KR20140143363A - 기질 줄기 세포 - Google Patents

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Abstract

기질 줄기 세포를 인간 골수로부터 예측 가능하게 단리하고 이어서 클론 집단으로 확대하고 배양하여 사용하며, 상기 단리는 세포 표면 마커의 발현에 근거하고, 여기에서 상기 세포 표면 마커는 항체와 결합하고 상기 항체는 마우스 기질 줄기 세포 또는 래트 기질 줄기 세포상에서, 및 임의로 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종들의 세포상에서 또한 발견되는 세포 표면 마커와 교차 반응한다. 유용한 기질 줄기 세포 집단은 SDC2에 대해 양성이다.

Description

기질 줄기 세포{STROMAL STEM CELLS}
본 발명은 줄기 세포의 단리 방법, 상기 단리된 세포로부터 수득된 줄기 세포 집단, 및 상기 집단 및 이로부터 유래된 세포 및 조직의 용도에 관한 것이다.
1960년대에서 70년대에, 프리덴스타인(Fridenstein)과 동료들은 골형성능(골수(BM) 세포의 이소이식에 의해 밝혀졌다)이 BM-단핵세포(MNC)의 소부분 모집단과 관련됨을 입증하였다(문헌[Friedenstein, 1990]에서 검토되었다). 이들 MNC는 플라스틱 조직 배양 용기에 대한 그들의 빠른 부착 및 배양물에서의 그들 자손의 섬유아세포-형 외관(이는 BM의 기질 구획으로부터의 기원을 암시한다)에 의해 대부분의 조혈 MNC와 구별될 수 있었다. 프리덴스타인, 오웬(Owen) 및 동료들은 공급원으로서 BM 기질을 확립시키는 것뿐만 아니라, 클론 밀도로 BM 세포 현탁액의 시딩이, 단세포에 의해 개시되는 분리된 콜로니들의 확립을 발생시킴을 보임으로써(콜로니-형성 단위 섬유아세포성, CFU-F, 문헌[Friedenstein et al., 1970]) 제 2의 획기적인 약진을 제공하였다.
프리덴스타인과 오웬은 나중에 이를 CFU-F 생성 세포 기질 줄기 세포(SSC)라 칭하였으며(문헌[Owen and Friedenstein, 1988]), 본 발명에서 SSC에 대한 언급은 상기 기원 세포 정의를 기본으로 한다.
BM-유래된 SSC는, 뼈, 지방 또는 연골을 생성시키고 효능 있는 면역조절 및 혈관형성 단백질을 분비하는 플라스틱-부착성(PA), 섬유아세포성 MNC의 혼합된 집단에서 확인될 수 있다. 전임상 연구들은 PA-SSC가 생체내에서 효능 있는 면역조절 및 혈관형성 반응을 매개함을 입증한다. 현재, 임상 시험은 40 개의 다른 퇴행성, 자가면역 및 허혈성 질병들에서 PA-SSC를 시험 중에 있다.
인간 골수에서, 매 80,000 개의 MNC 중 대략 하나의 BM 단핵세포(MNC)가 CFU-F 형성 SSC이다. 지금까지, BM으로부터 상기 SSC를 단리하는 가장 간단하고 빈번히 사용되는 방법은 앞서 나타낸 조직 배양 플라스틱에 대한 부착에 의존하며, 상기 방법에 따르면 상기 MNC를 10 내지 14일 동안 방치하여 배양하고 중간 시기에 CFU-F가 부착하여 1:80000의 인정된 빈도로 콜로니를 형성할 것이다. 10 내지 14일째에 이들 CFU-F를 트립신 절단 (trypsin digest)에 의해 수확하고 혈청-풍부 배지에 3 내지 8000 CFU-F/㎠의 밀도로 재도말한다. 이어서 상기 CFU-F를 생화학적 및 세포학적 평가를 허용하기에 충분한 세포수가 획득될 때까지 시험관내에서 번식시킨다. 이러한 접근법은 널리 사용되지만, 도말된 단지 1:80,000 BMMNC만이 SSC이므로 임상용으로 SSC를 한정하거나 정제하기에는 부적합한 것으로서 간주되며, 상기 방법은 관련된 제품의 임상적 승인에 필요한 양호한 제조 프로토콜에 부합하지 않을 것이다.
따라서, 종래 기술에서는, 줄기 세포 집단을 플라스틱 표면에 부착하는 초기 능력을 근거로 확인하였다. 이러한 초기 선별로부터, 세포 집단은 상기 표면상에서 개별적인 콜로니 형성 단위들로부터 클론 집단으로서 수득된다. 이들은 또한 상기 문헌에서 "중간엽 줄기세포"라 표지되었지만, 상기 용어는 비-중간엽 줄기세포도 상기 단리된 세포 내에 포함될 수 있기 때문에 부정확할 수 있다. 공지된 단리 접근법에서, 이러한 공지된 세포 집단은 알칼리 포스파타제(ALP) 및 CD271에 대해 양성인 줄기 세포로부터 유래된다. 그럼에도 불구하고, 임상 용어에서 상기 세포는 본질적으로 확인되지 않는다.
세포 집단은 이들 공지된 단리된 세포로부터, 예를 들어 단일의 단리된 세포로부터의 클론 확대에 의해 제조되며, 이식에 사용된다. 그러나, 상기 결과는 상기 이식된 세포 집단이 때때로 배치마다 다소 상이하고, 예측불가능 요소와 함께 작용한다는 점에서 가변적이다.
종래 기술 세포 집단은 뼈 및 지방 및 연골을 형성하지만, 제한된 조절로, 뼈 또는 연골이 필요한 경우 흔히 지방을 만드는 경향이 있다. 환언하면, 예를 들어 지방을 만드는 세포를 수득하는 것이 바람직한 경우, 상기 지방-생산 세포가 단지 신뢰할 수 없게 수득된다.
중요한 문제는 출발 세포 집단이, 플라스틱에 대한 부착성에 근거한 단리는 세포 유형의 충분히 기술적인 정의가 아니므로, 본질적으로 불명확하다는 것이다. 심지어 예를 들어 상기 언급된 마커(ALP 및 CD271)로 인해 선택되는 경우에조차, 상기 세포 또는 자손에서 상기 마커의 발현은 배양시 빨리 사라지고, 이는 유효하게 불확실한 집단을 남긴다. 상기 세포의 유용한 성질들이 또한 시간이 지남에 따라 감소되거나 사라지며, 이는 불확실한 세포 집단에 의한 또 다른 문제이다.
발명의 목적
본 발명의 종합적인 목적은 적어도 당해 분야에 대한 대안인 기질 줄기 세포 및 이로부터 유래된 세포 집단 및 조직의 단리 방법을 제공하는 것이며, 본 발명의 특정한 실시태양의 목적은 상기 수득된 세포, 또는 예를 들어 상기 수득된 세포를 임상 용도에 보다 적합하게 하는 상기 세포의 성질들의 증가된 신뢰성에 의해 개선된 세포들 및 조직들의 증가된 한정을 통해 개선된 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 다수의 포유동물 종들에서 발현되는 마커 또는 항원의 발현에 근거한, 기질 줄기 세포, 특히 인간 기질 줄기 세포의 예측성(prospective) 단리를 기본으로 한다. 본 발명의 방법 및 세포 집단에서, 세포를 특정한 종간 마커의 발현을 근거로 분류하며, 이를 예측성 단리라 칭하고, 이어서 상기 세포의 배양물을 수득하여 세포의 확인, 즉 클론 확대 가능한 섬유아세포의 콜로니 형성 단위(CFU-F)를 생성시킨다. 이어서 상기 클론 확대 후 수득된 세포 집단은 치료, 이식 및 다른 용도를 위해 제안된다.
따라서, 본 발명은 마커의 발현에 근거한 포유동물 세포의 혼합된 집단으로부터 세포를 단리함을 포함하는 기질 줄기 세포의 단리 방법을 제공하며, 여기에서
상기 마커는 항체에 결합하고, 여기에서
상기 항체는 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종의 세포상에서 발견되는 마커와 교차 반응한다.
본 발명은 마커의 발현에 근거한 포유동물 세포의 혼합된 집단으로부터 세포를 단리함을 포함하는 기질 줄기 세포의 단리 방법을 제공하며, 여기에서 상기 마커는 상기 포유동물 세포에 의해 발현되고, 여기에서 상응하는 마커는 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종의 세포상에서 또한 발현된다.
바람직하게 상기 마커는 인간 기질 줄기 세포 및 마우스 기질 줄기 세포 상에서, 또는 인간 기질 줄기 세포 및 래트 기질 줄기 세포 상에서, 또는 상기 3 개의 세포 모두 상에서 발견된다. 실시태양에서, 상기 마커는 SDC2이다.
보다 특히, 본 발명은 CD45에 대해 음성이고 추가의 세포 표면 마커에 대해 양성인, 인간 골수로부터의 세포의 단리를 포함하는 인간 기질 줄기 세포의 단리 방법을 제공하며, 여기에서 상기 추가의 세포 표면 마커는 항체와 결합하고 여기에서 상기 항체는 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종의 세포상에서 발견되는 세포 표면 마커와 교차 반응한다. 보다 특히, 본 발명은 FAP 알파에 대해 양성이고 추가의 세포 표면 마커에 대해 양성인, 인간 골수로부터의 세포의 단리를 포함하는 인간 기질 줄기 세포의 단리 방법을 제공하며, 여기에서 상기 추가의 세포 표면 마커는 항체와 결합하고 여기에서 상기 항체는 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종의 세포상에서 발견되는 세포 표면 마커와 교차 반응한다.
바람직하게 상기 추가의 마커는 인간 기질 줄기 세포 및 마우스 기질 줄기 세포상에서, 또는 인간 기질 줄기 세포 및 래트 기질 줄기 세포상에서, 또는 상기 3 개의 세포 모두 상에서 발견된다. 실시태양에서 상기 추가의 마커는 NG2, 또는 특히 SDC2이다.
본 발명에 따른 세포를 단리하고, 상기 단리된 세포로부터 세포의 집단을 유도하는 방법을 포함하는 상기 세포 집단의 수득 방법을 또한 제공하며; 본 발명에 따른 단세포를 단리하고 상기 단세포로부터 세포의 클론 집단을 유도함을 포함하는 상기 세포의 클론 집단의 수득 방법을 제공한다.
상기에 의해 수득된 세포, 따라서 상기 마커가 풍부한 기질 세포, 바람직하게는 기질 줄기 세포의 집단을 본 발명에 의해 또한 제공한다. 풍부는 세포의 30% 이상, 35% 이상, 또는 40% 이상이 상기 마커에 대해 양성일 수 있음이다. 실시태양에서, 상기 마커는 NG2, 또는 특히 SDC2이다.
본 발명의 특정한 세포의 집단을
인간 기질 줄기 세포를 제공하고,
상기 인간 기질 줄기 세포로부터 세포의 클론 집단을 유도하고,
임의로, 상기 세포를 배양물 중에서 추가로 증식 및/또는 확대 및/또는 계대배양함으로써 수득하며, 여기에서 상기 인간 기질 줄기 세포는 골수로부터 단리되고, CD45의 발현에 대해 음성이며 추가의 세포 표면 마커에 대해 양성이고, 여기에서 상기 추가의 세포 표면 마커는 항체와 결합하고 여기에서 상기 항체는 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종의 세포상에서 발견되는 세포 표면 마커와 교차 반응한다.
본 발명의 추가의 특정한 세포의 집단을
인간 기질 줄기 세포를 제공하고,
상기 인간 기질 줄기 세포로부터 세포의 클론 집단을 유도하고,
임의로, 상기 세포를 배양물 중에서 추가로 증식 및/또는 확대 및/또는 계대배양함으로써 수득하며, 여기에서 상기 인간 기질 줄기 세포는 골수로부터 단리되고, FAP 알파의 발현에 대해 양성이며 추가의 세포 표면 마커의 발현에 대해 양성이고, 여기에서 상기 추가의 세포 표면 마커는 항체와 결합하고 여기에서 상기 항체는 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종의 세포상에서 발견되는 세포 표면 마커와 교차 반응한다.
상기 세포로부터의 생성물, 예를 들어 뼈, 연골 힘줄 및 다른 기질 줄기 세포 생성물이, 예를 들어 분석에서 상기 세포의 사용 시, 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명은 특정한 마커 발현을 근거로 목적하는 기질 줄기 세포의 확인을 가능하게 하여, 예측 가능하게 정제되고 한정된 세포 및 이로부터 유래되는 집단을 제공한다.
