JP2012244979A - 軟骨疾患治療薬のスクリーニング方法および軟骨疾患治療用改変軟骨細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】軟骨量を増大させる作用および/または軟骨細胞分化を正常化させる作用を有する物質のスクリーニング方法であって、塩誘導性キナーゼ3を使用することを特徴とする方法、および、軟骨量が減少する病気および/または軟骨の成長が障害される病気の改善のために利用する、塩誘導性キナーゼ3遺伝子の発現もしくは機能が抑制または増強されている改変軟骨細胞。
【選択図】なし
Description
[1]軟骨量を増大させる作用および/または軟骨細胞分化を正常化させる作用を有する物質のスクリーニング方法であって、塩誘導性キナーゼ3を使用することを特徴とする方法。
[2]軟骨量が減少する病気および/または軟骨の成長が障害される病気の改善のために利用する、塩誘導性キナーゼ3の発現もしくは機能が抑制または増強されている改変軟骨細胞。
これらの知見から、SIK3を使用すれば、軟骨疾患の治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができることが明らかとなった。また、SIK3の発現もしくは機能が抑制されている軟骨細胞、SIK3の発現もしくは機能が増強されている軟骨細胞は、軟骨疾患の改善または治療に有用であることが明らかとなった。
本発明は、SIK3を使用して軟骨疾患の治療薬として有用な物質をスクリーニングする方法を提供する。より詳細には、SIK3を使用して軟骨量を増大させる作用および/または軟骨細胞分化を正常化させる作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。軟骨細胞分化を正常化させる作用には、軟骨細胞分化のスピードが正常より抑制されている場合に、これを亢進して軟骨細胞分化を正常化させる作用、および、軟骨細胞分化のスピードが正常より亢進している場合に、これを抑制して軟骨細胞分化を正常化させる作用が含まれる。
SIK3を使用して軟骨量を増大させる作用を有する物質、および、軟骨細胞分化のスピードを抑制する作用を有する物質は、SIK3の発現または機能を抑制する被験物質を選択することによりスクリーニングすることができる。一方、軟骨細胞分化のスピードを亢進する作用を有する物質は、SIK3の発現または機能を亢進する被験物質を選択することによりスクリーニングすることができる。
配列番号1または2で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列を有するDNA断片としては、例えば、配列番号1または2で表される塩基配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性がある塩基配列を有し、配列番号1または2で表される塩基配列を有するDNA断片と同質のプロモーター活性を有するDNA断片であればどのようなものでもよい。
Leu−X1−Y1−Y2−X2−Ser−X3−X4−X5−Leu (1)
(式中、X1、X2、X3、X4およびX5は、同一または異なって、任意のアミノ酸残基を表し、Y1はArgまたはLysを表し、Y2はSerまたはThrを表す。)
SIK3は、式(1)で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を基質として認識し、これと結合して当該アミノ酸配列の第6位のSerをリン酸化する。なお、式(1)で表されるアミノ酸配列の第1位のLeuおよび第10位のLeuは、他の疏水性アミノ酸に置換されていてもよい。
SIK3とSIK3の基質との結合状態を確認する方法は、特に限定されず、公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ELISA法を好適に用いることができる。ELISA法を用いて本実施形態のスクリーニング方法を実施する場合、SIK3およびSIK3の基質のいずれか一方を固相化し、そこに他方および被験物質を添加して反応させ、SIK3とSIK3の基質の結合状態を適当な一次抗体および二次抗体を用いて検出すればよい。
