FR2722207A1

FR2722207A1 - Methode pour generer une population de cellules presentant a leur surface une forte densite d'un pepride exogene specifique associe azx molecules du cmh; population de cellules

Info

Publication number: FR2722207A1
Application number: FR9408427A
Authority: FR
Inventors: Demoyen Pierre Langlade; Philippe Kourilsky; Jean Pierre Abastado
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1994-07-07
Filing date: 1994-07-07
Publication date: 1996-01-12
Anticipated expiration: 2014-07-07
Also published as: WO1996001891A1; FR2722207B1; AU2930395A

Abstract

L'invention a pour objet une méthode pour générer une population de cellules présentant à leur surface une forte densité d'un peptide exogène spécifique associé aux molécules du CMH de Classe 1.L'invention a également pour objet une population de cellules vivantes non tumorales de mammifères, notamment de cellules spléniques de lymphocytes de sang périphérique, de cellules de sang du cordon ou de cellules du placenta, d'origine humaine, caractérisée en ce que les cellules présentent à leur surface une densité d'un même peptide exogéne spécifique associé aux molécules du CMH et de même restriction allélique que celles-ci substantiellement supérieure à celles de cellules correspondantes exprimant ledit peptide exogène associé aux molécules du CMH à l'état natif.

Description

L'invention a pour objet une méthode pour produire une population de cellules vivantes du système immunitaire possédant à leur surface une densité élevée d'un peptide exogène spécifique, utile en thérapie notamment, pour réaliser une immunothérapie antitumorale ou anti-infectieuse chez un patient ou pour traiter une maladie auto-immune.

Le traitement des cancers par immunothérapie est depuis plusieurs années l'objectif primordial de nombreuses études.

Les lymphocytes cytotoxiques (CTL) détruisent les cellules infectées par un hôte infectieux, par exemple un virus avec une efficacité élevée et peuvent être utiles pour éliminer des cellules tumorales.

Alors que l'identification d'antigènes tumoraux spécifiques et la prédiction de peptides susceptibles de se lier aux CMH a progressé au cours de la période récente, l'induction des CTL a été le facteur limitant principal de l'immunothérapie tumorale.

De nombreuses difficultés pratiques et théoriques ont été rencontrées pour l'induction de CTL antitumoraux. La restriction du CMH et la tolérance immunologique au soi limitent le nombre de peptides cibles possible. Toutefois, l'obstacle majeur semble être les exigences d'afférence quantitativement différentes pour l'activation des lymphocytes T. Tandis que les lymphocytes T activés par l'antigène ne nécessitent que quelques centaines de complexes CMH Classe I/peptides pour exercer leur action, les lymphocytes T quiescents requièrent des quantités plus élevées d'antigènes pour leur activation. Etant donné que les antigènes tumoraux, pour ce qui concerne la présentation de antigène, peuvent être considérés comme des constituants cellulaires normaux, leurs peptides sont susceptibles d'entrer en compétition avec d'autres peptides dérivés de protéines cellulaires pour la liaison aux molécules de classe
I. Leur nombre peut être inférieur à celui de peptides provenant de particules virales qui habituellement synthétisent activement leurs constituants et souvent arrêtent la synthèse cellulaire. Ceci pourrait expliquer pourquoi les antigènes tumoraux ont une capacité relativement faible pour susciter des réponses à lymphocytes
T in vivo.

Des cellules dendritiques chargées en peptide sont capables d'initier une réponse primaire des CTL in vitro (Nair et al. (1)), c'est-à-dire des réponses lymphocytaires à CTL chez des souris non immunisées.

L'expression de B7, B7-2, HSA ou autres molécules costimulantes non identifiées est probablement un facteur important, mais la densité des complexes peptide/CMH est également critique, car des cellules mutantes humaines ou murines défectueuses qui peuvent être efficacement chargées avec des peptides exogènes peuvent également initier des réponses CTL primaires. De la même manière, on a montré que des cellules de Drosophila melanogaster transfectées avec des gènes H-2 et HLA, exprimant des molécules du CMH de Classe I "vides" pouvaient être chargées avec un peptide exogène et pouvaient induire in vitro une réponse à CTL spécifique dans des cultures primaires.

