JP2002051786A - 骨・軟骨形成組織特異的なプロモーター及びその利用 - Google Patents

骨・軟骨形成組織特異的なプロモーター及びその利用

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JP2002051786A
JP2002051786A JP2000243929A JP2000243929A JP2002051786A JP 2002051786 A JP2002051786 A JP 2002051786A JP 2000243929 A JP2000243929 A JP 2000243929A JP 2000243929 A JP2000243929 A JP 2000243929A JP 2002051786 A JP2002051786 A JP 2002051786A
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Hisafumi Komori
壽文 小守
Chisato Ueda
千里 上田
Naoko Kanetani
直子 金谷
Carolina Yoshida
カロリーナ 吉田
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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【課題】骨・軟骨形成組織において特異的なプロモータ
ー活性を呈する単離DNA;該組織特異的に外来遺伝子
を発現可能な発現ベクター;間葉系系列細胞の分化調節
剤又は骨・軟骨形成制御剤のスクリーニング系;骨・軟
骨疾患用の遺伝子治療剤並びに骨・軟骨疾患の処置方法
の提供。 【解決手段】マウス由来の特定の塩基配列を少なくとも
有したDNAで、かつ骨・軟骨形成組織において特異的
なプロモーター活性を呈する単離DNA;該単離DNA
が外来遺伝子を発現させ得る発現ベクター;該発現ベク
ターを有効成分として含有した遺伝子発現剤;該遺伝子
発現剤を有効成分として含有した遺伝子治療剤;該ベク
ターを保持する形質転換細胞;被検物質の存在下で、該
形質転換細胞を培養し、マーカー遺伝子の発現レベルを
評価する間葉系系列細胞の分化調節剤又は骨・軟骨形成
制御剤のスクリーニング方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、骨・軟骨形成組織
特異的なプロモーター及びその利用に関する。さらに詳
しくは、本発明は、間葉系系列細胞の分化調節又は骨・
軟骨形成制御の指標として有用であり、骨・軟骨形成組
織特異的な発現を可能にする、Cbfa1/RUNX2 プロモータ
ー及び遺伝子導入動物におけるその利用に関する。
【0002】
【従来の技術】近年、遺伝子治療は、実用化されつつあ
るが、組織特異的な遺伝子治療の観点から、まだ、十分
な効果が得られず、実用性に乏しいのが現状である。
【0003】骨・軟骨疾患については、リウマチ時の関
節破壊に対する外科手術などに伴い、罹患部位へのター
ゲットがしやすいという観点から遺伝子治療の対象とし
て興味が持たれている。
【0004】また、骨又は軟骨で特異的に発現している
遺伝子群として、コラーゲンや、非コラーゲン性タンパ
ク質であるオステオカルシンなどが知られている。これ
らの遺伝子群は、発現部位の組織特異性が比較的高いた
め、その組織特異性が遺伝子のどの部分に担われている
か、すなわち組織特異的発現調節部位がどこに存在する
のかが、トランスジェニック動物等を用いて検討されて
いる。なかでも、I型コラーゲン [J. Cell Biol., 12
9: 1421-1432,(1995)] 及びオステオカルシン [Mol. En
docrinol., 7: 462-467,(1993)]については、骨芽細胞
や歯芽細胞に特異的に発現させるための領域が同定され
ており、特定の遺伝子を骨芽細胞や歯芽細胞内で特異的
に発現させる目的で利用が試みられている。一方、軟骨
に関しては、軟骨特異的な遺伝子として知られているII
型コラーゲン [J. Cell Sci., 108:3677-3684,(199
5)]、XI型コラーゲン[J. Biol. Chem., 273: 22861-228
64,(1998)] に関して同様の解析が行なわれており、軟
骨細胞に特異的に遺伝子発現させるために必要な遺伝子
領域が同定され、特定の遺伝子を軟骨細胞に特異的に発
現させる目的で利用が試みられている[Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 93: 10240-10245,(1996)]。
【0005】しかしながら、上記の遺伝子のプロモータ
ーは、骨又は軟骨に特異的に発現させるためには有用で
あるが、骨・軟骨双方に発現させるためには適当である
とはいえないという欠点がある。また、異所性骨化な
ど、骨又は軟骨組織以外での石灰化などの現象にこうい
った遺伝子のプロモーターが有用であるか否かは検討さ
れていないのが現状である。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、骨及び軟骨
形成組織特異的に作動しうる、骨・軟骨形成組織におい
て特異的なプロモーター活性を呈する、単離されたDN
Aを提供することを目的とする。また、本発明は、骨・
軟骨形成組織特異的に外来遺伝子を発現させ得る発現ベ
クターを提供することを目的とする。さらに、本発明
は、間葉系系列細胞の分化調節剤又は骨・軟骨形成制御
剤(例えば、骨・軟骨・歯欠損や骨折治癒を促進する薬
剤、あるいは異所性骨化・異所性石灰化を抑制する薬
剤、骨・軟骨細胞分化を促進する薬剤、結合組織の繊維
化・骨髄の脂肪髄化を抑制する薬剤など)のスクリーニ
ング系(トランスジェニック動物、スクリーニング方法
など)を提供することを目的とする。さらに、本発明
は、骨・軟骨・歯欠損や骨折治癒促進を目的とした遺伝
子治療、又は異所性骨化・異所性石灰化の抑制、骨・軟
骨細胞分化の促進、結合組織の繊維化・骨髄の脂肪髄化
の抑制を目的とした遺伝子治療剤並びに骨・軟骨疾患の
処置方法を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、〔1〕
配列番号:1に示される塩基配列を少なくとも有して
なるDNAであって、かつ骨・軟骨形成組織において特
異的なプロモーター活性を呈する、単離されたDNA、
〔2〕 配列番号:1に示される塩基配列を少なくとも
有してなるDNAが、配列番号:2に示される塩基配列
を有するDNAである、前記〔1〕記載の単離されたD
NA、〔3〕 (a)配列番号:1又は2に示される塩
基配列において、少なくとも1塩基の置換、欠失、挿入
又は付加を有するDNA、(b)配列番号:1又は2に
示される塩基配列からなるDNAの相補鎖とストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズしうるDNA、及び
(c)配列番号:1又は2に示される塩基配列からなる
DNAに少なくとも60%の配列同一性を有するDNA
からなる群より選択されたDNAであって、かつ骨・軟
骨形成組織において特異的なプロモーター活性を呈す
る、単離されたDNA、〔4〕 転写の方向に関して、
外来遺伝子配列の上流側に、前記〔1〕〜〔3〕いずれ
かに記載の単離されたDNAが作動可能に連結されてな
る、骨・軟骨形成組織特異的に外来遺伝子を発現させ得
る発現ベクター、〔5〕 外来遺伝子が、対象疾患を治
療するためのタンパク質をコードする遺伝子である、前
記〔4〕記載の発現ベクター、〔6〕 対象疾患を治療
するためのタンパク質が、成長因子、ペプチドホルモ
ン、サイトカイン、ケモカイン類、成長因子受容体、ペ
プチドホルモン受容体、サイトカイン受容体、ケモカイ
ン類受容体、転写因子、転写調節因子、接着因子、細胞
内情報調節因子、骨・軟骨基質タンパク質及び細胞骨格
系タンパク質からなる群より選ばれた少なくとも1種で
ある、前記〔5〕記載の発現ベクター、〔7〕 外来遺
伝子がマーカー遺伝子である、前記〔4〕記載の発現ベ
クター、〔8〕 マーカー遺伝子がβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホ
ルモン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパ
ク質遺伝子、青色蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タン
パク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子及びこれらの
誘導体からなる群より選ばれる、前記〔7〕記載の発現
ベクター、
〔9〕 前記〔4〕〜〔6〕いずれかに記載
の発現ベクターを有効成分として含有してなる、骨・軟
骨形成組織特異的に外来遺伝子を発現させ得る遺伝子発
現剤、〔10〕 前記
〔9〕記載の遺伝子発現剤を有効
成分として含有してなる、骨・軟骨形成組織特異的に外
来遺伝子を発現させることにより治療され得る疾患のた
めの遺伝子治療剤、〔11〕 骨・軟骨形成組織特異的
に外来遺伝子を発現させることにより治療され得る疾患
が、代謝性骨疾患、軟骨関連疾患、異所性骨化又は異所
性石灰化である、前記〔10〕記載の遺伝子治療剤、
〔12〕 前記
〔9〕記載の遺伝子発現剤を有効成分と
して含有してなる、骨・軟骨疾患のための遺伝子治療
剤、〔13〕 骨・軟骨疾患が、代謝性骨疾患、軟骨関
連疾患又は異所性骨化である、前記〔12〕記載の遺伝
子治療剤、〔14〕 骨・軟骨形成組織を標的とし、前
〔9〕記載の遺伝子発現剤又は前記〔10〕〜〔1
3〕いずれかに記載の遺伝子治療剤を導入することを特
徴とする、骨・軟骨疾患又は異所性石灰化の処置方法、
〔15〕 前記〔4〕〜〔8〕いずれかに記載の発現ベ
クターを保持してなるトランスジェニック非ヒト哺乳動
物であって、該発現ベクター中の外来遺伝子が骨・軟骨
形成組織特異的に発現することを特徴とする、トランス
ジェニック非ヒト哺乳動物、〔16〕 前記〔7〕又は
〔8〕記載の発現ベクターを保持してなるトランスジェ
ニック非ヒト哺乳動物であって、該発現ベクター中のマ
ーカー遺伝子が骨・軟骨形成組織特異的に発現すること
を特徴とする、前記〔15〕記載のトランスジェニック
非ヒト哺乳動物、〔17〕 発現ベクターが哺乳動物の
染色体中に組み込まれてなる、前記〔15〕又は〔1
6〕記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、〔1
8〕 非ヒト哺乳動物がげっ歯動物である、前記〔1
5〕〜〔17〕いずれかに記載のトランスジェニック非
ヒト哺乳動物、〔19〕 げっ歯動物がマウスである、
前記〔18〕記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動
物、〔20〕 前記〔15〕〜〔19〕いずれかに記載
のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与
し、マーカー遺伝子の発現レベルを評価することを特徴
