CN112469817B - 通过使用igfbp2对人源性自然杀伤细胞的扩增和培养 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种扩增和培养自然杀伤细胞的方法。通过使用根据本发明的扩增和培养自然杀伤细胞的方法，人源性自然杀伤细胞的增殖显著被增强，使得可以高效获得要用于癌症治疗的自然杀伤细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养或扩增自然杀伤细胞的方法，并且更具体而言涉及一种培养或扩增自然杀伤细胞的方法，其包括在含有IGFBP2的培养基中培养自然杀伤细胞。
背景技术
现代医学难以治愈的多种难治的疾病如癌症是由于复杂的人免疫系统中的异常所致的免疫系统失衡引起的。因此，近年来，已经对免疫治疗剂的开发进行了积极的研究，以通过使免疫系统中的失衡消退以及使免疫系统恢复到正常状态来治疗多种疾病。
在免疫细胞中，T细胞具有抗原特异性，但是自然杀伤细胞具有在外来物质从外部渗入时首先被激活的重要特征。另外，为了使用T细胞作为细胞疗法产物，只能使用自体T细胞。然而，为了使用自然杀伤细胞作为细胞疗法产物，可以使用来自其他健康人的自然杀伤细胞。因此，自然杀伤细胞具有作为免疫细胞疗法产物用于癌症治疗的研究价值，并且也很有可能被使用。因为与其他免疫细胞相比，自然杀伤细胞在体内以少量存在，应获得大量自然杀伤细胞用作免疫细胞疗法产物。
因为在大多数癌症患者体内自然杀伤细胞的数量极少，其癌细胞杀伤能力也显著较低。特定地，自然杀伤细胞在低氧条件下不能适当地增殖并展现抗癌功能，而低氧条件是肿瘤微环境的典型特征。
既然大多数难治的实体癌具有低氧区，需要在此类低氧条件下扩增自然杀伤细胞的方法用于实体癌患者的有效治疗。
本发明是通过关注先前发明来做出的，所述先前发明传授，当在低氧条件下培养自然杀伤细胞时，其增殖和抗癌活性低，但是当将已经在正常条件下主动开始增殖的细胞置于低氧条件下时，其增殖显著增加(参见韩国专利公开号2017-0124467)。
本发明人已经努力开发有效增强处于静息状态的自然杀伤细胞在低氧条件下的扩增的方法，并且作为结果已经发现，当在自然杀伤细胞的离体扩增培养期间用胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)处理处于静息状态的自然杀伤细胞时，自然杀伤细胞的扩增不仅在正常条件下而且在低氧条件下显著增强，从而完成本发明。
发明内容
本发明的目标是提供一种培养有效增强自然杀伤细胞的扩增物的方法。
为了实现上文目标，本发明提供用于扩增自然杀伤细胞的培养方法，其包括在含有IGFBP2的培养基中培养自然杀伤细胞。
附图说明
图1显示分析IGFBP2对处于静息状态的自然杀伤细胞在低氧条件下的生长的作用的结果。图1(A)显示在低氧条件下扩增自然杀伤细胞的方法，并且显示通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测量分泌的IGFBP2的结果，图1(B)显示用于IGFBP2处理和在低氧条件下培养的方法，并且显示自然杀伤细胞的生长曲线，并且图1(C)显示分析在低氧条件下用IGFBP2处理后第14天，靶向慢性髓性白血病细胞系K562细胞(CCL-243TM)的自然杀伤细胞中，CD107a的表达(细胞毒性能力的量度)和IFN-γ(细胞因子)的分泌的结果。
图2(A)显示在常氧条件下在含有IGFBP2的培养基中培养自然杀伤细胞的方法，并且显示自然杀伤细胞的生长曲线，并且图2(B)显示分析在常氧条件下用IGFBP2处理后第14天，靶向K562细胞的自然杀伤细胞中，CD107a的表达(细胞毒性能力的量度)和IFN-γ(细胞因子)的分泌的结果。
图3显示分析在常氧条件下培养后从在低氧条件下培养的自然杀伤细胞分泌的IGFBP2对自然杀伤细胞的增殖的作用的结果。图3(A)显示测量在常氧条件和低氧条件下从自然杀伤细胞分泌的IGFBP2的方法，并且图3(B)显示根据图3(A)中所示的方法进行以测量在常氧条件和低氧条件下第14天、第18天和第22天，细胞培养基中的IGFBP2的ELISA(酶联免疫吸附测定)的结果。图3(C)显示用抑制IGFBP2的抗体处理细胞培养基的方法，并且图3(D)显示生长曲线，所述生长曲线表明，在用抑制IGFBP2的抗体处理后，在低氧条件下培养的自然杀伤细胞的增殖被抑制，并且显示自然杀伤细胞的分布的变化(同种型ctr＝同种型对照，hIGFBP2 ab＝人IGFBP2抗体)。
图4显示分析IGFBP2对癌细胞增殖的作用的结果。图4(A)显示在含有IGFBP2的培养基中培养K562癌细胞的方法，并且图4(B)显示根据图4(A)中所示的方法培养的K562细胞的生长曲线。
具体实施方式
除非另有定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本公开文本所属领域的技术人员通常理解相同的含义。通常，本说明书中所用的命名法是本领域中熟知且常用的。
