JPH06506112A - 細胞質顆粒構成成分のインビトロ診断のための手段及びその生物学的応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 −前記構成成分に対し特異的な抗体を産生ずることのできるハイブリッド細胞の 選択、 −これらのハイブリドーマのクローニング、−例えば腹水又は培地などから産生 されるようなモノクローナル抗体の精製、 という段階を含む方法によって誘導された、請求の範囲第１項乃至第３項に記載 の抗体。

５）融合段階において利用された細胞が、未変性の形の顆粒の構成成分によって 誘導されることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の抗体。

６）融合段階において利用された細胞によって産生される抗体が、組換え体の形 をした顆粒構成成分特に組換え型ヒトＢグランザイム又は組換え型ヒトパーフォ リンによって誘導されることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の抗体。

７）１９９１年３月１２日にｌ−１０６０及びｌ−１０５９という番号でＣＮＣ Ｍに寄託されたクローンＧＲＢ５１Ｄ及びＧＲＡ６６Ｄにより分泌されるような ヒトＢ抗−グランザイム及びヒトＡ抗−グランザイムモノクローナル抗体、或い は又１９９２年３月１３日付けでＤＳＭに寄託されたクローンによって分泌され るような組換え型ヒトＢ抗グランザイム又は組換え型ヒト抗パーフォリン抗体で あることを特徴とする、モノクローナル抗体。

８）請求の範囲第１項乃至第７項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を 分泌することができることを特徴とするハイプリドーマ株。

９）特に、精製されたグランザイム又はパーフォリン又は組換え型グランザイム 及びパーフォリンといった細胞障害性細胞の細胞質顆粒の一定の与えられた構成 成分での免疫化の後特異的抗体を産生ずる細胞と骨髄腫細胞を融合させた結果得 られるハイブリッド細胞で形成されていることを特徴とする請求の範囲第８項に 記載のハイプリドーマ株。

１０）　１９９１年３月１２日に［−１０６０及びｌ−１０５９という番号でＣ ＮＣＭに、又１９９２年３月１３日付でＤＳＭに寄託された抗−グランザイムモ ノクローナル抗体の産生クローン。

１１）　１９９２年３月１３日付でＤＳＭに寄託されたヒト組換え型抗パーフォ リンモノクローナル抗体の産生クローン。

１２）請求の範囲第４項に記載の融合及び選択段階を含むことを特徴とする請求 の範囲第８項乃至第１１項のいずれか１項に記載のハイブリドーマの調製方法。

１３）骨髄腫細胞が骨髄（ｍＹｅｌｏｎ）細胞ＮＳＩであり、モノクローナル抗 体産生細胞が牌細胞であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の方法。

１４）生物学的試料の中の特にグランザイム又はパーフォリンといった細胞障害 性細胞又は「ヘルパーＪＴ細胞の細胞質顆粒の構成成分の存在のインビトロ検出 方法において、−抗原−抗体複合体の産生に適した条件下で、前記構成成分特に グランザイム又はパー７オリンのエキソサイト−シスを伴う疾病に羅患している 可能性のある患者からの試料を上述のようなモノクローナル抗体又はそのフラグ メントの調製物と接触させ、免疫学的結合を検出する段階 を含むことを特徴とする方法。

１５）生物学的試料中の「ヘルパーＪＴ細胞又は細胞障害性細胞の細胞質顆粒の 構成成分特にグランザイム又はパーフォリンの存在をヱンビトロで検出するため のキットにおいて、−マイクロタイタープレートといった秤量のための支持体と して用いられる適当な固体相、 −上述のような遊離した又は不動化された特異的モノクローナル抗体又はフラグ メントの調製物、 −場合によっては標識基を伴う前記構成成分より特定的にはグランザイム又はパ ー７オリンの調製物、及びこの調製物に標識基が含まれていない場合にはこのよ うな基を伴う第２の抗体の調製物、−標識の特異的検出システム、 −免疫学的反応のため及び検出反応のために適切な緩衝液を含むことを特徴とす るキット。

１６）細胞障害性細胞により分泌された細胞質顆粒の構成成分の存在の検出に対 する、請求の範囲第１項乃至第７項のいずれが１項に記載のモノクローナル抗体 の応用。

１７）「ヘルパーＪＴ細胞又は細胞障害性細胞の細胞質顆粒のタンパク質におい て請求めるアミノ酸配列に対しコードする遺伝子フラグメントを封じ込めている 特にプラスミドといった発現ベクターの導入によって形質転換される特に細菌と いった細菌宿主の中で遺伝子工学により得られるような組換え型タンパク質であ ることを特徴とするタンパク質。

１８）請求の範囲第１７項に記載のタンパク質に対しコードする配列によって構 成されていること又は、このような配列を含むこと、及び場合によってはプラス ミドといった発現ベクタの中に取り込まれていることを特徴とする、ＤＮＡフラ グメント。

１９）特許請求の範囲第１８項に記載のＤＮＡフラグメントを封じ込めているプ ラスミドといった発現ベクター、及びこれらのベクタによって形質転換された細 胞宿主。

浄書（内容に変更なし） 明細書 細胞質顆粒構成成分のインビトロ診断のための手段及びその生物学的応用 本発明は、生体の免疫応答において役目を果たす「ヘルパーＪＴ細胞及び細胞障 害性細胞の構成成分のインビトロ診断のための手段に関する。

免疫系は、ウィルス性、細菌性又は同種抗原の生体内への導入に対して特異的に 又は非特異的に応答することができる。これらの異なる抗原の中性化又は排除は 、２つのタイプの細胞すなわちＢリンパ球及びＴリンパ球に起因するものである 。これらの細胞は、２つの形態の免疫応答を確実に行なう。すなわち、Ｂ細胞に より媒介される体液性応答と少なくとも２つの細胞個体群つまり細胞障害性Ｔリ ンパ球（ＣＴＬｓ）と［ナチュラルキラーＪ　（ＮＫ）細胞により媒介される細 胞応答である。

細胞媒介の細胞障害性においては、２つの溶菌プロセスが記述されてきている。

そのうちの１つは、細胞内の第２のメツセンジャーが無い場合に細胞溶解タンパ ク質のエフェクター細胞（ＣＴＬｓ及びＮＫ細胞）による分泌を含んでいる。調 節溶菌と呼ばれる第２のプロセスには、細胞質顆粒内に大量に溶菌タンパク質又 は溶菌に関連するタンパク質を貯蔵すること、そしてエフェクター細胞の表面レ セプターの活性化及び第２の細胞内メツセンジャの産生の後にはじめてそれらを 分泌することが含まれる。

これらの顆粒内では、異なるタンパク質が識別されており、特に挙げられるのは 、パーフォリンつまり気孔を形成するタンパク質、グランザイム（ｇｒａｎｚｙ ｍｅ）と呼ぶタンパク質分解酵素の１群、そしてパーフォリン又はグランザイム を細胞膜の方へ輸送することを担当する高分子量のタンパク質であるプロテオグ リカンである。

エフェクターとその標的の相互作用及びその活性化の間にエフェクタ／標的の接 触によって形成された細胞内空間内に自らの中味を分泌し標的細胞の溶菌を誘発 する顆粒状の細胞質内液胞のエキソサイト−シス（開口分泌）が発生する。

パーフォリンは、ラット又は人間の体内で細胞障害性細胞系統から単離された。

実施された研究により、Ｃａトの存在下でパーフォリンの分子が重合し、標的細 胞の原形質膜レベルに挿入され、標的細胞の破壊をひき起こす気孔を形成するこ とが観察できた。

マウス及びヒトのｃＤＮＡクローンが分離された。最近になって、マウスとヒト の体内でのパーフォリンのケノミック配列が報告されている。

一方グランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ）については、多くの研究チームが、ＣＴ Ｌ又はＮＫ／ＬＡＫ　（リンフ才力イン活性化キラー）活性細胞の顆粒からのそ の精製に関して記述している。これは、細胞質問顆粒のタンパク質の大部分（パ ーフォリンが１０％であるのに対して８５％）を占めている。さまざまなグラン ザイムが分離され、マウスならびにヒトにおいて特徴づけされてきた。より特定 的には、グランザイムＡ〜Ｆと名付けられた６つのグランザイムが、マウスのＣ ＴＬの細胞質顆粒において記述されている。グランザイムＧと呼ばれる７番目の グランザイムが最近マウスのＣＴＬ内で特徴づけされた。ヒトにおいては、グラ ンザイムＡとＢに対応する２つのグランザイムが分離され、Ｈと呼ばれる３番目 のグランザイムは、すでに分離されたマウスのいずれのグランザイムとも一致し ない。

グランザイムは、分泌されたタンパク質の特徴であるシグナルペプチドを含むか 又は顆粒自位置づけをもつ前駆分子の形で合成される。このシグナル配列の後に は一般にＧｌｙ−Ｇｌｕ又はＧｌｕ−Ｇｌｕ（プロペプチド）である活性化酸性 ジペプチドが続いており、この配列は、成熟タンパク質を遊離するべくジペブジ チルペブテターゼにより開裂されなくてはならない。

異なるグランザイムの間には大きな相同性が存在し、このことはそれらが顆粒状 セリンプロテアーゼの一族に属するということを示唆している。

これらは、セリンエステラーゼの触媒三構造を形成する全ての残基Ｈｉｓ”　＋ 　Ａｓｐ’°を及び３ｅ、　ｌ　＊　Ｓを含んでいる。全ての成熟グランザイム は、Ｎ末端配列１１ｅ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（残基１６−１９）で始まり、 次に可変的配列（残基２Ｏ−２３）　、その後に保存された配列（残基２４−３ ０）が続く。これらは多少の差こそあれ解糖されたタンパク質である。

保存された６つの残基Ｃｙｓは、３つの連鎖内ジスルフィド架橋を３つ形成する 。

分子生物学によるアプローチによってＣＴＬにおいて特異的に発現されるグラン ザイムに対しコードする遺伝子を分離することができた。

グランザイムに対しては複数の役割が割り当てられた。特に、パーフォリンの溶 菌活性を増大させ標的細胞のＤＮＡの断片化に有利に作用することによってパー フォリンに対し間接的に作用することが報告されている。

同様に、グランザイムは、ＴｃＲ／抗原（抗原に対するＴｃＲ＝Ｔ細胞レセプタ ）複合体及び細胞付着現象に関与するその他のレセプター／リガンド複合体の開 裂による致死的−撃を送り出した後のその標的からのＣＴＬの離脱のメカニズム にも介入する可能性がある。

最後に、グランザイムは、タンパク質分解により、細胞外マトリックスの構成成 分又は間質環境の構成要素を開裂し、かくして炎症プロセス中の組織内のリンパ 球の移動及び浸透の現象に関与しつる。

その他のタンパク質がＣＴＬ及びｒＮＫＪ細胞の顆粒内で特徴づけされた。すな わち、プロテオグリカンである。これらの分子は特に、パーフォリン及びグラン ザイムの「パッケージング」における役割を果たすことになる。これらは同様に 、分泌性顆粒の内部面の一種の保護障壁を構成し、かくして細胞障害性細胞をそ れ自身の溶菌分子の効果から保護することもできる。

パーフォリンとグランザイムは、１−ザンプロット及びドットブ大いに研究され てきた。

マウス及びヒトにおける病理学的状況でインビトロ及びインビボで実施された研 究はこれらの遺伝子が、早熟な形で、ＮＫ／ＬＡＮ活性を呈する細胞からＴリン パ球の細胞活性化の間に誘導可能であることを示している。ヒトにおいては、グ ランザイム及びパーフォリンの遺伝子発現は、血液学的障害、自己免疫疾患、皮 ふ疾患及び寄生虫、細菌又はウィルス性の感染症といったさまざまな病理学的状 況において観察することができた。最後に、グランザイム及びバーフォリグラン ザイムＢの遺伝子の発現は、腎臓の同種移植片の浸潤性細胞のレベルで見られた 。グランザイムＢ及び／又はパーフォリンの遺伝子発現は、拒絶を示す患者にお いて行なわれた心内膜心筋生検のリンパ球浸潤巣内の細胞好ましくはＣＤ”の中 で検出することができた。遺伝子又は表現型が同じであるＨＬＡ同種骨髄移植後 の、ＧＶＨ（移植片対宿主反応）を患う患者の皮ふの生検レベルで、同様の研究 が行なわれた。

