JPH06506112A - 細胞質顆粒構成成分のインビトロ診断のための手段及びその生物学的応用 - Google Patents

細胞質顆粒構成成分のインビトロ診断のための手段及びその生物学的応用

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JPH06506112A JP4508582A JP50858292A JPH06506112A JP H06506112 A JPH06506112 A JP H06506112A JP 4508582 A JP4508582 A JP 4508582A JP 50858292 A JP50858292 A JP 50858292A JP H06506112 A JPH06506112 A JP H06506112A
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サスポルテ,マリリーヌ
チョップ,ヨルク
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アンスティテュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 −前記構成成分に対し特異的な抗体を産生ずることのできるハイブリッド細胞の 選択、 −これらのハイブリドーマのクローニング、−例えば腹水又は培地などから産生 されるようなモノクローナル抗体の精製、 という段階を含む方法によって誘導された、請求の範囲第1項乃至第3項に記載 の抗体。
5)融合段階において利用された細胞が、未変性の形の顆粒の構成成分によって 誘導されることを特徴とする請求の範囲第4項に記載の抗体。
6)融合段階において利用された細胞によって産生される抗体が、組換え体の形 をした顆粒構成成分特に組換え型ヒトBグランザイム又は組換え型ヒトパーフォ リンによって誘導されることを特徴とする請求の範囲第4項に記載の抗体。
7)1991年3月12日にl−1060及びl−1059という番号でCNC Mに寄託されたクローンGRB51D及びGRA66Dにより分泌されるような ヒトB抗−グランザイム及びヒトA抗−グランザイムモノクローナル抗体、或い は又1992年3月13日付けでDSMに寄託されたクローンによって分泌され るような組換え型ヒトB抗グランザイム又は組換え型ヒト抗パーフォリン抗体で あることを特徴とする、モノクローナル抗体。
8)請求の範囲第1項乃至第7項のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を 分泌することができることを特徴とするハイプリドーマ株。
9)特に、精製されたグランザイム又はパーフォリン又は組換え型グランザイム 及びパーフォリンといった細胞障害性細胞の細胞質顆粒の一定の与えられた構成 成分での免疫化の後特異的抗体を産生ずる細胞と骨髄腫細胞を融合させた結果得 られるハイブリッド細胞で形成されていることを特徴とする請求の範囲第8項に 記載のハイプリドーマ株。
10) 1991年3月12日に[−1060及びl−1059という番号でC NCMに、又1992年3月13日付でDSMに寄託された抗−グランザイムモ ノクローナル抗体の産生クローン。
11) 1992年3月13日付でDSMに寄託されたヒト組換え型抗パーフォ リンモノクローナル抗体の産生クローン。
12)請求の範囲第4項に記載の融合及び選択段階を含むことを特徴とする請求 の範囲第8項乃至第11項のいずれか1項に記載のハイブリドーマの調製方法。
13)骨髄腫細胞が骨髄(mYelon)細胞NSIであり、モノクローナル抗 体産生細胞が牌細胞であることを特徴とする請求の範囲第12項に記載の方法。
14)生物学的試料の中の特にグランザイム又はパーフォリンといった細胞障害 性細胞又は「ヘルパーJT細胞の細胞質顆粒の構成成分の存在のインビトロ検出 方法において、−抗原−抗体複合体の産生に適した条件下で、前記構成成分特に グランザイム又はパー7オリンのエキソサイト−シスを伴う疾病に羅患している 可能性のある患者からの試料を上述のようなモノクローナル抗体又はそのフラグ メントの調製物と接触させ、免疫学的結合を検出する段階 を含むことを特徴とする方法。
15)生物学的試料中の「ヘルパーJT細胞又は細胞障害性細胞の細胞質顆粒の 構成成分特にグランザイム又はパーフォリンの存在をヱンビトロで検出するため のキットにおいて、−マイクロタイタープレートといった秤量のための支持体と して用いられる適当な固体相、 −上述のような遊離した又は不動化された特異的モノクローナル抗体又はフラグ メントの調製物、 −場合によっては標識基を伴う前記構成成分より特定的にはグランザイム又はパ ー7オリンの調製物、及びこの調製物に標識基が含まれていない場合にはこのよ うな基を伴う第2の抗体の調製物、−標識の特異的検出システム、 −免疫学的反応のため及び検出反応のために適切な緩衝液を含むことを特徴とす るキット。
16)細胞障害性細胞により分泌された細胞質顆粒の構成成分の存在の検出に対 する、請求の範囲第1項乃至第7項のいずれが1項に記載のモノクローナル抗体 の応用。
17)「ヘルパーJT細胞又は細胞障害性細胞の細胞質顆粒のタンパク質におい て請求めるアミノ酸配列に対しコードする遺伝子フラグメントを封じ込めている 特にプラスミドといった発現ベクターの導入によって形質転換される特に細菌と いった細菌宿主の中で遺伝子工学により得られるような組換え型タンパク質であ ることを特徴とするタンパク質。
18)請求の範囲第17項に記載のタンパク質に対しコードする配列によって構 成されていること又は、このような配列を含むこと、及び場合によってはプラス ミドといった発現ベクタの中に取り込まれていることを特徴とする、DNAフラ グメント。
19)特許請求の範囲第18項に記載のDNAフラグメントを封じ込めているプ ラスミドといった発現ベクター、及びこれらのベクタによって形質転換された細 胞宿主。
浄書(内容に変更なし) 明細書 細胞質顆粒構成成分のインビトロ診断のための手段及びその生物学的応用 本発明は、生体の免疫応答において役目を果たす「ヘルパーJT細胞及び細胞障 害性細胞の構成成分のインビトロ診断のための手段に関する。
免疫系は、ウィルス性、細菌性又は同種抗原の生体内への導入に対して特異的に 又は非特異的に応答することができる。これらの異なる抗原の中性化又は排除は 、2つのタイプの細胞すなわちBリンパ球及びTリンパ球に起因するものである 。これらの細胞は、2つの形態の免疫応答を確実に行なう。すなわち、B細胞に より媒介される体液性応答と少なくとも2つの細胞個体群つまり細胞障害性Tリ ンパ球(CTLs)と[ナチュラルキラーJ (NK)細胞により媒介される細 胞応答である。
細胞媒介の細胞障害性においては、2つの溶菌プロセスが記述されてきている。
そのうちの1つは、細胞内の第2のメツセンジャーが無い場合に細胞溶解タンパ ク質のエフェクター細胞(CTLs及びNK細胞)による分泌を含んでいる。調 節溶菌と呼ばれる第2のプロセスには、細胞質顆粒内に大量に溶菌タンパク質又 は溶菌に関連するタンパク質を貯蔵すること、そしてエフェクター細胞の表面レ セプターの活性化及び第2の細胞内メツセンジャの産生の後にはじめてそれらを 分泌することが含まれる。
これらの顆粒内では、異なるタンパク質が識別されており、特に挙げられるのは 、パーフォリンつまり気孔を形成するタンパク質、グランザイム(granzy me)と呼ぶタンパク質分解酵素の1群、そしてパーフォリン又はグランザイム を細胞膜の方へ輸送することを担当する高分子量のタンパク質であるプロテオグ リカンである。
エフェクターとその標的の相互作用及びその活性化の間にエフェクタ/標的の接 触によって形成された細胞内空間内に自らの中味を分泌し標的細胞の溶菌を誘発 する顆粒状の細胞質内液胞のエキソサイト−シス(開口分泌)が発生する。
パーフォリンは、ラット又は人間の体内で細胞障害性細胞系統から単離された。
実施された研究により、Caトの存在下でパーフォリンの分子が重合し、標的細 胞の原形質膜レベルに挿入され、標的細胞の破壊をひき起こす気孔を形成するこ とが観察できた。
マウス及びヒトのcDNAクローンが分離された。最近になって、マウスとヒト の体内でのパーフォリンのケノミック配列が報告されている。
一方グランザイム(granzyme)については、多くの研究チームが、CT L又はNK/LAK (リンフ才力イン活性化キラー)活性細胞の顆粒からのそ の精製に関して記述している。これは、細胞質問顆粒のタンパク質の大部分(パ ーフォリンが10%であるのに対して85%)を占めている。さまざまなグラン ザイムが分離され、マウスならびにヒトにおいて特徴づけされてきた。より特定 的には、グランザイムA〜Fと名付けられた6つのグランザイムが、マウスのC TLの細胞質顆粒において記述されている。グランザイムGと呼ばれる7番目の グランザイムが最近マウスのCTL内で特徴づけされた。ヒトにおいては、グラ ンザイムAとBに対応する2つのグランザイムが分離され、Hと呼ばれる3番目 のグランザイムは、すでに分離されたマウスのいずれのグランザイムとも一致し ない。
グランザイムは、分泌されたタンパク質の特徴であるシグナルペプチドを含むか 又は顆粒自位置づけをもつ前駆分子の形で合成される。このシグナル配列の後に は一般にGly−Glu又はGlu−Glu(プロペプチド)である活性化酸性 ジペプチドが続いており、この配列は、成熟タンパク質を遊離するべくジペブジ チルペブテターゼにより開裂されなくてはならない。
異なるグランザイムの間には大きな相同性が存在し、このことはそれらが顆粒状 セリンプロテアーゼの一族に属するということを示唆している。
これらは、セリンエステラーゼの触媒三構造を形成する全ての残基His” +  Asp’°を及び3e、 l * Sを含んでいる。全ての成熟グランザイム は、N末端配列11e−11e−Gly−Gly(残基16−19)で始まり、 次に可変的配列(残基2O−23) 、その後に保存された配列(残基24−3 0)が続く。これらは多少の差こそあれ解糖されたタンパク質である。
保存された6つの残基Cysは、3つの連鎖内ジスルフィド架橋を3つ形成する 。
分子生物学によるアプローチによってCTLにおいて特異的に発現されるグラン ザイムに対しコードする遺伝子を分離することができた。
グランザイムに対しては複数の役割が割り当てられた。特に、パーフォリンの溶 菌活性を増大させ標的細胞のDNAの断片化に有利に作用することによってパー フォリンに対し間接的に作用することが報告されている。
同様に、グランザイムは、TcR/抗原(抗原に対するTcR=T細胞レセプタ )複合体及び細胞付着現象に関与するその他のレセプター/リガンド複合体の開 裂による致死的−撃を送り出した後のその標的からのCTLの離脱のメカニズム にも介入する可能性がある。
最後に、グランザイムは、タンパク質分解により、細胞外マトリックスの構成成 分又は間質環境の構成要素を開裂し、かくして炎症プロセス中の組織内のリンパ 球の移動及び浸透の現象に関与しつる。
