、配列
番号16に示される配列に対する、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%
、90%、95%、またはこれを超える同一性を伴うポリヌクレオチド配列を共に含みう
る。
膜貫通ドメイン
複数の実施形態では、CARは、CARストークドメインの細胞外ドメインに融合され
る膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、CARのドメインの1つと天然では会合する
膜貫通ドメインが使用される。複数の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜を貫通する疎
水性アルファヘリックスである。
膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、合成供給源に由来する場合もあ
る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タン
パク質に由来しうる。本発明で特に使用される膜貫通領域は、T細胞受容体の、アルファ
鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD
5、CD8アルファ、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、C
D80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来する(すなわち、これら
の少なくとも膜貫通領域を含む)場合もある。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の場合
もあり、この場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を優先的に含む。複数の実施
形態では、合成膜貫通ドメインの各端では、フェニルアラニン、トリプトファン、および
バリンのトリプレットが見出される。任意選択で、複数の実施形態では、2~10アミノ
酸の間の長さである、短いオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、
CARの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成しうる。複
数の実施形態では、リンカーは、グリシン-セリンリンカーである。
複数の実施形態は、本明細書で記載されるCARの膜貫通ドメインは、CD8アルファ
膜貫通ドメインである。複数の実施形態では、CD8アルファ膜貫通ドメインは、配列番
号20のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチド
を含む。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARの膜貫通ドメインは、CD28膜貫
通ドメインである。複数の実施形態では、CD28膜貫通ドメインは、配列番号21のア
ミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%
、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチドを含む。
細胞質ドメイン(共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメイン)
本明細書で記載されるCARの細胞内シグナル伝達ドメインとしてまた公知の細胞質ド
メインは、CARを入れた免疫細胞の正常エフェクター機能のうちの少なくとも1つの活
性化の一因となる。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化機能を指す。T細胞
のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性の場合もあり、サイトカインの分泌を含む
ヘルパー活性の場合もある。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は
、エフェクター機能シグナルを伝達し、特化機能を実施するように、細胞を方向付ける、
タンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全体が用いられうるが、
多くの場合、鎖全体を使用することは必要ではない。細胞内シグナル伝達ドメインの、ト
ランケートされた部分を使用し、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、こ
のようなトランケートされた部分を、無傷鎖の代わりに使用することができる。したがっ
て、細胞内シグナル伝達ドメインという用語とは、エフェクター機能シグナルを伝達する
のに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの、任意のトランケートされた部分を含むこと
が意図される。
本明細書で記載されるCARでの使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗
原受容体結合後にシグナル伝達を開始するのに共に作用するT細胞受容体(TCR)およ
び共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体および同じ
機能的能力を有する任意の合成配列を含みうる。
TCR単独を介して生成されるシグナルは、通常、T細胞の完全な活性化には不十分で
あり、二次シグナルまたは共刺激シグナルもまた必要である。したがって、T細胞活性化
は、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されうる:TCRを介し
て抗原依存的な一次活性化を開始するもの(一次細胞質シグナル伝達配列)および抗原非
依存的な方法で二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすように作用するもの(二次
細胞質シグナル伝達配列)。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激する方法、または阻害する方法のいずれかでTC
R複合体の一次活性化を制御する。刺激する方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列
は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはITAMとして公知の、シグナル伝
達モチーフを含有しうる。
本発明での特定の使用のための、一次細胞質シグナル伝達配列を含有する、ITAMの
例は、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD
3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d由来のも
のを含む。複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARの細胞質シグナル伝達分子
は、CD3ゼータ由来の細胞質シグナル伝達配列を含む。
複数の実施形態では、CARの細胞質ドメインは、それ自体により、または本明細書で
記載されるCARの文脈において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて
、CD3-ゼータシグナル伝達ドメインを含むように指定されうる。例えば、CARの細
胞質ドメインは、CD3ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含みうる。共刺激
シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの部分を指す。共刺激
分子は、抗原に対するリンパ球の十分な応答に必要な、抗原受容体またはそれらのリガン
ド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例は、CD27、CD28、4-1BB
(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関
連抗原-1(FA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、DA
P10、DAP12、およびCD83と特異的に結合するリガンド等を含む。複数の実施
形態では、共刺激分子が共に使用されうる、例えば、CD28と4-1BBまたはCD2
8とOX40。したがって、本発明は、共刺激シグナル伝達エレメントとして主に4-1
BBとCD28によって例示されるが、他の共刺激エレメントも本発明の範囲内である。
本明細書で記載されるCARの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は
ランダムな順序または特定の順序で互いに連結されうる。任意選択で、2~10アミノ酸
の間の長さである、短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーは、連結を形成しう
る。グリシン-セリン対は、特定の適切なリンカーをもたらす。
一実施形態では、細胞質ドメインは、CD3ゼータのシグナル伝達ドメインおよびCD
28のシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、細胞質ドメインは、CD3ゼー
タのシグナル伝達ドメインおよび4-1BBのシグナル伝達ドメインを含む。さらに別の
実施形態では、細胞質ドメインは、CD3ゼータのシグナル伝達ドメインならびにCD2
8および4-1BBのシグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、本明細書で記載されるCARの細胞質ドメインは、4-1BBのシグ
ナル伝達ドメインおよびCD3ゼータのシグナル伝達ドメインを含み、4-1BBのシグ
ナル伝達ドメインは、配列番号22のポリペプチド配列との、少なくとも90%、91%
、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%
の同一性を有する、ポリペプチド配列を含み、CD3ゼータのシグナル伝達ドメインは、
配列番号26の核酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、9
5%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する、ポリペプチ
ド配列を含む。
一実施形態では、本明細書で記載されるCARの細胞質ドメインは、CD28のシグナ
ル伝達ドメインおよびCD3ゼータのシグナル伝達ドメインを含むようにデザインされ、
CD28のシグナル伝達ドメインは、配列番号23のポリペプチド配列との、少なくとも
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、
または100%の同一性を有する、ポリペプチド配列を含み、CD3ゼータのシグナル伝
達ドメインは、配列番号26のポリペプチド配列との、少なくとも90%、91%、92
%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一
性を有する、ポリペプチド配列を含む。
一実施形態では、本明細書で記載されるCARの細胞質ドメインは、4-1BBのシグ
ナル伝達ドメインおよびCD3ゼータのシグナル伝達ドメインを含み、4-1BBのシグ
ナル伝達ドメインは、配列番号22に記載のアミノ酸配列を含み、CD3ゼータのシグナ
ル伝達ドメインは、配列番号26に記載のアミノ酸配列を含む。
さらなる遺伝子エレメント
細胞療法は、ヒト疾患の処置のために、極めて有望であるが、細胞自体またはそれらの
トランス遺伝子産物に由来する著明な毒性は、臨床的探索を妨げている。本明細書で記載
される、複数の実施形態では、哺乳動物対象、例えば、ヒトへと輸注された、本明細書で
記載されるCARを含む免疫エフェクター細胞は、それらの使用から、毒性が生じる場合
は、このような免疫エフェクター細胞の効果を調節するために、枯渇させることができる
。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、MUC16特異的キメ
ラ抗原受容体に加えて、第2の遺伝子もまた、本明細書で記載される、操作免疫エフェク
ター細胞へと導入される。第2の遺伝子は、効果的に、MUC16 CARまたはMUC
16 CAR/mbIL-15を含有する細胞の枯渇を可能とする、「キルスイッチ」で
ある。ある特定の実施形態では、「キルスイッチ」とは、HER1またはCD20の、少
なくとも1つの抗体結合性エピトープまたはその機能的断片と、任意選択で、シグナルポ
リペプチド配列またはその断片とを含むHER1ポリペプチドまたはCD20ポリペプチ
ドを含むHER1タグまたはCD20タグである。
ある特定の実施形態では、第2の遺伝子は、表皮増殖因子受容体(HER1)またはこ
の断片もしくは変異体である、HER1タグである。複数の実施形態では、第2の遺伝子
は、トランケート型ヒト表皮増殖因子受容体1(例えば、HER1tまたはHER1t1
)である、HER1タグである。場合によって、第2の遺伝子は、ヒトトランケート型ヒ
ト表皮増殖因子受容体1の変異体である。複数の実施形態では、HER1、HER1t、
およびHER1t1のうちの少なくとも1つは、FDAにより承認されているセツキシマ
ブ、またはHER1、HER1t、および/もしくはHER1t1を認識する任意の抗体
の投与を介して、輸注されたCAR-T細胞の枯渇を可能にすることにより、安全性機構
をもたらす。複数の実施形態では、HER1t遺伝子は、配列番号65の核酸配列との、
少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%
、99%、または100%の同一性を有する、ヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態
では、HER1t1遺伝子は、配列番号66の核酸配列との、少なくとも90%、91%
、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%
の同一性を有する、ヌクレオチド配列を含む。トランケート型HER1配列、例えば、H
ER1tおよびHER1t1は、セツキシマブの、受容体への結合を無傷に保ちながら、
EGFリガンドへの結合、EGFRのホモ二量体化およびヘテロ二量体化、ならびにEG
FR媒介性シグナル伝達の潜在的可能性を消失させる(Ferguson, K., 2008. A structur
e-based view of Epidermal Growth Factor Receptor regulation. Annu Rev Biophys, V
olume 37, pp. 353-373)。
さらなる実施形態では、本発明の、治療用のMUC16に特異的なキメラ抗原受容体に
加えて、導入される第2の遺伝子は、CD20タグである。場合によって、CD20タグ
は、全長CD20ポリペプチド、またはトランケート型CD20ポリペプチド(CD20
t-1)である。場合によって、CD20タグ、例えば、CD20またはCD20t-1
はまた、FDAにより承認されているリツキシマブ療法の投与を介して、輸注されたCA
R-T細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構も可能とする。ある特定の実施形
態では、CD20タグは、配列番号36の配列と、少なくとも90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を
有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、CD20タグは、CD20
t-1タグであり、配列番号6の配列と、少なくとも90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポ
リペプチド配列を有する。一部の実施形態では、CD20タグは、配列番号160の核酸
配列と、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%
、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、CD20
遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、CD20タグは、配列番号160の
核酸配列と、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、9
7%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、CD
20t-1遺伝子によってコードされる。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARを含むCARベクターは、配列番号
159の核酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する核酸配列を含む全長
CD20タグをさらに含む。
複数の実施形態では、キルタグ、例えば、HER1t、HER1t-1、CD20、ま
たはCD20t-1タグをコードする遺伝子を、MUC16 CARへと、インフレーム
の、3’端に、例えば、トセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス(T2A)ペプチ
ドであるがこれらに限定されない、自己切断型ペプチドを介して、遺伝子融合させる。複
数の実施形態では、T2Aペプチドは、配列番号72のアミノ酸配列との、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
複数の実施形態では、キルタグ遺伝子を、MUC16 CAR遺伝子とインフレームで
、レンチウイルスプラスミド骨格へとクローニングする。他の実施形態では、キルタグを
、別個のレンチウイルスベクターへとクローニングする。他の実施形態では、両方の遺伝
子を、Sleeping Beautyトランスポゾンベクターへとクローニングする。
さらに他の実施形態では、HER1t、HER1t-1、CD20またはCD20t-1
などのキルタグを、別個のSleeping Beautyトランスポゾンベクターへと
クローニングする。ある特定の実施形態では、キルタグは、シグナルペプチド、例えば、
GM-CSFRaシグナルペプチドを有し、この場合、GMーCSFRaシグナルペプチ
ドは、配列番号58のアミノ酸配列と、少なくとも90%、91%、92%、93%、9
4%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する。あ
る特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号59の核酸配列と、少なくとも9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、ま
たは100%の同一性を有する、IgK配列である。場合によって、シグナルペプチドは
、IgE、CD8α変異体およびこれらの断片から選択することができる。
本明細書で記載されるCARおよびキルタグをコードする例示的な遺伝子発現カセット
が図1および図2に示される。
例示的なCARのオープンリーディングフレーム
本明細書で記載される方法および組成物によって包含される例示的なCARおよびヒト
MUC16受容体のオープンリーディングフレームは、表1に列挙する:
複数の実施形態では、本明細書では、CARをコードする単離核酸であって、CARが
、配列番号3~4または配列番号5~6のアミノ酸との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有するポリペプチドを含む、単離核酸が提示される。
「MUC16-2 scFv」を伴って表1に列挙された実施形態の各々では、CAR
抗原結合性部分は、配列番号3~4のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同
一性を有するポリペプチドを含む、MUC16-2 scFvである。複数の実施形態で
は、MUC16-3 scFvは、配列番号58のアミノ酸配列との、少なくとも90%
、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または
100%の同一性を有するGM-CSFRaシグナルペプチドを有する。
「CD8a」を伴う表1の実施形態の各々では、CARの膜貫通領域は、配列番号20
のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、9
6%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、
CD8アルファ膜貫通ドメインを含み、ストークドメインは、配列番号16のアミノ酸配
列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%
、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含むCD8aである
「CD28m」を伴う表1の実施形態の各々では、CARの細胞内ドメインは、配列番
号21のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を
伴うCD28を含む。
「T2A」を伴う表1の実施形態の各々では、CARのORFは、単一のベクターから
の複数の遺伝子産物の産生を可能にする、自己切断型トセア・アシグナ(Thosea asigna
)ウイルス(T2A)ペプチドを含む。複数の実施形態では、T2Aペプチドは、配列番
号72のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を
有する。
「HER1t」を伴う表1の実施形態では、CARのORFは、FDAにより承認され
ているセツキシマブ療法の投与を介して、輸注されたCAR-T細胞の枯渇を可能にする
ことにより、安全性機構をもたらす、トランケート型ヒト上皮増殖因子受容体1(HER
1t)を含む。本明細書で記載されるHER1t遺伝子は、配列番号65のアミノ酸配列
との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、
98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド配列を含みうる。表1に
、そうでないことが記されない限りにおいて、HER1tタグは、GM-CSFRaシグ
ナルペプチド(「GM-CSFRsp」)(配列番号58)を有する。ある特定の実施形
態では、HER1tは、別のタグ、例えば、HER1t-1と置換されうる。本明細書で
記載されるHER1t-1遺伝子は、配列番号66のアミノ酸配列との、少なくとも90
%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、また
は100%の同一性を有するポリペプチド配列を含みうる。「IgKsp」を伴う表1の
実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号59のアミノ酸配列との、少なくとも90
%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、また
は100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するIgKである。
「4-1BB」を伴う表1の実施形態では、CARのORFは、配列番号22のアミノ
酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、9
7%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド配列を有する共刺
激分子を含む。
「FL CD20」を伴う表1の実施形態では、CARのORFは、配列番号67のア
ミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%
、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、
全長CD20タグを含む。CD20は、FDAにより承認されているセツキシマブ療法の
投与を介して、輸注されたCAR-T細胞の枯渇を可能にすることにより、安全性機構を
もたらす。他の実施形態では、FL CD20は、配列番号68のアミノ酸配列との、少
なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
99%、または100%の同一性を有するポリペプチド配列を含むCD20t-1によっ
て置換されうる。
表1のある特定の実施形態では、CARのORFは、遺伝子転写のための、誘導性プロ
モーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガ
ンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、RHEOS
WITCH(登録商標)遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、2つのポリペプ
チドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。一部の実施形態では
、CARのORFおよび遺伝子スイッチ構成要素は、図1~2で描示されるように構成さ
れうる。
サイトカイン
一部の実施形態では、本明細書で記載されるCARは、サイトカインを含むが、限定さ
れない、1または複数のさらなる治療剤と共に対象に投与される。場合によって、サイト
カインは、少なくとも1つのケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホ
カイン、腫瘍壊死因子、またはこれらの変異体もしくは組合せを含む。場合によって、サ
イトカインは、インターロイキンである。場合によって、インターロイキンは、IL-1
、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9
、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-
16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、I
L-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29
、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、ならびにこれらの機能的な変異体
および断片のうちの少なくとも1つである。一部の実施形態では、サイトカインは、膜結
合型の場合もあり、分泌型の場合もある。複数の実施形態では、サイトカインは、可溶性
IL-15、可溶性IL-15/可溶性IL-15Rα複合体(例えば、ALT-803
)である。ある特定の場合では、インターロイキンは、膜結合型IL-15(mbIL-
15)またはIL-15とIL-15Rαの融合体を含みうる。一部の実施形態では、m
bIL-15は、本明細書で記載される改変免疫エフェクター細胞を用いて共発現させう
る、膜結合型キメラIL-15である。一部の実施形態では、mbIL-15は、全長I
L-15Rα、またはこれらの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させた
、全長IL-15(例えば、天然IL-15ポリペプチド)、またはこれらの断片もしく
は変異体を含む。場合によって、IL-15を、IL-15Rαへと、リンカーを介して
、間接的に連結する。場合によって、mbIL-15は、Hurton et al., “Tethered IL
-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-
specific T cells,” PNAS 2016において記載されている通りである。場合によって、サ
イトカインは、CARと同じ免疫エフェクター細胞で発現させる。
さらなる実施形態では、本明細書で記載されるCARを発現する免疫エフェクター細胞
は、膜結合型IL-15(「mIL-15またはmbIL-15」)を発現する。本発明
の態様では、mbIL-15は、IL-15と、IL-15Rαの間の融合タンパク質を
含む。さらなる実施形態では、mbIL-15は、配列番号69のアミノ酸配列との、少
なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の場合では、C
ARおよびサイトカインは、別個のベクターで発現させる。特定の場合では、ベクターは
、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはSleeping Bea
utyトランスポゾンでありうる。
一部の実施形態では、mbIL-15は、本明細書で記載されるHER1t、HER1
t-1、CD20t-1、またはCD20などの細胞タグと共に発現される。mbIL-
15は、HER1t、HER1t-1、CD20t-1、またはCD20と共にインフレ
ームで発現されうる。
一部の実施形態では、mbIL-15は、遺伝子転写のための誘導性プロモーターの制
御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの、リガンド誘導
性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、RHEOSWITC
H(登録商標)遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、2つのポリペプチドによ
る、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
別の態様では、インターロイキンは、IL-12を含みうる。一部の実施形態では、I
L-12は、単鎖IL-12(scIL-12)、プロテアーゼ感受性IL-12、不安
定化IL-12、膜結合型IL-12、挿入IL-12である。一部の場合には、IL-
12変異体は、それらの全てが、参照によりそれらの全体において組み込まれる、国際公
開第2015/095249号パンフレット、国際公開第2016/048903号パン
フレット、国際公開第2017/062953号パンフレットにおいて記載されている通
りである。
一部の実施形態では、上記で記載したサイトカインは、遺伝子転写のための誘導性プロ
モーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチのリ
ガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、RHEO
SWITCH(登録商標)遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、2つのポリペ
プチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
遺伝子スイッチ
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチド、リガンド誘導性遺伝子スイッチポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリペプチドおよび/またはポリ
ヌクレオチドを組み込む方法および系が提示される。「遺伝子スイッチ」という用語は、
プロモーターと関連する応答エレメントの組合せを指し、例えば、1または複数のリガン
ドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターを組み込んだ遺伝子の発現をモジュレ
ートする、エクジソン受容体(EcR)ベースの系を指す。緊密に調節された誘導性遺伝
子発現系または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールのタンパク質の作
製、細胞ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的なゲノミクス、な
らびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形質の調節など、
多様な適用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘導性異種遺伝子
発現系を含みうる。
EcRベースの遺伝子スイッチの初期形は、キイロショウジョウバエ(Drosophila mel
anogaster)EcR(DmEcR)ポリペプチドおよびマウス(Mus musculus)RXR(
MmRXR)ポリペプチドを使用し、これらの受容体が、ステロイドであるポナステロン
Aの存在下で、哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウスにおいて、レポーター遺
伝子をトランス活性化させることを示した(Christopherson et al., 1992;No et al.,
1996)。その後、Suhr et al., 1998は、非ステロイド系のエクジソンアゴニストである
テブフェノジドが、外因性ヘテロ二量体パートナーの非存在下で、カイコ(Bombyx mori
)EcR(BmEcR)を介して、哺乳動物細胞内のレポーター遺伝子の、高レベルのト
ランス活性化を誘導することを示した。
PCT国際特許出願/米国出願第97/05330号明細書(国際公開第97/381
17号パンフレット)およびPCT国際特許出願/米国出願第99/08381号明細書
(国際公開第99/58155号パンフレット)は、外因性遺伝子の発現をモジュレート
するための方法であって、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むDNA構
築物が、それに対するリガンドの存在下で、かつ、任意選択で、サイレントパートナーと
して作用することが可能な受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して、遺
伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む、第2のDNA構築物により活性化する方法
について開示している。この例では、エクジソン受容体を、キイロショウジョウバエ(Dr
osophila melanogaster)から単離した。典型的に、このような系は、最適の活性化をも
たらすために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドX受容体(RXR)の存在
を必要とする。哺乳動物細胞内では、昆虫エクジソン受容体(EcR)は、哺乳動物レチ
ノイドX受容体(RXR)と、ヘテロ二量体化し、これにより、標的遺伝子または異種遺
伝子の発現を、リガンド依存的に調節するのに使用することが可能である。PCT国際特
許出願/米国出願第98/14215号明細書(国際公開第99/02683号パンフレ
ット)は、カイコガであるカイコ(Bombyx mori)から単離されたエクジソン受容体が、
外因性の二量体パートナーを必要とせずに、哺乳動物系内で機能的であることについて開
示している。
米国特許第6,265,173号明細書は、受容体のステロイド/甲状腺スーパーファ
ミリーの多様なメンバーを、遺伝子発現系における使用のための、USPの、少なくとも
二量体化ドメインを含むキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)ウルトラ
スピラクル受容体(USP)またはこの断片と組み合わせうることについて開示している
。米国特許第5,880,333号明細書は、植物において使用された、キイロショウジ
ョウバエ(Drosophila melanogaster)のEcRおよびウルトラスピラクル(USP)に
よるヘテロ二量体系であって、トランス活性化ドメインおよびDNA結合性ドメインが、
2つの異なるハイブリッドタンパク質上に位置する、ヘテロ二量体系について開示してい
る。これらの場合の各々では、トランス活性化ドメインおよびDNA結合性ドメイン(P
CT国際特許出願/米国出願第98/14215号明細書における通りに、天然のEcR
として、またはPCT国際特許出願/米国出願第97/05330号明細書における通り
に、修飾EcRとして)を、単一の分子へと組み込み、USPまたはRXRである、他の
ヘテロ二量体パートナーを、それらの天然状態において使用した。
PCT国際特許出願/米国出願第01/0905号明細書は、トランス活性化ドメイン
と、DNA結合ドメインとを2つの異なるタンパク質上に置くことにより互いから隔てた
、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系が、リガンドの非存在下で、バックグラ
ウンド活性の大幅な低減を結果としてもたらし、リガンドの存在下で、バックグラウンド
を上回る活性の著明な増大を結果としてもたらすことについて開示している。この2ハイ
ブリッド系は、PCT出願/米国出願第97/05330号明細書およびPCT出願/米
国出願第98/14215号明細書の出願において開示されている、2つの系と比較して
、著明に改善された誘導性遺伝子発現モジュレーション系である。2ハイブリッド系は、
DNA結合性ドメインが、遺伝子上のDNA結合性部位に結合すると、トランス活性化ド
メインが、プロモーターを、より効果的に活性化させるように、相互作用タンパク質の対
が、転写活性化ドメインを、DNA結合性ドメインに対して、より好適な位置に置く能力
を利用すると考えられる(例えば、米国特許第5,283,173号明細書を参照された
い)。2ハイブリッド遺伝子発現系は、核内受容体ポリペプチドへと融合させたDNA結
合性ドメインをコードする、第1の遺伝子発現カセット、および異なる核内受容体ポリペ
プチドへと融合させたトランス活性化ドメインをコードする、第2の遺伝子発現カセット
である、2つの遺伝子発現カセットを含む。リガンドの存在下では、第1のポリペプチド
の、第2のポリペプチドとの相互作用を促進するコンフォメーション変化が誘導され、こ
れにより、DNA結合性ドメインと、トランス活性化ドメインとの二量体化が結果として
もたらされると考えられる。DNA結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは、2
つの異なる分子上に存在するので、リガンドの非存在下では、バックグラウンド活性が、
大幅に低減される。
2ハイブリッド系のある特定の修飾はまた、ステロイド性リガンド、例えば、ポナステ
ロンA(「PonA」)またはムリステロンA(「MurA」)と比較した場合に、非ス
テロイド性リガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する感受性の改善ももたらした。
すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイド性リガンドは、低リガンド濃度で、
より大きな遺伝子転写活性をもたらした。さらに、2ハイブリッド系は、非修飾RXRを
切り替えパートナーとして使用する場合に生じうる、RXRの過剰発現に起因する一部の
副作用も回避する。好ましい2ハイブリッド系では、EcRまたはRXRの、天然のDN
A結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは除去され、結果として、これらのハイ
ブリッド分子は、細胞内に存在する、他のステロイドホルモン受容体との相互作用の可能
性を低下させ、これにより、副作用の低減を結果としてもたらす。
エクジソン受容体(EcR)とは、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、
サブファミリー1、群H(本明細書では、「群H核内受容体」と称する)へと分類される
。各群のメンバーは、E(リガンド結合)ドメイン内で、40~60%のアミノ酸同一性
を共有する(Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Recepto
r Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163)。エクジソン受容体に加えて、この核内受容体
サブファミリー1、群Hの他のメンバーは、ユビキタス受容体(UR)、オーファン受容
体1(OR-1)、ステロイドホルモン核内受容体1(NER-1)、RXR相互作用性
タンパク質15(RIP-15)、肝臓x受容体β(LXRβ)、ステロイドホルモン受
容体様タンパク質(RLD-1)、肝臓x受容体(LXR)、肝臓x受容体α(LXRα
)、ファルネソイドx受容体(FXR)、受容体相互作用性タンパク質14(RIP-1
4)、およびファルネソール受容体(HRR-1)を含む。
場合によって、誘導性プロモーター(「IP」)は、Intrexon Corpor
ation製のRHEOSWITCH(登録商標)遺伝子スイッチなど、低分子リガンド
誘導性の、2つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチであり
うる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において
組み込まれる、PCT/米国出願第2001/009050号明細書(国際公開第200
1/070816号パンフレット);米国特許第7,091,038号明細書;同第7,
776,587号明細書;同第7,807,417号明細書;同第8,202,718号
明細書;PCT/米国出願第2001/030608号明細書(国際公開第2002/0
29075号パンフレット);米国特許第8,105,825号明細書;同第8,168
,426号明細書;PCT/米国出願第2002/005235号明細書(国際公開第2
002/066613号パンフレット);米国特許出願公開第10/468,200号明
細書(米国公開第20120167239号明細書);PCT/米国出願第2002/0
05706号明細書(国際公開第2002/066614号パンフレット);米国特許第
7,531,326号明細書;同第8,236,556号明細書;同第8,598,40
9号明細書;PCT/米国出願第2002/005090号明細書(国際公開第2002
/066612号パンフレット);米国特許第8,715,959号明細書(米国公開第
20060100416号明細書);PCT/米国出願第2002/005234号明細
書(国際公開第2003/027266号パンフレット);米国特許第7,601,50
8号明細書;同第7,829,676号明細書;同第7,919,269号明細書;同第
8,030,067号明細書;PCT/米国出願第2002/005708号明細書(国
際公開第2002/066615号パンフレット);米国特許出願公開第10/468,
192号明細書(米国公開第20110212528号明細書);PCT/米国出願第2
002/005026号明細書(国際公開第2003/027289号パンフレット);
米国特許第7,563,879号明細書;同第8,021,878号明細書;同第8,4
97,093号明細書;PCT/米国出願第2005/015089号明細書(国際公開
第2005/108617号パンフレット);米国特許第7,935,510号明細書;
同第8,076,454号明細書;PCT/米国出願第2008/011270号明細書
(国際公開第2009/045370号パンフレット);米国特許出願公開第12/24
1,018号明細書(米国公開第20090136465号明細書);PCT/米国出願
第2008/011563号明細書(国際公開第2009/048560号パンフレット
);米国特許出願公開第12/247,738号明細書(米国公開第200901234
41号明細書);PCT/米国出願第2009/005510号明細書(国際公開第20
10/042189号パンフレット);米国特許出願公開第13/123,129号明細
書(米国公開第20110268766号明細書);PCT/米国出願第2011/02
9682号明細書(国際公開第2011/119773号パンフレット);米国特許出願
公開第13/636,473号明細書(米国公開第20130195800号明細書);
PCT/米国出願第2012/027515号明細書(国際公開第2012/12202
5号パンフレット);および米国特許第9,402,919号明細書において記載されて
いる系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しうるが
、これらに限定されない。
宿主細胞内の、CARおよび/またはサイトカインの発現をモジュレートするための系
であって、本明細書で開示される遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを含む系が提示される。本明細書では、遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺
伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、遺伝子スイッチポリ
ペプチドが、(a)核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたDNA結合性ドメ
イン(DBD)を含む、第1の遺伝子スイッチポリペプチド;および(b)核内受容体リ
ガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第2の遺伝子スイ
ッチポリペプチドを含み;第1の遺伝子スイッチポリペプチドと、第2の遺伝子スイッチ
