WO1999045028A1 - Anticorps monoclonaux specifiques de la proteine esm-1, et utilisation de ces anticorps pour la detection de la proteine esm-1 - Google Patents

Anticorps monoclonaux specifiques de la proteine esm-1, et utilisation de ces anticorps pour la detection de la proteine esm-1 Download PDF

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WO1999045028A1
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antibodies
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Philippe Lassalle
Geneviève MARCHANDISE
Gwenola Kervoaze
André-Bernard TONNEL
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Institut Pasteur De Lille
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to monoclonal antibodies specific for the ESM-1 protein.
  • endothelial cells play a particularly important role vis-à-vis leukocytes.
  • the migration of leukocytes requires signal molecules, which are present in endothelial cells.
  • the emission of these signal molecules is under the control of cyto ines.
  • the proteins ICAM-1 and ICAM-2, and Nnterleukin-6 are thus strongly expressed in endothelial cells in the presence of cytokines.
  • the identification of specific molecules of endothelial cells can therefore contribute to a better understanding of the interactions between leukocytes and endothelial cells, and make it possible to find new therapies for diseases linked to the migration of leukocytes, in particular inflammatory diseases.
  • This complementary DNA sequence contains an open reading phase of 552 nucleotides, as well as a non-transcribed region of 1398 nucleotides. A sequence of 184 amino acids has been deduced therefrom. It is shown in Figure 1 of this article.
  • polyclonal antibodies by immunizing a rabbit with the purified ESM-1 protein is also described in this article.
  • Polyclonal antibodies generally have many disadvantages.
  • the polyclonal antibodies described in this article probably recognize various antigenic determinants of the protein with more or less strong affinities and specificities. As a result, preparations containing these antibodies exhibit low sensitivity.
  • the protein ESM-1 which is a human protein, could only be obtained in an appropriate quantity by expression of the gene in a bacterium, that is to say in a prokaryotic system, and not in eukaryote.
  • this protein is rich in cysteine which makes it difficult to obtain monoclonal antibodies recognizing its unreduced form.
  • the inventors therefore set out to find a protocol enabling monoclonal antibodies to be obtained which specifically recognize and with high affinity the human ESM-1 protein.
  • the present invention therefore relates to monoclonal antibodies characterized in that they specifically bind to at least one antigenic determinant, or epitope, of the protein ESM-1, as described in FIG. 1 of the article by LASSALLE and al. (1996, previously cited).
  • monoclonal antibodies can bind to various antigenic determinants of the ESM-1 protein.
  • a monoclonal antibody binds to the part of the ESM-1 protein comprised between the proline at position 79 and the cysteine at position 99 (antigenic determinant D1), of the peptide sequence of the protein ESM-1.
  • Antibodies directed against this part of the ESM-1 protein are particularly advantageous because they have a particularly high affinity.
  • preferential monoclonal antibodies are those which specifically bind to the part of the ESM-1 protein between glycine at position 159 and arginine at position 184 (antigenic determinant D3).
  • Antibodies specific for the antigenic determinant D3 can be obtained from the hybridoma lines 1-1942 (MEP14) and I-1943 (MEP19), deposited on November 19, 1997 with the Collection
  • the monoclonal antibodies specific for the antigenic determinant D1 can be obtained from the line 1-1944 (MEP21) deposited on 19 November 1997 with the National Collection of Culture of Microorganisms of the Pasteur Institute (CNCM).
  • D2 between serine 119 and valine 139 can be obtained from the line 1-1941 (MEP08) deposited on November 19, 1997 with the
  • the present invention further relates to conjugates consisting of a monoclonal antibody as defined above covalently linked to a molecule allowing its direct or indirect detection.
  • hybridomas secreting antibodies according to the present invention can be obtained by a process comprising the following steps:
  • hybridomas producing antibodies according to the present invention for their reactivity with respect to the fusion protein, consisting of part of the protein ESM-1 and part of an immunoglobulin (ESM-1g) , and possibly their lack of reactivity towards the fusion protein between a part of the ICAM-1 protein and a part of an immoglobulin (ICAM1-1g).
  • ESM-1 immunoglobulin
  • IAM1-1g immoglobulin
  • the antibodies according to the present invention can be used to detect the protein ESM-1, a protein exhibiting cross-immunoreactivity with ESM-1, or even fragments of these proteins.
  • the detection of these proteins can in particular be part of a more general diagnosis of diseases linked to leukocyte migration, and in particular of inflammatory diseases.
  • Such a method for detecting these proteins in a biological fluid can comprise the following steps:
  • the fluid is brought into contact with two monoclonal antibodies specific for two antigenic determinants of the protein ESM-1, advantageously specific for the antigenic determinants D3 and D1 respectively.
  • the biological fluid can be, in particular: a serum, a plasma, whole blood, urine, a cerebrospinal fluid, or cell supernatants or lysates.
  • the process used can advantageously be of the “sandwich” type.
  • the complex possibly formed can be demonstrated using an antibody, or a specific conjugate of the class or subclass of one of the monoclonal antibodies brought into contact with the fluid.
  • Another object of the present invention is such complexes, formed between the ESM-1 protein, or a protein exhibiting cross-immunoreactivity, or even a fragment thereof, and a monoclonal antibody according to the present invention.
  • the process defined above can advantageously be carried out using a suitable kit comprising at least one antibody or a conjugate according to the present invention in an appropriate form.
  • a suitable kit comprising at least one antibody or a conjugate according to the present invention in an appropriate form.
  • the use of antibodies according to the present invention has made it possible to demonstrate in the supernatants of certain cell lines expressing the protein ESM-1, proteins having a cross immunoreactivity with the protein ESM-1, as defined by LASSALLE et al. in their 1996 article cited above, and having a different molecular weight from the protein ESM-1.
  • the present invention therefore also relates to proteins of molecular weights different from the ESM-1 protein as described in the article by LASSALLE et al., And having a cross-immunoreactivity with the ESM-1 protein.
  • the present invention therefore relates to a protein, reacting specifically with a monoclonal antibody specific for one of the antigenic determinants D1 or D2, characterized in that it has a molecular weight of between approximately 15 and 15.5 kD, in non-denaturing condition.
  • the present invention also relates to a protein of molecular weight between 44 and 56 kD as defined above, glycosylated by at least one N-acetyl galactosamine residue, and in particular by a chondroitin sulfate residue.
  • a protein of molecular weight between 44 and 56 kD as defined above glycosylated by at least one N-acetyl galactosamine residue, and in particular by a chondroitin sulfate residue.
  • such a protein is glycosylated on only one of its amino acids, and even more preferentially on a serine.
  • Such a protein can also be characterized in that it comprises at least partially a part of the sequence described in FIG. 1 of the article by LASSALLE et al. (1996, previously cited).
  • the CHO-K1-ESM line (deposit no. 1-1970) is a line of hamster ovary cells stably expressing the protein ESM-1. This line was established by transfection of the CHO-K1 cell line (ATCC deposit number: CCL-61) with the plasmid pcDNA3-ESM (LASSALLE et al., 1996, previously cited), then selected.
  • the cell line 293-ESM (deposit no.
  • the A549-ESM line (deposit no. 1-1972) is a human epithelial line stably expressing the protein ESM-1. This line was established by transfection of the human epithelial line deposited with the ATCC Collection under the number CCL185, with the plasmid pcDNA3-ESM and then selected.
  • These proteins and antibodies can be used in the treatment, or diagnosis, of diseases linked to leukocyte migration, and in particular in the treatment of inflammatory diseases.
  • the antibodies according to the present invention can be used to measure the presence of ESM-1 in the blood or urine of patients who have had a kidney transplant.
  • the present invention further relates to medicaments containing such antibodies and proteins, and the use of such antibodies and proteins for the manufacture of medicaments for the treatment of diseases linked to leukocyte migration, and in particular for the treatment of diseases inflammatory, especially chronic inflammatory diseases.
  • FIG. 1 illustrates the detection of anti-ESM-1 antibodies by the use of ESM-1g protein.
  • the plates coated with human anti-immunoglobulin G antibodies (anti-hlgG) were incubated with CHO or HEK293 cell supernatants, supernatants containing ESM-1g, or supernatants containing 3D-ICAM1-1g.
  • FIGS. 2A and 2B illustrate the characterization and the mapping of the epitopes by the anti-ESM-1 monoclonal antibodies.
  • FIG. 2A represents an acrylamide gel stained with Coomassie blue, purified GST-ESM peptides.
  • FIG. 2B schematically represents the protein ESM-1, the peptide ESM-1 FO used for the immunization as well as the peptides F1, F2, F3 and F4 used for the mapping of the epitopes.
  • Figures 3A to 3D illustrate the quantification of ESM-1 in various cellular models expressing it.
  • the measurements in the supernatants correspond to the dark squares, while the measurements carried out in the cell lysates correspond to the dark circles.
  • Figure 3A illustrates the results obtained with HUVEC cells conditioned with growth factors (round or white squares) or unconditioned (round or dark squares).
  • FIGS. 3B, 3C and 3D correspond respectively to the COS-ESM, HEK-ESM and CHO-ESM cells.
  • Figures 4A to 4C illustrate the effect of cytokines (TNF ⁇ , IFN ⁇ and
  • FIGS. 4A and 4B relate to the expression of ESM-1 respectively in the supernatants and the lysates of HUVEC cells
  • FIG. 4C relates to the expression of ICAM-1 in the lysates of HUVEC cells.
  • FIGS. 5A to 5D represent immunotransferts of ESM-1 in different cell models expressing this protein.
  • Figure 5A is a transfer of crude supernatant from HEK-ESM and CHO-ESM cells.
  • FIG. 5B relates to the immunoprecipitation of supernatants from the COS-ESM, CHO-ESM and HEK-ESM cells.
  • FIG. 5C relates to the immunoprecipitation of lysates of different cell types.
  • FIG. 6A to 6E illustrate immunostaining of cells and in the lungs, kidneys and intestines.
  • FIG. 6A represents COS cells ( ⁇ 100).