実施された研究により、器官（心臓、腎臓）の移植中の拒絶又は骨髄移植後のＧ ＶＨの疑いがある場合に、免疫組織化学により表現型で特徴づけできしかもそれ でもグランザイム及びパーフォリンのメツセンシャーの発現が備わっていない組 織学によって検出された「無症状の」リンパ球浸潤巣の存在を観察することがで きた。このような結果の解決には疑問が残り、これらの浸潤巣の細胞の免疫化状 態、免疫抑制処置の効果及びこれらの細胞の実際の機能に関して数多くの問いを 投げかけるものである。経時的な患者の追跡監視のみが、これらの細胞湿潤巣の 進展、その成行き、投与された処置に従っての拒絶又はＧＶＨのプロセスの推移 に対するその関係を研究することを可能にして（れるはずである。

従って、インビトロでの細胞障害性及び／又は細胞の活性化の間のグランザイム 及びパーフォリンの遺伝子発現の研究のもつ利点が予測される。

実施された研究の大部分は、ノーザンプロット、ドツトプロット、インサイチュ ハイプリダイゼーシコンによって実現された。情報を提供してくれるものではあ るものの、これらの技術は大がかりなものであり、いかなる場合でもその病気の 推移を知るのに必要な追跡調査と併せて多数の患者を研究することができない。

組織学によって検出されるリンパ球浸潤巣は、実際、同種移植の場合の拒否反応 であれＧＶＨであれ臨床的診断を確認するのに臨床医が頼る唯一の手術基準であ りつづけている。

病院におけるこれらの応用全てにおいて、グランザイム及びパーフォリンのメツ センジャを検出する代りに、抗体を用いてタンパク質を検出する方がより容易で あるというのは明白である。

グランザイム及びパーフォリンの生物学的役割を理解することが関与する根本的 な様相には、同様に抗体を用いての微細でかつ効率の良い分析も必要とされる。

この分野における自らの技術的先進性及びグランザイム及びパーフォリンの分離 及び精製技術を充分に習得していることを利用して、当該発明式は、ヒトについ て、研究すべき生物学的試料内の細胞質顆粒の構成成分の存在を診断できるよう にする新しい手段を開発した。

今日まで提起されてきた問題を解決するための免疫学的アプローチを利用するこ とにより、発明式は、前述のタンパク質に対する高い特異性をもつ抗体を製造し た。

従って本発明の目的は、ヒトについて、上述の顆粒の構成成分の同様に、本発明 は、臨床及び基礎研究でのこれらの産物の検出を単純化できる診断方法をも目的 としている。

「ヘルパーＪＴ細胞又は細胞障害性細胞、より特定的には細胞障害性Ｔリンパ球 及び「ナチュラル・キラー」細胞の細胞質顆粒の構成成分に対して誘導される本 発明の抗体は、それがヒトの顆粒の一定の与えられた構成成分のエピトープ特に ヒト・グランザイム又はヒトパーフォリンエピトープを特異的に認識することが でき、抗原／抗体タイプの反応を発生させるモノクローナル抗体であることを特 徴とする。

記述内及びクレーム内で使用されるような「顆粒の構成成分」という表現は、構 成成分の未変性形態と同様に、人間においてグランザイム又はパーフォリンのア ミノ酸配列又はこれらのタンパク質に対しコードするヒト遺伝子のヌクレオチド 配列から演鐸されるアミノ酸配列を基礎にして遺伝子工学の古典的技術により得 られるような活性組換え型形態をも網羅している。かくして、言及されているグ ランザイム又はパーフォリンは、未変性形態をしているか、或いは又少なくとも これらのグランザイム又はパーフォリンの活性部分を含む組換え型形態をしてい る。

記述及びクレームにおいて使用されているような「１つのエピトープを特異的に 認識できる」という表現は、このモノクローナル抗体が、例に記されているＥＬ ＩＳＡ　、ウェスタンプロット又は免疫沈降法といった免疫学的技術を用いるこ とによって問題のエピトープと反応するということを意味している。

抗グランザイムモノクローナル抗体は、特にヒトの抗グランザイムＡ抗体又は抗 グランザイムＢ或いは又抗グランザイムＨである。

本発明のモノクローナル抗体は、さらに、それがＩｇＧのクラスに属すること、 又約２５〜３０ＫＤａ（グランザイムＢ）　、　６０ＫＤａ（グランザイムＡ） 又は約６６〜７５ＫＤａ（パーフォリン）の分子量のタンパク質に対して誘導さ れていることを特徴とする。

本発明は同様に、前記顆粒の一定の与えられた構成成分特にグランザイム又はパ ーフォリンと特異的に相互作用できるかぎりにおいて上述のモノクローナル抗体 の全てのフラグメントをも目的としている。

本発明のモノクローナル抗体は同様に、ヒト細胞障害性細胞の顆粒の一定の与え られた構成成分に対して誘導された抗体の産生細胞と非分泌性骨髄腫の不滅の細 胞の融合の結果としてもたらされるハイプリドーマ株から、分泌によって得られ るようなものであることをも特徴とする。

２つの細胞タイプの融合段階は特に、最も一般的に使用されている技術つまりＫ ｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、等２５６巻、　Ｐ４９５． 　１９７５の技術に従って実現される。

抗体産生細胞は、牌細胞である。これらの細胞は、適当な抗原を用いて動物のイ ンビボ免疫化の後に回収される。

免疫化段階のためには、精製された顆粒の構成成分を利用し、これをアジュバン トと共に注射する。特に満足のいく結果は、Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、、１４１． ３４７１−７７、１９８８内のＫｒａｈｅｎｂｕｈｌ他の技術に従って細胞質顆 粒の構成成分を精製することによって得られる。

顆粒の構成成分は、未変性形態をしているか又は変形態様においては組換え型形 態をしている。特に、組換え型ヒトグランザイムＢ又は組換え型ヒトバーフォリ ンが利用される。

記述及びクレームの中で、「抗グランザイムモノクローナル抗体」という表現は 、抗体がグランザイムの未変性分子によって誘導されるものであることを意味し 、「組換え型抗グランザイムモノクローナル抗体」という表現は、グランザイム の組換え型分子によって誘導されるようなものであることを意味する。パーフォ リンといった顆粒の他の構成成分についても同じことが言える。

不滅の細胞というのは、非分泌性骨髄腫細胞であり、このため産生細胞の特異性 の免疫グロブリンしか分泌しないハイブリドーマを得ることが可能である。

従来の技術に従うと、得られたハイブリドーマは、培養に付され、限界希釈方法 に従ってクローニングされる。育利なことに、培養上清のＥＬＩＳＡでの抗体力 価が最も高いハイブリドーマを選択する。抗体産生を増大させるためには、これ を動物つまり便宜上マウス、ラット又はウサギに対して注射し、かくして大量に 腹水を生産する。

変形実施態様では、ハイプリドーマ株を、ＣＯｘ入りインキュベータ内で培養状 態に保つ。

回収されたモノクローナル抗体は、そのままの状態で利用することもできるし、 或いは又例えばアフィニティ力ラムにより精製し、凍結保存するか又は場合によ っては凍結乾燥させる。

本発明は、特に組換え型ヒト抗グランザイムＢモノクローナル抗体及び組換え型 ヒト抗バーフすリンモノクローナル抗体を目的とする。

このタイプの抗体は、１９９２年３月１３日付でり、Ｓ、Ｍ　（Ｄｅｕｔｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に寄託された０ 本発明は、さらに特に、１９９１年３月１２日付でｌ−１０６０及びｌ−１０５ ９という番号でＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　ｄｅｓ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｅｓｉｎｅｓ（ＣＮＣＭ）　（国立微生物 培養収蔵所）に寄託されたＧＲＢ５１Ｄ及びＧＲＡ６６Ｄと呼ばれるクローンに よってそれぞれ産生されたヒト抗グランザイムＢ及びヒト抗グランザイムＡモノ クローナル抗体を目的とする。

本発明は同様に、１９９１年３月１２日にｌ−１０５８という番号でＣＮＣＭに 寄託されたマウスの抗パーフォリンモノクローナル抗体についても記述している 。

本発明は同様に、上述のモノクローナル抗体産生ハイブリッド細胞、さらに特定 的に言うとＥＬＩＳＡ試験により測定された抗体の高い力価を生み出すクローン をも目的とする。

本発明のハイプリドーマ株は、Ｔ［ヘルパー」細胞又は細胞障害性細胞の細胞質 顆粒の一定の与えられた構成成分に対して誘導された抗体特にグランザイム又は パーフォリンに対して誘導された抗体を産生ずる細胞と不滅細胞を融合させた結 果得られるハイブリッド細胞で形成されることを特徴としている。

これらのハイブリドーマの獲得方法も同様に本発明の枠内に入る。

この方法には、モノクローナル抗体に関連して上に規定されている融合及び選択 の段階を含んでいる。

上述のとおり、本発明のモノクローナル抗体の誘導対象であるタンパク質は、未 変性タンパク質であるか又は組換え型タンパク質である。これらの組換え型タン パク質は新しい産物であり、そのため本発明の枠内に入る。

さらに特定的にいうと、ここで問題になっているのは、成熟タンパク質の活性Ｃ 末端部分を少なくとも封じ込めるアミノ酸配列である。

特に、ヒト組換え型グランジムＢ及びヒト組換え型パーフォリンを挙げることが できる。

遺伝子工学の従来の技術に従って作業を行なうことにより、これらのタンパク質 は請求めるアミノ酸配列に対してコードする遺伝子フラグメントを封じ込める、 発現ベクター特にプラスミドの導入によって形質転換された細胞宿主特に細菌の 中で産生される。

これらのフラグメントは、成熟タンパク質に対してコードするＤＮＡクローンか ら切除され、選ばれたベクターの適切な部位内に連結によって導入される。

発現されたタンパク質は、細菌の溶菌後培養地から回収され、精製される。

これらの技術の利用により、新しい産物を構成する手段が作製されることになる 。かくして、形質転換された細胞宿主、プラスミドといった発現ベクター及び上 述のようなりＮＡフラグメントは、本発明の枠内に入る。本発明はより特定的に 言うと、パーフォリン及びグランザイムの組換え型タンパク質及びそれらの発現 のために利用される用具を目的としている。

従って、本発明は、ヒトパーフォリンのＣ末端活性部分を含むパーフォリン配列 の１つのフラグメント、さらに特定的にはｐＡＲ３０３９によるＤＮＡフラグメ ントＢａｌｌ−ＢａｍＨＩで発現されるようなフラグメントを目的とする。同様 に本発明は、ｐＡＲ３０３８によるＤＮＡフラグメンのフラグメントをも目的と する。

本発明は同様に、マウスの成熟パーフォリンのＣ末端活性部分を含むパーフォリ ンの配列の１つのフラグメント、より特定的には、１４００ｐｂのＤＮＡフラグ メントＳｍａｌ−ＥｃｏＲＶにより発現されるようなフラグメントについても記 述している。本発明は特に、図１で位置９８〜５３４まで拡がっているアミノ酸 配列を目的とする。本発明は同様に、このアミノ酸配列に対してコードすること のできるＤＮＡフラグメント、このようなりＮＡフラグメントを封じ込めるベク ター特にプラスミドベクター並びにこのようなベクターの取り込みによって形質 転換された細菌特に１１０５７という番号で１９９１年３月１２日にＣ，Ｎ、　 Ｃ，Ｍに寄託された形質転換された細菌をも目的とする。

上述のように、グランザイム及びパーフォリンの遺伝子は、正常な状況又は病的 状況の下で細胞の活性化の間にインビトロ又はエエビボで誘導されつる。グラン ザイムは、細胞活性化の早期標識として現われる；パーツすリンは、好ましくは １つの細胞の細胞障害活性の標識であると思われる。従って、これらのタンパク 質は、人間における細胞活性化及び／又は細胞障害性活性化の機能的標識である ように思われる。

本発明のモノクローナル抗体は特異性の高いものであることから、ヒトの体液又 は生物学的試料におけるこのような標識の存在を明らかにするために特に貴重な ものとなっている。

従って本発明は同様に、「ヘルパーＪＴ細胞又は細胞障害性細胞の細胞質顆粒の 構成成分、より特定的にはグランザイム又はパーフォリン或いは又例えばプロテ オグリカン又はリンホトキシンタイプの分子の存在を生物学的試料又は体液の中 でインビトロ診断するための生物活性物質としてのこれらのモノクローナル抗体 の利用をもその目的としている。

この利用分野においては、モノクローナル抗体は遊離している。

変形態様においては、これらの抗体は、非免疫原性の固体支持体上に固定される 。

上述の細胞質顆粒のグランザイム又はパーフォリン又はその他の構成成分の存在 のインビトロ診断のための本発明に基づく方法は、−試料中に存在する場合前記 構成成分特にそれぞれグランザイム又はパーフォリンと抗原−抗体複合体を産生 ずるのに適した条件の下で、固体支持体上に不動化された上述のようなフラグメ ント又はモノクローナル抗体の調製物と、テストすべき試料を接触させ、次に抗 原−抗体タイプのこのような複合体の形成を立証する、という段階が含まれてい ることを特徴とする。

