JP2010119398A - エネルギー恒常性および細胞小器官代謝の調節に関与するMnkキナーゼ相同性タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、エネルギー恒常性、中性脂肪の代謝を調節し、そして(または)膜安定性および(または)細胞小器官の機能(作用)に寄与するMnk相同性タンパク質、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドを開示する。
【選択図】なし
Description
(a)Genbankアクセッション番号AF237775、NM_017572.1、AB000409.1、またはNM_003684.2のヌクレオチド配列、および(または)その補体、
(b)1 x SSCおよび0.1%のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む溶液中で、50℃にて(a)の核酸分子、特に図3に示したようにアミノ酸配列をコードする核酸に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、
(c)遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)図3に示したように、少なくとも85%、望ましくは少なくとも90%、より望ましくは少なくとも95%、より望ましくは少なくとも98%および99,6%までアミノ酸配列に同一のポリペプチドをコードする配列、
(e)突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子と異なる配列であり、当該突然変異がコード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止を引き起こす配列または
(f)少なくとも15塩基、望ましくは少なくとも20塩基、より望ましくは少なくとも25塩基および最も望ましくは少なくとも50塩基の長さを有する(a)〜(e)のヌクレオチド配列の任意の部分的配列。
本発明において開示したデータは、ことを明らかにする。核酸および本発明のタンパク質およびそのエフェクター分子が、例えば、限定するものではないが、肥満症、糖尿病、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、すい臓の機能障害、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)のような代謝障害、および上記のようなその他の疾患および障害に関連する診断目的および治療目的において有用である。従って、本発明のMnkタンパク質の診断用途および治療用途は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである:(i)タンパク質治療、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的(治療、診断、薬剤ターゲッティング/細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法(遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)生体外および生体内における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。
(a) Mnk2(Mnk2aまたはMnk2b)またはMnk1核酸分子またはその断片;
(b) (a)の核酸を含むベクター;
(c) (a)の核酸または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(d) (a)の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e) (a)の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f) (a)の核酸または(d)または(e)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g) (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
が可能である。さらに、キットには、取扱説明書が含まれることが可能である。
図1は、Pベクター(EP対照群と比較して)のホモ接合性生存結合に起因する、EP(3)3333およびEP(3)3576ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。ここに示したのは、中性脂肪の突然変異体のタンパク質含有量に対する比率をパーセント(%)で表したものである)。
