JP5696991B2 - ヒトTGFβ1を発現するトランスジェニックマウス - Google Patents
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Description
また、IPF以外にも、TGFβ1の関与する繊維化および形態変化は、気管支喘息、COPD、肺癌などにも認められることが分かっている。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、肺特異的にTGFβ1を発現し、自然発症的に肺線維症を発症するTGマウスを提供することである。
上記トランスジェニックマウスの系統は、C57BL/6Jであることが好ましい。
また、上記トランスジェニックマウスの作成方法は、(1)ヒトTGFβ1遺伝子を含むBACにおいて、ヒトTGFβ1遺伝子のイントロン部分に選択用カセットを組み込み、選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子を得る選択用遺伝子組換え工程、(2)前記選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子の5'-側及び3'-側に、マウスSP-Cプロモータの下流の配列に相同的な配列を導入して、修飾hTGFβ1遺伝子フラグメントとする修飾工程、(3) 5'-側及び3'-側にフランキング配列を有するマウスSP-C全コード配列を含むBACにおいて、前記修飾hTGFβ1遺伝子フラグメントを、前記マウスSP-Cプロモータ領域の下流側に転移させて、SP-C・選択用hTGFβ1遺伝子フラグメントとする工程、(4)前記選択用カセットを取り除いて、SP-C-TGFβ1 BACトランスジェニック構築物を得る工程、(5)前記SP-C-TGFβ1 BACトランスジェニック構築物からSP-C-TGFβ1遺伝子を精製し、マウス胚にマイクロインジェクションして、トランスジェニックマウスを得る工程を備えることを特徴とする。
上記発明において、選択用遺伝子は、ストレプトマイシン感受性の野生型リボソーマルS12タンパクコード遺伝子(rpsl)であることが好ましい。
<試験材料と試験方法>
1.試薬
ダルベッコMEM(DMEM)、脂肪酸フリーBSA(BSA)及びL-グルタミンは、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich (St Louis, MO))から購入した。ウシ胎児血清(FBS)は、バイオ・ホイタッカー(Bio Whittaker (Walkersville, MD))、ペニシリンとストレプトマイシンは、ナカライテスクのものを用いた。非必須アミノ酸、トリゾール(TRIZOL)試薬、スーパースクリプト・プレアンプリフィケーション・システム(Superscript preamplification system)、リポフェクチン2000、オプティ-MEM(Opti-MEM)は、インビトロージェン(Invitrogen (Carlsbad, CA))から購入した。ブレオマイシン(Bleomycin (BLM))は、日本化薬から購入した。TGFβ1、PDGF、CTGF、TF、MCP-1、Smad3のsiRNAは、ハヤシ化成から購入した。その他の試薬については、試薬級または高度精製のものを一般的な市販品として購入した。
標的配列に対するsiRNA及び混合siRNAは、エンハンスト・siDirectプログラム(株式会社RNAi)を用いてデザインした。塩基配列として、オフターゲット作用を起こす可能性が低いものを選択した。
野生型マウスを用いた肺線維症モデルにおいて、潜在的に原因となりうる因子の経時的な変化を追うために、100 mg/kg BLMを経皮投与したマウスを投与後0, 3, 7, 14 及び 21日目に絶命させた。BALF中のTGFβ1, CTGF, PDGF, MCP-1及びTFタンパク質の濃度をEIAによって測定し、肺組織中の各mRNA量を各時点において定量的PCRによって測定した。BALF中の全タンパク質とコラーゲン濃度を各時点で測定し、21日目の肺内ヒドロキシプロリン濃度を測定した。
肺繊維化におけるsiRNAの効果を評価するために、20g〜22gのメス9〜11週齢のC57BL/6野生型(WT)マウスを用いた。マウスは、日本SLC(浜松市)から購入し、三重大学動物施設にて飼育した。本試験は、三重大学動物実験委員会によって承認された。滅菌生理食塩水にブレオマイシン(BLM)を溶解し、無作為抽出されたマウスに対して、浸透圧式ミニポンプ(model 2001; Alzet Corporation, Palo Alto, CA)を用いて、100 mg/kgを持続的に筋肉内投与することで肺障害を起こした。対照群には、BLMを含まない生理食塩水を投与した(20)。試験開始から、いずれの動物にも死亡例は認められなかった。21日後に、全ての試験動物を腹腔内へのペントバルビタールの過剰投与によって絶命させ、気管支肺胞洗浄液(BALF)、血液、及び臓器を摘出した。肺繊維化の程度は、アッシュクラフト・スコア(Ashcroft score)、CT所見、及び組織中のコラーゲン及び/又はヒドロキシプロリンの量によって評価した。