  • FIG. 6B illustrates the cytoplasmic staining of HUVEC cells (x 1000).
  • FIG. 6C represents normal pulmonary tissues (arrow head: capillary endothelial cells, complete arrow: bronchial epithelial cells) (x 250).
  • FIG. 6D represents normal kidney tissues (arrow: distal tubules; G: capillaries of the glomeruli, x 400).
  • FIG. 6E represents normal intestinal tissues (arrow heads: capillary endothelial cells; x 100). 10
  • Human endothelial cells derived from the umbilical vein (HUVEC) by treatment with collagenase were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 20% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 10 ⁇ g / ml heparin and 25 ⁇ g / ml of endothelial cell growth supplement marketed by SIGMA.
  • the HUVEC cells were cultured in culture plates, the wells of which were covered with 0.5% gelatin. At confluence, HUVEC cells were washed and incubated overnight with the medium containing 20% fetal calf serum.
  • the HUVEC cells were washed once and incubated in RPMI 1640 containing 5% of fetal calf serum.
  • the following cytokines were then added to the cell cultures: TNF ⁇ (200 U / ml, Genzyme), gamma interferon (IFN ⁇ ) (1000 U / ml, Genzyme), Interleukin beta 1 (IL-1 ⁇ ) (10 U / ml, Genzyme).
  • TNF ⁇ 200 U / ml, Genzyme
  • IFN ⁇ gamma interferon
  • IL-1 ⁇ Interleukin beta 1
  • the cell supernatants were clarified by centrifugation and stored at -20 ° C to allow the determination of ESM-1.
  • SV1 cells were cultured in RPMI 1640 containing 2 mM L-glutamine and 10% fetal calf serum (1992, LASSALLE et al., Eur. J. immunol. 22, 425-431).
  • HEK293 cells were maintained in complementary DMEM medium with 10% horse serum.
  • the COS cells were maintained in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum.
  • HUVEC cells and lines 1 1 For the determination of the quantity of ESM-1 in cell supernatants and in cell lysates, HUVEC cells and lines 1 1
  • ESM-1 expressing ESM-1 were cultured in 35 mm culture plates. At confluence, the cells were washed three times and 2 ml of fresh medium were added during the period ranging from 4 hours to 3 days of culture. At different times, the cell supernatants were centrifuged and allowed to freeze in order to allow the evaluation of the quantity of ESM-1.
  • the adherent cells were washed three times with HBSS and lysed for 30 minutes at 4 ° C. with stirring in 1 ml of cold PBS buffer containing 0.5% NP40 and antiproteases (Complete, Boehringer).
  • ESM-1 The preparation of ESM-1 has been described by LASSALLE et al. (1996, previously cited).
  • ESM-1 peptide is hereinafter referred to as Fo. 12
  • the nucleotide constructs allowing ESM-1-Ig and 3D-ICAM1-1g to be obtained were obtained in the following manner.
  • the plasmid containing the Fc fragment of human IgGI was supplied by Doctor R. Devos (Roche Research Gent, Gent, Belgium). It has been described by (ELISON et al. (1982), Nue. Acids Res.10, 4071 -4079).
  • the plasmid was digested with Eag I and Pst I and subcloned into the vector pBluescript SK sold by Stratagene.
  • the construct was then digested with HIND III and EcoR I and ligated with the DNA fragment coding for ESM-1 obtained by PCR, which contains the entire coding sequence and which is flanked by the HIND III and EcoR I sites respectively at the ends. 5 'and 3' (primer meaning 5'-CTCAAGCTTCCCACCAGCAAAGACCAC; antisense primer ⁇ '-TTTGAATTCCGCCGCTGGGATTTAACCATTTCCT).
  • the merged regions have been sequenced to confirm that the reading frame is correct.
  • FP1 ⁇ '-TATGAATTCATGCAAAGACTGTCCCTACGGC
  • FP2 5'-TATGAATTCAGGCATCTGTGACAGGGGGAC
  • FP3 5'-ATAGAATTCAGTAACCAAGTCTTCCAACAGA.
  • FP4 5'-AAAGAATTCAGGCAATATTGTGAGAGAAGAAGT; antisense primer
  • the GST-ESM fusion proteins were produced in the Escherichia coli DH1 strain, purified on a column of glutathione sepharose and eluted with 5 mM reduced glutathione. This purification process made it possible to obtain between 1.2 and 1.6 mg of ESM-1 fusion protein per liter of bacterial culture.
  • the ESM-1 construction contained in the plasmid pcDNA3 is that described in the article by LASSALLE et al., (1996 previously cited).
  • human immunoglobulin (IgG) (5 ⁇ g / ml, Sigma) diluted in carbonate buffer (0.1 M Na2CO3, 0.1 M NaHCO3, pH 9).
  • the complexes were revealed by antibodies labeled with peroxidase directed against both rabbit and mouse immunoglobulins (Sigma), then by staining with OPD in a buffer (0.1 M Na2HPO4.0 , 1 M NaH2PO4, 0.1 M citric acid, pH 5.5), containing 0.025% hydrogen peroxide.
  • the coloring reaction is stopped by adding a 4 N solution of hydrochloric acid.
  • the purified oligonucleotide constructs containing ESM-1g, protein 3D-ICAM1-1g, and ESM-1 were subcloned into the vector pcDNA3 and then transferred into CHO and HEK293 cell lines with iipofectamine as recommended by the manufacturer, GIBCO BRL. After a week of selection with 500 ⁇ g / ml of G418 (GIBCO BRL), the cells were subcloned at the rate of 0.5 cells per well in four culture plates in the presence of G418. 15
  • mice Immunization of mice, cell fusion, screening of hybridomas and subcloning.
  • mice were immunized with the 14 kDa peptide of ESM-1, obtained from Escherichia coli (10 ⁇ g per mouse). They were restimulated three times by injection into each of the legs.
  • mice were tested in the ELISA sandwich test, as a second antibody both against ESM-1g and against 3D-ICAMI-1g.
  • a mouse was re-stimulated three weeks later.
  • cells from inguinal lymph nodes (10 8 cells) were fused with cells of the sp2 / 0 myeloma cell line by addition of PEG 1500 (Boehringer), as recommended by the manufacturer. They were then seeded in culture plates in a medium containing RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum, 50 lU / ml of human interleukin-6 supplemented, hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT, Gibco BRL).
  • hybridomas Two weeks later, the supernatants of the hybridomas were screened for the presence of anti-ESM-1 antibodies by ELISA on ESM-1g, then again screened for the lack of reactivity against the 3D-ICAM1-1g protein. . Twenty-three hybridoma cell lines were selected. Several of them have been subcloned and the antibodies produced have been characterized. 16
  • the isotype of each monoclonal antibody was determined using two commercial assay tests (Isostrip, marketed by
  • Epitope mapping was performed by ELISA using the GST-ESM-1 fusion proteins used as fixed antigens.
  • hybridomas were cultured in a conditioned medium without fetal calf serum (CHO-SFM II marketed by GIBCO BRL).
  • the culture supernatants were passed through a protein A-sepharose column specific for the IgG2a monoclonal antibodies and a protein G sepharose column specific for the IgG1 monoclonal antibodies (Pharmacia).
  • the anti-ESM-1 antibodies were eluted with 0.1 M glycine at pH 2.7, and immediately neutralized with 3 M Tris buffer. Eluted antibodies were then dialyzed in PBS buffers and concentrated using a Centricon 30 (Amicon). The total amounts of protein were confirmed by assay of Bio Rad protein. The purity was checked by staining with Coomassie blue SDS-PAGE, and the anti-ESM-1 activity by ELISA assay on ESM-1g.
  • the purified anti-ESM-1 antibodies were stored at -20 ° C. until they were used. 17
  • the cell lysates were clarified either by centrifugation (12,000 g for 10 minutes) or by filtration through 0.45 ⁇ m filters (Millipore).
  • Immunodetection was performed using the ECL detection kit (Amersham), following the manufacturer's recommendations.
  • Primary antibodies consist of MEP 04 and MEP-21.
  • MEP21 is obtained from the hybridoma line 1-1944 deposited with the CNCM.
  • the MEP 04 antibody can advantageously be replaced by the MEP 14 antibody obtained from the line 1-1942 deposited with the CNCM.
  • concentrations of each of these primary antibodies are 1 ⁇ g / ml in PBS buffer, containing 0.1% of Tween 20 detergent. They were incubated for one hour at room temperature.
  • the second antibody is an affinity purified mouse immunoglobulin anti-Fc fragment labeled with peroxidase (Sigma). It was diluted to 1: 1000 (v: v), and incubated for one hour at room temperature.
  • MEP 19 (lgG1, K: directed against the antigenic determinant D3) and MEP 21 (lgG2a, K; directed against the antigenic determinant D1), produced respectively by the lines deposited under n ° 1-1943 and 1-1944 from the CNCM.
  • ELISA plates were covered overnight with the MEP19 antibody (100 ⁇ l / well or 5 ⁇ g / ml in carbonate buffer). The plates were then washed twice with PBS and saturated for one hour at room temperature with 200 ⁇ l / well of saturation buffer
  • the sensitivity of this test is 1-2 ng / ml.
  • the percentages of variation from one experiment to another, and within the same experiment are 17% (average of 11 independent experiences).
  • the samples to be tested were diluted in series in an ELISA buffer before the quantification of ESM-1. 20
  • the HUVEC cells obtained from the umbilical vein were subcultured in culture wells of staining slides.
  • COS-ESM cells transfected for 24 hours were subcultured on slides of the same type for 1 day.
  • the human lung and kidney sections were obtained from tissues surgically removed from localized tumors. The sample was immediately cut into small pieces, some being frozen in liquid nitrogen, others being fixed in 4% paraformaldehyde in cacodylate buffer, then coated in paraffin.
  • the monoclonal antibodies directed against the antigenic determinants 1, 2 and 3 gave similar results with regard to the cells fixed on the slides. On the other hand, the monoclonal antibodies directed against the antigenic determinant 1, in the tissue sections have been shown to give unsatisfactory results.