図3E.ヒトMAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)2a(配列識別番号2;GenBankアクセッション番号AF237775、GenBankアクセッション番号XM_030637と同一)のアミノ酸配列
図3F.ヒトMAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)2b(配列識別番号3;GenBankアクセッション番号AF237776またはNM_017572)の核酸配列
図3G.ヒトMAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)2b(配列識別番号4;GenBankアクセッション番号AF237776またはNM_017572)のアミノ酸配列
図3H.ヒトMAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)1(配列識別番号5;GenBankアクセッション番号AB000409またはNM_003684またはXM_001600)の核酸配列
図3I.ヒトMAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)1(配列識別番号6;GenBankアクセッション番号AB000409またはNM_003684またはXM_001600)のアミノ酸配列
図4は、脱共役タンパク質活性を調節する因子を発見するために使用した、脱共役タンパク質(dUCPy)の過剰発現によって誘導した眼表現型を示す。写真の左部に示したハエによれば、dUCPyは通常のレベルで発現される。写真の右部に示したハエによれば、dUCPyは過剰発現され、および眼は低下される。
図8Aは、対照細胞に比較してMnk2を過剰発現する細胞における細胞中性脂肪レベル(μg/mgタンパク質)の低下を示す。全試料は繰り返して分析した(s1;試料1、s2;試料2)。Y軸は細胞中性脂肪レベル(μg/mgタンパク質)を示し、そしてX軸は細胞分化の日数を示す。
図9Bは脂肪細胞分化中のヒトMnk2AおよびヒトMnk2Bの発現を示す。
ここに示したのは、オスのアクチン−mMnk2DN遺伝子組換えマウスおよびオスの野生型同腹仔から分離された異なる組織のtaqman分析である。データは、対応する野生型(wt)組織に相対したRNA誘発倍率として表現される。各バーの上部の番号は、対応するwt組織に相対した誘発倍率を示す。ここに示したのは代表的な実験である。
ここに示したのは、10週間にわたる高脂肪食後のオスのbアクチン−mMnk2DN遺伝子組換えマウス(濃灰色グラフ)およびオスのwt同腹仔(薄灰色グラフ)の成長曲線である。データは期間中の平均体重+/−標準誤差として表現した。ここに示したのは、群当たりのマウスをそれぞれN=8、N=10とした、代表的な実験である。
マ0ウスMnk2遺伝子のエキソン/イントロン境界はこの図において図解する。cエキソン番号、DNA(GenBankアクセッション番号BC010256)上のエキソンの位置、およびイントロン長も示す。イントロン配列は小文字で示し、そしてエキソン配列は大太文字で示す。
上部のラインはマウスMnk2の野生型遺伝子座を示し、中間部にあるグラフィックスはターゲッティングベクターを示し、そして図の底部にあるグラフィックスは標的遺伝子座を図解する。エキソンは黒色ボックスとして示す。制限部位、翻訳開始部位、および終止コドンも示してある。PGK−NEOカセットおよびTKカセットは灰色ボックスとして示す。マウスMnk2遺伝子の4.4kbのゲノム領域は、PGK NEOカセットによって置換する。除去された領域も表示した。サザンブロット分析に使用した外側フランキングプローブは黒色バーで示す。EcoR1消化DNA上のこのプローブで検出したゲノム断片は矢印として示す。詳細は実施例を参照。
特殊な発現系(EP−element、Rorth P、Proc Natl Acad Sci USA 1996、93(22):12418−22)を含んだキイロショウジョウバエの中性脂肪含有量の変化を測定した。変異体ハエはハエ変異在庫コレクションから取得する。ハエは、当業者であれば公知の標準条件下で増殖し、そして実験の過程で、追加摂食としてベーカーの酵母菌(サッカロミセスセレビジエ)を与える。特異的に、ホモ接合性オスのEP(3)3333およびEP(3)3576ハエを対照ハエに比較して検討した(図1)。中性脂肪含有量の定量のため、ハエを、5分間、90℃にて水溶性の緩衝液中において水浴を使用してインキュベートした後に熱抽出を行なった。