ポリペプチドとが、リンカーにより接続されている、ポリヌクレオチドが提示される。一
部の実施形態では、リンカーは、2Aリンカー、GSG-2Aリンカー、GSGリンカー
(配列番号85)、SGSGリンカー(配列番号86)、フューリンリンク変異体および
これらの誘導体からなる群から選択される、切断可能リンカー配列またはリボソームスキ
ッピングリンカー配列である。ある特定の実施形態では、2Aリンカーは、p2Aリンカ
ー、T2Aリンカー、F2Aリンカー、またはE2Aリンカーである。
一部の実施形態では、DNA結合性ドメイン(DBD)は、GAL4(GAL4 DB
D)、LexA DBD、転写因子DBD、ステロイド/甲状腺ホルモン核内受容体スー
パーファミリーメンバーDBD、細菌LacZ DBD、および酵母DBDのうちの少な
くとも1つを含む。場合によって、トランス活性化ドメインは、VP16トランス活性化
ドメインおよびB42酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの少なくとも1つを
含む。他の場合には、核内受容体リガンド結合性ドメインは、エクジソン受容体(EcR
)、ユビキタス受容体、オーファン受容体1、NER-1、ステロイドホルモン核内受容
体1、レチノイドX受容体相互作用性タンパク質-15、肝臓X受容体β、ステロイドホ
ルモン受容体様タンパク質、肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、
受容体相互作用性タンパク質14、およびファルネソール(famesol)受容体のうちの少
なくとも1つを含む。一部の実施形態では、核内受容体リガンド結合性ドメインは、配列
番号91および92のエクジソン受容体ポリペプチド配列由来である。一部の実施形態で
は、核内受容体リガンド結合性ドメインは、配列番号91および92のエクジソン受容体
ポリペプチド配列由来である。
さらに別の実施形態では、第1の遺伝子スイッチポリペプチドは、EcR核内受容体リ
ガンド結合性ドメインへと融合させたGAL4 DBDを含み、第2の遺伝子スイッチポ
リペプチドは、レチノイド受容体X(RXR)核内受容体リガンド結合性ドメインへと融
合させたVP16トランス活性化ドメインを含む。場合によって、第1の遺伝子スイッチ
ポリペプチドと、第2の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されてお
り、リンカーは、2Aリンカー、GSG-2Aリンカー、GSGリンカー(配列番号85
)、SGSGリンカー(配列番号86)、フューリンリンク変異体およびこれらの誘導体
のうちの1または複数から選択される。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる
、2つまたはこれを超えるポリペプチドは、リンカーポリペプチドをコードする介在配列
により隔てることができる。ある特定の場合では、リンカーは、易切断性リンカーである
。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性リンカーポリペプチドにより連
結された融合タンパク質として発現される。ある特定の実施形態では、易切断性リンカー
ポリペプチドは、F/T2A、T2A、p2A、2A、GSG-p2A、GSGリンカー
(配列番号85)、およびフューリンリンク変異体のうちの、任意の1または複数であり
うる。ある特定の実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号72~86または1
97~199を含む。
場合によって、ウイルス2A配列が使用されうる。2Aエレメントは、5~100塩基
対を有するIRESより短くなりうる。場合によって、2A配列は、5、10、15、2
0、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85
、90、または100ヌクレオチドの長さを有しうる。2Aを連結された遺伝子は、単一
のオープンリーディングフレーム内で発現させることができ、「自己切断」は、2Aポリ
ペプチドC末端の、最後の2つのアミノ酸であるG-P間で、共翻訳的に生じることが可
能であり、等量の共発現タンパク質をもたらす。
ウイルス2A配列は、約20アミノ酸でありうる。場合によって、ウイルス2A配列は
、コンセンサスモチーフである、Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro
-Gly-Pro(配列番号201)を含有しうる。コンセンサスモチーフ配列は、共翻
訳的に作用しうる。例えば、グリシン残基とプロリン残基との、正常なペプチド結合の形
成を防止することができ、これは、リボソームスキッピングおよび新生ポリペプチドの切
断を結果としてもたらしうる。この効果は、等モルレベルで、複数の遺伝子をもたらしう
る。
2Aペプチドは、単一のオープンリーディングフレーム内の、複数のタンパク質の、そ
の後、リボソームスキッピング機構を介して、個別のポリペプチドへと切断されうる、ポ
リペプチドへの翻訳を可能としうる(Funston, Kallioinen et al. 2008)。一部の実施
形態では、2A配列は、F/T2A、T2A、p2A、2A、T2A、E2A、F2A、
およびBmCPV2A、BmIFV2A、ならびにこれらの任意の組合せを含みうる。
場合によって、ベクターは、IRES配列および2Aリンカー配列を含みうる。他の場
合には、2Aペプチドと連結された、複数の遺伝子の発現は、2Aペプチドに前置された
スペーサー配列(GSG(配列番号85))により容易とすることができる。場合によっ
て、構築物は、スペーサー、リンカー、アダプター、プロモーター、またはこれらの組合
せを組み合わせうる。例えば、構築物は、異なる2Aペプチドと共に、スペーサー(SG
SG(配列番号86)またはGSG(配列番号85))およびフューリンリンカー(R-
A-K-R(配列番号81))切断部位を有しうる。スペーサーは、I-CeuI(Ceui
)でありうる。場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは
、疎水性などの化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少な
くとも2つのリンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。他の場合には、複数のリ
ンカーを、ベクター内で使用することができる。例えば、目的の遺伝子は、少なくとも2
つのリンカーにより隔てることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる
、2つまたはこれを超えるポリペプチドは、リンカーポリペプチドをコードする介在配列
により隔てることができる。ある特定の場合には、リンカーは、易切断性リンカーである
。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性介在リンカーポリペプチドによ
り連結された、融合タンパク質として発現する。ある特定の実施形態では、易切断性リン
カーポリペプチドは、配列番号72~86または197~199で記載されるフューリン
リンク、fmdv、p2a、GSG-p2a、および/またはfp2aのうちの、任意の
1つまたは2つでありうる。
一部の実施形態では、リンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチド内で用いる
ことができる。リンカーは、可撓性リンカー、非可撓性リンカー、in vivo切断可
能リンカー、またはこれらの任意の組合せでありうる。場合によって、リンカーは、機能
的ドメインを、併せて連結する(可撓性リンカーおよび非可撓性リンカーの場合のように
)場合もあり、in vivo切断可能リンカーの場合のように、遊離の機能的ドメイン
を、in vivoにおいて放出する場合もある。
リンカーは、生物学的活性を改善し、発現収率を増大させることから、所望の薬物動態
を達成しうる。リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエー
テル(thioesther)も含みうる。
場合によって、本明細書で記載されるリンカー配列は、可撓性リンカーを含みうる。可
撓性リンカーは、接合されるドメインが、ある程度の移動または相互作用を必要とする場
合に適用することができる。可撓性リンカーは、小型、非極性(例えば、Gly)、また
は極性(例えば、SerまたはThr)のアミノ酸から構成されうる。可撓性リンカーは
、Gly残基およびSer残基の連なりから主になる配列(「GS」リンカー)を有しう
る。可撓性リンカーの例は、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)nの配列(配
列番号197)を有しうる。コピー数である「n」を調整することにより、この例示的G
Sリンカーの長さを最適化して、機能的ドメインの適切な分離を達成することもでき、必
要なドメイン間相互作用を維持することもできる。GSリンカーのほかに、他の可撓性リ
ンカーも、組換え融合タンパク質に用いることができる。場合によって、可撓性リンカー
はまた、GlyおよびSerなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合もあるが
、可撓性を維持するように、ThrおよびAlaなど、さらなるアミノ酸を含有する場合
もある。他の場合には、LysおよびGluなどの極性アミノ酸を使用して、可溶性を改
善することができる。
本明細書で記載されるリンカー配列に含まれる可撓性リンカーは、良好な可撓性および
可溶性をもたらすように、GlyおよびSerなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に
富む場合がある。可撓性リンカーは、ある特定の移動または相互作用が、融合タンパク質
ドメインに所望される場合に適切でありうる。加えて、可撓性リンカーは、非可撓性構造
を有さない場合もあるが、機能的ドメイン間の距離を保持する、受動的リンカーとして用
いられる場合もある。可撓性リンカーの長さを調整して、適正なフォールディングを可能
とすることもでき、融合タンパク質の最適な生物学的活性を可能とすることもできる。
本明細書で記載されるリンカーは、場合によって、非可撓性リンカーをさらに含みうる
。非可撓性リンカーを用いて、ポリペプチドのドメイン間で、一定の距離を維持すること
ができる。非可撓性リンカーの例は、少数を挙げれば、アルファヘリックス形成リンカー
、Proに富む配列、(XP)n、X-Pro骨格、A(EAAAK)nA(n=2~5
)(配列番号202)でありうる。非可撓性リンカーは、場合によって、αヘリックス構
造を取ることにより、または複数のPro残基を含有することにより、比較的剛直な構造
を呈しうる。
本明細書で記載されるリンカーは、場合によって、切断されうる。他の場合に、リンカ
ーは、切断されない。切断されないリンカーは、in vivo過程またはex viv
o過程を通して1つの分子として作用するように、機能的ドメインを、共有結合的に、一
体に接合しうる。リンカーはまた、in vivoにおいても切断されうる。切断可能リ
ンカーは、in vivoにおいて、遊離の機能的ドメインを放出させるように導入する
ことができる。切断可能リンカーは、少数を挙げれば、還元試薬、プロテアーゼの存在に
より切断することができる。例えば、ジスルフィド結合の還元を用いて、切断可能リンカ
ーを作製することができる。ジスルフィドリンカーの場合、グルタチオンなど、チオール
とのジスルフィド交換を介する切断イベントが、切断をもたらしうるであろう。他の場合
には、in vivoにおける、組換え融合タンパク質内のリンカーの切断はまた、in
vivoの、病理学的状態(例えば、がんまたは炎症)下、特異的な細胞内または組織
内で発現する場合もあり、ある特定の細胞区画内に拘束される場合もあるプロテアーゼに
よっても実行されうる。場合によって、切断可能リンカーは、切断のターゲティングを可
能としうる。例えば、多くのプロテアーゼの特異性は、拘束区画内のリンカーの緩徐な切
断をもたらしうる。切断可能リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、ま
たはチオエーテルも含みうる。例えば、ヒドラゾンは、血清中の安定性を付与しうる。他
の場合には、ヒドラゾンは、酸性区画内の切断を可能としうる。酸性区画は、最大で7の
pHを有しうる。リンカーはまた、チオエーテルも含みうる。チオエーテルは、非還元性
でありうる。チオエーテルは、細胞内タンパク質分解のためにデザインすることができる
ある特定の実施形態では、fmdvリンカーポリペプチドは、配列番号82と、少なく
とも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、9
0%、95%、97%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含む。あ
る特定の実施形態では、fmdvリンカーポリペプチドは、2つまたはこれを超える融合
タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの1または複数
である。ある特定の場合には、fmdvリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオ
ープンリーディングフレーム(ORF)の核酸配列によりコードされうる。場合によって
、fmdvをコードするORFは、配列番号173の配列を含むか、またはこれからなる
。ある特定の実施形態では、fmdvをコードするポリヌクレオチドは、配列番号173
と、少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、8
5%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一である。
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは、「p2a」リンカーでありうる。ある
特定の実施形態では、p2aポリペプチドは、配列番号75と、少なくとも約45%、5
0%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、9
7%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含みうる。ある特定の実施
形態では、p2aリンカーポリペプチドは、2つまたはこれを超える融合タンパク質を連
結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの1または複数でありうる。場
合によって、p2aリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディング
フレーム(ORF)の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態では、p2a
をコードするORFは、配列番号167の配列を含むか、またはこれからなる。ある特定
の場合には、p2aをコードするポリヌクレオチドは、配列番号167と、少なくとも4
5%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、9
5%、97%、98%、99%、または100%同一であるか、または少なくともほぼこ
れらの比率で同一でありうる。
場合によって、リンカーポリペプチドは、「GSG-p2a」リンカーでありうる。あ
る特定の実施形態では、GSG-p2aリンカーポリペプチドは、配列番号76と、少な
くとも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、
90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含みう
る。ある特定の実施形態では、GSG-p2aリンカーポリペプチドは、2つまたはこれ
を超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの
1または複数でありうる。場合によって、GSG-p2aリンカーポリペプチドは、ポリ
ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム(ORF)の核酸配列によりコードされう
る。GSG p2aをコードするORFは、配列番号168の配列を含みうる。場合によ
って、GSG-p2aをコードするポリヌクレオチドは、配列番号168と、少なくとも
45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、
95%、97%、98%、99%、または100%同一であるか、または少なくともほぼ
これらの比率で同一でありうる。
リンカーポリペプチドは、本明細書で提示される「fp2a」リンカーでありうる。あ
る特定の実施形態では、fp2aリンカーポリペプチドは、配列番号77と、少なくとも
約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%
、95%、97%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含みうる。あ
る特定の場合には、fp2aリンカーポリペプチドは、2つまたはこれを超える融合タン
パク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの1または複数であ
りうる。場合によって、fp2aリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープン
リーディングフレーム(ORF)の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態
では、fp2aリンカーをコードするポリヌクレオチドは、配列番号169と、少なくと
も45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%
、95%、97%、98%、99%、または100%同一であるか、または少なくともほ
ぼこれらの比率同一でありうる。
場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性など
の化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも2つの
リンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。配列は、配列番号72~配列番号86
、または配列番号197~配列番号199の配列と、45%、50%、55%、60%、
65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、
99%、または100%同一でありうるか、またはほぼこれらの比率で同一でありうる。
他の場合には、複数のリンカーを、ベクター内で使用することができる。例えば、本明細
書で記載される、目的の遺伝子と、1または複数の遺伝子スイッチポリペプチド配列とは
、少なくとも2つのリンカーにより隔てることができる。場合によって、遺伝子は、2つ
、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または最大で10のリンカーにより隔て
ることができる。
リンカーは、操作リンカーでありうる。リンカーをデザインする方法は、コンピュータ
計算による方法でありうる。場合によって、コンピュータ計算による方法は、グラフ法を
含みうる。コンピュータ計算法を使用して、データベースから導出された三次元ペプチド
構造のライブラリーから、適切なペプチドを検索することができる。例えば、Brook
haven Protein Data Bank(PDB)を使用して、リンカーの選
択されたアミノ酸の間の間隔の距離を測ることができる。
一部の実施形態では、フューリンポリペプチドおよび2Aポリペプチドを含むポリペプ
チド構築物をコードするポリヌクレオチドが提供されるが、この場合、フューリンポリペ
プチドおよび2Aポリペプチドが、少なくとも3つの疎水性アミノ酸を含むポリペプチド
リンカーにより接続されている。場合によって、少なくとも3つの疎水性アミノ酸は、グ
リシン(Gly)(G)、アラニン(Ala)(A)、バリン(Val)(V)、ロイシ
ン(Leu)(L)、イソロイシン(Ile)(I)、プロリン(Pro)(P)、フェ
ニルアラニン(Phe)(F)、メチオニン(Met)(M)、トリプトファン(Trp
)(W)からなるリストから選択される。場合によって、ポリペプチドリンカーはまた、
1または複数のGSリンカー配列、例えば、(GS)n(配列番号203)、(SG)n
(配列番号204)、(GSG)n(配列番号198)、および(SGSG)n(配列番
号199)[配列中、nは、0~15の任意の数でありうる]も含みうる。
ポリペプチド構築物の発現の改善を得る方法であって、第1の機能的ポリペプチドおよ
び第2の機能的ポリペプチドを含む前記ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチ
ドを用意するステップであって、前記第1の機能的ポリペプチドと、第2の機能的ポリペ
プチドとが、配列APVKQ(配列番号205)との、少なくとも60%の同一性を伴う
配列を含むリンカーポリペプチドにより接続されている、ステップと;宿主細胞内で、前
記ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、ポリペプチド構築物の発現の、配列
APVKQ(配列番号205)との、少なくとも60%の同一性を伴う配列を含むリンカ
ーポリペプチドを有さない、対応するポリペプチド構築物と比較した改善を結果としても
たらすステップとを含む方法が提供される。
他の場合には、リンカーは、IRESでありうる。本明細書で使用される「内部リボソ
ーム進入部位(IRES)」という用語は、内部リボソーム進入部位を意味することが意
図されうる。IRES配列を含むベクター内では、第1の遺伝子が、その独自の5’-U
TRを伴う機構である、キャップ依存性のリボソーム走査により翻訳されうるのに対し、
後続の遺伝子の翻訳は、リボソームの、IRESへの直接的な動員により、キャップ非依
存的に達せられうる。IRES配列は、真核リボソームが結合し、5’キャップ末端に結
合せずに、翻訳を開始することを可能としうる。IRES配列は、1つの転写物からの、
複数の遺伝子の発現を可能としうる(Mountford and Smith 1995)。
例示的なIRES配列は、配列番号192および193に見出されうる。ある特定の場
合では、2xRbm3 IRESをコードするポリヌクレオチドは、配列番号192と、
少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%
、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一でありうるか
、またはほぼこれらの比率で同一でありうる。ある特定の場合では、EMCV IRES
をコードするポリヌクレオチドは、配列番号193と、少なくとも45%、50%、55
%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97
%、98%、99%、または100%同一でありうるか、またはほぼこれらの比率で同一
でありうる。
一部の実施形態では、宿主細胞内の、CARおよびサイトカインの発現をモジュレート
するための系であって、第1のポリペプチドをコードする、第1のポリヌクレオチドを含
む、第1の遺伝子発現カセット;第2のポリペプチドをコードする、第2のポリヌクレオ
チドを含む、第2の遺伝子発現カセット;およびリガンドを含み、宿主細胞を、リガンド
の存在下で、第1の遺伝子発現カセットおよび第2の遺伝子発現カセットと接触させると
、CARおよびサイトカインが、宿主細胞内で発現するように、第1のポリペプチドおよ
び第2のポリペプチドが、(i)トランス活性化ドメイン;(ii)DNA結合性ドメイ
ン;および(iii)リガンド結合性ドメイン;(iv)CAR;(vi)サイトカイン
、および/または(vii)細胞タグのうちの1または複数を含む系が提供される。場合
によって、CARは、MUC16 CARであり、サイトカインはmbIL-15である
。場合によって、MUC16 CAR、mbIL-15は、1つの細胞タグと共に共発現
する。MUC16 CARおよびmbIL-15は、それぞれ細胞タグと共に共発現する
。他の場合には、MUC16 CARは、細胞タグと共に発現し、mbIL-15は、第
2の細胞タグと共に発現する。遺伝子発現カセットの例示的な構成を、図1および図2に
描示する。他の場合には、CARはMUC16 CARであり、サイトカインはIL-1
2である。場合によって、MUC16 CAR、IL-12は、1つの細胞タグと共に共
発現する。場合によって、MUC16 CARおよびIL-12は、それぞれ細胞タグと
共に共発現する。他の場合には、MUC16 CARは、細胞タグと共に発現し、IL-
12は、第2の細胞タグと共に発現する。
一部の実施形態では、宿主細胞内の、CARおよびサイトカインの発現をモジュレート
するための系であって、第1のポリペプチドをコードする、第1のポリヌクレオチドを含
む、第1の遺伝子発現カセット;第2のポリペプチドをコードする、第2のポリヌクレオ
チドを含む、第2の遺伝子発現カセット;およびリガンドを含み、宿主細胞を、リガンド
の存在下で、第1の遺伝子発現カセットおよび第2の遺伝子発現カセットと接触させると
、CARおよび/またはサイトカインが、宿主細胞内で発現するように、第1のポリペプ
チドが、(i)トランス活性化ドメイン;(ii)DNA結合性ドメイン;および(ii
i)リガンド結合性ドメインのうちの1または複数を含み、第2のポリペプチドが、(i
)CAR;(ii)サイトカイン、および/または(iii)細胞タグのうちの1または
複数を含む系が提供される。場合によって、CARは、MUC16 CARであり、サイ
トカインはmbIL-15である。場合によって、MUC16 CARおよびmbIL-
15は、それぞれ細胞タグと共に共発現する。他の場合には、MUC16 CARは、第
1の細胞タグと共に発現し、mbIL-15は、第2の細胞タグと共に発現する。
宿主細胞内の、MUC16 CARおよびサイトカインの発現をモジュレートするため
の系の例示的な構成を、図1~2に描示する。一部の実施形態では、遺伝子発現カセット
はウイルス系またはウイルスベースの系を使用して、免疫エフェクター細胞へと導入され
る。本明細書で記載される非ウイルスベースの送達系の例は、SB11トランスポゾン系
、SB100Xトランスポゾン系、SB110トランスポゾン系、piggyBacトラ
ンスポゾン系を含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、1または複数のSlee
ping Beautyトランスポゾンで免疫エフェクター細胞へと導入される。
MUC16 CAR、サイトカイン(mbIL-15またはIL-12など)、および
細胞タグの構成的な発現をコードする遺伝子発現カセットの例示的な実施形態が、図1に
描示される。図1a~bは、多様な構成のMUC16 CAR、mbIL-15、および
細胞タグをデザインする例示的な遺伝子発現カセットを描示する。この実施形態では、遺
伝子発現カセットを、1つのSleeping Beautyトランスポゾンで免疫エフ
ェクター細胞へと導入する。図1c~dは、MUC16 CARが1つの遺伝子発現カセ
ット内にあってよく、mbIL-15および細胞タグが第2の遺伝子発現カセット内にあ
る、遺伝子発現カセット構成を描示する。この実施形態では、遺伝子発現カセットを、1
または複数のSleeping Beautyトランスポゾンで免疫エフェクター細胞へ
と導入する。
MUC16 CAR、サイトカイン(mbIL-15など)、および/または細胞タグ
の誘導性発現をコードする遺伝子発現カセットの例示的な実施形態が、図2に描示される
。図2a~dは、誘導性プロモーターの制御下での、多様な構成のMUC16 CAR、
mbIL-15、および細胞タグをデザインする例示的な遺伝子発現カセットを描示する
。図2eは、本明細書で記載される遺伝子スイッチポリペプチドをコードする遺伝子発現
カセットの例示的な実施形態である。この実施形態では、遺伝子発現カセットを、1また
は複数のSleeping Beautyトランスポゾンで免疫エフェクター細胞へと導
入する。
リガンド
一部の実施形態では、誘導性遺伝子スイッチの調節のために使用されるリガンドは、以
下:N-[(1R)-1-(1,1-ジメチルエチル)ブチル]-N’-(2-エチル-
3-メトキシベンゾイル)-3,5-ジメチルベンゾヒドラジド(ベレジメクスともまた
称する)、(2S,3R,5R,9R,10R,13R,14S,17R)-17-[(
2S,3R)-3,6-ジヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル]-2,3,14
-トリヒドロキシ-10,13-ジメチル-2,3,4,5,9,11,12,15,1
6,17-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-6-オン;N’-(
3,5-ジメチルベンゾイル)-N’-[(3R)-2,2-ジメチル-3-ヘキサニル
]-2-エチル-3-メトキシベンゾヒドラジド;5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベン
ゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N
’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド;5-メチル-2,3-
ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-
4-メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒド
ラジド;5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸
N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-
ヒドラジド;5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボ
ン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチ
ル-ベンゾイル)-ヒドラジド;5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオ
キシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル
-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド;5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ
[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベン
ゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド;5-エチ
ル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-te
rt-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;5-
エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-
tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)
-ヒドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロ
ピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメ
トキシ-4-メチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’
-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメチル-安息香
酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾ
イル)-ヒドラジド;3,5-ジメトキシ-4-メチル-安息香酸N-(1-tert-
ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3
,5-ジメチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(
2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメトキシ-4-メチ
ル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-
3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-te
rt-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジ
ド;3,5-ジメトキシ-4-メチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)
-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド;2-メトキシ-ニコ
チン酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-
ヒドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロ
ピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸
N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾ
イル)-ヒドラジド;および3,5-ジメトキシ-4-メチル-安息香酸N-(1-te
rt-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラ
ジドのうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。
場合によって、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子スイッチの、用量調節性制御の
ために使用されるリガンドは、エクジソン、20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロン
A、ムリステロンAなどのecdyステロイド、9-cis-レチノイン酸、レチノイン
酸の合成類似体、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,0
13,836号明細書;同第5,117,057号明細書;同第5,530,028号明
細書;および同第5,378,726号明細書、ならびに米国出願公開第2005/02
09283号明細書および同第2006/0020146号明細書において開示されてい
るN,N’-ジアシルヒドラジンなどのN,N’-ジアシルヒドラジン;米国出願公開第
2004/0171651号明細書において記載されているオキサゾリン;欧州出願第4
61,809号明細書において開示されているジベンゾイルアルキルシアノヒドラジンな
どのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン;米国特許第5,225,443号明細書に
おいて開示されているN-アルキル-N,N’-ジアロイルヒドラジンなどのN-アルキ
ル-N,N’-ジアロイルヒドラジン;欧州出願第234,994号明細書において開示
されているN-アシル-N-アルキルカルボニルヒドラジンなどのN-アシル-N-アル
キルカルボニルヒドラジン;米国特許第4,985,461号明細書において記載されて
いるN-アロイル-N-アルキル-N’-アロイルヒドラジンなどのN-アロイル-N-
アルキル-N’-アロイルヒドラジン;米国出願公開第2004/0049037号明細
書において記載されているアルニドケトンなどのアルニドケトン;3,5-ジ-tert
-ブチル-4-ヒドロキシ-N-イソブチル-ベンズアミド、8-O-アセチルハルパジ
ド、オキシステロール、22(R)ヒドロキシコレステロール、24(S)ヒドロキシコ
レステロール、25-エポキシコレステロール、T0901317、5-アルファ-6-
アルファ-エポキシコレステロール-3-スルフェート(sulfate)(ECHS)、7-
ケトコレステロール-3-スルフェート(sulfate)、フラメゾール、胆汁酸、1,1-
ビホスホネート(biphosphonate)エステル、若年性ホルモンIIIなどを含む、他の類
似の材料のうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。本開示において有用
なジアシルヒドラジンリガンドの例は、RG-115819(3,5-ジメチル-安息香
酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-メチル-3-メトキ
シ-ベンゾイル)-ヒドラジド)、RG-115932((R)-3,5-ジメチル-安
息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベ
ンゾイル)-ヒドラジド-)、およびRG-115830(3,5-ジメチル-安息香酸
N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイ
ル)-ヒドラジド)を含む。例えば、それらのいずれもが参照によりそれらの全体におい
て本明細書に組み込まれる、米国特許出願第12/155,111号明細書およびPCT
出願/米国出願第2008/006757号明細書を参照されたい。
非ウイルスベースの送達系
本発明で記載されるCARをコードする核酸はまた、DNA配列を、脊椎動物の染色体
へと導入するための、合成DNAトランスポゾン系を指す、「Sleeping Bea
uty(SB)トランスポゾン系」など、非ウイルスベースの送達系を使用して、免疫エ
フェクター細胞へと導入することもできる。例示的なSBトランスポゾン系は、例えば、
米国特許第6,489,458号明細書および同第8,227,432号明細書において
記載され、図3に描示されている。Sleeping Beautyトランスポゾン系は
、Sleeping Beauty(SB)トランスポザーゼおよびSBトランスポゾン
を含む。本明細書で使用する、Sleeping Beautyトランスポゾン系は、S
leeping Beautyトランスポザーゼポリペプチドならびに活性を保持する誘
導体、変異体および/または断片、およびSleeping Beautyトランスポゾ
ンポリヌクレオチド、活性を保持する誘導体、変異体および/または断片を含みうる。あ
る特定の実施形態では、Sleeping Beautyトランスポザーゼは、mRNA
として提供される。一部の態様では、mRNAは、SB10、SB11、SB110x、
またはSB110トランスポザーゼをコードする。一部の態様では、mRNAは、キャッ
プおよびポリAテールを含む。
DNAトランスポゾンは、1つのDNA部位から、別のDNA部位へと、単純なカット
アンドペースト方式で転座する。転移は、規定されたDNAセグメントを、1つのDNA
分子から切り出し、同じDNA分子内もしくはゲノム内、または異なるDNA分子内もし
くはゲノム内の別の部位へと移動させる、正確な過程である。他のTc1/marine
r型トランスポザーゼと同様、SBトランスポザーゼも、トランスポゾンを、レシピエン
トDNA配列内の、TAジヌクレオチド塩基対へと挿入する。挿入部位は、同じDNA分
子内の別の部位の場合もあり、別のDNA分子(または染色体)内の場合もある。ヒトゲ
ノムを含む哺乳動物ゲノムには、約2億カ所のTA部位が存在する。TA挿入部位は、ト
ランスポゾン組込みの過程において、重複される。このTA配列の重複は、転移の顕著な
特徴であり、一部の実験では、機構を確認するのに使用される。トランスポザーゼは、ト
ランスポゾン内でコードされる場合もあり、トランスポザーゼは、別の供給源により供給
される場合もあり、この場合、トランスポゾンは、非自立型エレメントとなる。非自律型
トランスポゾンは、挿入の後、独立では切出しおよび再挿入を行いえないため、遺伝子ツ
ールとして最も有用である。SBトランスポゾンは、脊椎動物のゲノムへの遺伝子の導入
および遺伝子治療のための非ウイルスベクターとして使用することが想定されている。略
述すると、免疫エフェクター細胞を遺伝子改変するように、Sleeping Beau
ty(SB)系(Hackett et al., Mol Ther 18:674-83, (2010))を適合させた(Cooper
et al., Blood 105:1622-31, (2005))。一実施形態では、2つのステップ:(i)T細
胞の特異性をリダイレクトするためのSBトランスポゾン[すなわち、キメラ抗原受容体
(CAR)]およびSBトランスポザーゼを発現するDNAプラスミドのエレクトロトラ
ンスファー(Jin et al., Gene Ther 18:849-56, (2011)、Kebriaei et al., Hum Gene T
her 23:444-50, (2012))、ならびに(ii)K562細胞株に由来するデザイナー人工
抗原提示細胞(AaPC)(AaPC(Activating and Propaga
ting Cell)としてもまた公知である)に接する形での、組込み配列を安定的に
発現するT細胞の繁殖および拡大増殖を伴った。別の実施形態では、第2のステップ(i
i)は省略し、遺伝子改変されたT細胞は凍結保存するか、または患者へとすぐに輸注す
る。
一実施形態では、SBトランスポゾン系は、例えば、参照によりそれらの全体において
本明細書に組み込まれる、Hudecek et al., Critical Reviews in Biochemistry and Mol
ecular Biology, 52:4, 355-380 (2017)、Singh et al., Cancer Res (8):68 (2008). Ap
ril 15, 2008およびMaiti et al., J Immunother. 36(2): 112-123 (2013)において記載
されている。
ある特定の実施形態では、MUC16 CARおよびmbIL-15は、トランスポゾ
ンDNAプラスミドベクター内でコードされ、SBトランスポザーゼは、別個のベクター
内でコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるMUC16 CAR
は、トランスポゾンDNAプラスミドベクター内でコードされ、mbIL-15は、第2
のトランスポゾンDNAプラスミドベクター内でコードされ、SBトランスポザーゼは、
第3のDNAプラスミドベクター内でコードされる。一部の実施形態では、CARは、キ
ルタグ、例えば、HER1t、HER1t1、CD20、またはCD20t-1と共にコ
ードされる。一部の実施形態では、mbIL-15は、キルタグ、例えば、HER1t、
HER1t1、CD20、またはCD20t-1と共にコードされる。
複数の実施形態では、MUC16 CARは、トランスポゾンDNAプラスミドベクタ
ーから、mbIL-15および細胞タグと共に共発現させうる。さらなる実施形態では、
MUC16 CARは、誘導性プロモーターの制御下にありうる。別の実施形態では、m
bIL-15は、誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモー
ターは、遺伝子スイッチの、リガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘
導性プロモーターは、RHEOSWITCH(登録商標)遺伝子スイッチなど、低分子リ
ガンド誘導性の、2つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチ
でありうる。ある特定の実施形態では、MUC16 CAR、mbIL-15、およびキ
ルタグは、1、2、またはそれを超えるトランスポゾン内に構成されうる。誘導性プロモ
ーターの制御下にあるMUC16 CARまたはmbIL-15の例示的な構成は、図2
に描示される。
複数の実施形態では、SB11トランスポゾン系、SB100Xトランスポゾン系、S
B110トランスポゾン系、piggyBacトランスポゾン系(例えば、参照によりそ
の全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第9,228,180号明細書、Wils
on et al, “PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells,” Molecul
ar Therapy 15:139-145 (2007)を参照されたい)、および/またはpiggyBatトラ
ンスポゾン系(例えば、Mitra et al., “Functional characterization of piggyBat fr
om the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon,” Proc.
Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013)を参照されたい)を使用して、MUC16 C
ARおよび他の遺伝子エレメントを、細胞へと送達する。さらなるトランスポザーゼおよ
びトランスポゾン系については、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書
に組み込まれる、米国特許第7,148,203号明細書、同第8,227,432号明
細書、米国特許公開第2011/0117072号明細書、Mates et al., Nat Genet, 4
1(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 2009 May 3, Gene Ther., 18(9):849-
56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Mar 31 およびIvics et al., Cell. 9
1(4):501-10, (1997)において提示されている。
他の実施形態では、MUC16 CAR、およびサイトカイン、mbIL-15および
/またはHER1t/HER1t1/CD20/CD20t-1タグなど、他の遺伝子エ
レメントが、リコンビナーゼおよび組込み用発現ベクターを介して免疫エフェクター細胞
のDNAへと組み込まれうる。このようなベクターは、宿主細胞のDNAへと、ランダム
に組み込まれる場合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能
とする組換え部位を含む場合もある。このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染
色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。一部の実
施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な
配列の存在により、組込みのターゲティングを促進する。例えば、本明細書で記載される
ドナーポリヌクレオチドを使用する、組込みのターゲティングは、従来のトランスフェク
ション法、例えば、相同組換えにより、遺伝子のノックアウトまたはノックインを創出す
るのに使用される技法に従い達成することができる。他の実施形態では、ドナーポリヌク
レオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在、および部位特異
的リコンビナーゼの存在下で、細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることの両方
により、組込みのターゲティングを促進する。部位特異的リコンビナーゼ、または、単に
、リコンビナーゼとは、その適合性の組換え部位の間の、保存的な部位特異的組換えを触
媒するポリペプチドを意味する。本明細書で使用される部位特異的リコンビナーゼは、天
然ポリペプチドのほか、活性を保持する誘導体、変異体、および/または断片、ならびに
天然ポリヌクレオチオド、活性を保持するリコンビナーゼをコードする誘導体、変異体、
および/または断片を含む。
リコンビナーゼは、標的細胞へと、ターゲティングベクターの導入の前に導入すること
もでき、これと共時的に導入することもでき、この後で導入することもできる。リコンビ
ナーゼは、例えば、リポソーム、粒子のコーティング、またはマイクロインジェクション
を使用して、細胞へと、タンパク質として直接導入することができる。代替的に、適切な
発現ベクターを使用して、リコンビナーゼをコードするDNAまたはメッセンジャーRN
Aである、ポリヌクレオチドを、細胞へと導入することもできる。上記で記載したターゲ
ティングベクターの構成要素は、目的のリコンビナーゼをコードする配列を含有する発現
カセットの構築において有用である。しかし、リコンビナーゼの発現は、他の方式で、例
えば、リコンビナーゼの発現を、調節可能なプロモーター(すなわち、その発現を選択的
に誘導または抑制しうるプロモーター)の制御下に置くことにより調節することもできる
リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーまたはリゾルバーゼファミリーに由来し
うる。リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーは、100を超えるメンバーを有し、
例えば、FLP、Cre、およびラムダインテグラーゼを含む。インテグラーゼファミリ
ーはまた、チロシンファミリーまたはラムダインテグラーゼファミリーとも称し、DNA
のホスホジエステル結合に対する求核攻撃のために、チロシンの触媒性ヒドロキシル基を
使用する。典型的に、チロシンファミリーのメンバーはまず、DNAにニックを入れ、こ
れにより、その後、二重鎖切断を形成する。チロシンファミリーインテグラーゼの例は、
Creインテグラーゼ、FLPインテグラーゼ、SSV1インテグラーゼ、およびラムダ
(λ)インテグラーゼを含む。セリンリコンビナーゼファミリーとしてもまた公知の、リ
ゾルバーゼファミリーでは、保存性セリン残基が、DNA標的部位への共有結合性連結を
形成する(Grindley, et al., (2006) Ann Rev Biochem 16:16)。
一実施形態では、リコンビナーゼは、SPβc2リコンビナーゼ、SF370.1リコ
ンビナーゼ、Bxb1リコンビナーゼ、A118リコンビナーゼ、およびΦRv1リコン
ビナーゼからなる群から選択されるリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む、単離ポ
リヌクレオチド配列である。セリンリコンビナーゼの例については、参照によりその全体
において本明細書に組み込まれる、米国特許第9,034,652号明細書において詳細
に記載されている。
本発明の実施における使用のためのリコンビナーゼは、組換えにより作製することもで
き、既に記載されている通りに精製することもできる。所望のリコンビナーゼ活性を有す
るポリペプチドは、当技術分野で公知の方法であって、タンパク質の硫酸アンモニウム沈
殿の方法、サイズ分画、アフィニティークロマトグラフィー、HPLC、イオン交換クロ
マトグラフィー、ヘパリンアガロースアフィニティークロマトグラフィー(例えば、Thor
pe & Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. 95:5505-5510, 1998)を含むがこれらに限定されな
いタンパク質精製の方法により、所望の純度まで精製することができる。
一実施形態では、リコンビナーゼを、任意の適切な方法による組換えが所望される組換
え接合部位を含有する真核細胞へと導入することができる。当技術分野では、例えば、マ
イクロインジェクションまたは他の方法により、機能的タンパク質を、細胞へと導入する
方法が周知である。精製リコンビナーゼタンパク質の導入は、タンパク質の一過性の存在
、およびその機能を確保するが、これは、好ましい実施形態であることが多い。代替的に
、リコンビナーゼをコードする遺伝子は、細胞を形質転換するのに使用される発現ベクタ
ーであって、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを、真核細胞内のポリヌクレ
オチドの発現を媒介するプロモーターに作動可能に連結した、発現ベクター内に含まれう
る。リコンビナーゼポリペプチドはまた、リコンビナーゼポリペプチドをコードするメッ
センジャーRNAによっても、真核細胞へと導入することができる。リコンビナーゼは、
核酸断片の、改変されるゲノムへの挿入に必要であるような時間の間だけ存在することが
一般に好ましい。したがって、大半の発現ベクターと関連する永続性の欠如は、有害では
ないと予測される。リコンビナーゼ遺伝子を、目的の外因性ポリヌクレオチドの導入の前
に導入することもでき、これと同時に導入することもでき、この後で導入することもでき
る。一実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、挿入されるポリヌクレオチドを保有する
ベクター内に存在し、リコンビナーゼ遺伝子はなお、ポリヌクレオチド内にも、組み入れ
ることができる。他の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子を、トランスジェニックの真
核生物へと導入する。リコンビナーゼを、構成的に、あるいは細胞特異的プロモーター、
組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、細胞小器官特異的プロモーター、ま
たは低分子誘導性プロモーターもしくは低分子抑制性プロモーター下で発現させる、トラ
ンスジェニック細胞またはトランスジェニック動物を作製することができる。リコンビナ
ーゼはまた、他のペプチド、タンパク質、核局在化シグナルペプチド、シグナルペプチド
、または細胞小器官特異的シグナルペプチド(例えば、ミトコンドリア内またはクロロプ
ラスト内の組換えを容易とする、ミトコンドリアまたはクロロプラストにおけるトランジ
ットペプチド)との融合タンパク質としても発現させることができる。
一実施形態では、部位特異的組換えのための方法は、第1の組換え部位および第2の組
換え部位を用意するステップと、第1の組換え部位および第2の組換え部位を、原核細胞
のリコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え部位の間の組換えをもた
らすステップとを含み、リコンビナーゼポリペプチドは、第1の組換え部位と、第2の組
換え部位との組換えを媒介することが可能であり、第1の組換え部位は、attPまたは
attBであり、第2の組換え部位は、attBまたはattPであり、第1の組換え接
合部位が、attBである場合、第2の組換え接合部位は、attPであり、第1の組換
え接合部位が、attPである場合、第2の組換え接合部位は、attBであるという条
件で、リコンビナーゼは、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)の
ファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)のファージリコンビ
ナーゼ、枯草菌(Bacillus subtilis)のファージリコンビナーゼ、結核菌(Mycobacteri
um tuberculosis)のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌(Mycobacterium smegm
atis)のファージリコンビナーゼからなる群から選択される。
さらなる実施形態は、部位特異的リコンビナーゼの、ゲノムが改変される細胞への導入
を提供する。一実施形態は、真核細胞内の部位特異的組換えを得るための方法であって、
第1の組換え接合部位および第2の組換え接合部位を含む真核細胞を用意するステップと
、第1の組換え接合部位および第2の組換え接合部位を、原核細胞のリコンビナーゼポリ
ペプチドと接触させる結果として、組換え接合部位の間の組換えをもたらすステップとを
含み、リコンビナーゼポリペプチドが、第1の組換え接合部位と、第2の組換え接合部位
との組換えを媒介することが可能であり、第1の組換え接合部位が、ファージゲノムの組
換え接合部位(attP)、または細菌ゲノムの組換え接合部位(attB)であり、第
2の組換え接合部位が、attBまたはattPであり、第1の組換え接合部位が、at
tBである場合、第2の組換え接合部位が、attPであり、第1の組換え接合部位が、
attPである場合、第2の組換え接合部位が、attBであるという条件で、リコンビ
ナーゼが、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のファージリコン
ビナーゼ、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)のファージリコンビナーゼ、枯草菌
(Bacillus subtilis)のファージリコンビナーゼ、結核菌(Mycobacterium tuberculosi
s)のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)のファー
ジリコンビナーゼからなる群から選択される、方法に関する。ある実施形態では、リコン
ビナーゼは、A118リコンビナーゼ、SF370.1リコンビナーゼ、SPβc2リコ
ンビナーゼ、ΦRv1リコンビナーゼ、およびBxb1リコンビナーゼからなる群から選
択される。一実施形態では、組換えは、組込みを結果としてもたらす。
外因性核酸を、宿主細胞へと導入するのに使用される方法にかかわらず、宿主細胞内の
組換えDNA配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。こ
のようなアッセイは、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、RT-PC
RおよびPCRなど、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ;例えば、免疫学的手段
(ELISAおよびウェスタンブロット)、またはペプチドもしくはタンパク質もしくは
核酸を同定するための、本明細書で記載されるアッセイであって、本発明の範囲内に収ま
るアッセイにより、特定のペプチドの有無を検出するアッセイなどの「生化学的」アッセ
イを含む。
ウイルスベースの送達系
本明細書ではまた、本発明の核酸を挿入したウイルスのベースの送達系も提供する。代
表的なウイルス発現ベクターは、アデノウイルスベースのベクター(例えば、Cruce
ll,Inc.(Leiden、Netherlands)から市販されている、アデノ
ウイルスベースのPer.C6系)、レンチウイルスベースのベクター(例えば、Lif
e Technologies(Carlsbad、Calif.)製の、レンチウイル
スベースのpLPI)、およびレトロウイルスベクター(例えば、pCFB-EGSHを
付加したpFB-ERV)、ヘルペスウイルスを含むがこれらに限定されない。ある実施
形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレ
トロウイルスに由来するベクターは、トランス遺伝子の、娘細胞における、長期にわたる
、安定的な組込みおよびその繁殖を可能とするので、長期にわたる遺伝子導入を達成する
のに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質
導入しうるという点で、マウス白血病ウイルスなど、がんレトロウイルスに由来するベク
ターに優る追加の利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低免疫原性という追加
の利点も有する。一般に、かつ、複数の実施形態では、適切なベクターは、少なくとも1
つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアー
ゼ部位、および1または複数の選択用マーカー(例えば、国際公開第01/96584号
パンフレット、国際公開第01/29058号パンフレット、および米国特許第6,32
6,193号明細書)を含有する。
複数の実施形態では、骨格ならびにキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸配列
を含むレンチウイルスベクターであって、CARが、(a)MUC16抗原結合性ドメイ
ン;(b)ストークドメイン;(c)膜貫通ドメイン;(d)4-1BBもしくはCD2
8、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;(e)CD3ゼータシグナル伝達ド
メインを含む、レンチウイルスベクターが提示される。任意選択で、ベクターは、トラン
ケート型表皮増殖因子受容体(HER1tまたはHER1t)、CD20t-1または全
長CD20をコードする核酸をさらに含む。
場合によって、骨格ならびに(1)トランケート型表皮増殖因子受容体、例えば、HE
R1tまたはHER1t-1またはこれらの機能的な変異体;および(2)キメラ抗原受
容体(CAR)をコードする核酸配列を含むベクターであって、CARが、(a)MUC
16抗原結合性ドメイン;(b)ストークドメイン;(c)膜貫通ドメイン;(d)4-
1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;および(e)
CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む、ベクターが提示される。
場合によって、骨格ならびに(1)全長CD20、トランケート型CD20またはこれ
らの機能的な変異体;および(2)キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸配列を
含むベクターであって、CARが、(a)MUC16抗原結合性ドメイン;(b)ストー
クドメイン;(c)膜貫通ドメイン;(d)4-1BBもしくはCD28、または両方を
含む共刺激シグナル伝達ドメイン;および(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含
む、ベクターが提示される。
複数の実施形態では、MUC16特異的CARをコードする核酸が、レンチウイルの骨
格構成成分を含むベクターへとクローニングされる。例示的な骨格構成成分は、pFUG
W、およびpSMPUWを含むがこれらに限定されない。pFUGWレンチウイルスベク
ター骨格は自己不活性化(SIN)レンチウイルスベクター骨格であり、不必要なHIV
-1ウイルス配列が除去され、腫瘍の発生、有害な変異、および感染性粒子の再生のため
の潜在的可能性の低下を結果としてもたらす。複数の実施形態では、MUC16 CAR
をコードするベクターはまた、単一の構築物内のmbIL-15もコードする。複数の実
施形態では、MUC16 CARおよびmbIL-15は、2つの別個のレンチウイルス
ベクター上にコードされる。一部の実施形態では、mbIL-15は、トランケート型表
皮増殖因子受容体タグと共に発現される。複数の実施形態では、MUC16 CARは、
単一のレンチウイルスベクター由来のmbIL-15および細胞タグと共に共発現されう
る。さらなる実施形態では、MUC16 CARは、誘導性プロモーターの制御下にあり
うる。別の実施形態では、mbIL-15は、誘導性プロモーターの制御下にありうる。
一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターであり
うる。場合によって、誘導性プロモーターは、RHEOSWITCH(登録商標)遺伝子
スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、2つのポリペプチドによる、エクジソン受容体
ベースの遺伝子スイッチでありうる。
一実施形態では、本明細書で記載される、MUC16 CARは、抗MUC16 sc
Fv、ヒトCD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにヒト4-1BBおよびCD3ゼ
ータシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、本発明のMUC16 CARは、
抗MUC16 scFv、ヒトCD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ヒト4-1BBおよ
びCD3ゼータシグナル伝達ドメインおよび、任意選択で、トランケート型表皮増殖因子
受容体(HER1tまたはHER1t-1)タグを含む。他の適切なベクターは、組込み
用発現ベクターを含み、これは宿主細胞のDNAへと、ランダムに組み込まれる場合もあ
り、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含む
場合もある。このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配
列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。部位特異的に組み込むベクターの
例は、例えば、Invitrogen(Carlsbad、Calif.)(例えば、p
cDNA(商標)5/FRT)製のflp-in系、またはStratagene(La
Jolla、Calif.)製のpExchange-6 Core Vectorsに
おいて見出されうるcre-lox系などのcre-lox系の構成要素を含む。宿主細
胞染色体へとランダムに組み込まれるベクターの例は、例えば、Invitrogen(
Carlsbad、Calif.)製のpcDNA3.1(T抗原の非存在下で導入され
る場合)、およびPromega(Madison、Wis.)製のpCIまたはpFN
10A(ACT)FLEXI(商標)を含む。さらなるプロモーターエレメント、例えば
、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的に、プロモーターエレメントは、
開始部位の30~110bp上流の領域内に位置するが、多数のプロモーターは、開始部
位の下流にも、機能的なエレメントを含有することが近年示されている。エレメントが、
互いに対して逆位であるか、または移動している場合にも、プロモーター機能が保存され
るように、プロモーターエレメントの間のスペーシングは、柔軟であることが多い。チミ
ジンキナーゼ(tk)プロモーターでは、活性が減衰し始める前に、プロモーターエレメ
ントの間のスペーシングが、50bpの距離まで増大する場合がある。個別のエレメント
は、転写を活性化させるように、プロモーターに応じて、共作動的に機能する場合もあり
、独立に機能する場合もあると考えられる。
適切なプロモーターの1つの例は、サイトメガロウイルス(CMV)即初期プロモータ
ー配列である。このプロモーター配列は、それへと作動的に連結された、任意のポリヌク
レオチド配列の、高レベルの発現を駆動することが可能である、強力な構成的プロモータ
ー配列である。
適切なプロモーターの別の例は、ヒト伸長成長因子1アルファ1(hEF1a1)であ
る。複数の実施形態では、本明細書で記載されるCARを含むベクター構築物は、hEF
1a1機能的変異体を含む。
しかし、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス(
MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)LTR(long terminal r
epeat)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモータ
ー、エプスタイン-バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター
、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、
およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子
プロモーターを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用
することができる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されないものと
する。誘導性プロモーターもまた、既に記載される通り、本発明の一部として想定される
。誘導性プロモーターの使用は、このような発現が所望される場合に、それが作動的に連
結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されない場合に
、発現をオフにすることが可能な分子スイッチをもたらす。誘導性プロモーターの例は、
メタロチオネイン(metallothionine)プロモーター、グルココルチコイドプロモーター
、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むがこれらに
限定されない。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチのリガンド誘導性プ
ロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、RHEOSWITCH(
登録商標)遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、2つのポリペプチドによる、
エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
本明細書で記載されるCARまたはこの部分の発現を評価するために、細胞へと導入さ
れる発現ベクターはまた、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを介してトランス
フェクトまたは感染させることが求められる細胞集団からの、発現細胞の同定および選択
を容易とする、選択用マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはこれらの両方も含
有しうる。他の態様では、選択用マーカーは、別個のDNA片上に保有され、共トランス
フェクション手順で使用さる場合もある。選択用マーカーおよびレポーター遺伝子のいず
れも、宿主細胞内の発現を可能とするように、適切な調節配列で挟むことができる。有用
な選択用マーカーは、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子(neo)およびアンピシリン耐
性遺伝子などの抗生剤耐性遺伝子を含む。一部の実施形態では、トランケート型表皮増殖
因子受容体(HER1tまたはHER1t-1)タグを、選択用マーカー遺伝子として使
用することができる。
レポーター遺伝子を、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定し、調節配列の
機能性について査定するために使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は、レ
シピエントの生物または組織において存在しないか、またはこれらにより発現せず、その
発現が、何らかの、容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペ
プチドをコードする遺伝子である。DNAを、レシピエント細胞へと導入した後の適切な
時点において、レポーター遺伝子の発現についてアッセイする。適切なレポーター遺伝子
は、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タン
パク質遺伝子(例えば、Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000))を含む。適
切な発現系が周知であり、公知の技法を使用して調製することもでき、市販品を購入する
こともできる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、最小の5’側フラ
ンキング領域を伴う構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター
領域は、レポーター遺伝子へと連結することができ、薬剤を、プロモーター駆動型転写を
モジュレートする能力について査定するのに使用することができる。
複数の実施形態では、本明細書で記載されるウイルスベクターは、トランス遺伝子の発
現を駆動するhEF1a1プロモーター、転写を増強するウシ成長ホルモンポリA配列、
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)のほか、pFUGWプラ
スミドに由来するLTR配列を含む。
遺伝子を細胞へと導入し発現させる方法が周知である。発現ベクターの文脈では、ベク
ターを、当技術分野における任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌
細胞、酵母細胞、または昆虫細胞へと、たやすく導入することができる。例えば、発現ベ
クターは、宿主細胞へと、物理的手段により導入することもでき、化学的手段により導入
することもでき、生物学的手段により導入することもできる。
ポリヌクレオチドを、宿主細胞、例えば免疫エフェクター細胞へと導入するための物理
的方法は、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、遺伝子銃法、マイクロインジ
ェクション法、電気穿孔法などを含む。当技術分野では、ベクターおよび/または外因性
核酸を含む細胞を作製するための方法が周知である。例えば、Sambrook et al. (Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))
を参照されたい。複数の実施形態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するため
の方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションまたはポリエチレンイミン(PEI)
トランスフェクションである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの宿主細胞への導
入のための方法は、電気穿孔法である。
目的のポリヌクレオチドを、宿主細胞、例えば、免疫エフェクター細胞へと導入するた
めの生物学的方法は、DNAベクターおよびRNAベクターの使用を含む。ウイルスベク
ターと、とりわけ、レトロウイルスベクターとは、遺伝子を、哺乳動物細胞、例えば、ヒ
ト細胞へと挿入するための、最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクタ
ーは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルス、
およびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第5,350,674号
明細書および同第5,585,362号明細書を参照されたい。
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための化学的手段は、高分子複合体、ナノ
カプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミ
セル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系を含む。in vi
troおよびin vivoにおける、送達媒体としての使用のための、例示的なコロイ
ド状系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
ウイルス送達系を用いる場合、例示的な送達媒体は、リポソームである。核酸の、宿主
細胞への導入(in vitro、ex vivo、またはin vivoにおける)の
ために、脂質製剤が使用されうる。別の態様では、核酸は、脂質と会合させることができ
る。脂質と会合させた核酸は、リポソームの脂質二重層内に散在する、水性のリポソーム
内部に封入することもでき、リポソームおよびオリゴヌクレオチドのいずれとも会合する
連結分子を介して、リポソームへと接合させることもでき、リポソーム内に取り込むこと
もでき、リポソームと複合体化させることもでき、脂質を含有する溶液中に分散させるこ
ともでき、脂質と混合することもでき、脂質と組み合わせることもでき、脂質中の懸濁液
として含有することもでき、ミセルと共に含有するかもしくは複合体化させることもでき
、または他の形で脂質と会合させることもできる。脂質、脂質/DNA、または脂質/発
現ベクターに関連する組成物は、溶液中の、任意の特定の構造に限定されない。例えば、
組成物は、ミセルとしての二重層構造内に存在する場合もあり、「コラプシング」構造を
伴う二重層構造内に存在する場合もある。組成物はまた、単に、溶液中に散在させること
もでき、おそらく、サイズまたは形状が均質ではない凝集物を形成しうる。脂質とは、天
然脂質の場合もあり、合成脂質の場合もある、脂肪性物質である。例えば、脂質は、天然
では、細胞質内で発生する脂肪性液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素、ならびに脂肪酸、ア
ルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなど、それらの誘導体を含有す
る化合物のクラスを含む。
使用に適する脂質は、市販元から購入することができる。例えば、ジミリスチルホスフ
ァチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma、St.Louis、Mo.から購入す
ることができ、ジセチルリン酸(「DCP」)は、K & K Laboratorie
s(Plainview、N.Y.)から購入することができ、コレステロール(「Ch
ol」)は、Calbiochem-Behringから購入することができ、ジミリス
チルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)および他の脂質は、Avanti P
olar Lipids,Inc.(Birmingham、Ala.)から購入するこ
とができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質原液は、約-20℃
で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりたやすく蒸発するので、唯一
の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、封入された脂質の二重層または脂凝集物
の作出により形成される、様々な単一の脂質媒体および多層性脂質媒体を包含する、一般
的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒質を伴う小胞構造
を有するものとして特徴づけることができる。多層性リポソームは、水性媒質により分離
された複数の脂質層を有する。多層性リポソームは、リン脂質を、過剰量の水溶液中に懸
濁させると、自発的に形成される。脂質成分は、閉止構造を形成する前に、自己転移を経
、脂質二重層の間に、水および溶解させた溶質を取り込む(Ghosh et al., Glycobiology
5: 505-10 (1991))。しかし、溶液中に通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物も
また、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取る場合もあり、脂質分子による不均
質の凝集物として存在する場合もある。また、リポフェクタミン-核酸複合体も想定され
る。
MUC16 CARおよびベクターを含む細胞
本明細書では、本明細書で記載されるCARを発現する操作細胞が提示される。ある特
定の実施形態では、本明細書で記載される操作細胞は、免疫エフェクター細胞である。複
数の実施形態では、本明細書では、骨格ならびに(1)トランケート型表皮増殖因子受容
体(HER1tまたはHER1t1)および(2)キメラ抗原受容体(CAR)をコード
する核酸配列を含むベクターを含む免疫エフェクター細胞であって、CARが(a)MU
C16抗原結合性ドメイン;(b)ストークドメイン;(c)膜貫通ドメイン;(d)4
-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;および(e
)CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む、免疫エフェクター細胞が提示される。
ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体(CAR)を含む免疫エフェクター細胞で
あって、CARが(a)MUC16抗原結合性ドメイン;(b)ストークドメイン;(c
)膜貫通ドメイン;(d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナ
ル伝達ドメイン;(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメイン;および(f)トランケート
型表皮増殖因子受容体(HER1tまたはHER1t1)を含む、免疫エフェクター細胞
が提示される。
複数の実施形態では、本明細書では、(1)キルスイッチとして使用するための細胞タ
グ、選択マーカー、バイオマーカー、またはこれらの組合せ、および(2)キメラ抗原受
容体(CAR)を含む免疫エフェクター細胞であって、CARが(a)MUC16抗原結
合性ドメイン;(b)ストークドメイン;(c)膜貫通ドメイン;(d)4-1BBもし
くはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;および(e)CD3ゼー
タシグナル伝達ドメインを含む、免疫エフェクター細胞が提示される。複数の実施形態で
は、細胞タグは、HER1t、HER1t1、CD20t-1またはCD20である。
複数の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細
胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、および調節性T細胞である。複数の実施形態では
、細胞は、MUC16抗原結合性ドメインがMUC16に結合する場合、抗腫瘍活性を示
す。
改変免疫エフェクター細胞
本明細書で記載される、1または複数の異種遺伝子またはポリペプチドを発現するよう
に改変された免疫エフェクター細胞が提示される。本明細書で記載されるMUC16 C
ARおよびHER1t、HER1t1、CD20、およびCD20t-1タグのうちの少
なくとも1つを発現するように改変された免疫エフェクター細胞が提示される。場合によ
ってMUC16 CAR、mbIL-15mおよび本明細書で開示されるHER1t、H
ER1t1、CD20、およびCD20t-1タグのうちの少なくとも1つを発現するよ
うに改変された免疫エフェクター細胞が提示される。
本明細書で使用される「T細胞」または「Tリンパ球」とは、細胞媒介性免疫において
、中心的な役割を果たす、リンパ球の種類である。「T細胞」または「Tリンパ球」は、
細胞表面上のT細胞受容体(TCR)の存在により、B細胞およびナチュラルキラー細胞
(NK細胞)など、他のリンパ球と区別されうる。
一部の実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、T細胞および/またはナチュラル
キラー細胞を含む改変免疫細胞である。T細胞またはTリンパ球は、細胞媒介性免疫に関
与する白血球の亜型である。例示的なT細胞は、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、T
17細胞、ステムセルメモリーT細胞(TSCM)、ナイーブT細胞、メモリーT細胞
、エフェクターT細胞、調節性T細胞、またはナチュラルキラーT細胞を含む。
「ヘルパーT細胞」(T細胞)は、B細胞の、血漿細胞およびメモリーB細胞への成
熟、ならびに細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫過程において、
他の白血球を支援する。場合によって、T細胞は、細胞表面上のCD4糖タンパク質の
発現のために、CD4+ T細胞として公知である。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞(
APC)の表面上で発現する、MHCクラスII分子により、ペプチド抗原を提示される
と、活性化する。活性化すると、ヘルパーT細胞は、急速に分裂し、活性の免疫応答を調
節するか、またはこれらを支援する、サイトカインと呼ばれる、小型のタンパク質を分泌
する。これらの細胞は、T1、T2、T3、T17、T9、またはTFHを含
む、いくつかの亜型であって、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を
容易とする、いくつかの亜型のうちの1つへと分化しうる。APCからのシグナル伝達は
、T細胞を、特定の亜型へと方向付ける。
「細胞傷害性T細胞」(TC細胞またはCTL)は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞
を破壊し、また、移植片拒絶にも関与している。これらの細胞はまた、それらの表面上に
おいて、CD8糖タンパク質を発現するので、CD8+ T細胞としても公知である。こ
れらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在する、MHCクラスI分子と会合する抗原
に結合することにより、それらの標的を認識する。調節性T細胞により分泌される、IL
-10、アデノシン、および他の分子を介して、CD8+細胞は、アネルギー状態へと不
活化される場合があり、これにより、自己免疫疾患を防止する。
「メモリーT細胞」は、感染が消失した後で、長期にわたり存続する、抗原特異的T細
胞のサブセットである。メモリーT細胞は、それらのコグネイト抗原へと再曝露されると
、多数のエフェクターT細胞へと急速に拡大増殖し、これにより、免疫系に、過去の感染
に対する「メモリー」をもたらす。メモリーT細胞は、亜型:ステムセルメモリーT細胞
(TSCM)、セントラルメモリーT細胞(TCM細胞)および2種類のエフェクターメ
モリーT細胞(TEM細胞およびTEMRA細胞)を含む。メモリー細胞は、CD4+細
胞の場合もあり、CD8+細胞の場合もある。メモリーT細胞は、細胞表面タンパク質で
ある、CD45RO、CD45RA、および/またはCCR7を発現しうる。
かつては、サプレッサーT細胞として公知であった、「調節性T細胞」(Treg細胞
)は、免疫寛容の維持において役割を果たす。調節性T細胞の主要な役割は、T細胞媒介
性免疫を遮断して、免疫反応を終了させ、胸腺内の陰性選択過程を回避した自己反応性T
細胞を抑制することである。
「ナチュラルキラーT細胞」(NKT細胞)は、適応免疫系を、自然免疫系と橋渡しす
る。主要組織適合性複合体(MHC)分子により提示されるペプチド抗原を認識する従来
のT細胞と異なり、NKT細胞は、CD1dと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原
を認識する。活性化すると、これらの細胞は、Th細胞およびTc細胞の両方に帰せられ
た機能(すなわち、サイトカインの産生および細胞溶解性/細胞殺滅分子の放出)を果た
しうる。NKT細胞はまた、一部の腫瘍細胞およびヘルペスウイルスに感染した細胞を認
識し、これらを消失させることも可能である。
ナチュラルキラー(NK)細胞とは、自然免疫系の、細胞傷害性リンパ球の種類である
。場合によって、NK細胞は、ウイルス感染および/または腫瘍形成に対する、最前線の
防御をもたらす。NK細胞は、感染細胞上またはがん性細胞上に提示されたMHCを検出
することが可能であり、サイトカイン放出を誘発し、その後、溶解およびアポトーシスを
誘導する。NK細胞はさらに、抗体および/またはMHCの非存在下で、ストレス細胞を
検出することが可能であり、これにより、迅速な免疫応答を可能とする。
改変免疫エフェクター細胞の用量
一部の実施形態では、ある量の改変免疫エフェクター細胞を、それを必要とする対象へ
と投与するが、量は、サイトカインと関連する傷害作用を誘導する有効性および潜在的可
能性に基づき決定する。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、1kg当たり
の改変免疫エフェクター細胞約10~約10個を含む。場合によって、改変免疫エフ
ェクター細胞の量は、1kg当たりの改変免疫エフェクター細胞約10~約10個を
含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、1kg当たりの改変免疫エフェ
クター細胞約10~約10個を含む。場合によって、場合によって、改変免疫エフェ
クター細胞の量は、1kg当たりの改変免疫エフェクター細胞約10~約10個を含
む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、1kg当たりの改変免疫エフェク
ター細胞約10~約10個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は
、1kg当たりの改変免疫エフェクター細胞約10~約10個を含む。場合によって
、改変免疫エフェクター細胞の量は、1kg当たりの改変免疫エフェクター細胞約10
~約10個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、1kg当たりの
改変免疫エフェクター細胞約10~約10個を含む。場合によって、改変免疫エフェ
クター細胞の量は、1kg当たりの改変免疫エフェクター細胞約10~約10個を含
む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、1kg当たりの改変免疫エフェク
ター細胞約10~約10個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は
、1kg当たりの改変免疫エフェクター細胞約10~約10個を含む。場合によって
、改変免疫エフェクター細胞の量は、1kg当たりの改変免疫エフェクター細胞約10
~約10個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、1kg当たりの
改変免疫エフェクター細胞約10~約10個を含む。場合によって、改変免疫エフェ
クター細胞の量は、1kg当たりの改変免疫エフェクター細胞約10個を含む。場合に
よって、改変免疫エフェクター細胞の量は、1kg当たりの改変免疫エフェクター細胞約
10個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、1kg当たりの改変
免疫エフェクター細胞約10個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量
は、1kg当たりの改変免疫エフェクター細胞約10個を含む。場合によって、改変免
疫エフェクター細胞の量は、1kg当たりの改変免疫エフェクター細胞約10個を含む
一部の実施形態では、CAR-T細胞は、MUC16特異的CAR-T細胞である。場
合によって、MUC16特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T細胞約
10~約10個を含む。場合によって、MUC16特異的CAR-T細胞の量は、1
kg当たりのCAR-T細胞約10~約10個を含む。場合によって、MUC16特
異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T細胞約10~約10個を含む
。場合によって、MUC16特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T細
胞約10~約10個を含む。場合によって、MUC16特異的CAR-T細胞の量は
、1kg当たりのCAR-T細胞約10~約10個を含む。場合によって、MUC1
6特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T細胞約10~約10個を
含む。場合によって、MUC16特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-
T細胞約10~約10個を含む。場合によって、MUC16特異的CAR-T細胞の
量は、1kg当たりのCAR-T細胞約10~約10個を含む。場合によって、MU
C16特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T細胞約10~約10
個を含む。場合によって、MUC16特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCA
R-T細胞約10~約10個を含む。場合によって、MUC16特異的CAR-T細
胞の量は、1kg当たりのCAR-T細胞約10~約10個を含む。場合によって、
MUC16特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T細胞約10~約1
個を含む。場合によって、MUC16特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりの
CAR-T細胞約10~約10個を含む。一部の場合には、MUC16特異的CAR
-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T細胞約10個を含む。一部の場合には、M
UC16特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T細胞約10個を含む
。一部の場合には、MUC16特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T
細胞約10個を含む。一部の場合には、MUC16特異的CAR-T細胞の量は、1k
g当たりのCAR-T細胞約10個を含む。一部の場合には、MUC16特異的CAR
-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T細胞約10個を含む。一部の場合には、M
UC16特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T細胞約10個を含む
。一部の場合には、MUC16特異的CAR-T細胞の量は、1kg当たりのCAR-T
細胞約10個を含む。一部の場合には、MUC16特異的CAR-T細胞の量は、1k
g当たりのCAR-T細胞約10個を含む。
免疫エフェクター細胞の供給源
ある特定の態様では、本明細書で記載される実施形態は、リダイレクトされた、抗原特
異的免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、Treg細胞、NK細胞、またはNK T
細胞)を作り出し、かつ/またはこれを拡大増殖させる方法であって、細胞に、CARを
コードするDNA(またはRNA)構築物を含有する発現ベクターによりトランスフェク
トし、次いで、任意選択で、細胞を、フィーダー細胞、組換え抗原、または受容体に対す
る抗体で刺激して、細胞を増殖させるステップを含む方法を含む。ある特定の態様では、
CARを発現するように操作された細胞(または細胞集団)は、肝細胞、iPS細胞、i
PS細胞から分化したT細胞、免疫エフェクター細胞、またはこれらの細胞の前駆細胞で
ある。
免疫エフェクター細胞の供給源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。場
合によって、免疫エフェクター細胞は、幹細胞または人工多能性幹細胞(iPSC)から
分化させることもできる。したがって、実施形態に従い操作するための細胞は、臍帯血、
末梢血、ヒト胚性幹細胞、またはiPSCから単離することができる。例えば、同種T細
胞は、キメラ抗原受容体を含むように(そして、任意選択で、機能的なTCRを欠くよう
に)改変することができる。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核
細胞(PBMC)に由来するT細胞などの初代ヒトT細胞である。PBMCは、末梢血か
ら回収することもでき、G-CSF(顆粒球コロニー刺激因子)による刺激の後で、骨髄
または臍帯血から回収することもできる。一態様では、免疫エフェクター細胞は汎T細胞
である。トランスフェクションまたは形質導入(例えば、CAR発現構築物の)の後、細
胞を、速やかに輸注することもでき、凍結保存することもできる。ある特定の態様では、
トランスフェクションまたは形質導入の後、細胞は、輸注の準備ができるまでIL-2お
よび/またはIL-21を含みうるサイトカインバス内で保存されうる。ある特定の態様
では、トランスフェクションの後、細胞は、細胞への遺伝子導入後、約1、2、3、4、
5日間またはこれを超える日数以内に、ex vivoにおいて、バルク集団として、数
日間、数週間、または数カ月間にわたり繁殖させることができる。さらなる態様では、ト
ランスフェクションの後、トランスフェクト細胞を、クローニングし、組み込まれるか、
またはエピソーム内に維持された、単一の発現カセットまたはプラスミドの存在、および
キメラ抗原受容体の発現を裏付けるクローンを、ex vivoにおいて拡大増殖させる
。拡大増殖のために選択されたクローンは、抗原を発現する標的細胞を特異的に認識し、
溶解させる能力を裏付ける。組換えT細胞は、IL-2または共通のガンマ鎖に結合する
他のサイトカイン(例えば、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、および他
のサイトカイン)を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えT細胞は、人工
抗原提示細胞を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えT細胞は、人工抗原
提示細胞に接する形で拡大増殖させることもでき、T細胞表面上のCD3を架橋する、O
KT3などの抗体により拡大増殖させることもできる。組換えT細胞のサブセットは、磁
気ビーズベースの単離法および/または蛍光活性化細胞分取技術の使用により、さらに選
択することができ、AaPCと共にさらに培養することができる。さらなる態様では、遺
伝子改変細胞は、凍結保存することができる。
T細胞はまた、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹
水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の供給源からも得ることができる。本発明
の、ある特定の実施形態では、当技術分野において入手可能な、任意の数のT細胞株を使
用することができる。本開示の、ある特定の実施形態では、T細胞は、Ficoll(登
録商標)分離など、当業者に公知の、任意の数の技法を使用して、対象から回収された血
液単位から得ることができる。複数の実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞は、
アフェレーシスにより得る。アフェレーシス生成物は、典型的に、T細胞、単球、顆粒球
、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。一実施形
態では、アフェレーシスにより回収された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を、
その語における加工ステップのために、適切な緩衝液中または培地中に入れる。本発明の
一実施形態では、細胞を、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)で洗浄する。代替的な実施形
態では、洗浄液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠く場合もあり、全てではないが
、多くの二価カチオンを欠く場合もある。カルシウムの非存在下における初期活性化ステ
ップは、活性化の強化をもたらす。当業者がたやすく理解する通り、洗浄ステップは、製
造元の指示書に従い、半自動式「フロースルー」型遠心分離機(例えば、Cobe 29
91細胞プロセッサー、Baxter CytoMate、またはHaemonetic
s Cell Saver 5)を使用することなど、当業者に公知の方法により達する
ことができる。洗浄の後、細胞を、例えば、Ca2+非含有PBS、Mg2+非含有PB
S、Plasmalyte A、または緩衝液を伴うかもしくは伴わない、他の生理食塩
液溶液など、様々な生体適合性の緩衝液中に再懸濁させることができる。代替的に、アフ
ェレーシス試料の、所望されない構成要素を除去し、細胞を、培養培地中に、直接再懸濁
させることもできる。
別の実施形態では、例えば、PERCOLL(登録商標)勾配を介する遠心分離、また
は対向流遠心溶出により、赤血球を溶解させ、単球を枯渇させることにより、T細胞を、
末梢血リンパ球から単離する。CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45R
A+、およびCD45RO+T細胞など、T細胞の特異的亜集団も、陽性選択法または陰
性選択法により、さらに単離することができる。別の実施形態では、CD14+細胞は、
T細胞集団から枯渇される。例えば、一実施形態では、T細胞を、DYNABEADS(
登録商標)M-450 CD3/CD28 Tなどの、抗CD3/抗CD28(すなわち
、3×28)コンジュゲートビーズを伴う、所望のT細胞陽性選択に十分な時間にわたる
インキュベーションにより単離する。一実施形態では、時間は、約30分間である。さら
なる実施形態では、時間は、30分間~36時間、またはこれより長い時間、およびこれ
らの間の任意の整数値の時間の範囲である。さらなる実施形態では、時間は、少なくとも
1、2、3、4、5、または6時間である。さらに別の実施形態では、時間は、10~2
4時間である。一実施形態では、インキュベーション時間は、24時間である。白血病を
伴う患者からのT細胞の単離ための、24時間など、長いインキュベーション時間の使用
は、細胞収率を増大させうる。腫瘍組織または免疫障害個体から、腫瘍浸潤リンパ球(T
IL)を単離する状況など、T細胞が、他の細胞型と比較して少数である、任意の状況に
おいては、より長いインキュベーション時間を使用してT細胞を単離することができる。
さらに、長いインキュベーション時間の使用は、CD8+ T細胞の捕捉効率も増加させ
うる。したがって、単に、時間を短くするかまたは長くすることにより、T細胞を、CD
3/CD28ビーズに結合させることが可能となり、かつ/またはビーズの、T細胞に対
する比(本明細書で、さらに記載される通り)を増加もしくは減少させることにより、T
細胞の亜集団を、培養の開始時、もしくは工程中の他の時点において、優先的に、陽性も
しくは陰性に選択することができる。加えて、ビーズ上または他の表面上の、抗CD3お
よび/または抗CD28抗体の比を増加または減少させることにより、T細胞の亜集団を
、培養の開始時、または他の所望の時点において、優先的に、陽性または陰性に選択する
ことができる。当業者は、本発明の文脈では、複数ラウンドにわたる選択もまた、使用し
うることを認識するであろう。ある特定の実施形態では、選択手順を実施し、「選択され
なかった」細胞を、活性化工程および拡大増殖工程において使用することも所望でありう
る。「選択されなかった」細胞はまた、さらなるラウンドにわたる選択にかけることもで
きる。
陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを指向
する抗体の組合せにより達することができる。1つの方法は、陰性選択された細胞上に存
在する細胞表面マーカーを指向する、モノクローナル抗体のカクテルを使用する、細胞分
取および/または陰性の磁気免疫接着もしくはフローサイトメトリーを介する選択である
。例えば、CD4+細胞を、陰性選択により濃縮するために、モノクローナル抗体カクテ
ルは、典型的に、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびC
D8に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、典型的に、CD4+、CD25+、
CD62Lhi、GITR+、およびFoxP3+を発現する調節性T細胞を、濃縮また
は陽性選択することが所望でありうる。代替的に、ある特定の実施形態では、調節性T細
胞を、抗CD25コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択法により枯渇させることが
できる。
陽性選択または陰性選択により、所望の細胞集団を単離するために、細胞の濃度および
表面(例えば、ビーズなどの粒子)を変動させることができる。ある特定の実施形態では
、ビーズと細胞とを、併せて混合する容量を著明に減少させて(すなわち、細胞の濃度を
増加させて)、細胞とビーズとの最大の接触を確保することが所望でありうる。例えば、
一実施形態では、1ml当たりの細胞20億個の濃度を使用する。一実施形態では、1m
l当たりの細胞10億個の濃度を使用する。さらなる実施形態では、1ml当たりの細胞
1億個を超えるものを使用する。さらなる実施形態では、1ml当たりの細胞1000万
、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、450
0万、または5000万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、1ml当た
りの細胞7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、または1億個
の細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、1ml当たりの細胞1億2500万また
は1億5000万個の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、
および細胞の拡大増殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、
CD28陰性T細胞、または多くの腫瘍細胞(すなわち、白血病性血液、腫瘍組織など)
が存在する試料に由来する細胞など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、よ
り効率的な捕捉を可能とする。このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり
、得ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、CD28の発現が通常低度で
ある、CD8+T細胞の、より効率的な選択を可能とする。
関連する実施形態では、低濃度の細胞を使用することが所望でありうる。T細胞と表面
(例えば、ビーズなどの粒子)との混合物を、著明に希釈することにより、粒子と細胞と
の相互作用を最小化する。これは、粒子に結合する、高量の所望の抗原を発現する細胞を
選択する。例えば、CD4+T細胞は、高レベルのCD28を発現し、希釈濃度のCD8
+T細胞より効率的に捕捉される。一実施形態では、使用される細胞濃度は、1ml当た
りの細胞5×106個である。他の実施形態では、使用される濃度は、1ml当たりの細
胞約1×105個~1ml当たりの細胞1×106個、およびこれらの間の任意の整数値
でありうる。
他の実施形態では、細胞は、速度を変動させて、2~10℃または室温で、長さを変動
させる時間にわたり、ロテーター上でインキュベートすることができる。
刺激されるT細胞はまた、洗浄ステップの後で、凍結させることもできる。血漿および
血小板を除去する洗浄ステップの後で、細胞を、凍結用溶液中に懸濁させることができる
。当技術分野では、多くの凍結用溶液および凍結パラメータが公知であり、この文脈でも
有用であろうが、1つの方法は、20%のDMSOおよび8%のヒト血清アルブミンを含
有するPBS、もしくは10%のデキストラン40および5%のデキストロース、20%
のヒト血清アルブミン、ならびに7.5%のDMSOを含有する培養培地、もしくは31
.25%のPlasmalyte-A、31.25%のデキストロース5%、0.45%
のNaCl、10%のデキストラン40および5%のデキストロース、20%のヒト血清
アルブミン、ならびに7.5%のDMSO、または例えば、HespanおよびPlas
malyte Aを含有する、他の適切な細胞凍結用培地の使用を伴い、次いで、細胞を
、1分間当たり1℃の速度で、-80℃へと凍結させ、液体窒素保管タンクの蒸気相中で
保存する。制御型凍結の他の方法を使用しうるほか、-20℃または液体窒素中における
速やかな非制御型凍結も使用しうる。ある特定の実施形態では、凍結保存された細胞を、
本明細書で記載される通りに、融解させ、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化の前に
、室温で、1時間にわたり休眠させる。
ある特定の実施形態ではまた、本明細書で記載される、拡張細胞が必要とされうる時点
より前の時期における、血液試料またはアフェレーシス生成物の、対象からの回収も提示
される。したがって、拡大増殖させる細胞の供給源は、任意の必要な時点において回収す
ることができ、T細胞など、所望の細胞を、本明細書で記載されるT細胞療法などのT細
胞療法から利益を得る、任意の数の疾患または状態のためのT細胞療法におけるその後の
使用のために、単離し、凍結させることができる。一実施形態では、血液試料またはアフ
ェレーシスを、一般に、健常対象から採取する。ある特定の実施形態では、血液試料また
はアフェレーシスを、一般に、疾患を発症する危険性があるが、疾患をいまだ発症してい
ない健常対象から採取し、目的の細胞を、その後の使用のために単離し、凍結させる。あ
る特定の実施形態では、T細胞を、その後の時点において、拡大増殖させ、凍結させ、使
用することができる。ある特定の実施形態では、試料を、患者から、本明細書で記載され
る特定の疾患についての診断の直後であるが、任意の処置の前において回収する。さらな
る実施形態では、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放
射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およ
びFK506などの免疫抑制剤、抗体、またはCAMPATH、抗CD3抗体、シトキサ
ン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ス
テロイド、FR901228、および照射など、他の免疫除去剤などの薬剤による処置を
含むがこれらに限定されない、任意の数の妥当な処置モダリティーの前に、対象に由来す
る血液試料またはアフェレーシスから単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホス
ファターゼである、カルシニューリン(シクロスポリンおよびFK506)を阻害するか
、または、増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なp70S6キナーゼを阻害する(ラパマ
イシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, (1991)、Henderson et al., Immun 73:316-32
1, (1991)、Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, (1993))。さらなる実施形
態では、細胞を、患者のために単離し、骨髄移植または幹細胞移植、フルダラビンなどの
化学療法剤、外部ビーム放射線療法(XRT)、シクロホスファミド、またはOKT3も
しくはCAMPATHなどの抗体を使用するT細胞除去療法を伴う(例えば、この前に、
これと同時に、またはこの後で)その後の使用のために凍結させる。別の実施形態では、
細胞を、あらかじめ単離し、CD20と反応する薬剤、例えば、RituxanなどのB
細胞除去療法の後における処置のためのその後の使用のために凍結させることができる。
本発明の、さらなる実施形態では、T細胞を、処置後における患者から直接得る。この
点で、ある特定のがん処置、特に、免疫系を損なう薬物による処置の後であって、患者が
通常、処置から回復する期間中の、処置の直後である、処置の後において、得られるT細
胞お品質は、最適でありうるか、またはex vivoにおいて拡大増殖するそれらの能
力について改善されうることが観察されている。同様に、本明細書で記載される方法を使
用する、ex vivoにおける操作の後、これらの細胞は、生着の延長、およびin
vivoにおける拡大増殖に好ましい状態でありうる。したがって、本発明の文脈内では
、この回復期において、T細胞、樹状細胞、または他の造血系列の細胞を含む血液細胞を
回収することが想定される。さらに、ある特定の実施形態では、動員(例えば、GM-C
SFによる動員)レジメンおよびコンディショニングレジメンを使用して、対象において
、とりわけ、治療後における規定された時間窓において、特定の細胞型の再増殖、再循環
、再生、および/またはぞうが好適となる条件を創出することができる。例示的な細胞型
は、T細胞、B細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞を含む。
T細胞の活性化および拡大増殖
本明細書に記載されるCARを発現するようにT細胞を操作する前であれ後であれ、T
細胞は、一般に、例えば、米国特許第6,352,694号明細書;同第6,534,0
55号明細書;同第6,905,680号明細書;同第6,692,964号明細書;同
第5,858,358号明細書;同第6,887,466号明細書;同第6,905,6
81号明細書;同第7,144,575号明細書;同第7,067,318号明細書;同
第7,172,869号明細書;同第7,232,566号明細書;同第7,175,8
43号明細書;同第5,883,223号明細書;同第6,905,874号明細書;同
第6,797,514号明細書;同第6,867,041号明細書;および米国特許出願
公開第20060121005号明細書において記載されている方法を使用して活性化さ
せ、拡大増殖させることができる。
一般に、本明細書で記載されるT細胞を、CD3/TCR複合体と関連するシグナルを
刺激する薬剤、およびT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを接合させた表面
と接触させることにより拡大増殖させる。特に、T細胞集団は、本明細書で記載される通
り、表面上に固定化させた、抗CD3抗体、もしくはこの抗原結合性断片、または抗CD
2抗体との接触、あるいはカルシウムイオノフォアを伴う、タンパク質キナーゼC活性化
因子(例えば、ブリオスタチン)との接触などにより刺激することができる。T細胞表面
上のアクセサリー分子を共刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用
する。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗CD
3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+T細胞またはCD8+
T細胞の増殖を刺激するには、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることがで
きる。抗CD28抗体の例は、9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone、
Besancon、France)を含み、当技術分野で一般に公知の他の方法と同様に
使用することができる(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, (1998)、Haa
nen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, (1999)、Garland et al., J. Immunol Met
h. 227(1-2):53-63, (1999))。
ある特定の実施形態では、T細胞のための一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、
異なるプロトコールによりもたらされる。例えば、各シグナルをもたらす薬剤は、溶液中
とする場合もあり、表面へとカップリングさせる場合もある。表面へとカップリングさせ
る場合、薬剤は、同じ表面へとカップリングさせることもでき(すなわち、「シス」構成
)、別個の表面へとカップリングさせることもできる(すなわち、「トランス」構成)。
代替的に、1つの薬剤を、表面へとカップリングさせ、他の薬剤を、溶液中とすることも
できる。一実施形態では、共刺激シグナルをもたらす薬剤を、細胞表面に結合させ、一次
活性化シグナルをもたらす薬剤を、溶液とするか、または表面へとカップリングさせる。
ある特定の実施形態では、いずれの薬剤も、溶液中とする。別の実施形態では、薬剤は、
可溶性形態であることが可能であり、次いで、Fc受容体もしくは抗体、または薬剤に結