  • the cell sections frozen or fixed using PFA were brought into contact overnight with the primary antibody (1/50 dilution).
  • the sections were then incubated for 30 minutes with an anti-mouse or anti-rabbit IgG antibody conjugated with biotin (Dako).
  • the sections were incubated for 20 minutes, with peroxidase conjugated to avidin (Sigma) and then brought into contact with a chromogenic substrate (3-amino-9-ethyl carbazoy / H2O2). Gill's hematoxylin was used as a negative stain control.
  • ESM-1g eukaryotic ESM-1 labeled with the Fc fragment of human anti-ESM1 IgG
  • ESM-1g has been found to be detectable by polyclonal anti-ESM-1 antibodies in rabbits and mice, indicating that there are cross-reacting, non-dependent epitopes in ESM-1 host cells producing it, i.e. not dependent on Escherichia coli or eukaryotic cell lines.
  • the detection threshold for rabbit serum is high (between 0.3 and 0.4 optical density values) which does not allow dilutions of the supernatants containing ESM-lg to more than 1/800 (v / v) .
  • ESM-1 The recognition of ESM-1 seems to be specific, since the anti-ESM-1 sera do not react with the protein 3D-ICAM-1-lg, and the antibodies binding to ESM-1g are specifically inhibited by the preincubation of the anti-ESM-1 mouse serum, with cell supernatants containing ESM-1 or ESM-1-lg.
  • the anti-ICAM-1 monoclonal antibodies react specifically with the 3D-ICAM1-1g protein, but not with ESM-1g, which confirms the validity of the selection protocol for these monoclonal antibodies.
  • the 23 hybridomas having a positive reaction against ESM-1g did not react with 3-D-ICAM1-1g, which confirms a specific recognition of ESM-1.
  • MEP 01 and MEP 23 Two hybridomas, called MEP 01 and MEP 23, were selected.
  • GST-ESM fusion proteins in which the 20 amino acids of the N-terminal end correspond to the 23
  • the purified GST-ESM fusion proteins were used as the fixed antigen in an ELISA test.
  • GST, ESM-lg and 3D-ICAM1-lg were used as controls.
  • ESM-1 purified from Escherichia coli was used as the reference antigen to determine the best pair of monoclonal antibodies that can be used in a test. ELISA to quantify the ESM-1.
  • This quantification method is specific, since a dilution in 1007o of fetal calf serum or horse serum does not show any interference, and shows a sensitivity of 1-2 ng / ml.
  • the level of ESM-1 in the supernatants of HUVEC cells is between 1 and 20 ng / ml, depending on the culture conditions. In the presence of specific growth factors, such as endothelial cell growth supplements and heparin, a 2-3 fold increase in the level of ESM-1 is observed in cell supernatants, as illustrated in FIG. Figure 3A.
  • the HUVEC cells were conditioned in a medium without growth factor.
  • FIG. 4A shows that the HUVEC cells release ESM-1 and that this release is improved after addition of TNF ⁇ . 25
  • ILI ⁇ gives results similar to TNF ⁇ .
  • the ESM-1 content decreases as a function of time, due to the absence of growth factor in the medium, as illustrated in FIG. 4B.
  • TNF ⁇ Gamma Interferon
  • IFN ⁇ Gamma Interferon
  • interferon gamma to inhibit the release of ESM-1 is greatly amplified when it is combined with factor TNF ⁇ , resulting in an almost complete inhibition of release induced by TNF ⁇ , as shown in FIG. 4A.
  • the level of ICAM-1 was determined in the lysates of HUVEC cells in parallel with ESM-1.
  • TNF ⁇ and IFN ⁇ alone induce a significant increase in ICAM-1 content, as illustrated in FIG. 4C, but unlike ESM-1, ICAM-1 content increases synergistically in the presence of TNF ⁇ and IFN ⁇ , as shown in Figure 4C.
  • EXAMPLE 5 Immunoprecipitation of ESM-1: Identification of two intracellular and secreted forms of ESM-1.
  • ESM-1 is present in two forms with apparent molecular weights of 17 kDa and 17.5 kDa, under non-reducing conditions, as illustrated by the results in Figure 5C.
  • these two bands were also detected, but two other bands of lower molecular weight were also detected, around 15 and 15.5 kDa, as illustrated by the results in FIG. 5C .
  • ESM-1 In cell supernatants, the forms of ESM-1 appear different. In the crude supernatants of CHO-ESM and HEK-ESM cells, conditioned in a medium devoid of fetal calf serum, the size of ESM-1 was estimated between 45 and 55 kDa. It appears in the form of a broad band during Western Blots, as shown in Figure 5A.
  • ESM-1 In the supernatants of HUVEC and COS-ESM cells, the levels of ESM-1 are lower than those found in other cell lines expressing ESM-1, and require immunoprecipitation in order to detect ESM-1, which appears also as a major band between 45 kDa and 55 kDa, quite similar to that observed in the other cellular models ( Figures 5B and 5D).
  • the immunolabelling is cytoplasmic, with an important expression in the juxtanuclear region, which is in agreement with a Golgian distribution, as illustrated in FIG. 6A.
  • ESM-1 is expressed by the endothelial cells of the venules, arterioles and capillaries that are present in the alveolar walls and in the bronchial submucosa, as shown in Figure 6C.
  • the epithelial cells of the bronchi and submucosal glands are also marked by monoclonal anti-ESM-1 antibodies.
  • ESM-1 is also expressed by the tubular epithelial cells of the kidney, but its expression is even more important in the epithelium 28

Abstract

Anticorps monoclonaux anti-ESM-1 et leurs utilisations dans la détection de la protéine ESM-1. Différentes formes de la protéine ESM-1 ont pu être mises en évidence à l'aide de ces anticorps. Ces anticorps et ces protéines peuvent être utilisés pour le traitement des maladies inflammatoires.

Description

Anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine ESM-1, et utilisation de ces anticorps pour la détection de la protéine ESM-1
La présente invention est relative à des anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine ESM-1.
Elle est en outre relative à l'utilisation de ces anticorps pour la détection de cette protéine, ou de protéines ou peptides présentant une immunoréactivité croisée.
Elle est de plus relative à des protéines présentant une immunoréactivité croisée avec la protéine ESM-1.
A l'interface entre les cellules circulantes et les tissus, les cellules endothéliales jouent un rôle particulièrement important vis-à-vis des leucocytes . En effet, la migration des leucocytes nécessite des molécules signal, qui sont présentent dans les cellules endothéliales. L'émission de ces molécules signal est sous contrôle des cyto ines. Les protéines ICAM-1 et ICAM-2 , et Nnterleukine-6 sont ainsi fortement exprimées dans les cellules endothéliales en présence de cytokines. L'identification des molécules spécifiques des cellules endothéliales peut donc contribuer à une meilleure connaissance des interactions entre les leucocytes et les cellules endothéliales, et permettre de trouver de nouvelles thérapies pour les maladies liées à la migration des leucocytes, en particulier les maladies inflammatoires. La séquence de l'ADN complémentaire de la protéine ESM-1 clonée à partir de cellules endothéliales humaines de la veine ombilicale a été récemment décrite par LASSALLE et al. (1996, J. Biol. Chem., 271 , n°34, 20458-20464).
Cette séquence d'ADN complémentaire contient une phase ouverte de lecture de 552 nucléotides, ainsi qu'une région non transcrite de 1398 nucléotides. Une séquence de 184 amino acides en a été déduite. Elle est représentée dans la figure 1 de cet article.
L'obtention d'anticorps polyclonaux par immunisation d'un lapin avec la protéine ESM-1 purifiée est aussi décrite dans cet article. Les anticorps polyclonaux présentent de manière générale de nombreux inconvénients. En particulier, les anticorps polyclonaux décrits dans cet article reconnaissent vraisemblablement divers déterminants antigéniques de la protéine avec des affinités et des spécificités plus ou moins fortes. De ce fait, des préparations contenant ces anticorps présentent une faible sensibilité.
En outre des anticorps dirigés contre des déterminants antigéniques autres que ceux de la protéine ESM-1 sont présents dans cette préparation, les rendant ainsi peu spécifiques. En conséquence l'utilisation des anticorps polyclonaux décrits dans cet article, pour la détection et le dosage d'ESM-1 n'est pas envisageable.
L'obtention d'hybridomes produisant des anticorps monoclonaux spécifiques de diverses protéines est connue depuis de nombreuses années. Néanmoins, l'obtention d'anticorps monoclonaux spécifiques d'une protéine déterminée n'est jamais une opération de routine, et requiert un protocole approprié pour chaque cas particulier.
Dans le cas présent, la protéine ESM-1 , qui est une protéine humaine, ne pouvait être obtenue en quantité appropriée, que par expression du gène dans une bactérie, c'est-à-dire dans un système procaryote, et non eucaryote.
Un des problèmes posés consistait donc à trouver un procédé permettant de sélectionner des hybridomes reconnaissant aussi bien la protéine ESM-1 exprimée à partir d'un système procaryote, que la protéine ESM-1 exprimée par un système eucaryote.
En outre, cette protéine est riche en cystéine ce qui rend difficile l'obtention d'anticorps monoclonaux reconnaissant sa forme non-réduite. Les inventeurs se sont donc attachés à trouver un protocole permettant l'obtention d'anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement et avec une forte affinité la protéine ESM-1 humaine.
La présente invention a donc pour objet des anticorps monoclonaux caractérisés en ce qu'ils se lient spécifiquement à au moins un déterminant antigénique, ou épitope, de la protéine ESM-1 , telle que décrite dans la figure 1 de l'article de LASSALLE et al. (1996, précédemment cité).
Ces anticorps monoclonaux peuvent se lier sur divers déterminants antigéniques de la protéine ESM-1. De manière préférentielle, un tel anticorps monoclonal se lie à la partie de la protéine ESM-1 comprise entre la proline en position 79 et la cystéine en position 99 (déterminant antigénique D1), de la séquence peptidique de la protéine ESM-1. Des anticorps dirigés contre cette partie de la protéine ESM-1 sont particulièrement avantageux car ils présentent une affinité particulièrement importante.