さらなる5分間、90℃にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Sigma 中性脂肪(INT 336−10または−20)アッセイを使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することによって、ハエ抽出物の中性脂肪含有量を決定した。参照として、BIO−RAD DCタンパク質測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って、同一抽出のタンパク質含有量を測定した。その測定法を何度か繰返した。EPコレクションの中性脂肪平均レベルを100%として図1に示した。EP(3)3333およびEP(3)3576ホモ接合性ハエは、対照と比較して常に高い中性脂肪含有量を示す(およそ140 %増)。つまり、遺伝子座86F7(推定)における遺伝子活性の変化は、EP(3)3333およびEP(3)3576ハエのEP−ベクターがLk6遺伝子座にホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から両方の事例において、肥満したハエモデルを表している。
EPベクターの統合に対して直接的に近接して局在するゲノムDNA配列を分離した(本明細書中ではEP(3)3333およびEP(3)3576)。それらの分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエ ゲノムプロジェクト(GadFly)のような公共データベースをスクリーニングし、それによってEP(3)3333ベクターおよびEP(3)3576ベクターのホモ接合性生存統合部位を確認した。図2はこの遺伝子座の分子構造を示す。図2において、ゲノムDNA配列は、EP(3)3333およびEP(3)3576の統合部位が含まれている黒色の点線としてアッセンブリによって表してある(染色体3R上の位置7544500から7559500まで)。転写されたDNA配列(発現した配列タグ、EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示す。遺伝子CG17342(GadFly、Lk6、Mnkに対して相同性を持つ)の予測エキソンは濃灰色バーとして示し、およびイントロンは図の中間部に細い灰色ラインとして示した。プラスミド救出方法を用いて、ゲノムDNA配列を直接的に局在化した3′のEP(3)3333およびEP(3)3576統合部位を分離した。プラスミド救出DNAを用いて、公共DNA配列データベースをスクリーニングし、それによってEP(3)3333およびEP(3)3576統合部位をの同定し、中性脂肪含有量の増加を引き起こした。EP(3)3333は遺伝子CG17342の5プライムエキソンの5′領域において、およびEP(3)3576は代替5′エキソンの5′領域において、それぞれ統合する。Mnkは、GadFly配列分析プログラムによってCG17342として予測される遺伝子に対してコード化する。以上の点から、CG17342の発現は、EP(3)3333およびEP(3)3576のホモ接合性生存統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増大および脱共役タンパク質活性の変化につながる。
ヒトUCP2およびUCP3遺伝子に対して相同性を持つ配列は、公的に利用できる全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のデータベースのプログラムBLASTを用いて同定した(Altschulらの、1997、Nucleic Acids Res.25:3389−3402を参照)。相同性検索により、UCP相同性を有するショウジョウバエ遺伝子ファミリーの配列断片が産出された。それらは明らかに、隣接する関連ミトコンドリアのタンパク質(オキシグルタミン酸担体)と異なる。
ショウジョウバエ細胞におけるdUCPyの発現効果をテストするために、制限部位NotIおよびKpnIを使用して、dUCPy cDNAを発現ベクターpUASTにクローニングした(Brand A&Perrimon N,Development 1993,118:401−415)結果として生じた発現構成物を、ショウジョウバエ胚の生殖細胞系列およびショウジョウバエの菌株に注入して、安定した構成物の統合を作成した。発現ベクターpUASTは、ショウジョウバエ細胞には通常存在しない酵母菌転写因子Gal4によって活性化されるので、dUCPyは、これらの遺伝子組換え動物には未だ発現されていない。pUAST−dUCPyハエが、組織特定の様式でGal4を発現する第2のショウジョウバエ菌株と交雑する場合、この交配による子孫ハエは、組織を発現するGal4においてdUCPyを発現する。