肺線維症に対するSmad3の抑制効果を評価するため、BLM投与によって肺線維症を起こさせたマウスに、マウス特異的Smad3 siRNA、混合siRNA、または基剤のみ(各5mg/kg)を投与し、肺線維症の程度を各投与処理から21日目に調べた。
マウスへの肺内投与の詳細は、既報(非特許文献1)に従って行った。簡単に説明すると、マウスの腹腔内にペントバルビタールナトリウム(75 mg/kg)を投与して睡眠状態とし、45°に傾けた処理台上に上歯を引っ掛けて吊した。舌をパッドしたピンセットを用いて引っ張り、その後から挿入した喉頭鏡を通して気管支を視認した。を気管支内微小噴霧器(Penn-Century, Philadelphia, PA)を用いて、肺内に75μLの試験液を投与し、機器を取り除いた。その後、マウスが完全に回復するまで監視した。この方法によって、経気管支的に投与された試験液が拡散することを75μLまたは50μLのエバンス・ブルーによって確認した。
肺内のTGFβ1 siRNAの局在を確認するために、C57BL/6野生型マウスに浸透圧ミニポンプを用いてBLMを投与し、その後7日目にCy3をラベルしたTGFβ1 siRNA(100μg)を経気管支投与した。3時間後にマウスを絶命し、肺を10%ホルマリンに漬けた後、膨らませて、パラフィンで固定した。肺組織は、パラフィンを除き、生理食塩水−トリス緩衝液にて数回洗浄した。洗浄後、切片を抗プロサーファクタント・タンパク質Cポリクローナル抗体(ウサギ血清:Millipore, Bedford, MA)と共に4℃にて1時間反応させ、生理食塩水−トリス緩衝液にて洗浄後、抗ウサギ抗体蛍光標識試薬(Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG)によって処理した。洗浄処理後に、サンプルを蛍光試薬を含むイメージング試薬(DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)を含むSlowFade Goldantifae)によって処理した。蛍光の局在を顕微鏡にて観察した。TGFβ1 siRNAのセンス配列とアンチセンス配列は、それぞれセンス:5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3'(配列番号1)、アンチセンス:5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3'(配列番号2)であった。
ヘパリンを含むチューブ内に心臓穿刺によって血液サンプルを集めた後、遠心分離(1000 g, 10 min)して血漿を回収した。BALFサンプルは、既報(非特許文献2)に記載された方法に従って得た。BALF中の全細胞数は、ケモメテック社製(ChemoMetec (Allerod, Denmark))の細胞計数装置によって計数した。BALFを遠心分離(1000 g, 10 min, 4℃)後に上清を回収し、必要となるまで-80℃にて保存した。分画細胞の計数のために、BALF細胞をサイトスピンを用いて遠心分離し、メイ・グリンヴァルト・ギムザ染料(May-Grunwald-Giemsa (Merck, Darmstadt, Germany))にて染色した。血液中の気体は、コーバスb221血液中気体システム(Cobas b221 Blood Gas system (Roche, Basel, Switzerland))によって解析した。
全タンパク質濃度は、市販のキット(BCATM protein assay kit; Pierce, Rockford, IL, USA)を用いて、使用マニュアルに従って測定した。ヒト及びマウスTGFβ1(R&D System, Minneapolis, MIN)、INF-αとIFN-β(PBL Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ)、MCP-1(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)、血液凝固活性マーカ、トロンビン・アンチトロンビン複合体(TAT)(Cedarlane Laboratories, Hornby, ON, Canada)及びTF(IMUBIND, Tissue factor, American Diagnostica, Greenwich, CT)の濃度については、市販のEIAキットを用いて、それぞれの使用マニュアルに従って測定した。PDGF濃度は、ポリクローナル抗PDGF抗体(Genzyme Corporation, Cambridge, MA)とビオチン化抗PDGF抗体を用いて測定した。PDGF濃度は、PDGF抗原の標準品を用いて作成した用量カーブに内挿することで求めた。PDGF測定系の日間及び日内変動は、10%以内であった。