따라서, 본 발명은 세포 표면 마커의 발현에 근거한 포유동물 세포의 혼합된 집단으로부터 세포를 단리함을 포함하는 기질 줄기 세포의 단리 방법을 제공하며, 여기에서
상기 세포 표면 마커는 항체에 결합하고, 여기에서
상기 항체는 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종의 세포상에서 발견되는 세포 표면 마커와 교차 반응한다.
상기 항체는 인간 세포상의 세포 표면 마커를 인식하여 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상의 세포 표면 마커와 교차 반응한다. 사용 시, 상기와 같은 방법은 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포, 특히 인간 세포의 단리에 적합하다.
상기 항체는 말 세포상의 세포 표면 마커를 인식하여 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상의 세포 표면 마커와 교차 반응한다. 사용 시, 상기와 같은 방법은 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포, 특히 말 세포의 단리에 적합하다.
유사하게, 본 발명은 세포 표면 마커의 발현에 근거한 포유동물 세포의 혼합된 집단으로부터의 세포의 단리를 포함하는, 기질 줄기 세포의 단리 방법을 제공하며, 여기에서 상기 세포 표면 마커는 상기 포유동물 세포에 의해 발현되고, 여기에서 상응하는 세포 표면 마커는 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종들의 세포상에서 또한 발현된다.
상기 마커는 인간 세포상에서 발현될 수 있고 상기 상응하는 마커는 예를 들어 인간 세포의 단리를 위해서 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상에서 발현될 수 있다. 상기 항체는 말 세포상에서 발현될 수 있고 상기 상응하는 마커는 예를 들어 말 세포의 단리를 위해서 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상에서 발현될 수 있다. 마커는, 항체가 인간 세포상의 마커에 대한 결합을 근거로 인간 세포를 분류하는데 사용될 수 있고 상기 동일한 항체를 또 다른 포유동물 종의 세포를 분류하는데 사용할 수 있는 경우 상응하는 마커이다.
따라서 본 발명의 예측성 기질 줄기 세포 단리는, 공통의 항체에 대한 상이한 포유동물 종들 중의 마커의 결합을 지칭하는, 종들 전체에서 발견되는 마커를 사용한다. 하기에 개시되는 특정한 실시태양에서, 인간 SDC2에 대한 항체는 인간 기질 줄기 세포에 결합하여 상기 세포를 단리하는데 사용될 수 있으며 또한 마우스, 래트, 말 및 토끼 중의 기질 줄기 세포에 결합하여 상기 세포들을 단리하는데 사용될 수 있다.
상기 항체는 3 개 이상의 포유동물 종, 4 개 이상 또는 5 개 이상의 종들의 세포상의 마커에 결합하거나 상기 마커와 교차 반응할 수 있다.
별도로, 본 발명은 예를 들어 인간 기질 줄기 세포의 단리를 위해, 인간, 및 마우스, 래트, 토끼, 말 및 돼지 세포 중 하나 이상의 다른 세포에서 유사하게 발현되는 마커의 발현에 근거한 세포의 예측성 단리를 포함하는 기질 줄기 세포 집단을 수득하거나 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시태양에서, 기질 줄기 세포를 적어도 인간 및 마우스 기질 줄기 세포에서, 적어도 인간 및 래트 기질 줄기 세포에서 또는 적어도 인간, 마우스 및 래트 기질 줄기 세포에서 발현되는 마커의 발현에 따라 단리한다. 따라서, 예를 들어 SDC2에 대한 항체를 사용하여 인간, 마우스, 토끼, 말 및 래트에서 기질 줄기 세포의 상응하는 집단을 단리할 수 있다. NG2 및 FAP 알파에 대한 다른 공지된 항체(이에 대한 상세한 내용은 하기에 있다)를 사용하여 인간, 마우스 및 래트에서 기질 줄기 세포의 상응하는 집단을 단리할 수 있다. 따라서 상응하는 기질 줄기 세포 집단 및 그의 유도체를 2 개의 종 모두 또는 3 개의 종 모두로부터, 병행하여 또는 비교를 위해서 또는 또 다른 기질 줄기 세포상에서 수행하기 전에 하나의 종의 기질 세포의 분석을 수행하기 위해서 수득할 수 있다.
상기 줄기 세포를 단리하기 위해 출발 세포의 다양한 공급원들이 적합하다. 포유동물 세포의 혼합된 집단인 공급원은 골수, 지방조직, 골격근, 자궁내막, 태반, 탯줄, 제대혈, 및 바르톤젤리일 수 있다. 인간, 마우스, 래트, 토끼, 말 및 돼지 세포의 공급원을 사용할 수 있으며, 특정한 실시예에서 인간 세포가 사용되었다. 실시예에 사용된 하나의 공급원은 골수이며, 특히 바람직한 공급원은 인간 골수이다. 또 다른 공급원은 인간 다능성 (pluripotent) 세포로부터 유래된 세포, 예를 들어 SSC이다. 일례로, hES 세포로부터의 인간 SSC가 사용되었다.
본 발명의 용도에서, 오직 제 1 마커, 예를 들어 SDC2 발현만을 근거로 초기 분류를 수행할 수 있다. 상기 방법은 일반적으로 불필요한 세포를 또한 단리하며, 상기 불필요한 세포는 기질 줄기 세포가 아니고 예를 들어 B-세포 또는 T-세포일 수 있는 세포를 의미한다. 그러나, CFU를 단리하는 추가의 단계에 의해, 상기 불필요한 세포들은 콜로니를 형성하지 않으므로 상실될 수 있으며, 따라서 상기 수준의 분류는 오직 상기 목적하는, CFU를 형성할 수 있는 기질 세포만이 클론 집단을 생성시킬 것이므로 허용될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 세포를 2 개의 별도 마커의 발현에 근거하여 단리한다. 상기 세포들의 조합 선택은 양성/양성 세포에 대한 선택일 수 있으며, 이는 세포들이 제 1 마커의 발현에 대해 양성이고 제 2 마커의 발현에 대해 양성인 경우 선택됨을 의미한다. 상기 선택은 또한 양성/음성, 음성/양성 또는 음성/음성에 대한 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 조합 방법, 전형적으로 본 발명의 어딘가에 개시된 임의의 방법의 모든 특징들 중 하나 이상을 겸비하는 방법은 상기 제 1 마커와 상이한 추가의 세포 표면 마커의 발현을 근거로 세포를 단리함을 포함한다. 이를 제 2 마커로서 지칭할 수 있지만, 상기 명명법은 단지 상기 마커들이 서로 상이하고 상기 마커에 따른 선택 또는 단리 시기에 있어서 일시적인 차이를 가리키는 것은 아님을 나타내는 것이다. 상기 마커들에 근거한 선택은 어느 순서든 순차적일 수 있지만, 통상적으로 단일의 분류 또는 단리로 수행되며, 이는 기술적으로 가능한 경우 동시적일 수 있다.
하나의 적합한 제 2 마커는 CD45이다. 적합하게, CD45 음성인 세포가 선택된다. 추가의 적합한 마커는 FAP 알파이며; 적합하게는 상기 FAP 알파 양성 세포가 선택된다. 적합한 제 1 세포 표면 마커는 SDC2 및 NG2를 포함한다.
본 발명의 또 다른 용도에서, 초기 분류를 CD45 발현을 근거로 수행하며, 음성 분획이 선택된다. 별도의 분류를 상기 제 1 마커, 예를 들어 SDC2 발현을 근거로 수행한다. 양성 분획을 취하거나 또는 음성 분획을 취할 수 있다. 실제로, 상기 분류를 일반적으로는 동시에 수행한다. 세포 생육성이 연속 분류에서 대단히 감소할 수 있다.
본 발명의 특정한 방법에서, 상기 제 1 마커에 대해 양성인 세포가 선택되며; 이러한 방법은 골형성 세포 및 혈관형성 세포의 단리에 적합하다.
본 발명의 또 다른 특정한 방법에서, 상기 제 1 마커에 대해 음성인 세포가 선택되며; 이러한 방법은 지방생성 세포의 단리에 적합하다.
인간 기질 줄기 세포의 특정한 단리 방법은, 제 1 마커에 대해 양성이고 CD45에 대해 음성인 인간 골수로부터의 세포의 단리를 포함하며, 여기에서 상기 제 1 마커는 항체와 결합하고 여기에서 상기 항체는 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종들의 세포상에서 발견되는 마커와 교차 반응한다. 상기 제 1 마커는 바람직하게는 SDC2이며 단리는, SDC2와 결합하고 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 모두 상의 상응하는 마커와 교차 반응하는 항체를 사용한다. 상기 제 1 마커는 NG2일 수 있으며 단리는, 인간 NG2와 결합하고 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중 하나 이상의 세포상의 NG2에 상응하는 마커와 교차 반응하는 항체를 사용한다.
조합 마커 분류는 또한 3 개의 상이한 마커에 따른, 예를 들어 제 2 마커 및 이어서 2 개 이상의 제 1 마커에 근거한 분류를 포함할 수 있다. NG2에 의한 분류를 사용하여 SDC2 +ve 집단을 세분할 수 있다.
본 발명의 특정한 단리된 기질 줄기 세포는 하기와 같다:
(i) CD45 -ve, SDC2 +ve
(ii) CD45 -ve, SDC2 -ve
(iii) CD45 -ve, SDC2 +ve, NG2 +ve
(iv) CD45 -ve, SDC2 +ve, NG2 -ve
(v) FAP 알파 +ve, SDC2 +ve
(vi) FAP 알파 +ve, SDC2 -ve
(vii) FAP 알파 +ve, SDC2 +ve, NG2 +ve
(viii) FAP 알파 +ve, SDC2 +ve, NG2 -ve
단리된 세포로부터, 세포 배양물 및 집단을 수득할 수 있다. 이를 단리된 세포(예를 들어 적어도 초기에 CD45 음성 및 SDC2 양성 또는 CD45 음성 및 SDC2 음성인 세포)의 클론 확대 및 이어서 수득된 세포의 계속된 증식 또는 배양에 의해 성취할 수 있다. 상기 계속된 증식 및 배양 및 계대배양에 의해 수득된 세포는 처음에 원래 단리된 세포 또는 세포와 동일한 마커 스펙트럼을 나타내는 경향이 있음에 주목한다. 시간이 지남에 따라 상기 발현 패턴이 변할 수도 있다. 그러나 상기 생성된 집단의 성질들을 상기 초기 단리의 기준(예를 들어 적어도 초기에 CD45 음성 및 SDC2 양성 또는 CD45 음성 및 SDC2 음성인 세포)과 결부시킨다.
단리된 세포로부터, 상기 단리에 사용된 마커 또는 항원의 발현에 의해 측정된 높은 동종성을 갖는 세포 배양물 및 집단을 일반적으로 수득할 수 있다. 따라서, 상기 제 1 세포 표면 마커를 높은 수준으로 발현하는 포유동물 기질 세포 집단들이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 상기 제 1 마커를 발현하는 세포의 %는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다. 하기에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시태양에서, 초기 세포 집단은 상기 제 1 마커를 95% 이상의 수준으로 발현한다. 양성인 세포에 관하여, 상기 세포 표면에서 또는 상기 표면상에서 측정시, 예를 들어 상기 마커에 대해 표지된 항체를 사용하여 검출가능할 때, 양성이라 언급한다.
세포 집단은 또한 예를 들어 배양 및/또는 계대배양에 의해 상기로부터 유도될 수 있으며, 그렇게 함에 있어서 상기 제 1 마커의 발현을 유지하는 세포의 비율이 감소될 수 있지만 그럼에도 불구하고 상기 비율은 상기 마커를 근거로 선택되지 않은 집단에서보다 더 높게 유지된다. 따라서, 높은 수준의 상기 제 1 마커를 발현하는 추가의 포유동물 세포 집단이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 상기 제 1 마커를 발현하는 세포의 %는 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 또는 바로 위에서 인용된 수준일 수 있다. 본 발명의 세포 집단은 명시된 순도를 가지며 한정된다. 상기 세포를 마커 발현을 근거로 확인/선택할 수 있으며, 세포의 충분히 순수한 집단이 수득되는지의 여부를 결정하기 위한 배양의 필요 없이 바로 사용할 수 있다.
본 발명의 특정한 실시태양에서 상기 마커는 NG2 또는 특히 SDC2이다.