眼にGal4発現を有する菌株のゲノム部分とpUAST−dUCPy構成物を保有する菌株とを、ゲノム組換え(再結合)を用いて1つの染色体上に混合した。結果として生じたハエ菌株は、dUCPy発現によって永久に損傷した眼を有する。この菌株のハエを、変異誘発したハエ菌株の大きな収集のハエと交雑種せしめた。この変異体収集において、特別発現システム(EPエレメント、前出のRorth、1996を参照)を異なるゲノム座位でランダムに統合する。酵母菌転写因子Gal4は、EPエレメントに結合し、そしてEPエレメントの統合部位を閉じる内在性遺伝子の転写を活性化することができる。遺伝子の活性化は以上の点から、dUCPyを過剰発現する同一細胞(眼)において発生する。変異体収集は、EPエレメントの異なる統合部位を有する数千の菌株を含むので、遺伝子の発現がdUCPy活性と相互作用するかどうかを確認するために、多数の遺伝子をテストすることが可能である。遺伝子が、UCP活性エンハンサーとして作用する場合には、眼欠陥は悪化され、抑制因子として作用する場合には、その欠陥は回復される(図4を参照)。
EPエレメントを救出する眼欠陥に近傍するゲノムDNAを逆PCR法によってクローニングし、配列した。この配列を、ショウジョウバエ遺伝子の公共データベースにおいて「BLAST」検索に用いた。ショウジョウバエ タンパク質のアミノ酸配列を図3Aに示す(dmAAB18789と呼ばれる)。
配列に対して相同性を持つショウジョウバエのLk6は、公的に利用できる全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の非重複タンパク質データベースのプログラムBLASTP 2.2.3を用いて同定した(Altschulらの、1997、Nucleic Acids Res.25:3389−3402を参照)。
本発明において開示した哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、いくつかのマウス菌株(望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究であるマウス菌株C57Bl/6J、C57Bl/6 ob/obおよびC57Bl/KS db/db)は、Harlan Winkelmann (33178 Borchen、Germany)から購入し、一定の温度下に維持し(望ましくは22℃)、湿度40パーセントおよび明/暗サイクルは望ましくは14/10時間とした。マウスには標準食を与えた(例えば、ssniff Spezialitaten有限責任会社、製品番号ssniff M−Z V1126−000)。絶食実験(「絶食野生型マウス」)に関しては、野生型マウスを食物を与えずに水のみを適時に与えるだけで48時間飢えさしめた(例えば、SchnetzlerらのJ Clin Invest 1993 Jul;92(1):272−80、MizunoらのProc Natl Acad Sci U S A 1996 Apr 16;93(8):3434−8を参照)。動物は6〜8週間目に達した時点で屠殺した。動物組織は、当業者であれば公知の標準手順に従って分離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで−80℃にて保管した。
マウスMnk1フォーワードプライマー(配列識別番号11)5′−GCT GAG GGC CTC TGC TCC−3′;
マウスMnk1逆プライマー(配列識別番号12)5′−TCG CCT TCG AGC CAG G−3′;
マウスMnk1 Taqmanプローブ(配列識別番号13)(5/6−FAM)TGA AGC TGT CCC CTC CAT CCA AAT CTC (5/6−TAMRA)
Taqman−1856F Mnk2フォーワードプライマー(配列識別番号14):5′−TGCACTTGATTGACCCCGA−3′
Taqman−1923R Mnk2逆プライマー(配列識別番号15):5′−TTTCTGATTGTCAACCCTCCAA−3′
Taqman−1877T Mnk2 Taqmanプローブ(配列識別番号16):(5/6−FAM)−CCCCATCATCCACCTGCAGTGTCC−(5/6−TAMRA)
Taqman分析は、Mnk2がより興味深いハエLk6遺伝子の相同体であることが明らかになった。その成果を図5および図6に示す。むしろ偏在的に発現するMnk1と比較して、Mnk2は茶色および白色脂肪組織において最も高い発現レベルを示す(それぞれ図5Aおよび6A)。白色脂肪組織におけるMnk2の発現は代謝制御下で行われる:絶食マウスおよび肥満した(ob/ob)マウスにおいては、発現は野生型マウスのレベルの40%に低下する(図5C;図5Bも参照)。加えて、Mnk2の発現は3T3−L1(図5D)の生体外分化中に強く誘導され、同様に、2つの追加モデル系の発現は、前脂肪細胞の脂肪細胞への生体外分化、3T3−F442A細胞株およびTA1細胞株に対して強く誘導される(それぞれ図5Eおよび図5F)。これとは反対に、Mnk1の相対発現レベルはこれらの細胞株の分化中に変化しない(それぞれ図6Dおよび6E)。