免疫学的反応を明らかにするため、前記構成成分、より特定的に言うと、グラン ザイム又はパーフォリンは標識基を含んでいる。これは、最も一般的には放射性 基である。変形態様としては、アルカリ性ホスファターゼ又は螢光基といったよ うな酵素などの活性が測定できる基に結合された第２の抗体が利用される。

この検出方法は、高い感度でかつ急速に、生物学的試料内の前記構成成分特にグ ランザイム又はパーフォリンの存在を明らかにし、特にそれらの位置を決定し例 えば病理学的組織又は末梢血の細胞の生検レベルでそれらを数量化することを可 能にする。

かくして、この方法は、器官（腎臓、心臓／肺、肝臓、膵臓）の移植の場合の拒 絶反応を診断するためそして骨髄移植の場合におけるＧＶＨ（皮ふ、肝臓、腸） の早期診断を行なうために特に適している。

これらの免疫組織学的応用以外に、本発明のモノクローナル抗体及びそのフラグ メント（遊離したもの又は不動化されたもの）は、病気の進展がグランザイム又 はパーフォリンの比率を変えるような病理における診断を実現するために利用さ れる。

これらは、例えば患者における移植片の将来特に場合によって変調されつる免疫 抑制処理の影響を追跡調査することを可能にするだろう。この監視は、移植部位 で採取された生検レベルで存在する「リンパ球浸潤巣」の動力学的調査によって 行なうことができる。

これらは又、自己免疫疾患、皮ふ疾患、感染性疾患（微生物、寄生虫又はウィル ス（ＨＩＶ））の場合にもきわめて有利である。

従って本発明のモノクローナル抗体の提供は、罹患した器官のレベルで又は末梢 血のレベルでの異常に高い数の活性化細胞及び／又は細胞障害性細胞の存在を診 断するために重要である。

これらは又、グランザイムがＴ又はＢ細胞分化の標識であることから、細胞分化 の研究を行なうためにも同様に利用可能である。

自己免疫疾患の場合において、関与するタンパク質分解酵素が自己抗原を構成す るということがわかるだろう。従ってこれらのタンパク質分解酵素は、形成され た自己抗体を認識するために利用可能である。この点において、本発明の組換え 型タンパク質、より特定的にはグランザイムＢ及びグランザイムＨは、自己免疫 血清に存在する自己抗体による認識のための自己抗原としての利用において、特 に有利である。この反応を行なうためには、通常の技術に従って作業を行なうの が有利である。

本発明は同様に、生物学的試料における前記細胞質顆粒の構成成このキットは、 以下のものを含むことを特徴とするニー　マイクロタイトレージョンプレートと いった秤量のための支持体として役立つ適切な固体相； −上述のような遊離した又は不動化されたモノクローナル抗体又はフラグメント の調製物ニ ー　場合によっては標識基を伴う前記構成成分より特定的にはグランザイム又は バーフォリンの調製物、及びこの調製物に標識基が含まれていない場合には１つ の標識基を伴う第２の抗体の調製物、−標識の特異的検出システム、 −免疫学的反応のため及び検出反応のために適切な緩衝液。

モノクローナル抗体は、同様にきわめて有利な治療剤を構成する可能性があり、 又酵素又は薬剤のベクターの役目を果たすことができる。

以下の例では本発明のその他の特徴及び利点が報告されている。

図１から・・・まではそれぞれ、次のものを表わす。

−図１は、例中に調製が報告されている組換え型バーフォリンのアミノ酸配列で ある。

−図２は、ＨＬＰＤＥ３の構築様式である。

−図３は、プラスミド１）ＡＲ３０３Ｂの部分的制限地図である。

−図４は、ヒトグランザイムＢのヌクレオチド配列及び組換え型ヒト抗グランザ イムＢモノクローナル抗体を形成するために利用される対応するアミノ酸配列（ １〜２２７）である。

−図５は、プラスミド９ＡＲ３０３９−ＨｕＰの構築様式である。

−図６は、ヌクレオチドｐＡＲ３０３９ＨｕＰの配列及び組換え型タンパク質の アミノ酸から演澤された配列、ならびにクローン３４から得られた配列を示す。

■−材料 Ｉ−１材料 −上記Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、中にＫｒａｈｅｎｂｕｌ他によって記述された技 術に従ってＦＰＬＣシステ（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）に連結された陽イオン交換器 ＭｏｎｏＳカラム（ＨＲ１５，ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）上でＬＧＬ（大顆粒リンパ 球）の細胞質顆粒のその他のタンパク質からグランザイムＡ及びＢを分離する。

−利用するマウスは、ハブロタイブＨ−２ｄのマウスＢＡＬＢ／Ｃである。

−ハブロタイブＨ−２ｄの非分泌性骨髄１１１Ｎｓ−１は、その増殖能を融合に おいてもたらす。これはＨＰＲＴ突然変異を有することから（Ｋｏｈｌｅｒｅｔ 　ａｌ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６．２９２−２９５．１９７６ 年”）　ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地内で対抗選 択される。

−グランザイム已に対して誘導されたポリクローナル抗体は、Ｋｒａｈｅｎｂｕ ｈｌにより記述された技術に従って得られるようなものである（上記参照）。

−ＲＥＸ細胞系統は、エプスタイン−バーウィルスによって不滅化されたＴ細胞 系統である。

−　モノクローナル抗体ＰＡｂ４１９はＳＶ４０のＴ抗原に対して誘導されてい る（Ｈａｒｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　８６１− ８６９．１９８１年）。

ｒ−２溶液 培地１　：　ＲＰＭ１１６４０　（ＧＩＢＣＯ）、　１００　ｕ／−のペニシリ ン、　１００　ｕ／−のストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、２　ｍＭのグルタ ミン（Ｇ［ＢＣＯ）。

培地２　：　ＲＰＭ１１６４０　（ＧＩＢＣＯ）、　１００　ｕ／−のペニシリ ン、　１００　ｕ／−のストレプトマイシン（ＧｒＢＣＯ）、２　［１１Ｍのグ ルタミン（ＧＩＢＣＯ）。

２５０ｕ／ｒｎｌのインターロイキン２　（Ｒｏｕｓｓｅｌ　Ｕｃｌａｆ、　０ ．７−１０’　ｕのＢＲＭＰ／試料）。

培地３　：　ＲＰＭＩ　（ＧＩＢＣＯ）、　１００　ｕ／−のペニシリン、　１ ００　ｕ／ｒｄのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、２　ｍＭのグルタミン（ ＧＩＢＣＯ）、１　ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ）、　１０％の不 活性化されたウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）、　０．３６％のグルコース（Ａ、Ｐ 、）。

培地４　：　ＤｕｂｅｃｃｏのＭＯＤイーグル培地（ＧＩＢＣＯ）、　１００　 ｕ／−のペニシリン、１００　ｕ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、２ ｍＭのグルタミン（Ｇ４ＢＣＯ）、１　ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣ Ｏ）、　１０％の不活性化されたウシ胎児血清（ＧＴＢＣＯ）、　１０％の不活 性化されたウマ血清（Ｇ［ＢＣＯ）、１０％のＮＣＴＣ１３５（（ｄＢｃｏ）、 ２　ｍＭのＮａＯＨ（Ｐｒｏｌａｂｏ）。

培地５　：　ＤｕｂｅｃｃｏのＭＯＤイングル培地（ＧｒＢＣＯ）、　１００　 ｕ／−のペニシリン、　１００　ｕ／ｒｎｌｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣ Ｏ）、２　ｍＭのグルタミン（ＧＩＢＣＯ）、１　ｍＭのピルビン酸ナトリウム （ＧＩＢＣＯ）、　１０％の不活性化されたウシ胎児血清（Ｇ［ＢＣＯ）、　１ ０％の不活性化されたウマ血清（ＧＩＢＣＯ）、　１０％のＮＣＴＣ１３５（Ｇ ＩＢＣＯ）、２　ｍＭのＮａＯＨ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、２％のヒボキサンチン（ ＧｒＢＣＯ）、２％のチミジン（（ｄＢｃＯ）、２％のアミノプテリン（ＧｒＢ ＣＯ）。

ＲＩＰＡ　：　１０ｍＭのトリスｐＨ８，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａ Ｃ１，１％のＮＰ４０゜１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＯＳ 　。

免疫沈降の洗浄用緩衝液：　１００　ｍＭのトリスｐＨ９，０，５ＭのＬｉＣ１ ゜１％のメルカプトエタノール。

ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｌａｅａｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ２２７．６８０−６８ ５．１９７０）　；　６２．５ｍＭのトリスｐＨ６，８，２％のＳＤＳ　、　１ ５％のグリセロール、５％のβ−メルカプトエタノール、　０．０１％のブロモ フェノールブルー。

■一方法 Ｉ［−１末梢血からのＬＧＬの分離 Ｃｈｏｕａｉｂ他がＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ８ ５．６８７５〜６８７９．１９８８で記述している通りに作業を行なう。

末梢血からリンパ球をフィコール勾配によって分離する（　ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ）。

培地５で２回洗浄した後、ハイエム溶液内で細胞を計数し、３７°Ｃで一時間、 不活性化されたＳＨＮで前処理された培養フラスコ（ＣＯ３ＴＡＲ）内で３Ｘ１ ０”細胞の割合でインキュベートさせる。このとき付着しなかった細胞を収集し 、ＲＰＭＩ　５ＨＮＩＯ％中で洗浄し、パーコールの不連続勾配上で遠心分離に より分別する（Ｐｉ（ＡＲＭＡＣＩＡ）。パーコールの異なる濃度の４つの溶液 を調製する（３１％、３４％、３７％及び４１％）。

２つに１つの溶液がＲＰＭ［培地（赤色）内又は等張塩化ナトリウム溶液（無色 ）内で調製され、かくして界面の優れた祝賀化が可能となる。４１％で４−の溶 液を流し、１５ｒｄ入りの円錐管（ＮＵＮＣＬＯＮ　ＤＥＬＴＡ。

ＰＡＬＩＬ　ＢＬＯＣＫ）内で減少する濃度で各溶液２ｒＩＬｌずつをこの上に そっと置いた後、２−のＲＰＭＩ中に含まれた３Ｘ１０’個のリンパ球を勾配の 表面に置く、管を、大気温でブレーキ無しで１４００回転／回転速さで３０分間 遠心分離させる。３７〜４０％の界面にあるＬＧＬリングをパスツールピペット で回収し、ＲＰＭ　［で３回洗浄し、次にまとめる。細胞を計数し、１ｒｒＬｌ あたり５Ｘ１０’の割合で培地２内で培養する。ＬＧＬはリンパ球の合計個体群 の２〜５％を占める。

ｎ−２末梢血のＬＧＬ又はＮＫ細胞から精製されたグランザイムＡ及びＢを用い た、マウスの免疫化、 アジュバント　Ｖａｃｃｉｃｏｘ”　（１０１単位）２００μｇの中で溶解した 精製タンパク質１０μｇ（グランザイムＡ及びＢ）を、マウスＢＡＬＢ／Ｃに腹 腔内注射する。２１日後、２回目の静脈内注射（生理血清２００μｇ内に溶解さ れた１０ｄｇのタンパク質）により追加免疫を行なう。

ｎ−３細胞融合 ５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ（細胞免疫学における選択された方法）（Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　ｃｏ 、　Ｍｉｓｈｅｌｌ、　Ｓｈｉｉｇｉ、　ｅｄｓ、　１９８０）においてＯｌ及 びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇが記述しているように、作業を行なう。

追加免疫の３日後、マウスを安楽死させ、その膵臓を無菌環境内で採取する。Ｒ ＰＭＩを５ｒｄ含む無菌ペトリ皿の中で５ｒｎｌの注射器ピストンを用いて膵臓 を切り裂く。次に５（７’のＲＰＭ　Ｉで牌細胞溶液を洗浄する。遠心分離の後 、細胞沈渣物を大気温に保つ。

培地２の中で培養状態にある骨髄腫細胞Ｎ５−１を１５００回転／回転子分間遠 心分離し、次にＲＰＭＩ５０ｒｄ！内で洗浄する。１０１ｄｌのＲＰＭＩ内で細 胞沈渣物を再び懸濁させ、２個の牌細胞について１つの骨髄腫細胞の割合で膵臓 細胞の入った管の中へ移す。この混合物をＲＰＭＩで４０ｍｔ’に調整し、次に ２０°Ｃで１５００回転／回転子分間遠心分離する。