Les inventeurs auteurs de la présente invention ont à présent montré qu'il était possible de détacher les peptides endogènes des molécules du CMH exprimées à la surface cellulaire de cellules vivantes présentant à leur surface des molécules du CMH associées à des peptides endogènes et éventuellement des peptides exogènes (pour une faible part d'entre elles) sans affecter la viabilité des cellules ni la capacité des molécules du CMH de lier à nouveau des peptides. De telles populations de cellules "re-chargées" avec un peptide exogène sont efficaces pour induire une réponse à CTL Cl8+, dirigés contre ce peptide dans le cas du CMH de Classe I, ou à CTL CD4' dirigés contre ce peptide dans le cas du CMH de Classe II à la fois in vitro et in vivo.

Cette approche permet d'éviter les techniques antérieures consistant à cloner et exprimer les nombreux antigènes du système HLA, dans la mesure où il permet l'utilisation de cellules autologues pour obtenir une prolifération élevée en CTL, ou pour activer les lymphocytes B dans le cas du CMH de Classe II.

L'invention a pour objet une méthode pour générer une population de cellules vivantes présentant à leur surface une forte densité d'un peptide exogène spécifique associé aux molécules du CMH, caractérisée en ce que l'on traite une population de cellules natives présentant des molécules du CMH chargées en peptides d'origine endogène et éventuellement exogène, pour en détacher lesdits peptides, et en ce que l'on charge les molécules du CMH avec ledit peptide exogène spécifique de même restriction allélique que les molécules du CMH.

Par forte densité en peptide exogène, on entend qu'au moins une partie des cellules de la population traitée possède au moins 10% et de préférence au moins 90% de molécules du CMH alléliques chargées avec le peptide spécifique. Ainsi, pour une cellule portant 106 molécules de CMH, la cellule présentera après traitement au moins 105 molécules du même peptide associées aux molécules du CMH.

Selon l'invention, les molécules du CMH englobent les molécules du CMH de Classe I classiques,
Classe I non classiques et classe Il.

Les peptides d'origine endogène et éventuellement exogène associés aux molécules du CMH sont avantageusement détachés de celle-ci par traitement à pH < 5 ou à pH > 9 pendant une durée variant entre 10 secondes et 1 minute, de préférence environ 30 secondes.

Le CMH de Classe I lie une grande diversité de peptides courts (8-10 aminoacides) par le biais d'interaction majoritairement conservées entre le squelette peptidique et les résidus terminaux non polymorphes du domaine al-a2 de la molécule du CMH. Une grande partie de l'énergie de liaison semble être fournie par des ponts hydrogène entre les extrémités du peptide et les résidus polaires ou chargés des molécules du CMH.

Par ailleurs, Ojcius et al. (2) ont montré que les complexes recombinants CMH Classe I-peptide se dissociaient à un pH inférieur à 5 ou supérieur à 9.

Avantageusement, le "détachement" (stripping) des peptides des molécules du CMH de Classe I classiques,
I non classiques ou II a lieu en milieu acide citrique tamponné à pH environ 3, en présence d'une concentration d'environ 20 ,uM pour 106 cellules/ml du peptide exogène d'intérêt.

Gracie à la méthode selon l'invention, il est possible de charger les molécules du CMH avec un peptide de faible affinité pour ces molécules (c'est-à-dire présentant un Kd supérieur à 0,5 uM1).

Avantageusement, le peptide exogène est un peptide antigénique viral ou tumoral ayant de 8 à 10 aminoacides pour les peptides présentés par le CMH de
Classe I et de 12 à 15 aminoacides pour les peptides présentés par le CMH de Classe II.

Les cellules obtenues par la méthode selon l'invention chargées de manière homogène ou quasihomogène (plus de 90% des peptides endogènes sont détachés par traitement en milieu acide) avec un peptide donné peuvent devenir des cellules présentant l'antigène avec une efficacité élevée.