合する他の結合剤を発現する細胞などの表面へと架橋される。この点で、本発明における
、T細胞の活性化および拡大増殖における使用のために想定される人工抗原提示細胞(a
APC)については、例えば、米国特許出願公開第20040101519号明細書およ
び同20060034810号明細書を参照されたい。
一実施形態では、2つの薬剤を、同じビーズ上に、すなわち、「シス」であるか、また
は別個のビーズへと、すなわち、「トランス」である、ビーズ上に固定化させる。例を目
的として述べると、一次活性化シグナルをもたらす薬剤は、抗CD3抗体またはこの抗原
結合性断片であり、共刺激シグナルをもたらす薬剤は、抗CD28抗体またはこの抗原結
合性断片であり、両方の薬剤を、等分子量で、同じビーズへと、共固定化させる。一実施
形態では、CD4+T細胞の拡大増殖およびT細胞の増殖のために、ビーズへと結合させ
た各抗体の、1:1の比を使用する。本発明のある特定の態様では、ビーズへと結合させ
た抗CD3:CD28抗体の比を、1:1の比を使用して観察される拡大増殖と比較した
、T細胞の拡大増殖の増大が観察されるように使用する。特定の一実施形態では、1:1
の比を使用して観察される拡大増殖と比較した、約1~約3倍の増大が観察される。一実
施形態では、ビーズへと結合させたCD3:CD28抗体の比は、100:1~1:10
0、およびこれらの間の全ての整数値の範囲である。本発明の一態様では、抗CD3抗体
より多くの抗CD28抗体を、粒子へと結合させる、すなわち、CD3:CD28の比は
、1未満である。本発明のある特定の実施形態では、抗CD28抗体の、ビーズへと結合
させた抗CD3に対する比は、2:1を超える。特定の一実施形態では、ビーズへと結合
させたCD3:CD28の、1:100の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと
結合させたCD3:CD28の、1:75の比を使用する。さらなる実施形態では、ビー
ズへと結合させたCD3:CD28の、1:50の比を使用する。別の実施形態では、ビ
ーズへと結合させたCD3:CD28の、1:30の比を使用する。複数の実施形態では
、ビーズへと結合させたCD3:CD28の、1:10の比を使用する。別の実施形態で
は、ビーズへと結合させたCD3:CD28の、1:3の比を使用する。さらに別の実施
形態では、ビーズへと結合させたCD3:CD28の、3:1の比を使用する。
1:500~500:1、およびこれらの間の任意の整数値である、粒子の、細胞に対
する比を使用して、T細胞または他の標的細胞を刺激することができる。当業者がたやす
く理解しうる通り、粒子の、細胞に対する比は、標的細胞と比べた粒子サイズに依存しう
る。例えば、小型サイズのビーズが、少数の細胞だけに結合しうるのに対し、大型のビー
ズは、多くの細胞に結合しうるであろう。ある特定の実施形態では、細胞の、粒子に対す
る比は、1:100~100:1、およびこれらの間の任意の整数値の範囲であり、さら
なる実施形態では、比は、1:9~9:1、およびこれらの間の任意の整数値を含み、こ
れらもまた、T細胞を刺激するのに使用しうる。抗CD3/抗CD28カップリング粒子
の、T細胞に対する比であって、T細胞の刺激を結果としてもたらす比は、上記で言及し
た通り、変動しうるが、ある特定の値は、1:100、1:50、1:40、1:30、
1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:
2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10
:1、および15:1を含み、1つの比は、少なくとも1:1のT粒子の、細胞に対する
比(at least 1:1 particles per T cell)である。一実施形態では、1:1またはこれ
未満の、粒子の、細胞に対する比を使用する。特定の一実施形態では、粒子:細胞比は、
1:5である。さらなる実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、刺激日に応じて変動
しうる。例えば、一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、1日目には、1:1~1
0:1であり、さらなる粒子を、細胞へと、その後、最長10日間にわたり、毎日または
隔日で追加し、最終的な比を1:1~1:10とする(追加日における細胞カウントに基
づく)。特定の一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、第1の刺激日には、1:1
であり、第3の刺激日および第5の刺激日には、1:5へと調整される。別の実施形態で
は、粒子を、1日目における、1:1の最終比、ならびに第3の刺激日および第5の刺激
日における1:5へと、毎日または隔日で追加する。別の実施形態では、粒子の、細胞に
対する比は、第1の刺激日には、2:1であり、第3の刺激日および第5の刺激日には、
1:10へと調整される。別の実施形態では、粒子を、1日目における、1:1の最終比
、ならびに第3の刺激日および第5の刺激日における1:10へと、毎日または隔日で追
加する。当業者は、様々な他の比も、本発明における使用に適しうることを理解するであ
ろう。特に、比は、粒子のサイズ、ならびに細胞のサイズおよび種類に応じて変動するで
あろう。
本明細書に記載されるさらなる実施形態では、T細胞などの免疫エフェクター細胞を、
薬剤コーティングビーズと組み合わせ、その後、ビーズと細胞とを分離し、次いで、細胞
を培養する。代替的な実施形態では、培養の前に、薬剤コーティングビーズと、細胞とを
分離せず、併せて培養する。さらなる実施形態では、ビーズおよび細胞を、まず、磁力な
どの力を適用することにより濃縮する結果として、細胞表面マーカーのライゲーションの
増加をもたらし、これにより、細胞の刺激を誘導する
例を目的として述べると、抗CD3および抗CD28を接合させた常磁性ビーズ(3×
28ビーズ)を、T細胞に接触させることにより、細胞表面タンパク質をライゲーション
させることができる。一実施形態では、細胞(例えば、T細胞104~109個)と、ビ
ーズ(例えば、比を1:1とする、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3
/CD28 T常磁性ビーズ、またはMiltenyi Biotec製のMACS(登
録商標)MicroBeads)とを、緩衝液中、例えば、PBS(カルシウムおよびマ
グネシウムなどの二価カチオンを伴わない)中で組み合わせる。ここでもまた、当業者は
、任意の細胞濃度を使用しうることをたやすく理解することができる。例えば、標的細胞
は、試料中で極めて稀であり、試料のうちの0.01%だけを含む場合もあり、全試料(
すなわち、100%)が、目的の標的細胞を含む場合もある。したがって、任意の細胞数
が、本発明の文脈内にある。ある特定の実施形態では、粒子と細胞とを、併せて混合する
容量を著明に減少させて(すなわち、細胞の濃度を増大させて)、細胞と粒子との最大の
接触を確保することが所望でありうる。例えば、一実施形態では、約1ml当たりの細胞
20億個の濃度を使用する。別の実施形態では、1ml当たりの細胞1億個を超えるもの
を使用する。さらなる実施形態では、1ml当たりの細胞1000万、1500万、20
00万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万、または500
0万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、1ml当たりの細胞7500万
、8000万、8500万、9000万、9500万、または1億個の細胞濃度を使用す
る。さらなる実施形態では、1ml当たりの細胞1億2500万または1億5000万個
の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、および細胞の拡大増
殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、CD28陰性T細胞
など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、より効率的な捕捉を可能とする。
ある特定の実施形態では、このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得
ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、CD28の発現が通常低度である
、CD8T細胞の、より効率的な選択を可能とする。
本明細書に記載される一実施形態では、混合物を、数時間(約3時間)~約14日間ま
たはこれらの間の任意の整数値時間にわたり培養することができる。別の実施形態では、
混合物を、21日間にわたり培養することができる。本発明の一実施形態では、ビーズお
よびT細胞を、併せて、約8日間にわたり培養する。別の実施形態では、ビーズおよびT
細胞を、併せて、2~3日間にわたり培養する。T細胞の培養期間が、60日間またはこ
れを超えるように、数サイクルにわたる刺激もまた、所望でありうる。T細胞の培養に適
切な条件は、増殖および生存に必要な因子であって、血清(例えば、ウシ胎仔血清または
ヒト血清)、インターロイキン2(IL-2)、インスリン、IFN-ガンマ、IL-4
、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、およびT
NF-アルファ、または当業者に公知である、細胞の増殖のための、他の任意の添加剤を
含む因子を含有しうる、適切な培地(例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640
、またはX-vivo 15(Lonza))を含む。細胞の増殖のための、他の添加剤
は、界面活性剤、プラズマネート、およびN-アセチルシステインおよび2-メルカプト
エタノールなどの還元剤を含むがこれらに限定されない。培地は、RPMI 1640、
AIM-V、DMEM、MEM、アルファ-MEM、F-12、X-Vivo 15およ
びX-Vivo 20、Optimizer、アミノ酸の添加、ピルビン酸ナトリウム、
ならびにビタミン、無血清もしくは適量の血清(または血漿)の補充、または規定された
セットのホルモン、ならびに/あるいはT細胞の増殖および拡大増殖に十分な量のサイト
カインを含みうる。抗生剤、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養
物に限り組み入れ、対象へと輸注される細胞培養物には組み入れない。標的細胞は、増殖
を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例え
ば、空気+5%のCO2)下で維持する。
変動させる刺激時間へと曝露されたT細胞は、異なる特徴を呈しうる。例えば、典型的
な血液生成物またはアファレーシスされた末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害性T細胞集
団またはサプレッサーT細胞集団(TC、CD8+)より多くのヘルパーT細胞集団(T
H、CD4+)を有する。CD3受容体およびCD28受容体を刺激することによる、e
x vivoにおけるT細胞の拡大増殖は、約8~9日目の前には、主にTH細胞からな
るが、約8~9日目の後では、ますます多くのTC細胞の集団を含むT細胞の集団をもた
らす。したがって、処置の目的に応じて、対象に、主にTH細胞を含むT細胞集団を輸注
することも、有利でありうる。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットを単離した場合
、このサブセットを、より大きな程度で拡大増殖させることが有益でありうる。
さらに、CD4マーカーおよびCD8マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、著明
に変動するが、大部分は、細胞拡大増殖工程の経過中において、再現可能な形で変動する
。したがって、このような再現性は、特殊な目的のためのT細胞生成物の活性化を調整す
る能力を可能とする。
場合によって、実施形態の免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)を、AaPC (
activating and propagating cell)と共に共培養して
、細胞の拡大増殖を支援する。AaPCはまた、人工抗原提示細胞(AaPC)と称する
こともできる。例えば、抗原提示細胞(APC)は、実施形態の治療用組成物および細胞
療法用生成物の調製において有用である。一態様では、AaPCは、遺伝子改変されたK
562細胞でありうる。抗原提示系の調製および使用に関する、一般的な指針については
、例えば、それらの各々が参照により組み込まれる、米国特許第6,225,042号明
細書、同第6,355,479号明細書、同第6,362,001号明細書、および同第
6,790,662号明細書、米国特許出願公開第2009/0017000号明細書お
よび同第2009/0004142号明細書、ならびに国際公開第2007/10300
9号パンフレットを参照されたい。実施形態についてのなおさらなる態様では、遺伝子改
変されたCAR細胞の培養は、CARを発現する免疫エフェクター細胞の拡大増殖を刺激
する、樹状細胞またはAaPC (activating and propagati
ng cell)の存在下で、遺伝子改変されたCAR細胞を培養することを含む。なお
さらなる態様では、AaPCは、AaPCの表面上で発現したCAR結合性抗体またはこ
の断片を含む。AaPCは、場合によって、T細胞を活性化させるかまたは共刺激する、
さらなる分子を含みうる。さらなる分子は、場合によって、膜結合型Cγサイトカインを
含みうる。なおまださらなる態様では、AaPCは、不活化させているかもしくは照射さ
れているか、または感染性物質について調べられ、これを含まないことが確認されている
。なおさらなる態様では、AaPCの存在下における遺伝子改変されたCAR細胞の培養
は、IL-15、IL-21、および/またはIL-2などの可溶性サイトカインを含む
培地中で、遺伝子改変されたCAR細胞を培養することを含む。細胞を、約10:1~約
1:10、約3:1~約1:5、約1:1~約1:3(免疫エフェクター細胞対AaPC
)、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養することができる。例えば、T細胞
およびAaPCの共培養は、約1:1、約1:2または約1:3の比でありうる。
一態様では、AaPCは、CD137Lを発現しうる。一部の態様では、AaPCは、
CAR細胞によってターゲティングされる抗原、例えば、MUC16(全長、トランケー
ト型、またはこれらの任意の変異体)をさらに発現しうる。他の態様では、AaPCは、
CD64、CD86、またはmIL15をさらに発現しうる。ある特定の態様では、Aa
PCは、例えば、OKT3および/またはUCHT1など、少なくとも1つの抗CD3抗
体クローンを発現しうる。一態様では、AaPCを不活化して(例えば、照射して)、そ
れらの増殖可能性を消失させることができる。一態様では、AaPCは、感染性物質につ
いて調べられ、これを含まないことが確認されている場合がある。当技術分野では、この
ようなAaPCを作製するための方法が公知である。一態様では、AaPCを伴うCAR
改変T細胞集団の培養は、細胞を、約10:1~約1:10、約3:1~約1:5、約1
:1~約1:3(T細胞対AaPC)、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養
することを含みうる。例えば、T細胞およびAaPCの共培養は、約1:1、約1:2ま
たは約1:3の比でありうる。一態様では、培養するステップは、アミノビスホスホネー
ト(例えば、ゾレドロン酸)と共に培養することをさらに含みうる。
一態様では、遺伝子改変CAR細胞の集団は、対象へと速やかに輸注される、または凍
結保存される。別の態様では、遺伝子改変CAR細胞の集団は、対象への輸注の前に、サ
イトカインバス内で保存される。さらなる態様では、遺伝子改変CAR細胞の集団は、1
、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35 42日間、49、56、63、ま
たは70日間以内で、培養および/または刺激される。ある実施形態では、刺激は、CA
R陽性T細胞の増殖を促進するように、遺伝子改変CAR T細胞のAaPCとの共培養
を含む。別の態様では、遺伝子改変されたCAR細胞の集団を、刺激1回、刺激2回、刺
激3回、刺激4回、刺激5回、刺激5回、刺激6回、刺激7回、刺激8回、刺激9回、ま
たは刺激10回を超えない回数にわたり刺激する。場合によって、遺伝子改変された細胞
を、AaPCの存在下にあるex vivoでは培養しない。一部の特殊な場合には、実
施形態の方法は、トランスフェクションステップおよび/または培養するステップの後で
、細胞集団を、CARを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)について濃縮
するステップをさらに含む。濃縮するステップは、蛍光活性化細胞分取(FACS)して
、CARを発現する細胞について分取することを含みうる。さらなる態様では、CARを
発現する細胞について分取することは、CAR結合性抗体の使用を含む。濃縮するステッ
プはまた、CD56+細胞の枯渇も含みうる。実施形態についての、なおまださらなる態
様では、方法は、遺伝子改変されたCAR細胞の集団についての凍結保存試料をさらに含
む。
場合によって、AaPCを、さらなるプロセシングを伴わずに、ペプチドの、MHC分
子との直接的な結合を可能とする、最適な長さのペプチドと共にインキュベートする。代
替的に、細胞は、目的の抗原(すなわち、MHC非依存型の抗原認識の場合)を発現しう
る。さらに、場合によって、APCは、特異的なCARポリペプチドまたは一般的なCA
Rポリペプチド(例えば、uAaPC(universal activating a
nd propagating cell)に結合する抗体を発現しうる。このような方
法については、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第2014/190273
号パンフレットにおいて開示されている。ペプチド-MHC分子または目的の抗原に加え
て、AaPC系はまた、少なくとも1つの外因性支援分子も含みうる。任意の適切な数お
よび組合せの支援分子を利用することができる。支援分子は、共刺激分子および接着分子
などの支援分子から選択することができる。例示的な共刺激分子は、CD70およびB7
.1(B7.1は、かつては、B7として公知であり、また、CD80としても公知であ
った)を含み、これらは、とりわけ、T細胞の表面上のCD28分子および/またはCT
LA-4分子に結合し、これにより、例えば、T細胞の拡大増殖、Th1の分化、短期的
なT細胞の生存、およびインターロイキン(IL)2など、サイトカインの分泌に影響を
及ぼす。接着分子は、セレクチンなどの炭水化物結合性糖タンパク質、インテグリンなど
の膜貫通結合生糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、および例
えば、細胞間または細胞-マトリックス間の接触を促進する、細胞間接着分子(ICAM
)などの、1回膜貫通免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリータンパク質を含みうる
。例示的な接着分子は、LFA-3およびICAM-1などのICAM、を含む。共刺激
分子および接着分子を含む、例示的な支援分子の選択、クローニング、調製、および発現
に有用な技法、方法、および試薬については、例えば、参照により本明細書に組み込まれ
る、米国特許第6,225,042号明細書、同第6,355,479号明細書、および
同第6,362,001号明細書において例示されている。
AaPCとなるように選択される細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞
内ペプチドトラフィッキング、および/またはMHCクラスI分子もしくはクラスII分
子の細胞内ペプチドローディングを欠損させているか、あるいは。変温性(すなわち、哺
乳動物細胞株より、温度刺激に対する感受性が小さい)であるか、あるいは欠損および変
温特性の両方を有する。好ましくは、AaPCとなるように選択される細胞はまた、細胞
へと導入される、外因性のMHCクラスI分子またはクラスII分子、および支援分子の
構成要素に対する、少なくとも1つの内因性対応物(例えば、内因性のMHCクラスI分
子もしくはクラスII分子、および/または上記で記載した内因性支援分子)を発現する
能力も欠く。さらに、AaPCは、AaPCを作出するための、それらの改変の前に、細
胞が保有していた欠損および変温特性を保持することが好ましい。例示的なAaPCは、
昆虫細胞株など、TAP(transporter associated with
antigen processing)欠損細胞株を構成するか、またはこれに由来す
る。例示的な変温性昆虫細胞株は、Schneider 2細胞株などのショウジョウバ
エ(Drosophila)属細胞株(例えば、Schneider 1972を参照されたい)である。Schn
eider 2細胞の調製、増殖、および培養のための例示的な方法は、米国特許第6,
225,042号明細書、同第6,355,479号明細書、および同第6,362,0
01号明細書において提示されている。
一実施形態ではまた、AaPCを、凍結融解サイクルにもかける。例示的な凍結融解サ
イクルでは、凍結が、迅速に生じるように、AaPCを含有する、適切なレセプタクルを
、適量の液体窒素、固体二酸化炭素(すなわち、ドライアイス)、または同様の低温材料
と接触させることにより、AaPCを凍結させることができる。次いで、凍結させたAP
Cを、AaPCの、低温材料からの摘出、および周囲の室温条件への曝露により、または
微温水浴もしくは手の温熱を利用して、融解時間の短縮を促進する、促進融解工程により
融解させる。加えて、融解の前に、AaPCを、凍結させ、長f時間にわたり保存するこ
とができる。凍結させたAaPCはまた、融解させ、次いで、さらなる使用の前に、凍結
乾燥させることもできる。好ましくは、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ポリエチレ
ングリコール(PEG)、および他の保存剤など、凍結融解手順に有害な影響を及ぼしう
る保存剤は、凍結融解サイクルを経るAaPCを含有する培地には非含有とするか、また
はこのような保存剤を本質的に欠く培地へのAaPCの導入などにより、本質的に除去す
る。
さらなる実施形態では、不活化の後で、細胞の増殖、複製、または核酸の発現が本質的
に生じないように、異種核酸およびAaPCに内因性の核酸を、架橋により不活化させる
ことができる。一実施形態では、AaPCを、外因性MHCおよび支援分子の発現、この
ような分子の、AaPC表面上の提示、ならびに提示されたMHC分子への、選択された
、1または複数のペプチドのローディングの後の時点において不活化させる。したがって
、このような、選択されたペプチドをロードした不活化AaPCは、増殖または複製が本
質的に不可能とされているが、選択されたペプチドの提示機能は保持する。好ましくは、
架橋はまた、AaPCの抗原提示細胞機能を、実質的に低下させずに、細菌およびウイル
スなどの汚染微生物を本質的に含まない、AaPCももたらす。したがって、架橋は、A
aPCを使用して開発される細胞療法製品の安全性に関する懸念を軽減する一助となる一
方、重要なAaPC機能を維持する。架橋およびAaPCに関する方法については、例え
ば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20090017000号
明細書を参照されたい。
ある特定の実施形態では、操作抗原提示細胞(APC)がさらに提供される。ex v
ivoにおいて、免疫エフェクター細胞を繁殖させるのに、このような細胞を、例えば、
上記で記載した通りに使用することができる。さらなる態様では、操作APC自体を、患
者へと投与し、これにより、in vivoにおける免疫エフェクター細胞の拡大増殖を
刺激することができる。実施形態の操作APC自体を、治療剤として使用することができ
る。他の実施形態では、操作APCを、標的抗原に特異的な内因性免疫エフェクター細胞
の活性化を刺激し、かつ/または標的抗原に特異的な、養子導入された免疫エフェクター
細胞の活性を増加させるか、もしくは存続を延長しうる治療剤として使用することができ
る。
本明細書で使用される「操作APC」という用語は、少なくとも第1のトランス遺伝子
を含み、第1のトランス遺伝子が、HLAをコードする細胞を指す。このような操作AP
Cは、抗原が、HLAと複合したAPCの表面上に提示されるように、抗原の発現のため
の第2のトランス遺伝子をさらに含みうる。一部の態様では、操作APCは、抗原を提示
した細胞型(例えば、樹状細胞)でありうる。さらなる態様では、操作APCは、T細胞
またはT細胞の前駆細胞など、通常、抗原を提示しない細胞型(「T-APC」と称する
)から作製することができる。したがって、一部の態様では、実施形態の操作APCは、
HLAが、標的抗原のエピトープと複合した操作APCの表面上で発現するように、標的
抗原をコードする第1のトランス遺伝子と、ヒト白血球抗原(HLA)をコードする第2
のトランス遺伝子とを含む。ある特定の具体的な態様では、操作APC内で発現するHL
Aは、HLA-A2である。
一部の態様では、実施形態の操作APCは、共刺激分子をコードする、少なくとも第3
のトランス遺伝子をさらに含みうる。共刺激分子は、膜結合型Cγサイトカインでありう
る、共刺激サイトカインでありうる。ある特定の態様では、共刺激サイトカインは、膜結
合型IL-15などのIL-15である。一部のさらなる態様では、操作APCは、編集
(または欠失)遺伝子を含みうる。例えば、PD-1、LIM-3、CTLA-4、また
はTCRなどの阻害性遺伝子は、遺伝子の発現を低減するかまたは消失させるように編集
することができる。実施形態の操作APCは、任意の目的の標的抗原をコードするトラン
ス遺伝子をさらに含みうる。
POC(point-of-care)
本開示の一実施形態では、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞を、POC(p
oint-of-care)施設で改変する。場合によって、改変免疫エフェクター細胞
はまた、操作T細胞とも呼ばれる。場合によって、POC(point-of-care
)施設は、処置を必要とする対象の近隣の病院または機関(例えば、医療機関)にある。
対象は、アファレーシスを受け、末梢血単核細胞(PBMC)またはPBMCのサブ集団
は、例えば、湿式分級またはFicoll分離により濃縮することができる。濃縮された
PBMCまたはPBMCのサブ集団は、さらなるプロセシングの前に任意の適切な凍結保
存用溶液中で凍結保存することができる。1つの場合には、ヒト血清アルブミンを含有す
る緩衝液を使用して、湿式分級工程を実施する。T細胞などの免疫エフェクター細胞は、
本明細書で記載される選択法により単離することができる。1つの場合には、T細胞につ
いての選択法は、T細胞上のCD3に特異的なビーズまたはCD4およびCD8に特異的
なビーズを含む。1つの場合には、ビーズは、常磁性ビーズでありうる。採取された免疫
エフェクター細胞は、改変の前に、任意の適切な凍結保存用溶液中で凍結保存することが
できる。免疫エフェクター細胞は、輸注に先立ち、最大で24時間、36時間、48時間
、72時間、または96時間にわたり融解させることができる。融解させた細胞は、改変
の前に、細胞培養緩衝液、例えば、ウシ胎仔血清(FBS)もしくはヒト血清ABを補充
した細胞培養緩衝液(例えば、RPMI)、またはIL-2およびIL-21などのサイ
トカインを含む緩衝液に入れることができる。別の態様では、採取された免疫エフェクタ
ー細胞は、凍結保存を必要とせずに、速やかに改変することができる。
場合によって、キメラ受容体、1もしくは複数の細胞タグ、および/またはサイトカイ
ンを、免疫エフェクター細胞へと操作/導入することにより、免疫エフェクター細胞を改
変し、次いで、対象へと、迅速に輸注する。場合によって、免疫エフェクター細胞の供給
源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。1つの場合には、免疫エフェクタ
ー細胞は、T細胞またはNK細胞でありうる。1つの場合には、キメラ受容体は、MUC
16 CARでありうる。別の場合には、サイトカインは、mbIL-15でありうる。
1つの場合には、mbIL-15は、配列番号69のmbIL-15、またはこの変異体
もしくは断片である。さらに別の場合には、mbIL-15の発現は、本明細書で記載さ
れる、リガンド誘導性遺伝子スイッチ発現系によりモジュレートされる。例えば、ベレジ
メクスなどのリガンドは、mbIL-15の発現をモジュレートするように対象へと送達
されうる。別の場合では、サイトカインは、IL-12でありうる。さらに別の場合では
、IL-12の発現は、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチ発現系によ
りモジュレートされる。例えば、ベレジメクスなどのリガンドを、対象へと送達して、I
L-12の発現をモジュレートすることができる。
別の態様では、ベレジメクスを、5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、
40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、または100mgで施
す。さらなる態様では、低用量のベレジメクスを、例えば、0.5mg、1mg、5mg
、10mg、15mg、または20mgで施す。一実施形態では、ベレジメクスを、改変
免疫エフェクター細胞を輸注する0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11
、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21日前に、対象へ
と投与する。さらなる実施形態では、ベレジメクスを、改変免疫エフェクター細胞の輸注
後、有効期間にわたり、約12時間ごとに1回、約24時間ごとに1回、約36時間ごと
に1回、または約48時間ごとに1回、対象へと投与する。一実施形態では、ベレジメク
ス投与のための有効期間は、約7、8、9、10、11、12、13、14、15、16
、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30日間である。他の実施形態では、休薬期間後の休眠期間の後、または対象が、再発を
被る場合に、ベレジメクスを再投与することができる。
対象に対する副作用が観察されるか、または処置が必要とされない、ある特定の場合に
は、例えば、セツキシマブを介して、in vivoにおける、改変免疫エフェクター細
胞の、条件付けアブレーションのために、本明細書で記載されるトランケート型表皮増殖
因子受容体タグなどの細胞タグを含む細胞タグを活性化させることができる。
一部の実施形態では、このような免疫エフェクター細胞を、図1~2Bに記載される構
築物により、電気穿孔を介して改変する。1つの場合には、電気穿孔を、Lonza製の
Nucleofector(商標)電気穿孔器などの電気穿孔器により実施する。他の実
施形態では、上述の構築物を含むベクターは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクタ
ーである。1つの場合には、非ウイルスベクターは、Sleeping Beautyト
ランスポゾン-トランスポザーゼ系を含む。1つの場合には、特異的配列を使用して、免
疫エフェクター細胞に電気穿孔する。例えば、免疫エフェクター細胞に、1つのトランス
ポゾンに続く、トランスポザーゼをコードするDNAに続く、第2のトランスポゾンを電
気穿孔することができる。別の場合には、免疫エフェクター細胞に、全てのトランスポゾ
ンと、トランスポザーゼとを、同時に電気穿孔することができる。別の場合には、免疫エ
フェクター細胞に、トランスポザーゼに続き、両方のトランスポゾンまたは1つのトラン
スポゾンを、同時に電気穿孔することができる。逐次的な電気穿孔を経ながら、免疫エフ
ェクター細胞を、次の電気穿孔ステップの前に、ある時間にわたり、休眠させることがで
きる。
場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、繁殖ステップおよび活性化ステップを経
ない。場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、インキュベーションステップまたは
培養ステップ(例えば、ex vivoにおける繁殖)を経ない。ある特定の場合には、
輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、IL-2およびIL21を含む緩衝液に入れ
る。他の場合には、輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、細胞培養緩衝液、例えば
、ウシ胎仔血清(FBS)を補充した細胞培養緩衝液(例えば、RPMI)に入れるか、
またはこの中で休眠させる。輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、採取し、洗浄し
、生理食塩緩衝液中で、対象への輸注のための調製物に製剤化することができる。
1つの場合には、輸注の前に、対象を、リンパ枯渇させている。他の場合には、リンパ
枯渇は、必要とされず、改変免疫エフェクター細胞は、対象へと、迅速に、輸注される。
例示的なリンパ枯渇レジメンを、下記の表4および5に一覧する。
さらなる場合には、対象は、最小リンパ枯渇を受ける。本明細書における最小リンパ枯
渇とは、リンパ枯渇レジメン後1日、2日、または3日以内に対象に輸注しうるような、
低減型リンパ枯渇プロトコールを指す。1つの場合には、低減型リンパ枯渇プロトコール
は、低用量のフルダラビンおよび/またはシクロホスファミドを含みうる。別の場合には
、低減型リンパ枯渇プロトコールは、短期間、例えば、1日間または2日間にわたるリン
パ枯渇を含みうる。
一実施形態では、キメラ受容体およびサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作
/導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、対象へと、迅速に輸注
する。他の場合には、キメラ受容体およびサイトカインを、細胞へと操作/導入すること
により、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、少なくとも0、0.5、1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、1
9、20、21、22、23,24、25、26、27、28、29、30、31、32
、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、
46、47、48、49、または50時間以内に、対象へと輸注する。他の場合には、キ
メラ受容体およびサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作/導入することにより
、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、0日間、<1日間、<2日間、<3日間、<
4日間、<5日間、<6日間、または<7日間以内に、対象へと輸注する。
一部の実施形態では、ある量の改変エフェクター細胞を、それを必要とする対象へと投
与し、その量を、有効性およびサイトカイン関連毒性を誘導する潜在的可能性に基づき決
定する。別の実施形態では、改変エフェクター細胞は、CAR細胞およびCD3細胞
である。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、1kg当たりの改変エフェクター
細胞約10~約10個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、1kg