D'autres anticorps monoclonaux préférentiels sont ceux se liant spécifiquement à la partie de la protéine ESM-1 comprise entre la glycine en position 159 et l'arginine en position 184 (déterminant antigénique D3).
Ces derniers anticorps présentent une affinité tout à fait acceptable, bien que moins importante que les anticorps dirigés à encontre du déterminant antigénique D3.
Ces anticorps monoclonaux sont obtenus à partir de lignées d'hybridomes. Les anticorps spécifiques du déterminant antigénique D3 peuvent être obtenus à partir des lignées d'hybridomes 1-1942 (MEP14) et I- 1943 (MEP19), déposées le 19 Novembre 1997 auprès de la Collection
Nationale de Culture des Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM).
Les anticorps monoclonaux spécifiques du déterminant antigénique D1 peuvent être obtenus à partir de la lignée 1-1944 (MEP21) déposée le 19 Novembre 1997 auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM).
Les anticorps monoclonaux spécifiques du déterminant antigénique
D2 compris entre la serine 119 et la valine 139 peuvent être obtenus à partir de la lignée 1-1941 (MEP08) déposée le 19 Novembre 1997 auprès de la
Collection Nationale de Culture des Microorganismes de l'Institut Pasteur
(CNCM).
La présente invention a en outre pour objet des conjugués constitués d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus lié de manière covalente à une molécule permettant sa détection directe, ou indirecte.
Les hybridomes sécrétant des anticorps selon la présente invention peuvent être obtenus par un procédé comprenant les étapes suivantes:
- immunisation d'un mammifère par les quantités adéquates d'ESM- 1 ou d'un de ses fragments, - fusion des cellules lymphoïdes du mammifère avec des cellules de myélome, et
- sélection des hybridomes produisant des anticorps selon la présente invention pour leur réactivité vis-à-vis de la protéine de fusion, constituée d'une partie de la protéine ESM-1 et d'une partie d'une immunoglobuline (ESM-lg), et éventuellement leur absence de réactivité vis- à-vis de la protéine de fusion entre une partie de la protéine ICAM-1 et une partie d'une immoglobuline (ICAM1-lg).
Les conditions générales de mise en oeuvre du procédé d'obtention des hybridomes sont bien connues de l'homme du métier, qui peut les retrouver dans la publication de Kôhler et Milstein ( 1975, Nature (London) 256, 495-497).
Les anticorps selon la présente invention peuvent être utilisés pour détecter la protéine ESM-1 , une protéine présentant une immunoréactivité croisée avec ESM-1 , ou encore des fragments de ces protéines. La détection de ces protéines peut notamment rentrer dans le cadre d'un diagnostic plus général de maladies liées à la migration leucocytaire, et en particulier de maladies inflammatoires.
Un tel procédé de détection de ces protéines dans un fluide biologique peut comprendre les étapes suivantes:
- mise en contact dudit fluide avec au moins un anticorps monoclonal selon la présente invention, et
- mise en évidence des complexes éventuellement formés entre ledit anticorps et l'une de ces protéines. De manière avantageuse, le fluide est mis en contact avec deux anticorps monoclonaux spécifiques de deux déterminants antigéniques de la protéine ESM-1 , avantageusement spécifiques respectivement des déterminants antigéniques D3 et D1.
Le fluide biologique peut être, en particulier: un sérum, un plasma, du sang total, de l'urine, un liquide cérébrospinal, ou des surnageants ou lysats cellulaires.
Le procédé mis en oeuvre peut être avantageusement du type « sandwich ».
Le complexe éventuellement formé peut être mis en évidence à l'aide d'un anticorps, ou d'un conjugué spécifique de la classe ou de la sous- classe d'un des anticorps monoclonaux mis en contact avec le fluide.
De tels complexes, formés entre la protéine ESM-1 , ou une protéine présentant une immunoréactivité croisée, ou encore un de leurs fragments, et un anticorps monoclonal selon la présente invention constituent un autre objet de la présente invention.
Le procédé défini ci-dessus peut être avantageusement mis en oeuvre à l'aide d'une trousse adaptée comprenant au moins un anticorps ou un conjugué selon la présente invention sous une forme appropriée. L'utilisation des anticorps selon la présente invention a permis de mettre en évidence dans les surnageants de certaines lignées cellulaires exprimant la protéine ESM-1 , des protéines présentant une immunoréactivité croisée avec la protéine ESM-1 , telle que définie par LASSALLE et al. dans leur article de 1996 précédemment cité, et présentant un poids moléculaire différent de la protéine ESM-1.
La présente invention est donc en outre relative à des protéines de poids moléculaires différents de la protéine ESM-1 telle que décrite dans l'article de LASSALLE et al., et présentant une immunoréactivité croisée avec la protéine ESM-1 .
La présente invention a donc pour objet une protéine, réagissant de manière spécifique avec un anticorps monoclonal spécifique d'un des déterminants antigéniques D1 ou D2, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire compris entre environ 15 et 15,5 kD, en condition non dénaturante.
Sans que les inventeurs soient engagés par une telle hypothèse, cette forme pourrait résulter d'un procédé de clivage de la protéine ESM-1 telle que définie dans l'article de LASSALLE et al. (1996, précédemment cité), dépendant de protéases. Une autre forme, mise en évidence à l'aide des anticorps selon la présente invention, est celle présentant un poids moléculaire compris entre environ 44 et 56 kD, et préférentieliement d'environ 50 kD en conditions non dénaturantes.
Les inventeurs ont montré que cette forme était O-glycosylée. En conséquence, la présente invention est en outre relative à une protéine de poids moléculaire comprise entre 44 et 56 kD telle que définie ci- dessus, glycosylée par au moins un résidu N-acétyl galactosamine, et en particulier par un résidu chondroïtine sulfate. Avantageusement, une telle protéine est glycosylée sur un seul de ses acides aminés, et encore plus préférentieliement sur une serine.
Une telle protéine peut en outre être caractérisée en ce qu'elle comprend au moins partiellement une partie de la séquence décrite sur la figure 1 de l'article de LASSALLE et al. (1996, précédemment cité).
Ces diverses protéines peuvent avantageusement être obtenues à partir de surnageants ou de lysats cellulaires des lignées cellulaires CHO- K1-ESM, 293-ESM et A549-ESM déposées le 28 Janvier 1998 auprès de la CNCM, respectivement sous les n° 1-1970, 1-1971 et 1-1972. La lignée CHO-K1-ESM (n°de dépôt 1-1970) est une lignée de cellules ovariennes de hamster exprimant de manière stable la protéine ESM-1. Cette lignée a été établie par transfection de la lignée cellulaire CHO-K1 (n° de dépôt ATCC: CCL-61) avec le plasmide pcDNA3-ESM (LASSALLE et al., 1996, précédemment cité), puis sélectionnée. La lignée cellulaire 293-ESM (n°de dépôt 1-1971) est une lignée épithéliale humaine exprimant de manière stable la protéine ESM-1. La lignée a été établie par transfection de la lignée cellulaire humaine 293 (n° de dépôt ATCC:CRL-1573) avec le plasmide pcDNA3-ESM, puis sélectionnée. La lignée A549-ESM (n°de dépôt 1-1972) est une lignée épithéliale humaine exprimant de manière stable la protéine ESM-1. Cette lignée a été établie par transfection de la lignée épithéliale humaine déposée auprès de la Collection ATCC sous le n°CCL185, avec le plasmide pcDNA3-ESM puis sélectionnée. Ces protéines et anticorps peuvent être utilisés dans le traitement, ou le diagnostic, de maladies liées à la migration leucocytaire, et en particulier dans le traitement des maladies inflammatoires.
Ils peuvent aussi être utilisés pour étudier l'évolution des greffes de rein. En particulier les anticorps selon la présente invention peuvent être utilisés pour doser la présence d'ESM-1 dans le sang ou les urines de patients ayant subi une greffe de rein.
En conséquence, la présente invention a pour objet des compositions contenant une quantité pharmaceutiquement efficace d'un des anticorps ou d'une des protéines décrits ci-dessus, ainsi que des excipients pharmaceutiquement acceptables.
La présente invention a en outre pour objet des médicaments contenant de tels anticorps et protéines, et l'utilisation de tels anticorps et protéines pour la fabrication de médicaments pour le traitement des maladies liées à la migration leucocytaire, et en particulier pour le traitement des maladies inflammatoires, particulièrement des maladies inflammatoires chroniques.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent. La figure 1 illustre la détection d'anticorps anti-ESM-1 par l'utilisation de protéine ESM-lg. Les plaques recouvertes par des anticorps anti-immunoglobulines G humains (anti-hlgG), ont été incubées avec des surnageants de cellules CHO ou HEK293, des surnageants contenant l'ESM-lg, ou des surnageants contenant la 3D-ICAM1-lg. Les figures 2A et 2B illustrent la caractérisation et la cartographie des épitopes par les anticorps monoclonaux anti-ESM-1. La figure 2A représente un gel d'acrylamide coloré par le bleu de Coomassie, des peptides GST-ESM purifiés. La figure 2B représente schématiquement la protéine ESM-1 , le peptide ESM-1 FO utilisé pour l'immunisation ainsi que les peptides F1 , F2, F3 et F4 utilisés pour la cartographie des épitopes.
Les figures 3A à 3D illustrent la quantification de l'ESM-1 dans divers modèles cellulaires l'exprimant. Les mesures dans les surnageants correspondent aux carrés sombres, tandis que les mesures effectuées dans les lysats cellulaires correspondent aux ronds sombres. La figure 3A illustre les résultats obtenus avec les cellules HUVEC conditionnées avec des facteurs de croissance ( ronds ou carrés blancs) ou non conditionnées (ronds ou carrés sombres). Les figures 3B, 3C et 3D correspondent respectivement aux cellules COS-ESM, HEK-ESM et CHO-ESM. Les figures 4A à 4C illustrent l'effet des cytokines (TNFα, IFNγ et
TNF et IFNγ) sur l'expression de ESM-1 et de ICAM1 dans les cellules HUVEC. Les figures 4A et 4B concernent l'expression d'ESM-1 respectivement dans les surnageants et les lysats des cellules HUVEC , tandis que la figure 4C concerne l'expression d'ICAM-1 dans les lysats des cellules HUVEC.