La méthode selon l'invention est mise en oeuvre sur toute source de cellules lymphoïdes de préférence sur des lymphocytes de sang humain périphérique, des cellules spléniques humaines ou des cellules de toute autre origine (sang du cordon, placenta,...), en raison de ce que certaines d'entre elles sont déjà des cellules présentant l'antigène "professionnelles", par exemple les cellules dendritiques et par conséquent deviendront après l'étape de "stripping" et de chargement avec un peptide antigène spécifique des cellules présentant l'antigène avec une grande efficacité.

L'invention a également pour objet une population de cellules vivantes non tumorales de mammifères, notamment d'origine humaine, notamment de cellules spléniques, de lymphocytes de sang périphérique, de cellules de sang du cordon ou du placenta, caractérisée en ce que les cellules présentent à leur surface une densité d'un même peptide exogène spécifique associé aux molécules du CMH et de même restriction allélique que celles-ci substantiellement supérieure à celle de cellules correspondantes exprimant ledit peptide exogène associé aux molécules du CMH à l'état natif, les molécules du CMH pouvant être de Classe I classiques, Classe
I non classiques ou Classe Il.

Avantageusement, les cellules selon l'invention comprennent une quantité de molécules du CMH supérieure d'un facteur d'environ 10, de préférence environ 100 et jusqu'à plus de 1000 pour les peptides de faible affinité par rapport aux cellules présentant ces peptides à l'état natif.

Ainsi, les cellules comprenant 106 molécules du CMH peuvent comprendre au moins 105 molécules dudit peptide exogène associé aux molécules du CMH et avantageusement de 105 à 10 molécules dudit peptide, de préférence 9.105 molécules dudit peptide.

L'invention a également pour objet un mélange de cellules comprenant une population telle que définie ci-dessus.

Cette population peut être utilisée en tant que composition thérapeutique afin de stimuler la production de lymphocytes cytotoxiques contre un antigène bactérien, viral, parasitaire ou tumoral ou du soi immunologique, chez un patient atteint d'une infection, d'une affection tumorale ou auto-immune, pour lesquelles on dispose de peptides antigéniques identifiés susceptibles de se lier au CMH.

Des exemples d'affections virales sont celles causées par le VIH ou l'influenza. Un exemple d'affection d'origine bactérienne est la tuberculose. Un exemple d'affection parasitaire est le paludisme. Un exemple d'affections tumorales est consituté par les mélanomes.

Elle peut également être utilisée pour le traitement de maladies autoimmunes pour lesquelles l'idiotype a été caractérisé, notamment le Lupus erythémateux disséminé ou la polyarthrite rhumatoïde.

Dans ce cas, l'antigène spécifique sera un antigène d'idiotype de cellules B.

L'invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique d'un hôte atteint d'une affection pour le traitement de laquelle intervient une stimulation de lymphocytes cytotoxiques, notamment une affection infectieuse, tumorale ou auto-immune, caractérisée en ce que l'on prélève un échantillon de cellules de l'hôte comprend des molécules du CMH, par exemple de sang périphérique ou de cellules spléniques de l'hôte, que l'on soumet à un "stripping" conformément à l'invention en présence d'un peptide antigénique spécifique de l'affection à traiter susceptible de se lier aux molécules du CMH et en ce que l'on réinjecte l'échantillon composé d'une population de cellules présentant une densité élevée dudit peptide exogène antigénique spécifique associé aux molécules du CMH audit hôte, afin d'obtenir la prolifération et l'activation de lymphocytes cytotoxiques spécifiques dudit peptide antigénique.

Avantageusement, on injecte à l'hôte une quantité d'environ 104 à 109 cellules fortement chargées en peptide exogène d'intérêt.