混合細胞沈渣物を、１分間管内でピペットをゆっくりと回すことによって、１− のＰＥＧ（ポリエチレングリコール１５００．　ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ）（融合 剤）と共に再懸濁させる。３７°Ｃで予め加熱されたＲＰＭ１１６４０１ｍ７を １分間で、次に同じ培地７−を２分間で付加することによって、ＰＥＧを希釈し 、この製剤の毒性を減衰させる。ブレーキ無しで４分間１００μＡ’分で遠心分 離した後、細胞沈渣物を、３７°Ｃに予備加熱された１０−の培地（４）内で再 度懸濁させる。１ウエルにつき１００μｌ中骨髄腫の細胞ｌＯ″個の割合で、９ ６の平底ウェルの無菌プレート内に細胞を分配する。

融合から２４時間後（１８目）、３７℃に予備加熱された培地５を１００μ！、 各ウェル内に付加する。この培地はハイブリドーマを選択し、融合しなかった骨 髄腫細胞を殺す。

７８目に、１００μ！の培地を吸引し、新しい培地４，１００μｌで置換する。

ｌＯ日１に、陽性ウェルの中味（ＥＬＩＳＡ試験：　ＡＭＥＲ３ＨＡＭキット） を２４ウエルの平底プレート上に移し、その中に１１ｄの培地４を付加する。１ ３日８に、分泌性ハイブリドーマをＳＶＦ／１０％のＤＭＳＯ内で液体窒素での 凍結により保存することができる。

Ｉｔ−４ＥＬＩＳＡ試験（酵素結合免疫吸着検定法）によるヒト抗−グランザイ ムＡ及びＢ抗体を分泌するハイブリドーマの研究、（ホースラディツシュのペル オキシダーゼに結合された全抗体であるマウスの抗−ＩＧキット） ９６の平底ウェルのプレートの準備は、試験の２４時間前に行なわれる。このた め、ｌ　ｔｔ　ｇ／ｒａｉｌ　（ＰＢＳ内）で１００μＡ’の抗原（精製された グランザイムＡ又はＢ）をウェル内に分配する。プレートを２４時間４℃に置（ 。

ウェルあたり２００１１１のＰＢＳ、　０．１％のＴｗｅｅｎ　２０を用いた２ 〜５回の洗浄をハイブリドーマの培養の上清をテストする前に行なう。テストす べきハイブリドーマ培養の上清をｌウェルあたり５０μｍ用いて３７°Ｃで１時 間、プレートをインキュベートする。

ＰＢＳ、　０．１％のＴｗｅｅｎ　２０で３回の洗浄の後、５０１ｔｌの２次抗 体（ペルオキシダーゼに接合され、ＰＢＳ、　０．２％　Ｔｗｅｅｎ　２０内で ５００分の１に希釈されたもの）を各ウェル内に付加する。インキュベーション は、３０分間３７°Ｃで行なわれる。

プレートは、ＰＢＳ、　０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０で新たに３度洗浄される。

基質を含む溶液（ＡＢＴＳ　１８０■／ｌ、　１２．５−中１０μ！のＰＢＳ、 　３％Ｈ，０□）１００μｌを付加することにより発色が行なわれる。

プレートは、基質の付加から１５〜２５分後に４０５　ｎｍでのＤＯを測定する ことによって、読みとられる。

上述のとおり作業を行なうことによりグランザイムＢで免疫化されたマウスに由 来する膵臓細胞と骨髄腫細胞ＮＳＩを融合させた後、ＧＲＢと呼ばれる２８のハ イブリドーマの上清は、ＥＬ４ＳＡ試験（精製タンパク質を用いて行なわれるテ スト）においてグ、ランザイムＢに特異的なものであることが判明した。

グランザイムＡで同じアプローチに従うと、ＥＬＩＳＡ試験（精製タンパク質を 用いて行なわれるテスト）で、グランザイムＡに特異的な抗体を分泌するＧＲＡ と呼ばれる。１５のハイブリドーマを分離することができた。

特異的抗体を分泌するハイブリドーマの百分率はきわめて満足の行くものであり 、実際、精製されたグランザイムＢで免疫化されたマウスの膵臓細胞と骨髄腫細 胞ＮＳＩの間の融合に由来する３００のハイブリドーマのうち、１０％はＥＬＩ ＳＡ試験で特異的抗体を分泌する。

グランザイムＡの場合、第２の融合のハイブリドーマの５％が同一条件下で特異 的である。

ｌｌ−５限界希釈によるハイブリドーマのクローニング上滑がＥＬＩＳＡ試験で 最も強い陽性度を呈するハイブリドーマは、９６の平底ウェルのプレート内でク ローニングされる。複数の希釈がテストされる。クローニングは、１つのウェル あたり１００μｌの培地４の割合で１ウエルにつき１００個、１０個、１個の細 胞で行なわれる。

クローニングの３日後に、培地４を１００μｌ用いて細胞に栄養を与え、その後 ７日毎にこれを行なう。倒立顕微鏡により検査された細胞の増殖が大きいと思わ れる場合、これらのウェルの培養の上清を、グランザイムＡ又はＢ上の精製済み グランザイム及び負の対照としてのリゾチームについて、ＥＩＪＳＡでテストす る。

陽性ハイブリドーマを、２４のウェルのプレート内に移し、次に６つのウェルの プレート上に、そしてその後フラスコ内に移して細胞の対数増殖を維持する。こ れらのハイブリドーマは腹水を生成するためマウスの腹膜内に注射される。これ らを、ウェスタンプロ・ソト又は免疫沈降法で研究される非常に濃縮された上滑 を得るべく、細胞の死に至るまで培養状態に放置することが可能である。

それぞれＧＲＢ９８Ｃ及びＧＲＢ５１Ｄと呼ばれるグランザイムＢを認識する抗 体を分泌する２つのハイブリドーマ及び、ＧＲＡ６６Ｄ、　ＧＲＡ３８２Ｅ及び ＧＲＡＩＯＤを認識する抗体を分泌するその他３つの株を回収する。残りのハイ ブリドーマは、ヒトグランザイムＡ及びＢに対して誘導された抗体パネルを構成 するべくクローニングされることになる。

Ｉｔ−６クローニングされた抗体のアイソタイプの特徴づけ試験すべきハイブリ ドーマの培養の上溝は２０ｍＭのトリスｐＨ７，６゜１３７　ｍＭ　Ｎａｃｌ（ ＴＢＳ）で１０分の１に希釈される。キットのテープを、希釈した上清と共に大 気温で１５分間インキュベートする。ＴＢＳ、　０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０　（ ＴＢＳ−Ｔ）での３回の洗浄の後、テープをペロキシダーゼに結合された抗マウ ス抗体（ＴＢＳ−Ｔ内で５００分の１に希釈されたもの）溶液内でインキュベー トする。

基質を含む溶液（過酸化水素を１滴含むＴＢＳ　５０ｒｄに即時に混合された、 １０−の低温メントール中に溶解されたクロロナフトール１錠）３−の中に大気 温で１５分間テープをインキュベートすることによって、発色を行なう。精製水 で３回洗浄した後、テープを乾燥し、これを解釈することができる。

本研究において用いられた免疫化技術は、アイソタイプ抗体［ｇＧを分泌するハ イブリドーマの獲得を可能にした。抗体のアイソタイプは、マウスのモノクロー ナル抗体のＡｍｅｒｓｈａａ＋社が商品化したキットによって確認された。モノ クローナル抗体ＧＲＢ９８Ｃ，ＧＲＡ６６Ｄ。

ＧＲＡ３８２Ｂ及びＧＲＡＩＯＤはアイソタイプＩｇＧ１を示す。ハイブリドー マＧＲＢ５１Ｄによって分泌された抗体はアイソタイプＩｇＧ２ａを示す。ＥＬ ＩＳＡ試験によってクローニングされたハイブリドーマの培養上清の滴定により 、１０００というハイブリドーマＧＲＢ９８Ｃの培養上清の力価を測定すること ができた。ハイブリドーマＧＲＢ５１Ｄ、　ＧＲＡ６６Ｄ及びＧＲＡＩＯＤの培 養上清の力価は、１００００である。ハイブリドーマＧＲＡ３８２Ｈの培養上清 の力価は１０００００である。これらの力価の値が高いことに留意されたい。

Ｉｔ−７タンパク質の電気転移及び免疫発色の技術（ウェスタンプロット）によ るこれらの抗体の特異性の決定。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７６、４３５０−４３５４． １９７９にＴｏｗｋｉｎ他によって記述されているとおりに作業を行なう。

タンパク質（精製抗原：グランザイムＡ又はＢ又は負の対照）は、１０分間１０ ０°ＣでＬａｅｍｍｌ　ｉの緩衝液中でインキュベートされ（幅１２ｏｎのｌμ ｇ／ゲル）、変性ポリアクリルアミドゲル上を移動し、次に１、５〜２時間、フ ィルター１ｃｄあたり１ｍＡの電流下で３９ｍＭのグリシン、４８ｍＭｃ７）　 ）リスｐＨ８，３，０，０３７％ノＳＤＳ、　２０　％（７）メタノールの緩衝 液中で、黒鉛製電極付き装置（ＣＥＲＡ　ＬＡＢＯ）内でニトロセルロースフィ ルター（ＢＡ８３．　ＣＥＲＡ、　ＬＡＢＯ）上で電気転移させられる。転移後 、ニトロセルロースフィルターをボンソー・レッド０．２％と三塩化酢酸０．３ ％で染色して、転移の有効性を確認し、次に輻０．６ｃｍのテープ状に切断する 。

テープを、４°Ｃで１時間０．２％のＴｗｅｅｎ　２０と５％の脱脂乳を含むＰ ＢＳ緩衝液中で予備インキュベートする。テストすべき異なるタンパク質を示す テープセットを、０．２％のＴｗｅｅｎ　２０と５％の脱脂乳を含むＰＢＳ緩衝 液中で１０分の１に希釈したハイブリドーマ上清と共に一晩４°Ｃでインキュベ ートする。次に実験室の温度で５分間５回平均撹拌下で０．２％のＴｗｅｅｎ　 ２０を含むＰＢＳ緩衝液内でテープを洗浄する。

実験室の温度で２時間アルカリ性ホスファターゼに結合されたマウスの抗免疫グ ロブリン抗体（上記ＰＢＳ緩衝液内で１０００分の１に希釈されたもの）と共に 、テープをインキュベートする。ＰＢＳ中で５分間５回洗浄した後、テープをア ルカリ性ホスファターゼ反応反応緩衝液（１００ｍＭのトリスｐＨ９，５、１０ ０ｍＭのＮａＣ１，５０ｍＭのＭｇＣ１＊　）中で平衡化し大気温で１５分間ホ スファターゼ基質（１０−の反応緩衝液。

４４μｌの塩化テトラゾリウムニトロブルー、３３μｌの（５−ブロモ−４−ク ロロ−３−インドリルホスファターゼ　ｐ−トルイジン）の存在下に置く。Ｈ２ Ｏでテープを洗浄することにより反応を停止させることができる。

還元され変性されたグランザイムＢをニトロセルロースフィルター上で電気転移 させる。ニトロセルローステープをまずはテストすべきさまざまな抗体と共に、 次にアルカリ性ホスファターゼに接合された抗マウス抗体と共にインキュベート する。

これらの条件下で、抗グランザイムＢポリクローナル血清と共にインキュベート されたテープ上には、３１ＫＤの帯が観察される。これに対して、抗グランザイ ムＢ抗体ＧＲＢ５１Ｄ及びＧＲＢ９８Ｃと共にインキュベートされたテープ上に は、この帯は検出されない。対照（ＳＶ４０のＴ抗原に対して誘導された抗体、 抗グランザイムＡ抗体ＧＲＡ６６Ｄ。

ＧＲＡ３８２Ｂ及びＧＲＡＩＯＤと共にインキュベートされたテープ）も同様に 陰性である。従って抗グランザイムＢ抗体は、ウェスタンプロットのこの実験の 条件下でグランザイムＢを認識しない。

ｌｌ−８インビトロ細胞標識付は及び免疫沈降反応１ｒｄ！につき３〜５×ｌＯ Ｓ細胞の割合で、ＬＧＬを培養に付す（培地：メチオニンが枯渇し、３５ｓメチ オニン：２０〜５０μＣｉ／ｒｎＩと１％の不活性ＳＨＮで補足されたＲＰＭｒ ）。ロイシンが枯渇し、２０〜５０μＣｉ／ｍＩの３Ｈロイシンが補足されたＲ ＰＭＩ培地内で、標識付けを行なうことができる。３７°Ｃで４時間のインキュ ベーションの後、ＰＢＳで２回細胞を洗浄する。５００μのＲＩＰＡ−０，０１ ％のＢＳＡ（Ｒ２５１８，ＳＩＧＭＡ）内で細胞沈渣物を再度取り込み、１５秒 間音波処理する（マイクロ音波処理装置、出力４０ワツト、プローブ０．３〜８ ７、ＢＩＯＢＬＯＣＫ）。放射能取り込みの後に、ＴＣＡで沈降した分画が計数 される。細胞抽出物は５Ｘ１０’ｃｐｍでアリコートされる。