ヒト初代脂肪細胞をHaunerらの1989(J Clin Invest84(5):1663−70)によって記載されたように成熟脂肪細胞分化した。簡潔に、細胞をDMEMと栄養素混合F12、1%のPenStrep、17μMのビオチン、33μMのパントテン酸(Pantothenat)、10%の熱不活化されていない胎児の子ウシ血清で育てた。分化の0日目には、培地をDMEM/栄養素混合F12、1%のPen/Strep、17μMのビオチン、33μMのパントテン酸(Pantothenat)、0,01mg/mlのトランスフェリン、ヒドロコルチゾン、20nMのヒトインスリン、0,2nMのT3、25nMのデキサメサゾン、250μMのIBMX、3μMのロシグリタゾンに変えた。分化の4日目には、培地をDMEM/栄養素混合F12 1%のPen/Strep、17μMのビオチン、33μMのパントテン酸(Pantothenat)、0,01mg/mlのトランスフェリン、100nMのヒドロコルチゾン、20nMのトインスリン、0,2nMのT3に変えた。分化手順のいくつかの時点、第0日目(密集日)および第4日目(ホルモン追加)を始めに、14日間を最大とする分化中には、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。RNAをTrizol試薬(例えば、ドイツ、KarlsruheのInvitrogen社製)を使用して、ヒト細胞の培養細胞から分離し、さらにRNeasyキット(例えば、ドイツ、Qiagen社製)と共にDNase−treatmentを使用し、製造者の指示に従って当業者であれば公知の方法で精製した。
ヒトMnk2a増幅用:
ヒトMnk2aフォーワードプライマー(配列識別番号17):5′−cca tct ccc cct ctg tac ata gg−3′;ヒトMnk2a逆プライマー(配列識別番号18):5′−ccg gct ggc gat agc tta a −3′;Taqmanプローブ(配列識別番号19):(5/6−FAM)cac ccg tcc ccc aat caa atc taa agg(5/6−TAMRA)
ヒトMnk2b増幅用:
ヒトMnk2bフォーワードプライマー(配列識別番号20):5′−TTA CTG TGA ATG AGT GAA GAT CCT GG −3′;ヒトMnk2b逆プライマー(配列識別番号21):5′−ATG GCC GTT CAC CGT CC −3′;Taqmanプローブ(配列識別番号22):(5/6−FAM)CCA GGC CAG CTC CCA TCG CTG(5/6−TAMRA)
図9Aに示したように、ヒト組織におけるMnk2aおよびMnk2bタンパク質の発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、両タンパク質が脂肪組織、筋肉、肺、睾丸、および胎盤における高レベルの発現で分析したすべての組織において発現されることを明らかにした。
前脂肪細胞のレトロウイルス性の感染
パッケージング細胞を、リン酸カルシウム法を用いて、マウスMnk2導入遺伝子および選択マーカーを保有するレトロウイルス性のプラスミドpLPCXで形質移入した。対照細胞を導入遺伝子を保有しないpLPCXで感染せしめた。簡潔に、指数関数的に成長するパッケージング細胞を、形質移入の1日前に、2mlのDMEM+10%FCSにおいて、6−ウェルあたり350,000細胞の密度で播種した。形質移入の10分前に、クロロキンを表面を覆う培地に直接添加した(25μM最終濃度)。250μlの形質移入のための混合物は、5μgのプラスミド−DNA(候補:ヘルパーウイルス、比率1:1)および250mMの塩化カルシウム(CaCl2)から成り、15mlのプラスチック管において調製した。同一容量の2 x HBS (280μMのNaCl、50μMのHEPES、1.5mMのNa2HPO4、pH 7.06)を加えた後、気泡を混合物に15秒間注入した。形質移入混合物を滴下式でパッケージング細胞に添加および分布した後に、細胞を37℃にて、5%のCO2で6時間インキュベートした。細胞はPBSで洗浄した後、培地を6−ウェル当たり2mlのDMEM+10%のCSと交換した。形質移入の1日後、細胞を再び洗浄し、6−ウェル当たり1mlのDMEM+10%のCS、32℃にて、5%のCO2において2日間(ウイルスコレクション)インキュベートした。さらに、その上澄みを0.45μmのセルロース アセテート フィルタを通してフィルターし、そしてポリブレン(最終濃度8μg/ml)を添加した。半密集状態における哺乳動物の線維芽細胞(3T3−L1)細胞を調製したウイルスを含んだ培地で覆った。感染した細胞を2μg/mlのピューロマイシンを用いて1週間選択した。その選択後、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光を用いて細胞における導入遺伝子の発現を確認した。過剰発現細胞を分化のために播種した。