Dans la mesure où les cellules injectées à l'hôte sont des cellules autologues, cette méthode permet de s'affranchir des contingences alléliques liées au CMH (système HLA chez l'homme), pour autant qu'au moins un peptide présentable par au moins un des allèles du CMH soit connu. Si un tel peptide n'est pas connu, des méthodes alternatives possibles consistent à mettre la population de cellules de l'hôte en présence d'un mélange de peptides antigéniques, au moins un des peptides du mélange étant susceptible d'être présenté par les molécules du CMH, ou de mettre les cellules de l'hôte en présence des produits de digestion tryptique d'un polypeptide ou d'une protéine, et à charger les molécules du CMH "vides" avec ces peptides. Ces peptides peuvent éventuellement être non optimaux. Dans ce cas, après leur liaison aux molécules du CMH, la partie non liée peut être clivée, par digestion, à l'aide de protéases appropriées bien connues de l'homme du métier.

Un autre avantage de cette méthode est qu'il n'est pas nécessaire de mettre en oeuvre une étape supplémentaire de purification des rares cellules présentant l'antigène "professionnelles".

On décrira ci-après en détail des exemples de réalisation de l'invention mettant en oeuvre des peptides présentables par le CMH de la Classe I en se rapportant aux figures annexées sur lesquelles
- la Figure 1 représente les résultats de la liaison d'une banque peptidique à des cellules P815 de souris avant (colonne 1) et après traitement (colonne 2) selon l'invention ;
- la Figure 2 représente les résultats de la liaison d'une banque peptidique à des cellules RMA-S traitées selon l'invention
- la Figure 3 représente les résultats de l'activation d'un hybridome de lymphocytes T par des cellules P815 traitées selon l'invention
- la Figure 4 représente les résultats d'induction primaire de CTL à partir de splénocytes de souris naïves
- la Figure 5 représente les résultats in vivo d'inhibition de la croissance tumorale obtenus avec des cellules traitées selon l'invention ;
- la Figure 6 représente les résultats d'induction primaire de CTL à partir de sang périphérique humain.

EXEMPLES
On donnera ci-après un tableau décrivant les caractéristiques des peptides exogènes utilisés dans les exemples.

<tb> <SEP> PEPTIDE <SEP> SEQUENCE <SEP> RESTRICTION <SEP> REFERENCE
<tb> Cw3 <SEP> RYLKNGKETL <SEP> Kd <SEP> [Romero, <SEP> 1991 <SEP> (3) <SEP>
<tb> NP <SEP> TYQRTRALV <SEP> Kd <SEP> [Rotzschke, <SEP> 1990 <SEP> (4) <SEP>
<tb> P198 <SEP> KYQAVTTTL <SEP> Kd <SEP> [Engelhard, <SEP> 1994 <SEP> (5)]
<tb> Ova8 <SEP> SIINFEKL <SEP> Kb <SEP> [Engelhard, <SEP> 1994 <SEP> (5)1
<tb> P1A <SEP> LPYLGWLVF <SEP> Ld <SEP> [Léthé, <SEP> 1992 <SEP> (6) <SEP>
<tb> VSV <SEP> RGYVYQGL <SEP> Kb <SEP> [Engelhard, <SEP> 1994 <SEP> (5) <SEP>
<tb> Gag <SEP> QMKDCTERQ <SEP> HLA-A2 <SEP> [Falk, <SEP> 1991 <SEP> (7)1
<tb> Env <SEP> LWVTVYYGV <SEP> HLA-A2 <SEP> [Falk, <SEP> 1991 <SEP> (7)] <SEP>
<tb> Pol <SEP> ILKEPVHGV <SEP> HLA-A2 <SEP> [Falk, <SEP> 1991 <SEP> (7)1 <SEP>
<tb>

Les peptides étaient radiomarqués par iodation catalysée par la chloramine T.

EXEMPLE 1
Préparation de cellules de mastocytoces de
CMH H-2 Kd chargés en peptides exogènes
La lignée cellulaire utilisée était la lignée de cellules de mastocytome P815 (H-2d) (ATCC TIB64).

L'essai mis en oeuvre était un essai de liaison quantitative de peptides Kd-restreints radiomarqués provenant d'une banque peptidique décrite par Abastado (8).