따라서, 포유동물 기질 줄기 세포의 집단이 제공되며, 여기에서 상기 세포의 75% 이상은 세포 표면 마커에 대해 양성이고 상응하는 세포 표면 마커는 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종들의 세포상에서 또한 발현된다. 상기 마커는 인간 세포상에서 적합하게 발현되며 상기 상응하는 마커는 마우스 세포상에서 발현되고 임의로 또한 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상에서 발현된다. 상기 마커는 인간 세포상에서 적합하게 발현되며 상기 상응하는 마커는 래트 세포상에서 발현되고 임의로 또한 마우스, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상에서 발현된다. 기질 줄기 세포의 또 다른 예시적인 집단에서, 상기 세포의 75% 이상이 SDC2 양성이며, 상기 세포는 골형성성이다. 더욱이, 상기 세포는 상기 제 2 마커의 발현 수준에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 상기 제 2 마커를 발현하는 세포의 %는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다. 하기에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시태양에서, 초기 세포 집단 중 세포의 95% 이상이 상기 제 2 마커에 대해 양성이다. 상기 세포는 상기 제 2 마커에 대해 별도로 음성일 수도 있다. 상기 제 2 마커를 발현하지 않는 세포의 %는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다. 하기에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시태양에서, 초기 세포 집단 중의 세포의 95% 이상이 상기 제 2 마커에 대해 음성이다. 골형성 및 혈관형성 기질 줄기 세포의 하나의 예시적인 집단에서 상기 세포의 75% 이상은 SDC2 양성이고 상기 세포의 75% 이상은 CD45 음성이다.
낮은 수준의 상기 제 1 마커를 발현하는 세포 집단이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 상기 제 1 마커를 발현하지 않는 세포의 %는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다. 하기에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시태양에서, 초기 세포 집단은 상기 제 1 마커를 5% 이하의 수준으로 발현하거나 또는 상기 제 1 마커에 대해 음성으로서 간주된다. 기질 줄기 세포의 하나의 예시적인 집단에서, 상기 세포의 75% 이상이 SDC2 음성이며, 지방생성 세포이다. 더욱이, 상기 세포는 상기 제 2 마커의 발현 수준에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 상기 제 2 마커를 발현하는 세포의 %는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다. 상기 세포는 상기 제 2 마커에 대해 별도로 음성일 수도 있다. 상기 제 2 마커를 발현하지 않는 세포의 %는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다. 하기에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시태양에서, 초기 세포 집단 중의 세포의 95% 이상이 상기 제 2 마커에 대해 음성이다. 지방생성 기질 줄기 세포의 하나의 예시적인 집단에서 상기 세포의 75% 이상은 SDC2 음성이고 상기 세포의 75% 이상은 CD45 음성이다.
따라서, 본 발명은 또한 상술한 방법에 따라 세포를 단리하고 상기 단리된 세포로부터 세포 집단을 유도함을 포함하는 상기 세포 집단의 수득 방법을 제공하며; 본 발명은 추가로 상기 개시된 방법에 따라 단세포를 단리하고 상기 단세포로부터 세포의 클론 집단을 유도함을 포함하는, 상기 세포의 클론 집단의 수득 방법을 제공한다. 일반적으로, 배양은 세포의 초기 집단을 수득하고 이어서 상기 세포를 배양물에서 추가로 증식 및/또는 확대 및/또는 계대배양함을 포함한다. SDC2는 하기에 개시된 특정 실시예들에서 특성화 마커이다.
하기의 특정 실시예들에 개시된 세포 집단을 수득하고 이들이 유용한 성질들을 나타냄을 발견하였다. 따라서, 더욱 추가로 상기 개시되고 특허청구된 방법에 따라 수득할 수 있는 세포의 집단이 본 발명에 의해 제공된다. 상기 세포 집단은 바람직하게는 인간, 말, 토끼, 마우스 및/또는 래트 세포이다.
특정한 실시태양의 세포 집단을
인간 기질 줄기 세포를 제공하고,
상기 인간 기질 줄기 세포로부터 세포의 클론 집단을 유도하고,
임의로, 상기 세포를 배양물 중에서 추가로 증식 및/또는 확대 및/또는 계대배양함으로써 수득하며, 여기에서 상기 인간 기질 줄기 세포는 골수로부터 단리되고, CD45의 발현에 대해 음성이며 추가의 세포 표면 마커에 대해 양성이고, 여기에서 상기 추가의 세포 표면 마커는 항체와 결합하고 여기에서 상기 항체는 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종의 세포상에서 발견되는 세포 표면 마커와 교차 반응한다.
상기 개시된 방법에 따라 세포를 수득하고 이로부터 조직을 수득함으로써, 본 발명에 의해 조직을 제공한다. 뼈, 연골 및 힘줄 중에서 선택된 조직을 상기 방식으로 수득할 수 있다. 지방 조직 또는 재건술을 위한 조직을 또한 수득할 수 있다.
본 발명의 추가의 용도는 상기 단리된 세포 및 그의 자손을 사용하는 분석에 세포를 제공함에 있다. 따라서, 분석의 수행 방법은 상기 개시된 방법에 따라 세포를 수득하고 상기 분석에 상기 세포를 사용함을 포함한다.
종래 기술의 세포 집단은, 언급된 바와 같이, 뼈 및 지방 및 연골의 형성을 의도하였으나, 제한된 조절을 가지며 따라서 때때로 뼈 또는 연골이 필요한 경우 지방을 만들었다. 본 발명의 세포 집단은 지방을 형성하지 않게 제조될 수 있다. 이는 유리하다. 본 발명의 별도의 세포 집단들은 실제로 지방을 형성하지 않게 제조될 수 있다. 따라서 사용자에게, 특별한 세포 마커 선택 기준을 근거로, 상기 세포의 성질들의 향상된 조절 및 예측성을 제공할 수 있다.
바꿔말하면, 본 발명의 특정한 세포 집단의 이점은, 즉 CD45 음성에 대해서, 골형성성인 경향이 있어서 뼈- 및 연골-생성 세포 집단을 더 높은 빈도로 생성시키는 SCD2 양성세포일 수 있다는 것이다. 이에 의해, 혼합된 결과 및 뼈 및 연골의 낮은 재현성의 종래 기술의 어려움을 해결할 수 있다. 본 발명에 이르러 수득할 수 있는 특정한 세포 집단들은 추가의 이점을 가질 수 있다; 예를 들어 SDC2 양성 집단은 보다 혈관형성성이어서 이웃하는 세포들이 맥관구조를 형성하도록 유도하는 것으로 보인다. 이는 개선된 맥관구조가 이로울 수 있는 질병, 예를 들어 허혈성 질병의 치료에 유리하다.
또한, SDC2 양성 집단은 본 발명의 특정한 방법에서 세포 및 자손에서 존속되는 마커를 참조함으로써, 종래 기술에서보다 더 고도로 한정된 출발 세포로부터 유도된다. 본질적으로, 이는 유리하다. 상기 세포 집단은 허용 가능하게 한정된 집단이다.
본 발명의 추가의 잠재적인 이점은 초기 세포 집단의 예측성 단리에 사용되는 마커가 다른 종들에서의 세포 집단의 예측성 단리에 또한 유용하다는 것이다. 따라서, 특정한 실시태양에서, SDC2는 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 모두에 걸쳐 공통적이다. 결과적으로, 말하자면 마우스 세포에서 상응하는 집단을 단리하고 마우스 세포 상에서의 작용으로부터 인간세포 상에서의 작용을 추정하는 것이 가능하다. 상기 마우스에서 한정된 집단을 사용하여 데이터를 획득하고, 이어서 이를 또 다른 종, 특히 인간 세포의 상응하는 한정된 집단에 받아들일 수 있다. 종래 기술의 중간엽 줄기 세포 집단, 즉 공지된 예측성 단리를 사용하여 획득된 집단에 대해 사실인 것으로 여겨지는 문제점은, 단리에 사용된 마커, 말하자면 마우스 세포에 대한 마커가 인간 세포에서 상응하는 발현 패턴을 갖지 않는다는 것이다. 따라서 본 발명은 한정된 세포 집단을 종간 대등한 집단들, 예를 들어 마우스 및 인간 또는 마우스 및 말 등에 제공할 수 있다. 이는 초기에 하나의 종의 세포상에서 수행된 실험들로부터 획득된 지식을 또 다른 종의 상응하는 한정된 세포 집단에 대한 나중의 연구로 이전할 수 있기 때문에 전임상 및 임상 연구를 용이하게 한다.
본 발명의 세포 및 조직, 및 상기 세포 및 조직을 포함하는 조성물을 사용하여 다양한 포유동물 상태 및 질병, 예를 들어 특히 기존의 SSC 생성물로부터 유래되는 세포 및 생성물을 사용하여 치료할 수 있는 상태 및 질병들을 치료할 수 있다. 상기 세포 및 조직은 수지상 세포와 상호작용할 수 있으며 IFN-β 분비를 유도할 수 있고, 따라서 종양 억제인자로서 사용될 수 있다. 일반적으로 암, 구체적으로 간세포 암종, 경부암, 췌장암, 전립선암, 섬유육종, 수질모세포종 및 성상세포종을 본 발명을 사용하여 치료할 수 있다. 폐 질병, 예를 들어 급성 폐손상(ALI); 급성 호흡곤란 증후군(ARDS); 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD); 특발성 폐 섬유증(IPF)을 치료할 수 있다. 상기 세포 및 조직을 사용하여 패혈증 및 폐혈증 유발된 다기관 부전, 골수 이식편(BMT) 또는 조혈성 줄기 세포(HSC) 거부; 고형 기관 이식편(SOT) 거부(간, 신장, 피부, 각막, 심장, 폐 포함); 급성 독소-유발된 간부전; 자가면역 간염; 원발성 담즙성 간경변증(PBC) 및 원발성 경화성 담관염(PSC); 골괴사; 퇴행성 디스크 질병; 류마티스성 관절염; 골관절염 및 당뇨병 환자의 지연된 골 치유; 베게너 육아종증(WG)을 포함한 자가면역 신장염; 화상, 중증 화상; 근위축 상태 및 근육감소증을 포함한 위축성 증후군; 악액질 및 근위축증(뒤시엔느 및 베커)을 포함한 다른 근위축 상태; 울혈성 심부전, 급성 심근 경색 및 뇌졸중; 1형 당뇨병; 2형 당뇨병; 당뇨성 망막병증 및 다른 망막병증; 당뇨성 신장병증 및 다른 신장병증; 당뇨성 신경병증 및 다른 신경병증; 비-치유성 당뇨성 궤양; 당뇨성 심근병증 및 다른 근육병증; 죽상경화증; 말초 동맥 질병 및 중증하지허혈; 포도막염; (습성 또는 건성) 급성 황반 변성(AMD); 망막 및 각막 손상; 자가면역 상태, 예를 들어 자가면역 위염(AIG); 이식편대 숙주병(GvHD); 다발성 경화증 및 탈수초성 질병; 갑상선 질병; 크론병, 궤양성 대장염 및 누공 크론병을 포함한 염증성 장 질병; 경피증; 루푸스(SLE); 그레이브스병; 및 자가면역 림프증식성 질병(ALPS)을 치료할 수 있다.
상기 세포 및 조직을 또한 제엽염, 힘줄 손상 및 운동 유발된 폐 출혈(EIPH)(또한 "출혈" 또는 "출혈성 발작"으로서 공지됨)를 포함한 특정한 다양한 말 상태들을 치료하는데 사용할 수도 있다.
본 발명은 또한 동물, 특히 포유동물 및 예를 들어 인간 또는 말의 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 적합하게는 본 발명의 세포 또는 조직을 상기 동물에서 상기 질병 또는 장애를 치료하기에 유효한 양으로 포함한다. 따라서 상기 세포를 허용 가능한 약학 담체와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포를 약학적으로 허용 가능한 주사용 액체 매질 중의 세포 현탁액으로서 투여할 수 있다. 액체 매질의 예는, 추가적인 물질, 예를 들어 다이메틸설폭사이드(DMSO) 및 인간 혈청 알부민을 또한 임의로 함유하는 염수, 포스페이트 완충된 염수이다. 상기 세포 및 조직을 일반적으로는 기존의 중간엽 줄기 세포 및 이로부터 유도되는 유사한 생성물 및 조직에 대해 공지된 바와 같은 다양한 포맷으로 투여할 수 있다. 상기 세포 및 조직을 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입 또는 직접 주사에 의해 투여할 수 있다. 상기 조성물은 매트릭스 또는 스캐폴드를 포함하거나, 또는 세포 또는 조직을, 원 위치에 이미 매트릭스 또는 스캐폴드를 포함하는 부위 내에 주사함으로써 투여할 수도 있다. 따라서 상기 세포 또는 조직을 히아루론산, 콜라겐 또는 다른 세포외 매트릭스와 함께 투여할 수도 있다. 본 발명의 세포 및 조직에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용할 수 있는 추가의 제형 및 투여 실시예들을 당해 분야에서, 예를 들어 WO2001080865, EP2545928 및 WO1999061587에서 찾을 수 있다. 동물에게 본 발명의 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 동물의 치료 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 세포 또는 조직을 동물의 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위해 제공한다. 상기 방법 및 용도의 실시태양은 일반적으로 본 발명에 개시된 바와 같은 발명의 실시태양들을 포함한다.
