BG107770A - Извлечени от кръв на човешка пъпна връв свободни соматични стволови клетки - Google Patents

Извлечени от кръв на човешка пъпна връв свободни соматични стволови клетки Download PDF

Info

Publication number
BG107770A
BG107770A BG107770A BG10777003A BG107770A BG 107770 A BG107770 A BG 107770A BG 107770 A BG107770 A BG 107770A BG 10777003 A BG10777003 A BG 10777003A BG 107770 A BG107770 A BG 107770A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
cells
stem cells
somatic stem
ussc
cells according
Prior art date
Application number
BG107770A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Wernet
Original Assignee
Kourion Therapeutics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kourion Therapeutics Gmbh filed Critical Kourion Therapeutics Gmbh
Publication of BG107770A publication Critical patent/BG107770A/bg

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC

Description

СОМАТИЧНИ СТВОЛОВИ КЛЕТКИ
Настоящото изобретение се отнася до соматични стволови клетки, по-специално до стволови клетки, серия от стволови клетки, медикамент, съдържащ стволовите клетки съгласно изобретението и метод за пречистване, изолиране и уникална възможност за диференциация на стволовите клетки съгласно изобретението.
Въпреки, че стволовите клетки са самоподменящи се, обикновено, този цикъл е бавен. Обикновено, се предполага, че тези клетки дават нарастване до директно прилагана клетъчна популация с ограничен самовъзстановяващ се капацитет, за да се повиши броят на диференцираните клетки. Било е предизвикателство да се въведат стволови клетки във възрастни хора и, поради това, в наличната литература има достатъчно данни за използуването на множество маркери на заместители (например, формиращи колония тестове за кръвотворен произход).
Множество американски патенти, например, US 5,486,359; 5,591,625; 5,736,396; 5,811,094; 5,827,740; 5,837,539; 5,908,782; 5,908,784; 5,942,225; 5,965,436; 6,010,696; 6,022,540; 6,087,113; 5,858,390; 5,804,446; 5,846,796; 5,654,186; 6,054,121; 5,827,735; 5,827,735; 5,906,934 се занимават с мезенхимните стволови клетки (MSC), които могат да бъдат диференцирани в няколко прогениторни клетки, например мускулни прогениторни клетки, прогенитори на съединителнотъканни клетки или на яйчни клетки. Прогениторните клетки на мускулите са диференцирани понататък в сърдечни, скелетни, както и в гладки мускулни клетки, тъй като прогенитора на съединителнотъкънните клетки може да се диференцира в кости, хрущял или мазнина. Яйчните клетки могат да диференцират в клетки на черен дроб или на панкреас (Grompe et al, 2001).
Наличието на не-кръвотворни клетки вътре в кръвта на пъпната връв е все още дискусионно (Mayani et al., 2000, Mareschi et al. 2001). Германската патентна заявка DE 198 03 267 Al беше първата, описваща остеобластни прогенитори и костни образования в кръв от човешката пъпна връв.
Често използуването на такива мезенхимни протогениторни клетки в предшествуващото състояние на техниката е ограничено, тъй като те са много развити с да цел да бъдат полезни инструменти за генериране на органи и тъкани. С други думи, те вече изглеждат толкова много ангажирани и специализирани в произвеждането на функционално увредени органи или тъкани.
Задача на изобретението е да се осигури стволова клетка, която е в състояние да диференцира в различни протогениторни клетки, такива като мезенхимни клетки, нервни клетки, кръвни клетки или ендотелиални клетки.
Друга задача на изобретението е да се осигури стволова клетка, която няма недостатъците на ембрионалните стволови клетки
Беше установено, че ново-идентифицираната стволова клетка е в състояние да реши по-горе поставените задачи. Стволовата клетка съгласно изобретението е извлечена от кръв на човешка пъпна връв, кръв на плацента и/или от кръв от новородено дете, споменатата стволова клетка е различна от и е в състояние да диференцира вътре в мезенхимни стволови или протогениторни клетки, в клетки с кръвотворен произход или в протогениторни клетки, в нервни стволови или протогениторни клетки или в ендотелиални клетки или в чернодробни протогениторни клетки. Тези клетки представляват протогенитор с кръвотворен произход на мезенхимните стволови клетки, както и на нервните стволови клетки. Този уникален мултифункционален капацитет и технологията за експанзия на тези свободни соматични стволови клетки, извлечени от кръв на пъпна връв, само като такива соматични стволови клетки или като ангажирани клетки при различни протоколи на диференциация, позволяват прецизното им характеризиране, стандартизиране и използуване за производство и за провеждане на терапия със стволови клетки в регенеративната медицина.
Фигура 1 показва фотография под микроскоп на първична култура свободни соматични стволови клетки (USSC), разстлана с ниска плътност.
Фигура 2 показва фотография под микроскоп на култура от сливащи се USSC клетки.
Фигура 3 показва FACS анализи на CD45 антиген след приключване на курс на in vitro култура.
Фигура 4 показва FACS анализи за SSEA4 ембрионален маркер.
Фигура 5 показва FACS анализи за HLA-клас I (А, В, С), HLA DR и CD14.
Фигура 6 показва FACS кинетични криви на CD34 повърхностен маркер.
Фигура 7 показва фотография под микроскоп на USSC клетки след нервно индуциране.
Фигура 8 показва, че USSC клетките съгласно изобретението имат имунно оцветяване на нервна стволова клетка с анти-нестин на маркера нестин.
Фигура 9 показва USSC, генериращи клетки с нервен произход.
Фигура 10 показва USSC, генериращи клетки с глиален произход.
Фигура 11 показва минерализирано образование след костно индуциране и след оцветяване с ализарин червен (В).
Фигура 12 показва показва оцветяване е алциан синьо на USSC клетки, извлечени от зърнеста култура.
Фигура 13 показва оцветени (зелено) с колаген тип II USSC култури след хондрогенна диференциация.
Фигура 14 показва липогенна диференциация на USSC култури, която е демонстрирана с оцветяване с Oil Red.