とする、間葉系系列細胞の分化調節剤又は骨・軟骨形成
制御剤のスクリーニング方法、〔21〕 前記〔7〕又
は〔8〕記載の発現ベクターを保持し、かつ該ベクター
中のマーカー遺伝子の発現レベルが、間葉系系列細胞の
分化調節又は骨・軟骨形成制御の指標となることを特徴
とする、間葉系系列細胞の形質転換細胞、〔22〕 前
記〔15〕〜〔19〕いずれかに記載のトランスジェニ
ック非ヒト哺乳動物から単離されてなる、前記〔21〕
記載の細胞、〔23〕 間葉系系列細胞が、骨芽細胞、
軟骨細胞、未分化間葉系系列細胞、骨細胞、繊維芽細
胞、脂肪細胞及び歯芽細胞からなる群より選択される、
前記〔21〕又は〔22〕記載の細胞、並びに〔24〕
被検物質の存在下で、前記〔21〕〜〔23〕いずれ
かに記載の細胞を培養し、マーカー遺伝子の発現レベル
を評価することを特徴とする、間葉系系列細胞の分化調
節剤又は骨・軟骨形成制御剤のスクリーニング方法、に
関する。
【0008】
【発明の実施の形態】Cbfa1/RUNX2 遺伝子は、骨芽細胞
の分化過程においてのみならず[Cell 89: 755-764, (19
97)]、軟骨分化過程においても広く発現していることが
最近明らかにされている[Dev. Dyn. 214: 279-290, (19
99)]。また、血管細胞の石灰化などにおいても、Cbfa1/
RUNX2 遺伝子が比較的早期から発現することが明らかに
されている [J. Biol. Chem 273: 7547-7553, (1998)]
。しかしながら、Cbfa1/RUNX2遺伝子において、Cbfa1/
RUNX2 遺伝子の骨・軟骨形成組織特異的な発現調節を司
る遺伝子発現調節領域(単に、「Cbfa1/RUNX2 プロモー
ター」と称する場合がある)、特に、in vivo におい
て、骨・軟骨形成組織特異的な発現調節を司るCbfa1/RU
NX2 プロモーター領域は、同定されていなかった。な
お、Cbfa1/RUNX2 遺伝子は、PEBP2 αA 遺伝子とも称す
る。
【0009】本発明は、in vivo においてもCbfa1/RUNX
2 遺伝子の骨・軟骨形成組織特異的な発現調節を司るCb
fa1/RUNX2 プロモーターに関する本発明者らの知見に基
づく。一般的に、in vitroにおける遺伝子発現の動向は
in vivo における実際の遺伝子発現の動向と大きく異な
る場合が多い。また、βグロビン[Proc. Natl. Acad.Sc
i. USA, 95: 8756-8760 (1998), Development, 122: 39
91-3999 (1996))やSOX9(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95: 10649-10654 (1998)]などのように、組織特異的な
遺伝子発現に大きく影響する調節領域が、転写開始部位
から、かなり上流に離れていたり、オステオカルシン遺
伝子[Nucleic Acid Res., 23: 5064-5072 (1995)] など
のようにイントロンに調節領域が存在している場合があ
るため、内在性の遺伝子発現を非常によく反映するよう
なプロモーター領域を同定することは、大変困難であ
る。しかしながら、本発明者らにより同定された「Cbfa
1/RUNX2 プロモーター」は、in vivo においても実際に
骨・軟骨形成組織特異的な発現調節を行なうものであ
り、これは、予想外のことである。
【0010】骨・軟骨形成組織とは、異所性骨化・異所
性石灰化といった疾患時に石灰化・骨化の起こる組織を
含めて、骨・軟骨を形成しうる組織、石灰化、骨化の起
こる組織をここではいい、例えば、関節周囲組織(例え
ば、膝、大腿骨付け根など)、皮膚、腎臓、血管組織、
乳がん組織、心臓等が挙げられる。
【0011】本明細書において、「プロモーター」と
は、細胞内でRNAポリメラーゼとの会合が可能な発現
調節領域を含むものであり、かかる領域の下流(3’末
端方向)に存在するコーディング配列の転写を開始させ
る機能を有する領域を含むものをいう。さらに、前記
「プロモーター」は、骨・軟骨形成組織特異的な発現調
節を担う、いわゆるエンハンサー領域をも含む領域をい
う。
【0012】骨・軟骨形成組織特異的な発現とは、骨・
軟骨形成組織における発現が、他の組織と比較して明ら
かに高いことを意味する。
【0013】本発明のDNAは、配列番号:1に示され
る塩基配列を少なくとも有してなるDNAであって、か
つ骨・軟骨形成組織において特異的なプロモーター活性
を呈することを1つの特徴とする、単離されたDNAで
ある。本発明のDNAは、配列番号:1に示される塩基
配列を有しているため、in vivo においても骨・軟骨形
成組織特異的に発現調節できるという優れた性質を有す
る。
【0014】前記配列番号:1に示される塩基配列は、
マウス由来のCbfa1/RUNX2 遺伝子(PEBP2αA 遺伝子) の
第1エクソン内の第1メチオニンの約50塩基下流から上
流に位置する約2kb からなる領域の配列である。かかる
配列により、in vivo においても骨・軟骨形成組織特異
的に発現調節できる。本発明においては、配列番号:2
に示される塩基配列を有するDNAがさらに高い特異性
を有し、骨・軟骨形成組織特異的な発現調節が可能であ
るため、より好ましい。前記配列番号:2に示される塩
基配列は、第1エクソン内の第1メチオニンの約50塩基
下流から上流に位置する配列であって、かつ前記2kb か
らなる領域を含む、約7kb からなる領域の配列である。
本発明においては、骨・軟骨形成組織への高い特異性及
び高い発現調節能の観点から、前記マウス由来のCbfa1/
RUNX2 遺伝子(PEBP2αA 遺伝子)の第1エクソン内の第
1メチオニンの約50塩基下流から上流に位置する2kb 以
上、好ましくは3kb 以上、より好ましくは7kb 以上の領
域を有する配列を有するDNAが望ましい。
【0015】なお、前記Cbfa1/RUNX2 遺伝子(PEBP2αA
遺伝子) の配列は、DDBJ AccessionNumber AB013129に
より参照できる。
【0016】本発明のDNAのプロモーター活性は、例
えば、下記の〜のステップ: 被検対象のプロモーターの制御下に、レポーター遺
伝子(例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスフ
ァターゼ遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝
子、青色蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タンパク質遺
伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子、これらの誘導体な
ど)を作動可能に連結した配列を保持した活性測定用プ
ラスミドを作製するステップ、 前記の活性測定用プラスミドを用いて適切な骨・
軟骨形成組織の細胞及び対照細胞(骨・軟骨形成組織を
除く細胞)を形質転換するステップ、並びに 前記で得られた細胞におけるレポーター遺伝子の
発現の有無を検出し、発現強度を測定するステップ を含む、レポータージーンアッセイなどにより決定でき
る。かかる測定方法により、骨・軟骨形成組織の細胞に
おいて対照細胞と比較して強い発現が検出された場合、
かかるプロモーターは、骨・軟骨形成組織特異的なプロ
モーターであることの指標となり、ここでレポーター遺
伝子の発現産物量がプロモーター活性の強度の指標とな
る。
【0017】本発明のDNAは、前記配列番号:1又は
2に示される塩基配列において、少なくとも1塩基、具
体的には、1又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入又は
付加を有するDNAであって、かつ骨・軟骨形成組織に
おいて特異的なプロモーター活性を呈する、単離された
DNAであってもよい。置換、欠失、挿入又は付加(以
下、単に「変異」と称する場合がある)の数及び導入位
置は、前記〜のステップを含む、レポータージーン
アッセイを実施することによって、骨・軟骨形成組織特
異的なプロモーターであることが決定されるものであれ
ばよい。好ましくは、1又は数個の置換、欠失、挿入又
は付加が挙げられる。
【0018】人為的な変異の導入方法としては、慣用の
部位特異的変異導入法などにより行なうことができる。
部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アン
バー変異を利用する方法 [ギャップド・デュプレックス
(gapped duplex )法、Nucleic Acids Research, 12,
9441〜9456 (1984)]、dut(dUTPase )とung(ウ
ラシル−DNAグリコシラーゼ)遺伝子を欠損した宿主
を利用する方法 [クンケル(Kunkel)法、Proc. Natl.
Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 〜492 (1985)] 、アン
バー変異を利用したPCRによる方法(国際公開第98/0
2535号パンフレット)等を用いることができる。
【0019】また、骨・軟骨形成組織において特異的な
プロモーター活性を呈するDNAであれば、配列番号:
1又は2に示される塩基配列からなるDNAの相補鎖と
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDN
Aであって、かつ骨・軟骨形成組織において特異的なプ
ロモーター活性を呈する単離されたDNAも本発明に包
含される。かかるDNAは、例えば、前記〜のステ
ップを含む、レポータージーンアッセイを実施すること
によって、骨・軟骨形成組織特異的なプロモーターであ
ることが決定されるものであればよい。
【0020】ここで、ハイブリダイゼーション操作は、
例えば、モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリ
ー・マニュアル 第2版 [T.マニアティス(T. Mania
tis)ら編集、Molecular Cloning : A Laboratory Manu
al 2nd ed., コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory )発行,(19
89)] などに記載の方法に従って、実施することができ
る。また、「ストリンジェントな条件」としては、前記
モレキュラークローニング:ア・ラボラトリーマニュア
ル第2版などに記載のハイブリダイゼーションの条件が
挙げられ、具体的には、10% デキストラン硫酸、1M NaC
l 、1% SDS、100 mg/ml サケ精子DNA 、1 ×106 cpm/ml
32P 標識プローブ(配列番号1又は2)の条件下でハ
イブリダイズ反応を行った後、2xSSC 、0.1%SDS 、室温
で2 回、0.1xSSC 、0.1%SDS 、60℃で2回の洗浄を行う
ような条件が挙げられる。
【0021】さらに、本発明のDNAには、配列番号:
1又は2に示される塩基配列からなるDNAに少なくと