その他のタンパク質がCTL及びrNKJ細胞の顆粒内で特徴づけされた。すな わち、プロテオグリカンである。これらの分子は特に、パーフォリン及びグラン ザイムの「パッケージング」における役割を果たすことになる。これらは同様に 、分泌性顆粒の内部面の一種の保護障壁を構成し、かくして細胞障害性細胞をそ れ自身の溶菌分子の効果から保護することもできる。
パーフォリンとグランザイムは、1−ザンプロット及びドットブ大いに研究され てきた。
マウス及びヒトにおける病理学的状況でインビトロ及びインビボで実施された研 究はこれらの遺伝子が、早熟な形で、NK/LAN活性を呈する細胞からTリン パ球の細胞活性化の間に誘導可能であることを示している。ヒトにおいては、グ ランザイム及びパーフォリンの遺伝子発現は、血液学的障害、自己免疫疾患、皮 ふ疾患及び寄生虫、細菌又はウィルス性の感染症といったさまざまな病理学的状 況において観察することができた。最後に、グランザイム及びバーフォリグラン ザイムBの遺伝子の発現は、腎臓の同種移植片の浸潤性細胞のレベルで見られた 。グランザイムB及び/又はパーフォリンの遺伝子発現は、拒絶を示す患者にお いて行なわれた心内膜心筋生検のリンパ球浸潤巣内の細胞好ましくはCD”の中 で検出することができた。遺伝子又は表現型が同じであるHLA同種骨髄移植後 の、GVH(移植片対宿主反応)を患う患者の皮ふの生検レベルで、同様の研究 が行なわれた。
実施された研究により、器官(心臓、腎臓)の移植中の拒絶又は骨髄移植後のG VHの疑いがある場合に、免疫組織化学により表現型で特徴づけできしかもそれ でもグランザイム及びパーフォリンのメツセンシャーの発現が備わっていない組 織学によって検出された「無症状の」リンパ球浸潤巣の存在を観察することがで きた。このような結果の解決には疑問が残り、これらの浸潤巣の細胞の免疫化状 態、免疫抑制処置の効果及びこれらの細胞の実際の機能に関して数多くの問いを 投げかけるものである。経時的な患者の追跡監視のみが、これらの細胞湿潤巣の 進展、その成行き、投与された処置に従っての拒絶又はGVHのプロセスの推移 に対するその関係を研究することを可能にして(れるはずである。
従って、インビトロでの細胞障害性及び/又は細胞の活性化の間のグランザイム 及びパーフォリンの遺伝子発現の研究のもつ利点が予測される。
実施された研究の大部分は、ノーザンプロット、ドツトプロット、インサイチュ ハイプリダイゼーシコンによって実現された。情報を提供してくれるものではあ るものの、これらの技術は大がかりなものであり、いかなる場合でもその病気の 推移を知るのに必要な追跡調査と併せて多数の患者を研究することができない。
組織学によって検出されるリンパ球浸潤巣は、実際、同種移植の場合の拒否反応 であれGVHであれ臨床的診断を確認するのに臨床医が頼る唯一の手術基準であ りつづけている。
病院におけるこれらの応用全てにおいて、グランザイム及びパーフォリンのメツ センジャを検出する代りに、抗体を用いてタンパク質を検出する方がより容易で あるというのは明白である。
グランザイム及びパーフォリンの生物学的役割を理解することが関与する根本的 な様相には、同様に抗体を用いての微細でかつ効率の良い分析も必要とされる。
この分野における自らの技術的先進性及びグランザイム及びパーフォリンの分離 及び精製技術を充分に習得していることを利用して、当該発明式は、ヒトについ て、研究すべき生物学的試料内の細胞質顆粒の構成成分の存在を診断できるよう にする新しい手段を開発した。
今日まで提起されてきた問題を解決するための免疫学的アプローチを利用するこ とにより、発明式は、前述のタンパク質に対する高い特異性をもつ抗体を製造し た。
従って本発明の目的は、ヒトについて、上述の顆粒の構成成分の同様に、本発明 は、臨床及び基礎研究でのこれらの産物の検出を単純化できる診断方法をも目的 としている。
「ヘルパーJT細胞又は細胞障害性細胞、より特定的には細胞障害性Tリンパ球 及び「ナチュラル・キラー」細胞の細胞質顆粒の構成成分に対して誘導される本 発明の抗体は、それがヒトの顆粒の一定の与えられた構成成分のエピトープ特に ヒト・グランザイム又はヒトパーフォリンエピトープを特異的に認識することが でき、抗原/抗体タイプの反応を発生させるモノクローナル抗体であることを特 徴とする。
記述内及びクレーム内で使用されるような「顆粒の構成成分」という表現は、構 成成分の未変性形態と同様に、人間においてグランザイム又はパーフォリンのア ミノ酸配列又はこれらのタンパク質に対しコードするヒト遺伝子のヌクレオチド 配列から演鐸されるアミノ酸配列を基礎にして遺伝子工学の古典的技術により得 られるような活性組換え型形態をも網羅している。かくして、言及されているグ ランザイム又はパーフォリンは、未変性形態をしているか、或いは又少なくとも これらのグランザイム又はパーフォリンの活性部分を含む組換え型形態をしてい る。
記述及びクレームにおいて使用されているような「1つのエピトープを特異的に 認識できる」という表現は、このモノクローナル抗体が、例に記されているEL ISA 、ウェスタンプロット又は免疫沈降法といった免疫学的技術を用いるこ とによって問題のエピトープと反応するということを意味している。
抗グランザイムモノクローナル抗体は、特にヒトの抗グランザイムA抗体又は抗 グランザイムB或いは又抗グランザイムHである。
本発明のモノクローナル抗体は、さらに、それがIgGのクラスに属すること、 又約25〜30KDa(グランザイムB) 、 60KDa(グランザイムA) 又は約66〜75KDa(パーフォリン)の分子量のタンパク質に対して誘導さ れていることを特徴とする。
本発明は同様に、前記顆粒の一定の与えられた構成成分特にグランザイム又はパ ーフォリンと特異的に相互作用できるかぎりにおいて上述のモノクローナル抗体 の全てのフラグメントをも目的としている。
本発明のモノクローナル抗体は同様に、ヒト細胞障害性細胞の顆粒の一定の与え られた構成成分に対して誘導された抗体の産生細胞と非分泌性骨髄腫の不滅の細 胞の融合の結果としてもたらされるハイプリドーマ株から、分泌によって得られ るようなものであることをも特徴とする。
2つの細胞タイプの融合段階は特に、最も一般的に使用されている技術つまりK ohler及びMilstein、 Nature、等256巻、 P495.  1975の技術に従って実現される。
抗体産生細胞は、牌細胞である。これらの細胞は、適当な抗原を用いて動物のイ ンビボ免疫化の後に回収される。
免疫化段階のためには、精製された顆粒の構成成分を利用し、これをアジュバン トと共に注射する。特に満足のいく結果は、J、 rmmunol、、141. 3471−77、1988内のKrahenbuhl他の技術に従って細胞質顆 粒の構成成分を精製することによって得られる。
顆粒の構成成分は、未変性形態をしているか又は変形態様においては組換え型形 態をしている。特に、組換え型ヒトグランザイムB又は組換え型ヒトバーフォリ ンが利用される。
記述及びクレームの中で、「抗グランザイムモノクローナル抗体」という表現は 、抗体がグランザイムの未変性分子によって誘導されるものであることを意味し 、「組換え型抗グランザイムモノクローナル抗体」という表現は、グランザイム の組換え型分子によって誘導されるようなものであることを意味する。パーフォ リンといった顆粒の他の構成成分についても同じことが言える。
不滅の細胞というのは、非分泌性骨髄腫細胞であり、このため産生細胞の特異性 の免疫グロブリンしか分泌しないハイブリドーマを得ることが可能である。
従来の技術に従うと、得られたハイブリドーマは、培養に付され、限界希釈方法 に従ってクローニングされる。育利なことに、培養上清のELISAでの抗体力 価が最も高いハイブリドーマを選択する。抗体産生を増大させるためには、これ を動物つまり便宜上マウス、ラット又はウサギに対して注射し、かくして大量に 腹水を生産する。
変形実施態様では、ハイプリドーマ株を、COx入りインキュベータ内で培養状 態に保つ。
回収されたモノクローナル抗体は、そのままの状態で利用することもできるし、 或いは又例えばアフィニティ力ラムにより精製し、凍結保存するか又は場合によ っては凍結乾燥させる。
本発明は、特に組換え型ヒト抗グランザイムBモノクローナル抗体及び組換え型 ヒト抗バーフすリンモノクローナル抗体を目的とする。
このタイプの抗体は、1992年3月13日付でり、S、M (Deutche Sammlung von Mikroorganismen)に寄託された0 本発明は、さらに特に、1991年3月12日付でl−1060及びl−105 9という番号でCo11ection Nationale de Cu1tu re des Microorganesines(CNCM) (国立微生物 培養収蔵所)に寄託されたGRB51D及びGRA66Dと呼ばれるクローンに よってそれぞれ産生されたヒト抗グランザイムB及びヒト抗グランザイムAモノ クローナル抗体を目的とする。
本発明は同様に、1991年3月12日にl−1058という番号でCNCMに 寄託されたマウスの抗パーフォリンモノクローナル抗体についても記述している 。
本発明は同様に、上述のモノクローナル抗体産生ハイブリッド細胞、さらに特定 的に言うとELISA試験により測定された抗体の高い力価を生み出すクローン をも目的とする。
本発明のハイプリドーマ株は、T[ヘルパー」細胞又は細胞障害性細胞の細胞質 顆粒の一定の与えられた構成成分に対して誘導された抗体特にグランザイム又は パーフォリンに対して誘導された抗体を産生ずる細胞と不滅細胞を融合させた結 果得られるハイブリッド細胞で形成されることを特徴としている。
これらのハイブリドーマの獲得方法も同様に本発明の枠内に入る。
この方法には、モノクローナル抗体に関連して上に規定されている融合及び選択 の段階を含んでいる。
上述のとおり、本発明のモノクローナル抗体の誘導対象であるタンパク質は、未 変性タンパク質であるか又は組換え型タンパク質である。これらの組換え型タン パク質は新しい産物であり、そのため本発明の枠内に入る。
さらに特定的にいうと、ここで問題になっているのは、成熟タンパク質の活性C 末端部分を少なくとも封じ込めるアミノ酸配列である。
特に、ヒト組換え型グランジムB及びヒト組換え型パーフォリンを挙げることが できる。
遺伝子工学の従来の技術に従って作業を行なうことにより、これらのタンパク質 は請求めるアミノ酸配列に対してコードする遺伝子フラグメントを封じ込める、 発現ベクター特にプラスミドの導入によって形質転換された細胞宿主特に細菌の 中で産生される。
これらのフラグメントは、成熟タンパク質に対してコードするDNAクローンか ら切除され、選ばれたベクターの適切な部位内に連結によって導入される。
発現されたタンパク質は、細菌の溶菌後培養地から回収され、精製される。
これらの技術の利用により、新しい産物を構成する手段が作製されることになる 。かくして、形質転換された細胞宿主、プラスミドといった発現ベクター及び上 述のようなりNAフラグメントは、本発明の枠内に入る。本発明はより特定的に 言うと、パーフォリン及びグランザイムの組換え型タンパク質及びそれらの発現 のために利用される用具を目的としている。