在本发明中，已确认，当在含有IGFBP2的培养基中从开始培养的时间点(培养的第0天)直至第22天在低氧条件(1.5％O2)和常氧条件(20％O2)下培养处于静息状态的人自然杀伤细胞(NK细胞)以供扩增时，自然杀伤细胞的增殖有所增强。另外，已确认，在含有IGFBP2的培养基中在低氧条件和常氧条件下培养的自然杀伤细胞可以维持其癌细胞杀伤能力，不论是否存在IGFBP2。
另外，结合在常氧条件下(20％O2)培养后在低氧条件下(1.5％O2)培养的自然杀伤细胞的增殖被增强的事实(参见韩国专利公开号2017-0124467)已确认，与仅在常氧条件下培养的自然杀伤细胞的IGFBP2分泌相比，在低氧条件下培养的自然杀伤细胞的IGFBP2分泌显著增加，并且在用抑制IGFBP2的抗体处理细胞培养基时，自然杀伤细胞的增殖被抑制。
因此，本发明涉及培养或扩增自然杀伤细胞的方法，其包括在含有IGFBP2的培养基中培养自然杀伤细胞。
IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)作为调节胰岛素样生长因子的功能的蛋白质而为人所知。
在本发明中，培养可以进行1至22天。
在本发明中，培养可以在低氧条件或常氧条件下进行。
在本发明中，低氧条件优选地是15％至0.5％O2、更优选地5％至1％O2的条件。
在本发明中，常氧条件优选地是18％至22％O2、更优选地19％至21％O2、甚至更优选地19.9％至20.9％O2的条件。
在本发明中，可以以0.1至10μg/ml、优选地0.5μg/ml至2μg/ml的浓度含有IGFBP2。
在本发明中，在低氧条件或常氧条件下的另外的培养可以进行1至30天。
在本发明的例子中，在培养第0天将自然杀伤细胞转移至含有IGFBP2的培养基上，并且另外在低氧条件(1.5％O2)或常氧条件(20％O2)下培养长达22天。
在本发明中，培养基还可以含有IL-2。
在本发明中，自然杀伤细胞可以进行共培养。作为与自然杀伤细胞共培养的饲养细胞，可以使用辐照的Jurkat细胞和辐照的EBV-LCL细胞。
在本发明中，已确认，当分离人外周血单核细胞并在低氧条件和常氧条件下与Jurkat细胞和EBV-LCL细胞共培养开始时(培养第0天)用IGFBP2处理时，自然杀伤细胞的数量与常规培养方法中相比有所增加。
另外，基于在常氧条件下(20％O2)培养9天然后在低氧条件下(1.5％O2)培养直至第22天的自然杀伤细胞的增殖有所增强的事实(参见韩国专利公开号10-2017-0124467中披露的培养方法)，本发明人分析细胞培养基并且作为结果已经发现，与仅在常氧条件下培养直至第22天的自然杀伤细胞相比，IGFBP2的分泌显著增加。为了检查分泌的IGFBP2是否是由于增强的增殖自然杀伤细胞的扩增所致，将细胞培养基用抑制分泌的IGFBP2的抗体处理，并培养自然杀伤细胞。因此，已确认，所述细胞的增殖减少。
另外，为了检查IGFBP2对癌细胞增殖的作用，将慢性髓性白血病细胞系K562细胞(CCL-243TM)在培养第0天用IGFBP2处理，并培养直至第22天，然后测量其增殖程度。因此，已确认，用IGFBP2处理对K562癌细胞的增殖没有影响。
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。对于本领域技术人员将明显的是，这些实施例仅用于说明本发明，并且认为本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1：在低氧条件和常氧条件下培养自然杀伤细胞期间，IGFBP2处理引起的细胞数量的增加和癌细胞杀伤能力的变化的检查
收集人血液，然后使用Ficoll(Ficoll-PaqueTM PLUS，GE Healthcare)以2500rpm离心30分钟，并从血沉棕黄层分离外周血单核细胞。之后，将分离的细胞与Jurkat细胞系(韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)(KCLB)：40152)和EBV-LCL细胞系(韩国细胞系库)(每种细胞系用100Gy辐照)以1:0.5:0.5的外周血单核细胞:Jurkat细胞:EBV-LCL细胞比率在hRPMI培养基(RPMI1640培养基，其含有10％FBS和1％青霉素/链霉素)中在500U/mlIL-2的存在下共培养。在培养期间，每2至3天一次用含有500U/ml IL-2的hRPMI培养基更换培养基。
在上述条件下培养期间，从第0天将细胞在低氧条件下(1.5％O2)培养，并且对细胞培养基进行采样并通过ELISA分析IGFBP2的分泌(图1A)。当从第0天至第22天在低氧条件下培养细胞时，IGFBP2的分泌没有显著变化(图1A)。
在上述条件下培养第0天，将自然杀伤细胞用IGFBP2(Sigma，0.5μg/ml至2μg/ml)处理一次，并且在低氧条件(1.5％O2)或常氧条件(20％O2)下培养，并对细胞数量进行计数(图1B和图2A)。在此时，每4天一次使用血细胞计数器计数细胞数量，同时将细胞进一步培养约22天，并且在培养期间，用含有500U/ml IL-2的hRPMI培养基更换培养基。