マウスを絶命後、肺循環を生理食塩水で洗浄した後、肺と他の臓器を取り出した。左肺はホルマリン(10%中性緩衝液)でかん流し、ガスで膨らませて、ホルマリン中にて24時間固定した後、パラフィンに包埋した。5μm厚さの組織検査用切片を作成後、パラフィンを除き、生理食塩-リン酸緩衝液にて数回洗浄した。組織切片は、ヘマトキシリン/エオジンとマッソン三色染色法にて処理した。ランダムに抽出された切片を盲験観測者によって評価した。肺の組織学的検査は、オリンパスDP70デジタルカメラを装着したオリンパスBX50顕微鏡を用いて行った。全群の各マウスについて、肺組織中の5個の顕微鏡視野をランダムに抽出し、アッシュクラフト繊維化スコア(非特許文献3)に従って5名の盲験観測者が肺繊維化の状態を評価した。
肺中のコラーゲン沈澱量とヒドロキシプロリン濃度は、比色分析により測定した。簡単に説明すると、次の通りである。左肺を切除し、ホモジナイズ処理前に乾燥させた。サンプルを6N塩酸中にて20時間、110℃にて加水分解した。96穴プレートに、いずれも3個ずつ(triplicate)の標準品またはサンプル(5μL)を用意し、5μLクエン酸・酢酸緩衝液(238 mM クエン酸、1.2% 氷酢酸、532 mM 酢酸ナトリウム、85 mM 水酸化ナトリウム)、100μLクロラミンT溶液(16 mLクエン酸・酢酸緩衝液に0.282 gクロラミンTを添加した溶液、2 mL n-プロパノール、2 ml 精製水)を加えて、室温にて20分間反応させた。その後、100μL エールリッヒ溶液(9.3 mL n-プロパノールと 3.9 mL 70% 過塩素酸に 2.5 g p-ジメチルアミノベンゾアルデヒドを加えた溶液)を加えて、65℃にて20分間反応させた後、プレートリーダーにて 550 nm の吸光度を測定した。
浸透圧ミニポンプにより生理食塩水を皮下投与された野生型C57BL/6マウスをランダムに次の3群に分類した。生理食塩水の投与から3,7及び14日目に、第1群にはマウスTGFβ1 siRNAを(表1)、第2群にはヒト及びマウスに共通な配列を持つsiRNA/DNAキメラを(TGFβ1-Ch1、表3)、第3群には基剤のみを、それぞれ投与した。マウスは21日目に絶命し、BALFと肺サイトカインをEIAにて測定した。
マウスSP-Cプロモータによって制御されるヒトTGFβ1遺伝子を持つTGFβ1 BAC トランスジェニックマウスは、C57BL/6Jマウス胚への前核インジェクションによって作成された(日本クレア株式会社)。BACによるトランスジェニック動物作成の初代遺伝子導入と生殖細胞への伝達の確認は、ヒトTGFβ1遺伝子のイントロン1フラグメントを[P32]でラベルしたDNAプローブを使用し、Pstlによって切断した尾部DNAを用いたサザンブロットによって行った。子孫56匹のうち7匹には、コロニーが得られた導入遺伝子を持っていた。
TGマウスの作成方法について、詳細に説明すると次の通りである。NCBI(National Center for Biotechnology Information)データベースを用いてマウスBACエンドデータベースを検索し、RPCI-23メスC57BL/6Jマウスから、SP-C BAC クローンマウス(RP23-216B15)を選択した。BACエンド配列は、このBACクローンが、全3kbのマウスSP-C遺伝子配列に加えて、5'側に59kb、3'側に145kbのゲノムDNAを含むことを示している。NCBIのジーンバンク(GenBank)データベースをブラスト(BLAST)検索し、RPCL-11ヒトBACライブラリーからヒトTGFβ1 BAC(hTGFβ1 BAC)クローン(RP11-638N16)を選択した。BACエンド配列は、このBACクローンが全23kbのhTGFβゲノム配列に加えて、5'側に57kb、3'側に115kbのゲノムDNAを含むことを示している。
