CA2106193A1 - Moyens pour le diagnostic in vitro de constituants de granules cytoplasmiques et applications biologiques - Google Patents

Abstract

2106193 9216644 PCTABS00160 L'invention concerne des moyens pour la détection de constituants de granules cytoplasmiques sécrétés par des cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques en particulier pour la détection de granzyme ou de perforine caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement un épitope de ces constituants en donnant lieu à une réaction immunologique de type antigène-anticorps.

Description

WO 92/1~ 3 ~, PCT/FR92/00240 . ~

MOYENS POUR LE DIAGN~STIC IN VITRO DE CONSTITUANTS DE
GRA~ .S CYTOPLASMIQUES
ET APPLICATIONS BIOLOGIQUES

L'invention concerne des moyens pour le diagnostic in v~tro de constituants des cellules cytotoxiques et des cellules T "helper" jouant un rôle dans la réponse immunitaire d'un organisme.
Le système immunitaire est capable de répondre spécifiquement ou non à l'introduction dans l'organisme d'antigènes viraux, bactériens ou allogéniques. Deux types de cellules sont responsables de la neutralisation et de l'élimination de ces différents antigènes : les lymphocytes B et les lymphocytes T. Ces cellules assurent les deux formes de la réponse immunitaire : la réponse humorale, médiée par les cellules B, et la réponse cellulaire, médiée par au moins deux populations cellulaires, à savoir les lymphocytes T cytotoxiques ~CTLs), et les cellules "natural killer" (NK).
Dans la cytotoxicité a médiation cellulaire, deux processus de lyse ont été décrits. L'un comporte la sécrétion par les cellules effectrices (CTLs et cellules NK) de protéines cytolytiques en l'absence de seconds messagers intracellulaires. Le deuxième processus, appelé
lyse régulée, comprend le stockage des protéines lytiques ou associées ~ la lyse dans les granules cytoplasmiques, en grande quantité, et leur sécrétion seulement après activation des récepteurs de surface des cellules effectrices et production de seconds messagers intracellulaires.
Dans ces granules, différentes protéines ont été
identifiées, parmi lesquelles, la perforine ou protéine qui forme des pores, une famille de protéases que l'on appel}e les granzymes, et les protéoglycanes, protéines de haut poids moléculaire, chargees du transport soit de la perforlne, soit des granzymes, vers la membrane cellulaire.

W092/1~
PCT/FR92/00~0 Au cours de l'interaction de l'effecteur avec sa cible et de son activation, il se produit une exocytose des vésicules intracytoplasmiques granulaires qui sécrètent leur contenu dans l'espace intercellulaire formé par le contact effecteur/cible, provoquant la lyse de la cellule cible.
La perforine a été isolée à partir d'une lignée cytotoxique chez le rat et chez l'homme~
Les travaux effectués ont permis d'observer qu'en présence de Ca2+, les molécules de perforine polymérisent, s'insèrent au niveau de la membrane plasmique de la cellule cible et forment des pores entrainant la destruction des cellules cibles.
Des clones d'ADNc murin et humain ont été isolés, On a rapporté récemment les séquences génomiques de la perforine chez la souris et l'homme.
Quant aux granzymes, de nombreuses équipes ont décrit leur purification à partir de granules de CTLs ou de cellules à activité NK/LAK (lymphokine activated ki~ler).
Ils représentent la majorité des protéines des granules intracytoplasmiques (85 ~ versus 10 ~ pour la perforine).
Dlfférents granzymes ont été isolés et caractérisés chez la souris ainsi que chez l'homme. Plus particulièrement, six granzymes nommés granzymes A à F ont été décrits dans les granules cytoplasmiques de CTLs murins. Un septième granzyme appelé granzyme G a été récemment caractérisé dans les CTLs de souris. Chez l'homme, on a isolé deux granzymes correspondant aux granzymes A et B, et un troisième appelé
H ne correspondant à aucun granzyme murin dé;à isolé. -~es granzymes sont synthétisés sous forme de prémolécules contenant un peptide signal caractéristique des protéines sécrétées ou ayant une localisation granulalre. Cette séquence signal est suivie d'un dipeptide acide d'actlvation qui est en général Gly-Glu ou Glu-Glu (propeptide) et doit être clivé par une dipepdityl-peptidase pour libérer la protéine mature.

WO92/l~ PCT/FR92/00240 ~ , Il existe une grande homologie entre les différents granzymes, ce qui suggère qu'ils appartiennent une famille de serines protéases granulaires.
Ils contiennent tous les résidus ~is57, ASP1O2 et Ser195 qui forment la triade catalytique des sérines estérases. Tous les granzymes matures commencent par la séquence N-terminale Ile-Ile-Gly-Gly (résidus 16-19), puis une séquence varizble (résidus 20-23), suivie d'une séquence conservée (résidus 24-30). Ce sont des protéines plus ou moins glycolysées. Six résidus Cys conservés forment trois ponts disulfures intra-chaîne.
L'approche par la biologie moléculaire a permis d'isoler des gènes codant pour des granzymes exprimés spécifiquement dans les CTLs.
lS Plusieu_s rôles ont été attribués aux granzymes.
On a rapporté notamment une action indirecte sur la perforine en augmentant son activité lytique, favorisant la fragmentation de l'ADN de la cellule cible.
Ils pourraient également intervenir dans le mécanisme du détachement du CTL de sa cible après la délivrance du coup létal par clivage du complexe TcR/
antigene (TcR = récepteur T à l'antigène) et des autres complexes récepteur/ligands impliqués dans les phénomènes d'adhésion cellulaire.
Enfin les granzymes, par protéolyse, pourraient cliver des constituants de la matrice extracellulaire ou des composants du milieu interstitiel et être ainsi lmpllqués dans les phénomenes de migration et d'lnfiltratlon des lymphocytes dans les tissus au cours de processus inflammatoires.
D'autres protéines ont été caractérisées dans les granules de CTLs et de cellules "NK" : il s'agit des protéoglycanes. Ces molécules ~oueraient notamment un role dans le "packaging" de la perforine et des granzymes. Elles peuvent également constltuer une sorte de barrière protectrice de la face interne des granules sécrétoires, protégeant ainsi la cellule cytotoxique des effets de ses propres molécules lytiques.

W092/1~ t) PCT/FR92/00240 La perforine et les granzymes ont éte très etudiés au niveau de leur expression génique par les techniques de Northern Blot et de Dot ~lot et plus récemment par la technique d'hybridation in situ utilisant des ribosondes specifiques.
Les études réalisées in vitro et, in vivo en situation pathologique chez la souris et chez l'homme, montrent que ces gènes sont inductibles au cours de 1'activation cellulaire de lymphocytes T, de cellules présentant une activité NK/LAK et ce, de façon précoce.
Chez l'homme, l'expression des gènes des granzymes et de la perforine a pu être observée dans difrérentes situations pathologiques comme les désordres hématologiques, les maladies auto-immunes, les maladies dermatologiques et les maladies infectieuses parasitaires, bactériennes ou virales. Enfin, les ARNm des granzymes et ou de la perforine ont pu etre détectés par hybridation ln_si~ au site de plusieurs types d'allogreffes.
L'expression du gène du granzyme B a été observée au niveau des cellules infiltrant des allogreffes de reins.
L'expression des gènes du granzyme B et/ou de la perforine a pu etre détectée dans les cellules préférentiellement CD8+ dans les infiltrats lymphocytaires de biopsies endomyocardiques réalisées chez des patients présentant un re~et. Une étude similaire a été réalisée au niveau de biopsies de peaux de patients atteints de GVH (Graft versus host reaction) après greffe de moelle allogénique HLA géno-ou phéno-identique.
Les études réalisées ont permis d'observer lors de la suspicion d'un rejet au cours d'une greffe d'organe (coeur, rein) ou d'une GVH après greffe de moelle osseuse, la préSence d'infiltrats lymphocytaires "silencieux"
détectés par l'histologie, caractérisés phénotypiquement par l'immunohistochimie et qui sont néanmoins dépourvus de l'expresslon des messagers des granzymes et de la perforine. L'interprétatlon de tels résultats demeure une lnterrogatlon et soulève de nombreuses questions en relation avec l'état d'immunisation des cellules de ces W092/1~ 9 ~ PCT/FR92/00~0 infiltrats, l'effet du traitement immunosuppresseur et la fonction réelle de ces cellules. Seul le suivi des patients dans le temps devrait permettre d'étudier l'évolution de ces infiltrats cellulaires, leur devenir et leur relation a l'évolution du processus de rejet ou de GVH en fonction du traitement administré.
On mesure donc l'intérêt de la recherche de l'expression génique des granzymes et de la per,orine au cours de l'activation cellulaire et/ou cytotoxique in vivo.
La plupart des études effectuées ont été réalisées par Northern Blot, Dot Blot, hybridation in situ. Bien qu'informatives, ces techniques sont lourdes et ne permettent en aucun cas d'etudier un grand nombre de patients avec le suivi nécessaire à la connaissance de l'évolution de leur pathologie.
Les infiltrats lymphocytaires détectés par l'histologie restent en fait le seul critère opérationnel sur lequel s'appuient les cliniciens pour confirmer le diagnostic clinique, qu'il s'agisse de rejet ou de GVH dans le cas des allogreffes.
Il est clair que dans toutes ces applications à la clinique, au lieu~ de détecter des messagers des granzymes et de la perforine, il serait plus aisé de détecter les protéines à l'aide d'anticorps.
L'aspect fondamental qui implique la compréhension du role biologique des granzymes et de la perforine requiert également une analyse fine et efficace à l'aide d'anticorps.
Mettant à profit leur avance technique dans ce domaine et leur grande maitrise des techniques d'isolement et de purification des granzymes et de la perforine, les inventeurs ont développé de nouveaux outils permettant de dlagnostlquer chez l'homme la présence de constituants des granules cytoplasmiques dans des échantillons biologiques à
étudier.
Utlllsant l'approche immunologique pour résoudre les problemes posés a ce jour, les inventeurs ont produit WO 92/1~ J j PCT/FR92/00240 ' :
G

des anticorps de haute spécificité vis-à-vis des protéines précitées.
L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux moyens très spécifiques de dlagnostic in vi ~ro chez l'homme de la présence des constituants des granules évoqués ci-dessus.
Elle vise égaiement une méthode de diagnostic permettant de simplifier la détection de ces produits en recherche clinique et fondamentale.
Les anticorps de l'invention, qui sont dirigés contre les constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques, plus spécialement des lymphocytes T cytotoxiaues et des cellules "natural killer", sont caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux capables de reconnaître spécifiquement un épitope d'un constituant donné d'un granule humain, en particulier un épitope de granzyme humain ou de la perforine humaine, en donnant lieu à une réaction du type antigene /anticorps.
L'expression "constituant des granules" telle qu'utilisée dans la description et les revendications recouvre aussi bien la forme native du constituant, qu'une forme recombinante active telle qu'obtenue par les techniques classiques de génie génétique sur la base de la séquence d'acides aminés des granzymes ou de la perforine chez l'homme, ou des séquences d'acides aminés déduites des séquences de nucléotides des genes humains codant pour ces prot~ines. Ainsi les granzymes ou la perforine auxquels il est falt référence sont soit sous leur forme native, soit sous une orme recombinante, comportant au moins la partie active de ces granzymes ou perforine.
L'expression "capable de reconnaître spécifiquement un épitope" telle qu'utilisée dans la descrlption et les revendications signifie que les antlcorps monoclonaux réagissent avec l'épitope en question en utilisant les techniques immunologiques ELISA, Wester~
~lot ou Immunoprécipitation décrites dans les exemples.