も60%の配列同一性を有するDNA、好ましくは70
%以上、より好ましくは80%以上の配列同一性を有す
るDNAであって、骨・軟骨形成組織において特異的な
プロモーター活性を呈する単離されたDNAも含まれ
る。かかる配列同一性を有するDNAは、例えば、前記
〜のステップを含む、レポータージーンアッセイを
実施することによって、骨・軟骨形成組織特異的なプロ
モーターであることが決定されるものであればよい。
【0022】本明細書において、「配列同一性」とは、
2つのポリヌクレオチド間の残基の配列類似性をいう。
前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたっ
て、最適な状態にアラインメントされた2つの配列を比
較することにより決定されうる。ここで、比較対象のポ
リヌクレオチドは、2つの配列の最適なアラインメント
のための参考配列(例えば、コンセンサス配列など)と
比べて、付加又は欠失(例えば、ギャップなど)を有し
ていてもよい。
【0023】配列同一性の数値(パーセンテージ)は、
両方の配列に存在する同一の核酸塩基を決定して、適合
部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の塩
基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に1
00をかけることにより、算出されうる。最適なアライ
ンメント及びホモロジーを得るためのアルゴリズムとし
ては、例えば、スミス(Smith) らの局所ホモロジーアル
ゴリズム[Add. APL. Math., 2, 482 (1981)]、ニードル
マン(Needleman) らのホモロジーアラインメントアルゴ
リズム[J. Mol. Biol., 48, 443(1970)]、パールソン(P
earson) らの相同性検索法[Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 85, 2444 (1988)] が挙げられ、より具体的には、ダ
イナミックプログラミング法、ギャップペナルテイ法、
Smith-Watermanアルゴリズム、Good-Kanehisa アルゴリ
ズム、BLAST アルゴリズム、FASTA アルゴリズム等が挙
げられる。
【0024】かかるDNAの配列同一性は、例えば、配
列解析ソフト、具体的には、BLASTNなどを用いて
測定される。かかるソフトウェアは、ホームページアド
レスhttp://www.ncbi.nlm.ni
h.gov/BLAST/において、一般に利用可能で
ある。BLASTNにより、2つの塩基配列を比較する
ためのデフォルトパラメータは、例えば、Matrix: BLOS
UM62、Gap existence cost: 11、Per residue gap cos
t: 1 、 Lambda ratio: 0.85 が挙げられる。
【0025】本発明のDNAによれば、骨・軟骨疾患を
治療対象とした遺伝子治療用のベクター;骨・軟骨・歯
欠損や骨折治癒を促進する薬剤、異所性骨化・異所性石
灰化を抑制する薬剤、骨・軟骨細胞分化を促進する薬剤
及び結合組織の繊維化・骨髄の脂肪髄化を抑制する薬剤
のin vitroスクリーニング系又はin vivo スクリーニン
グ系などへの応用が可能になる。さらに、本発明のDN
Aは、下記1)〜3)の理由から、それ自体が骨・軟骨
疾患における極めて有用な遺伝子治療剤のツールとな
り、また、骨・軟骨疾患を改善する薬剤の探索のための
ツールとなりうる。
【0026】すなわち、 1)骨折の治癒促進あるいは骨粗鬆症の治療に使用する
場合は、I型コラーゲンプロモーター及びオステオカル
シンプロモーターが成熟骨芽細胞においてのみ発現する
のに対し、Cbfa1/RUNX2 プロモーターは、成熟骨芽細胞
のみならず骨芽細胞前駆細胞においても発現する。した
がって、Cbfa1/RUNX2 プロモーターによれば、BMP や C
bfa1などの分化促進因子を骨芽細胞前駆細胞において発
現させることにより、成熟骨芽細胞への成熟を促進し、
骨芽細胞数を増加することができ、それにより骨折の治
癒促進あるいは骨量の増加を図ることができる点で優れ
た効果を発揮する。
【0027】2)ヒト又は非ヒト動物においては、加齢
に伴い、骨髄組織の脂肪髄化・結合組織の繊維化が進
み、骨髄機能や結合組織の弾力性が失われることが知ら
れている。そして骨・ 軟骨代謝においてもそのような変
化に伴い、正常な骨格組織の形成・維持が困難になって
くることが知られている。また、加齢に伴い、力学的負
荷により軟骨組織、特に関節部分の軟骨組織の摩耗が生
じることが知られている。このような加齢に伴う骨・軟
骨組織の変性に対しては、比較的分化度の低い間葉系系
列細胞において、BMP 、 Cbfa1などの分化促進因子を発
現させて、骨・軟骨細胞への分化を促進させることによ
り、症状の軽減又は治癒の効果が期待できる。さらに、
これによりそれらの細胞数が増加し、それにより骨・軟
骨組織の維持を図りうる。
【0028】3)Cbfa1/RUNX2 は、骨・軟骨分化の促進
因子であるので、該Cbfa1/RUNX2 プロモーターの活性を
調節する因子又は剤によれば、骨・軟骨分化を調節しう
ることが期待できる。特に、in vivo において、Cbfa1/
RUNX2 プロモーターの活性を調節する因子又は剤は、ヒ
ト又は非ヒト動物において、Cbfa1/RUNX2 遺伝子発現を
調節する働きがあると考えられ、骨・軟骨・歯欠損や骨
折治癒を促進する薬剤、あるいは異所性石灰化や異所性
骨化を抑制する薬剤、骨・軟骨細胞分化を促進する薬
剤、変形性関節症に見られる関節軟骨細胞の分化・成熟
を抑制し関節軟骨を維持する薬剤、結合組織の繊維化・
骨髄の脂肪髄化を抑制する薬剤として有用である。
【0029】本発明のDNAにより、骨・軟骨形成組織
特異的に外来遺伝子を発現させ得る発現ベクターが提供
される。かかる発現ベクターも本発明に含まれる。
【0030】本発明の発現ベクターは、転写の方向に関
して、外来遺伝子配列の上流側に、本発明の単離された
DNAが作動可能に連結されていることを1つの特徴と
し、骨・軟骨形成組織特異的に外来遺伝子を発現させ得
るものである。かかる発現ベクターは、外来遺伝子の上
流に本発明のDNAが局在するため、本発明のDNA中
における骨・軟骨形成組織特異的なプロモーターの制御
下に外来遺伝子を発現させることができるという優れた
効果を発揮する。したがって、前記外来遺伝子を骨・軟
骨形成組織特異的に発現させ得る。これにより、本発明
の発現ベクターは、それ自体が骨・軟骨疾患における極
めて有用な遺伝子治療剤のツールとなり、また、骨・軟
骨疾患を改善する薬剤の探索のためのツールとなりうる
という優れた性質を有する。
【0031】本発明の発現ベクターは、骨・軟骨形成組
織に導入することにより複製されうる形態であればよ
く、例えば、適切なレプリコンを有する環状又は直鎖状
のいずれであってもよい。
【0032】外来遺伝子としては、対象疾患を治療する
ためのタンパク質をコードする遺伝子、マーカー遺伝子
などが挙げられる。
【0033】前記「対象疾患」とは、例えば、骨・軟骨
形成組織特異的に外来遺伝子を発現させることにより治
療され得る疾患が挙げられる。具体的には、骨粗鬆症等
の代謝性骨疾患;骨欠損、骨折、軟骨欠損、歯欠損、骨
・軟骨破壊を伴うリウマチや変形性関節症等の軟骨関連
疾患、異所性骨化、異所性石灰化、くる病、骨軟化症、
パジェット病、ガンの骨転移及び類似のもの等が挙げら
れる。なお、本明細書において、「骨・軟骨・歯欠損」
とは、骨組織あるいは軟骨組織をもつ哺乳動物における
疾病又は損傷をうけた状態をさす。すなわち加齢や力学
的負荷、物理的外力により骨折や骨・軟骨の損失及び/
又は変性で特徴づけられる疾病である。
【0034】対象疾患を治療するためのタンパク質とし
ては、BMP 、 FGF、IGF 、EGF 、VEGF、PDGF、TGF 、PT
H 、PTHrP 、Chondromodulin、Wnt 、Interleukin 、In
terferon、TNF 、Notch 等の成長因子、ペプチドホルモ
ン、サイトカイン、ケモカイン類及びこれらの受容体;
Cbf 、SOX 、Smad、HOX 、CREB、核内受容体、STAT、AP
-1、CBP 、NCoR等の転写因子及び転写調節因子;ICAM、
VCAM、Selectin等の接着因子;p38 、ERK 、JNK 、CaM
K、PTP 等の細胞内情報調節因子;collagen、osteopont
in 、 osteocalcin、aggrecan等の骨・軟骨基質タンパ
ク質;NuMA、actin 等の細胞骨格系タンパク質などが挙
げられる。
【0035】本発明に用いられるマーカー遺伝子として
は、β−ガラクトシダーゼ (β-galと略記する場合もあ
る) 遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長
ホルモン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タン
パク質遺伝子、青色蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タ
ンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子並びにそれ
らの誘導体等が挙げられる。前記「誘導体」には、人工
的に作製された変異体が含まれる。
【0036】本発明の発現ベクターは、本発明のDNA
を適切なベクターに挿入することにより得ることができ
る。
【0037】本発明に用いられるベクターとしては、例
えば、プラスミド、ファージ、コスミドなどが挙げら
れ、具体的には、pNASS β、pGL3、pCAT3 、 pβgal 、
pEGFP-1 、pEYFP-1 、pSEAP2などが挙げられる。
【0038】本発明の発現ベクターの具体例としては、
例えば、ある哺乳動物又は胚の段階でその哺乳動物の先
祖細胞に導入できるように適応させた真核生物用のベク
ター(例えば、pNASS βなど) に、転写方向に関して、
外来遺伝子の上流に作動可能に連結された Cbfa1/RUNX2
プロモーターを含有した発現ベクターなどが挙げられ
る。
【0039】本発明の発現ベクターにおいて、外来遺伝
子が前記「対象疾患を治療するためのタンパク質をコー
ドする遺伝子」である場合、骨・軟骨形成組織特異的な
遺伝子発現剤の有効成分として使用されうる。かかる遺
伝子発現剤も本発明に含まれる。
【0040】本発明の遺伝子発現剤は、前記発現ベクタ
ーを有効成分として含有することを1つの特徴とし、骨
・軟骨形成組織特異的に外来遺伝子、具体的には、対象
疾患を治療するためのタンパク質をコードする遺伝子を
発現させ得るものである。かかる遺伝子発現剤は、前記
発現ベクターを有効成分として含有しているため、骨・
軟骨形成組織に対して高い特異性を発揮するという優れ
た性質を有する。したがって、本発明の遺伝子発現剤
は、特に後述の遺伝子治療剤に有効に使用できる。
【0041】本発明の遺伝子発現剤は、有効成分である
