KR20170023043A - 마이오스타틴 유전자를 표적으로 하는 talen 및 이를 이용한 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 동물을 제조하는 방법 - Google Patents

마이오스타틴 유전자를 표적으로 하는 talen 및 이를 이용한 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 동물을 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마이오스타틴(myostatin: MSTN) 유전자를 표적으로 하는 TALEN(Transcription Activator Like Effector-Nuclease) 및 이를 이용하여 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 동물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 마이오스타틴 유전자에 특이적인 TALEN과 체세포 핵이식 기술을 이용하는 경우, 효과적으로 마이오스타틴 유전자 녹아웃된 형질전환 돼지를 만들 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환동물을 제조하는 방법을 이용하면, 근육량이 증가된 돼지를 효과적으로 생산할 수 있으며, 이러한 방법은 인간에게 고기를 공급하는 다른 동물에도 이용될 수 있다.

Description

마이오스타틴 유전자를 표적으로 하는 TALEN 및 이를 이용한 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 동물을 제조하는 방법{Transcription Activation Like Effector Nuclease for Targeting Myostatin Gene and Methods for Making Myostatin Gene Knock out Animal Using Thereof}
본 발명은 마이오스타틴(myostatin: MSTN) 유전자를 표적으로 하는 TALEN(Transcription Activator Like Effector Nuclease) 및 이를 이용한 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 동물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 돼지고기 섭취로 인한 영양문제뿐 아니라 건강문제에 대한 관심이 점점 높아지면서, 지방량이 적은 살코기에 대한 수요가 증가하고 있다. 한편, 세계에서 가장 큰 돼지고기 생산, 소비국가인 중국이 성장하면서 일인당 돼지고기 소비량은 증가하는 추세인 반면, 사육량은 이러한 증가추세에 미치지 못하고 있는 실정이다. 이와 같은 문제를 해결하는 방법 중의 하나로 근육량이 증가한 돼지를 연구, 개발하려는 노력이 있어왔다.
마이오스타틴(Myostatin, MSTN)은 TGF-β 패밀리에 속하는 단백질로서 근육분화과정에서 근육의 분화 및 성장을 억제하는 조절인자이며, 성장분화인자 8(growth differentiation factor 8, GDF-8)로도 알려져 있다. 마이오스타틴은 주로 골근 세포에서 생산되어 혈액을 통해 순환하여 근육 조직에 작용을 한다. 따라서 동물에서 마이오스타틴 유전자가 없거나 마이오스타틴의 활성을 억제하는 경우 근육이 증가할 것을 기대할 수 있다. 인간과 소(Ravi Kambadur et al., Genome Res., 7: 910-915, 2007), 양과 개(Dana S. Mosher et al., Plos genet., 3: 779-786, 2007)에서 자연에 존재하는 마이오스타틴 돌연변이가 확인되었는데, 마이오스타틴 유전자에 결실이 있는 경우 천연형(wild-type)에 비해 근육이 증가한 표현형을 나타내었다. 또한, 마이오스타틴 유전자를 녹아웃(knock out)한 마우스를 만드는 경우, 유전자 녹아웃이 이형접합체(heterozygote)일 때 근육이 소량 증가하였고 녹아웃이 동형접합체(homozygote)일 때 이중 근육(double-muscle)이 되어 근육이 크게 증가하는 것을 관찰하였다(Se-Jin Lee et al., Nature, 16; 98: 9306-9311, 1997).
따라서 돼지에서 마이오스타틴 유전자를 효과적으로 녹아웃시킬 수 있다면, 근육이 증가한 돼지의 생산을 기대할 수 있다. 최근 출원한 중국특허(출원번호 CN101892264A)의 경우, TALEN(Trans Activation Like Effector-Nuclease)이 아닌 다른 기술을 사용하여 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환돼지를 생산하였는데 마이오스타틴 단측 유전자가 녹아웃된 이형접합체이었으며, 아직까지 돼지에서 마이오스타틴 양측 유전자가 녹아웃된 동형접합체가 보고된 바는 없다.
본 발명자들은 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환 돼지를 생산하는 방법을 발굴하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 마이오스타틴 유전자에 특이적인 TALEN과 체세포 핵이식 기술을 이용하는 경우, 효과적으로 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환 돼지를 만들 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 마이오스타틴 유전자의 특정 서열에 결합하여 절단하는 활성을 가지는 TALEN을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 TALEN을 이용하는 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 TALEN을 이용하여 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 세포를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 제조된 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 TALEN을 이용하여 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 인간을 제외한 형질전환동물을 제조하는 방법 및 이를 이용하여 제조된 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 인간을 제외한 형질전환동물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 마이오스타틴(myostatin: MSTN) 유전자의 특정 서열에 결합하여 절단하는 활성을 가지는 다음을 포함하는 융합단백질을 제공한다:
(a) TALE(Transcription Activator Like Effector) 도메인; 및
(b) 뉴클레오티드 절단 도메인.
본 발명에서 용어, "마이오스타틴 (myostatin: MSTN)"은 GDF8 (growth differentiation factor 8)로도 알려져 있으며, 근육 분화 및 성장을 억제하는 유전자로 알려져 있다. 마이오스타틴은 TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는 조절 리간드로서 그 유전자 구조는 TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는 다른 유전자들과 유사하다. 마이오스타틴 유전자 서열 등은 공지된 데이터 베이스(GenBank 등)에서 얻을 수 있다.
마이오스타틴은 근골격 구조의 발달, 성장 및 체내의 근육 항상성의 조절에 관여하는 음성 조절자로 작용하므로, 동물에서 마이오스타틴 유전자가 없거나 마이오스타틴의 활성을 억제하는 경우 근육이 증가할 것을 기대할 수 있다. 소, 양 및 개에서 자연에 존재하는 마이오스타틴 돌연변이가 확인되었으며, 마이오스타틴 유전자에 결실이 있는 경우 천연형(wild-type)에 비해 근육이 증가한 표현형을 나타내었다. 또한, 마이오스타틴 유전자를 녹아웃(knock out)한 마우스를 만드는 경우, 유전자 녹아웃이 이형접합체(heterozygote)일 때 근육이 소량 증가하였고, 녹아웃이 동형접합체(homozygote)일 때 이중 근육(double-muscle)이 되어 근육이 크게 증가하는 것을 관찰하였다. 따라서 인간에게 고기를 공급하는 식용동물에서 마이오스타틴 유전자를 효과적으로 녹아웃시킬 수 있다면, 근육이 증가한 식용동물의 생산을 기대할 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 근육량이 증가한 돼지를 생산하기 위해, 돼지의 마이오스타틴 유전자를 녹아웃하고자 하였다.
본 발명에서 용어, “마이오스타틴 유전자의 특정 서열에 결합하여 절단하는 활성을 가지는”은 마이오스타틴 유전자의 특정 핵산 서열을 특이적으로 인식하여 절단하는 것을 의미하며, 본 발명에서는 TALE 도메인이 마이오스타틴의 특정 핵산 서열을 특이적으로 인식하고, 상기 TALE 도메인과 펩티드 결합으로 연결된 뉴클레오티드 절단 도메인에 의해 마이오스타틴 유전자에 절단이 발생되는 것을 의미한다. 상기 "서열"이란 그 길이와 관계없이 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 이는 직선형, 원형 또는 가지형의 DNA 또는 RNA가 될 수도 있고, 단일 나선형이거나 이중 나선형일 수 있다.