확인된 마커들에 근거한 분류 및 단리를 수행하기에 적합한 항체들은 숙련가들에게 입수 가능하다. 인간 NG2/MCSP 항체를 단클론 마우스 IgG1 클론#7.1, 카탈로그 번호: MAB25851로서 R&D 시스템스 인코포레이티드(R&D Systems, Inc.)(614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA)로부터 입수할 수 있다. 마우스, 래트, 인간, 말, 개, 소 및 돼지와 반응성인 NG2(G-20) 항체를 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)(2145 Delaware Avenue, Santa Cruz, California , 5060, USA)(ref: sc-30923)로부터 입수할 수 있고; 차단 펩타이드, sc30923 P를 또한 입수할 수 있다. 인간 섬유아세포 활성화 단백질 α/FAP 항체, 카탈로그 번호: AF3715를 R&D 시스템스 인코포레이티드로부터 입수할 수 있다. 적어도 인간, 래트 및 마우스 및 또한 말, 개, 소, 돼지 및 조류와 반응성인 FAP알파(Y-16) 항체를 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드로부터 입수할 수 있다. 적어도 마우스, 래트 및 인간과 반응성인 항-섬유아세포 활성화 단백질, 알파 항체, ab28243을 애브캠(Abcam)(330 Cambridge Science Park, Cambridge, CB4 0FL, UK)으로부터 입수할 수 있다. 적어도 인간, 마우스 및 래트와 반응성인 신데칸 2 항체(Syndecan 2 antibody), orb13481을 바이올비트 리미티드(Biorbyt Ltd.)(12 Pembroke Avenue, Denny Industrial Centre, Waterbeach, Cambridge, CB25 9QR, UK)로부터 입수할 수 있다. 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지와 반응성인, 특정 실시예에 사용되는 SDC2 항체, 카탈로그 번호: MAB29651(클론 305507)을 R&D 시스템스 인코포레이티드로부터 입수할 수 있다.
SDC2(또한 피브로글리칸이라 칭하며 현재 CD362)는 처음에, 폐에서 발현되는 주요 헤파린 설페이트(HS) 글리코스아미노글리칸(GAG)-함유 세포 표면 단백질들 중 하나로서 생화학적으로 특성화되었다. SDC2는 척추동물 중의 상기 단일-통과 막관통 계열의 4 개의 일원 중 하나이다. 따라서 "S2" 및 "SDC2"에 대한 언급은 SDC2를 지칭한다.
[도면의 간단한 설명]
이제 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 특정한 실시태양들에서 개시하며, 도면에서:
도 1은 인간 기질 줄기 세포이나 인간 폐 섬유아세포는 아닌 세포의 항-SDC2 항체의 표지화를 도시한다. 녹색선은 세포의 항-SDC2-APC 염색을 가리킨다. 적색선은 적합한 대조용 항체(래트 IgG2B 아이소타입 대조용-APC; R&D # IC013A; 클론 - 141945)에 의한 표지화를 가리킨다. 청색선은 항-PDGFRa-APC 항체(R&D 시스템스 # FAB1264A; 클론 - PRa292)에 의한 MRC5의 양성 대조용 표지화를 가리킨다;
도 2는 CD271bright/DC45low 인간 골수 단핵세포의 SDC2-APC 항체에 의한 표지화를 도시한다. 데이터는 상기 언급된 SDC2-APC, CD271-PE 및 CD45-FITC(모두 BD로부터)로 염색된 3.5 x 107 BMMNC의 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 프로파일을 도시한다. CD45-FITC 염색은 3 개의 집단, (A) CD45-ve - BLUE, (B) CD45low - ORANGE, 및 (C) CD45high - GREEN 내로의 BMMNC의 입장을 허용하였다. (B)에서 드문 TP SDC+ve/CD271bright/CD45low 세포는 BLUE이다;
도 3은 SDC+/CD271bright/DC45low 분류된 골수 단핵세포 중의 CFU-F의 증대된 농축을 도시한다. 데이터는 상기 언급한 SDC2-APC, CD271-PE 및 CD45-FITC(모두 BD로부터)로 염색된 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 프로파일 107 BMMNC를 도시한다;
도 4는 세포당 SDC+/CD271bright/DC45- 단핵세포의 수의 함수로서, 96 웰 플레이트 중 클론이 형성되지 않은 웰의 백분율을 도시한다;
도 5는 클론들의 집단 배가의 수를 도시한다;
도 6은 2% 및 19% 산소 분압에서 SDC2+ 기질 줄기 세포의 시험관내 GAG 침착을 도시한다. SDC2+SSC 유도된 미세질량 펠릿으로부터의 전형적인 사프라닌-O 염색된 조직 단편들을 도시한다;
도 7은 SDC2+ 및 SDC2-(각각 S2+ 및 S2-로서 표지된다) 기질 줄기 세포의 시험관내 지질 침착을 도시한다;
도 8은 시험관내 골형성 자극에 반응하는 SDC2+ 및 SDC2- 기질 줄기 세포의 칼슘 침착을 도시한다;
도 9는 시험관내 연골형성 자극에 반응하는 SDC2+ 및 SDC2- 기질 줄기 세포의 GAG 침착을 도시한다;
도 10은 시험관내 혈관형성 자극에 반응하는 SDC2+ 및 SDC2- 기질 줄기 세포의 상대적인 HUVEC 코드 형성을 도시한다;
도 11은 드문 CD45-/SDC+ 인간 골수 단핵 세포가 기질 줄기 세포 마커 CD271, CD146 및 NG2를 발현함을 도시한다;
도 12는 토끼 골수로부터 단리된 기질 줄기 세포의 SDC2 발현을 도시한다;
도 13은 융합 (confluence)시 말 골수로부터 유래된 기질 줄기 세포 중의 증가하는 수준의 SDC2, 및 돼지 골수로부터 유래된 기질 줄기 세포가 낮은 산소 분압에서 SDC2를 발현함을 도시한다;
도 14는 융합 시 3 개 계통의 래트 골수로부터 유래된 기질 줄기 세포에서 증가하는 수준의 SDC2를 도시한다;
도 15는 SCD2 및 Scal에 대한 공-염색에 의한 CD45- 단핵세포의 FACS 단리를 도시한다;
도 16은 SDC+/Scal 선택된 마우스 단핵 세포 중의 CFU-F의 증대된 농축을 도시한다.
우리는 SDC2 단백질의 발현이 대조용 인간 태아 폐 섬유아세포 세포주, MRC5에 비해 인간 SSC의 세포 표면상에 풍부한 지를 가리키기 위해서 알로피코시아닌(APC) 형광색소(R&D 시스템스 번호 FAB2965A; 클론 305515)에 접합된 인간 SDC2에 대한 래트IgG2B 단클론 항체를 사용하였다. SSC 생육 배지(aMEM/10% PAA FSC; NUNC T175 플라스크)에서 배양된 MRC5 폐 섬유아세포는 SDC2를 발현하지 않았다(도 1). 대조용으로서, 우리는 MRC5 섬유아세포가 PDGFRa 마커(CD140a-APC)를 발현함을 보인다. 이러한 데이터는 SDC2 단백질의 발현이 대조용 폐 섬유아세포에 비해 인간 SSC의 표면상에 풍부함을 암시한다(도 1).
이때에, BM으로부터 SSC의 항체-기재 정제의 최첨단 기술은 리즈 대학(맥고나글(McGonagle)과 존스(Jones) 박사)에 의해 보고된 항-CD271(LNGFR) 및 항-CD45 항체의 조합을 사용하는 것으로 이루어진다. 상기 CD45low/CD271bright 세포의 단리는 모든 CFU-F(SSC)를 포획하는 것으로 나타났다.
그러나, CD271 'bright' 세포의 정의를 실험실마다 표준화하는 것은 어려울 수 있다. 상기 항-SDC2 항체가 CD45low/CD271bright BMMNC를 공-염색하는지의 여부를 조사하기 위해서 30 ㎖의 인간 BM이 골웨이(Galway) 대학병원(GUH)의 임상 연구 시설에서 루쓰 모렐(Ruth Morrell) 박사에 의해 공여체 CRFG#0007로부터 흡출 (aspirate)되었다.
BMMNC(5 x 108)를 피콜 원심분리에 의해 단리하고, PBS에서 세척하고, MACS 완충제 중에 재현탁하고, 인간 FC-블록(Miltenyi, UK)으로 차단하였다. BMMNC(4 x 107)를 항-SDC2-APC(R&D), 항-CD271-PE(BD) 항-CD45-FITC(BD) 및 사이톡스(Sytox)/DAPI 생육성 염료로 염색하였다. 세포들을 NUI 골웨이의 벡톤 디킨슨 아리알(Becton Dickinson Ariall)에서 FACS에 의해 분석하였다.
도 2는 SDC2/CD271/CD45 삼중 염색된 세포측정 실험으로부터의 전형적인 막대그래프/점 플롯을 가리킨다. 도 2B는 낮은/중간 수준의 CD45 마커(오렌지색)를 발현하는 BMMNC를 가리킨다. 다른 보고서들과 일치되게, 우리는 CD271-양성 세포가 CD45low 집단 내에서 발견됨(도 2B)을 발견하고, 이들 실험에서, 우리는 상기 항-SDC2-APC 항체가 CD45low/CD271 양성 세포를 표지함을 주목하였다. 구체적으로, 상기 항-SDC2-APC 항체는 CD45low/CD172bright BMMNC를 표지한다. 상기 SDC2+/CD45low/CD271+ 삼중 양성(TP) 집단은 BMMNC 내에 1:16,000 내지 1:23,000 범위의 빈도로 드물다.
도 3은 SDC2+/CD271+/CD45- MNC 분획이 고유의 분류-전 BMMNC에 비해 3000 배 더 많은 CFU-F/SSC를 함유함을 도시한다. 환언하면 상기 CD271+ 집단의 SDC2-음성 분획은 유의적인 수 (significant number)의 CFU-F/SSC를 보유하지 않는다.
단세포 FACS 분류 실험을 수행하여 상기 SDC2+/CD271+ 집단 내 증식성 세포의 수를 세었다. 단일 SDC2+/CD271+/CD45- MNC를 96 웰 플레이트에서 웰당 1, 3 및 20 세포로 분류하였다. 제한 희석 분석은 웰당 1 세포로, 96 웰 플레이트당 16 내지 17 개의 클론이 형성되었음을 보인다(도 4). 16 개의 클론은 모두 증식성이었으며 15 내지 20 회의 집단 배가를 겪을 수 있었다(도 5). 현저하게도, 선택된 SDC2+ 클론들은 시험관내 미세질량 배양에 반응하여 현저한 연골형성을 겪을 수 있었다. 5 개의 클론은 모두 낮은(2%) 산소 분압에서 배양시 증대된 글리코스아미노글리칸(GAG) 침착을 나타내었다(도 6).
분류-전(모) SSC에 비해, FACS-분류된 및 배양 확대된 SDC2+SSC는, 오일 레드 O 염색에 의한 가시화, 추출 및 정량분석시, 14일의 분화 섭생 동안 효능 있는 지방생성 배지에 의한 시험관내 자극에 반응하여 현저하게 약화된 지질 침착을 나타낸다. 환원하면, SDC2-SSC 및 분류-전 SSC에 비해, SDC2+ SSC는 각각 칼슘 추출 및 알리자린 레드(Alizarin Red) S 염색에 의해 측정시, 골형성 배지에 의한 14일 유도에 반응하여 칼슘의 증대된 침착 및 증대된 매트릭스 무기질화를 유도한다(도 8). 현저하게도, 연골형성 미세질량 배양 수행 시 상기 3 개의 SSC 집단간에는 차이가 관찰되지 않았다(도 9).
인간 혈관 내피세포(HUVEC)는 영양소-풍부 매트리젤상에서 도말되는 24 시간 이내에 혈관형성 코드-형 세관들을 형성할 수 있다. 매트리젤상에서 HUVEC와 1:1 비로 SDC2+ SSC를 공-배양하면 24 시간째에 안정한 미세혈관 수의 3 배 증가가 유도된다(도 10).