被験物質依存的なシグナル伝達状態の変化を分析する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群におけるSIK3のシグナル伝達状態と比較して、被験物質を接触させた場合にSIK3の活性が低下または上昇しているとの評価が得られれば、当該被験物質を目的物質として選択すれることができる。被験物質がSIK3の活性を低下または上昇させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない場合と比較して、50%以下または150%以上にさせる被験物質が好ましく、25%以下または175%以上にさせる被験物質がより好ましい。
上記、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質は、軟骨量を増大させる作用および/または軟骨細胞分化を正常化させる作用を有する物質であるので、種々の軟骨疾患の治療薬の有効成分として有用である。軟骨疾患としては、例えば、変形性関節症、軟骨損傷、軟骨形成異常症などが挙げられる。したがって、本発明には、SIK3の発現もしくは機能を抑制する物質、または、SIK3の発現もしくは機能を増強する物質を有効成分とする軟骨疾患の治療用医薬が含まれる。ここで、「軟骨量を増大させる作用を有する物質」とは、当該物質を正常個体に投与した場合に、当該物質を投与していない正常個体と比較して、同一部位(例えば四肢の関節)の軟骨量を増大させる作用を有する物質を意味する。軟骨量が増大しているか否かを確認する方法は特に限定されないが、例えば、比較する軟骨組織の組織標本を作製して顕微鏡観察することにより行うことができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
本発明は、SIK3の発現または機能が抑制されている改変軟骨細胞、および、SIK3の発現または機能が増強されている改変軟骨細胞を提供する。これらの改変軟骨細胞は、軟骨量が減少する病気および/または軟骨の成長が障害される病気の改善のために利用することができる。軟骨量が減少する病気としては、変形性関節症、軟骨損傷などが挙げられ、軟骨の成長が障害される病気としては、軟骨形成異常症などが挙げられる。具体的には、例えば、SIK3の発現または機能が抑制されている改変軟骨細胞は、軟骨細胞の成熟や変性が抑制されて軟骨細胞の形態を維持することができるので、軟骨が減少する疾患の再生医療に用いる細胞として非常に有用である。また、例えば、SIK3の発現または機能が抑制または増強されている改変軟骨細胞は、それぞれ、軟骨細胞の分化が亢進または抑制されている軟骨形成異常症の成長軟骨への移植に用いる細胞として非常に有用である。さらに、例えば、SIK3の発現または機能が抑制または増強されている改変軟骨細胞は、疾患モデル細胞として、軟骨形成異常症の病態解析や薬剤スクリーニングに用いる細胞として非常に有用である。
得られた細胞を軟骨細胞に分化誘導する方法は、例えば、文献 J Clin Invest. 2011 121:640-57. に記載の方法を好適に用いることができる。
(1)SIK3ノックアウトマウス(以下「SIK3KOマウス」という)
マウスSIK3遺伝子の5’側のゲノム配列(5’arm)、pgkプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、マウスSIK3遺伝子の3’側のゲノム配列(3’arm)を順に持つターゲティングベクター(図1(a)参照)を、定法に従い作製した。得られたターゲティングベクターを、マウスES細胞に導入し、G418を含む培地で培養してネオマイシン耐性ES細胞を得た。得られたネオマイシン耐性ES細胞からDNAを抽出し、サザンブロット解析により相同組換えクローンを同定した(図1(b)参照)。