Фигура 15 показва фотография под микроскоп на USSC клетки след миогенна диференциация.
Фигура 16 показва химия на клетъчния имунитет за бавнодействуващ миозин след третиране с азацитидин.
Фигура 17 показва фенотип на яйчна клетка на производни на USSC.
Фигура 18 показва преживяване и интегриране на USSC култури след инжектиране в паренхима на черен дроб на SCID мишка.
Соматичните стволови клетки съгласно изобретението могат да бъдат изолирани и пречистени чрез няколко метода, съдържащи стъпките изолиране в плътност градиент, култура от сливащи се клетки и прилагане на субкултура с фактори на растеж, както е описано в пример 1. След като е бил образуван слой от сливащи се клетки, за да се извлекат клетките съгласно изобретението, изолационният процес е контролиран рутинно чрез морфология (фибробластоидна морфология) и фенотипни анализи, използуващи антитела, насочени срещу CD 13 (положителни), CD 14 (отрицателни), CD45 (отрицателни) и CD29 (положителни; виж пример 2) повърхностни антигени.
Сомотичната стволова клетка съгласно изобретението е реагираща негативно със специфичните маркерите с кръвотворен произход, такива като CD45, и поради това, е различна от кръвотворните стволови клетки, които също могат да бъдат изолирани от кръв на плацентна пъпна връв.
CD14 е друг повърхностен антиген, който може да бъде открит върху USSC клетки. Стволовата клетка съгласно изобретението се характеризира с комплект от антигени, които са налични върху повърхността на клетката, такива като CD13, CD29, CD44, CD49e. Препаратите на USSC клетки се характеризират и чрез наличието на mRNA копия за определени молекулирецептори като рецептор на епидермалния фактор на растеж (EGF-R), алфа плоскостен рецептор на извлечен фактор на растеж (PDGF-RA), рецептор на инсулинов фактор на растеж (IGF-R). Тази клетки също са типични фактори на експресно копиране като YB1 (фактор 1 на копиране Y-кутия), Runxl (свързан с фактор 1 на копиране джудже) и AML1C (фактор на копиране на остра миелоидна левкемия), както е открито чрез RT-PCR. USSC препаратите са типично негативни за копия на хондрогенния фактор на копиране Cart-Ι и нервните маркери като неврофиламент, синаптофизин, тирозин хидроксилаза (TH) и глиален фибрален киселинен протеин (GFAP).
Таблица 1: анализи на копирани структури на USSC клетки чрез RTPCR.
Резултатите от RT-PCR са получени с предварително изчислени олигонуклеотидни начални параметри и mRNA копия и mRNA положителен контрол от други тъкани като кост, хрущял или мононуклеарни клетки от кръв на пъпна връв.
име PCR-резултат USSC PCR-резултат (други тъкани)
PDGFR alpha + + (зряла кост)
IGFR + + (зряла кост)
Неврофиламент - + (зрял на възрастен)
CD105 + + (моноядрени клетки от СВ)
GFAP - + (ембрионален мозък)
Синаптофизин - + (ембрионален мозък)
Тироксинхдроксилаза - + (ембрионален мозък)
YB1 + + (ембрионален мозък)
Runxl + + (зряла кост)
AMLlc + + (зряла кост)
BMPRII + + (зрял хрущял)
Колаген тип I + + (зряла кост)
Cart-1 - + (моноядрени клетки от СВ)
хондроадерин - + (зряла кост)
CD49e + + (зряла кост)
RNA представянето на USSC препарати и извлечени MSC клетки от костен мозък (Caplan, 1991) бяха сравнени директно чрез използуването на изчислителни микроматрици чрез Affymetrix GeneChip™ Копието на гена Fibulin-2 (номер на генната банка Х82494) беше открито в USSC клетките във високо изразени нива, но не и в MSC клетките. Fibulin-2 продукта беше демонстриран предварително във фибробласт (Pan et al., 1993). Анализът с Northem-пренос на mRNA от различни човешки тъкани разкри едно изменено 4.5-kb копие в тъкани от сърце, плацента и яйчник (Zhang et al., 1994). Протеинът беше локализиран при светлинно микроскопско ниво в човешки ембриони от 4-10 седмична бременност, използувайки антитела с много клони. Fibulin-2 беше открит първоначално вътре в невропителиума, гръбначния нервен възел и периферните нерви (Miosge et al., 1996).
В образец от плъх, миофибробластите на черен дроб на плъх (rMF) са ко-локализирани с Fibulin-2. Тези клетки бяха локализирани в областта на вратните вена, стените на централните вени, и само рядко в паренхимата. В ранните стадии на фиброза, rMF бяха открити вътре в развиващи се белези от рани. В напредналите стадии на фиброза, rMF за серия изброени клетките са локализирани в белега (Knittel et al., 1999). В друг образец от опитно животно протеинът Fibulin-2 на мишка е показан по време на епително-мезенхимна трансформация в ендокардиалната матрица на зараждане на ендокарда по време на развитието на сърцето на ембриона. Fibulin-2 също е синтезиран с клетки-предшественици от гладък мускул на развиващи се съдове на дъгата на аортата и на коронарните ендотелиални клетки, които са произлезли, съответно, от клетки на нервен израстък и на епикардиални клетки (Tsuda et al., 2001).
Копията на гена Hyaluronan Synthase (D84424), гена Fibomodulin (U05291) и копието на 1NFLS (W03846) не бяха открити в клетките, а на високи нива в MSC клетките. Northern-принос анализите показаха, че генът Hyaluronan Synthase е изразен повсеместно в човешките тъкани (Itano and Kimata, 1996). Продуктът на този ензим, Hyaluronan, служи при много функции, включително и при чувството за пространство, съставите на смазващата среда и осигуряване на матрица, чрез която клетките могат да мигрират (Hall et al., 1995). Fibromodulin е член на семейството на малките междуточкови протогликани. Протеинът показва широко разпространение в тъканите, като с най-високо изобилие е наблюдаван в ставния хрущял, сухожилието и свръзките (Sztrolovics et al., 1994). Копието на 1NFLS беше клонирано от черен дроб на човешки ембрион.