集密日(D0)以来、細胞培地は48時間毎に変えた。細胞および培地は次のように培地交換に8時間先行して収穫した。培地を収集し、PBSにおいて2回洗浄した600μlのHB−緩衝剤(0.5%ポリオキシエチレン10 tridecylethan、1mMのDTA、0.01MのNaH2PO4、pH7.4)における溶解に先行して、細胞を2回洗浄した。70℃にて5分間の不活性化後、細胞可溶化液をBio 101系溶解マトリックスB(0.1mmシリカ ビーズ;Q−Biogene社、Carlsbad、USA)上で、2 x 45秒間、4.5(Fastprep FP120、Bio 101 Thermosavant社、Holbrock、USA)の速度で攪拌することによって調製した。溶解細胞の上澄みを、3000rpmにて2分間の遠心分離後に収集し、後の分析のため、−80℃にてアリコットに保管した。
細胞可溶化液および培地のタンパク質および中性脂肪含有量の総量を、製造者の指示従って、Bio−Rad DCタンパク質測定法試薬(Bio−Rad社、Munich、ドイツ)および修飾酵素性中性脂肪キット(GPO−Trinder;Sigma社)を用いて、6−ウェルプレートにおいて同時に分析し、簡潔に、試薬の最終容量を次のように96−ウェル形式に調節した:10μlの試料を200μlの試薬Aを用いて5分間37℃でインキュベートした。グリセローム(初期の吸光度:540nm)の定量後、50μl試薬Bを添加し、継いで、別のインキュベーションを5分間、37℃にて行った(最終吸光度:540nm)。グリセローム濃度および中性脂肪濃度を、標準曲線を各測定に含むためにグリセローム標準セット(Sigma社)を用いて計算した。
脂質生成の末端段階中(第12日目)では、脂質を代謝する能力に関して細胞を分析した。脂質合成のため、Jensenらの(2000)、JBC 275、40148の方法に対する修飾プロトコルを樹立した。細胞は、0.1%のFCSで補充したKrebs−Ringer−Bicarbonate−Hepes緩衝剤(KRBH;134nMのNaCl、3.5mMのKCl、1.2mMのKH2 PO4、0.5mMのMgSO4、1.5mMのCaCl2、5mMのNaHCO3、10mMのHepes、pH7.4)における2.5時間、37℃にての血清飢餓に先行して、PBSで3回洗浄した。インスリン刺激脂質合成に関しては、細胞を1μMのウシインスリン(Sigma社;キャリア:0.005 NのHCl)で45分間、37℃にてインキュベートした。基礎脂質合成は、キャリアのみを用いて決定した。14C(U)−D−グルコース(NEN Life Sciences社)(1μCi/ウェル/mlの最終活性における)を5mMのグルコースの存在下で30分間37℃にて添加した。背景放射能の算出対しては、25μMのサイトカラシンB(Sigma社)を使用した。すべての測定法は、二通りのウェルにおいて実施した。反応を終結するため、細胞を氷のように冷たいPBSで3回洗浄し、1ml 0.1NのNaOHにおいて溶解した。各ウェルのタンパク質濃度は、標準Biuret方法(タンパク質測定法試薬;Bio−Rad社)を用いて評価した。全脂質は、Insta−Fluorシンチレーション反応混液(Packard Bioscience社)において一晩抽出後に水溶性の位相から分離し、継いで、シンチレーションカウンティングを行った。
脂質生成(D12)の末端段階中、細胞の長鎖脂肪酸を血漿膜全域に輸送する能力を分析した。脂肪酸の細胞輸送のため、Abumradらの(1991)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1991:88;6008−12)の方法に対する修飾プロトコルを樹立した。要約すれば、血清飢餓に先行して、細胞をPBSで3回洗浄した。これに継いで、0.1%のFCSで補充したKRBH緩衝剤において、2.5時間、37℃にてインキュベートした。外来性遊離脂肪酸の取り込みは、非放射性のオレイン酸および5mMのグルコース存在下で、1μCi/ウェル/mlの最終活性において血清アルブミンに対して複合型の(3H)オレイン酸(NEN Life Sciences社)を含んだ同位体の培地の追加により、30分間、室温(RT)にて開始した。血漿膜全域で能動輸送(AT)の不在下における、受動拡散(PD)の算出するため、グルコース遊離培地(Sigma社)における20mMのフロレチンを30分間、室温(RT)にて添加した。すべての測定法は、二通りのウェルにおいて実施した。能動輸送を終結するため、グルコース遊離培地における20mMのフロレチンを細胞に添加した。細胞を1ml 0.1NのNaOHに溶解し、そして標準Biuret方法(タンパク質測定法試薬;Bio−Rad社)を用いて各ウェルのタンパク質濃度を評価した。エステル型の脂肪酸は、Insta−Fluorシンチレーション反応混液(Packard Bioscience社)において一晩抽出を用いて遊離脂肪酸から分離し、継いで、シンチレーションカウンティングを行った。