方法を説明すると次の通りである。ヒトTGFβ1遺伝子のイントロン近傍の二つの配列によって、rpsl-neo用選択カセットをPCRによって増幅した。PCRに用いたプライマーと、その塩基配列は、それぞれRHODTF forward1(5'-GTA TAC TCT GCC ACG GCT TCC AAG ACG GAG ACC AGC CAG GTG GCC CGT GAG CAA GGG CGA GGA GCT G:配列番号3)及び RHODTF reverse1(5'-GTA TAC ATG GGA GAC TCC TAC AGT CGG CCA CGG AGT CCC TGG CAG TCT TGT ACA GCT CGT CCA TGC C:配列番号4)であった。増幅したrpsl-neo選択用カセットをRed/ET組み換えによって得られたヒトBACクローンのTGFβ1遺伝子中に組み込み、選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子とした(選択用遺伝子組換え工程)。
hTGFβ1-BAC TGマウスは、マイクロCTと組織学的な検討によって、10週齢から肺炎症と肺繊維化を発症する。マイクロCTによる肺炎症/肺繊維化を同程度に発症したhTGFβ1-BAC TGマウスをランダムに2つの群に分割した。一方の群には、ヒト特異的TGFβ1 siRNA (5 mg/kg)を連続する3週間に渡って毎週1回投与し、他方の群には、基剤のみを3週間に渡って毎週1回投与した。各マウスは毎週マイクロCTによって検査を行い、試験開始から21日目に絶命させ、BALF、血液及び肺組織のサンプリングを行った。
13.hTGFβ1-BAC TG マウスにBLMを皮下投与して肺線維症を進展させた後のsiRNAによる生存曲線への影響
hTGFβ1 siRNAの肺内投与治療による延命効果を評価するために、10匹のhTGFβ1-BAC TGマウスをランダムに2群に分類し、浸透圧ミニポンプにより80 mg/kg BLMを皮下投与した後に0,3,7及び14日目に、一方の群(BLM/TGFβ1 siRNA; n=5)には、ヒト特異的TGFβ1 siRNA (No 13)を経気管支投与し、他方の群(BLM/vehicle; n=5)には、基剤のみを投与した。BLMは、hTGFβ1-BAC TGマウスの肺繊維化の進行を速めるために投与した。
hTGFβ1 TGマウスの各組織におけるhTGFβ1遺伝子の発現量を調べるため、逆転写酵素PCR(RT-PCR)を行った。各組織からトリゾール(TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA))を用いて、全RNAを抽出した。RT-PCRに使用したプライマーの配列は、次の通りであった。human TGFβ1, forward 5'- AAGACTATCGACATGGAGCTGG-3'(配列番号5)及び、reverse 5'-GTATCGCCAGGAATTGTTGCTG-3'(配列番号6); human GAPDH, forward 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3'(配列番号7)及び reverse 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'(配列番号8); mouse GAPDH, forward 5'-CCCTTATTGACCTCAACTACATGGT-3'(配列番号9)及び reverse 5'-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3'(配列番号10)であった。全PCRは、各増幅反応においてプラトーとなる前の状態で実施した。PCR反応物は、2%アガロースゲルを用いて電気泳動し、バンドを臭化エチジウムで染色した後、紫外光にて観察した。
A549細胞及び器官組織から全RNAを抽出し、2μgの全RNAから逆転写反応とオリゴdTプライマーを用いてcDNAを調製した。定量的リアルタイムRT-PCRは、アプライド・バイオシステムズ7500リアル・タイムPCRシステム(Applied Biosystem 7500 Real-Time PCR System)によって実施した。マウス及びヒト遺伝子(TGFβ1, Tgfβ1, Ctgf, F3 [tissue factor], pdgfa, mcp-1)に特異的なプライマーとプローブは、キアゲン(Qiagen (Valencia, CA))から購入した。データは、アプライド・バイオシステムズの7500ソフトウエアによって解析し、各遺伝子の発現量はGAPDHの転写量によって標準化した。
16.マイクロCT(computed tomography)による肺線維症の評価