従って、本発明は、ヒトパーフォリンのC末端活性部分を含むパーフォリン配列 の1つのフラグメント、さらに特定的にはpAR3039によるDNAフラグメ ントBall−BamHIで発現されるようなフラグメントを目的とする。同様 に本発明は、pAR3038によるDNAフラグメンのフラグメントをも目的と する。
本発明は同様に、マウスの成熟パーフォリンのC末端活性部分を含むパーフォリ ンの配列の1つのフラグメント、より特定的には、1400pbのDNAフラグ メントSmal−EcoRVにより発現されるようなフラグメントについても記 述している。本発明は特に、図1で位置98〜534まで拡がっているアミノ酸 配列を目的とする。本発明は同様に、このアミノ酸配列に対してコードすること のできるDNAフラグメント、このようなりNAフラグメントを封じ込めるベク ター特にプラスミドベクター並びにこのようなベクターの取り込みによって形質 転換された細菌特に11057という番号で1991年3月12日にC,N、  C,Mに寄託された形質転換された細菌をも目的とする。
上述のように、グランザイム及びパーフォリンの遺伝子は、正常な状況又は病的 状況の下で細胞の活性化の間にインビトロ又はエエビボで誘導されつる。グラン ザイムは、細胞活性化の早期標識として現われる;パーツすリンは、好ましくは 1つの細胞の細胞障害活性の標識であると思われる。従って、これらのタンパク 質は、人間における細胞活性化及び/又は細胞障害性活性化の機能的標識である ように思われる。
本発明のモノクローナル抗体は特異性の高いものであることから、ヒトの体液又 は生物学的試料におけるこのような標識の存在を明らかにするために特に貴重な ものとなっている。
従って本発明は同様に、「ヘルパーJT細胞又は細胞障害性細胞の細胞質顆粒の 構成成分、より特定的にはグランザイム又はパーフォリン或いは又例えばプロテ オグリカン又はリンホトキシンタイプの分子の存在を生物学的試料又は体液の中 でインビトロ診断するための生物活性物質としてのこれらのモノクローナル抗体 の利用をもその目的としている。
この利用分野においては、モノクローナル抗体は遊離している。
変形態様においては、これらの抗体は、非免疫原性の固体支持体上に固定される 。
上述の細胞質顆粒のグランザイム又はパーフォリン又はその他の構成成分の存在 のインビトロ診断のための本発明に基づく方法は、−試料中に存在する場合前記 構成成分特にそれぞれグランザイム又はパーフォリンと抗原−抗体複合体を産生 ずるのに適した条件の下で、固体支持体上に不動化された上述のようなフラグメ ント又はモノクローナル抗体の調製物と、テストすべき試料を接触させ、次に抗 原−抗体タイプのこのような複合体の形成を立証する、という段階が含まれてい ることを特徴とする。
免疫学的反応を明らかにするため、前記構成成分、より特定的に言うと、グラン ザイム又はパーフォリンは標識基を含んでいる。これは、最も一般的には放射性 基である。変形態様としては、アルカリ性ホスファターゼ又は螢光基といったよ うな酵素などの活性が測定できる基に結合された第2の抗体が利用される。
この検出方法は、高い感度でかつ急速に、生物学的試料内の前記構成成分特にグ ランザイム又はパーフォリンの存在を明らかにし、特にそれらの位置を決定し例 えば病理学的組織又は末梢血の細胞の生検レベルでそれらを数量化することを可 能にする。
かくして、この方法は、器官(腎臓、心臓/肺、肝臓、膵臓)の移植の場合の拒 絶反応を診断するためそして骨髄移植の場合におけるGVH(皮ふ、肝臓、腸) の早期診断を行なうために特に適している。
これらの免疫組織学的応用以外に、本発明のモノクローナル抗体及びそのフラグ メント(遊離したもの又は不動化されたもの)は、病気の進展がグランザイム又 はパーフォリンの比率を変えるような病理における診断を実現するために利用さ れる。
これらは、例えば患者における移植片の将来特に場合によって変調されつる免疫 抑制処理の影響を追跡調査することを可能にするだろう。この監視は、移植部位 で採取された生検レベルで存在する「リンパ球浸潤巣」の動力学的調査によって 行なうことができる。
これらは又、自己免疫疾患、皮ふ疾患、感染性疾患(微生物、寄生虫又はウィル ス(HIV))の場合にもきわめて有利である。
従って本発明のモノクローナル抗体の提供は、罹患した器官のレベルで又は末梢 血のレベルでの異常に高い数の活性化細胞及び/又は細胞障害性細胞の存在を診 断するために重要である。
これらは又、グランザイムがT又はB細胞分化の標識であることから、細胞分化 の研究を行なうためにも同様に利用可能である。
自己免疫疾患の場合において、関与するタンパク質分解酵素が自己抗原を構成す るということがわかるだろう。従ってこれらのタンパク質分解酵素は、形成され た自己抗体を認識するために利用可能である。この点において、本発明の組換え 型タンパク質、より特定的にはグランザイムB及びグランザイムHは、自己免疫 血清に存在する自己抗体による認識のための自己抗原としての利用において、特 に有利である。この反応を行なうためには、通常の技術に従って作業を行なうの が有利である。
本発明は同様に、生物学的試料における前記細胞質顆粒の構成成このキットは、 以下のものを含むことを特徴とするニー マイクロタイトレージョンプレートと いった秤量のための支持体として役立つ適切な固体相; −上述のような遊離した又は不動化されたモノクローナル抗体又はフラグメント の調製物ニ ー 場合によっては標識基を伴う前記構成成分より特定的にはグランザイム又は バーフォリンの調製物、及びこの調製物に標識基が含まれていない場合には1つ の標識基を伴う第2の抗体の調製物、−標識の特異的検出システム、 −免疫学的反応のため及び検出反応のために適切な緩衝液。
モノクローナル抗体は、同様にきわめて有利な治療剤を構成する可能性があり、 又酵素又は薬剤のベクターの役目を果たすことができる。
以下の例では本発明のその他の特徴及び利点が報告されている。
図1から・・・まではそれぞれ、次のものを表わす。
−図1は、例中に調製が報告されている組換え型バーフォリンのアミノ酸配列で ある。
−図2は、HLPDE3の構築様式である。
−図3は、プラスミド1)AR303Bの部分的制限地図である。
−図4は、ヒトグランザイムBのヌクレオチド配列及び組換え型ヒト抗グランザ イムBモノクローナル抗体を形成するために利用される対応するアミノ酸配列( 1〜227)である。
−図5は、プラスミド9AR3039−HuPの構築様式である。
−図6は、ヌクレオチドpAR3039HuPの配列及び組換え型タンパク質の アミノ酸から演澤された配列、ならびにクローン34から得られた配列を示す。
■−材料 I−1材料 −上記J、 rmmunol、中にKrahenbul他によって記述された技 術に従ってFPLCシステ(PHARMACIA)に連結された陽イオン交換器 MonoSカラム(HR15,PHARMACIA)上でLGL(大顆粒リンパ 球)の細胞質顆粒のその他のタンパク質からグランザイムA及びBを分離する。
−利用するマウスは、ハブロタイブH−2dのマウスBALB/Cである。
−ハブロタイブH−2dの非分泌性骨髄111Ns−1は、その増殖能を融合に おいてもたらす。これはHPRT突然変異を有することから(Kohleret  al、 Eur、 J、 Immunol、 6.292−295.1976 年”) HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)培地内で対抗選 択される。
−グランザイム已に対して誘導されたポリクローナル抗体は、Krahenbu hlにより記述された技術に従って得られるようなものである(上記参照)。
−REX細胞系統は、エプスタイン−バーウィルスによって不滅化されたT細胞 系統である。
− モノクローナル抗体PAb419はSV40のT抗原に対して誘導されてい る(Harlow et al、 J、 of Virology、 861− 869.1981年)。
r−2溶液 培地1 : RPM11640 (GIBCO)、 100 u/−のペニシリ ン、 100 u/−のストレプトマイシン(GIBCO)、2 mMのグルタ ミン(G[BCO)。
培地2 : RPM11640 (GIBCO)、 100 u/−のペニシリ ン、 100 u/−のストレプトマイシン(GrBCO)、2 [11Mのグ ルタミン(GIBCO)。
250u/rnlのインターロイキン2 (Roussel Uclaf、 0 .7−10’ uのBRMP/試料)。
培地3 : RPMI (GIBCO)、 100 u/−のペニシリン、 1 00 u/rdのストレプトマイシン(GIBCO)、2 mMのグルタミン( GIBCO)、1 mMのピルビン酸ナトリウム(GIBCO)、 10%の不 活性化されたウシ胎児血清(GIBCO)、 0.36%のグルコース(A、P 、)。
培地4 : DubeccoのMODイーグル培地(GIBCO)、 100  u/−のペニシリン、100 u/mlストレプトマイシン(GIBCO)、2 mMのグルタミン(G4BCO)、1 mMのピルビン酸ナトリウム(GIBC O)、 10%の不活性化されたウシ胎児血清(GTBCO)、 10%の不活 性化されたウマ血清(G[BCO)、10%のNCTC135((dBco)、 2 mMのNaOH(Prolabo)。
培地5 : DubeccoのMODイングル培地(GrBCO)、 100  u/−のペニシリン、 100 u/rnllのストレプトマイシン(GIBC O)、2 mMのグルタミン(GIBCO)、1 mMのピルビン酸ナトリウム (GIBCO)、 10%の不活性化されたウシ胎児血清(G[BCO)、 1 0%の不活性化されたウマ血清(GIBCO)、 10%のNCTC135(G IBCO)、2 mMのNaOH(Prolabo)、2%のヒボキサンチン( GrBCO)、2%のチミジン((dBcO)、2%のアミノプテリン(GrB CO)。
RIPA : 10mMのトリスpH8,1mM EDTA、150mMのNa C1,1%のNP40゜1%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のSOS  。
免疫沈降の洗浄用緩衝液: 100 mMのトリスpH9,0,5MのLiC1 ゜1%のメルカプトエタノール。
laemmli緩衝液(Laeamli、 Nature227.680−68 5.1970) ; 62.5mMのトリスpH6,8,2%のSDS 、 1 5%のグリセロール、5%のβ−メルカプトエタノール、 0.01%のブロモ フェノールブルー。
■一方法 I[−1末梢血からのLGLの分離 Chouaib他がProc、 Natl、 Acad、 Set、 USA8 5.6875〜6879.1988で記述している通りに作業を行なう。
末梢血からリンパ球をフィコール勾配によって分離する( PHARMACIA )。