Les figures 5A à 5D représentent des immunotransferts d'ESM-1 dans différents modèles cellulaires exprimant cette protéine. La figure 5A est un transfert de surnageant brut de cellules HEK-ESM et CHO-ESM . La figure 5B est relative à l'immunoprécipitation de surnageants des cellules COS-ESM, CHO-ESM et HEK-ESM. La figure 5C est relative à l'immunoprécipitation de lysats de différents types cellulaires. La figure 5D concerne l'immunoprécipitation de surnageants et des lysats de cellules HUVEC. (S= surnageant; L = lysat). Ces immunotransferts ont été révélés par un mélange des anticorps MEP21 et MEP19 (1 μg/ml). Les figures 6A à 6E illustrent l'immunocoloration de cellules et dans les poumons, les reins et les intestins. La figure 6A représente des cellules COS (x 100). La figure 6B illustre la coloration cytoplasmique des cellules HUVEC ( x 1000). La figure 6C représente des tissus pulmonaires normaux (tête de flèche: cellules endothéliales capillaires, flèche complète: cellules épitheliales des bronches) (x 250). La figure 6D représente des tissus normaux de reins (flèche: tubules distales; G: capillaires des glomérules , x 400) . La figure 6E représente des tissus intestinaux normaux (têtes de flèches: cellules endothéliales capillaires; x 100). 10
MATERIELS ET METHODES UTILISES DANS LES EXEMPLES. 1) Cultures cellulaires.
Des cellules endothéliales humaines dérivées de la veine ombilicale (HUVEC) par traitement à l'aide de la collagénase ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 complémenté avec 20% de sérum foetal de veau, 2 mM de L-glutamine, 10 μg/ml d'héparine et 25 μg/ml de complément de croissance des cellules endothéliales commercialisé par la Société SIGMA. Les cellules HUVEC ont été cultivées dans des plaques de culture dont les puits ont été recouverts de 0,5% de gélatine. A confluence, des cellules HUVEC ont été lavées et incubées durant une nuit avec le milieu contenant 20% de sérum de veau foetal. Avant addition des cytokines, les cellules HUVEC ont été lavées une fois et incubées dans du RPMI 1640 contenant 5% de sérum de veau foetal. Les cytokines suivantes ont été ensuite ajoutées aux cultures cellulaires: TNFα(200 U/ml, Genzyme), interféron gamma (IFNγ) (1000 U/ml, Genzyme), Interleukine bêta 1 (IL-1 β) (10 U/ml, Genzyme). Après l'activation par les cytokines, les surnageants cellulaires ont été clarifiés par centrifugation et stockés à -20°C afin de permettre la détermination de l'ESM-1. Les cellules endothéliales humaines transfectées par le virus SV40
(cellules SV1) ont été cultivées dans du RPMI 1640 contenant 2 mM de L- glutamine et 10% de sérum de veau foetal (1992, LASSALLE et al., Eur. J. immunol.22, 425-431 ).
Les cellules HEK293 ont été maintenues dans du milieu DMEM complémentaire avec 10% de sérum de cheval. Les cellules COS ont été maintenues dans du milieu DMEM complémenté avec 10% de sérum de veau foetal.
Pour la détermination de la quantité d'ESM-1 dans les surnageants cellulaires et dans les lysats cellulaires, les cellules HUVEC et les lignées 1 1
cellulaires exprimant l'ESM-1 ont été cultivées dans des plaques de culture de 35 mm. A confluence, les cellules ont été lavées trois fois et 2 ml de milieu frais ont été ajoutés durant la période allant de 4 heures à 3 jours de culture. A différents temps, les surnageants cellulaires ont été centrifugés et mis à congeler afin de permettre l'évaluation de la quantité d'ESM-1.
Les cellules adhérent ont été lavées trois fois avec de l'HBSS et lysées durant 30 minutes à 4°C sous agitation dans 1 ml de tampon PBS froid contenant 0,5% de NP40 et des antiprotéases (Complète, Boehringer).
Après centrifugation à 10.000 g durant 10 mn les lysats clarifiés ont été conservés au froid afin de permettre l'évaluation de la quantité de ESM- 1.
2) Production d'ESM-1 et purification.
.La préparation d'ESM-1 a été décrite par LASSALLE et al. (1996, précédemment cité).
Brièvement le fragment Xma I de l'ADN complémentaire d'ESM-1 a été sous-cloné dans le vecteur pGEX-2TK (Pharmacia), résultant dans l'expression d'une protéine de fusion contenant la glutathione S-transférase (GST) et le peptide C-terminal de 14 kDa de l'ESM-1. Cette protéine de fusion a été ensuite purifiée sur une colonne de glutathione-sépharose. Le peptide ESM-1 est relargué de la colonne par traitement par de la thrombine, en suivant le protocole recommandé par la Société Pharmacia. Ces différentes étapes de purification ont permis d'obtenir entre 40 et 60 μg de peptide ESM-1 par litre de culture bactérienne. Ce peptide ESM-1 est dénommé ci-après Fo. 12
3) Constructions oliqonucléotidiques.
Les constructions nucléotidiques permettant l'obtention de l'ESM-1- Ig et du 3D-ICAM1 -lg ont été obtenues de la manière suivante.
Le plasmide contenant le fragment Fc de l'IgGI humaine a été fourni par le Docteur R. Devos (Roche Research Gent, Gent, Belgium). Il a été décrit par ( ELISON et al. (1982), Nue. Acids Res.10, 4071 -4079). Le plasmide a été digéré par Eag I et Pst I et sous-cloné dans le vecteur pBluescript SK commercialisé par Stratagene. La construction a été ensuite digérée par HIND III et EcoR I et ligaturée avec le fragment d'ADN codant pour ESM-1 obtenu par PCR, qui contient la séquence codante entière et qui est flanqué par les sites HIND III et EcoR I respectivement aux extrémités 5' et 3' (amorce sens 5'-CTCAAGCTTCCCACCAGCAAAGACCAC; amorce antisens δ'-TTTGAATTCCGCCGCTGGGATTTAACCATTTCCT).
La construction obtenue a été digérée par HIND III et Eag I et sous- clonée dans le vecteur pcDNA3 digéré par HIND III et Not I (commercialisé par In Vitrogen). En parallèle une protéine de fusion témoin a été aussi construite, qui contient les trois premiers domaines de la protéine humaine ICAM-1 au lieu de la protéine ESM-1 (amorce sens 5'-
CTCAAGCTTCCATTGTGCTCTAAAGACCTC; amorce antisens 5'- AAAGAATTCCGCCCTCTGGCTTCGTCAGAATCACG).
Les régions fusionnées ont été séquencées afin de confirmer que le cadre de lecture est correct.
En ce qui concerne les constructions d'ADN codant pour ESM-1 utilisées dans la cartographie des épitopes, plusieurs fragments d'ADN amplifiés par PCR de la protéine ESM-1 ont été sous-clonés dans le vecteur pGEX-4T3 commercialisé par Pharmacia et contenant les sites EcoR I - Xho i. Les amorces sens ont été sélectionnées afin d'éliminer les 20 acides aminés de l'extrémité N-terminale du peptide de 14 kDa , qui a servi pour l'immunisation des souris (amorces sens (FP):
FP1 : δ'-TATGAATTCATGCAAAGACTGTCCCTACGGC, FP2: 5'-TATGAATTCAGGCATCTGTGACAGGGGGAC FP3 : 5'-ATAGAATTCAGTAACCAAGTCTTCCAACAGA. FP4 5'-AAAGAATTCAGGCAATATTGTGAGAGAAGAAGT; amorce antisens
5'-GGGCTCGAGTAACAAATCTACATGCATTCG).
Les protéines de fusion GST-ESM ont été produites dans la souche d'Escherichia coli DH1 , purifiées sur une colonne de glutathione sépharose et éluées avec 5 mM de glutathione réduite. Ce procédé de purification a permis d'obtenir entre 1 ,2 et 1 ,6 mg de protéine de fusion ESM-1 par litre de culture bactérienne.
La construction ESM-1 contenue dans le plasmide pcDNA3 est celle décrite dans l'article de LASSALLE et al., ( 1996 précédemment cité).
4) Utilisation de l'ESM-lq pour la détection d'anticorps anti- ESM-1.
Des plaques ELISA ont été recouvertes durant une nuit avec un anticorps polyclonal purifié par affinité, et dirigé contre le fragment Fc de 14
l'immunoglobuline (IgG) humaine (5 μg/ml, Sigma) dilué dans du tampon carbonate (0,1 M Na2CO3, 0,1 M NaHCO3, pH 9).
Après une heure de saturation avec du tampon PBS complémenté avec 5 mM EDTA et 0,1 % de BSA, les surnageants des cellules transfectées, contenant les protéines chimères, ont été incubés une heure à température ambiante. Après plusieurs lavages, les protéines chimères retenues ont été détectées à l'aide d'un anticorps de lapin polyclonal anti- ESM-1 , tel que décrit par LASSALLE et al. (1996, précédemment cité), ou des anticorps monoclonaux dirigés contre ICAM-1(Becton - Dickinson) et par le clone 164B (fourni gracieusement par R. Vazeux (ICOS Corporation, Seattle, USA)). Les complexes ont été révélés par des anticorps marqués à la peroxydase dirigés aussi bien à encontre des immunoglobulines de lapins que de souris (Sigma), puis par une coloration à l'aide d'OPD dans un tampon (0,1 M Na2HPO4, 0,1 M NaH2PO4, 0,1 M acide citrique, pH 5,5), contenant 0,025% de peroxyde d'hydrogène . La réaction de coloration est arrêtée par addition d'une solution 4 N d'acide chlorhydrique.
5) Etablissement des lignées sécrétant le ESM-lg, le 3D-ICAM1- Ig, et le ESM-1.