−免疫沈降反応（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３１．４７２−４８３．１９７９内のＫ ｒｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ。

に従う）。

６０ｕｌのタンパク質Ａ　Ｓｇｐｈａｒｏｓｅ”　（ＰＨＡＲＭＡＣ［Ａ、　Ｃ Ｌ４Ｂ、５ｅｐｈａｒｏｓｅ’　）を共に細胞抽出物をホイール上で撹拌しなか ら４°Ｃで３０分間インキュベートすることにより、暗騒音を減少させることが できる。次に、試料をフリット（多孔質ポリエチレン）上でろ過する。１０μｌ のマウスの正常な血清と３０μｌのタンパク質Ａ　Ｓｃ！ｐｈａｒｏｓｅ”を溶 出液に付加し、撹拌しなから４°Ｃで１時間放置する。この溶液は、同じフィル ター上でろ過される。最後の暗騒音の減少段階は、ろ液に３０μｌのタンパク質 Ａ　５６ｐｈａｒｏｓｅ”　３０μｌを付加し、撹拌しながら４℃で３０分間イ ンキュベーションすることによって実現される。ろ過の後、溶出液を、テストす べき培養の上溝２００μｌ：タンパク質ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ　’　４０μＩ！ 及びＲｌＰＡ−０，０１％ＢＳＡ　（Ｂ２５１８．　ＳＩＧＭＡ）２０μｌの存 在下で撹拌しながら４°Ｃで４時間インキュベートする。抗原−抗体−タンパク 質Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ’の複合体をろ過し、次に洗浄し、ｌａｅｍｍｌｉの 緩衝液４５μｌで溶出させ１００’Ｃで１０分間煮沸する。

ＳＯＳの存在下でポリアクリルアミドゲル（１２，５％）上に試料を置く。４０ ｍＡ、　２００Ｖでの移動の後、ゲルを定着させ、ＥＮ’ＨＡＮＣＥ　（ＤＵＰ ＯＮＴｄｅ　ＮＥＭＯＵＲ３）で処理し、精製水で洗浄し、８０°Ｃで１時間乾 燥し一８０℃でＨｙ−ｐｅｒｆｉｌｍ−ＭＰ　（ＡＭＥＲＳＲＡＭ）上にＸ線螢 光撮影する。

以下では、ＬＧＬ顆粒内に含まれたグランザイムＢを免疫沈降する抗グランザイ ムＢモノクローナル抗体の能力を確認するために実施された、アクリルアミドゲ ル上の分離が後に続く免疫沈降反応実験の結果が報告されている。この実験では 、３５ｓ−メチオニンで標識付けした細胞抽出物（ＬＧＬ又はＲＥＸ）が利用さ れる。免疫沈降反応は、テストすべきハイブリドーマの培養を用いて行なわれる 。免疫沈降反応を受けたタンパク質を、１２．５％で変性したポリアクリルアミ ドゲル上で分離させる。オートラジオグラフィ期間は７日間である。

抗グランザイムＢ抗体ＧＲＢ５１Ｄ及びＧＲＢ９８Ｃによって免疫沈降された、 ＬＧＬの細胞抽出物の移動に対応する３１ＫＤでの帯が観察される。この３１Ｋ Ｄでの帯は同様に、抗グランザイムＢポリクローナル血清によって免疫沈降され た同じ細胞抽出物についても観察される。これに対して、この帯は、負の対照の 場合検出されない、前述の抗体によって免疫沈降された細胞抽出物ＲＥＸ（グラ ンザイムを発現しない細胞）の移動は、この分子量ではいかなる帯も発色しない 。これらの結果から、抗体ＧＲＢ５１ＤとＧＲＢ９８ＣがグランザイムＢを充分 に認識することがわかる。

抗グランザイムＡ抗体（ＧＲＡ６６Ｄ、　ＧＲＡ３８２Ｅ、　ＧＲＡＩＯＤ）の 特徴づけのために、ロイシン３Ｈで標識づけされた細胞系統ＲＥＸ及びＬＧＬの 抽出物について、免疫沈降反応が行なわれた：実際、グランザイムＡのアミノ酸 配列にはメチオニンが少ないが、逆に２６のロイシンが含まれている。免疫沈降 反応を受けたタンパク質は、１２．５％で変性するポリアクリルアミドゲル上で 分離される。オートラジオグラフィ期間は１力月である。３２ｋｄでの強度の低 い補足的な帯は、抗体ＧＲＡ６６Ｄにより免疫沈降されたＬＧＬの細胞抽出物の 場合にのみ観察され、抗体ＧＲＡ３８２Ｂ及びＧＲＡＩＯＤの場合にも又負の対 照として用いられる抗体の場合にも見られない。

ｌｌ−９腹水の産生 ＢＡＬＢ／Ｃマウスに対し腹腔内で５００μｌのテトラ−メチル−ペンタデカン （ＪＡＮＳＳＥＮ）を注射する。Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１２１． ３７５−３８１゜１９８６内でＨｏｏｇｅｎｒａａｄ及びＷｖａｉｇｈｔによっ て記されているように作業を行なう。１０日後、生理学的血清内で洗浄した１０ ７個のハイブリドーマを腹腔内注射する、マウスを毎日穿刺する。４°Ｃで毎分 １５００回転の速度で７分間腹膜液を遠心分離する。パスツールピペットを用い て回収した腹水を０，２μｍ　（ＮＡＬＧＥＮＥ）でろ過し、次に、脂質を除去 するため１２０００　ｇで３０分間４°Ｃで遠心分離し、−８０°Ｃで保存する 。

■−１０抗体の精製 （Ｉｍｍｕｎｏ　Ｐｕｒｅ　ｒｇＧ精製キット、ＰＩＥＲＣＥ）Ｎａアジド０． ０２％内に貯蔵したタンパク質Ａのカラムを５１ｄの結合緩衝液で洗浄する。結 合緩衝液中で１／２に希釈された２−の腹水をカラム上に置く。１５−の結合緩 衝液での洗浄後、５ｆｄの溶出緩衝液でｒｇＧ（免疫グロブリンＧ）を溶出する 。このカラムを８−の０．１Ｍクエン酸ｐＨ３で再生し、０．０２％のＮａアジ ド内で貯蔵する。

溶出された分画を、１０１ｄのＰＢＳを用いてＥｘｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム 上で脱塩する。これらの脱塩カラムを１５１Ｒ１のＰＢＳで再生し、０．０２％ のＮａアジド内で貯蔵する。■／ｌ単位で表わされた（ｒｇＧ　）　＝２８０　 ｎｍ／１．４でのＤＯという公式に従って、各分画中の免疫グロブリンの濃度を 決定するため２８０止でのＤＯの測定により、ｔｇＧの脱塩された分画を秤量す る。

ＩＦ−１１免疫細胞化学によるＬＧＬレベルでのグランザイムの検出以上で報告 したようにＥＬＩＳＡ試験により選択されたグランザイムＡ及びＢを認識する抗 体で、ＬＧＬをインキュベートした。

２５０回転／分で５分間、スライドガラス１枚につき２Ｘ１０’の細胞を細胞遠 心分離し、４℃で１０分間アセトン中で定着させる。ＰＢＳで２回洗浄した後、 テストすべき抗体（ＰＢＳ、　１％ＢＳＡ内で１７２に希釈されたもの）をスラ イドガラス１枚あたり１０μｌの割合で付加し、１時間３７℃に放置する。ＰＢ Ｓ中で２回スライドガラスを洗浄し、次に、マウスの抗Ｉｇ抗体（ＰＢＳ、　１ ％ＢＳＡ中で５００分の１に希釈されたもの）をスライドガラス１枚につき２０ ０μｌの割合で付加し、３７°Ｃで３０分放置する。ＰＢＳ中での２回の洗浄後 、ｌＯ分間大気温で、基質すなわち０．３％のＨｚＯｚ　１００μｌに即時的に 混合された１０ｍ１の５０−ドリスｐＨ７，６内に溶解された３、３′ジアミノ ベンジジン（ＳＩＧＭＡ）１錠（１０■）を含む溶液２００μｌによって被覆さ れたスライドガラスをインキュベートすることによって、発色を行なう。スライ ドガラスを洗浄し、大気温で１分間Ｈｇｍａｌｕｎ　ｄｅ　Ｍｅｙｅｒ　（ＶＥ ＲＣＫ）によって細胞を染色する。細胞を洗浄し、エタノール浴中で脱水しく７ ０％。

９０％及び１００％）、トルエン内を通し、モンタージュ樹脂−滴（ＢＩＯＬＹ ＯＮ）を用いて膨らます。分析は、光学顕微鏡で行なわれる。

このような条件の下で、細胞室の栗色染色が観察され、これらの抗体の定着を明 らかにする。負の対照として利用された抗体を用いた場合、いかなる染色も得ら れない。［Ｌ−２組換え体（２５０ｕ／ｒｎｌ）の存在下で一晩ＬＧＬを活性化 した場合、細胞個体群の一部分のみが染色される。同じ濃度でＩＬ２が存在する 中で７日間培養した後、全ての細胞個体群は染色される。

Ｉ［−１２免疫組織化学によるＧＶＨを呈する患者の皮ふの生検についてのグラ ンザイムＡ及びＢの検出 ＨＬＡ抗原一致で実施された同種骨髄移植の際に、宿主に対する移植片の反応の 臨床的症候群つまりＧＶＨが頻繁に観察される。ＧＶＨの臨床症状は、皮ふ、腸 及び肝臓の発作によって特徴づけられる。皮ふの生検は、組織学及び免疫組織化 学によりＧＶＨの診断を立証するための最も優れた材料として考えられている。

ＧＶＨと相容性のある患部を示す２名の患者ＣＲＡＰ　：慢性骨髄性白血病（Ｌ ＭＣ）　：　ＲＥＮ　：急性骨髄性白血病（ＬＡＭ）について研究した。

４°Ｃで１０分間アセトン中で定着させたＯＣＴ　（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、　 ＭｒＬＥＳ）で凍結された皮ふの生検を、５μｍで低温切断する。大気温で２０ 分間、ウマ血清（Ｖｅｃｔａｓｔｉｎキッｈ、　ＶＥＣ−ＴＯＲ）で組織切片を 飽和させる。ＰＢＳでの洗浄後、テストすべき抗体２５μｇを、大気温で３０分 分間外上に置く。抗グランザイム抗体ＧＲＡ５１Ｄ及びＧＲＡ６６Ｄで実現され た実験結果を報告する。スライドガラスを３回ＰＢＳで洗浄し、次にまず大気温 で３０分間ビオチニル化されたマウスの抗Ｉｇ抗体５０μ１（Ｖｅｃｔａｓｔｉ ｎキット）で、次に大気温で１時間ビオチニル化されたペルオキシダーゼに混合 されたアビジン（Ｖｅｃｔａｓｔｉｎキット）を用いてインキュベートする。Ｐ ＢＳで２回洗浄した後、基質（０，０３％でＨ，０２１００μｆに即時的に混合 されたトリス５０ｍＭ　ｐＨ７，６１０ｍ１の中に溶解されたジアミノベンジジ ン１錠（１０■））を含む溶液５０μｌにより被覆されたスライドガラスを大気 温で１ｏ分間インキュベートすることにより、検出を行なう。スライドガラスを 洗浄し、大気温で１分間Ｈｇｍａｌｕｎ　ｄｅ　Ｍｅｙｅｒで組織切片を染色す る。切片を洗浄し、エタノール浴（７０％、９０％及び１００％）内で脱水し、 トルエン内を通し、モンタージュ樹脂−滴で膨らませる。分析は、光学顕微鏡で 行なわれる。

ＬＧＬの場合における前述の通りにインビトロにて、皮ふに浸透するリンパ球の 細胞質の染色を観察する。負の対照として用いられた対照抗体では、いかなる染 色も得られない。

さらに、異なる抗グランザイム抗体の定着を表わす染色は、リンパ球（ＣＤ３． 　ＣＤ４．　ＣＤ８）分化膜状標識により免疫組織化学で特徴づけされたリンパ 球浸潤巣のレベルに局在化されている。

■−マウス組換え型パーフォリンの産生マウス組換え型パーフォリンを産生ずる ためには、ファージＴ７の転写及び翻訳シグナルの制御下でタンパク質を発現す る原核生物発現ベクターｐＡＲ３０３９が用いられる（Ｓｔｕｄｉｅｒ　ｅｔ　 ａｌ、、　；　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