TALEN이 결합하여 절단하는 특정서열을 선정하기 위해서는 여러 가지 요소를 고려할 수 있다. 우선, 타겟으로 하는 마이오스타틴 유전자만을 특이적으로 인식하고 절단하며 다른 유전자서열을 절단하지 않도록 하여야 한다. 이를 위해서는 이미 공지되어 있는 다양한 생물정보학의 방법을 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 TALEN이 특정위치의 서열에 효과적으로 결합하고 절단할 수 있어야 한다. 이론적으로 모든 특정서열에 대한 TALE 도메인을 설계할 수 있지만, 실험적으로 TALE 도메인이 결합하는 특정서열의 길이, 하나의 타겟 영역을 구성하는 2개의 절반-자리(half site) 사이의 스페이서의 길이 등이 TALEN의 효과적인 작용에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 실험에 의하면, 절반-자리의 길이가 각각 15-20 bp, 스페이서의 길이가 12-14 bp로서 총 서열의 길이가 42-54 bp이며, 특정서열의 시작하는 서열이 티민(T), 마지막 서열이 아데닌(A)인 경우 TALEN이 효과적으로 작용한다. 따라서 이러한 요소들을 고려하여 TALEN이 특이적이고 효과적으로 마이오스타틴 유전자를 절단할 수 있도록 특정위치를 선정하여야 한다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 생물정보학과 (주)툴젠이 보유하고 있는 다양한 특정서열에 대한 TALEN의 절단능력에 대한 데이터베이스를 이용하여 돼지 마이오스타틴 유전자의 서열 중 4개의 특정서열(서열목록 제1 내지 4서열)에 대한 TALEN을 제작하였으며 최종적으로 그 중에서 엑손 1 내에 위치하는 서열목록 제1서열을 TALEN이 결합하여 절단하는 특정서열로 선정하였다.
본 발명의 “TALE(Transcription Activator Like Effector) 도메인"에 대해서는 대한민국 출원특허인 '디자인된 TAL 이펙터 뉴클레아제를 통한 게놈 엔지니어링'(출원번호 10-2013-7018743)에 그 상세한 내용이 기재되어 있다. TALE은 크산토모나스 박테리아가 다양한 식물 종에 감염될 때 이들의 타입 Ⅲ 분비 시스템을 통해 분비되는 단백질로서 숙주 식물 내의 프로모터 서열과 결합하여 박테리아 감염을 돕는 식물 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다. TALE 단백질은 34개 이하의 다양한 수의 아미노산 반복으로 구성된 중심 반복 도메인을 통해 식물의 특정한 DNA 서열을 인식하므로 이러한 특징을 이용하면 TALE을 게놈 엔지니어링의 도구를 위한 신규 플랫폼으로 사용할 수 있다.
본 발명의 TALE 도메인은 하나 이상의 TALE-반복 모듈의 조합에 의해 서열-특이적 방식으로 뉴클레오티드에 결합하는 단백질 도메인을 가리킨다. 상기 TALE 도메인은 적어도 하나 이상의 TALE-반복 모듈, 구체적으로 1 내지 30개의 TALE-반복 모듈을 포함하나 이에 한정되지 않는다. TALE-반복 모듈은 TALE 도메인 내의 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하는 부위로서 다음의 일반적인 아미노산 서열을 가질 수 있다:
H2N-LTPEQVVAIASXXGGKQALETVQRLLPVLCQAHG-COOH. XX는 위치 12 및 13에서의 초-변성 아미노산을 가리키는 것으로서 염기 인식의 특이성을 결정한다. 상세하게는, 상기 TALE-반복 모듈의 제12 및 제13 아미노산은 1개의 특정 핵산을 인식한다. XX가 HD일 때, 상기 TALE-반복 모듈은 C를, XX가 NG일 때 T를, XX가 NI일 때 A를, XX가 NN일 때 G를 각각 인식한다. 따라서 다양한 TALE-반복 모듈을 조합하는 경우, 타겟유전자 내의 특정위치를 인식할 수 있는 TALE 도메인을 제조할 수 있다. 구체적인 TALE 도메인의 제조방법은 상기 대한민국 출원특허인 '디자인된 TAL 이펙터 뉴클레아제를 통한 게놈 엔지니어링'(출원번호 10-2013-7018743)에 상세하게 기재되어 있다. 한편, TALEN은 일반적으로 이량체(dimer)로 작용하기 때문에, 타겟유전자 내의 특정위치를 절단하기 위해서는 2개의 TALEN 단량체(monomer)를 설계할 필요가 있다(도 1). 본 발명에서는 절단 부위를 기준으로 TALE 도메인이 결합하는 왼쪽의 특정위치를 제 1 절반-자리(half-site), 오른쪽의 특정위치를 제 2 절반-자리로 명명하였다. 2개의 TALEN 단량체는 각각 상이한 타겟유전자 내의 2개의 절반-자리 중 하나를 인식하며, 2개의 절반-자리는 9 내지 14-bp의 스페이서에 의해 서로 분리되도록 설계한다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면 12-bp의 스페이서에 의해 서로 분리되며 각각 21bp(제 1 절반-자리, 서열목록 제 1서열), 20bp(제 2 절반-자리, 서열목록 제 2서열)를 인식하도록 TALEN 단량체를 설계하였으며, 이를 이용하여 효과적으로 돼지 마이오스타틴 유전자의 녹아웃을 유도할 수 있었다.
본 발명에서 용어, "절단"은 마이오스타틴 뉴클레오티드 분자의 공유결합된 백본의 연결을 해제하는 것을 의미하며, "뉴클레오티드 절단 도메인"은 이러한 마이오스타틴의 뉴클레오티드 절단을 위한 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드 서열을 의미한다.
상기 뉴클레오티드 절단 도메인은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 뉴클레오티드 절단 도메인을 얻어낼 수 있는 엔도뉴클레아제의 예로는 제한성 엔도뉴클레아제, 회귀성 엔도뉴클레아제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 효소들은 뉴클레오티드 절단 도메인의 기원으로 사용할 수 있다. 또한, 상기 뉴클레오티드 절단 도메인은 단일의 뉴클레오티드 서열을 절단할 수 있을 뿐만 아니라, 그 절단 도메인의 기원에 따라 이중 결합의 뉴클레오티드 서열을 절단할 수 있다.
상기 제한성 엔도뉴클레아제는 DNA(인식 부위)와 서열 특이적 결합이 가능하며, 결합 부위의 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 예를 들어, 타입 IIs 효소인 FokI는 하나의 나선에서 인식 부위와 9 뉴클레오티드 떨어진 장소 및 다른 하나의 나선에서 인식 부위로부터 13 뉴클레오티드 떨어진 장소에서 DNA의 이중 나선 절단을 촉진한다.
본 발명의 뉴클레오티드 절단 도메인은 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 유래일 수 있으며, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 예를 들어, FokI, AarI, AceIII, AciI, AloI, BaeI, Bbr7I, CdiI, CjePI, EciI, Esp3I, FinI, MboI, sapI 또는 SspD51 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 본 발명의 뉴클레오티드 절단 도메인은 FokI 일 수 있다.
본 발명의 융합단백질은 핵 위치 신호 (nuclear localization signal) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 핵 위치 신호는 본 발명의 마이오스타틴을 표적으로 하는 TALEN을 마이오스타틴 유전자를 녹아웃시키기 위하여 핵 내로 이동시키기 위한 수단으로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (b) 상기 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되어 있는(operatively linked) 전사조절서열을 포함하는 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 벡터는 세포 내에 도입하여 본 발명의 융합단백질(TALEN)을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현벡터를 사용할 수 있으며, 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
상기 “작동적으로 연결되어 있는(operatively linked)”은 핵산 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 결합된 전사조절서열은 동물세포(예컨대, 포유동물 세포)에서 작동하여 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 조합 발현 벡터는 폴리 아네닐화 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
(a)　TALEN을 이용하는 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계;
(b) 상기 세포 내에 도입된 발현 벡터로부터 발현된 TALEN에 의해 마이오스타틴 유전자가 절단되는 단계; 및
(c) 상기 절단에 의해 마이오스타틴 유전자에 돌연변이가 유발되는 단계.
마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터를 세포 내로 도입하기 위해서 당업계에 공지된 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 재조합 발현 벡터를 세포 내로 도입하기 위하여 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기천공법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면 전기천공법을 이용하여 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터를 돼지의 태아섬유아 세포 내에 도입하였다.