Les constructions oligonucléotidiques purifiées contenant l'ESM-lg, la protéine 3D-ICAM1-lg, et l'ESM-1 ont été sous-clonées dans le vecteur pcDNA3 puis transférées dans des lignées cellulaires CHO et HEK293 avec la iipofectamine comme recommandé par le fabriquant, la Société GIBCO BRL. Après une semaine de sélection avec 500 μg/ml de G418 (GIBCO BRL), les cellules ont été sous-clonées à raison de 0,5 cellule par puits dans quatre plaques de culture en présence de G418. 15
Trois semaines après, les surnageants cellulaires ont été criblés pour la présence d'ESM-lg, de 3DICAM1-lg par ELISA comme décrit ci- dessus.
Trois clones cellulaires présentant les taux les plus importants des protéines chimères ont été sélectionnés.
6) Immunisation des souris, fusion cellulaire , criblage des hybridomes et sous-clonage.
Les souris Balb/c ont été immunisées avec le peptide de 14 kDa d'ESM-1 , obtenu à partir d'Escherichia coli (10 μg par souris). Elles ont été restimulées trois fois par injection dans chacune des pattes.
Les sérums des souris ont été testés dans le test ELISA sandwich, en tant que deuxième anticorps aussi bien à rencontre de l'ESM-lg qu'à rencontre de la 3D-ICAMI-lg. Une souris a été restimulée à nouveau trois semaines après. Trois jours après la dernière immunisation, des cellules issues de ganglions lymphatiques inguinaux (108 cellules) ont été fusionnées avec des cellules de la lignée cellulaire de myélome sp2/0 par addition de PEG 1500 (Boehringer), comme recommandé par le fabriquant. Elles ont été ensuite ensemencées dans des plaques de culture dans un milieu contenant du RPMI 1640 complémenté avec 10% de sérum de veau foetal , 50 lU/ml d'lnterleukine-6 humaine complémenté, de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine (HAT, Gibco BRL).
Deux semaines après, les surnageants des hybridomes ont été criblés pour la présence d'anticorps anti-ESM-1 par ELISA sur ESM-lg, puis à nouveau criblés, pour l'absence de réactivité à rencontre de la protéine 3D-ICAM1-lg. Vingt-trois lignées cellulaires d'hybridomes ont été sélectionnées . Plusieurs d'entre-elles ont été sous-clonées et les anticorps produits ont été caractérisés. 16
7) Caractérisation de l'anticorps monoclonal anti-ESM-1.
L'isotype de chaque anticorps monoclonal a été déterminé à l'aide de deux tests de dosage commerciaux (Isostrip, commercialisé par
Boehringer et Mouse Immunoglobuline Isotyping Kit, commercialisé par
Pharmingen). La cartographie des épitopes a été effectuée par ELISA à l'aide des protéines de fusion GST-ESM-1 utilisés comme antigènes fixés.
8) Purification des anticorps monoclonaux
Les hybridomes ont été cultivés dans un milieu conditionné sans sérum de veau foetal (CHO-SFM II commercialisé par GIBCO BRL).
Les surnageants de culture ont été passés sur une colonne protéine A-sépharose spécifique des anticorps monoclonaux lgG2a et une colonne protéine G sépharose spécifique des anticorps monoclonaux IgG1 (Pharmacia).
Après l'étape de lavage avec 20 mM de Na2HPO4 (pH 7), les anticorps anti-ESM-1 ont été élues avec 0,1 M de glycine à pH 2,7, et immédiatement neutralisés avec du tampon Tris 3 M. Les anticorps élues ont été ensuite dialyses dans des tampons PBS et concentrés à l'aide d'un Centricon 30 (Amicon). Les quantités totales de protéine ont été confirmées par dosage de protéine Bio Rad. La pureté a été vérifiée par coloration par le bleu de Coomassie SDS-PAGE, et l'activité anti-ESM-1 par dosage ELISA sur ESM-lg.
Les anticorps anti-ESM-1 purifiés ont été stockés à -20°C jusqu'à leur utilisation. 17
9) Immunoprécipitation.
Des cellules exprimant l'ESM-1 ont été lavées trois fois avec de l'HBSS froid et ont été lysées dans un tampon de lyse contenant 0,5 % de NP40 et des antiprotéases (Boehringer), dans du tampon PBS durant 30 minutes à 4°C , avec agitation.
Les lysats cellulaires ont été clarifiés soit par centrifugation (12.000g durant 10 minutes) ou par filtration à travers des filtres de 0,45 μm (Millipore).
2 μg d'anticorps anti-ESM-1 ont été ajoutés aux lysats cellulaires, qui ont été incubés durant une nuit à 4°C sous agitation. 50 μl d'agarose - immunoglobuline anti-souris (Sigma) ont été ajoutés et incubés durant une heure trente à 4°C. Les billes d'agarose ont été ensuite lavées par centrifugation, deux fois dans du tampon de lyse et deux fois dans du tampon PBS. Les billes d'agarose ont été ensuite traitées durant cinq minutes avec 20 à 40 μl de tampon d'échantillon SDS-PAGE puis centrifugées , et les surnageants ont été conservés au froid à -20°C jusqu'à l'analyse par Westem-Blot. Le transfert (Westem-Blot) a été effectué en utilisant les protocoles usuels.
L'immunodétection a été effectuée à l'aide de la trousse de détection ECL (Amersham), en suivant les recommandations du fabriquant. Les anticorps primaires sont constitués de MEP 04 et de MEP-21. MEP21 est obtenu à partir de la lignée d'hybridome 1-1944 déposée auprès de la CNCM.
L'anticorps MEP 04 peut avantageusement être remplacé par l'anticorps MEP 14 obtenu à partir de la lignée 1-1942 déposée auprès de la CNCM. Les concentrations de chacun de ces anticorps primaires sont de 1 μg/ml dans du tampon PBS, contenant 0,1% de détergent Tween 20. Ils ont été incubés une heure à température ambiante.
Le second anticorps est un fragment anti-Fc d'immunoglobuline de souris purifié par affinité et marqué avec de la peroxydase (Sigma). Il a été dilué à 1 :1000 (v:v), et incubé une heure à température ambiante.
Les études préliminaires d'immunoprécipitation à partir de lysats de cellules HUVEC indiquaient que les anticorps monoclonaux anti-ESM-1 dirigés contre le déterminant antigénique D3 donnaient les meilleurs résultats. Parmi ces anticorps monoclonaux, l'anticorps MEP 04 (lgG1 , K), l'anticorps MEP 14 (lgG2a,K) obtenu à partir de la lignée 1-1942 et l'anticorps MEP 19 obtenu à partir de la lignée 1-1943 (lgG1 ,K) ont donné des résultats assez similaires.
10) Détermination quantitative par ELISA de l'ESM-1.
Un test sandwich a été développé afin de quantifier l'ESM-1.
Il est basé sur deux anticorps anti- ESM-1 :MEP 19 (lgG1 ,K: dirigé à rencontre du déterminant antigénique D3) et MEP 21 (lgG2a,K; dirigé contre le déterminant antigénique D1), respectivement produit par les lignées déposées sous les n° 1-1943 et 1-1944 auprès de la CNCM.
Des plaques ELISA ont été recouvertes durant une nuit avec l'anticorps MEP19 (100 μl/puits ou 5μg/ml dans du tampon carbonate). Les plaques ont été ensuite lavées deux fois avec du PBS et saturées durant une heure à température ambiante avec 200μl/puits de tampon de saturation
(0,1 % BSA, 5 mM EDTA dans du PBS).
Après trois lavages avec du tampon ELISA (0,1% Tween 20 ajouté au tampon de saturation), 100 μl de dilutions standard d'ESM-1 (100 ng/ml à 19
0,5 ng/ml) ont été incubées durant une heure sous agitation, à température ambiante.
Après trois nouveaux lavages avec du tampon ELISA, 100 μl de surnageant de l'hybridome MEP21 , ou 1 μg/ml d'anticorps MEP21 purifié dans du tampon ELISA ont été ajoutés et incubés une autre heure à température ambiante, sous agitation.
Après trois lavages avec du tampon ELISA, les puits ont été remplis avec 100 μl d'anticorps monoclonal de rat anti-souris lgG2a conjugués à la peroxydase.(Pharmingen) dilués à 1 :1000 (v/v) dans du tampon ELISA, et incubés durant une autre période d'une heure.
Après trois lavages avec du tampon ELISA et deux lavages avec du tampon PBS, une réaction colorimétrique est effectuée avec de l'OPD dans du tampon carbonate contenant 0,025 % de peroxyde d'hydrogène. Cette réaction est arrêtée avec de l'acide chlorhydrique 4 N. L'absorbance est lue à 492 nm sur un spectrophotomètre.
Afin de déterminer la spécificité réelle de ce test, une quantité connue (1 μg) d'ESM-1 purifiée a été diluée dans 1 ml contenant 100% de sérum de veau foetal. La quantité d'ESM-1 a été déterminée à l'aide de dilutions en série avec du sérum de veau foetal à 100%. Les résultats démontrent clairement qu'il n'existe aucune réactivité avec du sérum de veau foetal seul, et aucune différence dans les absorbances quel que soit le type de dilution .
La sensibilité de cet essai est de 1-2 ng/ml. Les pourcentages de variation d'une expérience à l'autre, et au sein d'une même expérience sont de 17% (moyenne de 11 expériences indépendantes). Les échantillons à tester ont quant à eux été dilués en série dans un tampon ELISA avant la quantification de l'ESM-1. 20
11) Immunocoloration pour la détection d'ESM-1.
Les cellules HUVEC obtenues à partir de la veine ombilicale ont été sous-cultivées dans des puits de culture de lames de coloration.
Des cellules COS-ESM transfectées depuis 24 heures ont été sous- cultivées sur des lames du même type durant 1 jour.
Les cellules cultivées sur les lames ont été fixées avec 4% de PFA durant 30 minutes et lavées avec du tampon PBS. Les lames ont été ensuite soumises à une détection immunocytologique avec les anticorps monoclonaux purifiés anti-ESM-1 en utilisant le protocole usuel APAAP.