当たりの改変エフェクター細胞約10~約10個を含む。場合によって、改変エフェ
クター細胞の量は、1kg当たりの改変エフェクター細胞約10~約10個を含む。
場合によって、改変エフェクター細胞の量は、1kg当たりの改変エフェクター細胞約1
~約10個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、1kg当たりの
改変エフェクター細胞>10個、かつ、≦約10個を含む。場合によって、改変エフ
ェクター細胞の量は、1kg当たりの改変エフェクター細胞>10個、かつ、≦約10
個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、1kg当たりの改変エフェク
ター細胞>10個、かつ、≦約10個を含む。
一実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、直接腫瘍組織への局所送達を介してが
んをターゲティングする。例えば、卵巣がんでは、改変免疫エフェクター細胞は、腹部ま
たは腹膜腔へと腹腔内(IP)に送達されうる。このようなIP送達は、化学療法薬の送
達のために設置されたポートまたは既存のポートを介して実施されうる。改変免疫エフェ
クター細胞の局所送達の他の方法は、切除腔へのカテーテル輸注、超音波誘導腫瘍内投与
、冠動脈輸注、または胸膜内送達を含みうる。
一実施形態では、それを必要とする対象は、IPを介して送達される第1の用量の改変
免疫エフェクター細胞により、続いてIVを介して送達される第2の用量の改変免疫エフ
ェクター細胞により治療を開始することができる。さらなる実施形態では、第2の用量の
改変免疫エフェクター細胞は、IVまたはIPを介して送達されうる次の用量へと続きう
る。一実施形態では、第1の用量および第2用量またはさらなる続く用量の間の期間は、
約:0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、2
9、30日でありうる。一実施形態では、第1の用量および第2の用量またはさらなる続
く用量の間の期間は、約:0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36カ月であり
うる。別の実施形態では、第1の用量および第2の用量またはさらなる続く用量の間の期
間は、約:0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10年でありうる。
別の実施形態では、カテーテルは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10用量の
改変免疫エフェクター細胞のさらなる投与のための腫瘍または転移部位に置かれうる。場
合によって、改変エフェクター細胞の用量は、1kg当たりの改変エフェクター細胞約1
~約10個を含みうる。毒性が観察される場合、改変エフェクター細胞の用量は、
1kg当たりの改変エフェクター細胞約10~約10個を含みうる。場合によって、
改変エフェクター細胞の用量は、1kg当たりの改変エフェクター細胞約10個で開始
することができ、続く用量は、1kg当たりの改変エフェクター細胞約:10、10
、10、10、10、または10個まで増加することができる。
他の実施形態では、操作細胞の増殖および/または生存を刺激する方法は、細胞試料を
、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、1または複数のトランスポゾンを含む、
1または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップとを含む。一実施形態
では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体(CAR)、サイトカイン、1または複数の
細胞タグ、および前記1または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込
んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形
態では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体(CAR)、サイトカイン、1または複数
の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、
および前記1または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作
細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、遺
伝子スイッチポリペプチドは、i)第1の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合さ
せたDNA結合性ドメインを含む、第1の遺伝子スイッチポリペプチド、およびii)第
2の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、
第2の遺伝子スイッチポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第1の遺伝子スイッチ
ポリペプチドと、第2の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されてい
る。1つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
1つの場合には、操作細胞のin vivoにおける繁殖の方法は、細胞試料を、対象
から得るステップと、細胞試料の細胞に、1または複数のトランスポゾンを含む、1また
は複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップを含む。一実施形態では、ト
ランスポゾンは、キメラ抗原受容体(CAR)、サイトカイン、1または複数の細胞タグ
、および前記1または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操
作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、
トランスポゾンは、キメラ抗原受容体(CAR)、サイトカイン、1または複数の細胞タ
グ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドおよび前記
1または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団
をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、遺伝子スイッ
チポリペプチドは、i)第1の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたDNA
結合性ドメインを含む、第1の遺伝子スイッチポリペプチド、およびii)第2の核内受
容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第2の遺伝
子スイッチポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第1の遺伝子スイッチポリペプチ
ドと、第2の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。1つの
場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
別の実施形態では、それを必要とする対象の、in vivoにおける操作細胞の存続
を増強する方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、1または
複数のトランスポゾンを含む、1または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトする
ステップとを含む。場合によって、1または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体
(CAR)、サイトカイン、1または複数の細胞タグ、およびDNAを、前記細胞のゲノ
ムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする
。場合によって、1または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体(CAR)、サイ
トカイン、1または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子
スイッチポリペプチド、およびDNAを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の
集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、遺伝子スイッ
チポリペプチドは、i)第1の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたDNA
結合性ドメインを含む、第1の遺伝子スイッチポリペプチド、およびii)第2の核内受
容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第2の遺伝
子スイッチポリペプチドを含み、第1の遺伝子スイッチポリペプチドと、第2の遺伝子ス
イッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。1つの場合には、操作細胞の
、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。1つの場合には、操作細胞の、対
象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
別の実施形態では、充実性腫瘍を伴う対象を処置する方法は、細胞試料を、対象から得
るステップと、試料の細胞に、1または複数のトランスポゾンを含む、1または複数のポ
リヌクレオチドをトランスフェクトするステップと、操作細胞の集団を、対象へと投与す
るステップとを含む。1つの場合には、リンパ枯渇は、操作細胞の対象への投与前に必要
ではない。場合によって1または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体(CAR)
、サイトカイン、1または複数の細胞タグ、およびDNAを細胞のゲノムへと組み込むの
に有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、1または複数のトランスポゾン
は、キメラ抗原受容体(CAR)、サイトカイン、1または複数の細胞タグ、サイトカイ
ンのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、およびDNAを、細胞の
ゲノムへと組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、遺伝子ス
イッチポリペプチドは、i)第1の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたD
NA結合性ドメインを含む、第1の遺伝子スイッチポリペプチド、およびii)第2の核
内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第2の
遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第1の遺伝子スイッチポリペプチドと、第2の遺伝
子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。場合によって、細胞は、
電気穿孔を介してトランスフェクトされる。場合によって、遺伝子スイッチポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターによりモジュレートされる。場合によっ
て、プロモーターは、組織特異的プロモーターもしくはEF1Aプロモーター、またはこ
れらの機能的な変異体である。場合によって、組織特異的プロモーターは、T細胞特異的
応答エレメントまたはNFAT応答エレメントを含む。場合によって、サイトカインは、
IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15、IL-15R
α、またはIL-15変異体の融合体のうちの少なくとも1つを含む。場合によって、サ
イトカインは、分泌形態にある。場合によって、サイトカインは、膜結合形態にある。場
合によって、細胞は、NK細胞、NKT細胞、T細胞、またはT細胞前駆細胞である。場
合によって、細胞は、対象へと(例えば、対象に、操作細胞を輸注することにより)投与
される。場合によって、方法は、有効量のリガンド(例えば、ベレジメクス)を投与して
、サイトカインの発現を誘導するステップをさらに含む。場合によって、CARは、少な
くともMUC-16に結合することが可能である。場合によって、トランスポザーゼは、
サケ科型Tc1様トランスポザーゼである。場合によって、トランスポザーゼは、SB1
1またはSB100xトランスポザーゼである。他の場合には、トランスポザーゼは、P
iggyBacである。場合によって、細胞タグは、HER1トランケート型変異体また
はCD20トランケート型変異体のうちの少なくとも1つを含む。
治療適用
本明細書で記載される複数の実施形態では、Sleeping Beautyトランス
ポゾンおよびSleeping Beautyトランスポザーゼにより形質導入された、
免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)が提示される。例えば、Sleeping B
eautyトランスポゾンまたはトランスポゾンは、本明細書で記載されるように、MU
C16の抗原認識ドメインをCD8アルファヒンジおよびこれらの変異体のストークドメ
イン、CD3ゼータ、CD28、4-1BBの細胞内ドメイン、またはこれらの任意の組
合せ、およびCD3ゼータ細胞内ドメイン、1または複数の細胞タグ、1または複数のサ
イトカイン、ならびに任意選択で、遺伝子スイッチ系の構成要素と組み合わせる、CAR
を含みうる。したがって、一部の場合には、形質導入したT細胞は、CAR媒介性T細胞
応答を誘発しうる。
本明細書で記載される複数の実施形態では、初代T細胞の特異性をMUC16表面抗原
へとリダイレクトするCARの使用が提示される。したがって、本発明はまた、T細胞媒
介性免疫応答を刺激し、哺乳動物において細胞集団または組織をターゲティングするため
の方法であって、CARを発現する哺乳動物のT細胞へと投与するステップを含み、CA
Rが、MUC16、ストークドメイン、例えば、ヒトCD3ゼータの細胞内ドメイン、お
よび共刺激シグナル伝達領域を含むゼータ鎖部分と特異的に相互作用する結合性部分を含
む、方法も提示する。
一実施形態では、本開示は、T細胞が遺伝子改変され、本発明のMUC16特異的CA
Rを発現し、CAR T細胞が、それを必要とするレシピエントに輸注される細胞療法を
含む。輸注された細胞は、レシピエント内でMUC16を過剰発現する細胞を死滅させる
ことができる。抗体療法とは異なり、本明細書で記載されるCAR T細胞は、in v
ivoで複製することができ、腫瘍細胞への持続作用をもたらしうる長期にわたる存続を
結果としてもたらすことができる。
本発明は、対象においてMUC16の過剰発現を含む疾患を検出するための方法であっ
て、a)本明細書で記載される、i)対象からの試料、およびii)抗体、またはこれら
の抗原結合断片のうちの任意の1または複数を用意するステップ、b)抗体のその抗原と
の特異的結合のための条件下で、試料を抗体と接触させるステップ、およびc)疾患を持
たない対照試料と比較して増加したレベルの、試料に対する抗体の結合を検出し、それに
より、対象における疾患を検出するステップを含む方法がさらに提示される。一実施形態
では、疾患はがんである。好ましい実施形態では、がんは、卵巣がんおよび乳がんからな
る群から選択される。検出の方法を限定することを意図しないが、一実施形態では、試料
への抗体の結合を検出するステップは、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ(EL
ISA)、蛍光活性化細胞分取(FACS)、ウェスタンブロット、免疫沈降法、および
/または放射線画像撮影法である。
本明細書では、MUC16の過剰発現を含む疾患を処置する方法であって、本明細書で
記載される治療有効量の抗体、またはこれらの抗原結合断片のうちの任意の1または複数
を、疾患を有する対象に投与するステップを含む方法も提示される。一実施形態では、疾
患は、卵巣がんおよび乳がんにより例示されるがんである。
一実施形態では、本明細書で記載されるMUC16 CAR T細胞は、強固なin
vivoにおけるT細胞拡大増殖を経ることができ、延長した時間存続することができる
。別の実施形態では、本明細書で記載されるCAR T細胞は、再活性化されうる特定の
メモリーT細胞へと進化しうる。
本明細書で記載されるCAR改変T細胞はまた、哺乳動物におけるex vivoにお
ける免疫および/またはin vivoにおける療法のためのワクチンの型としても寄与
しうる。複数の実施形態では、哺乳動物はヒトである。ex vivoにおける免疫に関
して、免疫エフェクター細胞を哺乳動物へと投与するステップの前に、以下のうちの少な
くとも1つがin vitroにおいて生じる:i)細胞の拡大増殖、ii)CARをコ
ードする核酸の細胞への導入、および/またはiii)細胞の凍結保存。
Ex vivoにおける手順は周知であり、以下により完全に議論される。略述すると
、細胞は哺乳動物(例えば、ヒト)から単離され、本明細書で開示されるCARを発現す
るベクターにより遺伝子改変される(すなわち、in vitroで形質導入またはトラ
ンスフェクトされる)。CAR改変細胞は、哺乳動物のレシピエントに投与され、治療効
果をもたらすことができる。哺乳動物のレシピエントは、ヒトの場合があり、CAR改変
細胞は、レシピエントに対して自家でありうる。あるいは、細胞は、レシピエントに対し
て同種、同質、または異種でありうる。
造血幹細胞および前駆細胞のex vivoにおける拡大増殖の手順は、参照により本
明細書に組み込まれる米国特許第5,199,942号明細書に記載され、本発明の細胞
に適用されうる。他の適切な方法が当技術分野で公知であり、したがって、本発明は、細
胞のex vivoでの拡大増殖の任意の特定の方法に限定されない。略述すると、ex
vivoにおける培養およびT細胞の拡大増殖は、(1)末梢血採取または骨髄移植片
からの哺乳動物由来のCD34+造血幹細胞および前駆細胞を回収するステップ、および
(2)そのような細胞をex vivoにおいて拡大増殖するステップを含む。米国特許
第5,199,942号明細書に記載される細胞増殖因子に加えて、flt3-L、IL
-1、IL-3およびc-kitリガンドなどの他の因子が、細胞の培養および拡大増殖
のために使用されうる。
ex vivoにおける免疫に関して、細胞ベースのワクチンを使用することに加えて
、本発明はまた、患者において抗原を指向する免疫応答を誘発するin vivoにおけ
る免疫のための組成物および方法も提供する。
一般に、本明細書で記載されるように活性化および拡大された細胞は、免疫無防備状態
の個体において生じる疾患の処置および予防に利用されうる。特に、本発明のCAR改変
T細胞は、MUC16悪性腫瘍、例えばMUC16などの処置で使用される。ある特定の
実施形態では、本発明の細胞は、MUC16を発症するリスクのある患者の処置に使用さ
れる。したがって、MUC16の処置または予防のための方法は、治療有効量の本発明の
CAR改変T細胞を、それを必要とする対象へと投与するステップを含む。複数の実施形
態では、本明細書で記載されるように活性化および拡大された細胞は、MUC16の処置
に利用されうる。
略述すると、本明細書で記載される医薬組成物は、本明細書で記載される標的細胞集団
を、1または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と
組み合わせて含みうる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩
液などの緩衝液;グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトー
ルなどの炭水化物;タンパク質;ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸;抗酸化剤
;EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミ
ニウム);および保存剤を含みうる。複数の実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投
与のために製剤化される。
本明細書で記載される医薬組成物は、処置される(または予防される)疾患に適切な方
法で投与されうる。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型および
重症度などの因子により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定されうる。
「免疫学的有効量」、または「治療量」が示される場合、投与される、本明細書で記載
される組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、および状態の個体差を考慮して
、医師により決定されうる。一般に、本明細書で記載されるT細胞を含む医薬組成物は、
これらの範囲内の全ての整数値を含む、kg体重当たり10~10個の細胞、kg体
重当たり10~10個の細胞の投与量で投与されうる。T細胞組成物はまた、これら
の投与量で複数回投与されうる。細胞は、免疫療法で一般的に公知の輸注技術を使用する
ことにより投与されうる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676,
(1988)を参照されたい)。特定の患者のための最適な投与量および投与レジメンは、患者
の疾患の徴候をモニタリングし、それにより処置を調整することにより、医薬の当業者に
より容易に決定されうる。
ある特定の実施形態では、活性化T細胞を対象に投与し、次いで血液を再び採血し(ま
たは、アフェレーシスを実施し)、それ由来のT細胞を活性化し、これらの活性化および
拡大T細胞をこの患者に再輸注することが所望されうる。このプロセスは、数週間ごとに
複数回実行されうる。ある特定の実施形態では、T細胞は、10cc~400ccの採血
から活性化されうる。ある特定の実施形態では、T細胞は、20cc、30cc、40c
c、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、または100ccの採血から
活性化されうる。理論に縛られはしないが、この複数回の採血/複数回の再輸注プロトコ
ールを使用することは、T細胞の特定の集団を選択するのに寄与しうる。別の実施形態で
は、放射線または化学療法のいずれかを介して、患者のリンパ枯渇後に対象組成物の活性
化T細胞を投与することが所望されうる。
本明細書で記載される組成物の投与は、エアゾル吸入、注射、摂取、輸注、移植(impl
antation)、または移植(transplantation)を含む、任意の便利な方法で実行されうる
。本明細書で記載される組成物は、患者の皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、
静脈内(i.v.)注射により、または腹腔内に投与されうる。一実施形態では、本発明
のT細胞組成物は、皮内注射または皮下注射により患者へと投与される。別の実施形態で
は、本発明のMUC16 CAR-T細胞組成物は、i.v.注射により、投与される。
T細胞の組成物は、リンパ節、または原発性腫瘍もしくは転移の部位へと直接注射されう
る。
患者へと投与される上記の処置の投与量は、処置される状態の正確な性質および処置の
レシピエントによって変わるであろう。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当技
術分野で承認された実行に従って実施されうる。例えば、上記処置の用量は、1kg当た
りのCAR+細胞1×10個~1kg当たりのCAR+細胞5×10個の範囲であり
うる。例示的な用量は、1kg当たりのCAR+細胞1×10個、1kg当たりのCA
R+細胞1×10個、1kg当たりのCAR+細胞1×10個、1kg当たりのCA
R+細胞1×10個、1kg当たりのCAR+細胞3×10個、1kg当たりのCA
R+細胞1×10個、1kg当たりのCAR+細胞5×10個、1kg当たりのCA
R+細胞1×10個、1kg当たりのCAR+細胞1×10個、または1kg当たり
のCAR+細胞1×10個でありうる。適切な用量は、成人か小児患者かによって調整
されうる。
代替的に、哺乳動物(例えば、ヒト)へと投与される免疫エフェクター細胞の典型的な
量は、例えば、100、1000、1万、100万~1000億個の細胞の範囲でありう
るが、この例示的な範囲を下回るまたは上回る量も本発明の範囲内である。例えば本発明
の宿主細胞の用量は、約100万~約500億個の細胞(例えば、約500万個の細胞、
約2500万個の細胞、約5億個の細胞、約10億個の細胞、約50億個の細胞、約20
0億個の細胞、約300億個の細胞、約400億個の細胞、または前述の値の任意の2つ
によって規定される範囲)、約1000万~約1000億個の細胞(例えば、約2000
万個の細胞、約3000万個の細胞、約4000万個の細胞、約6000万個の細胞、約
7000万個の細胞、約8000万個の細胞、約9000万個の細胞、約100億個の細
胞、約250億個の細胞、約500億個の細胞、約750億個の細胞、約900億個の細
胞、または前述の値の任意の2つによって規定される範囲)、約1億個の細胞~約500
億個の細胞(例えば、約1億2000万個の細胞、約2億5000万個の細胞、約3億5
000万個の細胞、約4億5000万個の細胞、約6億5000万個の細胞、約8億個の
細胞、約9億個の細胞、約30億個の細胞、約300億個の細胞、約450億個の細胞、
または前述の値の任意の2つによって規定される範囲)でありうる。
治療有効性または予防有効性は、処置される患者の周期的な評価によりモニターされう
る。数日間またはそれ以上にわたる繰り返し投与のため、状態に応じて、処置は、疾患症
状の所望の抑制が生じるまで繰り返される。しかし、他の投与レジメンが有用である場合
もあり、本発明の範囲内である。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与により、組
成物の複数回ボーラス投与により、または組成物の連続輸注投与により、送達されうる。
本開示の核酸配列を発現する免疫エフェクター細胞を含む組成物、またはこれらの核酸
配列を含むベクターは、1または複数のさらなる治療剤と共に投与することができ、哺乳
動物へと共投与することができる。「共投与」により、1または複数のさらなる治療剤お
よび本発明の宿主細胞を含む組成物または本発明のベクターを十分に近い時間に投与して
、1または複数のさらなる治療剤の効果を増強すること、またはその逆を意味する。この
点について、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞を含む組成物または本明細書で
記載されるベクターは、1または複数のさらなる治療剤と同時に投与される場合もあり、
1番目に投与され、2番目に1または複数のさらなる治療剤が投与される場合もあり、ま
たはその逆の場合もある。代替的に、開示された免疫エフェクター細胞を含む組成物また
は本明細書で記載されるベクター、および1または複数のさらなる治療剤は同時に投与さ
れうる。
本発明の宿主細胞および/または本発明のベクターを含む組成物に含まれうる、または
組成物と共に共投与されうる(またはキットに含まれる)治療剤の例は、インターロイキ
ン、サイトカイン、インターフェロン、アジュバント、および化学療法剤である。複数の
実施形態では、さらなる治療剤は、IFN-アルファ、IFN-ベータ、IFN-ガンマ
、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-ベータ、TNF-アルファ、増殖因子
、およびhGH、ヒトToll様受容体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TL
R5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、およびTLR10のリガンドである。
「消泡剤」は、加工時における発泡であって、水性分散液の凝固、薄膜完成品中の気泡
を結果としてもたらすか、または、一般に、加工を損なう発泡を低減する。例示的な抗発
泡剤は、シリコンエマルジョン(silicon emulsion)またはセスキオレ
イン酸(sesquoleate)ソルビタンを含む。
「抗酸化剤」は、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、アスコルビン酸ナ
トリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびトコフェロールを含む。あ
る特定の実施形態では、抗酸化剤は、必要とされる場合、化学的安定性を増強する。
本明細書で記載される製剤は、抗酸化剤、金属キレート化剤、チオールを含有する化合
物、および他の一般的な安定化剤から利益を得る場合がある。このような安定化剤の例は
、(a)約0.5%~約2%w/vのグリセロール、(b)約0.1%~約1%w/vの
メチオニン、(c)約0.1%~約2%w/vのモノチオグリセロール、(d)約1mM
~約10mMのEDTA、(e)約0.01%~約2%w/vのアスコルビン酸、(f)
0.003%~約0.02%w/vのポリソルベート80、(g)0.001%~約0.
05%w/vのポリソルベート20、(h)アルギニン、(i)ヘパリン、(j)硫酸デ
キストラン、(k)シクロデキストリン、(l)ポリ硫酸ペントサン、および他のヘパリ
ノイド、(m)マグネシウムおよび亜鉛などの二価カチオン、または(n)これらの組合
せを含むがこれらに限定されない。
「結合剤」は、凝集性の性質を付与し、例えば、アルギン酸およびその塩;カルボキシ
メチルセルロース、メチルセルロース(例えば、Methocel(登録商標))、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセ
ルロース(例えば、Klucel(登録商標))、エチルセルロース(例えば、Etho
cel(登録商標))、および結晶セルロース(例えば、Avicel(登録商標))な
どのセルロース誘導体;微晶質デキストロース;アミロース;ケイ酸マグネシウムアルミ
ニウム;多糖酸;ベントナイト;ゼラチン;ポリビニルピロリドン/酢酸ビニルコポリマ
ー;クロスポビドン;ポビドン;デンプン;アルファデンプン;トラガント、デキストリ
ン、スクロース(例えば、Dipac(登録商標))、グルコース、デキストロース、糖
蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール(例えば、Xylitab(登録商標)
)、およびラクトースなどの糖;アカシア、トラガント、ガッティガム、イサポールハス
クの粘液、ポリビニルピロリドン(例えば、Polyvidone(登録商標)CL、K
ollidon(登録商標)CL、Polyplasdone(登録商標)XL-10)
、カラマツ由来のアラビノガラクタン(arabogalactan)、Veegum商標)、ポリエ
チレングリコール、蝋、アルギン酸ナトリウムなどの天然ガムまたは合成ガムを含む。
「担体」または「担体材料」は、医薬中で一般に使用される任意の賦形剤を含み、イブ
ルチニブおよび抗がん剤の化合物など、本明細書で開示される化合物との適合性、ならび
に所望の剤形の放出プロファイル特性に基づき選択されるものとする。例示的な担体材料
は、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢
剤、保湿剤、希釈剤などを含む。「薬学的に適合性の担体材料」は、アカシア、ゼラチン
、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、カルシウム乳酸、マルトデキス
トリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン(PVP)、コレステ
ロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、ダイズレシチン、タウロコー
ル酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム
、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラ
ギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファデンプンなどを含みうるがこれらに
限定されない。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteent
h Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)、Hoover, John E., Remington’s
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975、Liberm
an, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New
York, N.Y., 1980、およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, S
eventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)を参照されたい。
「分散剤」および/または「粘性モジュレーティング剤」は、液体培地または顆粒化法
またブレンド法を介して、薬物の拡散および均質性を制御する材料を含む。一部の実施形
態では、これらの薬剤はまた、コーティングマトリックスまたはエローディングマトリッ
クスの有効性も促進する。例示的な拡散促進剤/分散剤は、例えば、親水性ポリマー、電
解質、Tween(登録商標)60またはTween(登録商標)80、PEG、ポリビ
ニルピロリドン(PVP;市販品では、Plasdone(登録商標)として公知である
)、and例えば、ヒドロキシプロピルセルロース(例えば、HPC、HPC-SL、お
よびHPC-L)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(例えば、HPMC K100
、HPMC K4M、HPMC K15M、およびHPMC K100M)、カルボキシ
メチルセルロースナトリウム(carboxymethylcellulose sodium)、メチルセルロース、
ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPM
CAS)、非晶質セルロースなど、炭水化物ベースの分散剤、ケイ酸マグネシウムアルミ
ニウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール(PVA)、ビニルピロリドン/
酢酸ビニルコポリマー(S630)、酸化エチレンおよびホルムアルデヒドを伴う、4-
(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェノールポリマー(チロキサポールとして
もまた公知である)、ポロキサマー(例えば、酸化エチレンと、酸化プロピレンとのブロ
ックコポリマーである、Pluronics F68(登録商標)、Pluronics
F88(登録商標)、およびPluronics F108(登録商標));およびポ
ロキサミン(例えば、酸化プロピレンおよび酸化エチレンの、エチレンジアミンへの逐次
的付加から導出される四官能性ブロックコポリマーである、Poloxamine 90
8(登録商標)(BASF Corporation、Parsippany、N.J.