,:. . .' , :
, ' ' . : ' W092/1~ ' PCT/FR92/OO~o ', Les anticorps monoclonaux anti-granzymes sont en particulier des anticorps anti granzyme A ou anti-granzyme B ou encore anti-granzyme H humains.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont encore caractérisés par le fait qu'ils appartiennent a la classe des IgG et qu'ils sont dirigés contre des protéines de poids moléculaire d'environ 25 à 30 kDa (Granzyme B), 60 kDa (Granzyme A) ou 66 à 75 kDa environ (Perforine).
L'invention vise également tout fragment des anticorps monoclonaux ci-dessus dès lors qu'il est capable d'interagir spécifiquement avec un constituant donne desdits granules, en particulier avec un granzyme ou de la perforine.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont également caractérisés par le .ai~ qu'ils sont tels qu'obtenus par sécrétion à partir de souches d'hybridomes résultant de la fusion d'une cellule immortelle de myélome non secréteur avec une cellule productrice d'anticorps dirigés contre un constituant donné de granules de cellules cytotoxiques humaines.
L'étape de fusion des deux types cellulaires est notamment réalisée selon la technique la plus couramment utilisée à savoir celle de K~hler et Milstein, Nature, vol 256, p. 495, 1975.
Les cellules productrices d'anticorps sont des splénocytes. Ces cellules sont récupérées après immunisation in vivo de l'animal avec l'antigène approprié.
Pour l'étape d'immunisation, on utilise les constituants des granules purifiés et on les injecte avec un adjuvant. Des résultats particulièrement satisfaisants sont obtenus en purifiant les constituants des granules cytoplasmiques selon la technique de Krahenb~hl et al, dans J. Immunol, 141, 3471-77, 1988.
Les constltuants des granules sont sous orme native ou, en varlante, sous forme recombinante. On utilise notamment un granzyme B humain recombinant ou une perforlne humaine recombinante.

W092/1~ ) ;3 PCT/FR92/00~0 Dans la description et les revendications, l'expression "anticorps monoclonal anti-granzyme" signifie que l'anticorps est tel qu'induit par la molécule native de granzyme et l'expression "anticorps monoclonal anti-granzyme recombinant" que l'anticorps monoclonal est tel qu'induit par une molécule recombinante de granzyme. Il en est de même pour les autres constituants des granules, comme la perforine.
Les cellules immortelles sont des cellules de myélome non sécréteur, ce qui permet d'obtenir des hybridomes ne sécrétant que l'immunoglobuline de la spécificité de la cellule productrice.
Conformément à la technique classique, les hybridomes obtenus sont mis en culture et clonés selon le procédé de dilution limite. On sélectionne avantageusement les hybridomes dont les surnageants de culture présentent les titres les plus élevés d'anticorps en ELISA. Pour accroitre la production d'anticorps, on les injecte à des animaux, par raison de commodité, à des souris, à des rats ou a des lapins et des ascites sont ainsi produites en grande quantité. En variante, les souches d'hybridomes sont malntenues en culture dans des incubateurs à CO2.
Les anticorps monoclonaux récupérés peuvent etre utilisés tels quels ou sont purifiés, par exemple par colonne d'affinité et conservés par congélation, ou éventuellement lyophilisés.
L'invention vise en particulier les anticorps monoclonaux anti-granzyme B humain recombinant et anti-perforine humaine recombinante.
Des anticorps de ce type ont été déposés à la D.S.M. (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) le 13 mars 1992.
L'invention vise tout spécialement les anticorps monoclonaux anti-granzyme 8 humain et anti-granzyme A
humain respectivement produits par les clones appelés GR8 51D et GRA 66D, déposés à la Collection Nationale de Culture des Mlcroorganismes (CNCM), sous les numéros I-1060 et I-1059, le 12 mars 1991.

W092/1~ J ~ PCT/FR92/00~0 Elle décrit également les anticorps monoclonaux anti-perforine de souris déposés à la CNCM sous le n I-1058 le 12 mars 1991c L'invention vise également les souches S d'hybridomes productrices d'anticorps monoclonaux définis ci-dessus et plus spécialement les clones produisant des titres éleves d'anticorps mesurés par test ELISA.
Les souches d'hybridomes de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules hybrides résultant de la fusion de cellules immortelles avec une cellule produisant des anticorps dirigés contre un constituant donné de granules cytoplasmiques de cellules T-"helper" ou de cellules cytotoxiques, notamment des anticorps dirigés contre les granzymes ou la perforine.
Le procédé d'obtention de ces hybridomes entre également dans le cadre de l'invention. Ce procédé comprend des étapes de fusion et de sélection définies plus haut en rapport avec les anticorps monoclonaux.
Comme indiqué ci-dessus, les protéines contre lesquelles sont dirigés les anticorps monoclonaux de l'invention sont soit des protéines natives, soit des protéines recombinantes. Ces protéines recombinantes sont des produits nouveaux et, en tant que tels, entrent dans le cadre de l'invention.
Il s'agit plus spécialement de séquences d'acides aminés renfermant au moins la partie C-terminale active de la protéine mature .
On citera en particulier les granzymes B
recombinants humains et la perforine recombinante humaine.
En opérant selon les techniques classiques du génie génétique, ces protéines sont produites dans des hôtes cellulaires, notamment dans des bactéries, transformés par introduction de vecteurs d'expression, notamment de plasmides, renfermant les fragments de gène codant pour les séquences d'acides aminés recherchées.
Ces fragments sont excisés à partir de clones d'ADN codant pour les protéines matures et sont introduits par ligaturation dans un site approprié du vecteur choisi.

W092/1~ ;`L3J PCT/FR92/00~0 , .
~0 Les protéines exprimées sont récupérées du milieu de culture, après lyse des bactéries, et purifiées.
La mise en oeuvre de ces techniques conduit à
l'élaboration d'outils qui constituent des produits nouveaux. Ainsi, les hôtes cellulaires transformés, les vecteurs d'expression tels que plasmides, et fragments d'ADN tels qu'évoqués ci-dessus entrent dans le cadre de l'invention. Celle-ci vise plus spécialement les protéines recombinantes de perforine et de granzyme et les outils mis en oeuvre pour leur expression.
L'invention vise ainsi un fragment de la séquence de la perforine comportant la partie active C-terminale de la perforine humaine, plus spécialement le fragment tel qu'exprimé par le fragment d'ADN BalI-Bam HI par pAR 3039.
Elle vise également un fragment de la séquence du granzyme B humain tel qu'exprimé par le fragment d'ADN BalI-Bam MI
par pAR 3038.
L'invention décrit également un fragment de la séquence de la perforine comportant la partie active C-terminale de la perforine mature de souris, plus spécialement le fragment tel qu'exprimé par le fragment d'ADN SmaI-EcoRV de 1400 pb. L'invention vise en particulier la séquence d'acides aminés s'étendant de la posltion 98 a 534 sur la figure 1. Elle vise également le fragment d'ADN capable de coder pour cette séquence d'acides aminés, les vecteurs renfermant un tel fragment d'ADN, en particulier un vecteur plasmidique, ainsi que les bactéries transformées par incorporation de tels vecteurs, en particulier les bactéries transformées mPerf-PL 40 déposées a la C.N.C.M. le 12 mars 1991 sous le n I-1057.
Comme indiqué ci-dessus, les gènes des granzymes et de la perforine sont inductibles ; n vitro et ;n vi.v~ au cours de l'activation cellulaire en situation normale ou pathologigue. Les granzymes apparaissent comme des marqueurs précoces de l'activation cellulaire ; la perforlne semble être préférentiellement un marqueur de l'activité cytotoxique d'une cellule. Ces protéines W092/l~4 ~ 3 PCT/FR92/00~0 ,'-apparaissent donc comme des marqueurs fonctionnels de l'activation cellulaire et/ou cytotoxique chez l'homme.
La spécificité élevée des anticorps monoclonaux de l'invention les rend particulièrement précieux pour mettre en évidence la présence de tels marqueurs dans un fluide ou un échantillon biologique humain.
L'invention vise donc également l'application de ces anticorps monoclonaux en tant que bioréactifs pour le diagnostic in vitro dans un fluide ou échantillon biologique de la présence de constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques plus spécialement de granzymes ou de perforine ou encore, par exemple, de protéoglycanes ou de molécules de type lymphotoxine Dans cette 2ppl~ cation, les anticorps monoclonaux sont libres. En variante, ils sont fixés sur un support solide non immunogène.
La méthode selon 1'invention de diagnostic in vitro de la présence de granzvmes ou de perforine ou autre constituant desdits granules cytoplasmiques est caractérisée par le fait qu'elle comprend les étapes suivantes :
- on met en contact l'échantillon à tester avec une préparation d'anticorps monoclonaux, ou d'un fragment tel que défini ci-dessus, immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec lesdits constituants, en partlculier respectivement avec un granzyme ou la perforine lorsqu'ils sont présents dans l'échantillon, puis on met en évidence la formation d'un tel complexe de type antigène-anticorps.
Pour révéler la réaction immunologique, ledit constltuant, plus spécialement le granzyme ou la perforine comporte un groupe marqueur. Il s'agit le plus généralement d'un groupe radioactif. En varlante, on utilise un deuxième antlcorps couplé a un groupement dont l'activité peut etre mesurée telle une enzyme, comme la phosphatase alcaline ou un groupe fluorescent.