１８９、１１３−１３０．１９８６を参照のこと）。

マウスパーフォリンの完全ｃＤＮＡクローンの１４００ｐｂのフラグメントＳｍ ａ　Ｉ−ＥｃｏＲＶを切除する。このセグメントは、残基９８〜５８４をカバー する成熟マウスのパーフォリンのＣ末端部分に対しコードする（単一の図を参照 ）。

セグメントの平滑末端は、リン酸化されたリンカ−（５′−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧ Ｇ−３’　）を用いてベクターｐＡＲ３０３９の部位ＢａｍＨ１内で連結される 。

このプラスミドはｐＡＲ３０３９−ｐｅｒｆと呼ばれる。誘導性プロモータｒＰ ＴＧの制御下でポリメラーゼＴ７の遺伝子をゲノム内に含むＥ、　ｃｏｌｉ（大 腸菌）　ＤＥ３を、このプラスミドで形質転換する。相応する細菌は、１９９１ 年３月１２日にｌ−１０５７という番号でＣ，Ｎ、　Ｃ，Ｍに寄託された。

組換え型パーフォリンの合成は、形質転換された細菌の中でＩＰＴＧによって誘 導される。

氷上で１２時間５０ｍＭのトリス−ＭＣ１，ｐＨ７，５，０，５ｍＭのＥＤＴＡ 及びｌＯμｇ／−のりボザイムを含む溶液２０−で細菌沈渣物（１００ｍｍ’の 培養からの）を溶菌することにより、４５ＫＤａの組換え型パーフォリンを精製 する。

１０％まで１．５−のＮＰ−４０及び１．５１ｄ！のＮａＣ１５Ｍを付加した後 、溶菌された細菌を氷上に２０分維持する。

細菌ＤＮＡを次に音波処理によって分割し、タンパク質封入体を１５分間１２０ ００回転／分で遠心分離する。

５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　ｐ）１７．５．　０．５ａ＋ＭのＥＤＴＡ及び３ ００　ｍＭのＮａＣ１の溶液で３回沈漬物を洗浄し、５ＯＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中 で溶解させる。

４５ＫＤａの組換え型タンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ポリアクリルアミドゲ ル１０％）により大部分の細菌タンパク質から分離し、タンパク質溶出装置ｒｓ ｃｏを用いて電気溶出に付す。

通常細菌培養１００−から１〜２■の組換え型パーフォリンが得られる。

雄ラットＯＦＡを、まずはマウス組換え型パーフォリン（又はｒＭｕｐ）５０℃ ｇで腹腔内注射により、そして次に３力月後第２回の腹腔内注射により免疫化す る。（ハイブリドーマの産生のため）牌細胞を採取する３日前に、アジュバント 無しで尾の静脈内に５０℃ｇのｒＭｕｐを注射する。

２）ハイブリドーマの産生及び選択 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　−二、−ヨー ク、１９８８中にＨａｒ　ｌｏｗ及びＬａｎｅによって記述されているように作 業を行なうことにより、ｒＭｕｐで免疫化されたラットの牌細胞と免疫グロブリ ンを産生じない骨髄牌細胞Ｓｐ２１０−Ａｇ８６の融合を実現する。簡単にいう と、血清を含まない培地ＲＰＭＩを針と注射器を用いてラットの組織内に用心深 く導入することにより、牌細胞を回収する。骨髄腫細胞について行なったように 、この培地を用いて牌細胞を洗浄する。このとき５〇−入りのＰＡＬＣＯＮ管の 中で、１０”個の牌細胞と１０’個の骨髄腫細胞を混合し、１０００回転／分で １０分間、遠心分離に付す。できるかぎり多くの上清を除去する。管の壁を穏や かに叩いて細胞を再度懸濁させ、５０％の高温ポリエチレングリコール５０％（ 重量／体積）０．４−を−滴ずつ付加するＣＰＥＧ、　５ｅｒｖａ、　ｃａｔ　 Ｎ’　３３１２３）と同時に管を３７℃のウォーターバス内に維持する。すべて のＰＥＧを付加した後、管を３７℃で３分間維持し、次に５分間８００回転／分 で遠心分離する。上溝を除去することなく、２分で血清の無い培地ＲＰＭＩ　５ 　ｍ１１３７°Ｃで）を付加し、次に新たに１度で５−を付加する。細胞を５分 間１０００回転／分で遠心分離する。上溝を除去し、完全ＲＰＩＪＩ培地５Ｏ− −ＦＣＳ　５％を付加する。予めＢａ１ｂ／Ｃマウスに由来する腹腔内単球／マ クロファージ（栄養細胞）を付加しておいた（１〜５日前）９６のウェルの１０ のプレートの中に、細胞懸濁液を分配する。１％のＨＡＴ　（Ｇｉｂｃｏ）を補 足した新鮮培地ｃＲＰＭＩ−５％ＦＣＳで培地を交換する前に、２４時間ＣＯ８ で５％に加湿された雰囲気内で３７°Ｃでプレートをインキュベートする。約ｌ Ｏ日間細胞を成長させる。この段階で、ウェルのうち約７０％が、発達したクロ ーンをを有し、その多くが複数のクローンを有している。

融合の約２０日後に、ハイブリドーマを含むウェルの大部分の中の細胞はほぼ最 大の密度に達しており、未変性マウスバーフォリン及びｒＭｕｐに対するＥＬＩ ＳＡ試験を実施するため、各ウェルの１００μｌが採取される。陽性度の高いハ イブリドーマが上述のＭａｒｌＯＷの論文で記されているようにサブクローニン グされ、もう１つの選択作業に付される。

配二とユとＬ狂二叩ｌ桂土牲玄匹毘Ｊ影往る選択 １００μｆのＭｕｐ　ＣＰＢＳＰＢＳ中ｇ（ｒＩｄりで４°Ｃで約１４時間、９ ６ウエ）しのマイクロタイトレージョンプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、　ＭＩＣ ２０００）を被覆する。変形態様としては、ウェルをホウヒゲコウモ１ノのＣＴ Ｌ　Ｂ６．１から誘導された顆粒（ＮａＣ１１，５Ｍ中で可溶化され、超速−Ｇ 分離され水中で１０分の１に希釈されたもの）又はヒトＬＡＫ細胞の顆粒（０， ５Ｍのリン酸塩中で可溶化され、超遠心分離され水中で１１５＋こ希釈されタモ ノ）テ、ウエルヲ被覆する。ＰＢＳ　０．０２％、　Ｔｗｅｅｎ−２０で３回ウ ェルを洗浄した後、大気温で２時間で各ウェル内↓こノ）イブＩＪドーマ上清を １００μ！付加する。上述のとおりにウェルを洗浄し、１時間でアルカリ性ホス ファターゼ（Ｓｉｇｍａ）に接合された抗ラット・ヤギ免疫クロプリン５０μｌ を付加する。洗浄の後、１００μｌのホスファターゼ基質（リン酸ｐ−ニトロフ ェニル、Ｓｉｇｍａ　１０４錠）を付加し、色が現われ始めた時点で直ちにＡ４ Ｏ５ｎｍを測定する。負の対照ウェルは、ハイプリドーマ上゛清でインキュベー トされる代わり（二、ＣＲＰＭＩ−５％ＦＣＳでインキュベートされる。かくし て、１９９１年３月１２日付ｌすでＮＯ，ｌ−１０５８という番号でＣＮＣＭで 寄託された、Ｃ２０，１０と０う略号で呼称される抗パーフォリンモノクローナ ル抗体を回収する。

■−フラックスサイトメトリーでの）く−フオリン及びグランザイムＢの発現の 研究 以下では、Ｓｃｈｍｉｄ　１　ｅｔ　ａｌ、のわずかに修正されｔコア法（ｅｙ ｔｏｍｅｔｒｙ。

１２　：　２７９−２８５．１９９１）に従って得られた結果を報告する。

材料： 全ての溶液は、ＰＢＳ中で調製される。

−３％のバラホルムアルデヒド母液 −０，２μでろ過されたウシ胎児血清（ＳＶＦ）−Ｔｗｅｅｎ２０　２％の母液 −Ａｒ１ｄｅ　ＮａＮ５．２００　ｍＭの母液技術： 定着： ＰＢＳで洗浄した１・１０＠個の細胞を８５０μｌのＰＢＳ　（４℃）内で再度 懸濁状態におかれ、１５０μｌのＰＦＡ　（４℃）を付加し、懸濁液を均質化す る。試料を１時間４℃でインキュベートし、次に２５０ｇで８分間遠心分離する 。

透過性付与： １ｒＩｄ！のＰＢＳｏ、２％　Ｔｗｅｅｎ　（９００ｍｔ’のＰＢＳ　＋１００ 　μＡ’のＴｗｅｅｎ　２％母液）中で、定着した細胞を再度懸濁状態におく。

次に試料を３７°Ｃで１５分間インキュベートさせる。このとき２ｄの洗浄溶液 ｌを付加する（洗浄溶液１＝ＰＢＳ２％のＳＶＦ、最終的に１０ｍＭのＮａＮ１ ）。懸濁液を８分間、２５０回転／分で遠心分離する。

上清は廃棄される；その後細胞試料は顆粒内タンパク質の研究にアクセス可能と なる。

インキュベージジンニ 一次抗体： 特異的定着を低減させるような形で、抗体のための緩衝液５０μｌを細胞沈渣物 に付加する。

再度懸濁状態に置き、次に５０μｌの抗パーフォリン抗体１　／３０００（つま り最終１　／６０００）及び抗−グランザイムＢ抗体０．２５μｇを付置の対照 ：研究すべき細胞懸濁液に対して、ＩｇＧ１タイプのマウスの無関連免疫グロブ リンが利用される。

−透過性付与用対照：抗細胞骨格抗体、抗チューブリンα薬（チュープリンαは 厳密に細胞内のタンパク質である）を、全ての細胞個体群についてテストする。

−細胞の負の対照：培養状態にあるＬＧＬ細胞。

−細胞の負の対照：リンパ球系統ＭＯＬＴ４゜このようにテストされた試料は、 ４°Ｃで３０分インキュベートされ、洗浄溶液（２）内で２度洗浄される（洗浄 溶液（２）　＝ＰＢＳ　０．２％。

Ｔｗｅｅｎ　２０．　２％のＳＶＦ、最終１０−のＮａＮ５）　、　２５０　ｇ で８分間遠心分離だ細胞沈渣に対して５０μｌのＰＢＳ中で６０ｎｇのＣＡＭを 付加する。４℃で３０分間インキュベートし、次に溶液（２）で２回洗浄する。

三次抗体：リンパ球の機能的状態及び表現型に従ったバーフォリン及びグランザ イムＢの発現のサイトフルオロメトリーでの同時研究を実現するような形で、膜 抗原を認識する抗体でのインキュベーションを実施する。

５０μｌのＰＢＳという体積で、次のような抗体を利用する。

−０，１２５μｇ　Ｃ２，，５ｔｔｌ！／ｆスト）の割合で抗ＣＤ３、・　０． ０３Ｍｇ（１５μｌ／テスト）の割合で抗ＣＤ８、・　７．５μｌ／テストの割 合で抗ＣＤ２５゜抗体のための緩衝液５０μｌと抗体５０μｌを細胞に加える。

４°Ｃで３０分間インキュベートさせ、次にＰＢＳ−アジド混合物を用いて２回 洗浄を行なう。

かくして処理された細胞をＰＢＳ／アジド培地内で再度懸濁状態におき、その後 ２時間以内に分析する。細胞がさらに遅く分析される場合には、ＰＢＳ−ＰＦＡ 　１％の培地内にこれを戻す。

この技術は、調帯の血液のリンパ球内におけるグランザイムＢ及びパーフォリン の発現を大人のリンパ球のものと比較し、移植の場合の細胞障害性を評価するた めに利用された。

−移植後の心臓の拒絶反応 −移植後の肺の拒絶反応 といったさまざまな病理学的状態における本発明の抗体の利用に関する研究の結 果を報告している。

これら２つのモデルにより、移植片に浸透する細胞の細胞障害性の活性化を研究 することが可能となる。

このアプローチは、いかなるものであれ移植片のあらゆる拒絶反応モデルに拡大 することができる。利用される材料は、肺の拒絶反応については気管支−肺胞の 洗浄及び凍結生検によって構成されている。

病気そのもの又はこの病気によって生み出された免疫応答における細胞障害性細 胞の役割が関与するその他のモデルも同様に研究された：すなわち、 −皮ふ腫瘍 −非ホジキン悪性リンパ腫におけるＴ細胞応答。