マウスモデルにおける肺線維症の評価は、マイクロCT(理化学研究所製)を用いて行った。CTデータは、イソフルランの吸入によって呼吸抑制された麻酔下にあるマウスを用いて得られた。データ取得時のパラメータは、スキャンスピード17秒、分解能20〜135μm、管電圧90kV、管電流200μAとした。イメージは、アイ・ビュー・ソフトウエア(i-VIEW software;モリタ製作所)によって解析した。CTデータはゼロアジャストを行い、各マウスから下部肺野の4ヶ所の断面図を採用した。換気可能な領域は、肺線維症の進展に伴って減少することから、肺断面図中の全換気可能領域が占める割合をウインドウズ版WinROOFイメージ解析ソフトウエア(三谷商事)にて解析し、そのデータを野生型マウスのCT画像から得られたデータと比較して、高密度領域の割合として示した。
3,7,及び14日目に、生理食塩水(SAL/vehicle)、BLM+基剤(BLML/vehicle)、またはBLM+マウス特異的TGFβ1 siRNA(BLM/TGFβ1 siRNA)を投与されたマウス肺組織を脱パラフィン処理し、トリス緩衝液-生理食塩水を用いて数回洗浄した。洗浄処理した後、切片を抗プロサーファクタントCウサギ抗血清(Millipore, Bedford, MA)と共に4℃にて1時間反応させ、トリス緩衝液-生理食塩水にて洗浄した後、抗ウサギIgGに結合させた蛍光色素(Alexa Fluor 594 anti-rabbit IgG)にて処理した。更に洗浄処理した後、切片を抗α平滑筋アクチンA4マウスモノクローナル抗体(DAKO, Glostrup, Denmark)の存在下で4℃、1時間反応させ、トリス緩衝液-生理食塩水で洗浄し、抗マウスIgGに結合させた蛍光色素(Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG)にて処理した。洗浄処理後に、サンプルを蛍光試薬を含むイメージング試薬(DAPIを含むSlowFade Goldantifae)によって処理した。スライドグラスをオリンパスFV1000-D顕微鏡にて観察した。共局在化をウインドウズ版WinROOFイメージ解析ソフトウエア(三谷商事)にて解析した。各群について、肺組織の10個の顕微鏡視野をランダムに抽出し、盲験観察者によってEMTの評価を行った。
BLMによって肺線維症を誘導し、BLM投与とは異なる日にマウスTGFβ1 siRNAまたは基剤で処理したマウスの肺組織から全RNAをトリゾール(TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA))によって抽出した。RNAサンプルを3D-Gene miRNAマイクロアレイプラットフォーム(東レ)を用い、マイクロRNAプロファイリングに供した。生理食塩水を投与された無処理マウスのマイクロRNAプロファイリングについても実施した。マイクロRNAプロファイリングデータは、NCBI GEOデータベースに寄託されている(accession No GSE28122)。
19.細胞株と培養条件
ヒト肺ガン由来肺胞上皮細胞株であるA549は、米国タイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection (Rockville, MD))から入手し、マウス肺腫瘍細胞株であるLA-4は、大日本住友製薬から入手した。A549細胞は、10% FBS(加熱処理済)、50μg/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、0.1mM 非必須アミノ酸を含むDMEMを用い、加湿環境において5%二酸化炭素、95%空気の環境下で培養した。LA-4細胞は、10% FBS(加熱処理済)を含むF-12 HAM培養液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)にて培養した。コンフルエントとなるまで培養した後、0.02% EDTAを含む0.025% トリプシン溶液(ヘペス緩衝液-生理食塩水(Hepes-buffered saline (50 mM Hepes, 150 mM NaCl at pH 7.4))にて短時間処理して細胞を回収し、5〜7日毎に継代した。
マウスTGFβ1 mRNAに対するsiRNAの活性評価をマウスLA-4細胞を用いて行い、ヒトTGFβ1 mRNAに対するsiRNAの活性評価をA549細胞を用いて行った。コンフルエント細胞を0.1% BSAを含むDMEM中において血清飢餓状態にて12時間培養した後、TGFβ1に対するsiRNA/DNAキメラまたはsiRNAを様々な濃度でリポフェクタミン(Lipofectamine)2000とOpti-MEMを用いて遺伝子導入した。6時間後に、細胞を回収し、TGFβ1 mRNAの発現量を評価した。
21.siRNAがmRNAの発現を抑制することの確認