遺伝子組換え動物の作成
当業者であれば公知のような標準プロトコルを用いて、、マウスMnk2のcDNAをマウス茶色脂肪組織(BAT)から分離し次のプライマーペアを用いて、cDNAをRT−PCRによって増幅した:
Mnk2フォーワードプライマー(配列識別番号23):5′ AAG TTG GCC TTC GCG TTA GAC 3′
Mnk2逆プライマー(配列識別番号24):5′ CGA TAT GTA CAA GGA GCT AG 3′。
標準技術で、β−アクチン−Mnk2DN導入遺伝子発現をTaqman分析によって、フォーワードプライマー(配列識別番号29):5′ CAG CGT GGT AGT ACA GGA CGT G 3′、逆プライマー(配列識別番号30):5′ TCC CTG TGG GCG ATG C 3′およびプライマー(配列識別番号31):5′ CAG TGC CCT GGA CTT CCT GCA TAA CAA 3′用いて検証した。Taqman分析は、マウス組織の代表的パネルを用いて実施した。
離乳後、オスのβ−アクチン−mMnk2DN遺伝子組換えマウスおよびそれらの野生型(wt)同腹仔対照を4〜5動物(N=4、最大でN=5)群に分け、食餌制限(望ましくはAltromin C1057 mod control、4.5%の粗脂肪または高脂肪食(望ましくはAltromin C1057mod.高脂肪、23.5%粗脂肪)をした。12〜16週間の期間にわたって、動物の全体重を毎週測定した。
各食餌で、β−アクチン−mMnk2DN遺伝子組換えマウスの平均体重は、それぞれの食餌で野生型同腹仔に比較して明らかに増加した。両食餌で、平均体重の著しい相違が最初に観察されたのは、出世後第4週目終わり頃であった。高脂肪食での10週間後、β−アクチン−mMnk2DN遺伝子組換えマウスの平均体重はwt同腹仔に比較して8.8g(=wt同腹仔の平均体重と比べて23%の増加)増加した(図11)。食餌制限をしたwtマウスおよびβ−アクチン−mMnk2DN遺伝子組換えマウスの平均体重においても類似の相違が観察された(データ図示せず)。従って、これらの結果は、mMnk2DN導入遺伝子の異所性発現が体重の増加につながることを明らかに示す。本効果は、食餌制限と同様に高脂肪食の場合でも見られるように、与えると食餌とは無関係のように思われる。
mMnk2のcDNA(GenBankアクセッション番号BC010256;位置61−665)の605ベースペア プローブを、フォーワードプライマー(配列識別番号32):5′ ACA TCA GCC CAC AGT GTG A 3′および逆プライマー(配列識別番号33):5′ TCT CCA TTG AGT TTG ATA CCA 3′を用いてPCR法によって、マウス白色脂肪組織(WAT)のcDNAから増幅した。このプローブは、129SVJゲノムファージライブラリをスクリーニングするために使用した(Stratagene社から取得した)。3つの非依存性クローンを分離し、そしてpBluescript KS+のNotIクローニング部位へサブクローニングした(Stratagene社)。これらのゲノムクローンを制限マッピングおよびシーケンシングのために用い、マウスMnk2のゲノム遺伝子座を特徴づけた(図12)。PGK−ネオマイシン カセットをマウスMnk2の遺伝子座に挿入し、4,4kbのゲノムDNAを置換し、それによってmMnk2の全翻訳領域を除去した。簡潔に、8kb SpeI−NotI断片をPGK−ネオマイシン カセットのpBluescript KS+上流のXbaI部位にクローニングし、それをpBluescriptのSmaI部位に挿入した。1kbのゲノム断片を、次のプライマーペア(非プライミング ヌクレオチド/付属的な制限部位は小文字表示):Mnk2−SAフォーワードプライマー(配列識別番号34):EcoRI 5′ cgg aat CCA CTA GCT CCT TGT ACA TAT 3′;Mnk2−SA逆プライマー(配列識別番号35):ClaI 5′ cca tcg atG GAA CTC GTA TTG CAT AGT AG 3′を用いて、PCR法によって増幅した。結果として得られた断片をpBluescript KS+のEcoRI/ClaI部位に挿入した。