培地5で2回洗浄した後、ハイエム溶液内で細胞を計数し、37°Cで一時間、 不活性化されたSHNで前処理された培養フラスコ(CO3TAR)内で3X1 0”細胞の割合でインキュベートさせる。このとき付着しなかった細胞を収集し 、RPMI 5HNIO%中で洗浄し、パーコールの不連続勾配上で遠心分離に より分別する(Pi(ARMACIA)。パーコールの異なる濃度の4つの溶液 を調製する(31%、34%、37%及び41%)。
2つに1つの溶液がRPM[培地(赤色)内又は等張塩化ナトリウム溶液(無色 )内で調製され、かくして界面の優れた祝賀化が可能となる。41%で4−の溶 液を流し、15rd入りの円錐管(NUNCLON DELTA。
PALIL BLOCK)内で減少する濃度で各溶液2rILlずつをこの上に そっと置いた後、2−のRPMI中に含まれた3X10’個のリンパ球を勾配の 表面に置く、管を、大気温でブレーキ無しで1400回転/回転速さで30分間 遠心分離させる。37〜40%の界面にあるLGLリングをパスツールピペット で回収し、RPM [で3回洗浄し、次にまとめる。細胞を計数し、1rrLl あたり5X10’の割合で培地2内で培養する。LGLはリンパ球の合計個体群 の2〜5%を占める。
n−2末梢血のLGL又はNK細胞から精製されたグランザイムA及びBを用い た、マウスの免疫化、 アジュバント Vaccicox” (101単位)200μgの中で溶解した 精製タンパク質10μg(グランザイムA及びB)を、マウスBALB/Cに腹 腔内注射する。21日後、2回目の静脈内注射(生理血清200μg内に溶解さ れた10dgのタンパク質)により追加免疫を行なう。
n−3細胞融合 5elected Methods in Ce1lular immunol ogy(細胞免疫学における選択された方法)(Freeman and co 、 Mishell、 Shiigi、 eds、 1980)においてOl及 びHerzenbergが記述しているように、作業を行なう。
追加免疫の3日後、マウスを安楽死させ、その膵臓を無菌環境内で採取する。R PMIを5rd含む無菌ペトリ皿の中で5rnlの注射器ピストンを用いて膵臓 を切り裂く。次に5(7’のRPM Iで牌細胞溶液を洗浄する。遠心分離の後 、細胞沈渣物を大気温に保つ。
培地2の中で培養状態にある骨髄腫細胞N5−1を1500回転/回転子分間遠 心分離し、次にRPMI50rd!内で洗浄する。101dlのRPMI内で細 胞沈渣物を再び懸濁させ、2個の牌細胞について1つの骨髄腫細胞の割合で膵臓 細胞の入った管の中へ移す。この混合物をRPMIで40mt’に調整し、次に 20°Cで1500回転/回転子分間遠心分離する。
混合細胞沈渣物を、1分間管内でピペットをゆっくりと回すことによって、1− のPEG(ポリエチレングリコール1500. BOEHRINGER)(融合 剤)と共に再懸濁させる。37°Cで予め加熱されたRPM116401m7を 1分間で、次に同じ培地7−を2分間で付加することによって、PEGを希釈し 、この製剤の毒性を減衰させる。ブレーキ無しで4分間100μA’分で遠心分 離した後、細胞沈渣物を、37°Cに予備加熱された10−の培地(4)内で再 度懸濁させる。1ウエルにつき100μl中骨髄腫の細胞lO″個の割合で、9 6の平底ウェルの無菌プレート内に細胞を分配する。
融合から24時間後(18目)、37℃に予備加熱された培地5を100μ!、 各ウェル内に付加する。この培地はハイブリドーマを選択し、融合しなかった骨 髄腫細胞を殺す。
78目に、100μ!の培地を吸引し、新しい培地4,100μlで置換する。
lO日1に、陽性ウェルの中味(ELISA試験: AMER3HAMキット) を24ウエルの平底プレート上に移し、その中に11dの培地4を付加する。1 3日8に、分泌性ハイブリドーマをSVF/10%のDMSO内で液体窒素での 凍結により保存することができる。
It−4ELISA試験(酵素結合免疫吸着検定法)によるヒト抗−グランザイ ムA及びB抗体を分泌するハイブリドーマの研究、(ホースラディツシュのペル オキシダーゼに結合された全抗体であるマウスの抗−IGキット) 96の平底ウェルのプレートの準備は、試験の24時間前に行なわれる。このた め、l tt g/rail (PBS内)で100μA’の抗原(精製された グランザイムA又はB)をウェル内に分配する。プレートを24時間4℃に置( 。
ウェルあたり200111のPBS、 0.1%のTween 20を用いた2 〜5回の洗浄をハイブリドーマの培養の上清をテストする前に行なう。テストす べきハイブリドーマ培養の上清をlウェルあたり50μm用いて37°Cで1時 間、プレートをインキュベートする。
PBS、 0.1%のTween 20で3回の洗浄の後、501tlの2次抗 体(ペルオキシダーゼに接合され、PBS、 0.2% Tween 20内で 500分の1に希釈されたもの)を各ウェル内に付加する。インキュベーション は、30分間37°Cで行なわれる。
プレートは、PBS、 0.1% Tween 20で新たに3度洗浄される。
基質を含む溶液(ABTS 180■/l、 12.5−中10μ!のPBS、  3%H,0□)100μlを付加することにより発色が行なわれる。
プレートは、基質の付加から15〜25分後に405 nmでのDOを測定する ことによって、読みとられる。
上述のとおり作業を行なうことによりグランザイムBで免疫化されたマウスに由 来する膵臓細胞と骨髄腫細胞NSIを融合させた後、GRBと呼ばれる28のハ イブリドーマの上清は、EL4SA試験(精製タンパク質を用いて行なわれるテ スト)においてグ、ランザイムBに特異的なものであることが判明した。
グランザイムAで同じアプローチに従うと、ELISA試験(精製タンパク質を 用いて行なわれるテスト)で、グランザイムAに特異的な抗体を分泌するGRA と呼ばれる。15のハイブリドーマを分離することができた。
特異的抗体を分泌するハイブリドーマの百分率はきわめて満足の行くものであり 、実際、精製されたグランザイムBで免疫化されたマウスの膵臓細胞と骨髄腫細 胞NSIの間の融合に由来する300のハイブリドーマのうち、10%はELI SA試験で特異的抗体を分泌する。
グランザイムAの場合、第2の融合のハイブリドーマの5%が同一条件下で特異 的である。
ll−5限界希釈によるハイブリドーマのクローニング上滑がELISA試験で 最も強い陽性度を呈するハイブリドーマは、96の平底ウェルのプレート内でク ローニングされる。複数の希釈がテストされる。クローニングは、1つのウェル あたり100μlの培地4の割合で1ウエルにつき100個、10個、1個の細 胞で行なわれる。
クローニングの3日後に、培地4を100μl用いて細胞に栄養を与え、その後 7日毎にこれを行なう。倒立顕微鏡により検査された細胞の増殖が大きいと思わ れる場合、これらのウェルの培養の上清を、グランザイムA又はB上の精製済み グランザイム及び負の対照としてのリゾチームについて、EIJSAでテストす る。
陽性ハイブリドーマを、24のウェルのプレート内に移し、次に6つのウェルの プレート上に、そしてその後フラスコ内に移して細胞の対数増殖を維持する。こ れらのハイブリドーマは腹水を生成するためマウスの腹膜内に注射される。これ らを、ウェスタンプロ・ソト又は免疫沈降法で研究される非常に濃縮された上滑 を得るべく、細胞の死に至るまで培養状態に放置することが可能である。
それぞれGRB98C及びGRB51Dと呼ばれるグランザイムBを認識する抗 体を分泌する2つのハイブリドーマ及び、GRA66D、 GRA382E及び GRAIODを認識する抗体を分泌するその他3つの株を回収する。残りのハイ ブリドーマは、ヒトグランザイムA及びBに対して誘導された抗体パネルを構成 するべくクローニングされることになる。
It−6クローニングされた抗体のアイソタイプの特徴づけ試験すべきハイブリ ドーマの培養の上溝は20mMのトリスpH7,6゜137 mM Nacl( TBS)で10分の1に希釈される。キットのテープを、希釈した上清と共に大 気温で15分間インキュベートする。TBS、 0.1%Tween 20 ( TBS−T)での3回の洗浄の後、テープをペロキシダーゼに結合された抗マウ ス抗体(TBS−T内で500分の1に希釈されたもの)溶液内でインキュベー トする。
基質を含む溶液(過酸化水素を1滴含むTBS 50rdに即時に混合された、 10−の低温メントール中に溶解されたクロロナフトール1錠)3−の中に大気 温で15分間テープをインキュベートすることによって、発色を行なう。精製水 で3回洗浄した後、テープを乾燥し、これを解釈することができる。
本研究において用いられた免疫化技術は、アイソタイプ抗体[gGを分泌するハ イブリドーマの獲得を可能にした。抗体のアイソタイプは、マウスのモノクロー ナル抗体のAmershaa+社が商品化したキットによって確認された。モノ クローナル抗体GRB98C,GRA66D。
GRA382B及びGRAIODはアイソタイプIgG1を示す。ハイブリドー マGRB51Dによって分泌された抗体はアイソタイプIgG2aを示す。EL ISA試験によってクローニングされたハイブリドーマの培養上清の滴定により 、1000というハイブリドーマGRB98Cの培養上清の力価を測定すること ができた。ハイブリドーマGRB51D、 GRA66D及びGRAIODの培 養上清の力価は、10000である。ハイブリドーマGRA382Hの培養上清 の力価は100000である。これらの力価の値が高いことに留意されたい。
It−7タンパク質の電気転移及び免疫発色の技術(ウェスタンプロット)によ るこれらの抗体の特異性の決定。
Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 76、4350−4354. 1979にTowkin他によって記述されているとおりに作業を行なう。
タンパク質(精製抗原:グランザイムA又はB又は負の対照)は、10分間10 0°CでLaemml iの緩衝液中でインキュベートされ(幅12onのlμ g/ゲル)、変性ポリアクリルアミドゲル上を移動し、次に1、5〜2時間、フ ィルター1cdあたり1mAの電流下で39mMのグリシン、48mMc7)  )リスpH8,3,0,037%ノSDS、 20 %(7)メタノールの緩衝 液中で、黒鉛製電極付き装置(CERA LABO)内でニトロセルロースフィ ルター(BA83. CERA、 LABO)上で電気転移させられる。転移後 、ニトロセルロースフィルターをボンソー・レッド0.2%と三塩化酢酸0.3 %で染色して、転移の有効性を確認し、次に輻0.6cmのテープ状に切断する 。
テープを、4°Cで1時間0.2%のTween 20と5%の脱脂乳を含むP BS緩衝液中で予備インキュベートする。テストすべき異なるタンパク質を示す テープセットを、0.2%のTween 20と5%の脱脂乳を含むPBS緩衝 液中で10分の1に希釈したハイブリドーマ上清と共に一晩4°Cでインキュベ ートする。次に実験室の温度で5分間5回平均撹拌下で0.2%のTween  20を含むPBS緩衝液内でテープを洗浄する。