5'-RACE法(Rapid amplification of cDNA ends)を実施することによって、インビボ(in vivo)においてsiRNAがTGFβ1 mRNAの発現を抑制することを確認した。マウス肺から得られた2μgの全RNAを用いてcDNAを合成した。5'-full RACE Core Set(タカラバイオ)と5'末端リン酸化プライマー(5'-gATCCCGTTGATTTCCACGT-3':配列番号11)を用いて、最初のcDNAを調製した。このcDNA(2μL)を用いて第1回目のPCRを行った。このときのセンスプライーマの配列は、5'-GCAACAATTCCTGGCGTTACC-3'(配列番号12)であり、アンチセンスプライマーの配列は、 5'-CACATGTTGCTCCACACTTGAT-3'(配列番号13)であった。PCRの反応条件は、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて1分間を1サイクルとし、25サイクルを行った。次いで、第1回目のPCR産物(2μL)を用いて、第2回目のPCR(nested PCR)を行った。このときのセンスプライマーの配列は、 5'-CGTCACTGGAGTTGTACGGCA-3'(配列番号14)であり、アンチセンスプライマーの配列は、 5'-TTAATCTCTGCAAGCGCAGC-3'(配列番号15)であった。PCRの反応条件は、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて1分間を1サイクルとし、35サイクルを行った。PCR産物は、4%アガロースゲルを用いた電気泳動によって解析した。
全データは、平均値±標準誤差(mean ± standard error (s.e.m.))によって示した。3個またはそれ以上の変数の統計的有意性は、チューキー検定(Tukey's test)を用いた事後解析(post hoc analysis)によって、分散分析を行うことによって評価した。2変数の統計的有意性は、マン・ホイットニーU検定(Mann-Whitney U test)によって評価した。生存曲線は、カプラン・メイヤー法(Kaplan-Meier method)によって計算し、有意差は、ログ・ランクテストで計算した。統計的有意差は、危険率5%(p<0.05)にて評価した。解析には、マッキントッシュ用ソフトウエアのスタットビュー4.1(StatView 4.1)パッケージ(Abacus Concepts, Berkeley, CA)を用いた。
1.肺線維症のマウスモデルにおける繊維形成因子の配列変異
ブレオマイシンによって誘導されたマウス慢性肺線維症モデルを用いて繊維化因子を経時的に評価したところ、慢性期には、主として成長因子(CTGF、PDGF)とTGFβ1誘導転写因子Smad3が増加し、繊維化サイトカイン(CCL2)と凝固活性化物質(トロンビン・アンチトロンビン複合体、組織因子)は、急性期に有意に増加することが分かった。これに対し、TGFβ1は両期に増加したことから、TGFβ1がより一般的なターゲットであることが示唆された(図7、A〜N)。
2.肺細胞へのsiRNAの到達
Cy3標識TGFβ1 siRNA を気管支内投与した後に、siRNAが肺に到達したか否かを評価した。気管支内投与から3時間後に、肺胞および肺間質に蛍光が観察された(図8、A〜H)。
肺線維症に対するsiRNA療法の有効性を確認するため、TGFβ1、CTGF、PDGF、CCL2及びTFに対するマウス特異的siRNAをデザインし、肺線維症における有効性を比較した(表1)。BLMの皮下投与開始から3日目(準急性期)、7日目(急性期)、及び14日目(慢性期)にエアロゾルによりsiRNAをそのまま投与した。各因子のタンパク質及びmRNA発現量は、コントロール群に比べて、対応するsiRNAを投与した群では、有意に減少した(図1A、図3A)。TGFβ1とCTGFに対しては、対応するsiRNAは、他の因子の場合よりも強いタンパク質の発現抑制効果が認められた(図1A、図93A,B)。このことから、これらの因子では、siRNAは、より強力にタンパク質の発現を抑制していると考えられる。組織学的及びアッシュクロフト・スコアを用いた定量化による肺繊維化と肺ハイドロプロリン量は、TGFβ1とCCL2 siRNA によって強く抑制されたものの、CTGF、PDGF及びTF siRNA では弱い抑制しか認められなかった(図1B,C)が、これらのsiRNAの多くは肺胞内の全タンパク量を減少させ、炎症性細胞による肺浸潤を抑制した(図9C、D)。次に、TGFβ1 siRNA に注目した試験を行った。これは、TGFβ1の肺での発現は、疾患の急性期及び慢性期のいずれでも維持されていたが、CCL2の肺における発現は、そうではなかったこと、及びCCL2 siRNA はBALFのCCL2タンパク質量を減少できなかったためである(図9C)。