因此，如图1B和图2A中所示，已确认，用IGFBP2处理的实验组中的细胞数量是未用IGFBP2处理的对照组的1.5至4倍。
另外，为了检查通过上述方法离体扩增的自然杀伤细胞的癌细胞杀伤能力是否发生变化，将慢性髓性白血病细胞系K562细胞(CCL-243TM)制备为靶癌细胞，并且向其添加2.5μl FITC标记的抗CD107a mAb和Golgi stop(BD Pharmingen)，之后在37℃下培养5小时。在IGFBP2处理组中，在培养第0天以2μg/ml的浓度向细胞一次添加IGFBP2，并且在含有500U/ml IL-2的hRPMI培养基中培养细胞。
在培养完成后，向细胞添加PerCPp标记的CD3 mAb(eBioscience)和APC标记的CD56mAb(eBioscience)并使其在4℃下反应20分钟。对于细胞内FACS，将细胞用FACS缓冲液洗涤，固定，使用BD Cytoperm/Cytofix试剂盒(BD Pharmingen，圣地亚哥，加利福尼亚州)进行渗透化处理，用PE标记的IFN-g mAb染色，然后通过流式细胞术进行分析。
因此，如图1C和图2B中所示可见，在用IGFBP2处理的自然杀伤细胞组和未处理的对照组中，CD107a的表达(细胞毒性能力的量度)和IFN-g(细胞因子)的分泌没有变化。
实施例2：在自然杀伤细胞的培养期间，在低氧条件下，细胞外分泌的IGFBP2引起的细胞数量的增加
先前已发现，当将以与实施例1相同的方式分离的自然杀伤细胞在常氧条件下(20％O2)培养9天并另外在低氧条件下(1.5％O2)培养直至第22天时，自然杀伤细胞的增殖有所增强(参见韩国专利公开号10-2017-0124467)。收集仅在常氧条件下培养的自然杀伤细胞的培养基和在常氧条件下培养9天后另外在低氧条件下培养的自然杀伤细胞的培养基(每种细胞培养基在培养的第14天、第18天和第22天收集)，并且通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测量从每种类型的自然杀伤细胞分泌的IGFBP2(参见图3A和图3B)。
因此，如图3B中所示，已确认，另外在低氧条件下培养的自然杀伤细胞中的IGFBP2的分泌是仅在常氧条件下培养的自然杀伤细胞中的2至4倍。
另外，在培养的第11天，将另外在低氧条件下培养的自然杀伤细胞的培养基用IGFBP2抗体处理，用于抑制细胞外分泌的IGFBP2，然后检查自然杀伤细胞的增殖程度(图3C)。
因此，可见，自然杀伤细胞的增殖受IGFBP2抗体处理的抑制，并且自然杀伤细胞的分布没有变化(图3D)。
实施例3：IGFBP2处理对癌细胞增殖的作用的检查
为了检查IGFBP2对癌细胞增殖的作用，在培养第0天，将慢性髓性白血病细胞系K562细胞(CCL-243TM)用IGFBP2处理，并且培养直至第18天(图4A)。作为测量细胞增殖程度的结果，已确认，IGFBP2处理对癌细胞增殖没有影响(图4B)。因此，已确认，通过IGFBP2处理引起的细胞增殖仅应用于自然杀伤细胞，并且不应用于癌细胞。
工业适用性
在使用根据本发明的培养或扩增自然杀伤细胞的方法时，人自然杀伤细胞的增殖可以被显著增强，并且因此可以高效获得用于癌症疗法的自然杀伤细胞。
尽管已经参考具体特征对本发明进行了详细描述，但是对于本领域技术人员而言将清楚的是，本说明仅描述了本发明的优选实施方案，而非限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同物定义。
Claims (8)
1.一种培养或扩增自然杀伤细胞的方法，所述方法包括在含有IGFBP2的培养基中培养自然杀伤细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养是在低氧条件或常氧条件下进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养进行1至22天。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述低氧条件是15％至0.5％O2的条件。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述低氧条件是5％至1％O2的条件。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述常氧条件是18％至22％O2的条件。
7.根据权利要求1所述的方法，其中以0.1至10μg/ml的浓度含有所述IGFBP2。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基还含有IL-2。
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