W092/1~ J PCT/FR92/00~0 -1~
Cette méthode de détection permet de révéler avec une grande sensibilité et rapidement la présence desdits constituants, en particulier de granzymes ou de perforine dans un échantillon biologique, notamment de les localiser et de les quantifier par exemple au niveau de biopsies de tissu pathologique, ou de cellules du sang périphérique.
Ainsi elle est particulièrement appropriée pour diagnostiquer un rejet dans le cas de transplantation d'organes, (rein, coeur, / poumon, foie, pancréas) et à des fins de diagnostic précoce de GVH [peau, foie, intestin] ) dans le cas de greffe de moelle osseuse.
Outre ces applications immunohistologiques, les anticorps monoclonaux de l'invention et leurs fragments, libres ou immobilisés, sont utilisés pour réaliser des diagnostics dans des patAologies où l'évolution de la maladie modifie le taux de granzyme ou de perforine.
Ils pourraient permettre par exemple de suivre le devenir d'une greffe chez un patient, et en particulier les implications du traitement immunosuppresseur qui pourrait être éventuellement modulé. Cette surveillance pourrait être éffectuée par l'étude cinétique des "infiltrats lymphocytaires" présents au niveau de biopsies prélevées au site de la greffe. Ils revetent également un grand intérêt dans le cas de maladies auto-immunes, dermatologiques, infectieuses (microbiennes, parasitaires ou virales (HIV)).
L'apport des anticorps monoclonaux de l'invention est donc important pour diagnostiquer la présence de cellules activées et/ou cytotoxiques en nombre anor~alement élevé au niveau de l'organe atteint, ou au niveau du sang périphérique.
Ils sont également utilisables pour effectuer des études de différenciation cellulaire, les granzymes étant des marqueurs de la différentiation cellulaire T ou L.
On notera que dans le cas de maladies auto-immunes les protéases lmpllquées constituent des auto-antigènes.
Elles peuvent donc ~tre utilisees pour reconnaître les auto-anticorps formés. A cet égard, les protéines recombinantes, plus particulièrement de granzyme L et de WO92/1~ PCTtF~92/00~0 - . . .
~ ;~
-~3 granzyme H de l'invention, présentent un ~rand intéret dans - une utilisation comme auto-antigènes en vue d'une reconnaissance par des auto-anticorps présents dans des sérums auto-immuns. Pour effectuer cette réaction, on opère avantageusement selon les techniques habituelles.
L'invention vise également un kit pour le diagnostic ~n vitro de la présence desdits constituants des granules cytoplzsmiques plus specialement de granzyme ou de perforine dans un échantillon biologique.
Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, - une préparation d'anticorps monoclonal ou de fragment, libre ou immobilisé, comme défini ci-dessus, - une préparation desdits constituants, plus spécialement de granzyme ou de perforine avec le cas échéant un groupe marqueur, et lorsque ia préparation ne comporte pas de groupe marqueur, une préparation d'un deuxieme anticorps avec un groupe marqueur, - un système de détection spécifique du marqueur, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.
Les anticorps monoclonaux sont susceptibles 25 également de constituer des agents thérapeutiques de grand intéret et peuvent ~ouer le role de vecteurs d'enzymes ou de médicaments.
On rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention. Les figures 1 30 a représentent respectivement - la figure 1 la séquence d'acides aminés de la perforine recombinante dont la préparation est rapportée dans les exemples, - la figure 2, le mode de construction de HLPDE3, - la figure 3, une carte de restrlction partielle du plasmide pAR 3038, - la figure 4, la séquence de nucléotides du granzyme B humain et la séquence correspondante d'acides W092/1~ 2 1 n ~ ~. 3 ~ RCT/FR92/00~0 (~
aminés (1 à 227) utilisee pour former des anticorps monoclonaux anti-granzyme B humain recombinant, - la figure 5, le mode de construction du plasmide pAR 3039-HuP, et - la figure 6, la sequence de nucléotides pAR 3039 HuP et la sequence deduite d'acides aminés de la protéine recombinante, ainsi que la sequence obtenue à partir du clone 34.
I - Matériel I-l Matériel - Les granzymes A et B sont séparés des autres protéines des granules cytoplasmiques des LGL (lymphocytes a larges granules) sur une colonne Mono S échangeuse de cations (HR/5, PHARMACIA) connectée à un système FPLC
(PHARMACIA) selon la technique décrite par (Krahenbul et al., dans J. Immunol, indiqué ci-dessus).
- Les souris utilisées sont des souris BALB/C
d'haplotype H-2d.
- Le myélome NS-l, non sécréteur d'haplotype H-2d, apporte dans la fusion son pouvoir de prolifération. Il est contre-sélectionné en milieu HAT (Hypoxanthine, Aminoptérine, Thymidine) car il porte la mutation HPRT-(Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6,292-295, 1976).
- L'anticorps polyclonal dirigé contre le granzyme B est tel qu'obtenu selon la technique décrite par Krahenb~hl (volr référence ci-dessus).
- La lignee REX est une lignée T immortalisée par le virus d'Epstein Barr.
- L'anticorps monoclonal PAb419 est dirigé contre l'antigène T de SV40 (Harlow et al., J of Virology, 861-869, 1981).

WO 92/1~ ,} ~ j' PCT/FR92/00240 I-2 Solutions MILLIEU 1 : RPMI 1640 (GIBCO), lOO u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO).
MILIEU 2 : RPMI 1640 (GIBCO), lOO u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 250 u/ml interleukine 2 (Roussel Uclaf, 0,7 106 u BRMP / échantillon).
MILIEU 3 : RPMI (GIBCO), lOO u/ml pénicilline, lOO
u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM
pyruvate de sodium (GIBCO), lO % sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 0,36 %. glucose (A.P.).
MILIEU 4 : Dubeccs's MOD Eagle Medium (GIBCO), lOO u/ml pénicilline, lOO u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM
glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de sodium (GIBCO), lO %
sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), lO % sérum de cheval inactivé (GIBCO), lO % NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH
(Prolabo).
MILIEU 5 : Dubecco's MOD Eagle Medium (GIBCO), lOO
u/ml pénlcilline, lOO u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM
glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de Sodium (GIBCO), lO
sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), lO % sérum de cheval inactivé (GIBCO), lO % NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH
(Prolabo), 2 % Hypoxanthine (GIBCO), 2 % Thymidine (GIBCO),

2 % Aminoptérine (GIBCO).
RIPA : lO mM Tris pH 8,1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 %
NP40, 1 % desoxycholate de Na, O,l % SDS.
Tampon de lavage des immunoprécipitations : lOO mM
Tris pH 9, 0,5 M LiCl, 1 % mercaptoéthanol.
Tampon Laemmli (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970) : 62,5 mM Tris pH 6,8, 2 % SDS, 15 % glycérol, 5 % ~-~ mercapto~thanol, O,Ol % bleu de bromophénol.

,~ ., W092/1~ s~ PCT/FR92/0024 II - Méthodes II-1 Isolement des LGL du sang périphérique On opère comme décrit par Chouaib et al., dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6875-6879, 1988.
Les lympAocytes sont isolés du sang périphérique par gradient de ~icoll (PHARMACIA). Après 2 lavages en milieu 5, les cellules sont numérées en solution de Hayem et incubées à raison de 3 x 108 cellules dans des flacons de culture (COSTAR) prétraités avec du ~N inactivé pendant 1 heure à 37C. Les cellules non adhérentes sont alors collectées, lavées en RPMI SHN 10 ~ et fractionnées par centrifugation sur un gradient discontinu de percoll (PHARMACIA). 4 solutions de concentration différente de percoll sont préparées (31 %, 34 %, 37 % et 41 %). Une solution sur deux est préparée dans du milieu RPMI (rouge), ou dans une solution de chlorure de Na isotonique (incolore), permettant ainsi une bonne visualisation des interfaces. Après avoir coulé 4 ml de la solution à 41 ~
puis déposé délicatement sur celle-ci 2 ml de chaque solution par concentration décroissante dans des tubes coniques de 15 ml (NUNCLON DELTA, PAUL BLOCK), 3 x 108 lymphocytes contenus dans 2 ml de RPMI sont déposés à la surface du gradient. Les tubes sont centrifugés 30 min à
1400 t/min sans frein à température ambiante. Les anneaux de LGL situés à l'interface 37 - 41 ~ sont récupérés à la pipette Pasteur, lavés 3 fois en ~PMI, puis regroupés~ Les cellules sont numérées et mises en culture dans du milieu 2 a raison de 5 x 105 cellules par ml. Les LGL représentent 2 a 5 ~ de la population totale des lymphocytes.

II-2 Immunisation de souris avec les granzymes A
et B purifiés a partir de LGL du sang périphérique ou de cellules NK.

W092~]~ PCT/FR92/00~0 10 ,ug de protéines purifiées (granzyme A et B) dissoutes dans 200 ~g de VaccicoxR (109 unités), adjuvant, sont injectées par voie intra-péritonéale à une souris BALB/C. 21 jours après, on effectue un rappel grâce à une 2ème injection par voie intra-veineuse (10 ug de protéines dissoutes dans 200 ,ug de sérum physiologique).