)としてもまた公知のTetronic 908(登録商標))、ポリビニルピロリドン
K12、ポリビニルピロリドンK17、ポリビニルピロリドンK25、またはポリビニル
ピロリドンK30、ポリビニルピロリドン/酢酸ビニルコポリマー(S-630)、ポリ
エチレングリコール(例えば、ポリエチレングリコールは、約300~約6000、また
は約3350~約4000、または約7000~約5400の分子量を有しうる)、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート80、アルギン
酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キ
サンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポ
リソルベート80、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン
、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアル
コール(PVA)、アルギン酸塩、キトサン、およびこれらの組合せを含む。セルロース
またはトリエチルセルロースなどの可塑化剤もまた、分散剤として使用することができる
。特に、リポソーム分散液中および自己乳化分散液中で有用な分散剤は、ジミリストイル
ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然
ホスファチジルグリセロール、コレステロール、およびイソプロピルミリスチン酸である
1または複数のエロージョン促進剤の、1または複数の拡散促進剤との組合せもまた、
本組成物中で使用することができる。
「希釈剤」という用語は、送達の前に、目的の化合物を希釈するのに使用される化合物
を指す。希釈剤はまた、より安定的な環境をもたらしうるため、化合物を安定化させるの
にも使用することができる。当技術分野では、緩衝液中に溶解させた塩(これはまた、p
Hの制御または維持ももたらしうる)を、リン酸緩衝生理食塩液溶液を含むがこれらに限
定されない希釈剤として用いる。ある特定の実施形態では、希釈剤は、組成物のバルクを
増大させて、圧縮を容易とするか、またはカプセルの充填のための均質なブレンドに十分
なバルクを創出する。このような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトー
ル、ソルビトール、デキストロース、Avicel(登録商標)などの結晶セルロース;
二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物;リン酸三カルシウム、リン酸
カルシウム;無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース;アルファデンプン、Di-Pac(
登録商標)(Amstar)などの圧縮糖;マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースベースの
希釈剤、粉砂糖;一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物;乳酸カル
シウム三水和物、デキストレート(dextrate);加水分解シリアル固形、アミロース;粉
末セルロース、炭酸カルシウム;グリシン、カオリン;マンニトール、塩化ナトリウム;
イノシトール、ベントナイトなどを含む。
「充填剤」は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カル
シウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、セルロース 粉末、デキストロース、デキス
トレート(dextrate)、デキストラン、デンプン、アルファデンプン、スクロース、キシ
リトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレン
グリコールなどの化合物を含む。
「滑沢剤」および「流動促進剤」とは、材料の接着または摩擦を防止、低減、または阻
害する化合物である。例示的な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、滑
石、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱物油などの炭化水素、または水素化ダイズ油(S
terotex(登録商標))などの水素化植物油、高脂肪酸、ならびにアルミニウム、
カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、それらのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属
塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、滑石、蝋、Stearow
et(登録商標)、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、ナトリウム酢酸、塩化ナトリウム、ロ
イシン、ポリエチレングリコール(例えば、PEG-4000)、またはCarbowa
x(商標)などのメトキシポリエチレングリコール、ナトリウムオレイン酸、安息香酸ナ
トリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムま
たはラウリル硫酸ナトリウム、Syloid(商標)、Cab-O-Sil(登録商標)
などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活
性剤などを含む。
「可塑化剤」とは、マイクロカプセル化材料を軟化させるのに使用される化合物、また
はマイクロカプセル化材料の脆性を低下させるフィルムコーティングである。適切な可塑
化剤は、例えば、PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450
、PEG 3350、およびPEG 800などのポリエチレングリコール、ステアリン
酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、およびトリアセチンを
含む。一部の実施形態では、可塑化剤はまた、分散剤または保湿剤としても機能しうる。
「可溶化剤」は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸
エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート(doccusate)、ビタミンE
TPGS、ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、N-ヒドロキシエチルピロリ
ドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルシクロデキストリン、エタノール、n-ブタノール、イソプロピルアルコール、コレス
テロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール200~600、グリコフロール、トランス
クトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
「安定化剤」は、任意の抗酸化薬剤、緩衝液、酸、保存剤などの化合物を含む。
「懸濁剤」は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンK12、ポリビ
ニルピロリドンK17、ポリビニルピロリドンK25、またはポリビニルピロリドンK3
0、ビニルピロリドン/酢酸ビニルコポリマー(S630)、ポリエチレングリコール(
例えば、ポリエチレングリコールは、約300~約6000、または約3350~約40
00、または約7000~約5400の分子量を有しうる)、カルボキシメチルセルロー
スナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸
酢酸ヒドロキシメチルセルロース、ポリソルベート80、ヒドロキシエチルセルロース、
アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどの
ガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナト
リウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリソルベ
ート80、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラ
ウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドンなどの化合物を含む。
「界面活性剤」は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート(docusate)、T
ween 60またはTween 80、トリアセチン、ビタミンE TPGS、モノオ
レイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート(
polysorbate)、ポロキサマー、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリン、酸化
エチレンと酸化プロピレンとのコポリマー、例えば、Pluronic(登録商標)(B
ASF)などの化合物を含む。他の一部の界面活性剤は、ポリオキシエチレングリセリン
脂肪酸エステルおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン(60)水素化ヒマシ油;な
らびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、
オクトキシノール10、オクトキシノール40を含む。一部の実施形態では、界面活性剤
は、物理的安定性を増強するか、または他の目的で、組み入れることができる。
「粘性増強剤」は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステ
アリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチル
セルロース、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、
およびこれらの組合せを含む。
「保湿剤」は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレイン酸
、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオ
キシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムド
クセート(docusate)、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムド
クセート(doccusate)、トリアセチン、Tween 80、ビタミンE TPGS、ア
ンモニウム塩などの化合物を含む。
キットおよび組成物
本開示の一態様は、本発明のMUC16特異的CARおよび任意選択で、安全性のため
、例えばHER1tもしくはHER1t-1およびこれらの機能的変異体、またはCD2
0もしくはCD20t-1、およびこれらの機能的変異体を含む遺伝子をコードするコー
ド領域を含む、第1のベクターを含む、キットおよび組成物に関する。キットおよび組成
物は、サイトカインをさらに含みうる。別の態様では、キットおよび組成物は、RHEO
SWITCH(登録商標)遺伝子スイッチ構成要素を含みうる。これらのキットおよび組
成物は、それぞれ異なるタンパク質またはタンパク質のサブセットをコードする、複数の
ベクターを含みうる。これらのベクターは、ウイルス、非ウイルス、エピソーム、または
組込みでありうる。一部の実施形態では、ベクターは、トランスポゾン、例えばSlee
ping Beautyトランスポゾンである。
一部の実施形態では、キットおよび組成物は、ベクターだけでなく、細胞および、イン
ターロイキン、サイトカイン、インターロイキンおよび化学療法剤、アジュバント、湿潤
剤、または乳化剤などの薬剤も含む。一実施形態では、細胞は、T細胞である。一実施形
態では、キットおよび組成物は、IL-2を含む。一実施形態では、キットおよび組成物
は、IL-21を含む。一実施形態では、キットおよび組成物は、Bcl-2、STAT
3またはSTAT5阻害剤を含む。複数の実施形態では、キットは、IL-15、または
mbIL-15を含む。
本明細書の、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、1または複数の方法に
よる使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験
管など、1または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法におい
て使用される個別のエレメントのうち1つを含む容器を受容するように区画化されたキャ
リングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイア
ル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチッ
クなど、様々な材料から形成されている。
本明細書で提示される製品は、パッケージング材料を含有する。医薬パッケージング材
料の例は、ブリスターパック、ボトル、試験管、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択さ
れる製剤と、意図される投与方式および処置方式とに適する、任意のパッケージング材料
を含むがこれらに限定されない。
例えば、容器は、CAR-T細胞(例えば、本明細書に記載されるMUC16特異的C
AR-T細胞)と、任意選択で、加えて、本明細書で開示されるサイトカインおよび/ま
たは化学療法剤とを含む。このようなキットは、任意選択で、本明細書で記載される方法
におけるその使用に関する記載または表示または指示書の内容確認を含む。
キットは、典型的に、内容物を列挙する表示、および/または使用のための指示書、な
らびに使用のための指示書を伴う添付文書を含む。典型的に、指示書のセットもまた、組
み入れられると予想される。
一部の実施形態では、表示は、容器上に貼付されているか、または容器に付随する。一
実施形態では、表示を形成する文字、数、または他の記号が、容器自体へと接着されてい
るか、鋳造されているか、またはエッチングされている場合、表示は容器上に貼付されて
おり、表示はまた、容器を保持する、レセプタクルまたはキャリングケース内に、例えば
、パッケージ添付文書として存在する場合、容器に付随する。一実施形態では、表示は、
内容物が、具体的な治療適用に使用されるものであることを指し示すのに使用される。表
示はまた、内容物の、本明細書で記載される方法などにおける使用のための指示も指し示
す。
これらの例は、例示的な目的だけで提示されるものであり、本明細書で提示される特許
請求の範囲を限定しようとするものではない。
[実施例1]
T細胞への、Sleeping Beauty系のヌクレオフェクション
遺伝子改変T細胞を作るため、凍結保存された汎T細胞を融解させ、洗浄し、あらかじ
め温めた、FBSおよびGlutamaxを補充したフェノールレッドフリーRPMI
1640培地(R20培地)で再懸濁し、37℃で5%CO2の加湿したインキュベータ
ー内に置いた。細胞をカウントし、遠心分離し、ヌクレオフェクション緩衝液中に再懸濁
した。CAR-T細胞を作るため、特定の数のT細胞(典型的には、キュベット当たり5
~40×10個の範囲)反応を含有する各ヌクレオフェクションキュベット用に、CA
R構築物を含む合計で15μgのトランスポゾンプラスミドを、SBトランスポザーゼを
コードする5μgのプラスミドと組み合わせた。T細胞の電気穿孔法は、Amexa 2
bヌクレオフェクション装置または4Dヌクレオフェクター(Lonza,Walker
sville,MD)を使用して達せられた。電気穿孔法後、各キュベットからの内容物
は、あらかじめ温めたR20培地に移し、37℃のインキュベーター内に置いた。各T細
胞培養の試料は、フローサイトメトリー解析のために採取し、特定の時点で適用可能なC
AR、HER1t、およびmbIL-15の発現を特徴づけた。ある特定の実験のため、
CART細胞は、さらに特徴づけるために、ex vivoにおいて、数的に拡大増殖
させた。作出されたCART細胞の、ex vivoにおける、数的な拡大のため、T
細胞を、さらに、AaPC(activating and propagating
cell)と共に共培養させた。略述すると、トランケート型MUC16(MUC16t
)抗原と一緒にCD86、41BBL、mbIL15を発現するように操作されたK56
2細胞系由来の照射されたAaPCを、続く毎週のAaPC添加のため、IL-21およ
びIL-2を伴う完全培地中でCART細胞と共に共培養させた。
CAR、HER1t1、およびmbIL15の発現のフローサイトメトリー解析を、電
気穿孔法後1日目、およびそれぞれ、HiLyte(商標)Fluor647コンジュゲ
ート組換えMUC16t-Fc融合タンパク質またはAF647で標識したProtei
n-L、フィコエリトリン(PE)コンジュゲートセツキシマブおよび蛍光イソチオシア
ネート(FITC)コンジュゲート抗IL-15および抗IL-15RA抗体を使用する
、各AaPC刺激の前に、実施した。
[実施例2]
MUC16 CAR-T細胞の作出
MUC16-2 CARを発現するCAR-T細胞は、実施例1に記載されるSB系プ
ラスミドの電気穿孔法により作出した。MUC16-2 CAR-HER1t1 T細胞
は、MUC16-2 CARおよびHER1t1をコードするSBトランスポゾンプラス
ミド、ならびにSB11トランスポザーゼプラスミドの、ヒトT細胞への電気穿孔法によ
り作出した。MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞は、(1)
MUC16-2 CAR、mbIL15、およびHER1t1をコードするSBトランス
ポゾンプラスミド、ならびに(2)SB11トランスポザーゼプラスミドの、ヒトT細胞
への電気穿孔法により作出した。CAR、mbIL15、およびHER1t1の発現は、
ヌクレオフェクション後1日目において、マルチパラメーターのフローサイトメトリーを
使用して定量した。
表4は、ヌクレオフェクション後1日目において、MUC16-2 CARおよびHE
R1t1遺伝子(MUC16-2 CAR-HER1t1 T細胞)またはMUC16-
2 CAR、mbIL15およびHER1t1(MUC16-2 CAR-mbIL15
-HER1t1 T細胞)を発現するトランスポゾンを使用する、SB系プラスミドのヌ
クレオフェクション後の異なるドナーT細胞において、トランス遺伝子を発現する細胞の
%により測定された、トランスフェクション効率を示す。細胞は、CD3+生集団につい
て、ゲートをかけられた。
MUC16-3 CARを発現するCAR-T細胞は、実施例1に示されるSB系プラ
スミドの電気穿孔法により作出した。MUC16-3 CAR-HER1t1 T細胞は
、MUC16-3 CARおよびHER1t1をコードするSBトランスポゾンプラスミ
ド、ならびにSB11トランスポザーゼプラスミドの、ヒトT細胞への電気穿孔法により
作出した。MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞は、MUC1
6-3 CAR、mbIL15、およびHER1t1をコードするSBトランスポゾンプ
ラスミド、ならびにSB11トランスポザーゼプラスミドの、ヒトT細胞への電気穿孔法
により作出した。CAR、mbIL15、およびHER1t1の発現は、ヌクレオフェク
ション後1日目において、マルチパラメーターのフローサイトメトリーを使用して定量し
た。
図4において明らかなように、MUC16-3 HER1t1またはMUC16-3-
mbIL15-HER1t1プラスミドのいずれかによりヌクレオフェクトしたT細胞は
、ヌクレオフェクション後、終夜インキュベーションした後のHER1t1発現により確
かめられたようにトランス遺伝子を発現する。各ドナーからの個々のデータポイントを、
図5に示す。
[実施例3]
異なるスペーサー長を有するMUC16 CAR
CD8アルファヒンジ領域由来の異なるスペーサー長のMUC16 CARを発現する
CAR-T細胞は、実施例1に記載されるように、健常なドナーのT細胞(ドナー番号D
133098)において、SB系プラスミドの電気穿孔法により作出した。CAR-T細
胞は、実施例1に記載されるように、週に1回の刺激により、MUC16tを発現するA
aPCと共培養することにより、ex vivoにおいて、数的に拡大増殖させた。CA
Rの発現は、ヌクレオフェクション後1日目および8日目において、マルチパラメーター
のフローサイトメトリーにより測定した。評価したCAR-T試験物を表6に列挙する。
図5は、異なるMUC16 CAR-T細胞のMUC16 CAR発現のフローサイトメ
トリーデータを示す。細胞は、CD3生細胞についてゲートをかけられた。図5に示す
ように、遺伝子導入後1日目におけるMUC16 CAR発現の程度の変動は、CAR分
子の構築のために利用されるMUC16scFvおよびスペーサーに依存して、観察され
た。CART細胞の濃縮は、in vitroにおけるCART細胞のMUC16t
AaPC株との共培養時に観察された。ドナー番号D133098由来のMUC16
CAR-T細胞については、MUC16-2 CARのCD8a(3×)スペーサーを使
用する、およびMUC16-7 CARのCD8a(2×)スペーサーを使用する、電気
穿孔法後1日目~8日目に、CART細胞のより強い濃縮が観察された。
CD8アルファヒンジ領域由来の異なるスペーサーを有するMUC16-3 CARを
発現する、MUC16-3 CAR-HER1t1およびMUC16-3-mbIL15
-HER1t1 T細胞は、健常なドナーのT細胞(ドナー番号D132552)におい
てSB系プラスミドの電気穿孔法により作出した。CART細胞は、先に記載されたよ
うに、週に1回の刺激により、MUC16tを発現するAaPCと共培養することにより
、ex vivoにおいて、数的に拡大増殖させた。MUC16-3 CARの発現は、
ヌクレオフェクション後1日目および8日目においてマルチパラメーターのフローサイト
メトリーを使用する、MUC16-Fcタンパク質染色により測定した。評価されたCA
R-T構築物を、表7に列挙する。図6は、異なるMUC16-3 CAR-T細胞のM
UC16-3 CAR発現のフローサイトメトリーデータを示す。図6に示されるように
、遺伝子導入後1日目におけるMUC16 CAR発現の程度の変動は、CAR分子の構
築のために利用されるスペーサーに依存して、観察された。遺伝子導入後8日目における
CART細胞の濃縮の程度の変動は、CAR分子の構築のために利用されるスペーサー
に依存して、in vitroにおいて、CART細胞のMUC16tAaPC株と
の共培養時に観察された。
[実施例4]
ウェスタンブロット
プロテアーゼ阻害剤を含有する放射性免疫沈降アッセイにおいて細胞ペレットを再懸濁
することにより、T細胞溶解物を作出した。精製した溶解物を、細胞抽出物から分離し、
凍結保存した。総タンパク質濃度を決定するため、また試料間のノーマライゼーションの
ために、ビシンコニン酸(BCA)アッセイを実施した。10μgのタンパク質試料の全
てを、還元状態下での電気穿孔法によって解析した。ゲルからのタンパク質材料を、フッ
化ポリビニリデン(PVDF)膜へと転写した。タンパク質が転写された膜は、ブロッキ
ングされ、次いでロッカープレート上で、一次抗体、マウス抗ヒトCD3ζ、または抗I
L-15抗体と、インキュベートされた。膜は、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ(H
RP)標識二次抗体の添加の前に洗浄した。ブロットは、化学発光(ECL)検出を使用
して調製した。ウェスタンブロットの画像を、FluorChem(商標)E Imag
erシステム上で捕捉した。
HER1t1の検出のため、ウェスタンブロットの前に免疫沈降法を実施した。A43
1細胞溶解物(陽性対照)および免疫沈降対照(細胞溶解物無しでの免疫沈降法;陰性対
照)を含む、さらなる対照を解析した。ゲルからのタンパク質材料を、PVDF膜へと転
写した。タンパク質が転写された膜は、ブロッキングされ、次いで、一次抗体、マウス抗
ヒトEGFR抗体と、インキュベートされた。膜は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HR
P)標識ヤギ抗マウス抗体の添加の前に洗浄した。ウェスタンブロットの画像を、Flu
orChem(商標)E Imager上で捕捉した。
図7~9は、MUC16-3 CAR HER1t1 T細胞およびMUC16-3
CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞溶解物を使用するウェスタンブロットの画
像を示す。図7に示されるように、MUC16-3 CARのバンドは、MUC16-3
CAR HER1t1 T細胞とMUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t
1 T細胞溶解物の両方で検出された。低分子量の天然CD3ζのバンドもまた、CAR
-T細胞溶解物から、予測される通りに検出された。図8に示されるように、mbIL1
5タンパク質発現は、mbIL15を共発現する、MUC16-3 CAR-mbIL1
5-HER1t1 T細胞からの溶解物においてのみ検出された(図8)。図9は、MU
C16-3 CAR HER1t1 T細胞およびMUC16-3 CAR-mbIL1
5-HER1t1 T細胞における、およそ40kDaの予測される分子量の、HER1
t1の発現を示す。要約すると、これらのデータは、MUC16 CAR、mbIL15
、およびHER1tを発現するT細胞が、SB系を使用して作出されうることを実証する
[実施例5]
MUC16-3 CAR-T細胞の細胞傷害性
T細胞の細胞傷害活性は、発光細胞生存率アッセイを使用して決定した。MUC16-
3 CAR-mbIL15-HER1t1細胞の特異的細胞傷害性は、上記に記載された
ように作出されたCART細胞を使用して評価した。MUC16-3 CAR-mbI
L15-HER1t1、対照MUC16-3 CAR-HER1t1 T細胞、および非
MUC16対照CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞は、MUC16 CAR、
HER1t1、およびmbIL-15の発現を評価した。エフェクターCAR-T細胞は
、HER1t1の発現によって同定された。異なるエフェクター:標的(E:T)比は、
卵巣細胞株、MUC16tを異所発現するSKVO3(SKVO3-MUC16t)、M
UC16を発現しないSKVO3親株、MUC16を自然発現するOVCAR3、および
MUC16陰性細胞株であるA549で評価した。細胞培養からの上澄みは、サイトカイ
ン解析まで-80℃で保存した。細胞傷害性のパーセントは、以下の式を使用して決定し
た:
MUC16発現腫瘍標的に対する、3人の健常なドナーのT細胞から作出されたMUC
16-3 CAR-T細胞の特異的細胞傷害性は、変動させたE:T比で、様々な腫瘍細
胞株の細胞傷害活性を比較することにより実証した。対照のCARを発現するCAR-T
細胞は、陰性対照として使用した。図10Aは、MUC16tがSKOV3-MUC16
t腫瘍細胞によってのみ発現されることを示す。エフェクターCAR-T細胞(HER1
t1細胞発現をベースにノーマライズした)は、変動させたE:T比で、標的腫瘍細胞と
共に共培養した。図10Bに示すように、MUC16-3 CAR-HER1t1 T細
胞(mbIL15を欠く)とMUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1の両
方は、SKOV3-MUC16tおよびOVCAR3腫瘍細胞株に対する類似の用量依存
的細胞傷害性を実証した。しかし、MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t
1のみが、高いE:T比で、OVCAR3を死滅させた。MUC16-3 CAR-mb
IL15-HER1t1によるOVCAR3細胞の選択的死滅は、改変T細胞においてT
細胞の活性化が増強されたことを示す。標識した標的細胞単独の培養からは、バックグラ
ウンドシグナルは検出されなかった。さらに、MUC16特異的CAR-T細胞は、MU
C16tneg腫瘍細胞株(SKOV3およびA549)を死滅させず、対照CAR-m
bIL15-HER1t T細胞では、いずれの腫瘍細胞株の死滅も観察されなかった。
まとめると、これらの結果は、MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1が
、MUC16発現腫瘍細胞株の死滅を特異的に媒介することを実証する。
[実施例6]
MUC16-3 CAR-T細胞によるサイトカイン産生
実施例5の細胞傷害性アッセイからの培養上清は、IFNγおよびGranzymeB
を含む、サイトカイン産生のため、慣例のマルチ分析キットを使用して、スクリーニング
した。
MUC16-3 CAR-HER1t1 T細胞(mbIL15を欠く)およびMUC
16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞のMUC16発現腫瘍細胞に向
けてリダイレクトした特異性は、MUC16-非発現およびMUC16-発現腫瘍細胞株
との共培養時に、サイトカイン分泌を調べることによってさらに研究された。これらの研
究では、3人の異なるドナーからのMUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t
1 T細胞によるサイトカイン産生を、腫瘍細胞株との共培養後、1:1のE:T細胞比
で評価した。図11に示すように、炎症促進性サイトカインのレベルの上昇は、MUC1
6tを発現する腫瘍細胞株によってのみ観察された。さらに、MUC16-3 CAR-
mbIL15-HER1t1 TにおけるmbIL15の発現は、mbIL15を持たな
いMUC16-3 CAR-HER1t1 T細胞の試験後に観察されたレベルと比較し
て低いサイトカイン産生をもたらした。これらのデータは、MUC16-3 CAR-m
bIL15-HER1t1 T細胞が、MUC16発現腫瘍細胞に対して特異的な細胞傷
害機能を示すことを実証し、mbIL15の共発現が、MUC16-3 CAR-mbI
L15-HER1t1の細胞傷害作用を損なうことなく、炎症促進性サイトカインの産生
を減少しうることを示した。
[実施例7]
MUC16 CAR-T細胞の特異性
T細胞の細胞傷害活性は、ルシフェラーゼアッセイを使用して決定した。対照CAR-
T細胞と共に、MUC16 CAR-T細胞(表8)は、実施例1に記載されるように、
2人の健常なドナーのT細胞(D326782およびD132552)への、SB系プラ
スミドの電気穿孔法によって作出し、ex vivoにおいて、AaPCとの共培養によ
り数的に拡大増殖させた。細胞傷害性は、3連のウェルで、標的細胞として、SKOV3
-MUC16t、OVCAR3、およびMUC16negA549細胞株を使用して、異
なるE:T比で評価した。細胞傷害性のパーセントは、上記に記載した式を使用して決定
した。
図12に示すように、mbIL15およびHER1t1を共発現するMUC16 CA
R-T細胞は、濃度依存的な方法で、MUC16腫瘍細胞株の特異的細胞傷害性を示し
た。試験したMUC16 CAR-T細胞のいずれも、MUC16neg腫瘍細胞株であ
るA549の顕著な細胞傷害性を示さなかった。CD8a(2×)スペーサーを持つMU
C16-3 CAR-mbIL15-HER1t1細胞は、健常なドナーのT細胞から作
出されたCAR-T細胞におけるCD8aスペーサーと比較して高い、MUC16腫瘍
細胞株の特異的細胞傷害性を示した。
[実施例8]
mbIL15を発現するMUC16 CAR-T細胞の自己増殖の存続および欠如
CAR-T細胞の存続へのmbIL15の影響を評価するため、MUC16-3 CA
R-HER1t1 T細胞およびMUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1
T細胞をCellTrace(商標)Violetで標識し、自己PBMCと共に共培
養した。共培養は、14日間維持した。細胞培養中、細胞試料は、生存率を測定するため
に評価し、CAR T細胞およびメモリー表現型のアセスメントのためのフローサイトメ
トリーのために染色した。増殖は、色素の希釈によって決定した。
細胞存続アセスメントは、MUC16-3 CAR-HER1t(mbIL15を欠く
)が2週間後培養中に存続せず、MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1
T細胞のみが14日目にサイトカインを欠損する培養中で検出されることを示した(図
13A)。これは、CAR-T細胞の存続の改善におけるmbIL15の役割を実証する
。自己増殖の潜在的可能性のアセスメントは、MUC16-3 CAR-mbIL15-
HER1t1 T細胞が14日目に検出されるが、娘細胞の不在により実証されるように
、それらが増殖に失敗することを示した(図13B)。さらに、14日目には、存続MU
C16-3 CARmbIL15-HER1t1 T細胞は、-1日目と比較して高いレ
ベルの、CD45RA/CD45RO細胞により決定されるように、メモリー様また
は静止状態様T細胞集団の濃縮を示した(図13C)。
MUC16-2 CAR-HER1t1 T細胞(mbIL15発現を欠く)およびM
UC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞は、3人の健常なドナーの
T細胞への、SB系プラスミドの電気穿孔法により作出した。CAR-T細胞は、毎週、
AaPCによる刺激により、ex vivoにおいて、数的に拡大増殖させた。CAR-
T細胞は、2週間外因性サイトカインを含まない培地中で培養した。開始細胞数の画分と
して、培養中の生存細胞を算出し、存続を示した。
図14に示すように、mbIL15を発現する、MUC16-2 CAR-mbIL1
5-HER1t1 T細胞は、サイトカインの除去後、15日目に、ex vivoの培
養において、維持することができたが、mbIL15発現を欠損する、MUC16-2
CAR-HER1t1 T細胞は、サイトカインの非存在下では、7日を超えては生存し
なかった。
これらのデータは、mbIL15がCARと共発現する場合、MUC16 CAR T
細胞の存続の改善を示す。
[実施例9]
ADCCアッセイ
自己ナチュラルキラー(NK)細胞を、ADCCアッセイのエフェクター細胞として使
用した。ex vivoにおいて拡大増殖させたMUC16-2 CAR-mbIL15
-HER1t1細胞を、このアッセイの標的細胞として使用した。エフェクター細胞と標
的細胞の共培養は、10μg/mLのセツキシマブもしくはリツキシマブの存在下または
抗体無しで、10:1のE:T比に設定した。生存率は、共培養後に、フローサイトメト
リーを使用して評価した。CART細胞の、ADCC%を決定するため、標識したCD
細胞の画分の欠如を、最初のCART細胞集団との比較により決定した。
図15は、3人の異なる健常なドナーのT細胞から作出したMUC16-2 CAR-
mbIL15-HER1t1 T細胞は、セツキシマブを培養に添加した場合、ADCC
を介して効率的に除去されたことを実証する。抗CD20リツキシマブ(非特異的対照)
の培養への添加は、CAR-T細胞のセツキシマブ媒介ADCCの特異性を証明する、細
胞傷害性の低いバックグラウンドレベルを示した。示したデータは、平均+/-SEMで
ある。
[実施例10]
卵巣がんのin vivoモデルにおけるMUC16-2 CAR-T細胞の機能的評

SKOV3-fLUC-MUC16を、NSGマウスへとIP投与した(0日目)。6
日目に、IVISイメージングにより確認した定着腫瘍量を有するマウスをランダム化し
(群当たりn=5~7匹のマウス)、生理食塩水(HBSS)、MUC16-2 CAR
-HER1t1 T細胞(マウス当たり2×10個の細胞)、MUC16-2 CAR
-mbIL15-HER1t1 T細胞(マウス当たり2×10個の細胞)のいずれか
を単回IP注射、またはMUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞
(マウス当たり2×10個の細胞)を単回IV注射した。腫瘍増殖に対する有効性は、
腫瘍量を評価するため、CAR-T細胞投与後、3~4日ごとに実施したin vivo
生物発光(IVIS)イメージングにより評価した。一般的安全性は、CAR T細胞投
与後、1週間当たり最少2~3回で、研究を通して実施された、体重および臨床観察のア
セスメントにより評価した。
図16に示すように、MUC16-2 CAR-T細胞の単回IPまたはIV注射は、
マウスのSKOV3-fLUC-MUC16腫瘍の除去に有効であった。バイアルIV注
射を注射したCAR-T細胞の抗腫瘍応答は、IP輸注と比較して、遅延した。
[実施例11]
卵巣がんのin vivoモデルにおけるMUC16-3 CAR-T細胞の機能的評価
SKOV3-fLUC-MUC16t腫瘍細胞を、0日目にNSGマウスへとIP投与
した。5日目に、定着腫瘍量を有するマウス(IVISイメージングにより確認した)を
ランダム化し(群当たりn=5~7匹のマウス)、生理食塩水(HBSS)、MUC16
-3 CAR-HER1t1 T細胞(マウス当たり2×10個の細胞)、またはMU
C16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞(マウス当たり2×10
の細胞)のいずれかを単回IP注射した。腫瘍増殖に対する有効性は、腫瘍量を評価する
ため、CAR-T細胞投与後、3~4日ごとに実施したin vivo生物発光(IVI
S)イメージングにより評価した。EDTA中の全血試料を1週間当たり1回採血し、異
なるT細胞サブセットのMUC16 CAR T細胞存続、拡大増殖、および定量の評価
のため、マルチパラメーターのフローサイトメトリーにかけた。血漿試料を、T細胞活性
の指標として、ヒトサイトカインを解析した。一般的安全性は、CAR T細胞投与後、
1週間当たり最少2~3回で、研究を通して実施された、体重および臨床観察のアセスメ
ントにより評価した。
図17に示すように、MUC16を発現するSKOV3腫瘍を担持するNSGマウスへ
のMUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞のIP投与は、生理食
塩水対照処置群と比較した場合、腫瘍量の顕著な減少をもたらした(>3 logの全流
束値の減少)。MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞における
、mbIL15の共発現は、mbIL15の発現を欠損するMUC16-3 CAR-H
ER1t1 T細胞と比較して著しく大きな、腫瘍量の減少と関連した。
MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞は、MUC16-3
CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞と比較して増加した、血液中のHER1t
1を発現するT細胞の数により実証されたようにin vivoにおける存続および拡大
増殖の増強を示した。さらに、CD4CAR-T細胞とCD8CAR-T細胞の両方
が、in vivoにおいて拡大増殖および存続を示した。図18A~Bを参照されたい
[実施例12]
卵巣がんのin vivoモデルにおけるMUC16 CAR-T細胞の用量応答
SKOV3-fLUC-MUC16を、0日目に、NSGマウスへとIP投与した。6
日目に、定着腫瘍量を有するマウス(IVISイメージングにより確認した)をランダム
化し(群当たりn=5匹のマウス)、生理食塩水(HBSS)、3つの異なる用量のMU
C16-2 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞(マウス当たり1×10
5×10、または1×10個の細胞)、およびMUC16-3 CAR-mbIL1
5-HER1t1 T細胞(マウス当たり1×10、5×10、または1×10
の細胞)または単一の用量のMUC16-3 CAR-HER1t1 T細胞(マウス当
たり1×10個の細胞)のいずれかを単回IP注射した。MUC16-2 CAR-m
bIL15-HER1t1 T細胞、MUC16-3 CAR-HER1t1 T細胞、
およびMUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞は全て、1人のド
ナー由来であり、2日以内に製造された。腫瘍増殖に対する有効性は、腫瘍量を評価する
ため、CAR-T細胞投与後、3~4日ごとに実施したin vivo生物発光(IVI
S)イメージングにより評価した。
図19~20に示すように、MUC16-2 CAR-mbIL15-HER1t1
T細胞とMUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞の両方は、マウ
スにおいてSKOV3-fLUC-MUC16腫瘍細胞のCAR-T用量依存的除去を示
した。MUC16-3 CAR-mbIL15-HER1t1 T細胞は、1×10
のCAR-T細胞/マウスの用量の、mbIL15を欠損するMUC16-3 CAR-
HER1t1 T細胞と比較して、マウス当たり1×10個のCAR-T細胞の用量で
、強い抗腫瘍応答を示した。
[実施例13]
抗MUC16モノクローナル抗体の結合親和性
様々な抗MUC16モノクローナル抗体(mAb)の結合親和性を、Biacore3
000を使用する表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイにより評価した。抗MUC16
mAbは、それぞれの軽鎖および重鎖プラスミドのHEK293細胞への一過性トランス
フェクションを介して作出した。抗-MUC16 mAbの可変領域を、マウス定常鎖領
域へと融合させ、キメラマウスIgG1 mAbを作出した。ヒトFc領域へと融合させ
たトランケート型MUC16を、センサーチップCM5上に固定した。異なる濃度のmA
bを溶液相で注射し、データをBIA評価を使用して解析し、mAbのKDを算出した。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての技術用語お
よび科学用語および任意の頭字語は、本発明の技術分野の当業者により一般に理解される
意味と同じ意味を有する。
本明細書では、本開示の好ましい実施形態を示し、それらについて記載してきたが、当
業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提示されていることが明らかであ
ろう。今や、本開示から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および
代用に想到するであろう。本明細書で記載される実施形態、またはこれらの実施形態、も
しくはその中で記載される態様のうちの1または複数の組合せに対する、多様な代替物を