肺内にTGFβ1 siRNA を投与すると、0.5 mg/kg 及び 5 mg/kg の用量において用量依存的に、TGFβ1の発現と肺線維症の増悪を有意に効果を示した。TGFβ1の発現を有意に抑制するが、低用量のsiRNAでは、肺線維症を抑制しなかった(図2A,B,C)。混合siRNAはポジティブコントロール群に対して効果をしめさなかったことから、TGFβ1 siRNAが、特異的に効果を示すことが分かった。TGFβ1 mRNA がsiRNA によって抑制されることをインビボ(in vivo)試験において5'-RACE 法によって確認した(図2D)。
5.肺線維症の全ステージにおけるTGFβ1 siRNA の効果
急性期、慢性期、または両期において、TGFβ1 siRNA を投与すると、混合siRNAまたは基剤のみを投与したマウスに比べ、肺におけるTGFβ1の発現および肺線維症を有意に抑制した。更に、慢性期におけるsiRNAの単回投与だけでも、コントロールマウスに比べ、肺内のコラーゲン低下を有意に抑制した(図3A〜D)。
ヒト、マウス、及び/又はラットのsiRNA標的配列(表2)によって、インビボ(in vivo)試験において、上皮から間葉への変化を効果的に抑制した(図10A,B)。また、ヒト及びマウスTGFβ1及びSmad3遺伝子をターゲットとするsiRNA/DNAキメラについても評価をした(表3)。TGFβ1 siRNA/DNAキメラは、ヒト(A549)および齧歯類(LA-4)細胞株のいずれにおいてもTGFβ1の発現を有意に阻害した(図4A,B)。TGFβ1 siRNA/DNAキメラを気管支内投与するとTGFβ1の発現を有意に誘導した(図4C)。TGFβ1及びSmad3 siRNA/DNAキメラは、混合siRNAまたは基剤のみを投与したマウスに比較すると、肺線維症を有意に阻害することが、アッシュクラフト・スコア及び肺内のコラーゲンとヒドロキシプロリンの評価によって確認された(図4D,E)。
従来報告されているTGFβ1トランスジェニック(TG)マウスとは異なり、TGFβ1-BAC TGマウスは、全長のヒトTGFβ1遺伝子の発現量と、潜在型及び活性型TGFβ1タンパク質の濃度をいずれも上昇させ、ヒトの形態に近似していた。こうして、ヒトの状態に近いインビボ(in vivo)モデルとして肺線維症を研究するための良好なTGFβ1 TGマウスを確立した。このマウスは、BACを利用して、サーファクタント・タンパク質C(SP-C)のプロモータの下流にヒトTGFβ1を配置した作成されたものである(図5A〜D)(非特許文献5、6)。このTGマウスは、肺の発達段階においてTGFβ1の過剰発現による胚致死性のものではなかったが、10週齢において肺炎症と肺線維症が増悪する(図5E,F)(非特許文献7)。導入された遺伝子は肺のみで特異的に発現し(図5G)、全TGFβ1及び活性型TGFβ1濃度は肺液中で増加した(図5H)。
インビトロ(in vitro)試験でヒト特異的siRNAの活性を評価した後、肺炎症/肺線維症を発症するヒトTGFβ1TGマウスを用いて、肺線維症に対するヒト特異的siRNAの効果を評価した(表4)。最も強いインヒビターは、siRNA13であり、0.01nMでも活性を示した(図11A〜D)。マイクロCTによって肺炎症/線維症が認められた10週齢ヒトTGFβ1-BAC TGマウスを用いて、siRNA13の阻害活性を評価した。ブラインドテストによってマウスをランダムに2群に分け、一方の群にはTGFβ1 siRNAを経気管支的に投与し(週1回×3週間)、他方の群には同様のプロトコールで基剤のみを投与した。最終投与から1週間後に動物を絶命させた。肺線維症の変化をCTと組織学的試験によって評価したところ、基剤のみを投与した群に比べ、TGFβ1 siRNA13 を投与した群では、有意に良好な結果が認められた(図6A〜C)。基剤を投与したTGマウスでは、野生型マウス(ネガティブコントロール)に比べて、有意に血中酸素濃度が低下した(図6D)。TGFβ1 siRNA13を投与したTGマウスでは、野生型マウスと同等の血中酸素濃度を維持していた(図6D)。
ヒトTGFβ1-BAC TGマウスは、10週齢から徐々に肺線維症を発症させ、16〜18週齢において死亡する。BLM(80 mg/kg mouse)を皮下投与すると、肺線維症を増悪させ、TGマウスを死亡させる。生存曲線に対する影響を評価するため、ヒトTGFβ1-BAC TGマウスをランダムに2群に分類し、一方の群には、BLM投与から0,3,7及び14日目にヒト特異的TGFβ1 siRNA(No.13)を経気管支投与し、他方の群には、同様のプロトコールで基剤のみを投与した。ヒト特異的TGFβ1 siRNAの肺への投与によって、TGマウスの生存曲線は有意に向上し、肺中のヒドロキシプロリン濃度及びコラーゲン量も好転した(図6,F,G,H)。