II-3 Fusion cellulaire On opère comme décrit par Oi et Her~enberg, dans Selected methods in cellular immunology. Freeman and co.
Mishell, Shiigi, eds. 1980) Trois jours après le rappel, la souris est sacrifiée et sa rate est prélevée en milieu stérile. Elle est dilacérée avec un piston de seringue de 5 ml dans une boîte de Pétri stérile contenant 5 ml de RPMI. La solution de splénocytes est ensuite lavée avec 50 ml de RPMI. Après centrifugation, les culots cellulaires sont conservés à
température ambiante.
Les cellules de myélome NS-1 mis en culture dans du milieu 2 sont centrifugés pendant 7 min à 1500 t/min, puis lavés dans 50 ml de RPMI. Les culots cellulaires sont resuspendus dans 10 ml de RPMI, et transférés dans le tube contenant les splénocytes selon le rapport de 1 cellule de myélome pour 2 splénocytes. Ce mélange est ajusté à 40 ml avec du RPMI, puis centrifugé pendant 7 min a 1500 t/min à
20C.
Le culot cellulaire mixte est resuspendu avec 1 ml de PEG (polyéthylene glycol 1500, BOEHRINGER), (agent fusionnant), en tournant doucement ia pipette dans le tube pendant 1 min. Le PEG est dilué en a;outant en 1 min 1 ml de RPMI 1640 préchauffé à 37C puis 7 ml du même milieu en 2 min pour atténuer la toxicité de ce produit. Apres centrifugatlon a 1800 t/min pendant 4 min sans frein, le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 ml de mllleu (4) préchauffé a 37C. Les cellules sont distribuées , . ' ' ' .
:, ' , W092/]~ 3 PCT/FR92/00240 1~ .
dans des plaques stériles de 96 puits à fond plat a raison de 105 cellules du myélome dans 100 ~1 par puits (temps 0).
24 heures après la fusion (jour 1), 100 ,ul de milieu 5 (sélection HAT) préchauffé à 37C sont ajoutés dans chaque puits. Ce milieu sélectionne les hybridomes et tue les cellules de myélome qui n'ont pas fusionné.
Au jour 7, 100 ul de milieu sont aspirés et remplacés par 100 ,ul de milieu 4 neuf. Au jour 10, le contenu des puits positifs (test ELISA ; kit AMERSHAM), est transféré sur plaque à fond plat de 24 puits dans lesquels on ajoute l ml de milieu de culture 4. Au jour 13, les hybridomes sécréteurs peuvent etre conservés par congélation en azote liquide dans du SVF/10~ DMS0.

II-4 Recherche des h~bridomes secrétant des anticorps anti-granzymes A et B humains par test ELISA
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).
(kit Anti-IG de souris, anticorps entier lié a de la peroxydase de raifort, AMERSHAM) La préparation des plaques de 96 puits à fond plat est réalisée 24 heures avant le test. A cet effet, lO0 ,ul d'antigene (granzymes A ou B purifiés), à l ,ug/ml (dans du PBS) sont distribués dans les puits. Les plaques sont mises a 4C pendant 24 heures.
2 à 5 lavages avec 200 ,ul par puits de PBS, 0,1 %
Tween 20 sont effectués avant de tester les surnageants de culture des hybridomes. Les plaques sont incubées 1 heure à
37 C avec 50 ,ul par puits de surnageant de culture de l'hybridome à tester.
Après 3 lavages avec du PBS, 0,1 ~ Tween 20, 50 ~1 d'anticorps secondaire (conjugué à la peroxydase et dilué
au l/5ooe dans du PBS, 0,2 % Tween 20) sont ajoutés dans cha~ue puits. L'incubation se fait ~ 37C pendant 30 min.
Les plaques sont de nouveau lavées 3 fois avec du PBS, 0,1 ~ Tween 20. La révélation est effectuée en a~outant 100 ,ul d'une solution contenant le substrat (10 ,ul PBS, 3 ~ H202 dans 12,5 ml d'ABTS 180 mg/l).

W092/1~ ~ t ~ ri t ~ ~ PCT/FR92/00240 Les plaques sont lues par mesure de la DO à 405 nm 15 à 25 min après l'addition du substrat.
Après fusion des cellules du myélome NSl avec les splenocytes provenant de la souris immunisée avec le granzyme B, en opérant comme indiqué ci-dessus, les surnageants de 28 hybridomes désignés GRB se sont avérés être specifiques du granzyme B en test ELISA (test réalisé
avec de la protéine purifiée).
La même démarche suivie avec le granzyme A, a conduit à isoler 15 hybridomes appelés GRA secrétant des anticorps spécifiques du granzyme A, en test ELISA (test réalisé avec de la protéine purifiée).
Le pourcentage d'hybridomes sécréteurs d'anticorps spécifiques est particulièrement satisfaisant, en effet sur 300 hybridomes issus de la fusion entre les cellules du myélome NSl et les splénocytes de la souris immunisée avec le granzyme B purifié, lO ~ secrètent des anticorps spécifiques en test ELISA. Dans le cas du granzyme A, 5 des hybridomes de la seconde fusion sont spécifiques dans les memes conditions.

II-5 Clonage des hybridomes par dilution limite.

Les hybridomes dont les surnageants présentent la plus forte positivité en test ELISA sont clonés dans des plaques de 96 puits à fond plat. Plusieurs dilutions sont testées. Le clonage est effectué à lOO cellules, lO
cellules, 1 cellule et 0,25 cellules par puits à raison de lOO ,ul de milieu 4 par puits.
Les cellules sont nourries 3 jours apres le clonage avec lOO ~ul de milieu 4, puis tous les 7 jours.
Lorsque la croissance cellulaire, contrôlée sur microscope inversé, semble lmportante, le surnageant de culture de ces puits est testé en ELISA sur les granzymes purifiés sur du granzyme A ou B et sur le lyzozyme comme contrôle négatif, Les hybridomes positifs sont transférés dans les plaques de 24 puits puis sur des plaques de 6 puits et par la suite en flacon pour maintenir la croissance .

W092/1~ PCT/FR92/00240 21~9 ~

exponentielle des cellules. Ces hybridomes sont injectés dans le péritoine des souris pour produire des ascites. Ils peuvent être laissés en culture jusqu'à la mort cellulaire afin d'obtenir des surnageants très concentrés étudiés en Western Blot ou en immunoprécipitation.
On récupère deux hybridomes secrétant des anticorps reconnaissant le granzyme B, appelés respectivement GRB98C et GRB51D et trois au~res souches secrétant des anticorps reconnaissant le granzyme A, appelés GRA66D, GRA382E et GRAlOD. Les hybridomes restants seront clonés afin de constituer un panel d'anticorps dirigés contre les granzymes humains A et B.

II-6 Caractérisation de l'isotype des anticorps clonés Le surnageant de culture de l'hybridome à tester est dilué au 1/l0e en 20 mM Tris pH 7,6, 137 mM NaCl (TBS).
La bandelette du kit est incubée 15 min à température ambiante avec le surnageant dilué. Après 3 lavages en TBS, 0,1 % Tween 20 (TBS-T), la bandelette est incubée dans une solution d'anticorps anti-souris couplés à la peroxydase (dilués au l/5ooe dans du TBS-T).
La révélation s'effectue par incubation de la bandelette durant 15 min a température ambiante dans 3 ml d'une solution contenant le substrat (1 pastille de chloro-naphtol dissoute dans 10 ml de méthanol froid, mélangés extemporanément à 50 ml de TBS contenant une goutte de peroxyde d'hydrogene). Après 3 lavages en eau distillée, les bandelettes sont séchées et peuvent etre interprétées.
La technique d'immunisation utilisée dans cette étude a permis d'obtenir des hybridomes sécrétant des anticorps d'isotype IgG. L'isotype des anticorps a été
confirmé par le kit commercialisé par Amersham d'anticorps monoclonaux de souris. Les anticorps monoclonaux GRB98C, GRA66D, GRA382E et GRAlOD présentent l'isotype IgGl. Celui sécrété par l'hybridome GRB51D présente l'isotype IgG2a. La tltration des surnageants de culture des hybridomes clonés W092/l~W ~ t ~ l '3 3 PCT/FR92/00~0 par test ELISA a permis de déterminer un titre du surnageant de culture de l'hybridome GRB98C de 1000. Ceux des surnageants de culture des hybridomes GRB51D, GRA66D et GRAlOD sont de 10 000. Le titre du surnageant de culture de l'hybridome GRA382E est de 100 000. Il convient de noter les valeurs élevees de ces titres.

II-7 Détermination de la specificité de ces anticorps par les techniques d' électro-transfert de protéines et d'immunorévélation (Western blot). On opère comme décrit par Towbin et al., dans Proc. Natl. Acad. Sci.
76, 4350-4354, 1979.

La protéine (antigbne puririé : granzymes A ou B, ou témoin négatif) est incubée dans du tampon de Laemmli à
100C pendant 10 min (1 ,ug/gel de 12 cm de largeur), migre sur un gel de polyacrylamide dénaturant, puis est électrotransférée sur filtre de nitrocellulose (BA83, CERA
LABO) dans un appareil a électrodes en graphite (CERA
LABO), dans un tampon 39 mM de glycine, 48 mM Tris pH 8,3, 0,037 ~ SDS, 20 % méthanol sous un courant de 1 mA/cm2 de filtre pendant 1,5 à 2 heures. Après transfert, le filtre de nitrocellulose est coloré avec du rouge ponceau 0,2 ~, et de l'acide trichloracétique 0,3 % pour vérifier l'efficacité du transfert, puis découpé en bandelettes de 0,6 cm de largeur.
Les bandelettes sont préincubées dans un tampon PBS avec 0,2 % de Tween 20 et 5 ~ de lait écrémé pendant heure à 4~C. Un jeu de bandelettes, représentant dif~érentes protéines a tester, sont incubées 1 nuit a 4C
avec le surnageant d'hybridome dilué au 1/10 dans le tampon PBS contenant 0,2 % de Tween 20 et 5 ~ de lait ecrémé. Les bandelettes sont ensuite lavées dans du tampon PBS
contenant 0,2 % de Tween 20 sous agitation moyenne pendant 5 fols 5 min a température du laboratoire. Les bandelettes sont incubées avec un anticorps anti-immunoglobulines de souris couplé a la phosphatase alcaline (dilué au l/lOOOe dans le tampon PBS ci-dessus) pendant 2 heures à

W092/1~ PCT/FR92/00240 température du laboratoire. Après 5 lavages de 5 min dans du PBS, les bandelettes sont équilibrées dans le tampon de réaction de la phosphatase alcaline (lOO mM Tris pH 9,5, lOO mM NaCl, 50 mM MgCl2) et mises en présence du substrat de la phosphatase (lO ml de tampon de réaction, 44 ~l de chlorure de tétrazolium nitro-bleu, 33 ,ul de sel de (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidine) pendant 15 minutes à température ambiante. La réaction peut etre stoppée en lavant les bandelettes avec H2O.
Le granzyme B, réduit et dénaturé, est électrotransféré sur un filtre de nitrocellulose. Les bandelettes de nitrocellulose sont incubées avec les différents anticorps à tester, puis avec un anticorps an~i-souris conjugué à la phosphatase alcaline.
Dans ces conditions, une bande à 31 XD est observée sur la bandelette incubée avec le sérum polyclonal anti-granzyme B. En revanche, cette bande n'est pas détectée sur les bandelettes incubées avec les anticorps anti-granzyme B GRB51D et GRB98C. Les controles (bandelettes incubées avec l'anticorps dirigé contre l'antigène T de SV 40, avec les anticorps anti-granzyme A
GRA66D, GRA382E et GRAlOD) sont également négatifs. Les anticorps anti-granzyme B ne reconnaissent donc pas le granzyme B dans les conditions de cette expérience de Western blot.