発現ベクターを安定な状態に保持するための成分、例え
ば、緩衝成分、分解保護剤(例えば、核酸分解酵素の阻
害因子など)などを適宜含有してもよい。本発明の遺伝
子発現剤は、細胞及び/又は組織への導入に適した薬剤
をさらに含有してもよい。
【0042】本発明の遺伝子発現剤における発現ベクタ
ーの量は、使用目的により適宜設定することができる。
例えば、後述の遺伝子治療剤に用いる場合、治療目的の
疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することがで
き、例えば、発現ベクター量として0.0001〜10
0mg、好ましくは0.001〜10mgであることが
望ましい。かかる投与用量を数日ないし数ヶ月に1回投
与することが望ましい。
【0043】本発明の遺伝子発現剤は、例えば、リポフ
ェクション法、リン酸−カルシウム共沈法;DEAE−
デキストラン法;微小ガラス管を用いた直接注入法など
の方法により、細胞に導入することができる。
【0044】また、本発明の遺伝子発現剤の組織への導
入法としては、内包型リポソームによる導入法、静電気
型リポソームによる導入法、HVJ−リポソーム法、改
良型HVJ−リポソーム法(HVJ-AVE リポソーム法)、
パーティクル銃で担体(金属粒子)とともに有効成分を
細胞に移入する方法、正電荷ポリマーによる導入法等が
挙げられる。
【0045】本発明の遺伝子発現剤によれば、さらに、
骨・軟骨形成組織特異的に外来遺伝子を発現させること
により治療され得る疾患を対象とする遺伝子治療剤及び
骨・軟骨疾患のための遺伝子治療剤が提供される。これ
らの遺伝子治療剤も本発明の範囲に含まれる。
【0046】本発明の遺伝子治療剤は、本発明の遺伝子
発現剤を有効成分として含有することに1つの大きな特
徴がある。したがって、本発明の遺伝子治療剤によれ
ば、骨・軟骨形成組織に高い特異性を有しているため、
骨・軟骨形成組織特異的に外来遺伝子を発現させること
により治療され得る疾患及び骨・軟骨疾患に対して特異
的に、症状の軽減又は治癒効果を発揮しうる。したがっ
て、同時に、骨・軟骨形成組織以外の組織に対する、遺
伝子治療剤の影響を低減することが可能になるという優
れた性質を有する。
【0047】「骨・軟骨形成組織特異的に外来遺伝子を
発現させることにより治療され得る疾患」としては、前
記「対象疾患」と同様のものが挙げられる。
【0048】本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法と
しては、該遺伝子治療剤を直接体内に導入するin v
ivo法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体
外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に
戻すex vivo法がある(日経サイエンス,1994 年
4 月号,20-45頁、月刊薬事,36(1),23-48,1994、実験医
学増刊,12(15),1994、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療
開発研究ハンドブック, エヌ・ティー・エス,1999 )。
【0049】in vivo法により投与する場合は、
本発明の遺伝子治療剤は、例えば、静脈、動脈、皮下、
皮内、筋肉内などに投与するか、又は対象の骨・軟骨形
成組織そのものに直接局所投与することができる。
【0050】製剤形態としては、上記の各投与形態に合
った種々の製剤形態(例えば液剤など)をとり得る。例
えば、遺伝子治療剤を含有した注射剤の場合、当該注射
剤は常法により調製することができ、例えば、適切な溶
剤(PBS等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等)に溶解
した後、場合によっては、フィルター等で濾過滅菌し、
次いで無菌的な容器に充填することにより調製すること
ができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を
加えても良い。また、HVJ−リポソーム等のリポソー
ムにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤な
どのリポソーム製剤の形態とすることができる。
【0051】また、徐放性の製剤(ミニペレット製剤
等)を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あ
るいはオスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に
徐々に投与することも可能である。
【0052】本発明の遺伝子治療剤の投与形態は、例え
ば、実験手引書などにその調製法、投与法などが詳しく
解説されている(別冊実験医学, 遺伝子治療の基礎技
術, 羊土社,1996 、別冊実験医学, 遺伝子導入&発現解
析実験法, 羊土社,1997 、日本遺伝子治療学会編遺伝子
治療開発研究ハンドブック, エヌ・ティー・エス,199
9)。以下、具体例を挙げて説明する。
【0053】本発明の発現ベクターの構築において、非
ウイルスベクターが用いられた場合、以下のような手法
により、本発明の遺伝子治療剤を細胞や組織に導入する
ことができる。
【0054】細胞への遺伝子導入法としては、リポフェ
クション法、リン酸−カルシウム共沈法;微小ガラス管
を用いた直接注入法などが挙げられる。
【0055】また、組織への遺伝子導入法としては、内
包型リポソームによる遺伝子導入法、静電気型リポソー
ムによる遺伝子導入法、HVJ−リポソーム法、改良型
HVJ−リポソーム法(HVJ-AVE リポソーム法)、受容
体介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体(金属粒
子)とともに有効成分を細胞に移入する方法、nake
d−DNAの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法
等が挙げられる。
【0056】本発明の発現ベクターの構築において、ウ
イルスベクターを用いる場合、かかるウイルスベクター
としては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等が
挙げられる。より具体的には、例えば、無毒化したレト
ロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘ
ルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイル
ス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイ
ルス、SV40、免疫不全症ウイルス(HIV)等のD
NAウイルス又はRNAウイルスに本発明のDNAと該
DNAに作動可能に連結した外来遺伝子とを導入し、得
られた発現ベクターを感染させることによって、細胞内
に遺伝子を導入することが可能である。前記ウイルスベ
クターのうち、高い感染効率を得ることができるという
観点から、アデノウイルスベクター系を用いることが望
ましい。
【0057】本発明の遺伝子治療剤の薬理効果は、対象
疾患により異なるが、例えば、骨減少性の疾患に対し
て、BMP2を外来遺伝子として含有した本発明の遺伝子治
療剤を用いた場合、骨量増加、骨形成マーカー(アルカ
リホスファターゼ、オステオカルシン等)の上昇が見ら
れることが予想されるので[J. Cell Biol., 113: 681-6
87 (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 172:295
-299 (1990), Science 286: 1946-1949 (1999)] 、DXA
法による骨量の測定やELISA 等による血中骨形成マーカ
ーの測定などで、その効果を確認することができる。
【0058】本発明の遺伝子治療剤により、骨・軟骨疾
患や異所性石灰化の処置方法が提供される。かかる処置
方法も本発明の範囲に含まれる。本発明の処置方法は、
骨・軟骨形成組織を標的とし、前記遺伝子発現剤又は遺
伝子治療剤を導入することに1つの大きな特徴がある。
かかる処置方法は、本発明の遺伝子発現剤又は遺伝子治
療剤を用いるため、骨・軟骨形成組織特異的なドラッグ
ターゲッティングを可能にし、それにより、骨・軟骨形
成組織を除く組織への副作用を低減し、より特異的な骨
・軟骨疾患等の処置を可能にするという優れた効果を発
揮する。
【0059】本発明の処置方法において、遺伝子治療剤
の導入方法は、前記と同様である。また投与量は、治療
目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節するこ
とができ、例えば、遺伝子治療剤中に含まれる発現ベク
ター量として0.0001〜100mg、好ましくは
0.001〜10mgであることが望ましい。かかる投
与用量を数日ないし数ヶ月に1回投与することが望まし
い。
【0060】本発明の処置方法は、両生類、鳥類、哺乳
動物、具体的にはヒト;サル、ウマ、ヒツジ、ウサギ、
ラット、マウスなどの非ヒト哺乳動物に適用されうる。
好ましくは、家畜であるウマ、ヒツジ、ウサギ等の非ヒ
ト哺乳動物であることが望ましい。
【0061】さらに、本発明の発現ベクターによれば、
さらに、骨・軟骨欠損や骨折治癒を促進する薬剤;異所
性石灰化や異所性骨化を抑制する薬剤;骨・軟骨細胞分
化を促進する薬剤;変形性関節症に見られる関節軟骨細
胞の分化・成熟を抑制し関節軟骨を維持する薬剤又は結
合組織の繊維化・骨髄の脂肪髄化を抑制する薬剤のスク
リーニングを可能にする。具体的には、かかる発現ベク
ターを保持したトランスジェニック非ヒト哺乳動物及び
それを用いるスクリーニング方法、並びに該発現ベクタ
ーを保持した細胞(形質転換細胞)及びそれを用いるス
クリーニング方法が提供される。これらも本発明の範囲
に含まれる。
【0062】本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動
物は、前記発現ベクターを保持してなるトランスジェニ
ック非ヒト哺乳動物であって、該発現ベクター中の外来
遺伝子が骨・軟骨形成組織特異的に発現することを1つ
の特徴とする。外来遺伝子として、マーカー遺伝子を含
有した発現ベクターを保持したトランスジェニック非ヒ
ト哺乳動物は、骨・軟骨形成組織において特異的なプロ
モーターを保持しているため、骨・軟骨形成組織特異的
なマーカー遺伝子の発現の有無及び強度を指標として、
簡便に、間葉系系列細胞の分化調節剤又は骨・軟骨形成
制御剤をスクリーニングすることができるという優れた
性質を有する。また、外来遺伝子として、対象疾患を治
療するためのタンパク質をコードする遺伝子を含有した
発現ベクターを保持したトランスジェニック非ヒト哺乳
動物は、骨・軟骨形成組織において特異的なプロモータ
ーを保持しているため、骨・軟骨形成組織において発現
させた場合の該タンパク質の治療効果を評価することが
できる。
【0063】ここでは前述の組換え遺伝子は、前述の哺