これらのモデル全てにおいて利用された技術は、３層でのＡＰＡＡＰ技術である 。

以下のようなプロトコルに従う： １０−冷凍庫に保たれたスライドガラスを１５分間大気温で解凍する。

２°−テストすべき抗体を各スライドガラス上にペンシルで記載する。

３°−大気温で１０分、アセトン浴中で定着させる。

４°−３〜４分間乾燥する。

５°−ＴＢＳ緩衝液＋１１４７．６　、３０％（７）ＳＶＦ内テ１０分間再度水 分補給する。

６°−最初の層を適用し、３０分間湿潤チャンバ内で大気温でインキュベーショ ンする。

７°−５分間２回ｐＨ７，６のＴＢＳ中で洗い流す。

８°−第２の層（抗マウスＩｇ　ウサギ抗体）でインキュベートする。

９°−ｐＨ７，６のＴＢＳで２〜３回洗い流す。

ｌＯｏ−第３の抗体層（湿潤チャンバ内で３０分間抗Ｐ、　Ａ、　３０マウス抗 体に結合されたＰ、　Ａ、複合体）を適用する。

１１０−ｐＨ７，６のＴ、　Ｂ、　Ｓ、で２回、次にｐＨ８，２のＴ、　Ｂ、　 Ｓ、で洗い流す。

１２°−暗所で２０〜３０分、アルカリ性ホスファターゼを発色させる。

１３°−洗い流す。

１４°一対抗染色 １５°−水性環境でのモンタージュ。

利用される製剤： ＊　Ｔ、　Ｂ、　Ｓ、緩衝液、０．０５Ｍ、　ｐＨ７，６溶液Ａ　ＴＲｌ５　＝ 精製Ｈ，Ｏｔｔ中６０．５５ｇ、　ｐＨ７，６溶液Ｂ＋ＮａＣＩ＝精製Ｈ，０１ １中８７．６６　ｇ＊　Ｔ、Ｂ、Ｓ、緩衝液０．０５Ｍ＝溶液Ａ１００μｌ十溶 液Ｂ　１００μｚ＋ｓｏ。

μｌのＥＤ　ｐＨ７，６゜ ＊発色剤：　１００　ｍｉ’のトリスに対して、１　’　）　ＡＳＴＲリン酸ナ フトール２０■２°）ジメチルホルムアミド２ｒｎ１ ３°）トリスｐＨ８，２、０，ＯＩＭ　１００　ｒｄ４°）１０−のＥＤ　１３ ０μ！に対してレバミゾール２−４ｇ５°）ファーストレッドＴＲｆＪ！　１０ ０■６°）ろ過 本　モノクローナル抗体。

第２層：　Ａｃ２２０％５ＨＮＡｂの１７２０に利用すべきＴＢＳ７．６中で希 釈されたＺ２５９８０％Ｄａｋｏ　１０ｇ　２０％。

第３層：２０％ＳＨＮ中で１１５０に希釈されたＡ、ＰＡＡＰ　Ｄ６５１゜組換 え型ヒトパーフォリンの発現 Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　（１９８６）、　１８９．　Ｐ１１３−１３０内で ５ｔｕｄｉｅｒ他が上述のとおりに記述しているように作業を行なう。

材料 ｐＡＲ３０３８Ｂａ１Ｉ　ＢａｍＨＩ（８ｖ−）　ＡＴＣＥｃｏＲＶへ１）ＡＲ ３０３９Ｂａｔ　Ｉ　Ｂａａ＋　Ｈｌ（１０ｖ−）　ＧＡＴ　ＥｃｏＲＶへＭｅ ｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｍｅ ｔ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＣＡＴ　ＡＴＣＧＣＴ　ＡＧＣＡＴＧ　ＡＣＴ　ＣＧＴ　Ｃ ＣＡ　ＣＡＧ　ＣＡＡ　ＡＴＣＧＣＴ　ＣＧＧ　ＡＴＣ’　Ｃ８７−Ｍ９＋ＣＡ Ａ、　Ｔｒ９．　Ａｍｐ培地Ｍ９培地＋２ｇ／Ｉ！のカザミノ酸ｌＯ■／ｒＲ１ で３．３ｒｄのトリプトファン ５０ｍＭ　）リス−ＣＩ　ＣｐＨ７，５’）ストック：　ＩＭ　ｐｌ（７，５０ 、５ｍ　ＥＤＴＡ　ストック：０．５Ｍ１０■／ｄの調製されたばかりのリゾチ ーム無菌Ｈ２０中のＩＰＴＧ　（２０℃のストック、２０１１１ｇ／ｒｄ＝０． ０８４　Ｍ、　２１０分の１に希釈）５ＭのＮａＣＩ Ｈ，Ｏ中ｌＯ％のＮＰ−４０ ＴＥＮ　：　５０ｍＭのトリス＋０．５　ｍＭのＥＤＴＡ＋３００　ｍＭのＮａ ＣＩＩＰＴＧによる誘導性プロモータの制御下にあるＴ７ポリメラーゼの遺母子 を伴う染色体を含む菌株ＤＢ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）。

（１）細胞の増殖： 例二Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＤＥ３　；　Ｔ７ＨＬＰ　；分析を目的として、体積を５ 分の１に縮減する。

１　、　Ｍ９＋ＣＡＡ、　Ｔｒｐ、　ＡＱ１９．中でＬＢ−Ａａ＋ｐ　（５０℃ ｇ　／ｒｄ）の調製されたばかり（４８時間以内）のプレートから、約１４時間 にわたり開始する（接種体）。１００μｌ入りＥｒ１ｅｎ内に置くため、採取を 行なう（ＬＢ内で細胞を増殖させることも同様に可能である）。

２、　Ｍ９＋Ａｍｐ、　ＣＡＡ、　ｔｒＰ、内で培養を１：１０まで希釈する。

充分に通気しながら３７゛ＣでＤＯ６００＝０．８−０．９　（通常２〜３時間 ）を測定するまで増殖が進行するままにしておく。

３　、　ＩＰＴＧｏ、　４　ＤＩＭでＲＮＡポリメラーゼＴ７の遺伝子を誘導す る。

４．３時間増殖を進行させておく。

５、細胞を回収し、４°Ｃ１３０分間、３５００回転／分で、５〇−入りの管内 で遠心分離が行なわれるまで、氷の上にこれを保存する。

６、沈渣物を必要とあらば一２０°Ｃまで凍結させる。

（２）細菌溶菌及び不溶性タンパク質の分画の調製１．５０μｆの培養に対して 、５０ｍＭのトリス十〇ＣＩ　（ｐＨ７，５）　、　０．５ｍＭのＥＤＴＡを再 度懸濁状態におき、（水中で調製されたばかりの）１５０μＩ！２５■／−のリ ゾチームを付加する。

２．３０分から２時間氷上で溶菌を進行させる。

３．０．７５ｄのＮａＣ１５Ｍを付加し、これにより細胞の溶菌がひき起こされ るはずである。Ｖｏｒｔｅｘを利用し、次に０．７５−の１０％ＮＰ−４０を付 加する。ＶｏｒｔｅＸを再度使用する。混合物は非常に粘度が高く、全ての細胞 の溶菌を得るため１０〜３０分氷上にこれを保存する。

４、ＤＮＡをこわすため音波処理を適用する。（液体培地が得られるまで２×１ ０〜１５秒の脈動）。

５、タンパク質ｐｐｒを回転させる。

６、ＴＥＡ内で２〜３回沈漬物を洗浄し、次に必要とあらば培地を清澄化するた め音波処理を行なう。

７．５００μ！のＳＯＳ緩衝液の中に沈漬物を再度とる。

完全に細胞を抽出するため、約２００μ！のＳＯＳ緩衝液の中にｌｒｄの細胞沈 渣物を再度懸濁状態に置（。

同様に、ＩＰＴＧによる誘導無しの対照、又は誤った方向づけでのインサートを もつプラスミドも調製する。

１８組換え型ヒトグランザイムＢ・ベクターｐＡＲ−３０３８−Ｇｒａ　Ｂの構 築利用されるクローニング技術は全て、「分子クローニング、実験室マニュアル 」ニューヨーク；　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙＰｒｅｓｓ内のＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　−Ｓｃｈｍｉｄｔ　ｅ ｔ　ａｌ、　１９８７　／　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３９、２５０−２５６に従って作業を行なうことにより実施される。

クローンＨＬＰから、ヒトグランザイムＢの完全なｃＤＮＡインサートを分離す る（ＢａｍＨｌでのインサートの活動化）。ｃＤＮＡ全てを、Ｍ１３ｍｐ８のＢ ａｍＨ１部位でサブクローニングする。

Ｋｕｎｋｅｌの技術を用いて（Ｂｉｏ−Ｒａｄキット、Ｋｕｎｋｅｌ　ｅｔ　ａ ｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｕｌｏｇｙ、　１９８７．１５４．３６ ７、３８２）　、インビトロ突然変異誘発によりＡからＴにヌクレオチド１１６ を変化させ、これは、グランザイム３のアミノ酸の部位の変化をひき起こす（ｇ ／ｕからｖａｌへ）。

このヌクレオチドの変化は、領域６〜２２７のアミノ酸に相応するグランザイム ＢのクローンのフラグメントＢａｌｌ−ＢａｍＨ１を分離できるようにする新し い制限部位Ｂａ１ｌと、未翻訳ヌクレオチド領域を生成する（図２及び３を参照 ）。

連結のためには、フラグメントＢａｌｌ−ＢａｍＨＩは、Ｎｄｅｌにより切断さ れ脱ホスホリル化されたベクターＰＡＲ−３０３８内に導入される。ベクターの Ｎｄｅ１部位及びグランザイムＢのＢａ１１部位を適合させるためグランザイム Ｂの最初の６つの残基を含む合成リンカ−Ｎｄｅｌ−Ｂａｌｌを利用する。

この構成により、前にＭｅｔが先行しアミノ酸６がＧｌｕではなくＶａｌである という点で未変性ヒトグランザイムのものと異なる配列をもつ組換え型グランザ イムＢの発現が可能となる。

組換え型グランザイムＢの発現 細菌発現ベクターＰＡＲ３０３８は、組換え型タンパク質を選択的に発現するた め、バクテリオファージＴ７のプロモータを利用する。

ＩＰＴＧにより誘導可能なプロモータの制御下にある内因性染色体ポリメラーゼ Ｔ７の遺伝子を含むＥ、　ｃｏｌｉ菌株の細菌は、プラスミドＡＲ−３０３８Ｂ によって形質転換される。

組換え型タンパク質の合成は、以下のようにプラスミドＰＡＲ−３０３８゜Ｇｒ ａＢでのトランスフェクシヨンを受けた細胞ＤＥ３の中で誘導される：Ｌ　Ｂｒ ｏｔｈ−５０℃ｇ／−アンピシリンが塗布されたばかりのプレートに由来する約 １４時間の接種体を同じ培地内で１／１０に希釈する。

０．８〜０．９という６００　ｎｍでの吸光度に至るまで２〜３時間細胞を成長 させる。

このときＴＡポリメラーゼの遺伝子を０．４　ｍＭのｒＰＴＧを付加することに よって３時間誘導する。

細胞を収集し、不溶性タンパク質分画から組換え型タンパク質を分離する。

簡単に言うと、５ｍＩのトリス）ＩＣＩ　（５０ｍＭ）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ 、　ｐＨ７，５に０．７５■ＺｒＩＬｌのリゾチームを補足したものの中で、細 胞沈渣物（５０μｌの培養）を再度懸濁状態におき、２時間氷上に放置する。

７５０μｌのＮａＣ１５Ｍと７５０μ７のＢＰ−４０を、力強く撹拌しながら１ ０％まで付加する。

氷上で３０分培地を維持し、溶液がその粘度を失ない液体になるまで音波処理に より（１５秒の脈動３回＞　ｌｉＢ’ａＤＮＡ　鎖をこわす。

遠心分離（６０００ｇ、　３０分、４０℃）によりタンパク質沈殿物を回収し、 ５０ｍＭのトリス−ＭＣＩ　、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、３００　ｍＭのＮａＣ１ ，ｐＨ７，５の中で３回洗浄し、緩衝液５ＯＳ−ＰＡＧＥ内に溶解させる。２５ ＫＤａの組換え型タンパク質を５ＯＳ−ＰＡＧＥにより主細菌タンパク質から分 離し、メーカーの取扱い説明に従ってタンパク質溶出装置Ｂｉｏｒａｄを用いて 電気溶出する。