상기 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터가 세포 내로 도입되어 이로부터 TALEN 융합단백질이 발현되면 마이오스타틴 유전자상의 원하는 부분에 이중 가닥 손상을 유도할 수 있으며, 마이오스타틴 유전자상에 이중 가닥 손상이 발생하면 세포는 자체적으로 가지고 있는 수리 기작을 이용하여 손상된 부위를 고치게 된다. 이때, 세포는 비상동 말단 결합 (non-homologous end joining, NHEJ) 방식으로 손상된 부위를 고치게 되고, 끊어진 DNA 가닥 말단에서 삽입 (insertion)이나 결실(deletion)이 일어나는 오류가 발생하기 쉬운(error-prone) 방향으로 수리가 진행된다. 따라서 마이오스타틴 유전자에 돌연변이가 유발되고, 결과적으로 마이오스타틴 유전자를 녹아웃 시킬 수 있다. 구체적으로 상기 돌연변이는 치환, 결실, 삽입 및 이들의 조합에 의한 돌연변이일 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, TALEN 융합단백질에 의해 삽입, 결실 등의 다양한 돌연변이가 유발되었으며, 이로 인해 마이오스타틴 유전자가 성공적으로 녹아웃되었다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 방법에 의해 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 세포를 제공한다. 상기 세포는 다양한 동물 세포일 수 있으나, 본 발명의 목적상 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환동물을 제조하기 위한 과정에서 이용될 수 있으므로, 구체적으로 형질전환하고자 하는 동물의 세포를 의미할 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환돼지를 제조하기 위해 돼지 태아 섬유아세포를 이용하여 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 세포를 제조하였다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 인간을 제외한 형질전환동물을 제조하는 방법을 제공한다:
(a)　TALEN을 이용하는 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터를 형질전환을 하고자 하는 동물의 세포 내로 도입하여 형질전환세포를 제조하는 단계;
(b) 형질전환을 하고자 하는 동물의 난소에서 난자를 채취한 후, 난자에서 핵을 제거하는 단계;
*(c) 상기 단계 (a)의 형질전환세포의 핵을 상기 단계 (b)의 핵이 제거된 난자에 이식하는 체세포 핵이식 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 체세포가 핵이식된 세포를 배양한 배아세포를 형질전환을 하고자 하는 동물의 대리모의 수란관에 이식하여 임신시키는 단계.
각 단계를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다:
(a)　 TALEN을 이용하는 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터를 형질전환을 하고자 하는 동물의 세포 내로 도입하여 형질전환세포를 제조하는 단계
상기 단계는 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 세포를 제조하는 방법에서 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
(b) 형질전환을 하고자 하는 동물의 난소에서 난자를 채취한 후, 난자에서 핵을 제거하는 단계
동물의 난소에서 난자를 채취하기 위해서는 당업계에 공지된 통상의 방법을 이용할 수 있다. 난자에서 핵을 제거하기 위해서는 물리적인 방법, 화학적인 방법 또는 Cytochalasin B를 사용한 원심분리법 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 암컷 돼지의 난소로부터 난포를 추출하여 난모세포 체외 성숙 배양액(in vitro maturation media, IVM media)에서 성숙시킨 다음, 난자 채취 바늘을 이용하여 난구세포를 제거하였으며, 이어서 화학적인 방법과 물리적인 방법을 이용하여 난자의 핵을 제거하였다.
(c) 상기 단계 (a)의 형질전환세포의 핵을 상기 단계 (b)의 핵이 제거된 난자에 이식하는 체세포 핵이식 단계
본 발명에서 용어, "체세포 핵 이식(Somatic-cell nuclear transfer, SCNT)"이란 세포의 핵을 이미 핵을 제거한 난자에 이식시키는 기술을 의미하며, 이와 같이 핵이식된 수정란을 발생이 진행되도록 활성화시틴 후, 대리모에 착상시켜서 태어난 개체는 핵공여 세포의 유전적 물질이 핵수여 세포질로 그대로 전달되었기 때문에 유전적으로 완전히 동일한 복제 개체가 된다. 체세포 핵 이식 방법에는 세포막융합법, 세포질내미세주입법 등을 이용할 수 있다. 세포막융합법은 간단하며 대규모 수정란 생산에 적합하다는 장점이 있으며, 세포질내 미세주입법은 핵과 난자내 물질들과의 접촉을 극대화시킨다는 장점이 있다. 체세포와 핵이 제거된 난자와의 융합은 전기자극을 통하여 세포막의 점도를 변화시켜 융합시키는 방법을 통하여 이루어진다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 핵 등이 제거된 난모세포와 체세포 핵을 이식할 공여세포를 전극과 평행하게 한 다음, 융합기기로 직류 전류 펄스를 가하여 융합을 진행하는 세포막융합법을 이용하였다.
(d) 상기 단계 (c)의 체세포가 핵이식된 세포를 배양한 배아세포를 형질전환을 하고자 하는 동물의 대리모의 수란관에 이식하여 임신시키는 단계
배아세포를 대리모의 수란관에 이식하여 임신시키는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 특별히 한정되는 것은 아니다.
상기 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 인간을 제외한 형질전환동물을 제조하는 방법은 다음의 단계를 더 포함할 수 있다.
(e) 상기 단계 (d)의 임신이 확정된 대리모에서 태아를 분리하고 마이오스타틴 유전자의 녹아웃 여부를 확인하는 단계;
(f) 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 태아의 세포의 핵을 상기 단계 (b)의 핵이 제거된 난자에 이식하는 체세포 핵이식 단계; 및
(g) 상기 단계 (f)의 체세포가 핵이식된 세포를 배양한 배아세포를 대리모 동물의 수란관에 이식하여 임신시키는 단계.
상기의 추가적인 단계들은 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환동물을 더 효과적으로 제조하기 위한 것으로서, 마이오스타틴 유전자의 녹아웃이 확인된 태아의 세포의 핵을 이용하여 2차 체세포 핵이식 및 배아이식을 진행하는 것이다. 구체적인 체세포 핵이식 및 배아이식 방법은 상기 방법과 동일하므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 2차 체세포 핵이식 및 배아이식을 통해 효과적으로 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환돼지를 생산할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 방법에 의해 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 인간을 제외한 형질전환동물을 제공한다. 본 발명에서 용어, "인간을 제외한 형질전환동물"은 포유동물, 어류, 조류 등일 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 목적상 인간에게 유용한 고기를 제공할 수 있는 식용동물일 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 상기 방법에 의해 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환돼지를 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 마이오스타틴 유전자의 특정 위치에 결합하여 절단하는 활성을 가지는 TALEN을 제공한다.
(b) 본 발명은 TALEN을 이용하는 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
(c) 본 발명은 TALEN을 이용하여 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 인간을 제외한 형질전환동물을 제조하는 방법을 제공한다.
(d) 본 발명의 방법을 이용하면, 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환돼지를 효과적으로 생산할 수 있으므로, 근육량이 증가된 돼지를 얻을 수 있으며, 이러한 방법은 인간에게 고기를 공급하는 다른 동물에도 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 TALEN이 작용하는 일반적인 원리를 나타내는 도면이다.
도 2는 돼지 MSTN 유전자의 특정서열을 타겟팅하여 제작한 TALEN의 활성을 측정하여 분석한 도표이다. A는 서열목록 제1서열, B는 서열목록 제2서열, C는 서열목록 제3서열, D는 서열목록 제4서열에 대한 TALEN의 활성을 측정하여 분석한 것이다.
도 3은 본 발명의 TALEN을 이용한 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 2차 체세포 핵이식 및 배아이식을 통해 생산된 수컷 돼지 태아에서 MSTN 유전자의 돌연변이 여부를 확인하기 위해 시퀀싱 분석을 한 결과이다. F1 및 18-2의 볼드체 G, 19-3의 164bp는 천연형에 비해 염기서열이 삽입(insertion)된 것을 나타내며, “---”는 천연형에 비해 염기서열이 결실(deletion)된 것을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 2차 체세포 핵이식 및 배아이식을 통해 생산된 MSTN-/- 수컷 돼지와 천연형 돼지를 비교한 사진이다.
도 6은 본 발명의 2차 체세포 핵이식 및 배아이식을 통해 생산된 MSTN-/- 수컷 돼지와 천연형 돼지에서 MSTN 단백질의 발현여부를 웨스턴 블롯으로 비교분석한 사진이다.
도 7은 본 발명의 2차 체세포 핵이식 및 배아이식을 통해 생산된 MSTN-/- 수컷 돼지와 천연형 돼지에서 면역조직화학분석 방법을 통해 근육조직을 형태학적으로 비교분석한 사진이다.