10.TGFβ1 siRNAのオフターゲット作用
TGFβ1 siRNAのオフターゲット作用を確認するため、通常マウスに対して、マウス特異的TGFβ1 siRNAを経気管支投与し、肺中のサイトカインの発現を測定した。通常マウスにTGFβ1 siRNAを経気管支投与したところ、IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-βの肺中濃度は、いずれも有意に増加せず、TGFβ1のBALF濃度は、コントロール群に比べ、TGFβ1 siRNAを投与した群では、有意に(完全にではないものの)阻害された(図12)。
Smad3を標的としたsiRNAを経気管支投与すると、肺内TGFβ1の発現と肺中コラーゲン沈澱量を僅かに抑制した(図13 A-D)。
12.TGFβ1 siRNAは、前繊維化miRNAを抑制する
異なるステージにおいてマウス特異的TGFβ1 siRNAを投与したマウス、及び異なるステージにおいてヒト特異的TGFβ1 siRNAを投与した hTGFβ1-BAC TGマウスを用いて、前繊維化miR-21 miRNAの発現パターンを評価した。野生型マウスにBLMを投与した肺線維症モデルマウスを用いた場合には、全てのステージにおいて、TGFβ1 siRNAは、前繊維化miR-21 miRNAの肺での発現を抑制し(図14A、B)、hTGFβ1 siRNA 13は、hTGFβ1-BAC TGマウスの前繊維化miR-21 miRNAの肺での発現を抑制した(図15A、B:GEO data base accession No GSE28122)。
このように本願実施形態によれば、肺特異的にTGFβ1を発現し、自然発症的に肺線維症を発症するTGマウスを提供できた。このTGマウスを用いることにより、呼吸器関連疾患(肺線維症、気管支喘息、肺ガン、COPDなどを含む)に関する研究を飛躍的に発展させられる。
Claims (4)
- (1)ヒトTGFβ1遺伝子を含むBAC(bacterial artificial chromosome)において、ヒトTGFβ1遺伝子のイントロン部分に選択用カセットを組み込み、選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子を得る選択用遺伝子組換え工程、(2)前記選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子の5'-側及び3'-側に、マウスSP-Cプロモーターの下流の配列に相同的な配列を導入して、修飾hTGFβ1遺伝子フラグメントとする修飾工程、(3) 5'-側及び3'-側にフランキング配列を有するマウスSP-C全コード配列を含むBACにおいて、前記修飾hTGFβ1遺伝子フラグメントを、前記マウスSP-Cプロモーター領域の下流側に転移させて、SP-C・選択用hTGFβ1遺伝子フラグメントとする工程、(4)前記SP-C・選択用hTGFβ1遺伝子フラグメントから前記選択用カセットを取り除いて、SP-C-TGFβ1 BACトランスジェニック構築物を得る工程、及び(5)前記SP-C-TGFβ1 BACトランスジェニック構築物からSP-C-TGFβ1遺伝子を精製し、マウス胚にマイクロインジェクションして、トランスジェニックマウスを得る工程を備え
前記選択用遺伝子組換え工程において、配列番号3と配列番号4を持つDNAフラグメントをプライマーとして用いたPCR法を実施し、前記修飾工程において、前記TGFβ1遺伝子をマウスSP-C遺伝子の非翻訳領域において、スタートコドン(5'エンド)とストップコドン(3'エンド)の隣に直接的に配置することを特徴とするトランスジェニックマウスの作成方法。 - 前記修飾工程において、前記TGFβ1遺伝子をマウスSP-C遺伝子の非翻訳領域の40塩基隣に配置することを特徴とする請求項1に記載のトランスジェニックマウスの作成方法。
- 請求項1または2のいずれか一つに記載の方法によって作成されたトランスジェニックマウスであって、マウス・サーファクタント・プロテインC(SP-C)のプロモーター領域と、その下流に配置されて発現を制御されるヒト形質転換因子β1(hTGFβ1)の全遺伝子領域とを含むことを特徴とするトランスジェニックマウス。
- 上記トランスジェニックマウスの系統は、C57BL/6Jであることを特徴とする請求項3に記載のトランスジェニックマウス。
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