乳動物又は胚の段階でその哺乳動物の先祖細胞(ancesto
r)に導入され、プロモーターは、マーカー遺伝子の転写
を制御している。
【0064】本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動
物においては、発現ベクターが哺乳動物の染色体中に組
み込まれていてもよい。
【0065】「非ヒト哺乳動物」としては、ヒト以外の
哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギブタ、イ
ヌ、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物などが挙げられる。な
かでも、医薬研究用途に用いられていること、病態モデ
ルが作製しやすいこと等の観点から、マウス、ラットな
どに代表されるげっ歯類動物が好ましく、特にマウスが
好ましい。
【0066】本発明のトランスジェニック非ヒト動物
は、例えば、本発明の発現ベクターを非ヒト哺乳動物の
受精卵にマイクロインジェクションすることにより得る
ことができる。具体的には、まず、過排卵誘起した雌と
種雄とを交配させる。交配後約12時間(動物種により
異なる)を経た雌から卵管を取り出し、1細胞基(前核
期)の受精卵を採取し、適切な培養液に入れる。つい
で、本発明の発現ベクターを受精卵の前核にマイクロイ
ンジェクションする。一方、性成熟に達した雌に精管切
除した雄を交尾させて、偽妊娠雌を作製する。マイクロ
インジェクション後、生存した受精卵を前記偽妊娠雌の
卵管内に移植する。その後、卵管内に移植された受精卵
より発生した胎仔を自然分娩又は切開手術により取り出
す。得られた仔の尾の一部からゲノムDNAを調製す
る。得られたDNAを分析して、得られた仔がトランス
ジェニック動物であるか否かを調べる。トランスジェニ
ック動物を交配して系統を樹立する。樹立されたトラン
スジェニック動物中の発現ベクターに存在する外来遺伝
子について、発現解析を行ない、骨・軟骨形成組織特異
的な発現を確認する。以上の操作により、本発明のトラ
ンスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
【0067】なお、前記トランスジェニック非ヒト動物
の詳細な作製方法は、例えば、マウス胚の操作マニュア
ル(近代出版、1989)、分子生物学プロトコール(南江
堂、1994)、ジーンターゲティング(羊土社、1995)な
どを参照することができる。
【0068】本発明の間葉系系列細胞の分化調節剤又は
骨・軟骨形成制御剤のスクリーニング方法は、マーカー
遺伝子を含有した発現ベクターを保持したトランスジェ
ニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、マーカー遺
伝子の発現レベルを評価することを特徴とする。なお、
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いるスクリーニ
ング方法を、スクリーニング方法Iと称する。
【0069】ここで、間葉系系列細胞としては、骨芽細
胞、軟骨細胞、未分化間葉系系列細胞、骨細胞、繊維芽
細胞、脂肪細胞、歯芽細胞などが挙げられる。
【0070】本発明のスクリーニング方法Iは、本発明
のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与
し、マーカー遺伝子の発現を上昇または抑制させること
を、間葉系系列細胞の分化調節又は骨・軟骨形成制御を
調節することの指標として評価するものである。
【0071】具体的には、間葉系系列細胞の分化調節剤
をスクリーニング対象とする場合、トランスジェニック
非ヒト哺乳動物中の間葉系系列細胞と対照細胞(例え
ば、肝細胞等)との両方におけるマーカー遺伝子の発現
を、免疫染色法、ELISA法、RI標識された酵素基
質を用いたアッセイ法、発光基質を用いたレポータージ
ーンアッセイ法などにより評価する(別冊実験医学 遺
伝子導入&発現解析実験法、羊土社:1997、別冊実
験医学 免疫染色・in situ ハイブリダイゼー
ション、羊土社:1997)。このとき、間葉系系列細
胞においてマーカー遺伝子の発現が見られ、対照細胞に
おいてはマーカー遺伝子の発現が全く見られないかもし
くはごく微弱な発現しか見られず、かつ、例えば間葉系
系列細胞におけるマーカー遺伝子の発現が、被検物質非
投与群と比較して被検物質投与群において1.2 倍以上
(もしくは0.8 倍以下) となるなど明らかに発現を上昇
(あるいは抑制) させる被検物質が、間葉系系列細胞の
分化調節剤の候補物質となる。
【0072】得られた間葉系系列細胞の分化調節剤の候
補物質の薬理評価の評価系としては、例えば、アルカリ
ホスファターゼ活性変動を指標とするラット初代培養骨
髄細胞培養系が挙げられる。前記アルカリホスファター
ゼは、骨芽細胞の初期分化マーカー遺伝子であるので、
本酵素活性の上昇(下降)は骨芽細胞の初期分化の促進
(抑制)を示すからである。その際、候補物質添加群が
物質無添加群の1.2 倍以上、好ましくは1.4 倍以上の酵
素活性を示す場合、初期分化の促進を表し、0.8 倍以
下、好ましくは0.7 倍以下の酵素活性を示す場合、初期
分化の抑制を表すものと考えられる。
【0073】一方、骨・軟骨形成制御剤をスクリーニン
グ対象とする場合、トランスジェニック非ヒト哺乳動物
の骨芽細胞・軟骨細胞と対照細胞(例えば腎臓細胞な
ど)との両方におけるマーカー遺伝子の発現を、免疫染
色法、ELISA法、RI標識された酵素基質を用いた
アッセイ法、発光基質を用いたレポータージーンアッセ
イ法などにより評価する(別冊実験医学 遺伝子導入&
発現解析実験法、羊土社:1997、別冊実験医学 免
疫染色・in situ ハイブリダイゼーション、羊
土社:1997)。このとき、骨芽細胞・軟骨細胞にお
いてマーカー遺伝子の発現が見られ、対照細胞において
はマーカー遺伝子の発現が全く見られないかもしくはご
く微弱な発現しか見られず、かつ、例えば骨芽細胞・軟
骨細胞におけるマーカー遺伝子の発現が、被検物質非投
与群と比較して被検物質投与群において1.2 倍以上(も
しくは0.8 倍以下) となるなど明らかに発現を上昇 (あ
るいは抑制) させる被検物質が、骨・軟骨形成制御剤の
候補物質となる。
【0074】得られた骨・軟骨形成制御剤の候補物質の
薬理評価の評価系としては、骨・軟骨基質産生調節評価
系が挙げられ、例えば骨芽細胞培養系における石灰化調
節作用・軟骨細胞培養系におけるプロテオグリカン産生
調節作用を指標として薬理評価を行なうことができる。
その際、候補物質添加群が物質無添加群の1.2 倍以上、
好ましくは1.4 倍以上の基質産生を示す場合、骨・軟骨
形成の促進を表し、0.8 倍以下、好ましくは0.7 倍以下
の基質産生を示す場合、骨・軟骨形成の抑制を表すもの
と考えられる。
【0075】本発明により提供される間葉系系列細胞の
形質転換細胞は、前記マーカー遺伝子を含有した発現ベ
クターを保持し、かつ該ベクター中のマーカー遺伝子の
発現レベルが、間葉系系列細胞の分化調節又は骨・軟骨
形成制御の指標となることを特徴とする、形質転換細胞
である。
【0076】かかる間葉系系列細胞の形質転換細胞は、
前記マーカー遺伝子を含有した発現ベクターを保持した
トランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離されたもの
であってもよく、慣用の形質転換法により作製したもの
であってもよい。
【0077】なお、内発性又は外来性のDNAが細胞内
へ導入された際、得られた細胞を形質転換細胞と称す
る。形質転換に用いられる発現ベクターは、細胞のゲノ
ムを構成する染色体DNA内に組み込まれていてもよ
く、染色体DNAに組み込まれず細胞内に保持されてい
てもよい。安定した形質転換細胞とは、形質転換させる
DNAが染色体に組み込まれたものであり、従ってその
DNAは染色体の複製を通じて娘細胞に受け継がれると
いう利点がある。
【0078】本発明の間葉系系列細胞の形質転換細胞
は、骨・軟骨形成組織において特異的なプロモーターを
保持しているため、骨・軟骨形成組織特異的なマーカー
遺伝子の発現の有無及び強度を指標として、簡便に、間
葉系系列細胞の分化調節剤又は骨・軟骨形成制御剤をス
クリーニングすることができるという優れた性質を有す
る。
【0079】したがって、本発明の形質転換間葉系系列
細胞により、間葉系系列細胞の分化調節剤又は骨・軟骨
形成制御剤のスクリーニング方法が提供される。なお、
前記形質転換間葉系系列細胞を用いるスクリーニング法
をスクリーニング法IIと称する。
【0080】本発明の間葉系系列細胞の分化調節剤又は
骨・軟骨形成制御剤のスクリーニング方法IIは、被検
物質の存在下で、前記間葉系系列細胞の形質転換細胞を
培養し、マーカー遺伝子の発現レベルを評価することを
特徴とする。
【0081】本発明のスクリーニング方法IIは、被検
物質の存在下で本発明の発現ベクターを保持した間葉系
系列細胞の形質転換細胞の培養を含む。ここで、プロモ
ーターは、間葉系系列細胞の分化又は骨・軟骨様の細胞
分化や組織形成の間において、発現調節が可能であリ、
マーカー遺伝子の発現を調節し、それにより発現された
マーカー遺伝子産物を用いて、間葉系系列細胞の分化調
節能又は骨・軟骨形成制御能の有無の解析を可能にす
る。ここでのマーカー遺伝子の検出は、薬剤による間葉
系系列細胞の分化調節、又は骨・軟骨形成制御作用の指
標となる。
【0082】具体的には、間葉系系列細胞の分化調節剤
をスクリーニング対象とする場合、形質転換された間葉
系系列細胞と対照細胞(例えば、肝臓由来細胞株 HepG2
など)との両方におけるマーカー遺伝子の発現をルシフ
ェラーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子等を用いた
レポータージーンアッセイにより評価する。このとき、
間葉系系列細胞においてマーカー遺伝子の発現が見ら
れ、対照細胞においてはマーカー遺伝子の発現が全く見
られないか、あるいはごく微弱な発現しか見られず、か
つ被検物質存在下の間葉系系列細胞においてマーカー遺
伝子の発現を明らかに変動させる被検物質が、間葉系系
列細胞の分化調節剤の候補物質となる。
【0083】得られた間葉系系列細胞の分化調節剤の候
補物質の薬理評価は、前記と同様である。
【0084】一方、骨・軟骨形成制御剤をスクリーニン
グ対象とする場合、形質転換された骨芽細胞及び/又は
軟骨細胞と対照細胞(例えば、腎臓由来細胞株 HEK-293
など)との両方におけるマーカー遺伝子の発現をルシフ
ェラーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子等を用いた
レポータージーンアッセイにより評価する。このとき、
骨芽細胞・軟骨細胞においてマーカー遺伝子の発現が見
られ、対照細胞においてはマーカー遺伝子の発現が全く
見られないか、あるいはごく微弱な発現しか見られず、
かつ被検物質存在下の骨芽細胞・軟骨細胞においてマー
カー遺伝子の発現を明らかに変動させる被検物質が、骨
・軟骨形成制御剤の候補物質となる。