도 8은 A는 본 발명의 2차 체세포 핵이식 및 배아이식을 통해 생산된 MSTN-/- 수컷 돼지와 천연형 돼지에서 Scion Image 소프트웨어로 근섬유 직경을 측정하여 400개의 근섬유를 분석한 도표이며, B는 이들의 평균치를 계산하여 비교분석한 도표이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터의 제작
TALEN을 이용하여 돼지 MSTN 유전자에 돌연변이를 유발하여 MSTN 유전자를 녹아웃하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다. 이를 위해 우선 TALE 도메인이 결합할 MSTN 유전자의 특정서열을 선정하였다. TALE 도메인에 연결된 FokⅠ 절단 도메인이 동형이량체(homdimer)를 이루어 작용할 수 있도록 TALE 도메인이 각각 결합하는 제 1 절반 자리(half-site)의 서열과 제 2 절반 자리(half-site)의 서열을 선정하였다. 생물 정보학 방법에 의한 돼지 MSTN 유전자의 서열분석과 (주)툴젠이 데이터베이스화하여 가지고 있는 특정서열에서의 TALEN의 DNA절단 능력 분석을 통해 돼지 MSTN 유전자 중 42-54 bp의 길이를 가지며 시작서열이 티민(T), 마지막 서열이 아데닌(A)인 4개의 서열(서열목록 제1 내지 4서열)을 특정서열을 선택하였다. 4개의 서열에 대해 TALEN을 제작하여 TALEN의 활성을 측정하였으며(도 2), 분석결과, TALEN이 활성을 나타내며 MSTN 유전자의 제1 엑손 내에 위치하고 있는 서열목록 제1서열을 최종적으로 선택하였다. 왼쪽 TALE 도메인이 결합할 제 1 절반 자리(half-site)의 서열은 5-ttcaaatcctcagtaaaactt-3이었으며, 오른쪽 TALE 도메인이 결합할 제 2 절반 자리(half-site)의 서열은 5-gctcctaacattagcaaaga-3이었으며, TALE 도메인에 연결된 FokⅠ 절단 도메인에 의해 절단될 서열은 cgcctggaaaca이었다.
선정된 돼지 MSTN 유전자의 특정서열에 작용할 TALEN을 제조하기 위하여 대한민국 출원특허인 '디자인된 TAL 이펙터 뉴클레아제를 통한 게놈 엔지니어링'(출원번호 10-2013-7018743)에 개시된 방법을 이용하였다. 선정된 특정서열 내의 각각의 염기에 특이적으로 결합하는 TALE-반복 모듈을 조합하여 결과적으로 전체 특정서열에 특이적으로 결합할 수 있는 TALE 도메인을 설계하였으며 여기에 핵산 엔도 뉴클레아제의 절단 도메인(FokⅠ)이 연결되도록 하였다. 제 1 절반자리에 결합할 TALEN의 전체 아미노산 서열은 서열목록 제5서열과, 제 2 절반자리에 결합할 TALEN의 전체 아미노산 서열은 서열목록 제6서열과 같다. 결과적으로, 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터(Pig myostatin TALEN)에는 암피실린(Ampicillin) 약물 내성 유전자, CMV 프로모터, HA 에피토프 태그, 핵 위치 신호(nuclear localization signal), AvrBs3의 N-말단 135개 아미노산, 돼지 마이오스타틴의 특정서열에 결합하는 TALE 도메인, FokI 절단 도메인이 순서대로 배열되도록 하였다(도 3). 제 1 절반자리에 결합할 TALEN을 발현하기 위한 재조합 발현벡터의 서열은 서열목록 제7서열, 제 2 절반자리에 결합할 TALEN을 발현하기 위한 재조합 발현벡터의 서열은 서열목록 제8서열과 같다.
실시예 2: 돼지 태아 섬유아세포주(fibroblast cell line)의 구축
돼지 태아 섬유아세포주는 임신한지 40일된 성체 암컷 돼지에서 분리한 태아로부터 얻어진 초대 섬유아세포(primary fibroblast)를 계대배양하여 구축하였으며, 그 중에서 수컷 태아로부터 얻어진 세포를 공여세포로 삼았다. 세포주를 확립하는 과정에는 통상적인 방법을 적용하였다. 이하 관련된 시약은 모두 Gibco사(USA)의 것을 사용하였다.
무균 상태에서 태막을 절취하여, 돼지태아를 PBS에 넣고 세척액이 투명해질 때까지 반복적으로 3-5번 헹군 다음, 페트리디시로 이동시킨 후, 안과용 가위로 머리 부위와 장기를 자르고, 75%의 알코올로 충분이 세척하여 소독하고, 다시 이를 0.5-1mm³ 크기의 조직덩어리로 절단하였다. 상기 절단한 조직덩어리를 0.25% 트립신을 포함한 DMEM 배지에 넣고 38.5℃의 CO2 인큐베이터에서 4분 동안 방치한 후, 소 태아 혈청을 함유한 DMEM 배지를 첨가하여 트립신의 활성을 정지시킨 다음, 15 ㎖ 실험관에 옮겨, 1,500 rmp의 속도로 10분 동안 원심 분리를 하였다. 원심분리한 상층액을 버리고, 38.5℃로 예열된 3 ㎖의 20% FBS/DMEM를 첨가하여 덩어리를 풀어준 후, 무균 처리된 세포배양 접시에 균일하게 뿌린 다음, 38.5℃ CO2 인큐베이터에 넣어 배양하였다. 이후 매일 세포의 형태와 성장 상황을 관찰하면서 3-5번 계대한 후, 세포 형질전환 실험에 사용하였다.
실시예 3: 전기천공법( electroporation )에 의한 돼지 태아 섬유아세포의 형질전환
전기천공법으로 세포를 형질전환하기 위하여 Amaxa4D(Lonza, 스위스)를 이용하였으며, 형질전환된 세포를 선별하기 위해 H-2Kk 마그네틱 리포터를 이용하는 방법(Kim H. et al., PLoS ONE 8(2):e54676 (2013))을 이용하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다:
상기 돼지 태아 섬유아세포를 15% 소 태아 혈정, 1% 비필수아미노산, 100 mg/㎖ 페니실린과 100 mg/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양한 세포를 트립신을 처리하여 떼어낸 다음, 세포들을 HBSS (WelGen, 대한민국)로 세척하여 원심분리를 하였다. 세포를 카운팅하여 최종적으로 약 1 × 106개의 세포를 세포에 도입하고자 하는 DNA 플라스미드가 포함되어 있는 완충용액에 현탁시킨 다음, 전기천공법(electroporation)을 수행하였다. 사용한 DNA의 비율은 45:45:10(TALEN monomer를 암호화하는 플라스미드(DAS): TALEN monomer를 암호화하는 플라스미드(RR): H-2Kk 마그네틱 리포터 유전자 플라스미드)로 하였다. 전기천공법을 거친 세포를 배양액에 풀어 배양접시에 뿌린 후 5% CO2, 37℃의 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다. 형질전환된 세포를 선별하기 위하여 Magnetic Separation and Antibiotics Selection(Kim H. et al., PLoS ONE 8(2):e54676 (2013))을 수행하였다. 이와 같이 선별된 형질전환 세포들을 15% FBS/DMEM에서 배양하여 4-8세대 계대 배양한 다음, 체세포 핵 이식의 공여세포로 활용하였다.
실시예 4: 난모세포 체외 성숙 배양
사춘기 전의 암컷 돼지로부터 난소를 얻은 다음, 난포흡입펌프로 난소로부터 직경이 3-8 mm인 난포를 빨아내었다. 난구가 3층 이상으로 감싸져 있고 치밀하며 세포질이 균일한 난구 세포-난모 세포 복합체(CumuLus-oocyte-complexes, COCs)를 선택하였고, TALP 배지로 세 번 세척한 다음, 난모세포 체외 성숙 배양액(in vitro maturation media, IVM media)에 넣었다. IVM 배양액의 성분은 다음과 같다: TCM-199 첨가 10% 돼지 난포액(pEE), 0.6 mmol·L-1 L-시스테인, 10 IU/㎖ 인간 융모성 생식선 자극호르몬(hCG), 10 IU/㎖ 임신된 말에서 얻어진 혈청성 성선 자극 호르몬(PMSG), 10 ng/㎖ 표피성장인자(EGF). 22 시간 후 호르몬이 없는 IVM 배양액으로 교체하였다. 다시 38.5℃, 5％ CO2 인큐베이터에서 38시간 배양한 다음, 0.1% 히알루로니다아제(hyaluronisase)에 넣고, 직경이 170-180μm인 난자 채취 바늘을 이용하여 반복적으로 난모세포를 흡입하여 난구세포를 제거하였다. 난구세포가 제거된 난모세포 중에서 난황주위간극(Perivitelline space)이 선명하고, 난세포가 완전하며, 제1극 세포가 배출된 난모세포를 선택하여 이후 체세포 핵이식에 사용하였다.