II-8 Marquage des cellules in vitro et immunoprécipitation.

Les LGL sont mis en culture (milieu : RPMI déplété
en méthionine, complémenté en 35S méthionine : 20 à 50 ,uCi/ml et en 1 % SHN inactivé) a raison de 3 a 5 x 105 cellules par ml. Le marquage peut être effectué dans un mllieu RPMI déplété en leucine et complémenté par 20 ~ 50 ,uC1/ml de 3H leucine. Après une incubation de 4 heures à
37C, les cellules sont lavées 2 fois en P~S. Le culot cellulaire est repris dans 500 ~l de RIPA-O,O1 ~ BSA
(B2518, SIGMA), puis soniqué pendant 15 s (micro . :: ,.... . .. .

W092/1~ PCT/FR92/00~0 : ., sonicateur, puissance 40 watts, sonde 0,3-87, BIOBLOCK).
L ' incorporation de radioactivite est suivie par comptage d'une fraction précipitée au TCA. L'extrait cellulaire est aliquoté par 5 x 106 cpm.

- Immunoprécipitation (selon Xress et al., dans J.
Virol. 31, 472-483, 1979).

L'incubation, pendant 30 min à 4C avec agitation sur roue, de l'extrait cellulaire avec 60 ~l de protéine A
SépharoseR (PHARMACIA, CL4B SépharoseR) permet de diminuer le bruit de fond. L'échantillon est ensuite filtré sur un frité (polyéthylène poreux). lO ,ul de sérum normal de souris et 30 ,ul de protéine A SépharoseR sont ajoutés à
l'éluat et laissés 1 heure à 4C avec agitation. Cette solution est filtrée sur le meme filtre. La dernière étape de diminution du bruit de fond est réalisée grace à
l'addition de 30 ~l de protéine A SépharoseR au filtrat et à une incubation de 30 min à 4C avec agitation. Après filtration, l'éluat est incubé, 4 heures à 4~C avec agitation, en présence de 200 ,ul de surnageant de culture à
tester ; 40 ,ul de protéine A SépharoseR et 20 ~l de RIPA-0,01 ~ BSA (B2518, SIGMA). Le complexe antigène-anticorps-protéine A SépharoseR est filtré, puis lavé, élué par 45 ,ul de tampon de Laemmli et bouilli 10 min à 100C.
Les échantillons sont déposés sur un gel de polyacrylamide (12,5 ~) en présence de SDS. Après migration a 40 mA 200 V, le gel est fixé, traité au EN3HANCE (DUPONT
de NEMOURS) lavé en eau dlstillée, séché 1 heure à 80C et fluorographié sur Hyperfilm-MP (AMERSHAM) à -80C.
On rapporte ci-après les résultats d'expériences d'immunoprécipitation suivies de séparation sur gel d'acrylamlde, réalisées pour vérifier la capacité des anticorps monoclonaux anti-granzymes ~ d'immunoprécipiter les granzymes B contenus dans les granules des LGL. Dans cette expérience, on utilise des extraits de cellules (LGL
ou REX) marqu~es à la 35S-méthionine. L'immunoprécipitation est réalisée ~ l'aide des surnageants de culture des W092/l~ PCT/FR92/00~0 l '3 ~

hybridomes à tester. Les protéines immunoprécipitées sont séparées sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5 ~.
Le temps d'autoradiographie est de 7 jours.
On observe une bande à 31 KD correspondant à la migration de l'extrait cellulaire de LGL, immunoprécipité
par les anticorps anti-granzyme B, GRB51D et GRB98C. Cette bande à 31 KD est aussi observée pour le meme extrait cellulaire immunoprécipité par le sérum polyclonal anti-granzyme B. En revanche, cette bande n'est pas détectée avec un controle négatif. La migration de l'extrait cellulaire REX (cellules n'exprimant pas les granzymes) immunoprécipité par les anticorps décrits précédemment ne révèle aucune bande à ce poids moléculaire. Ces résultats montrent que les anticorps GR~51D et GR~98C reconnaissent bien le granzyme B.
Pour la caractérisation des anticorps anti-granzyme A (GRA66D, GRA382E, GRAlOD), les immunoprécipitations ont été réalisées sur des extraits de LGL et de lignées cellulaires REX marqués à la leucine 3H ;
en effet la séquence en acides aminés du granzyme A est pauvre en méthionine, mais elle contient à l'inverse 26 leucines. Les protéines immunoprécipitées sont séparées sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5 %. Le temps d'autoradiographie est de 1 mois. Une bande supplémentaire de faible intensité à 32 Kd est observée uniquement avec l'extrait cellulaire de LGL immunoprécipité par l'anticorps GRA66D, mais non par les anticorps GRA382E et GRAlOD, ni par un anticorps servant de contrôle négatif~

II-9 Production d'ascites Une lnJection de 500 ,ul de tetra-méthyl-penta-décane (JANSSEN) est effectuée en intrapéritonéal à une sourls BALB/C. On opère comme décrit par Hoogenraad et Wraight, dans Methods Enzymol, 121, 375-381, 1986. Dix Jours plus tard, 107 hybrldomes lavés dans du sérum physlologlque sont lnJectés en intra-pérltonéal. Les souris sont ponctlonnées chaque Jour. Le llquide péritonéal est WO92/1~ f~ PCT/RR92/00240 centrifugé pendant 7 min à lS00 t/min à 4C. L'ascite récupérée à l'aide d'une pipette Pasteur est filtrée sur 0,2 ~m (NALGENE), puis centrifugée à 4C pendant 30 min à
12000 g pour éliminer les lipides et conservée à -80C.
s II-10 Purification des anticorps (ImmunoPure IgG Purification kit, PIERCE) La colonne de protéine A, stoc~ée en 0,02 ~ azide 10de Na, est lavée avec S ml de tampon de liaison. 2 ml d'ascite, diluée au 1/2 dans le tampon de liaison, sont déposes sur la colonne. Après lavage avec 15 ml de tampon de liaison, les IgG (immunoglobulines G) sont éluées avec S
ml de tampon d'élution. Cette colonne est régénérée avec 8 15ml 0,1 M d'acide citrique pH 3 et stockée en 0,02 % azide de Na.
Les fractions éluées sont dessalees sur des colonnes d'Exocellulose avec 10 ml de PBS. Ces colonnes de dessalage sont régénérées avec lS ml de PBS et stockées en 200,02 % azide de Na. Les fractions dessalées des IgG sont dosées par mesure de la D0 à 280 nm pour déterminer la concentration des immunoglobulines dans chaque fraction selon la formule : [IgG] en mg/l = D0 a 280 nm/1,4.

25II-11 Détection des granzymes au niveau des LGL
par immunocytochimie.

Les LGL ont été incubés avec des anticorps reconnaissant les granzymes A et B, sélectionnés par le 30test ELISA comme rapporté plus haut.
2 x 105 celluleq par lames sont cytocentrifugées pendant 5 mln a 250 t/min et fixées dans l'acétone pendant 10 min a 4C. Apres 2 lavages en PBS, 10 ,ul par lame de l'anticorps à tester (dilué au 1/2 dans du PBS, 1 ~ BSA) 35sont a~outés et laissés pendant 1 heure a 37C. Les lames 90nt lavées 2 fois en PBS puis 200 ,ul par lame de l'anticorps anti Ig de souris (dilué au l/5ooe dans du PBS, 1 % BSA) sont a~outes et laissés 30 min a 37C. Apres 2 W092/l~4 PCT/FR92/00240 ~ l n ~

lavages en P8S, la révélation est effectuée en incubant pendant 10 min à température ambiante la lame recouverte par 200 ,ul d'une solution contenant le substrat, 1 pastille (10 mg) de 3,3' diaminobenzidine (SIGMA) dissoute dans 10 ml de 50 mM Tris pH 7,6, mélangés extemporanément à 100 ,ul de H22 à 0,3 ~. Les lames sont lavées et les cellules sont colorées par de l'Hémalun de Meyer (MERCK) pendant 1 min à température ambiante. Les cellules sont lavées, déshydratées dans des bains d'éthanol (70 ~, 90 % et 100 ~), passées dans du toluene et montées avec une goutte de résine de montage (BIOLYON).
L'analyse est faite en microscopie photonique.
Dans ces conditions, une coloration marron du cytoplasme est observée, révélant la fixation de ces antisorps. Aucune coloration n'est obtenue avec un anticorps utilisé comme contrôle négatif. Lorsque les LGL
sont activés une nuit en présence d'IL-2 recombinant (250 U/ml), une partie seulement de la population cellulaire est colorée. Après sept jours de culture en présence d'IL2 à la même concentration toute la population cellulaire est colorée.

II-12 Détection des granzymes A et B sur les biopsies de peau de patients présentant une GVH par immunohistochimie.

Lors d'une greffe de moelle allogénique réalisée en identité HLA, le syndrome clinique de la réaction du greffon contre l'hôte ou GVH est fréquemment observé. Les manifestations cliniques de la GVH se caractérisent par des atteintes de la peau, de l'intestin et du foie. Les biopsies de peaux sont considérées comme le meilleur matériel pour établir le diagnostic de GVH grâce l'histologle et l'immunohistochimie. Les biopsies de 2 patlents (RAP : leucémie myelo~de chronique (LMC) ; REN :
leucémie aiguë myelo~de (LAM)) présentant des lésions compatlbles avec une GVH ont été étudiées.