【0085】得られた骨・軟骨形成制御剤の候補物質の
薬理評価は、前記と同様である。
【0086】これらのスクリーニング方法I及びIIに
よりスクリーニングされた物質は、哺乳動物に、薬剤と
して有効量を投与、あるいは薬学的に許容される担体と
結合させ、得られた医薬組成物を有効量投与することに
より、骨・軟骨欠損や間葉系系列細胞の分化異常の処置
を可能にする。
【0087】
【実施例】以下、本発明の一例として実施例により本発
明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これら実施例
により何ら限定されるものではなく、本発明の技術分野
における通常の変更ができることはいうまでもない。
【0088】実施例1 マウスCbfa1 プロモーター(7kb) を発現調節領域に持つ
β−ガラクトシダーゼ発現ベクターの構築 マウスCbfa1 の第1エクソン内の第1メチオニンの約50
塩基下流から上流約7kb (配列番号:2)を発現ベクタ
ーpNASS β(クローンテック) のXho1-site にライゲイ
ションキット(宝酒造)を用いて連結し、Cbfa1 プロモ
ーター7kb を発現調節領域に持つβ−ガラクトシダーゼ
発現ベクター(以下7k-pNASSβ)を得た。7k-pNASSβを
用いて、heat shock法により大腸菌を形質転換した。形
質転換体を常法により培養後、DNA精製キット(プロ
メガ)により、7k-pNASSβを大量調製した。得られた7k
-pNASSβを制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動に
より分離した。透析膜を用いて、目的の断片をアガロー
スゲルより回収後、フェノール・クロロホルム処理及び
エーテル処理を行い精製した。
【0089】実施例2 マウスCbfa1 プロモーター(7kb )を発現調節領域に持
つβガラクトシダーゼ発現ベクターのトランスジェニッ
クマウスの作出 (1)注入用DNAの調製 上記により大量調製したDNAをTE (10 mM Tris, 0.1
mM EDTA, pH. 7.4-7.5) で、1〜3ng/μl になるよう
に調製した。
【0090】(2)トランスジェニックマウスの作出 実験用マウスにはB6C3F1マウス(日本クレア)を用い
た。8週齢の採卵用雌性マウスに妊馬血清性性腺刺激ホ
ルモン (PMSG) (帝国臓器製薬)及びヒト胎盤性性腺刺
激ホルモン (hCG)(帝国臓器製薬)を48時間間隔で各
々5 IU腹腔内に投与したあと、正常の同系雄性マウス
(日本クレア)との同居により交配した。翌日、雌マウ
スの腟に腟栓(プラグ)が形成されているものを交配が
成立したマウスと判断した。交配が成立したマウスよ
り、卵管から顆粒層細胞及び卵丘細胞に囲まれた受精卵
(前核期受精卵)を採取した。採取した受精卵を0.1%ヒ
アルロニダーゼ(ナカライテスク)を含むM2 メディウ
ム(SIGMA )で室温、1 〜5 分間の酵素処理を行い、卵
丘細胞を除去した後、M2 メディウムで2 回洗浄して酵
素を除去し、DNA注入操作までM16メディウム(SIGM
A )中でCO2 インキュベーター内(5% CO2 - 95% O2
飽和湿度)に保存した。
【0091】数時間培養した受精卵の雄性前核に顕微注
入法を用いてDNAを注入した。注入操作した卵を仮親
に移植して出産させ、産仔を得た。得られた産仔は4週
齢時に、尾の先端部約1cmを切りDNAを抽出、精製
した後PCR法にて導入した遺伝子が染色体に組み込ま
れているかどうかを確認した。その際、用いたプライマ
ーは5'-ataattcgcgtctggccttcc-3' (配列番号:3)と
5'-cctcagtggatgttgctttac-3' (配列番号:4)であっ
た。
【0092】導入が確認されたものをF0として正常マウ
スと交配させ、その産仔の尾部DNAを用いてPCR法
によりトランスジーンの有無を確認した。トランスジー
ンが確認されたマウスをF1とした。F1雄性マウスを正常
雌性マウスと交配させ、雌性マウスの妊娠が確認されて
からの経時変化を追って胎児を取り出し、X-gal 染色を
行なった。
【0093】X-gal 染色は以下の手順で行なった。ま
ず、胎仔を取り出し、PBS (日水製薬)で洗浄し、4%パ
ラホルムアルデヒド(MERCK 製)で20分固定した。その
後、X-gal バッファー [4 mM K4Fe(CN)6 3H2O, 4 mM K3
Fe(CN)6, 2 mM MgCl2, X-gal(SIGMA 製) 1 mg/ml]中で
胎児を29℃で終夜浸漬して発色させた。発色があったも
のは、パラフィン包埋による組織切片を作製し、発現部
位の同定を行なった。
【0094】実施例3 導入した発現ベクターのトランスジェニックマウスにお
ける発現 発現状態の検討は、胎児全体を染色して観察を行ない
(whole)、同時に組織切片を作製して細部の観察を行な
った (section)。結果を以下に示す。
【0095】胎児全体 (whole)及び組織切片 (section)
の観察により、以下の部位に特異的にβガラクトシダー
ゼ遺伝子の発現が観察された。 E9.5(胎生9.5 日齢) whole:側頭部を中心に後頭にかかて広範に染色される。
脊柱にそって縞状に染色される。 section:頭部間葉系系列細胞、somite(原節)外側 E10.5 whole:前頭部、頭頂部、後頭部から頸椎領域。limb bud
(肢芽)。脊柱にそって縞状に染色される。 section:頭部間葉系系列細胞に広く染色される。limb b
udの一部。somite付近は切片では明確でない。 E11.5 whole:前頭部、頭頂部、後頭部、鼻部。眼下部に限局し
た染色領域あり。脊柱全域。四肢は軟骨原器周囲。 E12.5 whole:前頭部、頭頂部、後頭部、鼻部。四肢の軟骨原器
周囲。脊柱全域。 section: genital tubercle (性器結節)の一部。futu
re incisor region (予定切歯領域)。thymic primord
ium (胸腺原基)。midbrain(中脳)の一部。nasal ca
vity(鼻腔)の壁の一部。nasal bone(鼻骨)形成領
域。 E13.5 whole:前頭部、頭頂部、後頭部、鼻部。四肢の軟骨原器
周囲。脊柱全域。肋骨の一部。 E15.5 whole:前頭部、頭頂部、後頭部、鼻部。四肢骨周囲。脊
柱。肋骨の一部。 section: tendon (腱)。calvaria(頭蓋冠)。nasal
bone。mandible(下顎骨)周囲。nasal cavityの壁周
囲。vertebrae (椎骨)。dura matter (硬膜)。preh
ypertrophic chondrocytes(前肥大軟骨細胞)からterm
inal hypertrophicchondrocytes(終末肥大化軟骨細
胞)までのchondrocytes(一部immature chondrocytes
(未分化軟骨細胞)も染色されることあり)。osteobla
sts (骨芽細胞)。
【0096】以上のように7k-pNASSβは、未分化間葉系
系列細胞を含む骨及び軟骨系列の細胞・組織特異的に発
現していることが明らかとなった。
【0097】実施例4 マウスCbfa1 プロモーター(2kb )を発現調節領域に持
つβガラクトシダーゼ発現ベクターのトランスジェニッ
クマウスにおける発現 実施例1と同様にして、マウスCbfa1 の第1エクソン内
の第1メチオニンの約50塩基下流から上流約2kb (配列
番号:1)を発現ベクターpNASS β(クローンテック)
のXho1-site にライゲイションキット(宝酒造)を用い
ligationし、Cbfa1 プロモーター2kb を発現調節領域に
持つβガラクトシダーゼ発現ベクター(以下2k-pNASS
β)を得た。その後、実施例2と同様にしてトランスジ
ェニックマウスを作出し、得られたマウスについて実施
例3と同様の発現部位の観察を行った。結果を以下に示
す。
【0098】#49 E11.5 whole:後頭部。眼。胸部・腹部(脊柱より腹側)が広範
に染色される。四肢軟骨原器周囲。tail 縞状に染色さ
れる。 section:肋骨周囲と上皮までの間葉系系列細胞に広範に
染色が見られる。 #9 E11.5 whole:下顎から頸部にかけて。脊柱腹側に強く、脊柱に
弱く染色される。四肢に弱い限局した染色あり。
【0099】Cell 58: 337-347(1989)に記載のように、
トランスジェニックマウスにおいては、ニワトリβアク
チンプロモーター下流の外来遺伝子の発現が、全身にお
いて見られることが示されている。これと比較して、2k
-pNASSβの場合では、骨及び軟骨系列の細胞・組織への
特異性が見られた。かかる特異性は、7k-pNASSβの場合
に比べ低かった。
【0100】実施例5 (1)間葉系系列細胞の分化調節剤のスクリーニング 前記実施例3において得られたトランスジェニックマウ
スに、化合物ライブラリーの数種類の化合物を被検物質
として、それぞれ経口・皮下・あるいは腹腔内に1日1
回投与する。投与期間は1日〜2週間程度とし、12時間
の明暗サイクルの下、室温23℃±2 ℃、湿度55%±10%
に調節された飼育室にて食餌・給水を自由とした飼育条
件にて飼育を行う。また、対照として溶媒のみを投与し
た群を設定し、前記と同様に飼育する。ついで、上記の
投与が終了した動物より臓器を摘出し、実施例2と同様
にX-gal 染色し、間葉系系列細胞と対照細胞(肝細胞・
腎臓細胞など)におけるβ−ガラクトシダーゼの発現レ
ベルを、組織切片を作製して評価する。あるいは組織の
ホモジネートについて、発光基質を用いたβ-galアッセ
イにより比較する。このとき、溶媒のみを投与したトラ
ンスジェニックマウスの間葉系系列細胞におけるβ−ガ
ラクトシダーゼの発現レベルと比較して被検物質を投与
したトランスジェニックマウスの間葉系系列細胞におけ
るβ−ガラクトシダーゼの発現レベルを明らかに(0.8
倍以下もしくは1.2 倍以上)変動させる被検物質が、間
葉系系列細胞の分化調節剤の候補物質となる。
【0101】得られた間葉系系列細胞の分化調節剤の候
補物質についての薬理評価は、アルカリホスファターゼ
活性変動を指標とするラット初代培養骨髄細胞培養系を
用いて行なうことができる。前記アルカリホスファター
ゼは、骨芽細胞の初期分化マーカー遺伝子であるので、
本酵素活性の上昇(下降)は、骨芽細胞の初期分化の促
進(抑制)を意味する。その際、候補物質添加群が物質
無添加群の1.2 倍以上、好ましくは1.4 倍以上の酵素活
性を示す場合、初期分化の促進を表し、0.8 倍以下、好
ましくは0.7 倍以下の酵素活性を示す場合、初期分化の
抑制を表す。
【0102】(2)骨・軟骨形成制御剤のスクリーニン
グ 前記(1)において、間葉系系列細胞の代わりに、骨芽
細胞・軟骨細胞を用いて、同様に被検物質の評価を行
う。候補物質の薬理評価の評価系としては、骨・軟骨基
質産生調節評価系が挙げられ、骨芽細胞培養系における
石灰化調節作用及び軟骨細胞培養系におけるプロテオグ
リカン産生調節作用を指標として薬理評価を行なうこと
ができる。その際、候補物質添加群が物質無添加群の1.