Генът CD24 (L33930) е изразен в много ниско ниво в USSC клетките в сравнение с изразеното му ниво в MSC клетките. CD24 е изразен в много клетки с В-произход и по узрелите гранулоцити (Van der Schoot et al., 1989).
Когато MSC клетките се сравнят със соматичните клетки съгласно изобретението ясно се вижда, че последните са базирани на източник на тъкан, от който те са били изолирани. USSC клетките са характеризирани с не-изразяване на антигени на човешки левкоцити клас I (HLA-class I). В отличие от соматичните клетки съгласно изобретението, описаните преди това MSC клетки, изолирани от костен мозък и мускулна тъкан, показват много високи нива на антигени на HLA-class I по техните клетъчни повърхности. Клетките съгласно изобретението също изразяват скок на специфичен по-ранен антиген 4 (SSEA4) (виж фигура 4).
Соматичната клетка съгласно изобретение показва фибробластна форма на клетката и се разраства чрез слепване.
В едно предпочитано примерно изпълнение на настоящото изобретение соматичната стволова клетка съгласно изобретението (USSC) е присъствуваща в една серия или в смеси, представляващи предшественици на други соматични стволови клетки, т.е. на клетки с кръвотворен произход, за предпочитане, изразяващи АС 133 и CD34, мезенхимни протогениторни соматични стволови клетки, нервни протогениторни соматични стволови клетки или комбинации от тях. Това примерно изпълнение е с предимство, тъй като съдържа висок регенеративен потенциал, основан на възможността за диференциация в други различни соматични стволови клетки или в наличието на такива соматични стволови клетки като предпочитано примерно изпълнение на изобретението. За предпочитане, мезенхимните протогениторни соматични стволови клетки или нервните протогениторни соматични стволови клетки са получени чрез диференциация от стволова клетка съгласно изобретението.
Съгласно изобретението е осигурен медикамент (регенеративен терапевтичен), съдържащ соматични стволови клетки съгласно изобретението, както серия или смеси от соматични стволови клетки съгласно изобретението. Медикаментът може по-нататък да съдържа носеща субстанция или допълнителни субстанции, които са медицински и фармакологични приемливи. Настоящото изобретение е свързано, също така, с метод за използуване на USSC клетки или извличане от електролизьори или смеси от стволови клетки съгласно изобретението в терапията на гените, подмяната на органи, тестването на медикаменти, израстването in vitro на кръвоносни съдове, терапията на болести на кръвоносната система, костната система, както и на хепатит и панкреатични и нервни заболявания.
USSC клетките съгласно настоящото изобретение могат да бъдат приложени локално при нужда, например, с или без биоматериали.
В зависимост от вида на заболяването е подходящо локалното и/или системното прилагане на USSC клетки. USSC клетките могат да бъдат приложени директно или заедно с допустими лекарствени носители или помощни добавки. За препоръчване е добавяне на субстанции, които съдействуват за лечение на заболяванията. Например, при ортопедични приложения, субстанциите, които подобряват регенерирането на костите, могат да бъдат използувани заедно с USSC клетки.
Известните методи за прилагане на MSC клетките могат да бъдат приложени по аналогичен начин на начина, по който се използуват USSC клетки. Нещо повече, прилагането на стволови клетки е описано, например, в B.E.Straur et al. М. “Intracoronare, humane auttologe Stammzelltransplantation nach Herzinfarkt”, Dtsch med Wochenschr 2001, 126, 932-938; Quarto R. et al. “Repair of Large Bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells”, N Engl J Med 2001, 344, 385-386; Vacanti C.A., “Brief Report: Replacement of an avulsed phalanx with tissueengineered bone” N Engl J Med 2001, 344, 1511-1514, May 17, 2001; Hentz
V.R. “Tissue Engineering for reconstruction of the thumb” N Engl L Med 2001, 344, 1547-1548; Britterg M., “Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation”, N Engl L Med 1994q 331, 889895, Oct.6, 1994; Freed C.R., “Transplantation of embrionic dopamin neurons for severe Parkinson’s decease” N Engl L Med 2001, 344, 710-719; Shin’oka T., “Transplantation of tissue-engineered pulmolary artery”, N Engl L Med 200 lq 344, 532-533; Shapiro A.M., “islet transplantation in seven patientswith type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regiment”, N Engl L Med 2000q 343, 230-238. Тези цитирани материали са включени в описанието чрез посочването им.
Стволовите клетки съгласно изобретението са описани по-нататък в по-големи подробности.
Стволовите клетки съгласно изобретението са сраснали се една с друга една клетка с фибробластна форма и две или три нуклеоли (виж фигура 1), получени след третиране с трипсин етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA), повторна посявка при подходящи за културата условия (пример 1) и бързо разширение до израстване на една дълга разтегната морфология (фиг.2). Фигура 1 показва фотография под микроскоп на първична култура USSC клетки. Клетките са разстлани с ниска плътност, за да се демонстрира фибробластната морфология на USSC клетките. Тези клетки могат да бъдат отгледани лесно в повече от 14 пасажи на културата. Фигура 2 показва фотография под микроскоп на култури от слепени USSC клетки. Слоят от почти слепени USSC клетки показва едно паралелно ориентиране на клетките.
Фенотипът на повърхностния маркер на първичния слой прилепнали клетки, както и последващо получените от него пасажи, са и остават негативни за CD45 маркера. Фигура 3 показва активиран от флуоресценцията анализ на клетката (FACS) за CD45 антиген след приключване на in vitro курса на културата. CD45, характерен маркер антиген за кръвотворни клетки, почти не се открива в USSC клетките на по-късните пасажи (фиг. 3 на 48-ия, 54-ия, 82-ия ден).