실시예 5: 화학 보조 핵 제거 방법(chemically assisted enucleation )을 이용한 핵의 제거
상기 난모세포에서 핵을 제거하기 위하여, 수용체로 선택된 난모세포를 0.4 ug/㎖ 디메콜신(Demecolcine)과 0.05 mol/L 수크로즈를 포함한 배양액에서 1 시간 동안 처리한 후, 5 mg/㎖ 시토칼라신 B(cytochalasin B)와 0.4 mg/㎖ 디메콜신(demecolcine)이 포함된 용액으로 옮기었다. 현미경 조작 시스템(micromanipulator, 1 X 71, Olympus, Japan)을 사용하여 핵 제거 바늘로 M II 난모세포, 제1극세포 및 돌기측 세포핵을 제거한 뒤, 체세포 핵이식에 이용하였다.
실시예 6: 융합에 의한 1차 체세포 핵이식
상기 실시예 5의 핵 등이 제거된 난모세포를 융합액(0.28 mmol/L mannitol, 0.1 mmol/L MgCl2)에서 평형(equilibration)시킨 후, 융합액을 도포한 융합조 내에 넣었다. 융합조 내에 상기 실시예 3의 공여세포도 넣은 다음 유리 바늘을 이용하여 공여세포-수용체 난모 세포막 접촉면을 전극과 평행하게 한 다음, 융합기기(LF301, BEX, 일본)를 이용하여 2 kV/cm, 20μs의 직류 전류 펄스를 가하여 융합을 진행하였다. 융합한 후 재구축된 난자를 0.4 mg/㎖ 디메콜신(demecolcine)이 포함된 배양액에서 1 시간 동안 배양한 다음, 활성화액(0.28 mmol/L mannitol, 0.1 mmol/L MgCl2)과 0.1 mmol/L Ca2+가 포함된 용액에서 1.5 kV/cm, 100μs 직류 전류 펄스를 처리하여 활성화시킨 후, 2 mmol/L 6-DMAP가 포함된 배양액에서 4 시간 동안 배양하였다.
실시예 7: 배아 이식 및 대리모돈의 임신 진단
상기 방법으로 융합시켜 재구축된 배아를 NCSU-37 배양액에 넣어, 38℃, 5％ CO2 인큐베이터에서 배양하였으며, 배아 구축 당일을 0일로 하여 재구축 배아를 7-8일간 배양하였으며, 배양 후 38시간과 7일째에 각각 난분할율과 배낭 발육 상황(embryo sac development)을 관찰하고 기록하였다.
배아 이식을 위해 발정 주기가 정상이고, 생식기관에 질병이 없는 요크셔(Yorkshire) 돼지를 대리모돈으로 선택하였다. 대리모돈에 1000 IU 임신말 혈청성 성선 자극 호르몬(PMSG)을 주사하고 72 시간 후에 근육에 1000 IU 인간 융모성 생식선 자극호르몬(hCG)을 주사하여 발정을 유도하였다. hCG를 주사하고 48 시간 후, 1 내지 3일 배양한 난분할이 정상인 1 내지 8 세포기의 배아를 수술을 통해 대리모돈의 수란관에 이식하였다. 배아를 이식한 후 24-26일 동안 B형 초음파 진단을 통해 임신 상황을 검사하였다. 3 마리의 대리모돈에 배아를 이식한 결과, 총 17 개의 태아를 얻을 수 있었으며, 이를 정리한 표는 다음과 같다(표 1):
대리임신
암컷돼지 번호		 이식배아
수량		 임신나이
(일)		 태아수 태아 번호
R-29 196 36 9 F1, F2, F3
F4, F5, F6
F7, F8, F9
R-18 205 25 3 18-1, 18-2, 18-3
R-19 232 27 5 19-1, 19-2, 19-3
19-4, 19-5
실시예 8: 태아에서 MSTN 유전자의 돌연변이 확인
체세포 핵이식 및 배아 이식을 통해 얻은 태아에서 MSTN 유전자의 돌연변이 여부를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다:
배아 이식 36일 후 B형 초음파 진단으로 임신이 확정된 대리모돈으로부터 자궁을 적출하고, 냉장 보관 상태로 실험실로 가져온 후 자웅에서 태아를 분리하였다. 태아에서 G-DEX II cDNA 추출 키트(인트론바이오, 대한민국)를 사용하여 태아의 gDNA를 추출하였다. 추출한 gDNA를 nested PCR의 주형으로 사용하였으며, 프라이머는 마이오스타틴 녹아웃용 TALEN의 타켓 부위를 증폭할 수 있도록 다음과 같이 설계하였다: 정방향(5'-ctggtcccgtggatctgaatg-3'), 역방향(5'-gatcgtttccgtcgtagcgtg-3').
상기 프라이머를 사용하여 302 bp의 PCR 생성물을 얻었으며, 이를 주형으로 하고 다음의 프라이머를 사용하여 nested PCR을 수행하였다: 정방향(5'-gaatgagaacagcgagcaaaagg-3'), 역방향(5'-catcttccaaggagccatcac-3').
PCR 수행결과, 257 bp의 PCR 생성물을 얻었으며, 돌연변이 여부확인을 위한 T7E1 미스매치(mismatch) 분석을 하기 위해 PCR 생성물을 재풀림시킨후 다시 결합시켜 이종이중체가 만들어지도록 하였다. 이종이중체 DNA를 T7E1 효소((주)툴젠, 대한민국)로 처리하여 15분 반응 후, 아가로스 젤에 로딩하여 분석하였다. 분석결과, T7E1 효소에 의해 절단되어 미스매치가 확인된 PCR 생성물들을 T-Blunt PCR Cloning Kit(SolGent, 대한민국)를 사용하여 클론닝하였다. 클론닝한 플라스미드를 M13 프라이머를 이용하여 시퀀싱 분석을 하였다(도 4). 분석결과, 10개 태아에서 MSTN 유전자에 돌연변이가 있었으며, 이 중 3개는 MSTN 두 대립유전자에 돌연변이(bi-allelic null mutation, MSTN-/-)가 존재하였고(F1, F2, 19-3), 7개는 MSTN 하나의 대립유전자에만 돌연변이(Heterozygous knockout, MSTN+/-)가 있었다(F3, F5, F9, 18-2, 18-3, 19-1, 19-4). 획득한 10개 돌연변이 태아로부터 상기 실시예 2의 방법을 이용하여 세포주를 확립하였다.
실시예 9: 2차 체세포 핵 이식 및 배아 이식
상기 실시예 8의 돌연변이 태아 중 MSTN 두 대립유전자에 돌연변이를 나타낸 F2로부터 확립한 세포주를 공여세포로 하여 2차 체세포 핵이식 및 배아이식을 진행하였다. 체세포 핵 이식 및 배아 이식은 실시예 4 내지 7의 1차 체세포 핵이식 및 배아 이식방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 4마리의 대리모돈에 871개의 배아를 이식한 결과 20마리의 새끼돼지를 얻을 수 있었다(표 2). 상기 방법을 통하여 생산된 MSTN-/- 클론 돼지(cloned pig)는, 대조군의 동일한 나이의 돼지(2개월 나이)에 비하여 뚜렷한 더블 근육(double muscle) 특성을 나타내었다(도 5).