、本開示の実施において利用しうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開
示の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造
、ならびにそれらの均等物は、その対象となることが意図される。
配列
表11では、本明細書で提供される実施形態に含まれる特定の配列の代表的なリストを
提示する。
本明細書では、本開示の好ましい実施形態を示し、それらについて記載してきたが、当業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提示されていることが明らかであろう。今や、本開示から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到するであろう。本明細書で記載される実施形態、またはこれらの実施形態、もしくはその中で記載される態様のうちの1または複数の組合せに対する、多様な代替物を、本開示の実施において利用しうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造、ならびにそれらの均等物は、その対象となることが意図される。

本発明は、以下の態様を含み得る。
[1]
キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核酸であって、前記CARが、
(a)MUC16抗原結合性ドメイン;
(b)ストークドメイン;
(c)膜貫通ドメイン;
(d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;および、
(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメイン
を含む、単離核酸。
[2]
前記MUC16抗原結合性ドメインが、
(a)配列番号1、3、5、7、9、12、および14に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号2、4、6、8、10、11、13、および15に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド;および
(c)配列番号27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の単離核酸。
[3]
前記MUC16抗原結合性ドメインが、配列番号27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドである、請求項1または2に記載の単離核酸。
[4]
前記ストークドメインが、配列番号16のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドである、請求項1または2に記載の単離核酸。
[5]
前記共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BBを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の単離核酸。
[6]
前記4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号22のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項5に記載の単離核酸。
[7]
前記共刺激シグナル伝達ドメインがCD28を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の単離核酸。
[8]
前記CD28の共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号23のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項7に記載の単離核酸。
[9]
前記CD3ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の単離核酸。
[10]
トランケート型表皮増殖因子受容体をさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の単離核酸。
[11]
前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、HER1tであり、配列番号65のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項10に記載の単離核酸。
[12]
前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、HER1t-1であり、配列番号66のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項10に記載の単離核酸。
[13]
前記CARが、配列番号27~57に示されるアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1に記載の単離核酸。
[14]
骨格ならびに
(1)HER1t、HER1t-1、またはこれらの機能的な変異体のうちの少なくとも1つを含むトランケート型表皮増殖因子受容体;
(2)サイトカイン;および
(3)キメラ抗原受容体(CAR)
をコードする核酸配列を含むベクターであって、前記CARが、
(a)MUC16抗原結合性ドメイン;
(b)ストークドメイン;
(c)膜貫通ドメイン;
(d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;および
(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメイン
を含む、ベクター。
[15]
前記サイトカインが、IL-15またはIL-12である、請求項14に記載のベクター。
[16]
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項14または15に記載のベクター。
[17]
前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、配列番号65または配列番号66のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項14に記載のベクター。
[18]
前記IL-15が、膜結合IL-15である、請求項15に記載のベクター。
[19]
膜結合IL-15が、配列番号161をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項18に記載のベクター。
[20]
自己切断型トセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス(T2A)ペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項14から19のいずれか一項に記載のベクター。
[21]
前記骨格が、Sleeping BeautyトランスポゾンDNAプラスミドまたはpFUGWである、請求項14から20のいずれか一項に記載のベクター。
[22]
プロモーターをさらに含む、請求項14から21のいずれか一項に記載のベクター。
[23]
前記プロモーターが、hEF1a1である、請求項22に記載のベクター。
[24]
前記MUC16抗原結合性ドメインが、
(a)配列番号1、3、5、7、9、12、および14に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号2、4、6、8、10、11、13、および15に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド;および
(c)配列番号27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド
のうちの少なくとも1つを含む、請求項14から23のいずれか一項に記載のベクター。
[25]
前記MUC16抗原結合性ドメインが、配列番号27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドである、請求項14から24のいずれか一項に記載のベクター。
[26]
前記ストークドメインが、配列番号16のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項14から25のいずれか一項に記載のベクター。
[27]
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、4-1BBを含む、請求項14から26のいずれか一項に記載のベクター。
[28]
前記4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号22のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項27に記載のベクター。
[29]
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、CD28を含む、請求項14から26のいずれか一項に記載のベクター。
[30]
前記CD28の共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号23のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項29に記載のベクター。
[31]
前記CD3ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項14から30のいずれか一項に記載のベクター。
[32]
プラスミドを含む、請求項14から31のいずれか一項に記載のベクター。
[33]
各前記ベクターが発現プラスミドを含む、請求項14から31に記載のベクター。
[34]
前記非ウイルスベクターが、Sleeping Beautyトランスポゾンである、請求項16に記載のベクター。
[35]
請求項1から13のいずれか一項に記載のヌクレオチドを含む、免疫エフェクター細胞。
[36]
(1)細胞タグ(2)IL-15および(3)キメラ抗原受容体(CAR)を含む免疫エフェクター細胞であって、前記CARが、(a)MUC16抗原結合性ドメイン;(b)ストークドメイン;(c)膜貫通ドメイン;(d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;および(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む、免疫エフェクター細胞。
[37]
前記IL-15が、膜結合IL-15である、請求項36に記載の免疫エフェクター細胞。
[38]
前記膜結合IL-15が、配列番号161のポリペプチド配列を含む、請求項36に記載の免疫エフェクター細胞。
[39]
前記細胞タグが、HER1tを含み、前記HER1tが、配列番号65のポリペプチド配列を含む、請求項36に記載の免疫エフェクター細胞。
[40]
前記細胞タグが、HER1t-1を含み、前記HER1t-1が、配列番号66のポリペプチド配列を含む、請求項36に記載の免疫エフェクター細胞。
[41]
請求項14から34のいずれか一項に記載のベクターを含む免疫エフェクター細胞。
[42]
T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、または調節性T細胞である、請求項35から41のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
[43]
前記CARが、配列番号27~57のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを含む、請求項36に記載の免疫エフェクター細胞。
[44]
それを必要とするヒト対象において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された有効量の細胞をヒト対象に投与するステップを含み、前記CARが、
(a)MUC16抗原結合性ドメイン;
(b)ストークドメイン;
(c)膜貫通ドメイン;
(d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;
(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメイン;および
(f)トランケート型表皮増殖因子受容体(HER1t)
を含む、方法。
[45]
前記ヒトが、卵巣がんおよび乳がんのうちの少なくとも1つを伴うと診断されている、請求項44に記載の方法。
[46]
前記卵巣がんまたは乳がんが、再発性または不応性の卵巣がんまたは乳がんである、請求項45に記載の方法。
[47]
キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核酸であって、前記CARが、
(a)配列番号1~15または27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを伴うMUC16抗原結合性ドメイン;
(b)配列番号16のアミノ酸配列を伴うストークドメイン;
(c)配列番号23のアミノ酸配列を伴うCD28を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;
(d)配列番号65のアミノ酸配列を伴うHER1tおよび配列番号66のアミノ酸配列を伴うHER1t-1のうちの少なくとも1つを含むHER1タグ;および
(e)配列番号26のアミノ酸配列を伴うCD3ゼータシグナル伝達ドメイン
を含む、単離核酸。
[48]
キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核酸であって、前記CARが、
(a)配列番号1~15または27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを伴うMUC16抗原結合性ドメイン;
(b)配列番号16のアミノ酸配列を伴うストークドメイン;
(c)配列番号23のアミノ酸配列を伴う4-1BBを含む共刺激シグナル伝達ドメイン;
(d)配列番号65のアミノ酸配列を伴うHER1tおよび配列番号66のアミノ酸配列を伴うHER1t-1のうちの少なくとも1つを含むHER1タグ;および
(e)配列番号26のアミノ酸配列を伴うCD3ゼータシグナル伝達ドメイン
を含む、単離核酸。
[49]
請求項47または48に記載の1または複数のポリヌクレオチドのいずれかを含む、ベクター。
[50]
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項49に記載のベクター。
[51]
前記非ウイルスベクターが、Sleeping Beautyトランスポゾンである、請求項50に記載のベクター。
[52]
複数のベクターである、請求項51に記載のベクター。
[53]
免疫エフェクター細胞においてCARを発現するための系であって、請求項1から13および47から48のいずれか一項で提示される単離核酸をコードする1または複数のベクターを含む系。
[54]
前記免疫エフェクター細胞が、T細胞またはNK細胞である、請求項53に記載の系。
[55]
少なくとも1つのさらなる遺伝子をコードする核酸をさらに含む、請求項53または54に記載の系。
[56]
前記さらなる遺伝子が、サイトカインを含む、請求項55に記載の系。
[57]
前記サイトカインが、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、ならびにIL-15およびIL-15Rαの融合体のうちの少なくとも1つを含む、請求項56に記載の系。
[58]
前記サイトカインが、分泌形態にある、請求項56に記載の系。
[59]
前記サイトカインが、膜結合形態にある、請求項56に記載の系。
[60]
1つのベクターを含む、請求項53から59のいずれか一項に記載の系。
[61]
前記1または複数のベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項53から60のいずれか一項に記載の系。
[62]
前記非ウイルスベクターが、Sleeping Beautyトランスポゾンである、請求項61に記載の系。
[63]
Sleeping Beautyトランスポザーゼをさらに含む、請求項62に記載の系。
[64]
前記Sleeping Beautyトランスポザーゼが、SB11、SB100X、またはSB110である、請求項63に記載の系。
[65]
前記免疫エフェクター細胞が、哺乳動物細胞である、請求項53から64のいずれか一項に記載の系。
[66]
免疫エフェクター細胞においてCARを発現する方法であって、前記免疫エフェクター細胞を請求項53から65のいずれか一項に記載の系と接触させるステップを含む方法。
[67]
操作T細胞の増殖および/または生存を刺激する方法であって、
(a)細胞の試料を、対象から得るステップであって、前記試料がT細胞またはT細胞前駆細胞を含む、ステップ;
(b)細胞に、請求項1から13および44から45のいずれか一項で提示される単離核酸をコードする1または複数のベクター、ならびにトランスポザーゼをコードするベクターをトランスフェクトし、操作MUC16 CAR発現T細胞の集団をもたらすステップ;
(c)および、任意選択で、MUC16 CAR T細胞の集団を2日間またはそれ以下の間、ex vivoにおいて培養するステップ
を含む方法。
[68]
細胞に、サイトカインをコードするベクターをトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項67に記載の方法。
[69]
前記サイトカインが、IL-15およびIL-15Rαを含む融合タンパク質である、請求項68に記載の方法。
[70]
前記1または複数のベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項67から69のいずれか一項に記載の方法。
[71]
前記非ウイルスベクターが、Sleeping Beautyトランスポゾンである、請求項70に記載の方法。
[72]
Sleeping Beautyトランスポザーゼをさらに含む、請求項71に記載の方法。
[73]
前記Sleeping Beautyトランスポザーゼが、SB11、SB100XまたはSB110である、請求項72に記載の方法。
[74]
それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、有効量の操作T細胞の1または複数の用量を前記対象に投与するステップを含み、前記操作T細胞がMUC16 CARおよび膜結合IL-15を含む、方法。
[75]
有効量の操作T細胞の第1の用量が、腹腔内に投与される、請求項74に記載の方法。
[76]
有効量の操作T細胞の第2の用量が、静脈内に投与される、請求項75に記載の方法。
[77]
前記がんが、卵巣がんである、請求項74に記載の方法。
[78]
前記がんが、乳がんである、請求項74に記載の方法。
[79]
前記MUC16 CARが、配列番号95~107、119~149、または194~195に示される配列のうちのいずれか1つによってコードされる、請求項74に記載の方法。
[80]
前記膜結合IL-15が、配列番号161によってコードされる、請求項74に記載の方法。
[81]
操作T細胞の有効量が、少なくとも10 個の細胞/kgである、請求項74に記載の方法。
[82]
操作T細胞の有効量が、少なくとも10 個の細胞/kgである、請求項74に記載の方法。
[83]
操作T細胞の有効量が、少なくとも10 個の細胞/kgである、請求項74に記載の方法。

Claims (83)

  1. キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核酸であって、前記CARが、
    (a)MUC16抗原結合性ドメイン;
    (b)ストークドメイン;
    (c)膜貫通ドメイン;
    (d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;
    および、
    (e)CD3ゼータシグナル伝達ドメイン
    を含む、単離核酸。
  2. 前記MUC16抗原結合性ドメインが、
    (a)配列番号1、3、5、7、9、12、および14に示されるアミノ酸配列のうち
    の少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、
    96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド;
    (b)配列番号2、4、6、8、10、11、13、および15に示されるアミノ酸配
    列のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、
    95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチ
    ド;および
    (c)配列番号27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少な
    くとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、9
    9%、または100%の同一性を有するポリペプチド
    のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の単離核酸。
  3. 前記MUC16抗原結合性ドメインが、配列番号27~57に示されるアミノ酸配列の
    うちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
    %、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドで
    ある、請求項1または2に記載の単離核酸。
  4. 前記ストークドメインが、配列番号16のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91
    %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100
    %の同一性を有するポリペプチドである、請求項1または2に記載の単離核酸。
  5. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BBを含む、請求項1から4のいずれか一項
    に記載の単離核酸。
  6. 前記4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号22のアミノ酸配列との、
    少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%
    、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項5に記載の単離
    核酸。
  7. 前記共刺激シグナル伝達ドメインがCD28を含む、請求項1から5のいずれか一項に
    記載の単離核酸。
  8. 前記CD28の共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号23のアミノ酸配列との、少
    なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
    99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項7に記載の単離核
    酸。
  9. 前記CD3ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列との、少なく
    とも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99
    %、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1から8のいずれか一
    項に記載の単離核酸。
  10. トランケート型表皮増殖因子受容体をさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記
    載の単離核酸。
  11. 前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、HER1tであり、配列番号65のアミノ
    酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、9
    7%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1
    0に記載の単離核酸。
  12. 前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、HER1t-1であり、配列番号66のア
    ミノ酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%
    、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求
    項10に記載の単離核酸。
  13. 前記CARが、配列番号27~57に示されるアミノ酸配列との、少なくとも90%、
    91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または1
    00%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1に記載の単離核酸。
  14. 骨格ならびに
    (1)HER1t、HER1t-1、またはこれらの機能的な変異体のうちの少なくと
    も1つを含むトランケート型表皮増殖因子受容体;
    (2)サイトカイン;および
    (3)キメラ抗原受容体(CAR)
    をコードする核酸配列を含むベクターであって、前記CARが、
    (a)MUC16抗原結合性ドメイン;
    (b)ストークドメイン;
    (c)膜貫通ドメイン;
    (d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン
    ;および
    (e)CD3ゼータシグナル伝達ドメイン
    を含む、ベクター。
  15. 前記サイトカインが、IL-15またはIL-12である、請求項14に記載のベクタ
    ー。
  16. レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである
    、請求項14または15に記載のベクター。
  17. 前記トランケート型表皮増殖因子受容体が、配列番号65または配列番号66のアミノ
    酸配列との、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、9
    7%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1
    4に記載のベクター。
  18. 前記IL-15が、膜結合IL-15である、請求項15に記載のベクター。
  19. 膜結合IL-15が、配列番号161をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1
    8に記載のベクター。
  20. 自己切断型トセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス(T2A)ペプチドをコード
    するヌクレオチド配列をさらに含む、請求項14から19のいずれか一項に記載のベクタ
    ー。
  21. 前記骨格が、Sleeping BeautyトランスポゾンDNAプラスミドまたは
    pFUGWである、請求項14から20のいずれか一項に記載のベクター。
  22. プロモーターをさらに含む、請求項14から21のいずれか一項に記載のベクター。
  23. 前記プロモーターが、hEF1a1である、請求項22に記載のベクター。
  24. 前記MUC16抗原結合性ドメインが、
    (a)配列番号1、3、5、7、9、12、および14に示されるアミノ酸配列のうちの
    少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、9
    6%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド;
    (b)配列番号2、4、6、8、10、11、13、および15に示されるアミノ酸配列
    のうちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、9
    5%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチド
    ;および
    (c)配列番号27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとの、少なく
    とも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99
    %、または100%の同一性を有するポリペプチド
    のうちの少なくとも1つを含む、請求項14から23のいずれか一項に記載のベクター。
  25. 前記MUC16抗原結合性ドメインが、配列番号27~57に示されるアミノ酸配列の
    うちの少なくとも1つとの、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95
    %、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドで
    ある、請求項14から24のいずれか一項に記載のベクター。
  26. 前記ストークドメインが、配列番号16のアミノ酸配列との、少なくとも90%、91
    %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100
    %の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項14から25のいずれか一項に記載のベ
    クター。
  27. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、4-1BBを含む、請求項14から26のいずれ
    か一項に記載のベクター。
  28. 前記4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号22のアミノ酸配列との、
    少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%
    、99%、または100%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項27に記載のベクタ
    ー。
  29. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、CD28を含む、請求項14から26のいずれか
    一項に記載のベクター。
  30. 前記CD28の共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号23のアミノ酸配列との、少
    なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
    99%、または100%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項29に記載のベクター
  31. 前記CD3ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列との、少なく
    とも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99
    %、または100%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項14から30のいずれか一
    項に記載のベクター。
  32. プラスミドを含む、請求項14から31のいずれか一項に記載のベクター。
  33. 各前記ベクターが発現プラスミドを含む、請求項14から31に記載のベクター。
  34. 前記非ウイルスベクターが、Sleeping Beautyトランスポゾンである、
    請求項16に記載のベクター。
  35. 請求項1から13のいずれか一項に記載のヌクレオチドを含む、免疫エフェクター細胞
  36. (1)細胞タグ(2)IL-15および(3)キメラ抗原受容体(CAR)を含む免疫
    エフェクター細胞であって、前記CARが、(a)MUC16抗原結合性ドメイン;(b
    )ストークドメイン;(c)膜貫通ドメイン;(d)4-1BBもしくはCD28、また
    は両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;および(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメ
    インを含む、免疫エフェクター細胞。
  37. 前記IL-15が、膜結合IL-15である、請求項36に記載の免疫エフェクター細
    胞。
  38. 前記膜結合IL-15が、配列番号161のポリペプチド配列を含む、請求項36に記
    載の免疫エフェクター細胞。
  39. 前記細胞タグが、HER1tを含み、前記HER1tが、配列番号65のポリペプチド
    配列を含む、請求項36に記載の免疫エフェクター細胞。
  40. 前記細胞タグが、HER1t-1を含み、前記HER1t-1が、配列番号66のポリ
    ペプチド配列を含む、請求項36に記載の免疫エフェクター細胞。
  41. 請求項14から34のいずれか一項に記載のベクターを含む免疫エフェクター細胞。
  42. T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、または調
    節性T細胞である、請求項35から41のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
  43. 前記CARが、配列番号27~57のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを含む、請
    求項36に記載の免疫エフェクター細胞。
  44. それを必要とするヒト対象において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫
    応答を刺激するための方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された有効量の
    細胞をヒト対象に投与するステップを含み、前記CARが、
    (a)MUC16抗原結合性ドメイン;
    (b)ストークドメイン;
    (c)膜貫通ドメイン;
    (d)4-1BBもしくはCD28、または両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン;
    (e)CD3ゼータシグナル伝達ドメイン;および
    (f)トランケート型表皮増殖因子受容体(HER1t)
    を含む、方法。
  45. 前記ヒトが、卵巣がんおよび乳がんのうちの少なくとも1つを伴うと診断されている、
    請求項44に記載の方法。
  46. 前記卵巣がんまたは乳がんが、再発性または不応性の卵巣がんまたは乳がんである、請
    求項45に記載の方法。
  47. キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核酸であって、前記CARが、
    (a)配列番号1~15または27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも
    1つを伴うMUC16抗原結合性ドメイン;
    (b)配列番号16のアミノ酸配列を伴うストークドメイン;
    (c)配列番号23のアミノ酸配列を伴うCD28を含む共刺激シグナル伝達ドメイン

    (d)配列番号65のアミノ酸配列を伴うHER1tおよび配列番号66のアミノ酸配
    列を伴うHER1t-1のうちの少なくとも1つを含むHER1タグ;および
    (e)配列番号26のアミノ酸配列を伴うCD3ゼータシグナル伝達ドメイン
    を含む、単離核酸。
  48. キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離核酸であって、前記CARが、
    (a)配列番号1~15または27~57に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも
    1つを伴うMUC16抗原結合性ドメイン;
    (b)配列番号16のアミノ酸配列を伴うストークドメイン;
    (c)配列番号23のアミノ酸配列を伴う4-1BBを含む共刺激シグナル伝達ドメイ
    ン;
    (d)配列番号65のアミノ酸配列を伴うHER1tおよび配列番号66のアミノ酸配
    列を伴うHER1t-1のうちの少なくとも1つを含むHER1タグ;および
    (e)配列番号26のアミノ酸配列を伴うCD3ゼータシグナル伝達ドメイン
    を含む、単離核酸。
  49. 請求項47または48に記載の1または複数のポリヌクレオチドのいずれかを含む、ベ
    クター。
  50. レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである
    、請求項49に記載のベクター。
  51. 前記非ウイルスベクターが、Sleeping Beautyトランスポゾンである、
    請求項50に記載のベクター。
  52. 複数のベクターである、請求項51に記載のベクター。
  53. 免疫エフェクター細胞においてCARを発現するための系であって、請求項1から13
    および47から48のいずれか一項で提示される単離核酸をコードする1または複数のベ
    クターを含む系。
  54. 前記免疫エフェクター細胞が、T細胞またはNK細胞である、請求項53に記載の系。
  55. 少なくとも1つのさらなる遺伝子をコードする核酸をさらに含む、請求項53または5
    4に記載の系。
  56. 前記さらなる遺伝子が、サイトカインを含む、請求項55に記載の系。
  57. 前記サイトカインが、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、ならびにIL
    -15およびIL-15Rαの融合体のうちの少なくとも1つを含む、請求項56に記載
    の系。
  58. 前記サイトカインが、分泌形態にある、請求項56に記載の系。
  59. 前記サイトカインが、膜結合形態にある、請求項56に記載の系。
  60. 1つのベクターを含む、請求項53から59のいずれか一項に記載の系。
  61. 前記1または複数のベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、
    または非ウイルスベクターである、請求項53から60のいずれか一項に記載の系。
  62. 前記非ウイルスベクターが、Sleeping Beautyトランスポゾンである、
    請求項61に記載の系。
  63. Sleeping Beautyトランスポザーゼをさらに含む、請求項62に記載の
    系。
  64. 前記Sleeping Beautyトランスポザーゼが、SB11、SB100X、
    またはSB110である、請求項63に記載の系。
  65. 前記免疫エフェクター細胞が、哺乳動物細胞である、請求項53から64のいずれか一
    項に記載の系。
  66. 免疫エフェクター細胞においてCARを発現する方法であって、前記免疫エフェクター
    細胞を請求項53から65のいずれか一項に記載の系と接触させるステップを含む方法。
  67. 操作T細胞の増殖および/または生存を刺激する方法であって、
    (a)細胞の試料を、対象から得るステップであって、前記試料がT細胞またはT細胞
    前駆細胞を含む、ステップ;
    (b)細胞に、請求項1から13および44から45のいずれか一項で提示される単離
    核酸をコードする1または複数のベクター、ならびにトランスポザーゼをコードするベク
    ターをトランスフェクトし、操作MUC16 CAR発現T細胞の集団をもたらすステッ
    プ;
    (c)および、任意選択で、MUC16 CAR T細胞の集団を2日間またはそれ以
    下の間、ex vivoにおいて培養するステップ
    を含む方法。
  68. 細胞に、サイトカインをコードするベクターをトランスフェクトするステップをさらに
    含む、請求項67に記載の方法。
  69. 前記サイトカインが、IL-15およびIL-15Rαを含む融合タンパク質である、
    請求項68に記載の方法。
  70. 前記1または複数のベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、
    または非ウイルスベクターである、請求項67から69のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記非ウイルスベクターが、Sleeping Beautyトランスポゾンである、
    請求項70に記載の方法。
  72. Sleeping Beautyトランスポザーゼをさらに含む、請求項71に記載の
    方法。
  73. 前記Sleeping Beautyトランスポザーゼが、SB11、SB100Xま
    たはSB110である、請求項72に記載の方法。
  74. それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、有効量の操作T細胞の1
    または複数の用量を前記対象に投与するステップを含み、前記操作T細胞がMUC16
    CARおよび膜結合IL-15を含む、方法。
  75. 有効量の操作T細胞の第1の用量が、腹腔内に投与される、請求項74に記載の方法。
  76. 有効量の操作T細胞の第2の用量が、静脈内に投与される、請求項75に記載の方法。
  77. 前記がんが、卵巣がんである、請求項74に記載の方法。
  78. 前記がんが、乳がんである、請求項74に記載の方法。
  79. 前記MUC16 CARが、配列番号95~107、119~149、または194~
    195に示される配列のうちのいずれか1つによってコードされる、請求項74に記載の
    方法。
  80. 前記膜結合IL-15が、配列番号161によってコードされる、請求項74に記載の
    方法。
  81. 操作T細胞の有効量が、少なくとも10個の細胞/kgである、請求項74に記載の
    方法。
  82. 操作T細胞の有効量が、少なくとも10個の細胞/kgである、請求項74に記載の
    方法。
  83. 操作T細胞の有効量が、少なくとも10個の細胞/kgである、請求項74に記載の
    方法。
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