Les sections de poumon et de rein humains ont été obtenues à partir de tissus prélevés de manière chirurgicale à partir de tumeurs localisées. L'échantillon a été immédiatement coupé en petits morceaux, certains étant congelés dans de l'azote liquide, d'autres étant fixés dans du paraformaldéhyde à 4% dans du tampon cacodylate , puis enrobés dans de la paraffine.
Les meilleurs résultats ont été obtenus avec des dilutions de 1/50 à 1/100(v/v) à partir d'une concentration initiale de 1 mg/ml.
Les anticorps monoclonaux dirigés contre les déterminants antigéniques 1 , 2 et 3 ont donné des résultats similaires en ce qui concerne les cellules fixées sur les lames. Par contre, les anticorps monoclonaux dirigés contre le déterminant antigénique 1 , dans les coupes tissulaires se sont révélés donnés des résultats peu satisfaisants.
Toutes les études immunohistochimiques ont été faites à l'aide des anticorps MEP 08 et MEP 14, respectivement dirigés contre les déterminants antigéniques D2 et D3. 21
Après incubation durant 5 minutes dans du peroxyde d'hydrogène à 3%, les coupes cellulaires congelées ou fixées à l'aide de PFA ont été mises en contact durant une nuit avec l'anticorps primaire (dilution 1/50). Les coupes ont ensuite été incubées durant 30 minutes avec un anticorps IgG anti-souris ou anti-lapin conjugué à de la biotine (Dako). Après lavage, les coupes ont été incubées durant 20 minutes, avec de la peroxydase conjuguée à de l'avidine (Sigma) puis mises en contact avec un substrat chromogène (3-amino-9-éthyl carbazoie/H2O2). L'hématoxyline de Gill a été utilisée comme témoin négatif de coloration.
EXEMPLE 1 :
Utilisation d'ESM-lq pour la détection anticorps anti-ESM-1
Afin de détecter des anticorps anti-ESM-1 par ELISA, l'ESM-1 eucaryote marquée avec le fragment Fc de l'IgG humaine anti-ESM1 (ESM- lg) a été utilisée comme antigène dans un test ELISA sandwich, comprenant des anticorps de chèvre anti-Fc humain fixés, et comprenant en outre des anticorps de chèvre supposés être anti-ESM-1.
L'ESM-lg immobilisé par affinité s'est révélé être détectable par des anticorps anti-ESM-1 polyclonaux de lapins et de souris, ce qui indique qu'il existe dans ESM-1 des épitopes présentant des réactions croisées qui ne dépendent pas des cellules hôtes la produisant, c'est-à-dire qui ne dépendent pas d'Escherichia coli ou des lignées cellulaires eucaryotes.
Le seuil de détection du sérum de lapin est élevé (entre 0,3 et 0,4 valeurs de densité optique) ce qui ne permet pas des dilutions des surnageants contenant l'ESM-lg à plus de 1/800 (v/v).
Les meilleurs résultats ont été obtenus avec le sérum contenant des anticorps polyclonaux de souris anti-ESM-1, comme le montre la figure 22
1 , car le seuil était bas (0,02 unité de densité optique). Des dilutions en série ont permis de détecter l'ESM-lg jusqu'à 1/4000 (v/v).
La reconnaissance de l'ESM-1 semble être spécifique, puisque les sérums anti-ESM-1 ne réagissent pas avec la protéine 3D-ICAM-1-lg, et les anticorps se liant à ESM-lg sont spécifiquement inhibés par la préincubation du sérum de souris anti-ESM-1 , avec des surnageants cellulaires contenant de l'ESM-1 ou de l'ESM-1-lg.
Par contre, les anticorps monoclonaux anti-ICAM-1 réagissent de manière spécifique avec la protéine 3D-ICAM1-lg, mais pas avec ESM-lg, ce qui confirme la validité du protocole de sélection de ces anticorps monoclonaux.
EXEMPLE 2:
Sélection d'anticorps monoclonaux anti-ESM-1 et caractérisation .
En utilisant les deux molécules chimères ESM-lg et 3D-ICAM1-lg, 10 plaques de culture contenant 96 puits chacune et contenant des hybridomes ont été criblées.
23 puits montrant une forte réactivité avec l'ESM-lg ont été mis en évidence, ce qui correspond à une fréquence d'au moins 2,3% de cellules B de souris réagissant avec le ESM-1 , en supposant que tous les puits contiennent des cellules d'hybridomes.
Les 23 hybridomes ayant une réaction positive à rencontre de l'ESM-lg, n'ont pas réagi avec la 3-D-ICAM1-lg, ce qui confirme une reconnaissance spécifique de l'ESM-1.
Deux hybridomes, appelés MEP 01 et MEP 23 ont été sélectionnés.
Afin de localiser les déterminants antigéniques reconnus par les surnageants des hybridomes, des protéines de fusion GST-ESM, dans lesquelles les 20 acides aminés de l'extrémité N-terminale correspondent au 23
peptide de 14 kDa qui avait servi pour l'immunisation des souris (figure 2A), ont été préparées.
Les protéines de fusion GST-ESM purifiées ont été utilisées comme antigène fixé dans un test ELISA. La GST, l'ESM-lg et la 3D-ICAM1-lg, ont été utilisées comme témoins.
Il ressort des résultats du tableau ci-après qu'aucun des anticorps anti-ESM-1 monoclonaux ne réagit avec la 3D-ICAM1-lg ou la GST seule, ce qui confirme que seuls les peptides de type ESM-1 expriment les déterminants antigéniques reconnus par ces anticorps. Trois familles d'anticorps ESM-1 monoclonaux peuvent être définies comme l'illustre la figure 2B., en fonction du déterminant antigénique reconnu:
- déterminant antigénique D1 de la proline 79 à la cystéine 99 de la séquence d'ESM-1, - déterminant antigénique D2 de la serine 119 à la valine 139,
- déterminant antigénique D3 de la glycine 159 à l'arginine 184.
EXEMPLE 3:
Préparation d'un test immunologique pour la détermination quantitative de l'ESM-1.
L'ESM-1 purifiée et native n'étant pas disponible, l'ESM-1 purifiée à partir d'Escherichia coli a été utilisée comme antigène de référence, afin de déterminer la meilleure paire d'anticorps monoclonaux pouvant être utilisée dans un test ELISA afin de quantifier l'ESM-1.
Parmi les paires testées, les anticorps reconnaissant les déterminants antigéniques D1 et D3 donnent les meilleurs résultats.
Le test est encore meilleur quand les anticorps fixés sont ceux dirigés contre le déterminant antigénique D3. 24
Cette méthode de quantification est spécifique, puisqu'une dilution dans 1007o de sérum de veau foetal, ou de sérum de cheval ne met pas en évidence d'interférence, et montre une sensibilité de 1-2 ng/ml.
Ce test a été mis en oeuvre afin de déterminer les quantités d'ESM-1 produites dans différents modèles cellulaires. Dans les surnageants des cellules, les taux les plus importants ont été trouvés dans les cellules CHO-ESM (entre 0,5 et 2 μg/ml), comme le montre la figure 3D. Les cellules HEK-ESM présentent elles aussi des taux importants : entre 0,02 et 0,5μg/ml (figure 3C), ainsi que les cellules transfectées COS (entre 0,01 et 0,3μg/ml comme le montre la figure 3B).
Le taux d'ESM-1 dans les surnageants des cellules HUVEC est compris entre 1 et 20 ng/ml, en fonction des conditions de culture. En présence de facteurs de croissance spécifiques, tels que les compléments de croissance des cellules endothéliales et l'héparine, une augmentation d'un facteur 2 à 3 du taux d'ESM-1 est observé dans les surnageants cellulaires, comme l'illustre la figure 3A.
Dans les lysats cellulaires, les taux d'ESM-1 les plus importants sont observés pour les cellules HEK-ESM et CHO-ESM.
EXEMPLE 4:
Effets des cytokines sur le relarguage d'ESM-1 à partir des cellules HUVEC.
Afin de déterminer les effets des cytokines sur l'expression d'ESM- 1 , les cellules HUVEC ont été conditionnées dans un milieu sans facteur de croissance.
La figure 4A montre que les cellules HUVEC relarguent de l'ESM-1 et que ce relarguage est amélioré après addition de TNFα. 25
Cette augmentation est détectable après 24 heures de culture et devient significative après 48 heures de culture. Ce niveau reste stable durant jusqu'à 72 heures de culture. l'ILIβ donne des résultats similaires au TNFα. Dans les lysats cellulaires des cellules HUVEC non stimulées, le contenu en ESM-1 décroît en fonction du temps, du fait de l'absence de facteur de croissance dans le milieu, comme l'illustre la figure 4B. En présence de TNFα, le contenu en ESM-1 est significativement différent des valeurs de base après 24 heures et 48 heures (figure 4B). La présence de l'Interféron gamma (IFNγ) induit une légère décroissance du contenu en ESM-1 dans les surnageants des cellules HUVEC, par comparaison au témoin, comme le montre la figure 4A.
La capacité de l'interféron gamma à inhiber le relarguage d'ESM-1 est fortement amplifiée quand il est combiné au facteur TNFα , aboutissant en une inhibition à peu près totale du relarguage induit par le TNFα, comme le montre la figure 4A.
A titre de témoin, le niveau en ICAM-1 a été déterminé dans les lysats des cellules HUVEC en parallèle avec ESM-1. TNFα et IFNγ seuls induisent une augmentation significative du contenu en ICAM-1 , comme l'illustre la figure 4C, mais contrairement à l'ESM-1 , le contenu en ICAM-1 augmente de manière synergique en présence de TNFα et d'IFNγ, comme le montre la figure 4C.
EXEMPLE 5 Immunoprécipitation d'ESM-1 : Identification de deux formes intracellulaires et sécrétées d'ESM-1.