2 倍以上の基質産生を示す場合、骨・軟骨形成の促進を
表し、0.8 倍以下の基質産生を示す場合、骨・軟骨形成
の抑制を表す。
【0103】実施例6 間葉系系列細胞を用いた、間葉系系列細胞の分化調節剤
又は骨・軟骨形成制御剤のスクリーニング 1)マウス未分化間葉系系列細胞の培養 マウス未分化間葉系系列細胞株C3H10T1/2 を、100 mm直
径の培養皿に40-70%コンフルエントになるようにまきこ
む。1日後、pSV2 neo(BRL )1μg と実施例1又は4
で作製した各レポーターベクター24μg との計25μg を
リン酸カルシウム法あるいはLT-1(Panvera) により導入
する。遺伝子導入2日培養後、1/100 の細胞密度となる
ように100 mm直径の培養皿3枚にまき直すと同時に、抗
生物質であるG418(500μg/ml) によるセレクションを開
始する。増殖してきたコロニーは、もう一度1/100 の細
胞密度となるようにまき直す。再度コロニーを形成した
ものに対してコロニーリングでトリプシン処理にてコロ
ニーを24ウエル培養皿に移す。
【0104】2)スクリーニング用細胞の選択 24ウエル培養皿に移した細胞が増殖してきたら、継代す
る時点で一部を96穴ウエル培養皿にまきこみ、1日後、
プロモーター活性を変動させる物質(レチノイン酸な
ど)を添加する。その際、何も添加しないウエルも残し
ておく。さらに48時間後、培地を吸引し、PBS(-)で洗浄
後、レポーターアッセイキット(東洋紡)中に含まれる
細胞溶解バッファーを20μl 添加して細胞を溶解した。
β−ガラクトシダーゼ活性は前記のレポーターアッセイ
キットを使用しルミノメーター(Dynatech Laboratorie
s ML3000など)を用いて測定した。ルシフェラーゼ遺伝
子をレポーター遺伝子とする場合は、次のようにアッセ
イを行った。すなわち、培養終了後、培地を吸引し、PB
S(-)で洗浄後、細胞溶解液(ニッポンジーン)を20μl
添加して細胞を溶解した。ルシフェラーゼ活性は、ルシ
フェラーゼアッセイ基質(プロメガ)を基質としてルミ
ノメーターで検出した。
【0105】プロモーター活性を変動させる物質での活
性変動率の高い細胞、すなわち被検物質がプロモーター
活性に及ぼす作用がより検出し易い細胞を選択し、拡大
培養してストックした。
【0106】3)ハイスループット・スクリーニング 2)で作製した細胞を、96ウエル培養皿に400000個/ウ
エル/100 μl になるようにまきこみ、24時間培養を行
なう。その際の培地としては、上記C3H10T1/2の場合
は、10% ウシ胎児血清を含むEagles Basal Medium(BME)
(ギブコ)を使用する。各ウエルに被検化合物溶液(10
μg/ml) を25μl ずつ添加し(終濃度2 μg/ml)、24時
間培養を続ける。培養終了後、培養上清を吸引し、ルシ
フェラーゼの基質(LucLite;パッカード)を添加し、定
量する。
【0107】ついで、上記間葉系系列細胞においてマー
カー遺伝子の発現を変動させた被検物質につき、同様に
対照細胞(肝臓由来細胞株HepG2 など)の形質転換細胞
におけるマーカー遺伝子発現を検討し、間葉系系列細胞
においてマーカー遺伝子発現を変動させるが対照細胞で
は変動させない被検物質を選択し、間葉系系列細胞の分
化調節剤の候補物質とする。
【0108】得られた間葉系系列細胞の分化調節剤の候
補物質の薬理評価は、アルカリホスファターゼ活性変動
を指標とするラット初代培養骨髄細胞培養系を用いて行
なうことができる。前記アルカリホスファターゼは、骨
芽細胞の初期分化マーカー遺伝子であるので、本酵素活
性の上昇(下降)は骨芽細胞の初期分化の促進(抑制)
を意味する。その際、候補物質添加群が物質無添加群の
1.2 倍以上の酵素活性を示す場合、初期分化の促進を表
し、0.8 倍以下の酵素活性を示す場合、初期分化の抑制
を表すものと考えられる。
【0109】配列表フリーテキスト 配列番号:3は、トランスジェニックマウスの確認用の
プライマーの配列である。
【0110】配列番号:4は、トランスジェニックマウ
スの確認用のプライマーの配列である。
【0111】
【発明の効果】本発明のDNAは、in vivo においても
骨・軟骨形成組織特異的に発現調節できるという優れた
性質を有する。また、本発明の発現ベクターは、外来遺
伝子を骨・軟骨形成組織特異的に発現させ得るという優
れた効果を奏する。したがってかかる発現ベクター自体
が骨・軟骨疾患における遺伝子治療に好適に用いられう
る。さらに本発明の遺伝子治療剤及びそれを用いる処置
法によれば、骨・軟骨形成組織特異的なドラッグターゲ
ッティングを可能にし、それにより、骨・軟骨形成組織
を除く組織への副作用を低減し、より特異的な骨・軟骨
疾患の処置を可能にするという優れた効果を奏する。ま
た、本発明により、骨・軟骨・歯欠損や間葉系系列細胞
の分化異常の処置を可能にする間葉系系列細胞の分化調
節剤又は骨・軟骨形成制御剤のクリーニング系が提供さ
れる。
【0112】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Toshihisa Komori <120> Promoter which is specific to the tissues involving ossification a nd chondrogenesis, as well as the use thereof <130> SP-12-004 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1
【0113】 <210> 1 <211> 1870 <212> DNA <213> mouse <400> 1 taaagaatct tatgaacatg atttcataga taactttaac taagaggaaa caaaaacaga 60 caatgagtta ttttggggtg tacagacaca agaatatttt acttctgtca ccctctaagt 120 cactccctct tacctccact gtgcacccca aataatttct tgtacttctg tgcccccacc 180 caccatcaca gtcatccgtt ccatgccact cctggttacc atcacactag gaagaaatct 240 aacatgcaaa ttcagagtgg cgtggataaa tggcaaaaaa tgcctaggaa attggtctgc 300 tcgcctttat aatgtttgtt gaaaaatcct ccatcgctcc caactaatga aaacaggaag 360 ctctattcat aaatgtgaaa ttcactgcct atgatatata atcatcctaa taagaaaatg 420 agctctagac atacatgtcc aagagggcaa aagaagagat agtttcccaa agatggtttc 480 aattttcttc tgaatcagaa ttagcaaatc aagacgacta acatactctg tctgtgtgca 540 ttattcctta ctacacacag cattttgtaa tttatttcaa agcttccatt ataaacaaca 600 aaaacttaca gtttctgtta accccctcta ttctgagcta tggaaattac tgcatatttc 660 attatatatg cagaactgca cccaaagtcc tgttacagtc actgtccacg ctgatgaaag 720 aattatacaa aacatttctt tgaaagataa aatccaatca tacagaaaac taacattagt 780 ccaacaaaat gtccaccaca attcctgaca tttgtttttt aagatcttca aagtaaccat 840 gggatgatgg caaaaataat gtaaacgata ctaattacat ttaatcttta ttgtaagagc 900 cgccacgtaa taaaaaaaaa aaaatcaact acacagccat gatttaatat ttgtaaagga 960 atccccaggc taacactttt gtgacagcca attacagtcg atcccgatcc cggcaaggag 1020 tttgcaagca gagctctgga aaggtaaact cctttttaca atgagttaca gatccccaag 1080 cttaggaaga caagcaaaag gcaaacagaa ggaagcagcc accctgggaa atccgaagca 1140 gccttgcaag tgatacaatc ccaagatgcg aattactgca aagcagcact gttgctcaga 1200 acgccacaca ctcagttgag acaattttgc tcacttttcc atagacataa taatgaagga 1260 aagggaggag gggtagagaa gagagatgaa aaagcagagg agggaagggg gagtagggag 1320 gtggcagaaa ggaaaagcct tagctacaga gttctgctct ccagaggctt aaccttacag 1380 gagtgtgggc tccttcagca tttgtgttct agccaaatcc tcatgagtca caaaaattaa 1440 aaagctataa ccttctgaat gccaggaagg ccttaccaca agccttttgt cagagggaga 1500 aagggagaga gagagggaga gagagaggga gagagagagg gagagaggaa gggaaggaga 1560 gacagaggaa cacccataag taaagagaca gaaggaagga aagggagagg acaagagaag 1620 agaaaggagg gaggggaggg gagaaggaaa aagattgaga aagagggagg gaagagagca 1680 agggggaagc cacagtggta ggcagtccca ctttactttg agtactgtga ggtcacaaac 1740 cacatgattc tgtctctcca gtaatagtgc ttgcaaaaaa taggagtttt aaagcttttg 1800 cttttttgga ttgtgtgaat gcttcattcg cctcacaaac aaccacagaa ccacaagtgc 1860 ggtgcaaact 1870
【0114】 <210> 2 <211> 6703 <212> DNA <213> mouse <400> 2 agagtctcct caacgggtct aaaaatggcc tgtgcagttc tcttcttttc ctttttttat 60 tttctttttt ctttctttct ttctttttct tttttttttt ttcgtagcaa tcaatctagg 120 ttcacaaata tagctaacct ttgagaaata aacaccagtt cttttttaaa caatctattt 180 gtacatggca tattctcatc tctctatgaa tttgttcact gaaaagccag aagtggttgc 240 cccagtcttc atgctctgga aggacatcag ccacatggga aaggaggtct gtgtctctgt 300 agattgtgtt gggagaacag agaggacaca aacttatctt gggaggttag aattattata 360 agtatattaa gtatatacac taatcaagtg aaaagtcttg tgaatgtttt taatacaatt 420 attgcaaata gtaattatga acaagtccaa atatatcatt ttattaaaag aaacactttt 480 gcaaaagtct agagttcact aaaaatgtca gtttttgagg caccaacttt cttttaagaa 540 aacttgtaat tttaattata gttttgaatt ttgaacaaag ctttaatcat cgcataaaag 600 actggtagcc tgcaaattat gcctacatac ttagaaactg tcttctccag aatttatttc 660 aatgcttcca agcttttact aaattataaa atttacaaac actgtttata agtaatattg 720 ttttttaaat atactttaag aaattgtaat tttcctaata ttatcagaaa atacaaatat 780 ttgaatattt ctaattttta aaaatcttta 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gaacattaaa tatattaaaa tctgatcttt 1680 ttatgataca ttgatacatt tttagccaca tcaaataaaa gttcactttt gctttgcctt 1740 gacttcatca agtttatgga cagaagggga acgtatggat acaatggtga gagagacaat 1800 tactcagaaa agaaggatgc ctcactgggc ttgactcaag ttggggccac tacccaacaa 1860 caaatgataa gtcagacttt taaaaactgc acctggctct ctacaaagct tacataagac 1920 caacagtatc taaaattgta actttgttgc cttttgggtg acaggctcct ctaactctgt 1980 tcaatacaag aacaattcaa gtgaacaaga gagtggtggc ctatagggcc ttttccaaga 2040 caagggacac caattaagtt ctcacttcag aataatgtca tctgcagtaa agtcctaaat 2100 cacaaagaca aaatgacaat caaggttccc atgtattagg ctgccccaca cttacccctt 2160 actatgcaag cacaaaagtt agtttcactt ttccctagat acactaactt gcatagctag 2220 gatattattt ttctttggtt tggtcagaag catgtttgat ataaatttta ttaagtggta 2280 gtgtatgtaa cattgcattg tgggtagtcg tttcctgctt tagtctggcc acatcctcag 2340 ctgtcataca agcatgtttc ccacattttg tgcaagttgt caccttttta aaaaaaaaaa 2400 tcttacaaaa atgacacgaa gatgaattgc tttaataatt ataagaaaca taaaatattt 2460 tatacagata cattacagaa gtatagacca ccactcttca gagagcaatg cctcacaatc 2520 agagtgctaa tgtcatacat aacaatatgc ctaagtaaaa gagcataaag gaaagggtca 2580 agggacagac tggcagaaat aaaacattcc tggacagagc tgtcaatgat ctctaagacc 2640 tgaggtacag tacaccgcag tgtgcacaaa gggctgcact tcagacctgt gaggtgctca 2700 ttagtgagtg ctacaatgtc gatattcctc aatagaattt taagaaagtt ctgaatatat 2760 agaaacgtga aagcatggaa aaagaaaagt aaaaagcctg gagctggagt agaaaggaaa 2820 aagagaggaa cagaaatgaa ggaggaggga ccataggagg gggggtgtgg aggggggaag 2880 gaggggaagg aggagggagg aggtaagatg tggacactaa cttaggatgt tctctctggg 2940 catccaatct gcatattaca tcacacttag aaagaccact gccaggagta cacacgcatg 3000 aaatcagtaa acaagaaaac tgtggtactt tttaaaatat tatctaattt aaaacctcat 3060 agccaagttc aaaatactct gtactcacaa ccagatatgc tttcttatat ttgtaatata 3120 aagcatgaga gttaatatct