대리모돈 이식배아수량 출산 수 새끼돼지번호 출생시 체중(g)
R-1 222 6 MA1-1 485
MA1-2 575
MA1-3 545
MA1-4 430
MA1-5 1060
MA1-6 655
R-3 222 4 MA3-1 840
MA3-2 980
MA3-3 515
MA3-4 1075
R-4 232 4 MA4-1 780
MA4-2 700
MA4-3(사태) 580
MA4-4 615
R-28 205 9 MA28-1 700
MA28-2 1295
MA28-3 840
MA28-4 915
MA28-5(사태) 500
MA28-6 1095
MA28-7 630
MA28-8 540
MA28-9(사태) 1235
실시예 10: MSTN -/- 클론 돼지에서의 마이오스타틴 발현여부 확인
MSTN-/- 클론 돼지에서 마이오스타틴의 발현여부를 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 수행하였다. MSTN-/- 클론 돼지와 천연형 돼지의 근육조직으로부터 RIPA 분해액(50 mM Tris-HCl, pH8.0, 150 mM NaCl， 1％ NP-40， 0.5 ％ sodium deoxycholate, 0.1％ SDS)을 사용하여 총 단백질을 추출하였다. 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리한 다음, PVDF 필름(GE water & Process Technologies. Trevose, PA. USA)에 옮기고, 5% 탈지 분유용액에 넣어 실내 온도에서 1 시간 동안 배양하여 비특이적 결합을 억제한 다음, 여기에 1차 항체(anti-Myostatin, 영인프론티어, 대한민국)를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 세척 후, HRP가 표지된 2차 항체(anti-mouse IgG, Santa Cruz, CA, USA)를 1:5000로 희석하여 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, 향상된 화학발광 기 측정방법(Enhanced chemiluminescence assay, Animal Genetics Inc., 대한민국)을 통해 발생된 신호를 분석하였다. GAPDH(Santa Cruz, CA, USA)를 내재적 컨트롤로 사용하였다. 분석결과, 천연형 돼지에서는 마이오스타틴이 검출되었으나, MSTN-/- 클론 돼지에서는 마이오스타틴이 검출되지 않았으며(도 6), 이를 통해 MSTN-/- 클론 돼지에서 마이오스타틴이 발현되지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 11: 면역 조직 화학 및 형태학 관찰을 통한 MSTN -/- 클론 돼지의 더블 근육 특성(double-muscle trait) 확인
MSTN-/- 클론 돼지의 더블 근육 특성을 확인하기 위해, 출생한 후 25일이 된 MSTN-/- 클론 돼지와 천연형 돼지에서 각각 위팔두갈래근(biceps brachii)을 적출하였다. 근육 조직을 포름알데히드에서 10시간 동안 고정시킨 후, 알코올 구배를 이용하여 탈수시킨 다음, 클로로포름으로 투명화시키고, 파라핀으로 포매(Embedding)한 다음 절편기(microtome)로 두께가 일3-5 μm가 되도록 절단하였다. 절단한 조직 박편들을 신속하게 30% 알코올 수용액에 담근 다음, 40℃ 항온의 온수기에 옮겨 조직 박편을 완전히 펴놓은 후, 슬라이드에 부착시켰다. 조직이 부착된 슬라이드를 건조시킨 후 56-60℃에서 30분 동안 가열한 다음, HE(Hematoxyline-Eosin)염색을 하였다(도 7). 세포핵은 파란색으로 나타났으며, 근육의 세포질은 빨간색으로 나타났다. MSTN-/- 클론 돼지는 천연형 새끼 돼지에 비해 MSTN-/- 새끼 돼지가 대조군에 비하여 근육 절편 상의 근섬유가 비대하고 치밀한 것으로 나타났다. 한편, Scion Image 소프트웨어를 이용하여 근섬유 직경과 개수를 측정하였다. 400개의 근섬유를 분석한 결과, MSTN-/- 클론 돼지는 천연형 새끼 돼지에 비해 근섬유의 직경이 증가한 것을 확인하였다(도 8).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 구체적인 실현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다.
<110> ToolGen Incorporation <120> Transcription Activation Like Effector Nuclease for Targeting Myostatin Gene and Methods for Making Myostatin Gene Knock out Animal Using Thereof <130> DPP20170625KR <150> CN 201410168615.5 <151> 2014-04-23 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> pig_MSTN <400> 1 ttcaaatcct cagtaaactt cgcctggaaa cagctcctaa cattagcaaa ga 52 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> pig_MSTN <400> 2 tggaaacagc tcctaacatt agcaaagatg ctataagaca acttttgccc a 51 <210> 3 <211> 53 <212> DNA <213> pig_MSTN <400> 3 tgcccaaagc tcctccactc cgggaactga ttgatcagta cgatgtccag aga 53 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> pig_MSTN <400> 4 tccactccgg gaactgattg atcagtacga tgtccagaga gatgacagca 50 <210> 5 <211> 1006 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSTN_1_Left TALEN <400> 5 Met Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Leu Pro Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile Arg Ile Gln Asp Leu Arg Thr Leu Gly 20 25 30 Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr 35 40 45 Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala 50 55 60 His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala 65 70 75 80 Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu 85 90 95 Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu 100 105 110 Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu 115 120 125 Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala 130 135 140 Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu 145 150 155 160 Asn Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly 165 170 175 Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 180 185 190 Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp 195 200 205 Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 210 215 220 Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 225 230 235 240 Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 245 250 255 Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile 260 265 270 Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 275 280 285 Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val 290 295 300 Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 305 310 315 320 Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln 325 330 335 Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 340 345 350 Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 355 360 365 Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu 370 375 380 Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu 385 390 395 400 Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln 405 410 415 Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His 420 425 430 Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly 435 440 445 Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 450 455 460 Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp 465 470 475 480 Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 485 490 495 Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 500 505 510 Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 515 520 525 Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile 530 535 540 Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 545 550 555 560 Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val 565 570 575 Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 580 585 590 Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln 595 600 605 Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 610 615 620 Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro 625 630 635 640 Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu 645 650 655 Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu 660 665 670 Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln 675 680 685 Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His 690 695 700 Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly 705 710 715 720 Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 725 730 735 Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 740 745 750 Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 755 760 765 Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 770 775 780 Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser 785 790 795 800 Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu 805 810 815 Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu 820 825 830 Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Pro Thr Gln Asp Arg Ile 835 840 845 Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg 850 855 860 Gly Glu His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr 865 870 875 880 Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr 885 890 895 Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Ala Met Gln Ser 900 905 910 Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu 915 920 925 Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe 930 935 940 Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu 945 950 955 960 Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu 965 970 975 Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu 980 985 990 Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Leu Asp 995 1000 1005 <210> 6 <211> 1006 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSTN_2_Right TALEN <400> 6 Met Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Leu Pro Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile Arg Ile Gln Asp Leu Arg Thr Leu Gly 20 25 30 Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr 35 40 45 Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala 50 55 60 His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala 65 70 75 80 Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu 85 90 95 Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu 100 105 110 Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu 115 120 125 Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala 130 135 140 Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu 145 150 155 160 Asn Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly 165 170 175 Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 180 185 190 Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 195 200 205 Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 210 215 220 Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 225 230 235 240 Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 245 250 255 Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile 260 265 270 Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 275 280 285 Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val 290 295 300 Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 305 310 315 320 Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln 325 330 335 Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 340 345 350 Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 355 360 365 Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu 370 375 380 Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu 385 390 395 400 Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln 405 410 415 Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His 420 425 430 Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly 435 440 445 Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 450 455 460 Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 465 470 475 480 Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 485 490 495 Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 500 505 510 Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 515 520 525 Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile 530 535 540 Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 545 550 555 560 Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val 565 570 575 Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 580 585 590 Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln 595 600 605 Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 610 615 620 Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 625 630 635 640 Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu 645 650 655 Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu 660 665 670 Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln 675 680 685 Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His 690 695 700 Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly 705 710 715 720 Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 725 730 735 Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn 740 745 750 Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 755 760 765 Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 770 775 780 His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser 785 790 795 800 Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu 805 810 815 Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu 820 825 830 Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Pro Thr Gln Asp Arg Ile 835 840 845 Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg 850 855 860 Gly Glu His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr 865 870 875 880 Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr 885 890 895 Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Ala Met Gln Ser 900 905 910 Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu 915 920 925 Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe 930 935 940 Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu 945 950 955 960 Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu 965 970 975 Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu 980 985 990 Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Leu Asp 995 1000 1005 <210> 7 <211> 6763 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSTN_1_Left TALEN_CMV Sequence <400> 7 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagatgcaa gcttgccacc 900 atggtgtacc cctacgacgt gcccgactac gccgaattgc ctccaaaaaa gaagagaaag 960 gtagggatcc gaattcaaga tctacgcacg ctcggctaca gccagcagca acaggagaag 1020 atcaaaccga aggttcgttc gacagtggcg cagcaccacg aggcactggt cggccatggg 1080 tttacacacg cgcacatcgt tgcgctcagc caacacccgg cagcgttagg gaccgtcgct 1140 gtcaagtatc aggacatgat cgcagcgttg ccagaggcga cacacgaagc gatcgttggc 1200 gtcggcaaac agtggtccgg cgcacgcgct ctggaggcct tgctcacggt ggcgggagag 1260 ttgagaggtc caccgttaca gttggacaca ggccaacttc tcaagattgc aaaacgtggc 1320 ggcgtgaccg cagtggaggc agtgcatgca tggcgcaatg cactgacggg tgcccccctg 1380 aacctcactc ccgctcaggt ggtggctatt gcaagtaatg gaggagggaa gcaggccttg 1440 gagacagtcc aacgcttgct gcccgttctt tgtcaggatc atgggttgac acccgagcaa 1500 gttgtggcaa ttgcttcaca cgatggtggc aaacaggctt tggaaacagt tcaaagattg 1560 ttgcctgtcc tttgccaagc tcatggactt actccagcac aggtggtggc catcgcatcc 1620 aacataggag gtaaacaagc actggaaacc gtccagaggc ttttgcctgt cctctgccag 1680 gatcacgggt tgacccccga tcaggtggtt gccatcgcat caaatatcgg tgggaaacaa 1740 gcacttgaga ctgtccaacg gttgttgcct gtcctctgcc aggctcatgg attgactccc 1800 gaccaggttg tcgctattgc ttcaaacatt ggaggaaagc aggccttgga gactgtgcag 1860 cggcttcttc ctgtcctttg tcaagaccat ggcctgaccc ccgaccaggt ggtggccatc 1920 gccagcaacg gaggcggcaa gcaggccctg gaaaccgtgc agagactgct gcccgtgctg 1980 tgccaggccc acggtcttac accagaccag gtcgttgcca ttgctagtca tgacgggggt 2040 aaacaggctc tcgaaactgt gcaacgcttg ttgccagttt tgtgccaagc tcatggcttg 2100 acacctgcac aagtggttgc aatcgcttca cacgacggag gaaagcaagc cctcgaaact 2160 gtgcagcggc tcctccccgt gctgtgtcaa gatcacggcc ttacacccgc tcaagtcgtc 2220 gcaattgcca gcaatggagg cggtaagcag gccttggaga ctgttcagag gttgttgccc 2280 gtgctttgcc aagcacatgg cttgacccct gagcaggtcg tggccatcgc aagccacgac 2340 ggtggtaaac aagccttgga aaccgttcaa cggcttttgc ccgtgttgtg tcaagcccac 2400 ggcctgactc ctgctcaagt ggttgcaatt gcttctaaca ttggagggaa acaggccctg 2460 gaaaccgtgc aacggttgct gccagtgctc tgtcaagcac atggactcac acccgcccag 2520 gtcgtggcta tcgcttctaa taatggcggt aaacaagcac tcgagacagt tcagagactg 2580 cttcctgtcc tgtgtcaaga tcatgggctg actcctgagc aggtcgtcgc cattgcaagt 2640 aatggaggag ggaaacaggc acttgagaca gtccaaaggc tccttccagt tctgtgtcaa 2700 gctcatggac tcacaccagc ccaggtggtc gcaattgctt caaacattgg gggaaagcag 2760 gctttggaga cagtgcagcg cttgctccca gttttgtgtc aagaccatgg gttgactcct 2820 gctcaagtcg tggctatcgc ctcaaatata ggtggcaaac aggccctcga aacagtgcaa 2880 agattgcttc ctgtgctttg tcaagctcat ggattgaccc ctgagcaagt ggttgccatt 2940 gccagtaata tcggcggcaa gcaggctttg gaaactgttc agagattgct gcccgttctt 3000 tgccaagcac atggcttgac acccgatcaa gttgttgcta tcgctagcca tgatggaggg 3060 aaacaagccc ttgagactgt gcaacggctg cttccagtgt tgtgccaagc tcatggactt 3120 actcccgatc aggtcgtggc tattgcatca aatggtggtg gcaaacaagc actggaaacc 3180 gttcaaaggt tgcttcctgt tctgtgtcag gaccacggtc tgactccgga acaggtggtg 3240 gcgattgcaa gcaacggcgg cggcaaacag gctctagaga gcattgttgc ccagctctcc 3300 agacctgatc cggcgctagc cgcgttgcta gtcaaaagtg aactcgagga gaagaaatct 3360 gaacttcgtc ataaattgaa atatgtgcct catgaatata ttgaattaat tgaaattgcc 3420 agaaatccca ctcaggatag aattcttgaa atgaaggtaa tggaattttt tatgaaagtt 3480 tatggatata gaggtgagca tttgggtgga tcaaggaaac cggacggagc aatttatact 3540 gtcggatctc ctattgatta cggtgtgatc gtggatacta aagcttatag cggaggttat 3600 aatctgccaa ttggccaagc agatgccatg caaagctatg tcgaagaaaa tcaaacacga 3660 aacaaacata tcaaccctaa tgaatggtgg aaagtctatc catcttctgt aacggaattt 3720 aagtttttat ttgtgagtgg tcactttaaa ggaaactaca aagctcagct tacacgatta 3780 aatcatatca ctaattgtaa tggagctgtt cttagtgtag aagagctttt aattggtgga 3840 gaaatgatta aagccggcac attaacctta gaggaagtga gacggaaatt taataacggc 3900 gagataaact ttctcgatta gtagtcaggg ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag 3960 agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 4020 ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 4080 ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 4140 ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 4200 tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg gggtatcccc acgctgcagt 4260 gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga 4320 tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc 4380 cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccaactt 4440 gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 4500 agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 4560 tgtctgtata ccgtcgacct ctagctagag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 4620 tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 4680 taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 4740 cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 4800 gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 4860 ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 4920 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 4980 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 5040 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 5100 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 5160 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta 5220 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 5280 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 5340 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 5400 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 5460 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 5520 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 5580 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 5640 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 5700 ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 5760 tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 5820 atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 5880 tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga tccacgctca ccggctccag atttatcagc 5940 aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 6000 catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 6060 gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 6120 ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 6180 aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 6240 atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 6300 cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 6360 gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 6420 agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 6480 gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 6540 caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 6600 ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 6660 tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 6720 aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtc 6763 <210> 8 <211> 6763 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSTN_1_Right TALEN_CMV Sequence <400> 8 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagatgcaa gcttgccacc 900 atggtgtacc cctacgacgt gcccgactac gccgaattgc ctccaaaaaa gaagagaaag 960 