WO92/1~ PCT/FR92/00~0 . ......................... .
~t Les biopsies de peau congelées en OCT (Tissue-Tek, MILES), fixées en acétone pendant 10 min a 4C, sont coupées à froid à 5 ,um. Les coupes de tissus sont saturées avec du sérum de cheval (kit Vectastin, VECTOR) pendant 20 min à température ambiante. Après un lavage en PBS, 2,5 ,ug de l'anticorps à tester sont déposés sur la coupe pendant ~0 min à température ambiante. On rapporte les résultats d'expériences réalisées avec les anticorps anti-granzymes GRA51D et GRA66D. Les lames sont lavées 3 fois en PBS puis incubées avec 50 ,ul d'anticorps anti Ig de souris biotinylés (kit Vectastin) pendant 30 min à température ambiante, puis avec de l'avidine mélangée à de la peroxidase biotinylée (kit Vectastin) pendant 1 heure à
température ambiante. Après 2 lavages en P8S, la révélation est effec~uée en incubant pendant 10 min à température ambiante la lame recouverte par 50 ~1 d'une solution contenant le substrat (1 pastille (10 mg) de diaminobenzidine, dissoute dans 10 ml de Tris 50 mM pH 7,6, mélangés extemporanément a 100 ,ul de H22 à 0,03 %). Les lames sont lavées et les coupes de tissus sont colorées par de l'Hémalun de Meyer pendant 1 min a température ambiante.
Les coupes de tissus sont lavées, déshydratées dans des bains d'éthanol (70 %, 90 % et 100 %), passées dans du toluène et montées avec une gout~e de résine de montage.
L'analyse est faite en microscopie photonique.
On observe comme précédemment ~_vitro, dans le cas des LGL, une coloration du cytoplasme des lymphocytes lnfiltrant la peau. Aucune coloration n'est obtenue avec l'antlcorps controle utilisé comme témoin négatif.
De plus, la coloration indiquant la fixation des différents anticorps anti-granzymes se trouve etre locallsée au niveau des infiltrats lymphocytaires qui ont été caractérisés en immunohistochimie par les marqueurs membranaires de différenciation des lymphocytes (CD3, CD4, CD8).

WO92/1~ PCT/FR92/00240 ~g III - Production de ~erforine recombinante de ~.

S Pour produire de la perfprine recombinante de souris, on utilise un vecteur d'expression procaryote pAR3039 qui exprime les protéines sous le contrôle des signaux de transcription et de traduction du phage T 7 (voir Studier et al., : J. Mol. Biol., 189, 113-130, 1986).
On excise un fragment SmaI-EcoRV de 1400 pb d'un clone d'ADNc complet de perforine de souris. Ce segment code pour la partie C-terminale de la perforine de souris mature recouvrant les résidus 98 à 534 (voir figure unique).
L'extrémité franche du segment est ligaturée dans le site BamH1 du vecteur pAR3039 à l'aide de linkers phosphorylés (5'- CCG GAT CCGG-3').
Ce plasmide est appelé pAR3039-perf.
On transforme avec ce plasmide des bacteries E.co1i DE3 qui contiennent dans leur génome le gene de la polymérase T7 sous le controle d'un promoteur inductible IPTG. Des bactéries correspondantes ont été déposées à la C.N.C.M. le 12 mars 1991 sous le n I-1057.
La synthèse de la perforine recombinante est induite par IPTG dans les bactéries transformées.
On purifie la perforine recombinante de 45 kDa en lysant le culot bactérien (à partir de 100 ml de culture) avec 20 ml d'une solution contenant 50 mM de Tris-HCl, pH
7,5, 0,5 mM d'EDTA et 10 ~g/ml de lypozyme pendant 12 heures sur de la glace.
Après addition de 1,5 ml de NaCl 5M et de 1,5 ml de NP-40 à 10 %, on maintient les bactéries lysées 20 minutes sur de la glace.
L'ADN bactérien est ensuite fragmenté par sonlcation et les corps d'inclusion protéiques sont centrlfuges, 15 mlnutes a 12 000 t/mln.

W092~ .? .?. i~ Ç .~ PCT/FR92/00~0 ~g Le culot est lavé à trois reprises avec une solution de S0 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM d'EDTA et 300 mM de NaCl et dissous dans du tampon SDS-PAGE.
La protéine recombinante de 45 kDa est séparée de la majorité des protéines bactériennes par SDS-PAGE (10 ~
de gel de polyacrylamide) et soumise à une électroélution en utilisant le dispositif d'élution de protéines ISC0.
On obtient en routine de 1 a 2 mg de perforine recombinante à partir de 100 ml de culture bactérienne.

IV - ~roduction de l'anticor~s monoclonal anti-perfor;ne CE2.10 1) Pr~cessus d';mmunis2tion :

Des rats males OFA sont immunisés par voie intrapéritonéale avec 50 ,ug de perforine recombinante murine (ou rMup) puis par une seconde injection, par voie intraperitonéale, 3 semaines plus tard. 3 jours avant de prélever les splénocytes (pour la production d'hybridomes), on in~ecte 50 ,ug de rMuP dans la veine de la queue sans ad;uvant.

2).~roduct;on d'hybridome~ et sélection :

En opérant comme décrit par Harlow et Lane dans Cold Spring Harbor Laboratory - New-York, 1988, on réalise la fusion de cellules de myélome Sp2/O-Ag86 ne produisant pas d'immunoglobulines avec des splénocytes de rats immunlsés avec la rMuP. Brievement, les splénocytes sont récupérés en lntroduisant avec précaution dans les tissus de la rate avec une aiguille et une seringue du milieu RPMI
dépourvu de sérum. Les splénocytes sont lavés avec le milieu comme effectué avec les cellules de myélome. 108 splénocytes sont alors mélangés avec 107 cellules de myélome dans un tube FA~CON de 50 ml et soumis a centrifugation pendant 10 minutes ~ 1 000 t/min. On élimine W092/l~ PCT/FR92/00240 21~r3~ 93 ~.~
3o autant de surnageant que possible. Les cellules sont remises en suspension en tapant doucement sur les parois du tube et on ajoute goutte à goutte 0,4 ml de polyéthylene glycol 1500 chaud 50 % (p/v) (PEG, Serva, cat. N 33123) tout en maintenant le tube dans un bain marie à 37C. Après l'addition de tout le PEG, le tube est maintenu à 37C
pendant 3 min puis centrifugé à 800 t~min pendant 5 min.
Sans enlever le surnageant, on ajoute 5 ml de milieu RPMI
dépourvu de sérum (à 37C) en 2 min, puis à nouveau 5 ml en une fois. Les cellules sont centrifugées à l 000 t/min pendant 5 min. Le surnageant est éliminé et on ajoute 50 ml d'un milieu RPMI complet - 5 % de FCS. La suspension cellulaire est distribuée dans dix plaques de 96 puits auxquelles on a ajouté au préalable des monocytes péritonéaux/macrophages (cellules nourricières) provenant de souris Balb/c (l à 5 jours avant). Les plaques sont incubées à 37C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 24 heures, avant de remplacer le milieu avec un milieu frais cRPMI-5% FCS supplémenté avec l % de HAT
(Gibco). On laisse les cellules croltre pendant environ l0 jours. A ce stade, environ 70 ~ des puits comportent des clones qui se sont développés, beaucoup d'entr'eux possédant plus d'un seul clone. Environ 20 jours après la fusion, les cellules dans la majorité des puits contenant des hybridomes ont atteint une densité pratiquement maximale et l00 ,ul de chaque puits sont prélevées pour effectuer un test ELISA sur de la rMuP et de la perforine de murin native. Des hybridomes fortement positifs sont 90us-clonés comme décrit dans l'article de Harlo~ dont questlon ci-dessus et soumis à une autre opération de sélection.

Sélect1On par test ~ISA pour obtenir un antiCorps Des plaques de mlcrotitratlon de 96 puits (Dynatech, MIC 2000) sont recouvertes pendant environ 14 heures à 4C avec l00 ,ul de rMuP (l0 ~g/ml dans PBS). En W092tl~ ? ~ PCT/FR92/00~0

3~
variante, les puits sont recouverts de granules dérivés de CTL B6.1 de murin (solubilisés dans 1,5 M de NaCl, ultracentrifugés et dilués à 1/10 dans l'eau) ou de granules de cellules LAK humaines (solubilisés dans du phosphate 0,5 M, ultracentrifugés et dilués à 1/5 dans l'eau). Après lavage des puits à trois reprises avec P~S
0,02 ~ Tween-20, on ajoute 100 ul de surnageant d'hybridomes dans chaque puits en 2 h à température ambiante. Les puits sont lavés comme indiqué plus haut et on ajoute 50 ,ul d'immunoglobulines de chèvre anti-rat conjuguées à de la phosphatase alcaline (Sigma) en 1 heure.
Après le lavage, on ajoute 100 ,ul de substrat de phosphatase (p-nitrophényl phosphate, Sigma 104 tablettes) et on mesure le A40snm dès que la couleur commence à
apparaltre. Les puits témoins négatifs sont incubés avec cRPMI-5 % FCS au lieu d'être incubés avec des surnageants d'hybridomes. On récupère ainsi l'anticorps monoclonal anti-perforine désigné par l'abréviation CE2.10 déposé à la CNCM sous le n I-1058 le 12 mars 1991.
V -en ~ytométrie en flux.

On rapporte ci-après les résultats obtenus en suivant la méthode, légerement modifiée, de Schmid I et al.
Cytometry, 12 : 279-285, 1991.

Matér1el :

Toutes les solutions sont préparées en PBS.

- Paraformaldéhyde Solution mère à 3 ~ (PFA), - Sérum de veau foetal (SVF) flltré a 0,2 ,u, - Tween 20. Solution mere à 2 ~, - Aride NaN3. Solution mere à 200 mM

W092~

211~`19 Techni~ue :

Fixation :
1.106 cellules lavées en PBS sont remises en suspension dans 850 ul de PBS (4C), 150 ,ul de PFA (4C) sont ajoutés et la suspension homogénéisée. Les échantillons sont mis à incuber à 4C pendant 1 heure, puis centrifugés 8 min à 250 g.
p~erm~abili~i~n :
Les cellules fixées sont remises en suspension dans 1 ml Pss 0,2 ~. Tween (900 ,ul PBS + 100 ul de solution mère Tween 2 ~).
Les échantillons sont ensuite mis à incuber pendant 15 min à 37C. On ajoute alors 2 ml d'une solution de lavage 1 (solution de lavage 1 = PBS 2 ~ de SVF, 10 mM
inal de NaN3). La suspension est centrifugée 8 min à 250 t/min.
Le surnageant est re;eté ; les échantillons cellulaires sont ensuite accessibles à l'étude des protélnes intra-granulaires.

Incubation :
anticorps primaire :
De façon à réduire la fixation non spécifique, on aJoute au culot cellulaire 50 ul d'une solution tampon pour anticorps.
On remet en suspension, puis on aJoute 50 ,ul d'antlcorps antiperforine 1/3000 (soit 1/6000 final) et d'anticorps anti-granzyme B 0,25 ,ug.