Les cellules P815 (107) ont été traitées pendant 30 secondes avec un tampon de "stripping" (0,13
M acide citrique, 66 mM Na2H P04, 150 mM NaCl, 17 pg/ml de rouge phénol) contenant 4 uM de la banque de peptides radiomarqués, en l'absence ou en présence de peptide Cw3 ou VSV (40 uM chacun).

Après avoir ajusté le pH à neutralité par addition goutte à goutte d'une solution saturée de
Na2HPO4 (300 ,ut), les cellules ont été lavées à trois reprises avec un tampon phosphate salin afin d'éliminer les peptides non liés, lysées sur de la glace pendant 5 minutes dans du Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1 mM PMSF. Les noyaux ont été séparés par centrifugation à 15000 g pendant 10 minutes et les molécules Kd immunoprécipitées avec l'anticorps monoclonal SF1-1.1.1 (ATCC HB159).

Comme représenté à la Figure 1, les cellules traitées (Colonne 2) ont lié deux fois plus de peptide que les cellules non traitées (colonne 1). Le peptide CW3 (Kd restreint) présent en un excès de 10 fois pendant le traitement entrait en compétition pour la liaison de la banque peptidique aux cellules P815 (col. 3) à la différence du peptide VSV (Kb-restreint) (col. 4).

Ces résultats montrent que le "stripping" des peptides des molécules du CMH de Classe I ne fait pas disparaître leur capacité à lier des peptides et que l'augmentation de la liaison du peptide conserve la spécificité allélique.

EXEMPLE 2
Préparation de cellules de lymphomes de CMII H2b chargées eu peptide exogène
La lignée de cellules RMA-S (Lijunggren et al. (9) est un lymphome à lymphocytes B présentant une mutation dans le gène Tap2.

Dans cette lignée de cellules, les peptides dérivés des peptides synthétisés par la voie endogène ne sont pas transportés dans la lumière du reticulum endoplasmique et les molécules du CMH de Classe I ne sont pas chargées avec des peptides de forte affinité.

En conséquence, les molécules du CMH de
Classe I qui atteignent la surface cellulaire sont thermolabiles. A 37 C, les cellules RMA-S expriment très peu de molécules de Classe I à leur surface, mais l'expression peut être induite en cultivant des cellules
RMA-S à 26 C ou en les mettant à incuber avec des peptides de forte affinité.

Les cellules RMA-S ont été cultivées pendant 16 heures à 26 C en présence de 2 pM du peptide VSV. Ce peptide, dérivé de la protéine G du Virus de la Stomatite
Vésiculaire, se lie avec une forte affinité aux molécules
Kb, mais non aux molécules Db. Comme représenté à la
Figure 2, ces conditions de culture induisent un niveau élevé d'expression de Kb, mais non de Dd (non représenté).

Les cellules ont été traitées comme précédemment (Exemple 1) en présence ou en absence de différents peptides (20 Nit), puis lavées et incubées dans un milieu de culture (RPMI complet) pendant 1 heure à 37"C, et l'expression de Classe I a été testée par cytométrie de flux après marquage des cellules par immunofluorescence indirecte à l'aide de l'anticorps monoclonal 5F1 (Sherman et al. (10)) spécifique de Kb et un anticorps polyclonal IgG de chèvre anti-souris marqué à la fluorescéine (Immunotech, Marseille). La Figure 2 montre que le traitement en milieu acide abolit complètement l'expression de Kb à un niveau comparable à celui des
RMA-S cultivées à 37"C. Lorsque le peptide VSV était présent pendant le traitement en milieu acide, un niveau élevé d'expression de Kb était observé, ce niveau étant en fait supérieur à celui obtenu avec des cellules non traitées, ce qui suggère que certains des complexes Kb- peptide exprimés sur les cellules non traitées se dissocient pendant les deux heures d'incubation à 37 C.