得られた相同組換えクローンをBDF2マウスより得た胚盤胞へマイクロインジェクションし、操作胚を子宮へ移植した。操作胚を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラマウスをC57BL/6マウスと交配することによって、変異アレルを持つヘテロ接合体マウス(以下「SIK3ヘテロKOマウス」という)を得た。SIK3ヘテロKOマウス同士の交配によってホモ接合体のSIK3KOマウスを得た。胎児または出生児の遺伝子型は、尾、耳または皮膚の一部からゲノムDNAを抽出し、PCRにて確認した。PCRには、以下の3種類のプライマーを用いた。プライマーaおよびプライマーbから、野生型アレル由来の270bpのバンドが増幅され、プライマーaおよびプライマーcから、変異アレル由来の429bpのバンドが増幅される(図1(c)参照)。なお、SIK3ヘテロKOマウスは、独立行政法人医薬基盤研究所から入手可能である。
プライマーa:5'-GCTACCAACTTGGTTACAGTTGCT-3'(配列番号4)
プライマーb:5'-AAAACGTCGAGGGTCAGCAGCAACTTCTAA-3'(配列番号5)
プライマーc:5'-ACGAGACTAGTGAGACGTGCTACTTCCATT-3'(配列番号6)
SIK3ヘテロKOマウス同士の交尾を確認し、所定の日数経過後に妊娠マウスを二酸化炭素投与により安楽死させ、14.5日胚(14.5dpc)および交尾後18.5日胚(18.5dpc)を得た。胎児の肢芽を採取し、ホルマリン固定した。
(3)生後マウスからの四肢採取
生後3月齢のSIK3KOマウスおよび同腹の野生型(WT)マウスを二酸化炭素投与により安楽死させ、解剖して四肢を採取し、ホルマリン固定およびEDTAによる脱灰を行った。
(4)組織標本作製
採取、固定した四肢の1つをパラフィン包埋し、5マイクロメートルの厚みの切片を作製した。切片をスライドガラスに貼付し、脱パラフィン後サフラニンO−ファーストグリーン−アイアンヘマトキシリン染色を行った。軟骨マトリックスはサフラニンOにより赤〜オレンジ色に染色される。
得られた標本を光学顕微鏡で観察した。図2(a)、(b)に14.5dpc胚の大腿骨を含む切片の組織染色像を示した。(a)は野生型マウス、(b)はSIK3KOマウスである。また、図において大腿骨内で濃く染まっているのが肥大化していない軟骨細胞である。図2(a)、(b)から明らかなように、14.5dpc胚において、(a)野生型マウスでは大腿骨の中央部において軟骨細胞が肥大化し、染まりが薄くなっているが、(b)KOマウスでは大腿骨の中央部の中央部がほとんど薄くなっておらず、軟骨細胞の肥大化が抑制されていることが分かった。
図3(a)、(b)に18.5dpc胚の大腿骨を含む切片の組織染色像を示した。(a)は野生型マウス、(b)はSIK3KOマウスである。図3(a)、(b)から明らかなように、野生型マウス(a)では大腿骨の中央部において骨化が進行しているが、KOマウス(b)では未だ軟骨細胞の肥大化が抑制されており、骨化は生じていないことが分かった。
図4(a)、(b)に3月齢マウスの膝関節を含む切片の組織染色像を示した。(a)は野生型マウス、(b)はSIK3KOマウスである。図4(a)、(b)から明らかなように、(b)KOマウスの関節軟骨は、(a)野生型マウスの関節軟骨と比較して、顕著に肥厚していることが分かった。
以上の結果から、SIK3KOマウスにおいて軟骨細胞の肥大化の抑制および関節軟骨の肥厚が観察されたことから、SIK3は、軟骨細胞肥大化抑制および軟骨肥厚化のターゲットとなる可能性が示唆された。
(1)SIK3トランスジェニックマウス(以下「SIK3Tgマウス」という)
軟骨特異的発現をもたらすXI型コラーゲンα2鎖遺伝子(Col11a2)プロモーター/エンハンサー(Tsumaki N, et al. J Cell Biol. 1996; 134:1573-1582.)にヒトSIK3cDNA(ACCESSION NM_025164)を結合してトランスジーンコンストラクトを作製した。このトランスジーンインサートをベクターバックボーンから切り出して精製した後、マウス受精卵にマイクロインジェクションし、それらを偽妊娠マウスの卵管に移植した。偽妊娠マウスから生まれたマウスからSIK3Tgマウスを選別し、SIK3Tgマウスラインを樹立した。胎児または出生児の遺伝子型は、尾または耳組織よりゲノムDNAを抽出し、PCRにて確認した。PCRには、以下のプライマーを用いた。