gtagggatcc gaattcaaga tctacgcacg ctcggctaca gccagcagca acaggagaag 1020 atcaaaccga aggttcgttc gacagtggcg cagcaccacg aggcactggt cggccatggg 1080 tttacacacg cgcacatcgt tgcgctcagc caacacccgg cagcgttagg gaccgtcgct 1140 gtcaagtatc aggacatgat cgcagcgttg ccagaggcga cacacgaagc gatcgttggc 1200 gtcggcaaac agtggtccgg cgcacgcgct ctggaggcct tgctcacggt ggcgggagag 1260 ttgagaggtc caccgttaca gttggacaca ggccaacttc tcaagattgc aaaacgtggc 1320 ggcgtgaccg cagtggaggc agtgcatgca tggcgcaatg cactgacggg tgcccccctg 1380 aacctcactc cagcccaggt ggtcgccatt gcaagccatg acgggggcaa gcaagcattg 1440 gaaaccgttc aacgcttgct cccagtgttg tgccaggctc atggacttac cccagatcaa 1500 gtggttgcaa tcgctagtaa tgggggtggc aagcaggccc tcgagacagt ccagaggttg 1560 ttgccagtcc tttgtcaggc tcatggcctg acccccgcac aagtcgtggc aattgcctct 1620 aacggcggtg ggaaacaagc tcttgaaaca gtccaaagac tcctgccagt gctctgccag 1680 gaccatgggt tgaccccagc acaagtggtc gccatcgcat ccaacggtgg tgggaaacag 1740 gcattggaga cagttcaacg gctgcttcct gtgctgtgcc aggctcacgg actgactcct 1800 gaccaagttg ttgcaatcgc cagcaataat ggtggcaaac aagcccttga gacagtccag 1860 cggctcctcc ccgtcctttg tcaagcacat ggcctcacac cagctcaagt cgttgctatt 1920 gcttcacatg atggaggtaa acaagcactt gaaaccgtgc aaagactctt gcccgtgctt 1980 tgtcaggctc acgggttgac accagagcag gtcgtcgcca ttgcaagtaa tggaggaggg 2040 aaacaggcac ttgagacagt ccaaaggctc cttccagttc tgtgtcaagc tcatggactc 2100 acaccagccc aggtggtcgc aattgcttca aacattgggg gaaagcaggc tttggagaca 2160 gtgcagcgct tgctcccagt tttgtgtcaa gaccatgggt tgactcctgc tcaagtcgtg 2220 gctatcgcct caaatatagg tggcaaacag gccctcgaaa cagtgcaaag attgcttcct 2280 gtgctttgtc aagcacatgg ccttacacct gcacaagttg ttgcaattgc aagcaacggc 2340 ggcggaaaac aggcactgga aactgtgcaa agactcctgc cagttttgtg ccaggctcat 2400 ggcctgactc cagaccaggt cgttgctatt gccagcaata acggaggtaa gcaagcattg 2460 gagactgttc agcggctcct ccctgtcctc tgtcaggccc acgggctgac tcctgcacag 2520 gtggtggcca tcgcttcaaa cggggggggg aagcaagccc tcgaaactgt tcaacggttg 2580 ttgcctgttt tgtgtcagga tcatgggctg actcctgcac aggttgtcgc catcgctagc 2640 aatgggggtg gcaaacaggc acttgaaaca gtgcaacggt tgttgcccgt cttgtgtcag 2700 gaccatgggc ttacccctgc acaggtcgtg gcaattgcct ccaacatcgg ggggaagcaa 2760 gcccttgaaa ctgtccagcg cctgttgcca gttctttgtc aagcccatgg attgactccc 2820 gaccaggtgg tcgcaattgc aagtaacaac ggtgggaaac aggctttgga gactgtgcag 2880 agacttcttc ccgtgttgtg ccaagctcat ggcctcactc ctgatcaagt ggttgccatt 2940 gcctctaaca acggcggaaa acaggctctt gagactgtcc agaggctgct gcccgtgctc 3000 tgtcaggatc atggactcac acctgctcaa gtggttgcaa tcgccagcaa tattggcggt 3060 aaacaggcct tggaaacagt tcaacgcttg cttccagtct tgtgccaagc tcacgggctg 3120 accccagagc aggtcgtggc tatcgcatct aacaatggtg gtaagcaagc tctggagaca 3180 gtgcagagac ttctcccagt tctgtgccag gcccacggtc tgactccgga acaggtggtg 3240 gcgattgcaa gccatgatgg cggcaaacag gctctagaga gcattgttgc ccagctctcc 3300 agacctgatc cggcgctagc cgcgttgcta gtcaaaagtg aactcgagga gaagaaatct 3360 gaacttcgtc ataaattgaa atatgtgcct catgaatata ttgaattaat tgaaattgcc 3420 agaaatccca ctcaggatag aattcttgaa atgaaggtaa tggaattttt tatgaaagtt 3480 tatggatata gaggtgagca tttgggtgga tcaaggaaac cggacggagc aatttatact 3540 gtcggatctc ctattgatta cggtgtgatc gtggatacta aagcttatag cggaggttat 3600 aatctgccaa ttggccaagc agatgccatg caaagctatg tcgaagaaaa tcaaacacga 3660 aacaaacata tcaaccctaa tgaatggtgg aaagtctatc catcttctgt aacggaattt 3720 aagtttttat ttgtgagtgg tcactttaaa ggaaactaca aagctcagct tacacgatta 3780 aatcatatca ctaattgtaa tggagctgtt cttagtgtag aagagctttt aattggtgga 3840 gaaatgatta aagccggcac attaacctta gaggaagtga gacggaaatt taataacggc 3900 gagataaact ttctcgatta gtagtcaggg ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag 3960 agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 4020 ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 4080 ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 4140 ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 4200 tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg gggtatcccc acgctgcagt 4260 gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga 4320 tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc 4380 cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccaactt 4440 gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 4500 agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 4560 tgtctgtata ccgtcgacct ctagctagag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 4620 tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 4680 taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 4740 cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 4800 gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 4860 ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 4920 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 4980 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 5040 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 5100 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 5160 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta 5220 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 5280 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 5340 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 5400 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 5460 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 5520 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 5580 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 5640 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 5700 ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 5760 tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 5820 atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 5880 tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga tccacgctca ccggctccag atttatcagc 5940 aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 6000 catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 6060 gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 6120 ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 6180 aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 6240 atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 6300 cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 6360 gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 6420 agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 6480 gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 6540 caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 6600 ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 6660 tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 6720 aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtc 6763

Claims (6)

  1. 다음의 단계를 포함하는 마이오스타틴 (myostatin: MSTN) 유전자가 녹아웃된 돼지 세포를 제조하는 방법:
    (a)　다음의 (i) 및 (ii)를 포함하는 재조합 발현 벡터를 돼지 세포 내로도입하는 단계:
    (i) 돼지의 마이오스타틴 유전자 중의 서열목록 제1 서열에 결합하여 절단하는 활성을 가지고 TALE(Transcription Activator Like Effector) 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 (ii) 상기 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되어 있는(operatively linked) 전사조절서열;
    (b) 상기 세포 내에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 발현된 TALEN에 의해 마이오스타틴 유전자가 절단되는 단계; 및
    (c) 상기 절단에 의해 마이오스타틴 유전자에 돌연변이가 유발되는 단계..
  2. 제1항의 방법에 의해 제조되고 마이오스타틴 유전자 중의 서열목록 제1 서열에 돌연변이가 발생한, 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 돼지 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포는 돼지 태아 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  4. 다음의 단계를 포함하는 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환 돼지를 제조하는 방법:
    (a)　다음의 (i) 및 (ii)를 포함하는 마이오스타틴 유전자 녹아웃용 재조합 발현 벡터를 돼지의 세포 내로 도입하여 형질전환세포를 제조하는 단계:
    (i) 돼지의 마이오스타틴 유전자 중의 서열목록 제1 서열에 결합하여 절단하는 활성을 가지고 TALE(Transcription Activator Like Effector) 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및
    (ii) 상기 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되어 있는(operatively linked) 전사조절서열;
    (b) 돼지의 난소에서 난자를 채취한 후, 난자에서 핵을 제거하는 단계;
    (c) 상기 단계 (a)의 형질전환세포의 핵을 상기 단계 (b)의 핵이 제거된 난자에 이식하는 체세포 핵이식 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)의 체세포가 핵이식된 세포를 배양한 배아세포를 형질전환을 하고자 하는 동물의 대리모의 수란관에 이식하여 임신시키는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계를 더 포함하는 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환 돼지를 제조하는 방법:
    (e) 제4항의 상기 단계 (d)의 임신이 확정된 대리모에서 태아를 분리하고, 태아에서 마이오스타틴 유전자의 녹아웃 여부를 확인하는 단계;
    (f) 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 태아의 세포의 핵을 제4항의 상기 단계 (b)의 핵이 제거된 난자에 이식하는 체세포 핵이식 단계; 및
    (g) 상기 단계 (f)의 체세포가 핵이식된 세포를 배양한 배아세포를 대리모 동물의 수란관에 이식하여 임신시키는 단계.
  6. 제4항 또는 제5항의 방법에 의해 제조되고, 마이오스타틴 유전자 중의 서열목록 제1 서열에 돌연변이가 발생한, 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 형질전환 돼지.
KR1020170021838A 2014-04-23 2017-02-17 마이오스타틴 유전자를 표적으로 하는 talen 및 이를 이용한 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 동물을 제조하는 방법 KR101748823B1 (ko)

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CN104946654A (zh) * 2015-07-14 2015-09-30 江苏省家禽科学研究所 抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列及其应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101892264A (zh) * 2010-05-28 2010-11-24 吉林大学 肌生成抑制素mstn基因敲除猪的建立
CN102021201A (zh) * 2010-09-06 2011-04-20 南京农业大学 一种肌肉生成抑制素基因敲除猪的制备方法
KR101556359B1 (ko) * 2011-01-03 2015-10-01 주식회사 툴젠 디자인된 tal 이펙터 뉴클레아제를 통한 게놈 엔지니어링
MX363013B (es) * 2011-02-25 2019-03-04 Recombinetics Inc Animales genéticamente modificados y métodos para su obtención.
CN102296073B (zh) * 2011-08-11 2014-04-23 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 锌指核酸酶定点敲除Myostatin基因特异靶位点
CN103088044B (zh) * 2011-11-02 2014-09-03 内蒙古大学 一种敲除牛mstn基因的打靶载体及其应用
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