T~moln~ ut~ c témoin négatif : une immunoglobuline irre~evante de souris, de type IgGl est utilisée sur la suspension cellulaire à étudier.
- Contrôle de perméabilisation : un anticorps anti-cytosquelette, l'antitubuline a, (la tubuline a étant W092/1~ f~ ~ PCT/FR92/00~0 une protéine strictement intra-cellulaire), est testé sur toutes les populations cellulaires.
- Temoin positif cellulaire : cellules LGL en culture, - témoin négatif cellulaire : lignée lymphoïde MOLT 4.
Les échantillons ainsi traités sont incubés 30 min à 4C, puis lavés 2 fois en solution de lavage (2) (solution de lavage (2) = PBS 0,2 ~, Tween 20, 2 ~ SVF, 10 mM NaN3 final). On effectue une centrifugation 8 min à
250 g.

Anticor~s secondaire : 60 ng de GAM sont ajoutés dans 50 ,ul de PBS au culot cellulaire remis en suspension dans 50 ~1 de tampon pour anticorps. On laisse incuber 30 min à 4C, puis on procède à deux lavages en solution (2)~
Anticorps tertiaire : de fa,con à realiser une étude simultanée en cytofluorométrie de l'expression de la perforine et du granzyme B en fonction du phénotype et de l'état fonctionnel des lymphocytes une incubation avec des antlco.ps reconnaissant des antigènes de membrane est réalisee.
On utilise des anticorps . anti CD3, a raison de 0,125 ,ug (2,5 ,ul/test), . anti CD8 ~ raison de 0,03 ,ug (2,5 ,ul/test) et . anti CD25 à raison de 7,5 ,ul/test sous un volume de 50 ,ul PBS.
On a~oute aux cellules 50 ,ul de tampon pour anticorps et 50 ,ul d'anticorps. On laisse incuber 30 min à

4~C, puis on effectue deux lavages à l'aide d'un mélange PBS-azide.
Les cellules alnsi traitées sont remises en suspension en milieu P~S-azide et analysées dans les deux heureg qui sulvent. Si les cellules sont analysées plus tardlvement, elles sont remises en milieu PBS-PFA 1 %.
Cette technique a été utilisée pour comparer l'expression du granzyme B et de la perforine dans des lymphocytes du sang de cordon ombilical avec celle de , W092/1~ PCT/FR92/00~0 21~161 ~.,'~ ,, lymphocytes adultes et évaluer la cytoxicité dans le cas de greffes.

VI - ~plicatio~c clin~ues :
On rapporte ci-après les résultats d'études concernant l'utilisation des anticorps de l'invention dans différentes situations pathologiques telles que :
- les rejets de coeur après transplantation, - les rejets de poumons après transplantation.
Ces deux modèles permettent d'étudier l'activation cytotoxique de cellules qui infiltrent un greffon.
Cette approche permet d'etre étendue à tous les modèles de rejets de greffes quels qu'ils soient. Le matériel utilisé est constitué par des biopsies congelées et des lavages bronchoalvéolaires pour les rejets de poumon.
D'autres modèles impliquant un role des cellules cytotoxiques dans la pathologie elle-meme ou dans la réponse immunitaire générée par cette pathologie ont également été étudiés, à savoir - les tumeurs cutanées, - la réponse cellulaire T dans les lymphomes malins non Hodgkinien.
La technique utilisée dans tous ces modèles est la technique APAAP, en trois couches On suit le protocole suivant :
1 - décongélation des lames gardées au congélateur a température ambiante 15 min, 2 - inscription sur chaque lame au crayon de l'anticorps à tester, 3 - fixation dans un bain d'acétone 10 min à
température ambiante, 4 - séchage 3 - 4 min,

5 - réhydratation 10 min dans du tampon TBS pH
7,6, 30 ~ de SVF,

6 - application d'une première couche et incubation à température ambiante en chambre humide 30 min, W092/]~ tj~ PCT/FR92/00240 3~

7 - rin~ages dans TBS pH 7,6 à deux reprises 5 min,

8 - incubation avec la deuxième couche (anticorps de lapin anti Ig souris),

9 - rinçages deux à trois fois en TBS pH 7,6,

10 - application d'une troisième couche d'anti-corps (complexe P.A. couplé à un anticorps de souris anti P.A. 30 min en chambre humide),

11 - rinçages deux fois en T.B.S. pH 7,6 puis 10 T.B.SpH 8,2,

12~ - révélation de la phosphatase alcaline 20 à
30 min dans l'obscurité,

13 - rinça~e,

14 - contrecoloration,

15 - montage en milieu aqueux.

produits utilises :
* tampon T.B.S. 0,05 M, pH 7,6 solution A TRIS = 60,55 g dans 11 H20 distillée, p~ 7,6 solution B + Nacl = 87,66 dans 11 H20 distillées, pH 7,6 * tampon TBS 0,05 M 5 Solution A 100 ~l + solution B 100 ,ul + 800 ~l ED pH 7,6 * Révélateur : pour 100 ml de Tris 1/ Naphtol ASTR phosphate 20 mg 2/ Dimethylformamide 2 ml 3/ TRIS pH 8,2, 0,01 M 100 ml 4/ Levamisol 2,4 g pour 10 ml d'ED 130 ,ul 5/ Fast Red TR salt 100 mg 6/ Flltration * Antlcorps monoclonaux deuxibme couche: Dako lOg 20 ~, Z 259 80 % dilué dans TBS
7,6 a utili8er 1/20 de Ac2 20 ~ SHN Ab trol8bme couche : A.PAAP D 651 1/50 dilué dans 20 ~ SHN

W092/1~ PCT/FR92/00~0 VII - Expr~ssion du ~ranzyme a humain,recombinant et de la ~erforine humaine recombinante d~ns des hôtes ~actéri~,ns -(T7 POLl.

On opère comme décrit ci-dessus par Studier et al.
dans J. Mol. Biol (1986), 184, P 113-130.

MATERIEL

Plasmide Site amont Fusion Cadre Terminaison aval site de ouvert clonage pAR3038 ~al I ~a_HI(8mères) ATC To ~QRV
pAR3039 ~al I BamHI(10mères) GAT To ~QRV

2 3 ~ 5 6 7 8 9 10 11 Met Al- Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln M-t Gly Arg CAT ATC GCT AGC ATG ACT GGT GGA CAC CAA ATG GGT CGG ATC'C a~ro-C~ilL5~ lO~ere~

M9 + CAA, Trp. Amp milieu M9 milieu plus 2 g/l casaminoacides 3,3 ml de tryptophane à
10 mg/ml -50 mM Trls-Cl (pH 7.5) Stock : 1 M pH7,5 0,5 m EDTA Stock : 0,5 M
10 mg/ml lysozyme fraichement préparé
IPTG dans H20 stérile (stock à 20C, 20 mg/ml = 0,084M, dllué 210 fois) 5 M NaCl 10 ~ NP-40 dans H20 TEN : 50 mM Tris et 0,5 mM EDTA + 300 mM NaCl W092/~ ? ~ PCT/FR92/00~0 ~ 3~
Souche DE3 (E.coli) contenant un chromosome avec le gène de la T7 polymérase soue le controle d'un promoteur inductible par IPTG
(1) Croissance des cellules :
Exemple : E.coli DE3 ; T7 HLP ; à des fins analytiques le volume est réduit de 5 fois.
1. On démarre sur 14 h environ (inoculum) à partir de plaques fraichement préparees (moins de 48 h) de LB-Amp (50 ug/ml) dans M9 + CAA, Trp. Amp~ On prélève pour déposer dans un Erlen de 100 ml. Le volume doit etre de 10 % du volume souhaité pour la culture (il est également possible de faire croître les cellules dans LB).
2. On dilue à 1:10 les cultures dans M9 + Amp.
CAA, trp. On laisse la croissance s'effectuer jusqu'à une mesure de DO~Qn = 0,8 - 0,9 (habituellement 2 à 3 heures) à
37C avec une bonne aeration.
3. On induit le gène de l'ARN polymérase T7 avec IPTG 0,4 mM.
4. On laisse la croissance s'effectuer pendant 3 heures.
5. On récupere les cellules et les conserve sur la glace avant la centrifugation réalisée dans des tubes de 50 ml, a 3500 t/min, 30 min a 4C.
6. Le culot est congelé jusqu'à -20C si nécessaire.
(2) lyse cellulaire et préparation de fractions de proteines insolubles.

1. Pour 50 ul de culture, on remet en suspension (50 mM Tris + HCl (pH 7,5~, 0,5 mM EDTA, et on a;oute 150 ,ul 25 mg/ml de lysozyme (fraichement préparé dans l'eau).
2. On laisse la lyse s'effectuer sur de la glace 30 mln a 2 heures.
3. On a~oute 0,75 ml de NaCl 5M, ce qui doit entrainer la lyse des cellules. On utilise un Vortex puis on a~oute 0,75 ml 10 % NP-40. On réutilise le Vortex. Le mélange est très vlsqueux et conservé sur de la glace 10 a 30 m~n pour obtenir la lyse de toutes les cellules.

W092/1~ PCT/FR92/00~0 '21 0~1 9 4. On applique un traitement de sonication pour casser l'ADN (pulsations de 2 x 10 - 15 sec. jusqu'à
l'obtention d'un milieu liquide).
5. On fait tourner les protéines ppr.
6. On lave le culot deux à trois fois dans TEA
puis on effectue une sonication pour clarifier le milieu si nécessaire.
7. On reprend le culot dans 500 ~ul de tampon SDS.
Pour ~ne extraction cellulaire complète, on remet en suspension 1 ml de culot cellulaire dans environ 200 ,ul de tampon SDS.
On prépare également un témoin sans induction par IPTG ou un plasmide avec un insert dans une mauvaise orientation.
VIII - Granzyme R humain ~combinant . Construction du vecteur pAR - 3038 - GraB

Toutes les techniques de clonage utilisées sont réalisées en opérant selon Maniatis et al. dans Molecular Cloning. A laboratory manual New York ; Cold Spring Harbor, Laboratory Press - Schmidt et al., 1987 /J. Immunol. 139, 250-256.
A partir d'un clone HLP, on isole un insert d'ADN-c complet de granzyme B humain (mobilisation de l'insert avec BamH1). L'ADN-c entier est sous-cloné dans le site BamHl de ml3mp8.
En utilisant la technique de Kunkel (kit ~io-Rad, Kunkel et al. Methods in Enzymology, 1987, 154, 367, 382), on change le nucléotide 116 d'un A en T par mutagénèse in vitro, ce qui entraine un changement dans le site de l'acide aminé du granzyme 3 (de glu en val).
Ce changement de nucléotide génere un nouveau site de restrlction Ball qui permet d'isoler le fragment Ball -BamH1 du clone du granzyme B correspondant aux acides amines de la région 6 à 227, plus une région de nucléotides non tradults (volr les igures 2 et 3).