En revanche, lorsque le peptide CW3 (se liant à Kd) était présent durant le traitement, le profil d'expression de
Kb était superposable à celui obtenu en absence de peptide.

Ces résultats montrent que le traitement en milieu acide détache les peptides des molécules du CMH de Classe I et confirment que de telles molécules du CMH de Classe I traitées en milieu acide peuvent lier des peptides et que cette liaison est spécifique d'allèle.

EXEMPLE 3
Aptitude à présenter l'antigène de cellules traitées selon l'invention
Bien que les cellules possédant des molécules
Kd et Kb traitées en milieu acide étaient capables de lier des peptides d'une manière spécifique et étaient efficacement reconnues par des anticorps sensibles à la conformation (Exemple 1 et Exemple 2), il restait possible que les complexes CMH-peptide obtenus de cette manière présentaient une structure légèrement différente ou n 'étaient pas entièrement fonctionnels en ce qui concerne la présentation du peptide.

Les inventeurs ont donc étudié la reconnaissance de cellules traitées en milieu acide en présence de peptide exogène par un lymphocyte T spécifique.

Les cellules P815 ont été traitées en milieu acide en présence d'un excès de peptide Cw3 comme décrit précédemment et testées pour leur capacité à activer l'hybridome de lymphocytes T 9.4 spécifique de Cw3 obtenu en fusionnant le clone de CTL CW3/1.1 (Maryanski et al.

(11)) et l'hybridome de lymphocytes T58a- (Letourneur et al. (12)).

A cet effet, 105 lymphocytes T de l'hybridome ont été cultivés dans des plaques à 96 puits avec la quantité d'APC (cellules présentant l'antigène) requise pendant 48 heures. Les surnageants de culture étaient réunis et testés pour évaluer la teneur en IL-2 en fonction de leur aptitude à maintenir en culture une lignée de CTL-L dépendante de 1'IL-2. La prolifération des cellules CTL-L a été mesurée par l'incorporation de thymidine tritiée.

A titre de témoin, des cellules P815 non traitées ont été incubées en présence de la même concentration du peptide Cw3 et testées par leur aptitude à activer l'hybridome 9.4.

Comme représenté à la Figure 3, 300 cellules
P815 traitées en milieu acide/puits étaient suffisantes pour stimuler la secrétion d'IL-2 par l'hybridome 94 (col. 2) alors que le même nombre de cellules stimulatrices non traitées ne procuraient qu'un signal de fond (comparer col. 2 et col. 2). Une quantité de trois à quatre fois supérieure de cellules P815 non traitées était nécessaire pour obtenir un niveau de stimulation similaire de l'hybridome 9.4 (comparer col. 2 et 4).

EXEMPLE 4
Induction primaire de CTL par des cellules autologues obtenues selon 1 'invention
Les peptides suivants ont été utilisés : un peptide Kb-restreint : Ova8 de l'ovalbumine et trois peptides Kd-restreints : NP, CW3 et 0198 dérivés de la nucléoprotéine duvirus influenza, de HLA-CW3 (Maryansky et al. (11)) et de l'antigène variant P815, respectivement. Des Con-A blasts de souris DBA/2 et C57 bI/6 naïves obtenus par incubation pendant deux jours de 5 x 106 splénocytes dans 15 ml RPMI 1640 additionné de 5% de sérum foetal de veau et 5 ,ug/ml de Concanavaline A ont été traités comme décrit précédemment en présence des peptides appropriés (20 pM) et co-cultivés en présence de splénocytes syngéniques.

Après 5 jours, la prolifération de lymphocytes cytotoxiques a été testée sur des cellules cibles marquées au Cr51. Comme représenté sur la Figure 4 (en haut à gauche), les splénocytes de souris C57/B16 naïves cultivées en présence de blasts traités selon l'invention chargés avec Ova8, lysaient les cellules RMA-S (H-2b) en présence d'Ova8 mais non en son absence. Les cellules
P815, même en présence d'0va8, n'étaient pas lysées. De façon similaire, des splénocytes de souris DBA12 naïves cultivés en présence de blasts traités selon l'invention chargés avec CW3, NP ou P198 lysaient les cellules P815 transfectées avec HLA-CW3 (P815-CW3) chargées avec le peptide NP ou le variant P198 Tum de P815, respectivement.