След in vitro културата, използуваща метод А (пример 1), получените USSC клетки стават положителни за специфичното предишно състояние на антиген 4 (SSEA4) и показват хомогенно изразяване на тези ембрионални маркери. Фигура 4 показва FACS-анализи за SSEA4 ембрионални маркери. Клетките, отгледани чрез метод А (пример 1), показват силно видимо изразяване на специфичното състояние на предишния антиген 4 (SSEA4). В същото време, културите от USSC клетки са отрицателно изразени за повърхностния антиген HLA-class I (фиг.5А), за HLA-DR антиген (фиг.5В), както и за CD 14 (фиг.5С). Фигура 5 показва FACS-анализи за HLA-class I (A, В,С), HLA-DR и CD14. Културите от USSC клетки съгласно изобретението след разрастване in vitro са негативни за антигени HLA-class I (сектор А). Тези клетки са негативни, също, за повърхностни антигени HLA-DR (сектор В) и CD 14 (сектор С), характерни за антигени, представляващи клетки (HLA-DR) и моноцити (CD 14).
Фигура 6 показва FACS криви за CD34 повърхностен маркер. USSC клетките бяха отгледани в Н5100 или PEI за над 10 пасажа. През този период в културата беше наблюдавано значително нарастване на изявяването на CD34 антигена. По отношение на маркера CD34 на кръвотворни стволови клетки фигура 6 разкрива, че в пасажа 3 до 54 дни не са били открити положителни стволови клетки CD34. Напротив, в седмия пасаж на 82-ия ден се е появила нова положителна субпопулация на CD34. От друга страна, ако тези CD34 или/и FIF1 положителни протогениторни клетки бяха култивирани в подобрена с цитокин среда, специфична за кръвотворната диференциация, биха се развили типично смесени или кръвотворни колонии от червени и бели кръвни клетки-предшественици (CFU-GM и BFU-E) развити спрямо CD45+ кръвотворните протогениторни клетки (пример 9).
От друга страна, моноядрени клетки от кръв на пъпна връв за CD 14 са култивирани в среда, съдържаща високо съдържание на гликоза и те разкриват свойства на нервни стволови клетки. Фигура 7 показва фотография под микроскоп на USSC клетки съгласно изобретението, култивирани в среда Dilbecco’s modified eagle medium (DMEM) c висока концентрация на гликоза, които демонстрират морфология, подобна на тази на астроцит. Фигура 7 показва пример на такива култивирани клетки, показващи глиална морфология, получена след 13-ия дни в култура (пример 6). След като са били разширени с PEI, USSC клетките са изразени чрез маркера за нервна стволова клетка нестин. Първото наблюдение показва, че оцветяването с нестин е по-слабо изразено след като клетките са били стимулирани с нервни индуциращи агенти, като ретиноидна киселина (RA), основен фибробластен фактор на растеж bFGF, и нервен фактор на растежа β (NGF-β) (McKay, 1997).
Фигура 8 показва в детайли USSC клетки съгласно изобретението, изразени с маркера за нервна стволова клетка нестин. Фигура 8 А показва USSC клетки, които са били отгледани в среда Н5100 или PEI за 7 дни и са били подложени на стандартна анти-зачатъчна имунохистохимия. Фигура 8 В, показва клетките, които са били отгледани за 7 дни в Н5100 или PEI, последвани от 9 дни на индукция в Н5100 с RA, bFGF и NGF. Отбелязва се, че оцветяването с нестин е намалено в сравнение с клетките, отгледани при условия (А).
По-нататъшни анализи на тези клетки разкриват, също така, изразяване на протеинови свойства за нервни клетки подобни на γаминобутирична киселина (GABA, фиг.9 В), тирозин хидроксилаза (фиг. 9 В), синаптофизин (фиг. 9 D), неврофиламент (фиг. 9 F) или типично глиални антигени като глактоцереброзид (GalC, фиг.10 В) и глиални фибриларни киселинни протеини (GFAP, фиг.10 D). Фигура 9 показва
USSC клетки съгласно изобретението, генериращи клетки с невронен произход. USSC клетки съгласно изобретението бяха отгледани в Н5100 или PEI за 7 дни и пазени 27 дни върху Н5100, съдържащ RA, bFGF и NGF. След стандартните фиксиращи протоколи бяха приложени невронни специфични антитела. Фигури 9 А, 9 С, 9 D представляват фотографии с фазов контраст, фигури 9 В, 9 D, 9F представляват флуоресцентни фотографии на същите препарати от фиг. 9 А, 9 С, 9 D. Оцветителят на DNA DAPI (синьо) е използуван за да оцвети ядрата на клетките. Фигура 9 В представлява двойно-имунофлуорисцентна фотография, използуваща анти-GABA (червено), и анти-тиросин хидроксилаза (TH, зелено). Фигура 9 D показва оцветяване с анти-синаптофизин (зелено). Фигура 9 F показва оцветяване със специфичен невронен анти-неврофиламент (червено). Беше използувана смес от антитела срещу различни субтипове на неврофиламента. Фигура 10 показва USSC клетки съгласно изобретението, генериращи клетки с глиален произход. Клетките бяха подложени на същите условия като културата, както е показано на фигура 9. DAPI е в синьо. Фигури 9 А, 9 С показват фазо-контрастни фотографии. Фигура 9 В показва същите клетки, както се виждат от фиг.9 А, които са били подложени на анти-GalC имунооцветяване (червено). Фигура 9 D показва същата клетка от фиг.9 С, оцветена с анти-глиален фибриларен киселинен протеин (GFAP).
Ако по-горе описаните универсални стволови клетки са взети от който и да е от изразените пасажи и са индуцирани в DAG (дексаметазон, аскорбинова киселина, β-гликол фосфат), изпълняващ условията на културата или в среда, съдържаща фиброхектин, е индуцирана диференциация с остеногенен произход (пример 3). Както е показано в таблица 2 гените на специфични костни маркери (алкалин фосфатаза, остеокалцин, колаген тип I) са индуцирани лесно и могат да бъдат открити чрез RT-PCR.
Таблица 2: RT-PCR анализи по време на остеогенна диференциация на USSC клетки.
контрол 7 ден 14 ден
β-актин + + +
алкалин фосфатаза - + +
колаген тип I - + +
остеокалцин + + -
Всички гени на маркери на остеогенна диференциация показват повишено mRNA изразяване на 7-мия ден от DAG индукцията, β-актинът служи като позитивен контрол.