Dans les lysats cellulaires, les analyses par Western Blot des immunoprécipités montrent que dans les cellules transfectées COS-ESM 26
ainsi que dans les cellules HEK-ESM et CHO-ESM, l'ESM-1 est présente sous deux formes présentant des poids moléculaires apparents de 17 kDa et de 17,5 kDa, dans des conditions non réductrices, comme l'illustrent les résultats de la figure 5C. Dans les lysats des cellules HUVEC et SV1 , ces deux bandes ont été aussi détectées, mais deux autres bandes de poids moléculaire inférieur ont en outre été détectées, autour de 15 et 15,5 kDa, comme l'illustrent les résultats de la figure 5C.
Dans les surnageants cellulaires, les formes d'ESM-1 apparaissent différentes. Dans les surnageants bruts des cellules CHO-ESM et HEK-ESM, conditionnées dans un milieu dépourvu de sérum de veau foetal, la taille d'ESM-1 a été estimée entre 45 et 55 kDa . Elle apparaît sous la forme d'une large bande lors des Western Blot, comme le montre la figure 5A.
De plus, une bande de 14-15 kDa apparaît dans les surnageants de cellules CHO-ESM, probablement due à un processus de clivage par des protéases, comme le suggère l'inhibition de son apparition par l'addition d'antiprotéases.
Dans les surnageants des cellules HUVEC et COS-ESM , les niveaux d'ESM-1 sont inférieurs à ceux trouvés dans les autres lignées cellulaires exprimant l'ESM-1 , et nécessitent une immunoprécipitation afin de détecter l'ESM-1 , qui apparaît aussi comme une bande majeure entre 45 kDa et 55 kDa, assez similaire à celle observée dans les autres modèles cellulaires (figures 5B et 5D).
EXEMPLE 6
Etude immunochimigue des cellules exprimant l'ESM-1
Environ 10% des cellules transfectées COS exprimant l'ESM-1 ont été marquées avec les anticorps monoclonaux anti-ESM-1. 27
L'immunomarquage est cytoplasmique, avec une expression importante dans la région juxtanucléaire, ce qui est en accord avec une distribution Golgienne, comme l'illustre la figure 6A.
Une répartition similaire a été trouvée dans les cellules HUVEC, (figure 6B).
Les résultats sont similaires avec deux anticorps monoclonaux dirigés à rencontre de différents épitopes (MEP 04, MEP14 et MEP 08).
Aucune coloration des cytoplasmes ou de la membrane nucléaire, n'a pu par contre être détectée pour ICAM1 .
Aucun marquage n'a en outre été observé quand un témoin constitué d'immunoglobulines ou des anticorps anti-ESM-1 ont été utilisés.
EXEMPLE 7:
Immunomarguage d'ESM-1 dans des tissus humains
Dans le poumon, ESM-1 est exprimé par les cellules endothéliales des veinules , des artérioles et des capillaires qui sont présentes dans les parois alvéolaires et dans la sous muqueuse bronchique, comme l'illustre la figure 6C. De plus, les cellules épitheliales des bronches et des glandes submuqueuses sont aussi marquées par les anticorps monoclonaux anti- ESM-1.
Dans le rein, un faible immunomarquage par les anticorps monoclonaux anti-ESM-1 a été mis en évidence dans les cellules endothéliales des artérioles et des veinules, mais pas dans les capillaires des glomérules.
L'ESM-1 est aussi exprimée par les cellules épitheliales tubuiaires du rein , mais son expression est encore plus importante dans l'épithélium 28
des tubules contournés distaux par rapport à l'épithelium des tubules proximaux, comme l'illustre la figure 6D.
Ces photographies ont été obtenues avec des anticorps MEP 08 et MEP 14, les anticorps monoclonaux dirigés à rencontre du déterminant antigénique D1 se révélant inefficaces.
29
TABLEAU
Antigène ICAMMg ESM-lg GST Fo F1 F2 F3 F4
AgD
Balb C 0,005 0.035 0,017 0,043 0.06S 0,065 5,038 O'.o l MIS 0.012 2,720 0, 161 2,502 2,662 2.665 2,520 2,5 10
MEP 01 0.016 2.570 0.003 2,500 0.02S 0,030 0,012 0,019
MEP 04 0.023 2,700 0.003 ixJ 2,770 2.S00 2,700 2,700
MEP 06 0.045 2,590 0,01 1 2.5S0 0,024 0,025 0,010 0,020
MEP 08 0,076 2,300 0,010 nd 1 ,540 1 ,500 0,015 0,014 2
MEP 13 0,012 2,690 0,007 nd 2,350 2,900 0,035 0,070 2
MEP 14 0,034 3,000 0,010 n 3,000 3,000 2,900 3,000 3 EP 19 0,013 3,000 0,012 ixJ 3,000 3,000 3,000 3,000 3 MEP 21 O.OOS 2.S60 0.015 2,630 0.057 0,032 0,020 0,020 1

Claims

30
REVENDICATIONS
I . Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il se lie spécifiquement à au moins un déterminant antigénique de la protéine ESM- 1.
2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il se lie spécifiquement à la partie de la protéine ESM-1 comprise entre la proline en position 79 et la cystéine en position 99.
3. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il se lie spécifiquement à la partie de la protéine ESM-1 comprise entre la glycine en position 159 et l'arginine en position 184.
4. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il se lie spécifiquement à la partie de la protéine ESM-1 comprise entre la serine en position 1 19 et la valine en position 139.
5. Hybridome caractérisé en ce qu'il produit un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4.
6. Lignée d'hybridome selon la revendication 5 déposée le 19 Novembre 1997 sous le n°l-1941 auprès de la CNCM.
7. Lignée d'hybridome selon la revendication 5 déposée le 19. Novembre 1997 sous le n°l-1942 auprès de la CNCM.
8. Lignée d'hybridome selon la revendication 5 déposée le 19..
Novembre 1997 sous le n°l-1943 auprès de la CNCM.
9. Lignée d'hybridome selon la revendication 5 déposée ie 19.. Novembre 1997 sous le n°l-1944 auprès de la CNCM.
10. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il est produit par l'une des lignées selon l'une des revendications 6 à 9.
I I . Conjugué constitué d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4 et 10 lié de manière covalente à une molécule permettant sa détection directe, ou indirecte. 31
12. Procédé d'obtention d'hybridomes selon la revendication 5 comprenant les étapes suivantes:
- immunisation d'un mammifère par une quantité adéquate d'ESM-1 ou d'un de ses fragments, - fusion des cellules lymphoïdes du mammifère avec des cellules de myéiome, et
- sélection des hybridomes selon la revendication 5 pour leur réactivité vis-à-vis de la protéine de fusion ESM-lg.
13. Procédé de détection de la protéine ESM-1 , ou d'une protéine présentant une immunoréactivité croisée avec ESM-1 , ou de fragments de ces protéines, dans un fluide biologique comprenant les étapes suivantes:
- mise en contact dudit fluide avec au moins un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4, et 10
- mise en évidence des complexes éventuellement formés entre les anticorps et la protéine ESM-1 , une protéine présentant une immunoréactivité croisée, ou un de leurs fragments.
14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que le fluide est mis en contact avec deux anticorps monoclonaux spécifiques de deux déterminants antigéniques différents de la protéine ESM-1.
15. Procédé selon l'une des revendications 13 et 14, caractérisé en ce que le fluide est mis en contact avec un anticorps selon la revendication 2 et un anticorps selon la revendication 4.
16. Procédé selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le complexe formé est mis en évidence à l'aide d'un anticorps, spécifique de la classe ou de la sous-classe d'un des anticorps monoclonaux mis en contact avec le fluide, ou à l'aide d'un conjugué contenant un tel anticorps.
17. Trousse pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 13 à 15 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un 32
anticorps ou un conjugué selon l'une des revendications 1 à 4, 10 et 1 1 , sous une forme appropriée.
18. Complexe formé entre la protéine ESM-1 , ou une protéine présentant une immunoréactivité croisée, ou un de leurs fragments, et un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4 et 10 .
19. Protéine caractérisée en ce qu'elle forme un complexe avec un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4 et 10 et en ce qu'elle présente un poids moléculaire compris entre environ 15 et 15,5 kD, en conditions non dénaturantes.
20. Protéine caractérisée en ce qu'elle forme un complexe avec un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4 et 10 et en ce qu'elle présente un poids moléculaire compris entre environ 44 et 56 kD en conditions non dénaturantes.
21. Protéine selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle est glycosylée.
22. Protéine selon l'une des revendications 20 et 21 , caractérisée en ce qu'elle est O-glycosylée.
23. Protéine selon l'une des revendications 20 et 21 , caractérisée en ce qu'elle est glycosylée par un résidu N-acétylgalactosamine.
24. Protéine selon l'une des revendications 20 et 21 , caractérisée en ce qu'elle est glycosylée par un résidu chondroïtine sulfate.
25. Protéine selon l'une des revendications 20 à 24, caractérisée en ce qu'elle est glycosylée sur un seul de ces acides aminés .
26. Protéine selon l'une des revendications 20 à 25, caractérisée en ce qu'elle est glycosylée sur une serine.
27. Lignée cellulaire CHO-K1-ESM déposée le 28 Janvier 1998 auprès de la CNCM sous le -n°l-1970.
28. Lignée cellulaire 293-ESM déposée le 28 Janvier 1998 auprès de la CNCM sous le n° 1-1971. 33
29. Lignée cellulaire A549-ESM déposée le 28 Janvier 1998 auprès de la CNCM sous le n° 1-1972.
30. Protéine selon l'une des revendications 19 à 26 caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être produite par une lignée cellulaire selon l'une des revendications 27 à 29.
31. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmacologiquement efficace d'un anticorps ou d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 4, 10, 19 à 26 et 30, en association avec des excipients pharmaceutiquement acceptables.
32. Médicament caractérisé en ce qu'il contient une quantité efficace d'un anticorps d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 4, 10, 19 à 26 et 30 en association avec des excipients pharmaceutiquement acceptables.
33. Utilisation d'un anticorps ou d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 4, 10, 19 à 26 et 30 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies inflammatoires.
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