Des cellules P815 non transfectées, non chargées ou de type sauvage n'étaient pas lysées (Figure 4, en haut à droite, et en bas, à droite et à gauche).

Ces résultats montrent que les blasts traités selon 1 invention chargés avec des peptides génèrent de façon efficace des CTL primaires in vitro qui sont spécifiques du CMH et du peptide d'intérêt.

EXEMPLE 5
Essai d'immunisation primaire in vivo chez la souris
Des conA blasts (2 x 107) de souris C57BL/6 naïves, qui ont été traités comme décrit ci-dessus en présence de 20 NiM d'Ova8 ou seulement chargés avec Ova8 sans avoir été traitées en milieu acide ont été injectés par voie péritonéale aux mêmes souris. Après 7 jours, on a injecté aux souris 10' cellules du transfectant EG7 (Moore et al. (13)). Ces cellules sont dérivés du lymphome murin EL4 (H-22) (ATCC TIB 39) par transfection de l'ADNc d'ovalbumine de poulet. Des souris témoins ont été immunisées avec 2 x 107 cellules EG7 irradiées, connues pour générer des CTL spécifiques d'Ova8 in vivo (Moore et al. (13)).

Comme réprésenté à la Figure 5A, des souris auxquelles avaient été injectés des blasts traités selon l'invention ont rejeté rapidement la tumeur EG7. En fait, le rejet était plus rapide que pour les souris immunisées avec la tumeur irradiée elle-même. Des souris n'ayant reçu aucune injection ou auxquelles on avait injecté des conA blasts chargés avec le peptide en l'absence de traitement en milieu acide, n'ont pas rejeté la tumeur pendant ladurée de l'expérience (30 jours).

Des études supplémentaires ont été réalisées afin de déterminer si la méthode selon l'invention pouvait être efficace pour immuniser un animal contre une tumeur syngénique, en l'occurence P815 (un système plus physiologique). A cet effet, on a injecté à 4 reprises sur 3 jours 107 conA blasts traités comme décrit cidessus et chargés avec le peptide P1A (système tumoral
A, B, Léthé et al. ; (6)) par voie sous-cutanée.

On a ensuite injecté à ces souris 106 cellules tumorales P815. Comme représenté sur la Figure 5B, ces souris ont rapidement rejeté la tumeur. Des souris ayant reçu des injections de blasts non traités n'ont pas été protégées, tandis que les souris ayant reçu des cellules P815 irradiées ont rejeté la tumeur.

EXEMPLE 6
Résultats d'induction primaire de CTL chez l'homme
Des pHA-blasts dérivés de sang humain périphérique de donneurs sains HLA A2-1 ont été utilisés.

Les lymphocytes de sang périphériques (PBL) ont été isolés sur un gradient Ficoll, Hypaque. Les pHA blasts ont été obtenus par incubation pendant 2 jours de 3 x 106 PBL dans 15 ml de RPMI 1640 additionné de 20% de sérum foetal de veau, 1 mM de pyruvate de sodium, de phytohémagglutine (PHA) (dilution au 1/1000, Difco) et 10-8 d'acétate-myristate de phorbol (PMA). Les CTL humains primaires ont été obtenus dans une culture mixte de lymphocytes. Les PBL (106) de donneurs VIH-séronégatifs ont été mélangés avec 106 blasts autologues traités comme décrit précédemment, chargés avec 20 uM de peptide
Gag ou Env. du VIH dans 2 ml de RPMI 1640 additionné de 1 mM de pyruvate de sodium en présence de sérum foetal de veau.

Après 5 jours de co-culture en présence des
PBL naïfs autologues, l'activité CTL primaire a été détectée.