実験室の温度で2時間アルカリ性ホスファターゼに結合されたマウスの抗免疫グ ロブリン抗体(上記PBS緩衝液内で1000分の1に希釈されたもの)と共に 、テープをインキュベートする。PBS中で5分間5回洗浄した後、テープをア ルカリ性ホスファターゼ反応反応緩衝液(100mMのトリスpH9,5、10 0mMのNaC1,50mMのMgC1* )中で平衡化し大気温で15分間ホ スファターゼ基質(10−の反応緩衝液。
44μlの塩化テトラゾリウムニトロブルー、33μlの(5−ブロモ−4−ク ロロ−3−インドリルホスファターゼ p−トルイジン)の存在下に置く。H2 Oでテープを洗浄することにより反応を停止させることができる。
還元され変性されたグランザイムBをニトロセルロースフィルター上で電気転移 させる。ニトロセルローステープをまずはテストすべきさまざまな抗体と共に、 次にアルカリ性ホスファターゼに接合された抗マウス抗体と共にインキュベート する。
これらの条件下で、抗グランザイムBポリクローナル血清と共にインキュベート されたテープ上には、31KDの帯が観察される。これに対して、抗グランザイ ムB抗体GRB51D及びGRB98Cと共にインキュベートされたテープ上に は、この帯は検出されない。対照(SV40のT抗原に対して誘導された抗体、 抗グランザイムA抗体GRA66D。
GRA382B及びGRAIODと共にインキュベートされたテープ)も同様に 陰性である。従って抗グランザイムB抗体は、ウェスタンプロットのこの実験の 条件下でグランザイムBを認識しない。
ll−8インビトロ細胞標識付は及び免疫沈降反応1rd!につき3〜5×lO S細胞の割合で、LGLを培養に付す(培地:メチオニンが枯渇し、35sメチ オニン:20〜50μCi/rnIと1%の不活性SHNで補足されたRPMr )。ロイシンが枯渇し、20〜50μCi/mIの3Hロイシンが補足されたR PMI培地内で、標識付けを行なうことができる。37°Cで4時間のインキュ ベーションの後、PBSで2回細胞を洗浄する。500μのRIPA−0,01 %のBSA(R2518,SIGMA)内で細胞沈渣物を再度取り込み、15秒 間音波処理する(マイクロ音波処理装置、出力40ワツト、プローブ0.3〜8 7、BIOBLOCK)。放射能取り込みの後に、TCAで沈降した分画が計数 される。細胞抽出物は5X10’cpmでアリコートされる。
−免疫沈降反応(J、 Virol、 31.472−483.1979内のK ress et al。
に従う)。
60ulのタンパク質A Sgpharose” (PHARMAC[A、 C L4B、5epharose’ )を共に細胞抽出物をホイール上で撹拌しなか ら4°Cで30分間インキュベートすることにより、暗騒音を減少させることが できる。次に、試料をフリット(多孔質ポリエチレン)上でろ過する。10μl のマウスの正常な血清と30μlのタンパク質A Sc!pharose”を溶 出液に付加し、撹拌しなから4°Cで1時間放置する。この溶液は、同じフィル ター上でろ過される。最後の暗騒音の減少段階は、ろ液に30μlのタンパク質 A 56pharose” 30μlを付加し、撹拌しながら4℃で30分間イ ンキュベーションすることによって実現される。ろ過の後、溶出液を、テストす べき培養の上溝200μl:タンパク質ASepharose ’ 40μI! 及びRlPA−0,01%BSA (B2518. SIGMA)20μlの存 在下で撹拌しながら4°Cで4時間インキュベートする。抗原−抗体−タンパク 質A 5epharose’の複合体をろ過し、次に洗浄し、laemmliの 緩衝液45μlで溶出させ100’Cで10分間煮沸する。
SOSの存在下でポリアクリルアミドゲル(12,5%)上に試料を置く。40 mA、 200Vでの移動の後、ゲルを定着させ、EN’HANCE (DUP ONTde NEMOUR3)で処理し、精製水で洗浄し、80°Cで1時間乾 燥し一80℃でHy−perfilm−MP (AMERSRAM)上にX線螢 光撮影する。
以下では、LGL顆粒内に含まれたグランザイムBを免疫沈降する抗グランザイ ムBモノクローナル抗体の能力を確認するために実施された、アクリルアミドゲ ル上の分離が後に続く免疫沈降反応実験の結果が報告されている。この実験では 、35s−メチオニンで標識付けした細胞抽出物(LGL又はREX)が利用さ れる。免疫沈降反応は、テストすべきハイブリドーマの培養を用いて行なわれる 。免疫沈降反応を受けたタンパク質を、12.5%で変性したポリアクリルアミ ドゲル上で分離させる。オートラジオグラフィ期間は7日間である。
抗グランザイムB抗体GRB51D及びGRB98Cによって免疫沈降された、 LGLの細胞抽出物の移動に対応する31KDでの帯が観察される。この31K Dでの帯は同様に、抗グランザイムBポリクローナル血清によって免疫沈降され た同じ細胞抽出物についても観察される。これに対して、この帯は、負の対照の 場合検出されない、前述の抗体によって免疫沈降された細胞抽出物REX(グラ ンザイムを発現しない細胞)の移動は、この分子量ではいかなる帯も発色しない 。これらの結果から、抗体GRB51DとGRB98CがグランザイムBを充分 に認識することがわかる。
抗グランザイムA抗体(GRA66D、 GRA382E、 GRAIOD)の 特徴づけのために、ロイシン3Hで標識づけされた細胞系統REX及びLGLの 抽出物について、免疫沈降反応が行なわれた:実際、グランザイムAのアミノ酸 配列にはメチオニンが少ないが、逆に26のロイシンが含まれている。免疫沈降 反応を受けたタンパク質は、12.5%で変性するポリアクリルアミドゲル上で 分離される。オートラジオグラフィ期間は1力月である。32kdでの強度の低 い補足的な帯は、抗体GRA66Dにより免疫沈降されたLGLの細胞抽出物の 場合にのみ観察され、抗体GRA382B及びGRAIODの場合にも又負の対 照として用いられる抗体の場合にも見られない。
ll−9腹水の産生 BALB/Cマウスに対し腹腔内で500μlのテトラ−メチル−ペンタデカン (JANSSEN)を注射する。Methods Enzymol、 121. 375−381゜1986内でHoogenraad及びWvaightによっ て記されているように作業を行なう。10日後、生理学的血清内で洗浄した10 7個のハイブリドーマを腹腔内注射する、マウスを毎日穿刺する。4°Cで毎分 1500回転の速度で7分間腹膜液を遠心分離する。パスツールピペットを用い て回収した腹水を0,2μm (NALGENE)でろ過し、次に、脂質を除去 するため12000 gで30分間4°Cで遠心分離し、−80°Cで保存する 。
■−10抗体の精製 (Immuno Pure rgG精製キット、PIERCE)Naアジド0. 02%内に貯蔵したタンパク質Aのカラムを51dの結合緩衝液で洗浄する。結 合緩衝液中で1/2に希釈された2−の腹水をカラム上に置く。15−の結合緩 衝液での洗浄後、5fdの溶出緩衝液でrgG(免疫グロブリンG)を溶出する 。このカラムを8−の0.1Mクエン酸pH3で再生し、0.02%のNaアジ ド内で貯蔵する。
溶出された分画を、101dのPBSを用いてExocelluloseカラム 上で脱塩する。これらの脱塩カラムを151R1のPBSで再生し、0.02% のNaアジド内で貯蔵する。■/l単位で表わされた(rgG ) =280  nm/1.4でのDOという公式に従って、各分画中の免疫グロブリンの濃度を 決定するため280止でのDOの測定により、tgGの脱塩された分画を秤量す る。
IF−11免疫細胞化学によるLGLレベルでのグランザイムの検出以上で報告 したようにELISA試験により選択されたグランザイムA及びBを認識する抗 体で、LGLをインキュベートした。
250回転/分で5分間、スライドガラス1枚につき2X10’の細胞を細胞遠 心分離し、4℃で10分間アセトン中で定着させる。PBSで2回洗浄した後、 テストすべき抗体(PBS、 1%BSA内で172に希釈されたもの)をスラ イドガラス1枚あたり10μlの割合で付加し、1時間37℃に放置する。PB S中で2回スライドガラスを洗浄し、次に、マウスの抗Ig抗体(PBS、 1 %BSA中で500分の1に希釈されたもの)をスライドガラス1枚につき20 0μlの割合で付加し、37°Cで30分放置する。PBS中での2回の洗浄後 、lO分間大気温で、基質すなわち0.3%のHzOz 100μlに即時的に 混合された10m1の50−ドリスpH7,6内に溶解された3、3′ジアミノ ベンジジン(SIGMA)1錠(10■)を含む溶液200μlによって被覆さ れたスライドガラスをインキュベートすることによって、発色を行なう。スライ ドガラスを洗浄し、大気温で1分間Hgmalun de Meyer (VE RCK)によって細胞を染色する。細胞を洗浄し、エタノール浴中で脱水しく7 0%。
90%及び100%)、トルエン内を通し、モンタージュ樹脂−滴(BIOLY ON)を用いて膨らます。分析は、光学顕微鏡で行なわれる。
このような条件の下で、細胞室の栗色染色が観察され、これらの抗体の定着を明 らかにする。負の対照として利用された抗体を用いた場合、いかなる染色も得ら れない。[L−2組換え体(250u/rnl)の存在下で一晩LGLを活性化 した場合、細胞個体群の一部分のみが染色される。同じ濃度でIL2が存在する 中で7日間培養した後、全ての細胞個体群は染色される。
I[−12免疫組織化学によるGVHを呈する患者の皮ふの生検についてのグラ ンザイムA及びBの検出 HLA抗原一致で実施された同種骨髄移植の際に、宿主に対する移植片の反応の 臨床的症候群つまりGVHが頻繁に観察される。GVHの臨床症状は、皮ふ、腸 及び肝臓の発作によって特徴づけられる。皮ふの生検は、組織学及び免疫組織化 学によりGVHの診断を立証するための最も優れた材料として考えられている。
GVHと相容性のある患部を示す2名の患者CRAP :慢性骨髄性白血病(L MC) : REN :急性骨髄性白血病(LAM)について研究した。
4°Cで10分間アセトン中で定着させたOCT (Tissue−Tek、  MrLES)で凍結された皮ふの生検を、5μmで低温切断する。大気温で20 分間、ウマ血清(Vectastinキッh、 VEC−TOR)で組織切片を 飽和させる。PBSでの洗浄後、テストすべき抗体25μgを、大気温で30分 分間外上に置く。抗グランザイム抗体GRA51D及びGRA66Dで実現され た実験結果を報告する。スライドガラスを3回PBSで洗浄し、次にまず大気温 で30分間ビオチニル化されたマウスの抗Ig抗体50μ1(Vectasti nキット)で、次に大気温で1時間ビオチニル化されたペルオキシダーゼに混合 されたアビジン(Vectastinキット)を用いてインキュベートする。P BSで2回洗浄した後、基質(0,03%でH,02100μfに即時的に混合 されたトリス50mM pH7,610m1の中に溶解されたジアミノベンジジ ン1錠(10■))を含む溶液50μlにより被覆されたスライドガラスを大気 温で1o分間インキュベートすることにより、検出を行なう。スライドガラスを 洗浄し、大気温で1分間Hgmalun de Meyerで組織切片を染色す る。切片を洗浄し、エタノール浴(70%、90%及び100%)内で脱水し、 トルエン内を通し、モンタージュ樹脂−滴で膨らませる。分析は、光学顕微鏡で 行なわれる。