ネガティブ選択マーカーとしてチミジンキナーゼ カセットをターゲッティング作成物のClaI/XhoI部位にクローニングした。(図13)作成物をNotI消化によって直線化し、そしてマウス胚幹(ES)細胞に電気穿孔した。ES細胞クローンを、G418およびガンシクロビル(Gancyclovir)治療(望ましくは350μgのG418/mlおよび2μmのガンシクロビル)によって選択した。600のネオマイシン耐性コロニーの中から2つの非依存性の相同性組み換えES細胞クローンをPCR法によって同定した。その結果は、3′フランキングプローブ(位置2495−3065mMnk2のcDNA)を用いて、EcoRI消化ゲノムDNAのサザンブロット分析によって確認した。単一の統合イベントを、ネオマイシンプローブを用いて、BamHI消化DNAのサザンブロット分析によって確認した。ES細胞クローンをNMRIマウスから取り出した8−細胞−段階胚で凝集し、そして発生発達する胚盤胞をキメラを作成するため偽妊娠のマウスに移した。キメラをC57/BL6マウスと繁殖させ、そして次のプライマー: Mnk2−ESプライマー(配列識別番号36):5′ AGA CTA GGG AGG AGG GTG GAG GA 3′;Mnk2−KOプライマー(配列識別番号37):5′ GGT GGA TGT GGA ATG TGT GCG A 3′;Mnk2−WT 5′ GGG GTGTAG GGG TCT GTT AGG 3′を用いて、子孫の遺伝子型をPCR法によって同定した。ヘテロ接合性マウスを、さらに交雑させるためおよび分析jを行うために使用した。
Mnk−関連の代謝障害の予防、治療または診断のために好適である化合物は、Mnkポリペプチド、Mnkポリペプチド断片またはその誘導体に関連する機能(作用)を測定するために、キナーゼアッセイ、結合アッセイまたは他の任意の好適な測定法を介して同定することが可能である。このキナーゼアッセイは、組換え(型)のヒトMnk2(Mnk2aまたはMnk2b)またはMnk1タンパク質およびelF4E標的配列から成る標識ペプチド、標識組換え(型)elF4E標的配列または基質としての標識組換え(型)elF4Eタンパク質を利用したものであってもよい。測定法は、放射性のキナーゼアッセイまたはSer209にてelF4Eリン酸化を認識する能力のある抗ホスホセリン抗体を利用した測定法であってもよい。
Claims (4)
- Mnk2の機能的等価物であり、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるMnk2相同性ポリペプチド又はMnk2の機能的等価物であるその断片の酵素活性を増加または減少させる物質のスクリーニング方法であって、以下の工程
(a)下記の混合物をインキュベートする工程および
(aa)酵素的に活性なMnk2の機能的等価物であり、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるMnk2相同性ポリペプチド又はMnk2の機能的等価物であるその断片
(ab)蛍光体でラベルされているキナーゼ基質;および
(ac)候補物質
(ad)適切な反応バッファー
(b)キナーゼ基質のいかなるリン酸化を検出する工程、その際、上記候補物質が溶液中で上記蛍光体ラベルされたキナーゼ基質と結合し、その際、蛍光性の偏りが、上記Mnk2の機能的等価物であり、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるMnk2相同性ポリペプチド又はMnk2の機能的等価物であるその断片の酵素活性における増加または減少を検証するのに用いられる、
を含む、Mnk2の機能的等価物であり、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるMnk2相同性ポリペプチド又はMnk2の機能的等価物であるその断片の酵素活性を増加または減少させる物質のスクリーニング方法。 - 上記キナーゼ基質が、基質上に固定化される請求項1記載の方法。
- 上記キナーゼ基質が、立体障害をさけるために分子スペーサー腕によって上記特徴と関連する請求項1に記載の方法。
- 候補物質のために、キナーゼ基質と競争する蛍光性のトレーサー分子をさらに含み、
その際、間接的な蛍光性の偏りが、上記Mnk2の機能的等価物であり、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるMnk2相同性ポリペプチド又はMnk2の機能的等価物であるその断片の酵素活性における増加または減少を検証するために使用される請求項1に記載の方法。
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