최종적으로, 인간 SDC2+/CD45- MNC는 CD146, NG2(CSPG4) 및 CD271을 포함하여 핵심 기질 마커들을 또한 발현한다(도 11).
도 12는 염소의 BM 및 지방 MNC 및 토끼 BM 조직으로부터 유래된 SSC의 유식세포측정 막대그래프를 나타낸다. 상기 SDC2 마커는 염소 SSC상에서 검출가능한 것으로 보이지 않는 반면, 토끼 SSC상에서는 현저한 수준의 SCD2 단백질을 검출할 수 있다(도 12).
SDC2 단백질의 증가된 검출은 융합된 배양물에 반응하여, 배양된 말 SSC에서 증가된다(도 13). SDC2 단백질이 또한 저 산소 분압에서 배양 시 돼지 SSC의 부분 모집단에서 검출될 수 있다(도 13).
SDC2 마커가 래트 SSC의 표면상에서 발현된다(도 14). 말 SSC에서 보이는 바와 같이, SDC2 단백질은 융합에 반응하여 래트 SSC의 표면에서 증가한다. 이러한 패턴은 3 개의 전형적으로 사용되는 실험용 래트의 계통, 즉 다크 아구티, 스프래그 다우리 및 루이스의 골수로부터 유래된 SSC에서 볼 수 있다(도 14).
실시예
실시예 1.1 - 골수 흡출물의 단리
인간 골수 샘플을 환자의 서면 승낙에 따라 건강한 자원자(n=3)의 뒤엉덩이뼈 능선으로부터 수득하였다. 환자는 EU 조직 지령 2006/17/EC 요구에 따라 HIV I 및 II, Hep A/C, HBsAg, 항-HB 코어, Syphilis 및 CMV에 대한 바이러스 검사를 수행하였다. BSC에서, 샘플을 모으고 7.5 ㎖ 분액으로 나누어 밀도-구배 원심분리를 수행하였다.
실시예 1.2 - 밀도-구배 원심분리(피콜)에 의한 인간 SSC의 단리 및 확대
무균 기법 하에 생물학적으로 안전한 캐비넷에서, 7.5 ㎖의 피콜을 50 ㎖ 원심분리 튜브에 피펫팅한다. 응고물을 제거하기 위해서, 30 ㎖의 BM을 100 마이크론 세포 체(BD 팔콘(Falcon))를 통해 50 ㎖ 원심분리 튜브내로 여과하였다. 여과된 골수를 D-PBS에서 1/1 희석하고 이어서 피콜을 함유하는 4 개의 튜브에 고르게 분할하고, 상기 BM을, 피콜을 휘젓거나 기포가 발생하게 하지 않으면서 BM의 느린 방출을 보장하도록 35 내지 45°의 각으로 놓인 상기 튜브의 측면상에 느리게 피펫팅한다. 이어서 튜브를, 원심분리 중단을 0으로 설정하여 900 g에서 22 분간 원심분리시켜 분별된 샘플을 형성시켰다. 원심분리 후에, 튜브 내용물은 3 개의 층을 형성하였다; 상부 혈장층, 박층-버피 코트-는 MNC를 함유한다, 투명한 피콜층 및 적혈구 구성성분들 - 적혈구 및 과립구를 함유하는 기부층. 상기 버피 코트를, 주변 세포를 방해하지 않도록 조심하면서, 조심스럽게 흡출하였다. 이어서 상기 세포를 또 다른 50 ㎖ 원심분리 튜브로 옮기고 45 ㎖ D-PBS에 재현탁하였다. 이어서 상기 튜브를 350 g에서 10 분간 원심분리하였다. 상등액을 흡출하고 펠릿을 5 ㎖ 완전 배지에 재현탁하였다. 이어서 상기를 350 g에서 10 분간 원심분리하였다. 상등액을 흡출하고 펠릿을 5 ㎖ D-PBS에 모았다.
실시예 1.3 - CFU-F 플레이트 시딩
직접 도말 또는 피콜을 통한 단핵세포의 단리 후에, 9 x 106 세포를 상기 두 세포 세트로부터 단리하고 10 ㎝ 디쉬에 3 x 106 MNC/플레이트의 시딩 밀도로 3 회 중복하여 시딩하였다. 상기 세포를 세척하고 동시에 상기에 개략한 바와 같이 배양물 중의 세포로서 공급하였다.
실시예 1.4 - 크리스탈 바이올렛 CFU-F 염색
12 내지 14일째에, 세포를 고정시키고 CFU-F 분석을 위해 염색하였다. 배지를 플레이트로부터 흡출하고 플레이트를 D-PBS에서 3 회 세척하여 남은 배지를 제거하였다. 세포를, -20 ℃에서 보관된 8 ㎖의 95% 메탄올을 10 분간 세포 상에 피펫팅하고 서서히 저어서 고정시켰다. 메탄올을 플레이트로부터 흡출하고 세포를 D-PBS로 1 회 세척하였다. 이어서 8 ㎖의 크리스탈 바이올렛(0.5% 크리스탈 바이올렛, 95.5% 메탄올)을 플레이트에 가하고 플레이트를 서서히 저었다. 플레이트를 10 내지 15 분간 방치하였다. 과잉의 크리스탈 바이올렛을 흡출하고 세포를 D-PBS로 3 회 세척하여 남은 과잉의 착색제를 제거하였다. 이어서 플레이트를 뒤집어 밤새 방치하여 건조시켰다. 이어서 건조한 플레이트를 평판 스캐너를 사용하여 이미지화하였다. 이어서 콜로니를 카운트하고 도립 광현미경(올림푸스(Olympus) CKx41) 하에서 육안 검사에 의해 특성화하였다. 50+ 초과의 클러스터들로 구성된 콜로니들을 CFU로서 카운트하였다.
실시예 2 - 단핵세포 및 기질 줄기 세포의 항체 분석
표 1은 실시예 1에서 생성된 단핵 세포 및 기질 줄기 세포의 프로파일에 사용되는 항체들의 상세한 내용을 나타낸다.
항체 공급처 카탈로그 번호
CD362/시데칸(Sydecan)-2 R&D 시스템스 N/A
CD271/LNGFR BD N/A
W8B2/TNAP/ALP 밀테니(Miltenyi) N/A
TWEAK/TNFSF13 BD N/A
APRIL/CD256 BD N/A
CD146 BD N/A
CD105 인비트로젠(Invitrogen) MHCD10504
CD73 BD 550257
CD90 BD 555596
CD14 AbD 세로텍(Serotec) SFL2185
CD19 BD 345777
CD3 BD 345765
CD34 BD 555822
CD45 BD 555483
Γ1, γ2a 대조군 BD 342409
HLA-DR 인비트로젠 MHLDR04
Γ2b 대조군 칼택(Caltag) MG2b04
차단 용액 제조
차단 용액을, 50 ㎖ 튜브 중에서 49 ㎖의 D-PBS에 1 ㎖의 FBS를 가하여 제조하였다.
샘플 제조
세포를 37 ℃에서 트립신 처리하고 15 ㎖ 튜브 중의 배양 배지로 옮겼다. 세포를 400 g에서 5 분간 원심분리시켰다. 상등액을 흡출하고 세포를 5 ㎖ 완전 배양 배지에 재현탁하였다. 세포 카운트 및 생육성 시험을 트립판 블루(Trypan blue)를 사용하여 수행하였다. 이어서 세포를 400 g에서 5 분간 원심분리하고 상등액을 흡출하였다. 이어서 차단 용액을 세포 펠릿에 가하여 세포를 1 x 106 세포/㎖로 재현탁하였다.
SSC의 염색(FACS 칸토 상에서의 분석)
PE-표지된 항체를 냉장고에서 꺼내어 96 웰 환저 플레이트(사르스테트(Sarstedt)) 및 차단 용액과 함께 얼음상에 놓았다. 1 x 105 세포(100 ㎕)를 상기 얼음상의 96 웰 플레이트 중 12 개 웰 각각에 피펫팅하였다(각 항체에 대해 하나 및 염색되지 않은 세포에 대해 1). 이어서 플레이트를 400 g, 4 ℃에서 4 분간 원심분리시켰다. 상등액을, 세포 펠릿을 방해하지 않도록 조심스럽게 흡출하고 50 ㎕의 차단 용액을 각 웰에 가하고 펠릿을 용액의 피펫팅에 의해 재현탁하였다.
실시예 3 - SSC의 연골형성 분화
표 2는 불완전 연골형성 배지(ICM)의 조성을 나타낸다.
시약 부피 최종 농도
DMEM (HG) 95㎖
덱사메타손 1mM 10㎕ 100nM
아스코르브산 2-P: 5㎎/㎖ 1㎖ 50㎍/㎖
L-프롤린: 4㎎/㎖ 1㎖ 40㎍/㎖
ITS+ 보충제 1㎖ 6.25㎍/㎖ 소 인슐린
6.25㎍/㎖ 트랜스페린
6.25㎍/㎖ 아셀렌산
5.33㎍/㎖ 리놀레산
1.25㎎㎖ BSA
나트륨 피루베이트 1㎖ 1mM
페니실린/스트렙토마이신 1㎖ 100U/㎖ 페니실린
100㎍/㎖ 스트렙토마이신
세포를 37 ℃ 수욕을 사용하여 해동시키고 15 ㎖ 튜브 중의 배양 배지로 신속히 옮기고, 상기 냉동바이알을 1 ㎖의 배지로 세척하였다. 세포를 400 g에서 5 분간 원심분리시켰다. 상등액을 흡출하고 세포를 5 ㎖ 완전 배양 배지에 재현탁하였다. 세포 카운트를 수행하고 2 내지 2.5 x 105 세포/펠릿의 펠릿을 형성하기에 충분한 세포를 수확하였다. 4 개의 양성 배양물 및 2 개의 음성 배양물을 각 샘플에 대해 지정하였다. 세포를 다시 400 g에서 5 분간 원심분리하여 배양 배지를 제거하였다. 상등액을 흡출하고 세포를 3 ㎖ 불완전 연골형성 배지(ICM)에 재현탁하였다. 3 ㎖ 세포 현탁액을 15 ㎖ 튜브에 분할하였다(양성 펠릿에 대해 2 ㎖, 음성 펠릿에 대해 1 ㎖). 튜브들을 100 g에서 5 분간 원심분리하였다. 양성 펠릿에 대한 세포를, 형성되는 모든 펠릿에 대해 500 ㎕의 완전 연골형성 배지(CCM)에 재현탁하였다. CCM은 ICM의 ㎖당 0.5 ㎕의 TGF-β를 갖는 ICM으로 이루어진다.
음성 펠릿에 대한 세포를, 형성되는 모든 펠릿에 대해 500 ㎕의 ICM에 재현탁하였다. 세포를 스크류 캡 에펜도르프 튜브로 옮기고 스윙 아웃 로터에서 100 g에서 5 분간 원심분리하였다. 튜브 캡을 느슨하게 하여 기체 교환을 허용하였으며 37 ℃, 5% CO2에서 BSC 중에서 배양하였다. 배지를, 상기 펠릿을 방해하지 않으면서 상기 배지를 가능한 한 많이 흡출하고 각각 양성 펠릿 및 음성 펠릿에 대해 CCM 또는 ICM으로 교체함으로써 이틀마다 교환하였다. 21일째에, 세포 펠릿을, 모든 배지의 흡출 및 D-PBS 중에서 2 회 세척에 의해 수확하였다. 펠릿을 공기 건조시키고 4 개의 양성 펠릿 중 3 개를 GAG 측정에 사용하고 다른 하나를 조직학에 사용하였다. GAG 측정용 펠릿을 -20 ℃에서 보관하고 조직학에 사용되는 펠릿을 10% 포르말린 중에서 1 시간 동안 고정시키고 이어서 처리 준비가 될때까지 수중에서 보관하였다.
실시예 4 - 연골형성 분석
DMMB 모액의 제조
16 ㎎의 DMMB를 5 ㎖의 시약 등급 100% 에탄올에 밤새 용해시켰다. 2.73 g NaCl 및 3.04 g 글리신을 975 ㎖의 탈이온수에 가하였다. 0.69 ㎖의 농 HCl(11.6 M)을 상기 용액에 가하고 혼합하였다. 용해된 DMMB를 상기 용액에 가하였다. 이어서 DMMB의 용기를 상기 DMMB 용액이 전부 옮겨질 때까지 DI 수로 반복해서 세정하였다. pH를 1M HCl로 3.0으로 조절하였다. 부피를 탈이온수로 1 ℓ로 조절하고 용액을 은박지로 감싸 빛을 차단시켰다.