LGLの場合における前述の通りにインビトロにて、皮ふに浸透するリンパ球の 細胞質の染色を観察する。負の対照として用いられた対照抗体では、いかなる染 色も得られない。
さらに、異なる抗グランザイム抗体の定着を表わす染色は、リンパ球(CD3.  CD4. CD8)分化膜状標識により免疫組織化学で特徴づけされたリンパ 球浸潤巣のレベルに局在化されている。
■−マウス組換え型パーフォリンの産生マウス組換え型パーフォリンを産生ずる ためには、ファージT7の転写及び翻訳シグナルの制御下でタンパク質を発現す る原核生物発現ベクターpAR3039が用いられる(Studier et  al、、 ; J、 Mo1. Biol、。
189、113−130.1986を参照のこと)。
マウスパーフォリンの完全cDNAクローンの1400pbのフラグメントSm a I−EcoRVを切除する。このセグメントは、残基98〜584をカバー する成熟マウスのパーフォリンのC末端部分に対しコードする(単一の図を参照 )。
セグメントの平滑末端は、リン酸化されたリンカ−(5′−CCGGATCCG G−3’ )を用いてベクターpAR3039の部位BamH1内で連結される 。
このプラスミドはpAR3039−perfと呼ばれる。誘導性プロモータrP TGの制御下でポリメラーゼT7の遺伝子をゲノム内に含むE、 coli(大 腸菌) DE3を、このプラスミドで形質転換する。相応する細菌は、1991 年3月12日にl−1057という番号でC,N、 C,Mに寄託された。
組換え型パーフォリンの合成は、形質転換された細菌の中でIPTGによって誘 導される。
氷上で12時間50mMのトリス−MC1,pH7,5,0,5mMのEDTA 及びlOμg/−のりボザイムを含む溶液20−で細菌沈渣物(100mm’の 培養からの)を溶菌することにより、45KDaの組換え型パーフォリンを精製 する。
10%まで1.5−のNP−40及び1.51d!のNaC15Mを付加した後 、溶菌された細菌を氷上に20分維持する。
細菌DNAを次に音波処理によって分割し、タンパク質封入体を15分間120 00回転/分で遠心分離する。
50mMのトリス−HCl、 p)17.5. 0.5a+MのEDTA及び3 00 mMのNaC1の溶液で3回沈漬物を洗浄し、5OS−PAGE緩衝液中 で溶解させる。
45KDaの組換え型タンパク質を5DS−PAGE (ポリアクリルアミドゲ ル10%)により大部分の細菌タンパク質から分離し、タンパク質溶出装置rs coを用いて電気溶出に付す。
通常細菌培養100−から1〜2■の組換え型パーフォリンが得られる。
雄ラットOFAを、まずはマウス組換え型パーフォリン(又はrMup)50℃ gで腹腔内注射により、そして次に3力月後第2回の腹腔内注射により免疫化す る。(ハイブリドーマの産生のため)牌細胞を採取する3日前に、アジュバント 無しで尾の静脈内に50℃gのrMupを注射する。
2)ハイブリドーマの産生及び選択 Co1d Spring Harbor Laboratory −二、−ヨー ク、1988中にHar low及びLaneによって記述されているように作 業を行なうことにより、rMupで免疫化されたラットの牌細胞と免疫グロブリ ンを産生じない骨髄牌細胞Sp210−Ag86の融合を実現する。簡単にいう と、血清を含まない培地RPMIを針と注射器を用いてラットの組織内に用心深 く導入することにより、牌細胞を回収する。骨髄腫細胞について行なったように 、この培地を用いて牌細胞を洗浄する。このとき5〇−入りのPALCON管の 中で、10”個の牌細胞と10’個の骨髄腫細胞を混合し、1000回転/分で 10分間、遠心分離に付す。できるかぎり多くの上清を除去する。管の壁を穏や かに叩いて細胞を再度懸濁させ、50%の高温ポリエチレングリコール50%( 重量/体積)0.4−を−滴ずつ付加するCPEG、 5erva、 cat  N’ 33123)と同時に管を37℃のウォーターバス内に維持する。すべて のPEGを付加した後、管を37℃で3分間維持し、次に5分間800回転/分 で遠心分離する。上溝を除去することなく、2分で血清の無い培地RPMI 5  m1137°Cで)を付加し、次に新たに1度で5−を付加する。細胞を5分 間1000回転/分で遠心分離する。上溝を除去し、完全RPIJI培地5O− −FCS 5%を付加する。予めBa1b/Cマウスに由来する腹腔内単球/マ クロファージ(栄養細胞)を付加しておいた(1〜5日前)96のウェルの10 のプレートの中に、細胞懸濁液を分配する。1%のHAT (Gibco)を補 足した新鮮培地cRPMI−5%FCSで培地を交換する前に、24時間CO8 で5%に加湿された雰囲気内で37°Cでプレートをインキュベートする。約l O日間細胞を成長させる。この段階で、ウェルのうち約70%が、発達したクロ ーンをを有し、その多くが複数のクローンを有している。
融合の約20日後に、ハイブリドーマを含むウェルの大部分の中の細胞はほぼ最 大の密度に達しており、未変性マウスバーフォリン及びrMupに対するELI SA試験を実施するため、各ウェルの100μlが採取される。陽性度の高いハ イブリドーマが上述のMarlOWの論文で記されているようにサブクローニン グされ、もう1つの選択作業に付される。
配二とユとL狂二叩l桂土牲玄匹毘J影往る選択 100μfのMup CPBSPBS中g(rIdりで4°Cで約14時間、9 6ウエ)しのマイクロタイトレージョンプレート(Dynatech、 MIC 2000)を被覆する。変形態様としては、ウェルをホウヒゲコウモ1ノのCT L B6.1から誘導された顆粒(NaC11,5M中で可溶化され、超速−G 分離され水中で10分の1に希釈されたもの)又はヒトLAK細胞の顆粒(0, 5Mのリン酸塩中で可溶化され、超遠心分離され水中で115+こ希釈されタモ ノ)テ、ウエルヲ被覆する。PBS 0.02%、 Tween−20で3回ウ ェルを洗浄した後、大気温で2時間で各ウェル内↓こノ)イブIJドーマ上清を 100μ!付加する。上述のとおりにウェルを洗浄し、1時間でアルカリ性ホス ファターゼ(Sigma)に接合された抗ラット・ヤギ免疫クロプリン50μl を付加する。洗浄の後、100μlのホスファターゼ基質(リン酸p−ニトロフ ェニル、Sigma 104錠)を付加し、色が現われ始めた時点で直ちにA4 O5nmを測定する。負の対照ウェルは、ハイプリドーマ上゛清でインキュベー トされる代わり(二、CRPMI−5%FCSでインキュベートされる。かくし て、1991年3月12日付lすでNO,l−1058という番号でCNCMで 寄託された、C20,10と0う略号で呼称される抗パーフォリンモノクローナ ル抗体を回収する。
■−フラックスサイトメトリーでの)く−フオリン及びグランザイムBの発現の 研究 以下では、Schmid 1 et al、のわずかに修正されtコア法(ey tometry。
12 : 279−285.1991)に従って得られた結果を報告する。
材料: 全ての溶液は、PBS中で調製される。
−3%のバラホルムアルデヒド母液 −0,2μでろ過されたウシ胎児血清(SVF)−Tween20 2%の母液 −Ar1de NaN5.200 mMの母液技術: 定着: PBSで洗浄した1・10@個の細胞を850μlのPBS (4℃)内で再度 懸濁状態におかれ、150μlのPFA (4℃)を付加し、懸濁液を均質化す る。試料を1時間4℃でインキュベートし、次に250gで8分間遠心分離する 。
透過性付与: 1rId!のPBSo、2% Tween (900mt’のPBS +100  μA’のTween 2%母液)中で、定着した細胞を再度懸濁状態におく。
次に試料を37°Cで15分間インキュベートさせる。このとき2dの洗浄溶液 lを付加する(洗浄溶液1=PBS2%のSVF、最終的に10mMのNaN1 )。懸濁液を8分間、250回転/分で遠心分離する。
上清は廃棄される;その後細胞試料は顆粒内タンパク質の研究にアクセス可能と なる。
インキュベージジンニ 一次抗体: 特異的定着を低減させるような形で、抗体のための緩衝液50μlを細胞沈渣物 に付加する。
再度懸濁状態に置き、次に50μlの抗パーフォリン抗体1 /3000(つま り最終1 /6000)及び抗−グランザイムB抗体0.25μgを付置の対照 :研究すべき細胞懸濁液に対して、IgG1タイプのマウスの無関連免疫グロブ リンが利用される。
−透過性付与用対照:抗細胞骨格抗体、抗チューブリンα薬(チュープリンαは 厳密に細胞内のタンパク質である)を、全ての細胞個体群についてテストする。
−細胞の負の対照:培養状態にあるLGL細胞。
−細胞の負の対照:リンパ球系統MOLT4゜このようにテストされた試料は、 4°Cで30分インキュベートされ、洗浄溶液(2)内で2度洗浄される(洗浄 溶液(2) =PBS 0.2%。
Tween 20. 2%のSVF、最終10−のNaN5) 、 250 g で8分間遠心分離だ細胞沈渣に対して50μlのPBS中で60ngのCAMを 付加する。4℃で30分間インキュベートし、次に溶液(2)で2回洗浄する。
三次抗体:リンパ球の機能的状態及び表現型に従ったバーフォリン及びグランザ イムBの発現のサイトフルオロメトリーでの同時研究を実現するような形で、膜 抗原を認識する抗体でのインキュベーションを実施する。
50μlのPBSという体積で、次のような抗体を利用する。
−0,125μg C2,,5ttl!/fスト)の割合で抗CD3、・ 0. 03Mg(15μl/テスト)の割合で抗CD8、・ 7.5μl/テストの割 合で抗CD25゜抗体のための緩衝液50μlと抗体50μlを細胞に加える。
4°Cで30分間インキュベートさせ、次にPBS−アジド混合物を用いて2回 洗浄を行なう。
かくして処理された細胞をPBS/アジド培地内で再度懸濁状態におき、その後 2時間以内に分析する。細胞がさらに遅く分析される場合には、PBS−PFA  1%の培地内にこれを戻す。
この技術は、調帯の血液のリンパ球内におけるグランザイムB及びパーフォリン の発現を大人のリンパ球のものと比較し、移植の場合の細胞障害性を評価するた めに利用された。
−移植後の心臓の拒絶反応 −移植後の肺の拒絶反応 といったさまざまな病理学的状態における本発明の抗体の利用に関する研究の結 果を報告している。
これら2つのモデルにより、移植片に浸透する細胞の細胞障害性の活性化を研究 することが可能となる。
このアプローチは、いかなるものであれ移植片のあらゆる拒絶反応モデルに拡大 することができる。利用される材料は、肺の拒絶反応については気管支−肺胞の 洗浄及び凍結生検によって構成されている。
病気そのもの又はこの病気によって生み出された免疫応答における細胞障害性細 胞の役割が関与するその他のモデルも同様に研究された:すなわち、 −皮ふ腫瘍 −非ホジキン悪性リンパ腫におけるT細胞応答。