Фигура 11 показва минерализирано кълбовидно образование след остегогенно индуциране и след оцветяване с ализарин червен (В). Остеогенната диференциация на почти успоредните слоеве USSC беше индуцирана чрез добавяне на дексаметазон, аскорбинова киселина и βглицеролфосфат към среда на културата Н5100. На 10-ия ден от стимулирането се появиха характерните костни образования (11 А). Минералното депозиране на тези образования може да бъде демонстрирано чрез ализарин червен (11В). При тези условия на остеогенна индукция клетките съгласно изобретението претърпяват завършена остеогенна диференциация като демонстрираната чрез акумулиране на минерализирана кост в ясно изразени кълбовидни образования (фиг.11 А), които могат да бъдат оцветени с ализарин червен (фиг.НВ). Алтернативно, акумулирането на хидроксиапатит в клетъчната култура може да бъде открито след 6 дни чрез оцветяване с Kossa.
От тези резултати е очевидно, че кръвта от пъпната връв съдържа неоткрита досега стволова клетка, която може да бъде отгледана в големи количества. В допълнение, тази клетка може да бъде индуцирана, за да диференцира вътре в MSC клетки и да оформи там вътре в тях остеобласти, както вече беше демонстрирано чрез фигура 11 А. След приключване на индукцията с DAG може да бъде извършена по-нататъшна диференциация до създаването на минерализирани костни кълбовидни образования, както е показано на фигура 11В чрез оцветяване с ализарин червен.
Подвижността на клетките съгласно изобретението е очевидно поголяма, което е показано чрез хондрогенна диференциация след култивиране в DMEM гликоза с високо съдържание, съдържаща дексаметазон, пролин, натриев пируват, ITS+ премикс, и TGF-βΙ (Johnstone et al., 1998). На 0-вия и 14-ия ден от тези експерименти за диференциация, клетките бяха събрани и анализирани чрез RT-PCR (таблица 3, пример 4).
Таблица 3: RT-PCR анализи по време на хондрогенната диференциация на USSC клетки.
контрол 14-ти ден
β-актин (поз.контрол) + +
карт-1 - +
колаген тип II (несъединен) - +
хондроадхерин - +
На 14-ия ден от хондрогенната стимулация са изразени три характерни маркерни гена на протичащата хондрогенеза.
Резултатите от тези изследвания ясно демонстрират регулирането нагоре с карт-1, специфичен фактор на хондрогенна транскрипция 14 дни след хондрогенната стимулация. Нещо повече, mRNA транскрипцията за
два типично хрущялни извънклетъчни протеина (колаген тип II и хондроадхерин), също така, бяха регулирани нагоре. Следователно, ясно е, че клетките съгласно изобретението произвеждат извънклетъчен молекулен протогликан, типичен за хондроцитната диференциация, както е демонстрирано чрез оцветяване с алкиан син. Фигура 12 показва оцветяване с алкиан син на USSC клетки, извлечени от зърнеста култура. USSC клетките бяха отгледани като седиментационна култура в една хондрогенна среда за диференциация. След 6 дни в индуцираната среда не са открити съществени количества на протогликани (PG) като характерни маркери на хондрогенната диференциация чрез оцветяване с алкин син (фиг. 12 А). В отличие от това, лесно са открити протогликани като индицирани чрез син или зелен цвят (фиг. 12 В).
Наличието на специфичния за хрущяла колаген тип II може да бъде демонстрирано на протеиново ниво. Фигура 13 показва оцветяване с колаген тип II (зелено) на USSC култури след хондрогенна диференциация.
USSC клетките бяха култивирани в среда на хондрогенна диференциация. Изявяването на извънклетъчния матричен протеин колаген тип II на 14-ия ден беше демонстрирано чрез флуоресцентна макроскопия, използувайки анти-колаген тип II, първични антитела и FITC вторични антитела на мишка (фиг. 13 В).
По-нататък е показана подвижността на свободните стволови клетки чрез диференциация на същите описани по-горе при PEI-протокол отгледани култури в мастни клетки с висока концентрация на дексаметазон (пример 5).
Фигура 14 показва мастни клетки, които могат да бъдат оцветени специфично с Oil Red (Sigma). Адипоцитите са характеризирани чрез голямо количество вътреклетъчни мехурчета и със специфично червено оцветяване с Oil Red.
Нещо повече, когато USSC клетки са култивирани за 24 часа в Н5100 с 10 μΜ 5’-азацитидин и последващо с 100 ng/ml bFGF показват силно изразени данни за мускулна диференциация. Промяната в морфологията на клетката е приключила чрез изявяването на бавнодействуващ миозин (фиг. 15 и 16).
В допълнение, външността и пъпкуването на типично яйчните клетки е наблюдавано постоянно в късните преходи (фиг. 17), когато PEI индуцирани USSC клетки са субклонирани от CD34+, което е показано на фигура 6 (пример 8). Тези клетки изразяват в променяща се степен ензима дипептидил пептидаза IV, обозначавайки, че такива яйчни клетки могат да диференцират по-нататък вътре в клетки на черен дроб.
In vitro отгледаните USSC клетки оцеляват и се запазват след инжектиране вътре в регенериращите черни дробове на SCFD мишки с 50% частична хепатектомия както и не-хепатектомийни черни дробове, докато моноядрените клетки, извлечени от кръв на пъпна връв не могат да бъдат открити даже когато са били трансплантирани 25 порции с по-висока концентрация на клетки. Фигура 18 показва оцеляването и интегрирането на USSC култури след инжектиране вътре в паренхима на черния дроб на SCID мишка. Фигура 18 А показва червена флуоресценция 7 дни след трансплантацията, доказваща оцелелите и интегрирани човешки USSC съгласно изобретението, белязани с РКН26, вътре в тъкан от черен дроб на мишка (без хепатектомия). В контраст на това, след трансплантиране на моноядрени клетки, извлечени от кръв на пъпна връв (MNC) не беше открита червена флуоресценция, доказваща интегриране на човешките MNC клетки. Фигура 18 В показва крио-разрез на тъкан от черен дроб на мишка, съответствуващ на този от фиг. 18 А, изследван чрез предаваща светлина микрография на тъканта от черен дроб на мишка с интегрирани човешки USSC клетки.