細菌培養４００　ｄから、反復的に組換え型タンパク質的１〜２■を得る。

図４は、ヒトグランザイムＢのヌクレオチド配列及び相応するアミノ酸配列を示 している。

■−組換え型ヒトパーフォリンＢ ベクターｐＢ５／クローン１５内のｃＤＮＡバンク（ラムダＺＡＰ−ＬＡＫ）か ら分離されるようなヒトパーフォリンｃＤＮＡを利用する。ヒトパーフォリンの ｃＤＮＡインサートを封じ込めるプラスミドは、ｐＡＲ３０３９ＨｕＰと呼ばれ る。このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する。構成様式は図５に示さ れている。ｃＤＮＡ　Ｓｍａ／ＥｃｏＲＩインサートは１６００の塩基対を含む ：このフラグメントは位置Ａ　ｒ　ｇ　＊　ｌからＴｒｐｓ３４までのアミノ酸 配列に対してコードする。

ＲＮＡでの転写はＩＰＴＧによって誘導される。構築のためには、アダプタとし てＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによってＢａ１ ＩＩＨＩ〜Ｓｍａ　ｒと共にｐＡＲが適合される。フラグメントＨｕバーフォリ ンＳｍａｌ（ｐＢＳ／クローン１５の）を連結段階に付す。読み取り枠は、配列 決定によって制御される。

図６は、ヌクレオチド９ＡＲ３０３９−ＨｕＰ及び組換え型タンパク質から推論 されるアミノ酸配列を表わしている。同様に、クローン３４の配列も示す。

浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒｅ　１ｍ ｖａｃｔａｕｒ　３０３９　ｆａｃｉｄｅｓ　ａｘｎＬｔｓ４ｓ　１−１５１バ ーフオリン（アミノ酸９９−４５１）ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＭＴ　 ＡＴＣＡＡＴ　ＡＡＣＧＡＣＴＧＧＧｌｕ　入１ａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｎ　 工ｉｓ　Ａｓｎ　ＡＳｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ＞ＣＯＴ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＣＴＧ　 ＧＡＴ　ＧＴＧ　ＡＡＣＣＣＴ　ＡＧＧ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＡＡＣＡＴ Ｇ　ＣＧＣＧＣＣ八ｒへＪ　’Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｓ ｎ　ｐｒｏ　ｘｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＡＳｎ　ＭｅＣｋｒｑ　Ａｌ＝ ■ ＴＣＣＧＴＧ　ＧＣＴ　ＧＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＡＧ　ＧＴＡ　ＧＣＣＭＴ 　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＭＧＳｅｒ　ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓ ｅｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　八ｌａ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　八ｌａ　Ａ ｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ■ ＡＣＣＴＡＴ　ＣＡＧ　ＧＡＣＣＡＧ　ＴＡＣＡＡＣＴＴＴ　ｋＡＴ　ＡＧＣＧ ＡＣＡＣＡ　ＧＴＡ　ＧＡＧ　ＴＧＴ　ＣＧＣＴｈｒ　Ｔｙｒ　にｉｎ　Ａｓｐ 　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　ＡＳｎ　Ｐｈｅ　入ｊｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ 　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ■ ＡＴＧ　ＴＡＣＡＧＴ　ＴＴＴ　ＣＧＣＣＴＧ　ＧＴＡ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＣＣ Ｔ　ＣＣＡ　ＣＴＣＣＡＣＣＴＴ　ＧＡＣＴＴＣＭｅ仁　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈ ｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｈｉ ｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ■ ＡＡＡ　、、、Ｃ；　ＧＣＧ　ＣＴＣＡＣＡ　ＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＣＡＡＣ ＴＴＴ　ＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡ　ＧＡＣ；Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ 　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ 　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ■ Ｆｉ炉「龜　３ Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　 Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ■ 浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒａ　１ｃ ＧＡＣＴｒＴ　ＧＡＧ　Ｍ’ｒ　ＧＴＧ　ＣＴＣＣＴＣＴＣＣＡＣＡ　ＧＧＧ　 ＧＧＡ　ＣＣＣＣＴＣＡＧＧ　ＧＴＧ　Ｃ入ＧＡｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ 　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ 　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ■ ＧＴＣＴＧＧ　ＧＡＴ　ＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＴＧＧ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　Ｇ ＡＣＣＴＴ　ＣＴ”ｒ　ＧＧＴ　ＴＣＴ　ＴＧＴｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ａｌ ａ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ■ ＧＡＣＡＧＧ　ＴＣＴ　ＣＣＣＣＡＣＴＣＴ　ＧＧＴ　ＴＴＣＣＡＴ　ＧＡＧ　 ＧＴＧ　ＡＣＡ　ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＣＴＡ　ＡＡＣＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐ ｒｏ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｎ　Ｔｈｒ　Ｃ ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ■ ＣＡＣＧＧＣＡＧＧ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＴ　ＧＣＣＡＡ Ｇ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＣＣＣＣＡＴ　ＣＴＣＨｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　 Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　 Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ■ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒｅ　３ Ｆｉｇｕｒ＠　４＋ａ 浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒｅ　４ｂ ＣＧＧ　ＣＡＧ　ＡＣＧ　ＧｅＣＣＣＣＣＴＧ　ＧＧＡ　ＡＡＡ　Ｃ入丁　ＴＣ Ａ　ＣＡＣＡＣＡ　ＣＴＡ　ＣＭ　ＧＡＧ　ＧＴＧＧｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ａ ｌａ　Ｆ’ｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　 Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｖａ戟■ ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＣＡ　ＧＴＧ　ＣＡＣＧＡＡ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ｋｋＧ　Ｔ ＧＣＧＡＡ　ＴＣＴ　ＧＡＣＴＴＡ　ＣＧＣＣＡＴＬｙｓ　Ｍｅｅ　Ｔｈｒ　Ｖ ａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　入 ｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ■ Ｔ入τ　ＴＡＣＧＡＣｋＧＴ　ＡＣＣ入’ｒＴ　ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＴＧＣＧＴＧ 　ＧＧＧ　ＧＡＣＣＣＡ　ＧＡＧ　ＡＴＴ　ＡＡＡＴｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｓ ａｒ　Ｔｈｒ　工ｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｕ　工１ｅ　Ｌｙｓ■ ＣＣＡ　ＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＡ　ＧＴＣＴＣＡ　入ＧＣＴｒＴ　ＧＴＡ　Ｃ ＡＣＴＧＧ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　Ａｃｅ入ｒｇ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ 　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓ＠ｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　ＶａＬ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　ＩＩｅ 　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ■ 合成オリゴマー 浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒｅ　５ 手続補正書（方式） 平成５年ＩＯ月１３日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）活性化された「ヘルパー」Ｔ細胞又は細胞障害性細胞、より特定的には細胞 障害性Ｔリンパ球及び「ナチュラルキラー」細胞の細胞質顆粒の構成成分に対し て向けられた抗体において、未変性又は組換え体の形のヒトの顆粒の一定の与え られた構成成分のエピトープ、特に未変性又は組換え体の形でのヒト・グランザ イム（ｇｒａｎｚｙｍｅ）又はパーフォリンのエピトープと特異的に反応して抗 原−抗体タイプの化合物を生成することのできるモノクローナル抗体であること を特徴とする抗体。 ２）抗グランザイムモノクローナル抗体が、ヒト抗−グランザイムＡ．Ｂ又はＨ モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の抗体。 ３）ＩｇＧのクラスに属していること、約２５〜３０ＫＤａ（グランザイムＢ） 、６０ＫＤａ（グランザイムＡ）又は６６〜７５ＫＤａ（パーフォリン）の分子 量のタンパク質に対して誘導されていることを特徴とする、請求の範囲第１項又 は第２項に記載の抗体。 ４）細胞障害性細胞又は「ヘルパー」Ｔ細胞の細胞質顆粒の一定の与えられた構 成成分に対し向けられた抗体特にグランザイム又はパーフォリンに対して向けら れた抗体を産生する細胞と非分泌性骨髄腫細胞の融合、 −前記構成成分に対し特異的な抗体を産生することのできるハイブリッド細胞の 選択、 −これらのハイブリドーマのクローニング、−例えば腹水又は培地などから産生 されるようなモノクローナル抗体の複製、 という段階を含む方法によって誘導された、請求の範囲第１項乃至第３項に記載 の抗体。 ５）融合段階において利用された細胞が、未変性の形の顆粒の構成成分によって 誘導されることを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の抗体。 ６）融合段階において利用された細胞によって産生される抗体が、組換え体の形 をした顆粒構成成分特に組換え型ヒトＢグランザイム又は組換え型ヒトパーフォ リンによって誘導されることを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の抗体。 ７）１９９１年３月１２日にＩ−１０６０及びＩ−１０５９という番号でＣＮＣ Ｍに寄託されたクローンＧＲＢ５１Ｄ及びＧＲＡ６６Ｄにより分泌されるような ヒトＢ抗−グランザイム及びヒトＡ抗−グランザイムモノクローナル抗体、或い は又１９９２年３月１３日付けでＤＳＭに寄託されたクローンによって分泌され るような組換え型ヒトＢ抗グランザイム又は組換え型ヒト抗パーフォリン抗体で あることを特徴とする、モノクローナル抗体。 ８）請求の範囲第１項乃至第７項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を 分泌することができることを特徴とするハイブリドーマ株。 ９）特に、精製されたグランザイム又はパーフォリン又は組換え型グランザイム 及びパーフォリンといった細胞障害性細胞の細胞質顆粒の一定の与えられた構成 成分での免疫化の後特異的抗体を産生する細胞と骨髄腫細胞を融合させた結果得 られるハイブリッド細胞で形成されていることを特徴とする、請求の範囲第８項 に記載のハイブリドーマ株。 １０）１９９１年３月１２日にＩ−１０６０及びＩ−１０５９という番号でＣＮ ＣＭに、又１９９２年３月１３日付でＤＳＭに寄託された抗−グランザイムモノ クローナル抗体の産生クローン。 １１）１９９２年３月１３日付でＤＳＭに寄託されたヒト組換え型抗パーフォリ ンモノクローナル抗体の産生クローン。 １２）請求の範囲第４項に記載の融合及び選択段階を含むことを特徴とする、請 求の範囲第８項乃至第１１項のいずれか１項に記載のハイブリドーマの調製方法 。 １３）骨髄腫細胞が骨髄（ｍｙｅｌｏｎ）細胞ＮＳ１であり、モノクローナル抗 体産生細胞が脾細胞であることを特徴とする、請求の範囲第１２項に記載の方法 。 １４）生物学的試料の中の特にグランザイム又はパーフォリンといった細胞障害 性細胞又は「ヘルパー」Ｔ細胞の細胞質顆粒の構成成分の存在のインビトロ検出 方法において、−抗原−抗体複合体の産生に適した条件下で、前記構成成分特に グランザイム又はパーフォリンのエキソサイトーシスを伴う疾病に羅患している 可能性のある患者からの試料を上述のようなモノクローナル抗体又はそのフラグ メントの調製物と接触させ、免疫学的結合を検出する段階 を含むことを特徴とする方法。 １５）生物学的試料中の「ヘルパー」Ｔ細胞又は細胞障害性細胞の細胞質顆粒の 構成成分特にグランザイム又はパーフォリンの存在をインビトロで検出するため のキットにおいて、−マイクロタイタープレートといった秤量のための支持体と して用いられる適当な固体相、 −上述のような遊離した又は不動化された特異的モノクローナル抗体又はフラグ メントの調製物、 −場合によっては標識基を伴う前記構成成分より特定的にはグランザイム又はパ ーフォリンの調製物、及びこの調製物に標識基が含まれていない場合にはこのよ うな基を伴う第２の抗体の調製物、−標識の特異的検出システム、 −免疫学的反応のため及び検出反応のために適切な緩衝液を含むことを特徴とす るキット。 １６）細胞障害性細胞により分泌された細胞質顆粒の構成成分の存在の検出に対 する、請求の範囲第１項乃至第７項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体 の応用。 １７）「ヘルパー」丁細胞又は細胞障害性細胞の細胞質顆粒のタンパク質におい て、求めるアミノ酸配列に対しコードする遺伝子フラグメントを封じ込めている 特にプラスミドといった発現ベクターの導入によって形質転換される特に細菌と いった細菌宿主の中で遺伝子工学により得られるような組換え型タンパク質であ ることを特徴とするタンパク質。 １８）請求の範囲第１７項に記載のタンパク質に対しコードする配列によって構 成されていること又は、このような配列を含むこと、及び場合によってはプラス ミドといった発現ベクタの中に取り込まれていることを特徴とする、ＤＮＡフラ グメント。 １９）特に請求の範囲第１８項に記載のＤＮＡフラグメントを封じ込めているプ ラスミドといった発現ベクター、及びこれらのベクタによって形質転換された細 胞宿主。