cataatcata attcagaata taaaactata atgttttgct 3180 aacacagaac aatttcacgt ctttaataaa agtttgataa atgctaggtg aacttaaaca 3240 gctatgcatt aaacctgaaa aaagaaaaat tacccaccaa tggaaaacac aaattactaa 3300 atattaagtt aaaatgaatt aagaaagtcc 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taaactcttg tatcatgaga tacagaccat 4200 aactcacaga cacaggaaat agggttaggt tacctgcaaa acagaccatg tgactactca 4260 tctgataaat gagatggtgg taaaatttat tcaaattcat tttagatcaa tttgaatacc 4320 aaaatgtata tacctttttt ttaaaaaatg taagggaaaa attattgcat gaaaaattag 4380 gacataaaag acctgggcac tctaaaagaa aagcatttgc ttactatcct atagcaacta 4440 cgcaaacatc ttcaactgcc aagtgctgcg attccttgta catatggaac taagttcaga 4500 aactccacaa attatataga caaaaccctt tttttattta ctttgaataa tagagataaa 4560 gatcacactg gcacacttta tttatgaaag aggataatag agtaactttt ttctcctctg 4620 catgaataat gaccctaaat gaaaacttca gtataaatat ctgttttaca gtaaaacatg 4680 agtctagcct caaaaatcaa acaaaagaat gtatttctgt ggttttgtca ttaaaacttt 4740 attctgaaaa attaaataaa taaacctaga ttcttgaaaa ataaggggtt aaaagcatta 4800 ccatgtcttt ccagtatata gagaataaat gtttaaagaa tcttatgaac atgatttcat 4860 agataacttt aactaagagg aaacaaaaac agacaatgag ttattttggg gtgtacagac 4920 acaagaatat tttacttctg tcaccctcta agtcactccc tcttacctcc actgtgcacc 4980 ccaaataatt tcttgtactt ctgtgccccc acccaccatc acagtcatcc gttccatgcc 5040 actcctggtt accatcacac taggaagaaa tctaacatgc aaattcagag tggcgtggat 5100 aaatggcaaa aaatgcctag gaaattggtc tgctcgcctt tataatgttt gttgaaaaat 5160 cctccatcgc tcccaactaa tgaaaacagg aagctctatt cataaatgtg aaattcactg 5220 cctatgatat ataatcatcc taataagaaa atgagctcta gacatacatg tccaagaggg 5280 caaaagaaga gatagtttcc caaagatggt ttcaattttc ttctgaatca gaattagcaa 5340 atcaagacga ctaacatact ctgtctgtgt gcattattcc ttactacaca cagcattttg 5400 taatttattt caaagcttcc attataaaca acaaaaactt acagtttctg ttaaccccct 5460 ctattctgag ctatggaaat tactgcatat ttcattatat atgcagaact gcacccaaag 5520 tcctgttaca gtcactgtcc acgctgatga aagaattata caaaacattt ctttgaaaga 5580 taaaatccaa tcatacagaa aactaacatt agtccaacaa aatgtccacc acaattcctg 5640 acatttgttt tttaagatct tcaaagtaac catgggatga tggcaaaaat aatgtaaacg 5700 atactaatta catttaatct ttattgtaag agccgccacg taataaaaaa aaaaaaatca 5760 actacacagc catgatttaa tatttgtaaa ggaatcccca ggctaacact tttgtgacag 5820 ccaattacag tcgatcccga tcccggcaag gagtttgcaa gcagagctct ggaaaggtaa 5880 actccttttt acaatgagtt acagatcccc aagcttagga agacaagcaa aaggcaaaca 5940 gaaggaagca gccaccctgg gaaatccgaa gcagccttgc aagtgataca atcccaagat 6000 gcgaattact gcaaagcagc actgttgctc agaacgccac acactcagtt gagacaattt 6060 tgctcacttt tccatagaca taataatgaa ggaaagggag gaggggtaga gaagagagat 6120 gaaaaagcag aggagggaag ggggagtagg gaggtggcag aaaggaaaag ccttagctac 6180 agagttctgc tctccagagg cttaacctta caggagtgtg ggctccttca gcatttgtgt 6240 tctagccaaa tcctcatgag tcacaaaaat taaaaagcta taaccttctg aatgccagga 6300 aggccttacc acaagccttt tgtcagaggg agaaagggag agagagaggg agagagagag 6360 ggagagagag agggagagag gaagggaagg agagacagag gaacacccat aagtaaagag 6420 acagaaggaa ggaaagggag aggacaagag aagagaaagg agggagggga ggggagaagg 6480 aaaaagattg agaaagaggg agggaagaga gcaaggggga agccacagtg gtaggcagtc 6540 ccactttact ttgagtactg tgaggtcaca aaccacatga ttctgtctct ccagtaatag 6600 tgcttgcaaa aaataggagt tttaaagctt ttgctttttt ggattgtgtg aatgcttcat 6660 tcgcctcaca aacaaccaca gaaccacaag tgcggtgcaa act 6703
【0115】 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence of primer for confi rmation of transgenic mouse. <400> 3 ataattcgcg tctggccttc c 21
【0116】 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence of primer for confi rmation of transgenic mouse. <400> 4 cctcagtgga tgttgcttta c 21
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 19/02 C12Q 1/02 19/04 G01N 33/15 Z 19/08 33/50 X C12N 5/10 Z C12Q 1/02 C12R 1:91) G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA 33/50 A61K 37/02 37/24 //(C12N 5/10 C12N 5/00 B C12R 1:91) C12R 1:91) Fターム(参考) 2G045 AA29 AA35 BB01 BB14 BB20 BB24 BB51 CB13 FB01 FB02 FB05 GC15 4B024 AA01 AA11 BA80 DA02 EA04 FA02 FA10 GA12 HA17 4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QR77 QR80 QS38 QX01 QX02 4B065 AA91X AA91Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA04 BD50 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 BA44 DA01 DB22 DB63 NA14 ZA962

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 配列番号:1に示される塩基配列を少な
    くとも有してなるDNAであって、かつ骨・軟骨形成組
    織において特異的なプロモーター活性を呈する、単離さ
    れたDNA。
  2. 【請求項2】 配列番号:1に示される塩基配列を少な
    くとも有してなるDNAが、配列番号:2に示される塩
    基配列を有するDNAである、請求項1記載の単離され
    たDNA。
  3. 【請求項3】 (a)配列番号:1又は2に示される塩
    基配列において、少なくとも1塩基の置換、欠失、挿入
    又は付加を有するDNA、(b)配列番号:1又は2に
    示される塩基配列からなるDNAの相補鎖とストリンジ
    ェントな条件下でハイブリダイズしうるDNA、及び
    (c)配列番号:1又は2に示される塩基配列からなる
    DNAに少なくとも60%の配列同一性を有するDNA
    からなる群より選択されたDNAであって、かつ骨・軟
    骨形成組織において特異的なプロモーター活性を呈す
    る、単離されたDNA。
  4. 【請求項4】 転写の方向に関して、外来遺伝子配列の
    上流側に、請求項1〜3いずれかに記載の単離されたD
    NAが作動可能に連結されてなる、骨・軟骨形成組織特
    異的に外来遺伝子を発現させ得る発現ベクター。
  5. 【請求項5】 外来遺伝子が、対象疾患を治療するため
    のタンパク質をコードする遺伝子である、請求項4記載
    の発現ベクター。
  6. 【請求項6】 対象疾患を治療するためのタンパク質
    が、成長因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、ケモ
    カイン類、成長因子受容体、ペプチドホルモン受容体、
    サイトカイン受容体、ケモカイン類受容体、転写因子、
    転写調節因子、接着因子、細胞内情報調節因子、骨・軟
    骨基質タンパク質及び細胞骨格系タンパク質からなる群
    より選ばれた少なくとも1種である、請求項5記載の発
    現ベクター。
  7. 【請求項7】 外来遺伝子がマーカー遺伝子である、請
    求項4記載の発現ベクター。
  8. 【請求項8】 マーカー遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ
    遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェ
    ニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホル
    モン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク
    質遺伝子、青色蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タンパ
    ク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子及びこれらの誘
    導体からなる群より選ばれる、請求項7記載の発現ベク
    ター。
  9. 【請求項9】 請求項4〜6いずれかに記載の発現ベク
    ターを有効成分として含有してなる、骨・軟骨形成組織
    特異的に外来遺伝子を発現させ得る遺伝子発現剤。
  10. 【請求項10】 請求項9記載の遺伝子発現剤を有効成
    分として含有してなる、骨・軟骨形成組織特異的に外来
    遺伝子を発現させることにより治療され得る疾患のため
    の遺伝子治療剤。
  11. 【請求項11】 骨・軟骨形成組織特異的に外来遺伝子
    を発現させることにより治療され得る疾患が、代謝性骨
    疾患、軟骨関連疾患、異所性骨化又は異所性石灰化であ
    る、請求項10記載の遺伝子治療剤。
  12. 【請求項12】 請求項9記載の遺伝子発現剤を有効成
    分として含有してなる、骨・軟骨疾患のための遺伝子治
    療剤。
  13. 【請求項13】 骨・軟骨疾患が、代謝性骨疾患、軟骨
    関連疾患又は異所性骨化である、請求項12記載の遺伝
    子治療剤。
  14. 【請求項14】 骨・軟骨形成組織を標的とし、請求項
    9記載の遺伝子発現剤又は請求項10〜13いずれかに
    記載の遺伝子治療剤を導入することを特徴とする、骨・
    軟骨疾患又は異所性石灰化の処置方法。
  15. 【請求項15】 請求項4〜8いずれかに記載の発現ベ
    クターを保持してなるトランスジェニック非ヒト哺乳動
    物であって、該発現ベクター中の外来遺伝子が骨・軟骨
    形成組織特異的に発現することを特徴とする、トランス
    ジェニック非ヒト哺乳動物。
  16. 【請求項16】 請求項7又は8記載の発現ベクターを
    保持してなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物であっ
    て、該発現ベクター中のマーカー遺伝子が骨・軟骨形成
    組織特異的に発現することを特徴とする、請求項15記
    載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  17. 【請求項17】 発現ベクターが哺乳動物の染色体中に
    組み込まれてなる、請求項15又は16記載のトランス
    ジェニック非ヒト哺乳動物。
  18. 【請求項18】 非ヒト哺乳動物がげっ歯動物である、
    請求項15〜17いずれかに記載のトランスジェニック
    非ヒト哺乳動物。
  19. 【請求項19】 げっ歯動物がマウスである、請求項1
    8記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  20. 【請求項20】 請求項15〜19いずれかに記載のト
    ランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、
    マーカー遺伝子の発現レベルを評価することを特徴とす
    る、間葉系系列細胞の分化調節剤又は骨・軟骨形成制御
    剤のスクリーニング方法。
  21. 【請求項21】 請求項7又は8記載の発現ベクターを
    保持し、かつ該ベクター中のマーカー遺伝子の発現レベ
    ルが、間葉系系列細胞の分化調節又は骨・軟骨形成制御
    の指標となることを特徴とする、間葉系系列細胞の形質
    転換細胞。
  22. 【請求項22】 請求項15〜19いずれかに記載のト
    ランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離されてなる、
    請求項21記載の細胞。
  23. 【請求項23】 間葉系系列細胞が、骨芽細胞、軟骨細
    胞、未分化間葉系系列細胞、骨細胞、繊維芽細胞、脂肪
    細胞及び歯芽細胞からなる群より選択される、請求項2
    1又は22記載の細胞。
  24. 【請求項24】 被検物質の存在下で、請求項21〜2
    3いずれかに記載の細胞を培養し、マーカー遺伝子の発
    現レベルを評価することを特徴とする、間葉系系列細胞
    の分化調節剤又は骨・軟骨形成制御剤のスクリーニング
    方法。
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