Следователно предшественикът на чернодробни и панкреатични β изолирани клетки, такива като СВ-извлечени яйчни клетки, могат, също така, да бъдат диференцирани вътре в произвеждащите инсулин изолирани клетки, правейки ги полезен инструмент за клетъчна терапия на пациенти с диабет или на пациенти с хепатитни нарушения.
В допълнение към тези задължителни клинични приложения, всяка от тези добре характеризирани и разширени при стандартни условия компоненти на стволовите клетки, както и техните прогени могат да бъдат използувани, за да се наблюдават и дефинират въздействията и молекулярните и клетъчните ефекти на нови разработени фармакологични агенти, като по този начин, могат да заместят по същество експериментите, които са базирани на опити с животни.
Тези добре стандартизирани стволови клетки са диференцирани клетки, извлечени от култури на кръв от човешка пъпна връв и могат да се използуват като реагенти за оценяващ тест за фармацевтичната индустрия и при производството на биоматериали.
Препаратите от USSC клетки при определени подходящи условия за културата развиха съставни колонии от различен кръвотворен произход, осигурявайки доказателства, че тези клетки могат да нараснат до кръвотворство.
При определени условия на средата на културата с определени концентрации на VEGF, Fit 3L, SCGF (фактор на растеж на стволовите клетки) и в метил-целулоза тези клетки развиват смесени колонии с клетки, които също така са положителни за FLK1+ АС133+, Tell и Те12 маркери. При по-нататъшна диференциация беше развит профил на маркер, характерен за ендотелиални клетки с АС 133 отрицателен, CD31+, CD54+, VWF+, УЕ-цетерин+.
В настоящото изобретение е претендирана явната полезност на такива ендотелиални клетки за in vitro отглеждането на автологови и алогенни кръвоносни съдове за терапия на заболявания на кръвоносната система.
В същото време е ясно, че всички тези in vitro генерирани и хомогенно отгледани прогенитори и техните диференцирани клетки на клонирано ниво ще служат като изключително важен инструмент за дефиниране на ролята на специфични гени и на техните продукти в клетъчната биология и всички следващи медицински приложения ще се основават на клетъчно- или молекулно-осъществени терапии.
Само малък брой от тези уникални видове клетки са подходящи за генериране на големи количества от отгледани слепено USSC клетки съгласно изобретението, както и за повечето диференцирани мезенхимни стволови клетки за произвеждане на медицински приложими регенеративни видове клетки.
Един съвсем нов аспект на това познание е фактът, че такива предшественици могат да се развият асиметрично в два или повече ясно диференцирани вида клетки. Това открива нов биологичен принцип на многокомпонентно регулиране в регенерирането на функционално ориентирана клетка, намиращо приложение даже in vitro.
Последицата от това изобретение е, че терапиите, базирани на стволовата клетка съгласно изобретението, трябва да бъдат разработени съгласно този принцип, а не само да се свеждат до един тип клонцрана клетва. Цо-рататък изобретението е описано с иеорганичаващи го примери.
Пример 1
Събиране на кръв от пътна връв (СВ)
Събиране на кръв от пъпна връв беше изпълнено в отделенията по акушерство с информираното съгласие на майката. След раждането на бебето с плацента, намираща се още в матката на майката, пъпната връв беше прещипана двойно и отрязана напречно на 7-10 cm от пъпа. След дезинфекция на пъпната връв, пъпната вена беше продупчена и кръвта от нея беше събрана в торбички, съдържащи декстроза на цитрат фосфат (CPD), служеща като антикоагулант.
Изолиране на моноядрени клетки от кръвта на пъпната връв
Кръвта от пъпната връв беше заредена внимателно в разтвор на фикол (плътност 1.077 g/cm3). Беше извършено центрофугиране в плътност градиент (450 g, стайна температура, 25 минути). Моноядрените клетки (MNC) на вътрешната фаза бяха събрани и измити два пъти в буферен фосфатен салин, pH 7,3 (PBS).
Генериране на слепени слоеве с фибробластоидна морфология
Моноядрените клетки бяха разстлани с плътност от около 5x103 клетки/cm2 в Т25 колби за култура (Nunclon) [А), В), С)]. Бяха използувани четири различни метода за отглеждане на култура, за да се инициира растеж на слепен стволови клетки:
A) СВ-извлечените MNC клетки бяха отгледани първоначално в среда миелокулт Н5100 (StemCell Technology, Vancouver/Canada), съдържаща ΙΟ7 М дексаметазон.
B) СВ-извлечените MNC клетки бяха отгледани първоначално в «7 среда мезенкулт (StemCell Technology, Vancouver/Canada), съдържаща 10' М дексаметазон.
C) В-извлечените MNC клетки бяха отгледани първоначално в DMEM гликоза с ниско съдържание (Bio-Whittaker) с 30% FCS, съдържаща •Ί
10' М дексаметазон.
D) CB-извлечените MNC клетки бяха разстлани с плътност 5xl06/ml миелокулт Н5100 (StemCell Technology, Vancouver/Canada) в 50 ml колби за култура (Nunclon) без дексаметазон.
Всички култури бяха инкубирани при 37°С в 5% СО2 в напълно овлажнена атмосфера и бяха подхранвани веднъж седмично чрез отстраняване на отработената среда с не-прилепналите клетки и добавяне на 10 ml свежа среда. След известно време се показаха слепени клетки с формата на вретено, които бяха отстранени чрез третиране с 0.05% трипсин и 0.53 mM EDTA за 2 min, промити с 50% серум сдържаща среда, събрани чрез центуфугиране до 780g и анализирани чрез проточна цитометрия или RT-PCR. След две до три седмици слепените клетки на фибробластоидната морфология се появиха в около 30% от културата от клетки.