これらのモデル全てにおいて利用された技術は、3層でのAPAAP技術である 。
以下のようなプロトコルに従う: 10−冷凍庫に保たれたスライドガラスを15分間大気温で解凍する。
2°−テストすべき抗体を各スライドガラス上にペンシルで記載する。
3°−大気温で10分、アセトン浴中で定着させる。
4°−3〜4分間乾燥する。
5°−TBS緩衝液+1147.6 、30%(7)SVF内テ10分間再度水 分補給する。
6°−最初の層を適用し、30分間湿潤チャンバ内で大気温でインキュベーショ ンする。
7°−5分間2回pH7,6のTBS中で洗い流す。
8°−第2の層(抗マウスIg ウサギ抗体)でインキュベートする。
9°−pH7,6のTBSで2〜3回洗い流す。
lOo−第3の抗体層(湿潤チャンバ内で30分間抗P、 A、 30マウス抗 体に結合されたP、 A、複合体)を適用する。
110−pH7,6のT、 B、 S、で2回、次にpH8,2のT、 B、  S、で洗い流す。
12°−暗所で20〜30分、アルカリ性ホスファターゼを発色させる。
13°−洗い流す。
14°一対抗染色 15°−水性環境でのモンタージュ。
利用される製剤: * T、 B、 S、緩衝液、0.05M、 pH7,6溶液A TRl5 = 精製H,Ott中60.55g、 pH7,6溶液B+NaCI=精製H,01 1中87.66 g* T、B、S、緩衝液0.05M=溶液A100μl十溶 液B 100μz+so。
μlのED pH7,6゜ *発色剤: 100 mi’のトリスに対して、1 ’ ) ASTRリン酸ナ フトール20■2°)ジメチルホルムアミド2rn1 3°)トリスpH8,2、0,OIM 100 rd4°)10−のED 13 0μ!に対してレバミゾール2−4g5°)ファーストレッドTRfJ! 10 0■6°)ろ過 本 モノクローナル抗体。
第2層: Ac220%5HNAbの1720に利用すべきTBS7.6中で希 釈されたZ25980%Dako 10g 20%。
第3層:20%SHN中で1150に希釈されたA、PAAP D651゜組換 え型ヒトパーフォリンの発現 J、 Mo1. Biol (1986)、 189. P113−130内で 5tudier他が上述のとおりに記述しているように作業を行なう。
材料 pAR3038Ba1I BamHI(8v−) ATCEcoRVへ1)AR 3039Bat I Baa+ Hl(10v−) GAT EcoRVへMe r Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Me t Gly ArgCAT ATCGCT AGCATG ACT CGT C CA CAG CAA ATCGCT CGG ATC’ C87−M9+CA A、 Tr9. Amp培地M9培地+2g/I!のカザミノ酸lO■/rR1 で3.3rdのトリプトファン 50mM )リス−CI CpH7,5’)ストック: IM pl(7,50 、5m EDTA ストック:0.5M10■/dの調製されたばかりのリゾチ ーム無菌H20中のIPTG (20℃のストック、20111g/rd=0. 084 M、 210分の1に希釈)5MのNaCI H,O中lO%のNP−40 TEN : 50mMのトリス+0.5 mMのEDTA+300 mMのNa CIIPTGによる誘導性プロモータの制御下にあるT7ポリメラーゼの遺母子 を伴う染色体を含む菌株DB (E、 coli)。
(1)細胞の増殖: 例二E、 colt DE3 ; T7HLP ;分析を目的として、体積を5 分の1に縮減する。
1 、 M9+CAA、 Trp、 AQ19.中でLB−Aa+p (50℃ g /rd)の調製されたばかり(48時間以内)のプレートから、約14時間 にわたり開始する(接種体)。100μl入りEr1en内に置くため、採取を 行なう(LB内で細胞を増殖させることも同様に可能である)。
2、 M9+Amp、 CAA、 trP、内で培養を1:10まで希釈する。
充分に通気しながら37゛CでDO600=0.8−0.9 (通常2〜3時間 )を測定するまで増殖が進行するままにしておく。
3 、 IPTGo、 4 DIMでRNAポリメラーゼT7の遺伝子を誘導す る。
4.3時間増殖を進行させておく。
5、細胞を回収し、4°C130分間、3500回転/分で、5〇−入りの管内 で遠心分離が行なわれるまで、氷の上にこれを保存する。
6、沈渣物を必要とあらば一20°Cまで凍結させる。
(2)細菌溶菌及び不溶性タンパク質の分画の調製1.50μfの培養に対して 、50mMのトリス十〇CI (pH7,5) 、 0.5mMのEDTAを再 度懸濁状態におき、(水中で調製されたばかりの)150μI!25■/−のリ ゾチームを付加する。
2.30分から2時間氷上で溶菌を進行させる。
3.0.75dのNaC15Mを付加し、これにより細胞の溶菌がひき起こされ るはずである。Vortexを利用し、次に0.75−の10%NP−40を付 加する。VorteXを再度使用する。混合物は非常に粘度が高く、全ての細胞 の溶菌を得るため10〜30分氷上にこれを保存する。
4、DNAをこわすため音波処理を適用する。(液体培地が得られるまで2×1 0〜15秒の脈動)。
5、タンパク質pprを回転させる。
6、TEA内で2〜3回沈漬物を洗浄し、次に必要とあらば培地を清澄化するた め音波処理を行なう。
7.500μ!のSOS緩衝液の中に沈漬物を再度とる。
完全に細胞を抽出するため、約200μ!のSOS緩衝液の中にlrdの細胞沈 渣物を再度懸濁状態に置(。
同様に、IPTGによる誘導無しの対照、又は誤った方向づけでのインサートを もつプラスミドも調製する。
18組換え型ヒトグランザイムB・ベクターpAR−3038−Gra Bの構 築利用されるクローニング技術は全て、「分子クローニング、実験室マニュアル 」ニューヨーク; Co1d Spring Harbor、 Laborat oryPress内のManiatis et al、 −Schmidt e t al、 1987 / J、 Immunol。
139、250−256に従って作業を行なうことにより実施される。
クローンHLPから、ヒトグランザイムBの完全なcDNAインサートを分離す る(BamHlでのインサートの活動化)。cDNA全てを、M13mp8のB amH1部位でサブクローニングする。
Kunkelの技術を用いて(Bio−Radキット、Kunkel et a l、 Methodsin Enzymulogy、 1987.154.36 7、382) 、インビトロ突然変異誘発によりAからTにヌクレオチド116 を変化させ、これは、グランザイム3のアミノ酸の部位の変化をひき起こす(g /uからvalへ)。
このヌクレオチドの変化は、領域6〜227のアミノ酸に相応するグランザイム BのクローンのフラグメントBall−BamH1を分離できるようにする新し い制限部位Ba1lと、未翻訳ヌクレオチド領域を生成する(図2及び3を参照 )。
連結のためには、フラグメントBall−BamHIは、Ndelにより切断さ れ脱ホスホリル化されたベクターPAR−3038内に導入される。ベクターの Nde1部位及びグランザイムBのBa11部位を適合させるためグランザイム Bの最初の6つの残基を含む合成リンカ−Ndel−Ballを利用する。
この構成により、前にMetが先行しアミノ酸6がGluではなくValである という点で未変性ヒトグランザイムのものと異なる配列をもつ組換え型グランザ イムBの発現が可能となる。
組換え型グランザイムBの発現 細菌発現ベクターPAR3038は、組換え型タンパク質を選択的に発現するた め、バクテリオファージT7のプロモータを利用する。
IPTGにより誘導可能なプロモータの制御下にある内因性染色体ポリメラーゼ T7の遺伝子を含むE、 coli菌株の細菌は、プラスミドAR−3038B によって形質転換される。
組換え型タンパク質の合成は、以下のようにプラスミドPAR−3038゜Gr aBでのトランスフェクシヨンを受けた細胞DE3の中で誘導される:L Br oth−50℃g/−アンピシリンが塗布されたばかりのプレートに由来する約 14時間の接種体を同じ培地内で1/10に希釈する。
0.8〜0.9という600 nmでの吸光度に至るまで2〜3時間細胞を成長 させる。
このときTAポリメラーゼの遺伝子を0.4 mMのrPTGを付加することに よって3時間誘導する。
細胞を収集し、不溶性タンパク質分画から組換え型タンパク質を分離する。
簡単に言うと、5mIのトリス)ICI (50mM)、0.5mMのEDTA 、 pH7,5に0.75■ZrILlのリゾチームを補足したものの中で、細 胞沈渣物(50μlの培養)を再度懸濁状態におき、2時間氷上に放置する。
750μlのNaC15Mと750μ7のBP−40を、力強く撹拌しながら1 0%まで付加する。
氷上で30分培地を維持し、溶液がその粘度を失ない液体になるまで音波処理に より(15秒の脈動3回> liB’aDNA 鎖をこわす。
遠心分離(6000g、 30分、40℃)によりタンパク質沈殿物を回収し、 50mMのトリス−MCI 、0.5mMのEDTA、300 mMのNaC1 ,pH7,5の中で3回洗浄し、緩衝液5OS−PAGE内に溶解させる。25 KDaの組換え型タンパク質を5OS−PAGEにより主細菌タンパク質から分 離し、メーカーの取扱い説明に従ってタンパク質溶出装置Bioradを用いて 電気溶出する。
細菌培養400 dから、反復的に組換え型タンパク質的1〜2■を得る。
図4は、ヒトグランザイムBのヌクレオチド配列及び相応するアミノ酸配列を示 している。
■−組換え型ヒトパーフォリンB ベクターpB5/クローン15内のcDNAバンク(ラムダZAP−LAK)か ら分離されるようなヒトパーフォリンcDNAを利用する。ヒトパーフォリンの cDNAインサートを封じ込めるプラスミドは、pAR3039HuPと呼ばれ る。このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する。構成様式は図5に示さ れている。cDNA Sma/EcoRIインサートは1600の塩基対を含む :このフラグメントは位置A r g * lからTrps34までのアミノ酸 配列に対してコードする。
RNAでの転写はIPTGによって誘導される。構築のためには、アダプタとし てGATCCCCGGG (Pharmacia)を用いることによってBa1 IIHI〜Sma rと共にpARが適合される。フラグメントHuバーフォリ ンSmal(pBS/クローン15の)を連結段階に付す。読み取り枠は、配列 決定によって制御される。
図6は、ヌクレオチド9AR3039−HuP及び組換え型タンパク質から推論 されるアミノ酸配列を表わしている。同様に、クローン34の配列も示す。