フォワードプライマー:5'-GATGTCGGATGCAGTTCTC-3'(配列番号7)
リバースプライマー :5'-ATGTCTGTAATACACGTAGATGGATA-3'(配列番号8)
SIK3ヘテロKOマウスとSIK3Tgマウスを交配し、交尾確認後15.5日で妊娠マウスを二酸化炭素投与により安楽死させ、15.5日胚(15.5dpc)を得た。各胎児の皮膚よりゲノムDNAを抽出し、PCRにてSIK3ノックアウトとSIK3トランスジェニックの遺伝子型を解析した。胎児の肢芽を採取し、ホルマリン固定した。
(3)組織標本作製
参考例1と同様の手順で切片を作製し、染色を施した。
得られた標本を光学顕微鏡で観察した。図5(a)〜(d)に15.5dpc胚の大腿骨を含む切片の組織染色像を示した。(a)はSIK3Tg、SIK3+/+の遺伝子型を持つマウス、(b)はSIK3Tg、SIK3+/−の遺伝子型を持つマウス、(c)はSIK3−/−の遺伝子型を持つマウス、(d)はSIK3Tg、SIK3−/−の遺伝子型を持つマウスである。図5から明らかなように、(c)SIK3−/−の遺伝子型を持つマウス(SIK3KOマウス)は、参考例1と同様に大腿骨中央部の軟骨細胞の肥大化が抑制されていたが、(d)SIK3Tg、SIK3−/−の遺伝子型を持つマウスは、軟骨細胞の肥大化が抑制されていなかった。したがって、SIK3の機能がレスキューされていることが明らかとなった。
この結果から、軟骨細胞の肥大化抑制は、SIK3の機能欠失に基づくものであることが明らかとなった。
生後3月齢、6月齢および8月齢のSIK3Tgマウスおよび野生型マウスを二酸化炭素投与により安楽死させ、解剖して四肢を採取し、ホルマリン固定およびEDTAによる脱灰を行った。その後、参考例1と同様の手順で切片を作製し、染色を施した。
得られた標本を光学顕微鏡で観察した。図6に各月齢マウスの膝関節を含む切片の組織染色像を示した。左が野生型マウス(図中Wt)、右がSIK3Tgマウス(図中LI−hSIK3Tg)である。図6から明らかなように、3月齢では野生型マウスおよびSIK3Tgマウスのどちらにも成長軟骨板が観察されたが、6月齢および8月齢のSIK3Tgマウスでは、成長軟骨板が消失していた。一方、6月齢および8月齢の野生型マウスでは、成長軟骨板が観察された。
この結果から、SIK3の機能亢進は、軟骨細胞の肥大化を促進させ、軟骨細胞の骨化を加速するものと考えられた。
HEK293細胞に、レポーターベクターGAL4−Luc(ホタルルシフェラーゼ:pTAL−5XGAL4(150ng))、内因性レポターターベクター(リニーラルシフェラーゼ:pRL−Int(−)(30ng))、TORC発現ベクターの有り無し(pM−TORC2またはpMのみ(50ng))およびSIK3発現ベクターの有り無し(pTarget−SIK3またはpTargetのみ(50ng)をLipofectamine2000を利用して導入し、24時間後に被験物質を加えさらに6時間処理した。レポーター活性の測定には、プロメガ社のDual Luciferaseアッセイキットを利用した。被験物質には、スタウロスポリン(STS)、SIK2阻害剤であるCompoundCを用いた。コントロールにはDMSOのみを加えた。当該スクリーニング系の模式図を図6に示した。
Claims (2)
- 軟骨量を増大させる作用および/または軟骨細胞分化を正常化させる作用を有する物質のスクリーニング方法であって、塩誘導性キナーゼ3を使用することを特徴とする方法。
- 軟骨量が減少する病気および/または軟骨の成長が障害される病気の改善のために利用する、塩誘導性キナーゼ3の発現もしくは機能が抑制または増強されている改変軟骨細胞。
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