Comme représenté à la Figure 6A, les PBL cocultivés avec les PHA-blasts traités selon l'invention en présence du peptide Gag lysaient les lymphocytes T2 chargés avec Gag, mais non les lymphocytes T2 chargés avec un peptide indifférent (Pol). De manière analogue, les PBL co-cultivés avec les PHA blasts traités en présence d'Env, lysaient spécifiquement les lymphocytes
T2 chargés avec Env (Fig. 6B).

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. NAIR S. et al., 1992, J. Exp. Med. 175:609 2. OJCIUS D. et al., 1993, J. Immunol.

3. ROMERO P. et al., 1991, J. Exp. Med. 174:603 4. ROETZSCHKE 0., 1990, Nature (London) 348:252 5. ENGELHARD V., 1994, Curr. Opin. in Immunol. 6:13 6. LETHE B. et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22:2283 7. FALK K. et al., 1991, Nature 351:290 8. ABASTADO J.-P. et al., 1993, Eur. J. Immunol.

23:1776 9. LJUNGGREN H.-G., 1985, J. Exp. Med. 162:1745 10. SHERMAN L. et al., 1981, Immunogenetics 12:183 11. MARYANSKI J. et al., 1986, J. Immunol. 136:4340 12. LETOURNEUR F. et al., 1989, Eur. J. Immunol. 19:2269 13. MOORE M. et al., 1990, Cell 60:397

Claims

REVENDICATIONS

1. Méthode pour générer une population de cellules vivantes présentant à leur surface une forte densité d'un peptide exogène spécifique associé aux molécules du CMH de Classe I classiques et non classiques, caractérisée en ce que l'on traite une population de cellules natives présentant des molécules du CMH chargées en peptides d'origine endogène et éventuellement exogène, pour en détacher lesdits peptides, et en ce que l'on charge les molécules du CMH avec ledit peptide exogène spécifique de même restriction allélique que les molécules du CMH.

2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les peptides associés aux molécules du

CMH sont détachés desdites molécules par traitement en milieu acide à pH < 5 ou en milieu basique à pH > 9.

3. Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les molécules du

CMH sont de Classe I.

4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que le traitement est réalisé en milieu acide citrique tamponné à pH environ 3 pendant une durée comprise entre 10 secondes et 1 minute, de préférence pendant environ 30 secondes, en présence d'un excès du peptide antigénique spécifique.

5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le peptide exogène antigénique est un peptide de faible affinité pour les molécules du CMH de même restriction allélique.

6. Méthode selon la revendication 5, caractérisé en ce que le peptide exogène spécifique est un peptide antigénique, bactérien, parasitaire, viral ou tumoral.

7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les cellules sont des lymphocytes de sang humain périphérique, des cellules spléniques humaines, des cellules de sang du cordon ou des cellules du placenta.

8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que les cellules sont des cellules présentant l'antigène à l'état natif.

9. Population de cellules vivantes non tumorales de mammifères, notamment de cellules spléniques de lymphocytes de sang périphérique, de cellules de sang du cordon ou de cellules du placenta, d'origine humaine, caractérisée en ce que les cellules présentent à leur surface une densité d'un même peptide exogène spécifique associé aux molécules du CMH et de même restriction allélique que celles-ci substantiellement supérieure à celles de cellules correspondantes exprimant ledit peptide exogène associé aux molécules du CMH à l'état natif.

10. Population selon la revendication 9, caractérisée en ce que les cellules comprennent au moins 10% et de préférence au moins 90% de molécules du CMH alléliques chargées avec le peptide spécifique.

11. Population selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que le peptide exogène est un peptide de faible affinité pour les molécules du CMH, notamment un antigène viral ou tumoral.

12. Population selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que les cellules sont des cellules présentant l'antigène à l'état natif.

13. Population selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par la méthode définie à l'une quelconque des revendications 1 à 8.

14. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend une population de cellules selon l'une quelconque des revendications 9 à 13.

15. Composition thérapeutique selon la revendication 14, destinée à être administrée à un être humain déterminé, caractérisée en ce que la population de cellules est constituée de cellules autologues dudit être humain.