浄書(内容に変更なし) Figure 1m vactaur 3039 facides axnLts4s 1−151バ ーフオリン(アミノ酸99−451)GAG GCA GCT GCT MT  ATCAAT AACGACTGGGlu 入1a Ala Ala Asn  工is Asn ASn Asp Trp>COT GTG GGG CTG  GAT GTG AACCCT AGG CCA GAG GCA AACAT G CGCGCC八rへJ ’Val Gly Leu Asp Val As n pro xrg Pro Glu Ala ASn MeCkrq Al= ■ TCCGTG GCT GGCTCCCACTCCAAG GTA GCCMT  TTT GCA GCT GAG MGSer val Ala Gly S er His Ser Lys Val 八la Asn Phe 八la A la Glu Lys■ ACCTAT CAG GACCAG TACAACTTT kAT AGCG ACACA GTA GAG TGT CGCThr Tyr にin Asp  Gin Tyr ASn Phe 入jn Ser Asp Thr Val  Glu Cys Arg■ ATG TACAGT TTT CGCCTG GTA CAA AAA CC T CCA CTCCACCTT GACTTCMe仁 Tyr Ser Ph e Arg Leu val Gin Lys Pro Pro Leu Hi s Leu Asp Phe■ AAA 、、、C; GCG CTCACA CCCCTCCCCCGCAAC TTT AACAGCTCCACA GAC;Lys Lys Ala Leu  Arg Ala Leu Pro Arg Asn Phe Asn Ser  Ser Thr Glu■ Fi炉「龜 3 Ser Arg Ala Arg Trp Gin Asn Cys Ser  Arg Pro Cys Arg Ser Gly Gin■ 浄書(内容に変更なし) Figura 1c GACTrT GAG M’r GTG CTCCTCTCCACA GGG  GGA CCCCTCAGG GTG C入GAsp Phe Glu Asn  Val Leu Leu Ser Thr Gly Gly Pro Leu  Arg Val Gin■ GTCTGG GAT GCCGACTACGGCTGG GAT GAT G ACCTT CT”r GGT TCT TGTval Trp Asp Al a Asp Tyr Gly Trp Asp Asp Asp Leu Le u Gly Ser Cys■ GACAGG TCT CCCCACTCT GGT TTCCAT GAG  GTG ACA TGT GAG CTA AACAsp Arg Ser P ro His Ser Gly Phe His Glu Van Thr C ys Glu Leu Asn■ CACGGCAGG GTG AAA TTCTCCTACCAT GCCAA G TCT CTG CCCCAT CTCHis Gly Arg Val  Lys Phe Ser Tyr His Ala Lys Cys Leu  Pro His Leu■ 浄書(内容に変更なし) 浄書(内容に変更なし) Figure 3 Figur@ 4+a 浄書(内容に変更なし) Figure 4b CGG CAG ACG GeCCCCCTG GGA AAA C入丁 TC A CACACA CTA CM GAG GTGGly Gin Thr A la F’ro Leu Gly Lys His Ser His Thr  Lau Gin Glu Va戟■ AAG ATG ACA GTG CACGAA GAT CCA kkG T GCGAA TCT GACTTA CGCCATLys Mee Thr V al Gin Glu Asp Arg Lys Cys Glu Sar 入 sp Leu Arg His■ T入τ TACGACkGT ACC入’rT GAG TTG TGCGTG  GGG GACCCA GAG ATT AAATyr Tyr Asp S ar Thr 工is Glu Leu Cys Val Gly Asp P ro Glu 工1e Lys■ CCA GCCTGCACCAAA GTCTCA 入GCTrT GTA C ACTGG ATA AAG AAA Ace入rg Ala Cys Thr  Lys Val S@r Ser Phe VaL His Trp IIe  Lys Lys Thr■ 合成オリゴマー 浄書(内容に変更なし) Figure 5 手続補正書(方式) 平成5年IO月13日

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1)活性化された「ヘルパー」T細胞又は細胞障害性細胞、より特定的には細胞 障害性Tリンパ球及び「ナチュラルキラー」細胞の細胞質顆粒の構成成分に対し て向けられた抗体において、未変性又は組換え体の形のヒトの顆粒の一定の与え られた構成成分のエピトープ、特に未変性又は組換え体の形でのヒト・グランザ イム(granzyme)又はパーフォリンのエピトープと特異的に反応して抗 原−抗体タイプの化合物を生成することのできるモノクローナル抗体であること を特徴とする抗体。 2)抗グランザイムモノクローナル抗体が、ヒト抗−グランザイムA.B又はH モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求の範囲第1項に記載の抗体。 3)IgGのクラスに属していること、約25〜30KDa(グランザイムB) 、60KDa(グランザイムA)又は66〜75KDa(パーフォリン)の分子 量のタンパク質に対して誘導されていることを特徴とする、請求の範囲第1項又 は第2項に記載の抗体。 4)細胞障害性細胞又は「ヘルパー」T細胞の細胞質顆粒の一定の与えられた構 成成分に対し向けられた抗体特にグランザイム又はパーフォリンに対して向けら れた抗体を産生する細胞と非分泌性骨髄腫細胞の融合、 −前記構成成分に対し特異的な抗体を産生することのできるハイブリッド細胞の 選択、 −これらのハイブリドーマのクローニング、−例えば腹水又は培地などから産生 されるようなモノクローナル抗体の複製、 という段階を含む方法によって誘導された、請求の範囲第1項乃至第3項に記載 の抗体。 5)融合段階において利用された細胞が、未変性の形の顆粒の構成成分によって 誘導されることを特徴とする、請求の範囲第4項に記載の抗体。 6)融合段階において利用された細胞によって産生される抗体が、組換え体の形 をした顆粒構成成分特に組換え型ヒトBグランザイム又は組換え型ヒトパーフォ リンによって誘導されることを特徴とする、請求の範囲第4項に記載の抗体。 7)1991年3月12日にI−1060及びI−1059という番号でCNC Mに寄託されたクローンGRB51D及びGRA66Dにより分泌されるような ヒトB抗−グランザイム及びヒトA抗−グランザイムモノクローナル抗体、或い は又1992年3月13日付けでDSMに寄託されたクローンによって分泌され るような組換え型ヒトB抗グランザイム又は組換え型ヒト抗パーフォリン抗体で あることを特徴とする、モノクローナル抗体。 8)請求の範囲第1項乃至第7項のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を 分泌することができることを特徴とするハイブリドーマ株。 9)特に、精製されたグランザイム又はパーフォリン又は組換え型グランザイム 及びパーフォリンといった細胞障害性細胞の細胞質顆粒の一定の与えられた構成 成分での免疫化の後特異的抗体を産生する細胞と骨髄腫細胞を融合させた結果得 られるハイブリッド細胞で形成されていることを特徴とする、請求の範囲第8項 に記載のハイブリドーマ株。 10)1991年3月12日にI−1060及びI−1059という番号でCN CMに、又1992年3月13日付でDSMに寄託された抗−グランザイムモノ クローナル抗体の産生クローン。 11)1992年3月13日付でDSMに寄託されたヒト組換え型抗パーフォリ ンモノクローナル抗体の産生クローン。 12)請求の範囲第4項に記載の融合及び選択段階を含むことを特徴とする、請 求の範囲第8項乃至第11項のいずれか1項に記載のハイブリドーマの調製方法 。 13)骨髄腫細胞が骨髄(myelon)細胞NS1であり、モノクローナル抗 体産生細胞が脾細胞であることを特徴とする、請求の範囲第12項に記載の方法 。 14)生物学的試料の中の特にグランザイム又はパーフォリンといった細胞障害 性細胞又は「ヘルパー」T細胞の細胞質顆粒の構成成分の存在のインビトロ検出 方法において、−抗原−抗体複合体の産生に適した条件下で、前記構成成分特に グランザイム又はパーフォリンのエキソサイトーシスを伴う疾病に羅患している 可能性のある患者からの試料を上述のようなモノクローナル抗体又はそのフラグ メントの調製物と接触させ、免疫学的結合を検出する段階 を含むことを特徴とする方法。 15)生物学的試料中の「ヘルパー」T細胞又は細胞障害性細胞の細胞質顆粒の 構成成分特にグランザイム又はパーフォリンの存在をインビトロで検出するため のキットにおいて、−マイクロタイタープレートといった秤量のための支持体と して用いられる適当な固体相、 −上述のような遊離した又は不動化された特異的モノクローナル抗体又はフラグ メントの調製物、 −場合によっては標識基を伴う前記構成成分より特定的にはグランザイム又はパ ーフォリンの調製物、及びこの調製物に標識基が含まれていない場合にはこのよ うな基を伴う第2の抗体の調製物、−標識の特異的検出システム、 −免疫学的反応のため及び検出反応のために適切な緩衝液を含むことを特徴とす るキット。 16)細胞障害性細胞により分泌された細胞質顆粒の構成成分の存在の検出に対 する、請求の範囲第1項乃至第7項のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体 の応用。 17)「ヘルパー」丁細胞又は細胞障害性細胞の細胞質顆粒のタンパク質におい て、求めるアミノ酸配列に対しコードする遺伝子フラグメントを封じ込めている 特にプラスミドといった発現ベクターの導入によって形質転換される特に細菌と いった細菌宿主の中で遺伝子工学により得られるような組換え型タンパク質であ ることを特徴とするタンパク質。 18)請求の範囲第17項に記載のタンパク質に対しコードする配列によって構 成されていること又は、このような配列を含むこと、及び場合によってはプラス ミドといった発現ベクタの中に取り込まれていることを特徴とする、DNAフラ グメント。 19)特に請求の範囲第18項に記載のDNAフラグメントを封じ込めているプ ラスミドといった発現ベクター、及びこれらのベクタによって形質転換された細 胞宿主。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4783410A (en) * 1985-06-28 1988-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Cytotoxic t lymphocyte serine esterase and method for stimulation and inhibition
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