1 ㎎의 파파인(시그마(Sigma) P4762))을 9.75 ㎖의 따뜻한 희석된 완충제 중에 용해시킴으로써 파파인 용액을 제조하였다. 희석된 파파인은, 상기 용액 250 ㎕를 10 ㎖의 희석 완충제에 가함으로써 제조되었다.
200 ㎕의 파파인 용액을 각 펠릿에 가하고 60 ℃ 오븐에서 밤새 절단 (digest)시켰다. 이어서 샘플을 와동 (vortex)시켜 펠릿을 분산시켰다. 4 ㎎의 콘드로이친-6-설페이트를 10 ㎖의 희석 완충제에 가하여 400 ㎍/㎖의 모액을 제조함으로써 콘드로이친-6-설페이트(시그마 C4384)를 사용하여 표준을 구성하였다. 이어서 상기를 희석하여 40 ㎍/㎖ 용액을 제공하였다. 희석을 하기와 같이 상기 40 ㎍/㎖로부터 표 3에 나타낸 바와 같이 수행하였다.
콘드로이친 설페이트 용액 (40 ㎍/㎖) 희석 완충제 농도 GAG/웰 (50㎕)
200㎕ 0㎕ 2㎍
180㎕ 20㎕ 1.8㎍
160㎕ 40㎕ 1.6㎍
120㎕ 80㎕ 1.2㎍
80㎕ 120㎕ 0.8㎍
40㎕ 160㎕ 0.4㎍
0㎕ 200㎕ 0㎍
50 ㎕의 표준 및 샘플을 3 회 중복하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 가하였다. 200 ㎕의 DMMB 모액을 각 웰에 가하고 실온(RT)에서 5 분간 배양하였다. 플레이트를 595 ㎚에서 흡광도 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 0 ㎕의 GAG/웰을 함유하는 표준에 대한 흡광도 판독(이 경우 블랭크 값으로서 사용되며 다른 흡광도 판독치로부터 공제된다).
피코그린(PicoGreen)을 사용하는 DNA의 측정
1 x TE 용액을, 콴트(Quant)-iT 키트(시그마 P7589)에 제공된 20x 모액을 증류수 중에서 20 부 중 1로 희석함으로써 제조하였다. 희석된 피코그린 용액은 DMSO를 200 부의 dH2O 중 1로 희석함으로써 제조되었다. DNA 모액(100 ㎍/㎖)을 1 x TE 중에서 50 배로 희석하여 2 ㎍/㎖의 최종 농도를 제공하였다. DNA 표준을 표 4에 나타낸 바와 같이 제조하였다.
DNA 작용 모액 1xTE 최종 농도 DNA/㎖
400㎕ 0 2000ng
200㎕ 200㎕ 1000ng
100㎕ 300㎕ 500ng
40㎕ 360㎕ 200ng
20㎕ 380㎕ 100ng
10㎕ 390㎕ 50ng
4㎕ 396㎕ 10ng
0㎕ 400㎕ 0ng
파파인-절단된 샘플(상기에 개략됨)을 1 x TE 중에서 25 배 추가 희석하였다. 100 ㎕의 표준 및 샘플을 3 회 중복하여 96-웰 흑색 플레이트에 가하였다. 플레이트는 반응이 빛에 의해 영향을 받기 때문에 흑색이어야 한다. 100 ㎕의 피코그린 용액을 각 표준 및 샘플 웰에 가하고 2 내지 3 분간 배양하였다. 먼저 플레이트를 485 ㎚에서 여기시키고 이어서 플레이트를 538 ㎚에서 판독함으로써 형광 플레이트 판독기 상에서 플레이트들을 판독하였다.
실시예 5 - SSC의 지방생성 분화
표 5는 지방생성 유도 배지의 조성을 나타낸다.
시약 부피(100㎖을 만들기 위한) 최종 농도
DMEM (HG) 87.6㎖
덱사메타손 1mM 100㎕ 1μM
인슐린 1㎎/㎖ 1㎖ 10㎍/㎖
인도메타신 100mM 200㎕ 200μM
500mM 혼합물 100㎕ 500μM
페니실린/스트렙토마이신 1㎖ 100U/㎖ 페니실린
100㎍/㎖ 스트렙토마이신
FBS 10㎖ 10%
표 6은 지방생성 유지 배지의 조성을 나타낸다.
시약 부피(100㎖을 만들기 위한) 최종 농도
DMEM (HG) 88㎖
인슐린 1㎎/㎖ 1㎖ 10㎍/㎖
페니실린/스트렙토마이신 1㎖ 100U/㎖ 페니실린
100㎍/㎖ 스트렙토마이신
FBS 10㎖ 10%
세포를 37 ℃ 수욕을 사용하여 해동시키고 15 ㎖ 튜브 중의 배양 배지로 신속히 옮기고, 상기 냉동바이알을 1 ㎖의 배지로 세척하였다. 세포를 400 g에서 5 분간 원심분리시켰다. 상등액을 흡출하고 세포를 5 ㎖ 완전 배양 배지에 재현탁하였다. 세포 카운트를 수행하고 편평한 바닥을 갖는 24 웰 플레이트 중에서 융합율(4 x 104 세포/웰)로 세포를 시딩하기에 충분한 세포를 수확하였다. 4 개의 시험 웰 및 4 개의 대조용 웰을 마련하였다. 세포를 각 웰 중의 1 ㎖의 배양 배지에 시딩하였다. 세포를 37 ℃, 5% CO2에서 배양하고 48 시간 후에 세포를, 상기 플라스틱에 부착하였고 융합물이 나타났는지에 대해서 관찰하였다. 웰을 시험하기 위해서, 완전 배양 배지를 1 ㎖의 지방생성 유도 배지로 교체하고 3일 동안 방치하였다. 대조용 웰을 완전 배양 배지로 교체하였다. 지방생성 배양 배지 중에서 3일 후에, 시험 웰 중의 배지를 1 ㎖/웰의 유지 배지로 교체하고 1 내지 3일 동안 방치하였다. 이어서 이를 1 ㎖/웰의 유지 배지로 교체하였다. 이 과정을 3 회 반복하였다. 유지 배지로의 최종 배지 교환 후에, 세포를 수확 전 5 내지 7일 동안 배지 중에서 방치하였다.
실시예 6 - 지방생성 분석
오일 레드 O 염색
오일 레드 O의 작용 용액을, 6 부의 오일 레드 O 모액을 4 부의 dH2O와 혼합하여 제조하였다. 용액을 10 분간 정치시키고 이어서 와트만 1번 여과지를 통해 여과하였다.
배지를 흡출하고 세포를 D-PBS 중에서 2 회 세척하였다. 이어서 세포를 RT에서 1 시간 동안 10% 포르말린 중에 고정시켰다. 포르말린을 흡출하고 플레이트를 dH2O 중에서 세정하였다. 500 ㎕의 오일 레드 O 작용 용액을 각 웰에 피펫팅하여 세포층을 덮었다. 플레이트를 숫자 8 작동으로 서서히 회전시켜 오일 레드 O를 세포 위에 고르게 덮고 5 분간 방치하였다. 착색제를 흡출하고 과잉의 착색제는 2 ㎖/웰의 60% 아이소프로판올을 가하여 제거하였다. 플레이트를 다시 숫자 8 작동으로 휘젓고 아이소프로판올 흡출하였다. 플레이트를, 물이 플레이트를 매끄럽게 흐를 때까지 수돗물로 세정하였다. 이어서 샘플들을 이미지화할 때까지 dH2O 중에 보관하였다.
염색된 지질의 추출
샘플의 이미지화 후에, 물을 웰로부터 흡출하였다. 오일 레드 O를, 상기 웰의 표면 위에서 아이소프로판올(2 x 500 ㎕)을 수회 피펫팅함으로써 추출하였다. 이어서 아이소프로판올 및 염료를 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 샘플들을 500 g에서 2 분간 원심분리하여 샘플 중의 찌꺼기를 펠릿화하였다. 각 샘플에 대해 추출된 착색제 200 ㎕를 3 회 중복하여 96 웰 플레이트에 가하였다. 염색을 520 ㎚에서 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
실시예 7 - SSC의 골형성 분화
표 7은 골형성 분화 배지의 조성을 나타낸다.
시약 부피(100㎖을 만들기 위한) 최종 농도
DMEM (LG) 87.5㎖
덱사메타손 1mM 10㎕ 100nM
아스코르브산 2-P 10mM 1㎖ 100μM
B 글리세로포스페이트 1㎖ 10mM
FBS 10㎖ 10%
페니실린/스트렙토마이신 1㎖ 100U/㎖ 페니실린
100㎍/㎖ 스트렙토마이신
세포를 37 ℃ 수욕을 사용하여 해동시키고 15 ㎖ 튜브 중의 배양 배지로 신속히 옮기고, 상기 냉동바이알을 1 ㎖의 배지로 세척하였다. 세포를 400 g에서 5 분간 원심분리시켰다. 상등액을 흡출하고 세포를 5 ㎖ 완전 배양 배지에 재현탁하였다. 세포 카운트를 수행하고 편평한 바닥을 갖는 24 웰 플레이트 중에서 융합율(4 x 104 세포/웰)로 세포를 시딩하기에 충분한 세포를 수확하였다. 4 개의 시험 웰 및 4 개의 대조용 웰을 마련하였다. 세포를 각 웰 중의 1 ㎖의 배양 배지에 시딩하였다. 세포를 37 ℃, 5% CO2에서 배양하고 48 시간 후에 세포를, 상기 플라스틱에 부착하였고 융합물이 나타났는지에 대해서 관찰하였다. 시험 웰 중의 배지를 골형성 배지로 교체하고 대조용 웰 중의 배지를 완전 배양 배지로 교체하였다. 모든 웰 중의 배지를 매주 2 회 교환하였다. 세포를 10 내지 17일째에 수확하였다.
골형성 분석
4 개의 시험 웰 중 1 및 대조용 웰을 알리자린 레드(Alizarin Red) 염색에 사용한다. 다른 3 개는 칼슘 정량분석에 사용하였다.
알리자린 레드 염색
2% 알리자린 레드 S 용액을, 2 g 알리자린 레드 S를 100 ㎖ dH2O에 용해시켜 제조하였다. 용액을 혼합하고 pH가 염색 과정에 필수적이므로 1% 수산화 암모늄을 사용하여 pH를 대략 4.1 내지 4.3으로 조절하였다. 배지를 웰들로부터 흡출하였다. 세포를 D-PBS로 2 회 세척하여 남은 배지를 제거하여 배지 염색이 발생하지 않도록 하였다. 95 ㎖의 100% 메탄올을 5 ㎖의 물로 희석함으로써 95% 메탄올을 제조하였다. 이어서 메탄올을 얼음 중에서 저온으로 보관하였다. 세포를 10 분간 빙냉 메탄올 중에서 고정시켰다. 메탄올을 흡출하고 세포를 dH2O로 세정하였다. 500 ㎕의 2% 알리자린 레드 S를 웰에 가하고, 때때로 상기 플레이트를 숫자 8 작동으로 서서히 휘저으면서 5 분간 방치하였다. 5 분 후에 칼슘 염색이 가시화되었다. 세포를 dH2O 중에서 세정하고 올림푸스 CKx41을 사용하여 이미지화하였다.
칼슘 분석
0.5 M HCl을, 95.7 ㎖의 물에 4.3 ㎖의 11.6 M HCl을 희석함으로써 제조하였다. 배지를 웰로부터 흡출하고 웰을 D-PBS로 2 회 세척하여 임의의 남은 배지를 제거하였다. 0.2 ㎖의 0.5 M HCl을 각 웰에 가하고 세포를 세포 스크래퍼를 사용하여 긁어내고 표지된 에펜도르프 튜브에 수거하였다. 용액을 어두운 저온실에서 세포 진탕기 상에서 밤새 진탕 방치하였다. 샘플을 세포 찌꺼기가 펠릿화되도록 간단히 원심분리하였다. 칼슘 분석을 스탠바이오(Stanbio) 키트를 사용하여 수행하였다. 결합 시약 및 작용 염료의 1:1 작용 용액을 제조하였다.
표 8은 칼슘 분석 표준의 조성을 나타낸다.