Условия за отглеждане на култура от USSC клетки съгласно изобретението
USSC клетки съгласно изобретението могат да бъдат отгледани в Н5100 среда, съдържаща 10 ng/ml IGF I (инсулиноподобен фактор на растеж-1), 10 ng/ml PDGF-BB (тромбоцит-извлечен фактор-ВВ на растеж) и 10 ng/ml EGF (рекомбинант човешки епидермален фактор на растеж) (PEI среда) при плътност в обхвата от 1х104 до lxlO3 клетки/ml (метод на израстване А). Алтернативно, USSC проби могат да бъдат израстнати и в първоначалната среда за отглеждане А, В, С.
Пример 2
Имунофенотип на клетки чрез цитофлуорометрия
С цел да се определи имунофенотипа на USSC клетките, клетките бяха оцветени с FITC-свързани анти-СО45 (Becton Dickinson, Coulter), РЕ свързани анти-СО14 (PharMingenq Coulter), aHTH-SSEA-4 (MC-813-70) белязани c F(ab')2 анти-мишка IgG+IgM (H+L)-FITC (Courier), анти-CDlO22
PE (CALLA,PharMingen), анти-НЬА-клас I (Courier) белязан c F(ab')2, антимишка IgG+IgM (H+L)-FITC, анти-СО13-РЕ (Becton Dickinson, Coutler), анти-СО29 (Coutler), анти-СО44 (Coutler), анти-СО49е (Coutler), анти-СО90 (Coutler), анти-НЕА-клас II-FITC (Coutler). Клетките бяха анализирани, използувайки EPICS (Coulter) или FACS (Becton Dickinson) анализатор.
Пример 3
Демонстриране на възможността за остеогенна диференциация на USSC клетки
USSC клетките, получени както беше описано в пример 1, бяха култивирани в стандартна среда докато достигнаха 70% слепване. Остеогенната диференциация на тези клетки беше индуктирана чрез добавяне на ΙΟ’7 М дексаметазон, 50 pg/ml аскорбинова киселина, 10 шМ βглицеролфосфат (Bruder et al., 1994, Jaiswal et al., 1997). Ha 10-ия ден от стимулацията, клетките показаха отлагане на калциев фосфат, изразяващ се в костни кълбовидни образования. Минерализираните костни образования бяха открити чрез оцветяване с ализарин червен както следва: прилепналите клетки в културата бяха измити два пъти с PBS, pH 7.3 и оцветени с 5 ml 0.1% разтвор на ализарин червен за един час при стайна температура и последващо измити с 0.1% оцетна касиелина и чист етанол, както и с PBS. Оцветяването с ализарин червен и вон косса на калций демонстрира възможността за минерализация на тези клетки (Stahford et al., 1995, Rungby et al., 1993). Остеогенната диференциация беше демонстрирана чрез RT-PCR, използувайки специфичните маркери за костна диференциация - остеокалцин (ОС), остеопонтин (ОР), специфичния костен алкалин фосфат (АР), специфичния костен протеин (BSP), тромбоцид-извлечен рецептор алфа (PDGF-Ra) на фактора на растеж, рецептор на епидермалния фактор на растеж (EGFR) и колаген тип I.
Пример 4
Демонстриране на възможността за хондрогенна диференциация на USSC клетките
За хондрогенна диференциация 2x103 слепени стволови клетки бяха поставени в седиментационна култура в 15 ml полипропиленови съдове. Като среда за клетъчна култура беше използувана DMEM гликоза с високо съдържание, съдържаща дексаметазон, пролин, натриев пируват, ITS+ премикс и TGF-βΙ (Johnstone et al., 1998, Yoo et al., 1998). Ha 7-мия, 14-ия и 21-ия ден фракциите от клетки бяха анализирани чрез RT-PCR за специфични хрущялни генни продукти, кодирани като Cartl, колаген тип II и хондроадерин. В допълнение, USSC клетките бяха използувани в други сидементационни култури. След две седмици бяха фиксирани Dewax разрези с 4% параформалдехид за 15 минути при стайна температура и измети в етанол. Разрезите бяха оцветени в 1% алкин син или с 3% оцетна киселина, pH 2,5 (Sigma) за 5 минути и измити в дестилирана вода. Те ясно показаха положително оцветяване на специфични протогликани, както е показано чрез оцветяване с алкин син (фиг. 12) (Chao, G et al., 1993). След един период на хондрогенна индукция от 14 дни клетките бяха фиксирани съгласно стандартен протокол и анализирани чрез флуоресцентна микроскопия (Rosenbaum et al., 1998), показвайки наличието на специфична извънклетъчна матрица на колаген тип II (фиг. 13 В).
Пример 5
Демонстриране на възможност за адипогенна диференциация на USSC клетки
USSC клетки бяха култивирани в Н5100, съдържащ 10'6 дексаметазон, 50 pg/ml аскорбинова киселина и 10 тМ β-глицеролфосфат, получавайки частична диференциация на USSC клетките до адипоцити, както е демонстрирано чрез оцветяване с Oil Red (Ramirez-Zacarias et al., 1992).
Пример 6
Демонстриране на възможността за неврогенна диференциация на USSC клетки
Изолиране на клетки и условия за култура от глиални клетки
Моноядрените клетки от пъпна връв, извлечени, както беше описано по-горе, бяха развити за CD 14+ клетки чрез магнитно сортиране на активирани клетки (MACS) на CD 14 и чрез система за изолиране, прилагаща VS+ сепариране на колонии съгласно инструкциите на производителя (Miltenyi Biotec, Bergsch Gladbach). Отделените моноядрени клетки CD 14 бяха култивирани при плътност от 2xl06/ml в 10 ml среда с високо съдържание на гликоза (Dulbecco’s MEM with 4500 G/L Glucose) вътре в T25 колби за култура (Nunclon) и инкубирани при 37°С в напълно влажна атмосфера. След 10-15 дни в културата бяха открити клетки с глиална форма.