W092/1~ ~' ~` PCT/FR92/00240 ' `' ' 3~
Par ligation le fragment Ball - BamH1 est introduit dans le vecteur PAR-3038, qui a éte coupé par Nde I et BamHl et déphosphorylé. On utilise un linker synthétique NdeI - Ball qui comprend les 6 premiers résidus du granzyme B pour adapter le site NdeI du vecteur et le site Ball du granzyme B.
Cette construction permet l'expression du granzyme B recombinant dont la séquence diffère de celle du granzyme B humain natif par le fait qu'elle est précédée par Met et que l'acide aminé 6 n'est pas Glu mais Val.

. Fxpression du ~ranzvme B recnm~n~nt Le vecteur d'expression bactérien PAR 3038 utilise le promoteur du bactériophage T7 pour exprimer sélectivement les protéines recombinantes.
Les bactéries DE3 de la souche d'E,coli contenant un gene de la polymérase T7 chromosomale endogène sous le contrôle d'un promoteur inductible par IPTG, sont transformées par le plasmide AR-3038 B.
La synthèse de la protéine recombinante est induite dans les cellules DE3, transfectées avec le plasmide PAR-3038. GraB comme suit :
un inoculum de 14 heures environ, provenant de plaques sur lesquelles ont récemment été appliqués L Broth-50 ,ug/ml d'ampicilline, est dilué au 1/lOeme dans le même milieu. On laisse pousser les cellules 2 a 3 heures jusqu'à
une absorbance A 600 nm de 0,8 a 0,9.
Le gene de la TA polymérase est alors induit pendant 3 heures par addition de 0,4 mM d'IPTG.
Les cellules sont recueillies et la protéine recombinante est isolée de la fraction protéique insoluble.
En bref, le culot cellulaire (de 50 ,ul de culture) est remls en suspension dans 5 ml de Tris Hcl (~0 mM), 0,5 mM d'EDTA, pH 7,5, supplémenté avec 0,75 mg/ml de lysozyme et lalssé sur de la glace pendant deux heures.
On a~oute 750 ~l de NaCl 5 M et 750 ,ul de BP-40 a 10 % sous agitation vigoureuse.

W092/1~ PCT/FR92/00~0 2 ~
On maintient le milieu 30 min sur de la glace, puis on casse les chaines d'ADN bactérien par sonication (trois impulsions de 15 sec) jusqu'a ce que la solution perde sa viscosité et devienne liquide.
Le précipité de protéine est récupéré par centrifugation (6000 g, 30 min, 40C) lavé à trois reprises dans 50 mM de Tris-HCl, 0,5 mM d'EDTA, 300 mM de NaCl, pH
7,5 et dissous dans un tampon SDS-PAGE. La protéine recombinante de 25 kDa est séparée des protéines bactériennes principales par SDS-PAGE et électro-éluées en utilisant le dispositif d'élution de protéines Biorad, en suivant les instructions du constructeur.
A partir de 400 ml de culture bactérienne, on obtient environ 1 a 2 mg de protéine recombinante de manière répétée.
La figure 4 donne la séquence de nucléotides du granzyme B humain et la séquence correspondante d'acides aminés.

IX - ~ :

On utilise un ADNc de perforine humaine tel qu'isolé à partir d'une banque d'ADNc (lambda ZAP-LAK) dans un vecteur pBs/clone 15. Le plasmide renfermant un insert d'ADNc de la perforine humaine est appelé pAR 3039 ~uP. Ce plasmide comporte un gène de résistance à l'ampicilline. Le mode de construction est représenté sur la fi~ure 5.
L'insert d'ADNc Sma/Eco RI comporte 1600 paires de base ;
ce fragment code pour la séquence d'acides aminés allant de la position Arg98 à ~rp534.
La transcription en ARN est induite par IPTG. Pour la construction, pAR 3039 est adapté avec BamHI à SmaI en utilisant comme adaptateur GATCCCCGGG (Pharmacia). Le fragment ~u periorine Sma I (de pSS/clone 15) est soumis à
une étape de ligation. Le cadre ouvert de lecture est contr~lé par séquençage.

WOg2/1~ tl-li PCT/FR92/00~0 - 4~
La figure 6 represente le nucléotide pAR 3039 -HuP et la séquence d'acides aminés déduite de la protéine recombinante. On indique également la séquence du clone 34.

Claims (19)

REVENDICATIONS

1/ Anticorps dirigés contre les constituants des granules cytoplasmiques de cellules activées T "helper" ou de cellules cytotoxiques, plus spécialement des lymphocytes T cytotoxiques et des cellules "natural killer", caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux capables de réagir spécifiquement avec un épitope d'un constituant donné d'un granule humain, sous forme native ou sous forme recombinante, en particulier un épitope de granzyme humain ou de perforine humaine, sous forme native ou recombinante, en donnant lieu à un composé du type antigène-anticorps.

2/ Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce que les anticorps monoclonaux anti-granzymes sont des anticorps monoclonaux anti-granzyme A, B
ou H humains.

3/ Anticorps selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils appartiennent à la classe des IgG, qu'ils sont dirigés contre des protéines de poids moléculaire d'environ 25 à 30 kDa (granzyme B), 60 kDa (granzyme A) ou 66-75 kDa environ (perforine).

4/ Anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, tels qu'induits par un procédé comprenant les étapes :
- de fusion de cellules de myélome non sécréteur avec des cellules productrices d'anticorps dirigés contre un constituant donné de granules cytoplasmiques de cellules cytotoxiques ou de cellules T "helper", en particulier d'anticorps dirigés contre les granzymes ou la perforine.
- de sélection de cellules hybrides capables de produire des anticorps spécifiques vis-à-vis desdits constituants, - de clonage de ces hybridomes, et - de purification des anticorps monoclonaux tels que produits par exemple à partir de liquides d'ascites ou de milieux de culture.

5/ Anticorps selon la revendication 4, caractérisés en ce que les anticorps produits par les cellules utilisées dans l'étape de fusion sont induits par des constituants de granule sous forme native.

6/ Anticorps selon la revendication 4, caractérisés en ce que les anticorps produits par les cellules utilisées dans l'étape de fusion sont induits par des constituants de granule sous forme recombinante, notamment par un granzyme B humain recombinant ou une perforine humaine recombinante.

7/ Anticorps monoclonaux caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux anti-granzyme B humain et anti-granzyme A humain tels que sécrétés par les clones GRB
51D et GRA 66D déposés à la CNCM sous les n° I-1060 et I-1059 le 12 mars 1991, ou encore d'anticorps anti-granzyme B
humain recombinant ou anti-perforine humaine recombinante tels que sécrétés par les clones déposés à la DSM le 13 mars 1992.

8/ Souches d'hybridomes caractérisées en ce qu'elles sont capables de sécréter des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications précédentes.

9/ Souches d'hybridomes selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules hybrides résultant de la fusion de cellules de myélome avec des cellules produisant des anticorps spécifiques après immunisation avec un constituant donné des granules cytoplasmiques de cellules cytotoxiques, plus spécialement avec des granzymes ou de la perforine purifiés, ou des granzymes et perforine recombinants.

10/ Clones producteurs d'anticorps monoclonaux anti-granzyme déposés à la CNCM sous les n° I-1060 et I-1059 le 12 mars 1991 et à la DSM le 13 mars 1992.

11/ Clone producteur d'anticorps monoclonaux anti-perforine recombinante humaine déposé à la DSM le 13 mars 1992.

12/ Procédé pour la préparation d'un hybridome selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de fusion et de sélection définies dans la revendication 4.

13/ Procédé selon la revendication 12, caractérisé
en ce que les cellules de myélome sont des cellules de myélone NS1 et que les cellules productrices d'anticorps monoclonaux sont des splénocytes.

14/ Méthode de détection in vitro de la présence de constituants des granules cytoplasmiques de cellules T
"helper" ou de cellules cytotoxiques, en particulier de granzymes ou de perforine dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact de l'échantillon provenant d'un patient susceptible d'être atteint d'une maladie s'accompagnant de l'exocytose desdits constituants, en particulier d granzyme ou de perforine, avec une préparation d'anticorps monoclonal ou d'un fragment de ce dernier, tel que défini ci-dessus, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps, et la détection de la liaison immunologique.

15/ Kit pour la détection in vitro de la présence des constituants des granules cytoplasmiques de cellules T
"helper" ou de cellules cytotoxiques en particulier de granzyme ou de perforine dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titrage, - une préparation d'anticorps monoclonal spécifique ou de fragment, libre ou immobilisé, comme défini ci-dessus, - une préparation desdits constituants, plus spécialement de granzyme ou de perforine avec le cas échéant un groupe marqueur, et, lorsque la préparation ne comporte pas de groupe marqueur, une préparation d'un deuxième anticorps avec un tel groupe, - un système de détection spécifique du marqueur, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.

16/ Application des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 à la détection de la présence de constituants des granules cytoplasmiques sécrétés par des cellules cytotoxiques.

17/ Protéines des granules cytoplasmiques des cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques, caractérisées en ce qu'il s'agit de protéines recombinantes telles qu'obtenues, par génie génétique, dans des hôtes cellulaires, notamment des bactéries, transformés par introduction de vecteurs d'expression, notamment de plasmides, renfermant des fragments de gène codant pour les séquences d'acides aminés recherchées.

18/ Fragments d'ADN caractérisés en ce qu'ils sont constitués par la séquence codante vis-à-vis d'une protéine selon la revendication 17, ou qu'ils comportent une telle séquence, et qu'ils sont le cas échéant incorporés dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide.

19/ Vecteurs d'expression notamment plasmide renfermant un fragment d'ADN selon la revendication 18, et hôtes cellulaires transformés par ces vecteurs.