농도(㎍/웰) 부피 10 mg/dl 표준/웰
0 0
0.05 0.5㎕
0.10 1㎕
0.2 2㎕
0.4 4㎕
0.6 6㎕
0.8 8㎕
1.0 10㎕
표준 및 샘플을 96 웰 플레이트에 3 회 중복하여 도말하였다. 10 ㎕의 0.5M HCl을 각 표준 웰에 가하였다. 10 ㎕의 샘플을 각 웰에 가하였다. 200 ㎕의 작용 용액을 모든 표준 및 샘플 웰에 가하였다. 흡광도를 빅터(Victor)3(상표) 1420을 사용하여 550 내지 650 ㎚에서 판독하였다.
SDC2를 C57/BI6 계통 (strain)으로부터의 CD45-ve 쥐 BMMNC상에서 표면에서 Sca1으로 공-염색하였다. 더욱이, 쥐 골수로부터의 SDC2+/Sca1+MNC의 FACS 분류는 SDC2가 도말된 분류-전 MNC에 비해 현저하게 증가된 빈도로 CFU-F를 형성할 수 있는 SSC의 자기재생 부분 모집단을 표시함을 밝힌다.
실시예 8 - 인간 다능성 세포로부터의 SDC2 + 세포
우리는, 골수로부터 유래된 세포(BM-)와의 비교를 위해서, 인간 다능성 세포(이 경우에 ES 세포(ES-))로부터 SDC2를 발현하는 세포의 집단들을 획득하였다.
BM-SSC 및 ES-SSC(밀리포어(Millipore) 인간 중간엽 줄기 세포(hES 세포로부터 유래됨))를 완전 배지(BM-SSCs: α-MEM, 10% FBS; ES-SSCs: 밀리포어 피브로그로(FibroGRO)(상표) LS 완전 배지 키트) 중에 6-웰 플레이트(넝크(Nunc))의 웰당 105 세포의 밀도로 도말하고 밤새 부착되도록 방치하였다. 세포가 융합 이하 수준(∼60% 융합율), 및 융합 수준(100% 융합율)에 도달했을 때 세포를 수확하였다.
"전통적인" SSC 마커의 유식 세포측정 분석으로부터의 결과는 BM-SSC 및 ES-SSC가 CD73의 유사한 발현을 가짐을 예시하였다. 마커 CD105의 발현은 상기 융합 및 융합 이하 배양물 모두에 대해 동일하게 남아있었으며; CD105 발현은 융합율의 증가에 따라 감소하는 것으로 나타났다. BM- 및 ES-SSC에 의한 SDC2의 발현은 융합 및 융합-이하 (sub-confluent) 배양 조건에서 일관되게 남아있었으며; SDC2를 발현하는 집단 BM-SSC 백분율은 융합 배양물에서 증가하고 융합 및 비-융합 배양물 모두에서 ES-SSC에 대해 일관되게 높다. ES-SSC에 의한 SDC2 발현의 RFI는 더 높다.
따라서, hES 유래된 기질 줄기 세포는 SDC2를 발현하였고 따라서 SDC2가 풍부한 세포 집단을 hES 및 hiPS 세포를 포함한 인간 다능성 세포로부터 직접 수득할 수 있다.
실시예 9 - 래트에서 인공호흡기 유발된 폐 손상의 치료에 있어서 SDC2 + 세포
방법 및 물질
모든 연구는 아일랜드 골웨이 국립 대학의 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었으며 아일랜드의 보건부로부터의 인가 하에 수행되었다.
hSSC 단리 및 배양
인간 SSC(hSSC)를 앞서 개시한 바와 같이 성인 자원자로부터 단리하였다. 흡출에 이어서, 골수를 조직 배양 플라스크에 도말하였다. 부착 세포를 80% 융합율까지 증식시키고, 이어서 트립신 처리하고 계대배양 4까지 배양물을 확대시켰으며, 이때 상기 배양물을 실험에 사용하였다. SSC를 국제 지침에 따라 특성화하였다. 대조용 세포로서 사용된 섬유아세포를 앞서 개시한 바와 같이 안정한 세포주로부터 수득하였다.
시리즈 1[환기 유발된 폐 손상]
·다자란 수컷 스프래그 다우리 래트를 마취시키고, 구기관 삽관하고, 무작위로 손상을 주는 기계적 환기를 겪게 하였다.
·하기의 인공호흡기 설정을 사용하였다: Pinsp 35 ㎝H2O, 호흡률 18 min-1, 및 PEEP 0 ㎝H2O. 호흡 정적 탄성이 50%까지 감소했을 때 상기 동물들을 회복시켰다.
·회복에 이어서, 동물들에게 4 그룹 설계로, 무작위로 (i) 비히클(PBS, 300 ㎕); (ii) 섬유아세포(4 x 106 세포); (iii) 인간 SSC(4 x 106 세포) 또는 (iv) 본 발명의 세포(인간 S2+SSC라 칭함)(4 x 106 세포)를 정맥내 투여하였다.
·ALI 및 염증 반응에 이은 회복의 정도를 24 시간 후에 평가하였다.
시리즈 2[저 신장 '보호성 환기]
·다자란 수컷 스프래그 다우리 래트를 마취시키고, 구기관 삽관하고, 무작위로 저 신장 기계적 환기를 겪게 하였다.
·상기 '저 신장' 프로토콜은 하기의 설정과 함께 90 분간 기계적 환기로 이루어졌다: 0.3의 FiO2, 호흡률 80.min-1, 1회 호흡량 6 ㎖.㎏-1 및 2 ㎝ H2O의 호기말 양압.
·회복에 이어서, 동물들에게 6 그룹 설계로, 무작위로 (i) 비히클(PBS, 300 ㎕); (ii) 섬유아세포(4 x 106 세포); 또는 (iii) 기관내 인간 SSC(4 x 106 세포)를 정맥내 투여하였다.
·ALI 및 염증 반응에 이은 회복의 정도를 24 시간 후에 평가하였다.
통계학적 분석
모든 데이터의 분포를 콜모고로프-스미노프 시험을 사용하여 정규분포에 대해 시험하였다. 데이터를, 적합한 대로, 일원 ANOVA에 의해 분석한 다음, 스튜던트-뉴만-쿨을 수행하거나, 또는 크루스칼리스-왈리스에 이어서 다중 비교를 위한 본페로니 보정과 함께 만-휘트니 U 시험에 의해 분석하였다. 근원적인 모델 가정은 적합한 잔차산점도를 근거로 적합한 것으로 간주되었다. <0.05의 양측 검증 p 값은 유의수준으로 간주되었다.
결과
환기 유발된 ALI로부터의 회복을 증대시킴에 있어서 S2+SSC의 효능
40 마리의 동물들을 실험 프로토콜에 참여시켰으며, 이때 상기 VILI 그룹들에 각각 10 마리씩 할당하였다. 4 마리의 VILI 동물들(2 마리는 비히클을 수용하도록 할당되고 2 마리는 섬유아세포를 수용하도록 할당되었다)은 상기 손상 프로토콜을 견디지 못했다. 다른 동물들은 모두 상기 손상 프로토콜 및 후속의 치료 배정에서 생존하였다. 8 마리의 동물들을 각각 상기 비히클 대조군 및 섬유아세포 그룹에 참여시킨 반면, 10 마리의 동물들은 각각 hSSC 및 S2+SSC를 수용하였다.
기준선 특징들: 기준선에서 손상-전 변수, 손상을 주는 환기 (ventilation)의 지속기간 또는 발생된 폐 손상의 정도에 관하여 상기 VILI 그룹들 간에 차이가 없었다(표 9)
고 신장 환기를 가한 동물들에 관한 기준선 데이터
변수 고 신장 환기
비히클 섬유아세포 hSSCs S2 + SSCs
동물의 수 8 8 10 10
동물 중량(g) 400±26 392±51 410±19 417±18
환기 시간(분) 76±27 76±16 77±19 78±14
손상전 폐 탄성 (㎖/mmHg) 0.64±0.09 0.66±0.12 0.67±0.13 0.66±0.11
VILI 후 폐 탄성 0.31±0.02 0.32±0.02 0.31±0.03 0.32±0.03
주) 데이터를 평균±SD로서 나타낸다.
S2+SSC는 VILI에 따른 폐 기능 및 구조를 복원하였다: S2+SSC 요법은 비히클에 비해 감소된 폐포-동맥 산소 구배에 의해 입증된 바와 같이, 동맥 산소화의 복원을 증대시켰다(p<0.05). S2+SSC 요법에 반응한 폐 생리학의 추가적인 기능 회복은 비히클에 비해 호흡계 정적 탄성 (static compliance)의 현저한 개선(p<0.01)에 의해 입증되었다.
S2+SSC는 폐 습윤:건조 중량비의 감소 및 폐포액 단백질 농도의 감소에 의해 입증된 바와 같이, 폐 미세혈관 침투성을 개선시켰다(표 10). hSSC는 폐 구조의 회복을 증대시켰다. S2+SSC는 감소된 폐포 조직 부피 분획에 의해 입증된 바와 같이 폐포 비후를 감소시켰고, 증가된 폐포 공기층 부피 분획에 의해 입증된 바와 같이 공기층 부피의 회복을 증가시켰다(표 10).
고 신장 환기에 따른 24 시간 분해 정도에 관한 데이터

변수 		고 신장 환기
비히클 섬유아세포 hSSCs S2 + SSCs
동맥 O2 분압
(FiO2=0.3;KPa)		 13.4±2.8 12.7±2.8 16.9±2.9* 17.0±1.7*
동맥 O2 분압
(FiO2=1.0;KPa)		 32.1±13.1 32.8±16.0 65.3±9.4* 56.2±14.4*
폐 정적 탄성 (㎖/mmHg) 0.37±0.04 0.34±0.08 0.55±0.14* 0.53±0.08*
폐 습윤:건조 중량비 5.9±0.8 5.4±0.9 4.6±0.2* 4.3±0.7*
주) 데이터를 평균±SD로서 나타낸다. 최종 데이터는 실험 프로토콜의 종료 시 수집된 데이터이다.
*현저하게 상이한 비히클 및 섬유아세포 그룹.
S2+SSC는 VILI에 따른 염증을 조절하였다: S2+SSC는 BAL(기관지폐포 세척)액 중의 총 염증 세포 수를 감소시켰고 폐 호중구 축적을 실질적으로 감소시켰다(p<0.001). S2+SSC 및 미분화된 hSSC는 모두 VILI에 따른 염증 반응의 조절에 동등하게 유효하였다(표 11)
고 신장 환기에 따른 24 시간 염증 반응에 관한 데이터
변수 고 신장 환기
비히클 섬유아세포 hSSCs S2 + SSCs
BAL 세포수(x 106/㎖) 2.91±1.0 3.42±0.86 1.30±0.32* 1.50±0.51*
% BAL 호중구(%) 44.7±12.2 56.7±3.4 15.8±8.5* 16.0±8.5*
BAL 호중구수 (x 106/㎖) 1.31±0.60 1.92±0.44 0.20±0.10* 0.27±0.22*
BAL 림프구수 (x 105/㎖) 1.57±1.02 0.94±0.44 0.57±0.14 1.03±0.67
주) 데이터를 평균±SD로서 나타낸다. 최종 데이터는 실험 프로토콜의 종료 시 수집된 데이터이다.
*현저하게 상이한 비히클 및 섬유아세포 그룹.
†비히클 그룹과 현저하게 상이하다
'비-손상' 매개변수에 대한 효과: S2+SSC 또는 미분화된 hSSC는 동맥 pH, PCO2, 바이카보네이트, 염기 과잉, 락테이트 또는 평균 동맥압에 대해 효과가 없었다(데이터 도시 안 됨).
저 신장 환기에 따른 동물 중 S2+SSC의 효과
16 마리의 동물을 실험 프로토콜에 참여시켰으며, 이때 상기 그룹들 각각에 4 마리씩 할당하였다. 모든 동물이 상기 손상 프로토콜 및 후속의 치료 배정에서 생존하였다.
기준선 특징들: 기준선에서 상기 보호성 환기 그룹들 간에, 손상-전 변수, 손상을 주는 환기의 지속기간 또는 생성된 폐 손상의 정도에 관하여 차이가 없었다(데이터 도시 안 됨).
S2+SSC는 폐 기능 또는 구조에 영향을 미치지 않았다: 보호성 환기에 따른 폐 구조 또는 기능에 대한 S2+SSC 요법의 효과는 없었다(표 12).
저 신장 환기에 따른 24 시간 분해 정도에 관한 데이터
변수 저 신장 환기
비히클 섬유아세포 hSSCs S2 + SSCs
동맥 O2분압(FiO2=0.3;KPa) 17.6±1.2 17.8±0.8 17.8±0.6 18.5±0.7
동맥 O2분압(FiO2=1.0;KPa) 65.8±1.7 69.2±1.7 68.8±3.3 64.3±6.3
폐 정적 탄성 (㎖/mmHg) 0.53±0.03 0.59±0.06 0.64±0.02 0.61±0.04
폐 습윤:건조 중량비 4.3±0.4 4.3±0.5 4.2±0.2 4.3±0.6
주) 데이터를 평균±SD로서 나타낸다. 최종 데이터는 실험 프로토콜의 종료 시 수집된 데이터이다.
S2+SSC는 염증을 유발하지 않았다: 보호성 환기에 따른 폐 구조의 염증 반응에 대해 S2+SSC 요법의 효과는 없었다(표 13)
저 신상 환기에 따른 24 시간 염증 반응에 관한 데이터
변수 저 신장 환기
비히클 섬유아세포 hSSCs S2 + SSCs
BAL 세포수(x 106/㎖) 1.24±0.24 1.08±0.13 1.01±0.10 1.14±0.32
% BAL 호중구 (%) 11.3±2.8 9.8±2.1 20.8±4.9 10.3±2.0
BAL 호중구수 (x 106/㎖) 0.14±0.06 0.10±0.02 0.21±0.04 0.11±0.03
BAL 림프구수 (x 105/㎖) 0.64±0.16 0.65±0.38 0.65±0.52 0.59±0.31
주) 데이터를 평균±SD로서 나타낸다. 최종 데이터는 실험 프로토콜의 종료 시 수집된 데이터이다.
'비-손상' 매개변수에 대한 효과: S2+SSC 또는 미분화된 hSSC는 동맥 pH, PCO2, 바이카보네이트, 염기 과잉, 락테이트 또는 평균 동맥압에 대해 효과가 없었다(표 14)
저 신장 환기에 따른 24 시간 '비-손상' 매개변수에 관한 데이터
변수 저 신장 환기
비히클 섬유아세포 hSSCs S2 + SSCs
동맥 pH 7.40±0.04 7.39±0.03 7.38±0.03 7.40±0.04
동맥 PCO2(KPa) 5.4±0.8 5.5±0.2 5.0±0.2 4.4±0.3
동맥 바이카보네이트 (mMol/L) 20.5±2.0 22.0±1.5 20.9±1.0 21.7±2.1
염기 과잉 3.4±1.5 3.3±1.7 3.4±2.0 2.8±1.8
동맥 락테이트 (mMol/L) 3.1±1.4 2.2±0.6 2.1±0.8 2.0±1.2
평균 동맥압 (mmHg) 113.2±2.7 101.0±10.7 98.0±13.7 99.5±17.1
주) 데이터를 평균±SD로서 나타낸다. 최종 데이터는 실험 프로토콜의 종료 시 수집된 데이터이다.
결론
본 발명의 S2+SSC는 감소된 폐포-동맥 산소 구배, 호흡계 정적 탄성의 현저한 개선(p<0.01), 및 개선된 폐 미세혈관 침투성에 의해 입증된 바와 같이, VILI에 따른 폐 기능 및 구조를 복원시켰다. 또한, 상기는 VILI에 따른 폐 구조의 회복을 증대시켰다. 상기 세포는 VILI에 따른 염증을 조절하여, BAL 액 중의 총 염증 세포수를 감소시키고 폐 호중구 축적을 실질적으로 감소시켰다(p<0.001). 보호성 환기에 따른 폐 구조 또는 기능, 또는 염증 반응에 대한 S2+SSC 요법의 효과는 없었다. 이러한 발견은 본 발명의 세포가 상기 모델에서 잘 허용됨을 암시한다.
따라서 본 발명은 한정된 기질 줄기 세포 집단을 수득하는 방법 및 그의 용도를 제공한다.

Claims (55)

  1. 포유동물 기질 줄기 세포의 집단으로, 상기 세포의 30% 이상이 SDC2에 대해 양성인 세포의 집단.
  2. 제 1 항에 있어서,
    마우스, 래트 또는 인간 세포인 세포의 집단.
  3. 제 2 항에 있어서,
    인간 세포인 세포의 집단.
  4. 제 1 항에 있어서,
    말 세포인 세포의 집단.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포의 40% 이상이 SDC2에 대해 양성인 세포의 집단.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포의 50% 이상이 SDC2에 대해 양성인 세포의 집단.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 세포의 집단으로부터 수득된 조직.
  8. 제 7 항에 있어서,
    뼈, 연골 및 힘줄 중에서 선택된 조직.
  9. 세포 표면 마커의 발현에 근거하여 포유동물 세포의 혼합된 집단으로부터 세포를 단리함을 포함하는 기질 줄기 세포의 단리 방법으로, 상기 세포 표면 마커가 항체에 결합하고 상기 항체가 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종들의 세포상에서 발견되는 세포 표면 마커와 교차 반응하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    항체가 인간 세포상의 세포 표면 마커를 인식하고 마우스 세포상의 세포 표면 마커 및 임의로 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상의 세포 표면 마커와 교차 반응하는 방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    항체가 인간 세포상의 세포 표면 마커를 인식하고 래트 세포상의 세포 표면 마커 및 임의로 마우스, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상의 세포 표면 마커와 교차 반응하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서,
    항체가 말 세포상의 세포 표면 마커를 인식하고 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상의 세포 표면 마커와 교차 반응하는 방법.
  13. 세포 표면 마커의 발현에 근거하여 포유동물 세포의 혼합된 집단으로부터 세포를 단리함을 포함하는 기질 줄기 세포의 단리 방법으로, 상기 세포 표면 마커가 상기 포유동물 세포에 의해 발현되고 상응하는 세포 표면 마커가 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종들의 세포상에서 또한 발현되는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    마커가 인간 세포상에서 발현되고 상응하는 마커가 마우스 세포상에서 및 임의로 또한 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상에서 발현되는 방법.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    마커가 인간 세포상에서 발현되고 상응하는 마커가 래트 세포상에서 및 임의로 또한 마우스, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상에서 발현되는 방법.
  16. 제 13 항에 있어서,
    마커가 말 세포상에서 발현되고 상응하는 마커가 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상에서 발현되는 방법.
  17. 제 9 항 내지 제 11 항 및 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 세포의 단리를 위한 방법.
  18. 제 9 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    말 세포의 단리를 위한 방법.
  19. 제 9 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    마커 또는 상응하는 마커가 3 개 이상의 포유동물 종들의 세포상에서 발현되는 방법.
  20. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    마커가 SDC2인 방법.
  21. 제 9 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포의 혼합된 집단을 골수, 지방 조직, 골격근, 자궁내막, 태반, 제대혈, 탯줄, 바르톤젤리 및 다능성 세포로부터 유래된 세포 중에서 선택된 공급원으로부터 수득하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    공급원이 골수 또는 다능성 (pluripotent) 세포로부터 유래된 세포인 방법.
  23. 제 9 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포를 제 1의, 임의로 CD45 또는 FAP 알파와 상이한 추가의 세포 표면 마커의 발현을 근거로 단리함을 포함하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    CD45 음성 또는 FAP 알파 양성인 세포를 단리함을 포함하는 방법.
  25. 제 9 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 표면 마커, 또는 적용 가능한 경우 제 1 세포 표면 마커를 SDC2 및 NG2 중에서 선택하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    SDC2에 대해 양성이거나 SDC2 및 NG2 모두에 대해 양성인 세포를 단리함을 포함하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    골형성 및 혈관형성 세포의 단리를 위한 방법.
  28. 제 24 항에 있어서,
    SDC2에 대해 음성인 세포를 단리함을 포함하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    지방생성 세포의 단리를 위한 방법.
  30. 인간 골수로부터 (i) CD45에 대해 음성 또는 FAP 알파에 대해 양성이고 (ii) 추가의 세포 표면 마커에 대해 양성인 세포를 단리함을 포함하는 인간 기질 줄기 세포의 단리 방법으로, 상기 추가의 세포 표면 마커가 항체에 결합하고 상기 항체가 마우스 또는 래트 기질 줄기 세포상에서 발견되는 세포 표면 마커와 교차 반응하고 임의로 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종들 상의 세포 표면 마커와 교차 반응하는 방법.
  31. 제 9 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 방법에 따른 세포를 단리하고; 상기 단리된 세포로부터 세포의 집단을 유도함을 포함하는, 상기 세포 집단의 수득 방법.
  32. 제 9 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 방법에 따른 단세포를 단리하고; 상기 단세포로부터 세포의 클론 집단을 유도함을 포함하는, 상기 세포의 클론 집단의 수득 방법.
  33. 제 31 항, 제 32 항 및 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 따른 세포의 초기 집단을 수득하고 이어서 상기 세포를 배양물 중에서 추가로 증식 및/또는 확대 및/또는 계대배양함을 포함하는, 세포 집단의 수득 방법.
  34. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득할 수 있는 세포의 집단.
  35. 인간 기질 줄기 세포를 제공하고,
    상기 인간 기질 줄기 세포로부터 세포의 클론 집단을 유도하고,
    임의로, 상기 세포를 배양물 중에서 추가로 증식 및/또는 확대 및/또는 계대배양함으로써 수득되는 세포의 집단으로,
    상기 인간 기질 줄기 세포가 (i) 골수로부터 단리되고, (ii) CD45의 발현에 대해 음성이거나 FAP 알파의 발현에 대해 양성이고, (iii) 추가의 세포 표면 마커의 발현에 대해 양성이고, 상기 추가의 세포 표면 마커가 항체와 결합하고 상기 항체가 마우스 또는 래트 기질 줄기 세포상에서 발견되는 세포 표면 마커와 교차 반응하고 임의로 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종 상의 마커와 또한 교차 반응하는 세포의 집단.
  36. 포유동물 기질 줄기 세포의 집단으로, 상기 세포의 75% 이상이 세포 표면 마커에 대해 양성이고, 상응하는 세포 표면 마커가 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 종들의 세포상에서 또한 발현되는 집단.
  37. 제 36 항에 있어서,
    마커가 인간 세포상에서 발현되고 상응하는 마커가 마우스 세포상에서 및 임의로 또한 래트, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상에서 발현되는 집단.
  38. 제 36 항에 있어서,
    마커가 인간 세포상에서 발현되고 상응하는 마커가 래트 세포상에서 및 임의로 또한 마우스, 말, 토끼 및 돼지 세포 중에서 선택된 하나 이상의 다른 포유동물 세포상에서 발현되는 집단.
  39. 기질 줄기 세포의 집단으로, 상기 세포의 75% 이상이 SDC2 양성인 집단.
  40. 기질 줄기 세포의 집단으로, 상기 세포의 75% 이상이 SDC2 음성인 집단.
  41. 제 39 항 또는 제 40 항에 있어서,
    세포의 75% 이상이 CD45 음성 또는 FAP 알파 양성인 기질 줄기 세포의 집단.
  42. 제 36 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 9 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득될 수 있는 세포의 집단.
  43. 조직의 수득 방법으로, 제 9 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 세포를 수득하고 이로부터 조직을 수득함을 포함하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서,
    뼈, 연골 및 힘줄 중에서 선택된 조직을 수득하기 위한 방법.
  45. 제 43 항에 있어서,
    지방 조직 또는 재건술용 조직을 수득하기 위한 방법.
  46. 제 34 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항의 세포 집단으로부터 수득되는 뼈, 연골 또는 힘줄.
  47. 제 34 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항의 세포 집단으로부터 수득되는 지방 조직 또는 재건술용 조직.
  48. 분석의 수행 방법으로, 제 9 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 세포를 수득하고, 상기 분석에 상기 세포를 사용함을 포함하는 방법.
  49. 제 34 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항의 세포의 사용을 포함하는 분석.
  50. 제 1 항 내지 제 8 항, 제 34 항 내지 제 42 항, 제 46 항 및 제 47 항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 조직을 포함하는, 동물에서 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약학 조성물.
  51. 제 50 항에 있어서,
    약학적으로 허용 가능한 담체를 또한 포함하는 조성물.
  52. 제 50 항 또는 제 51 항에 있어서,
    염수 또는 포스페이트 완충된 염수를 포함하고, 다이메틸설폭사이드, 인간 혈청 알부민, 히아루론산 및 콜라겐 중 하나 이상을 임의로 또한 포함하는 조성물.
  53. 동물에게 제 50 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 동물의 치료 방법.
  54. 동물의 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 8 항, 제 34 항 내지 제 42 항, 제 46 항 및 제 47 항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 조직.
  55. 실질적으로 본 발명에서 앞서 개시한 바와 같은 인간 기질 세포 집단.
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