Диференциация до нервни клетки
А) клетките бяха израстнати за 7 дни или в чиста среда Н5100 или в същата среда с наличие на 40 pg/ml PDGFB, 10 pg/ml IGF-I. Клетките бяха трипсинизирани и разстлани при плътност от около 3,5x10 клетки/cm в 24 добре напълнени широки плоски съда върху покривни стъкла, покрити с поли D-лизин (PDL) и ламинин (PDL/lam). Последващата, невронна диференциация беше инициирана чрез добавяне на агенти за индукция като универсална-транс ретиноидна киселина (ΙΟ’3 М), bFGF (20ng/ml) и NGF-β (50 ng/ml).
Флуоресцентна микроскопия
След период на индукция (27 дни) клетките бяха фиксирани съгласно стандартен протокол (Rosenbaum et al., 1998) и оцветени с антитела срещу специфични нервни антигени. Препаратът беше анализиран, използувайки флуоресценция и излъчваща светлина микроскопия.
Пример 7
Демонстриране на възможност за диференциация с миоцитен произход lxlO4 USSC клетки бяха култивирани в Н5100 среда (StemCell Technology) с добавяне на 10 ng/ml PDGFBB, 10 ng/ml EGF, 10 ng/ml IGF при 37°C, 5% CO2 докато достигнаха около 70% сливане. След това клетките бяха инкубирани с 10 μΜ 5’-азацитидин (Sigma) за 24 часа, измити два пъти с PBS и култивирани в Н5100 среда с прибавени 100 ng/ml bFGF (Sigma). След една седмица в средата за диференциация, морфологията на клетките се промени (фиг. 15). След 10 дни клетките бяха трипсинизирани и прехвърлени за имунно оцветяване върху стъклена камера, покрита с фибронектин.
Имунохистохимия.
Клетките бяха фиксирани с 5% формалдехид или с PBS за 15 минути и измити два пъти в PBS, pH 7.3. Използувайки стандартен протокол, клетките бяха инкубирани с антискелетен миозин (бавен) специфично първично антитяло (клон NOQ7.5.4D, 1:400), (показан в зелено) и с анти-СО13 първично антитяло (показано в червено) или моноклонингово антискелетно първично антитяло миозин (клон MY-32,
1:4000). Оцветяването беше положително за USSC клетки, култивирани при горе описаните условия (фиг.16).
Пример 8
Човешки USSC клетки, както и моноядрени клетки извлечени от кръв на пъпна връв (MNC) бяха белязани с РКН26 RED Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, PKH26-GL). 2x103 MNS клетки бяха инжектирани в паренхима от черен дроб на SCID мишка с и без 50% хепатектомия. Седем дни след извършената трансплантация за животните с хепатектомия беше получена завършена регенерация на черния дроб. Тъканта на черния дроб беше анализирана чрез флуоресцентна микроскопия на крио-сечения за наличие на червено белязани човешки клетки (фиг.18).
Пример 9
Демонстриране на възможност за диференциация на USSC клетки вътре в клетки с кръвотворен произход
Три различни USSC проби (USSCKSB55 в DMEM среда, съдържаща 30% FCS, USSCKSB12 в среда Н5100, съдържаща дексаметазон, USSCKSB13 в MesenCult среда, съдържаща дексаметазон и USSCKSB12 в Н5100 среда, съдържаща PEI) бяха отгледани в подходяща среда за израстване за определени периоди на израстване (пасажи 5 до 8) и бяха посети в 250 μΐ (2х104 - 2х105 клетки) клетъчна суспензия в трипликат в 24 добре изравнение плоскости в среда на специфична кръвотворна култура (Methocult 4434). Бяха изброени колонии на повече от 50 клетки и класифицирани като извлечени от гранулоцит или макрофага (CFU-GM), ранен еритроид (BFU-E) или мултипотент (CFU-GEMM) клеткипредшественици съгласно установения критерий. Формирането на колонии в различните култури беше започнало очевидно от първата седмица на наблюдението и приключено до 3 седмици при определените условия на диференциация. USSC пробите развиха серия колонии с различен произход, осигурявайки доказателство, че тези клетки могат да дадат ръст до кръвотворство.
Пример 10
Молекулни методи за анализиране на свободни соматични стволови клетки и техните продукти, получени чрез последваща диференциация
PCR-изходни продукти за използуване на специфични cDNA поредици от остеокалцин, остеопонтин, костен сиало-протеин, алкалин фосфатаза, PDGFRa и EGF рецептор бяха избрани от ясно изразени ексзони, с цел да се осигури възможност те да бъдат разграничени по размера на съответно генерираните DNA фрагменти.
Чрез клониране вътре в pCRLl вектор (Invitrogen/USA) и последващо трансформиране в E.coli strain TOP 10F бяха получени и характеризирани съответните специфични cDNA клони чрез циклична поредица с автоматизиран секвенсер (Applied Biosystems).
RT-PCR реакциите бяха изпълнение в двустепенна процедура. Общо 200 ng RNA от клетките първо са презаписани реверсивно с 10 U AMV Revers Transcriptase (Promega, Mannheim), 1.5 pmol 3’-гении специфични примери, 1 mM dNTP и добавен буфер (Promega, Mannheim) в обем от 20 pl за 1 час при 50°С. PCR реакцията беше изпълнена с 2 μΐ от cDNA с 1 U HotStarTaq DNA полимераза, буфер и Q-воден разтвор (Qiagen, Hilden), 1.5 mM dNTP и 20 pmol специфичен пример на 3’- и 5’-ген. PCR реакцията беше проведена с операция линеализиране за 15 минути при 95°С, 37 цикъла при 94°С за 30 секунди, 56°С за 30 секунди, 68°С за 1 минута и крайна операция полимеризация за 5 минути при 68°С.
Таблица 4: PCR-примери за прилагане на специфични cDNA поредици
Таблицата показва поредиците на 3’- и 5’-гени примери на изпитаните и очакваните дължини на PCR-фрагмента в Ьр.
name 5'primer sequence 3'primer sequence bp
PDGFR alpha acagtggagattacgaatgtg cacarcagtggtgatctcag 251
IGFR cgagtggagaaatctgcgg gaccagggcgtagttgtag 272
EGFR tgccacaaccagtgtgct ccacataattacggggacac 205
Neurofilament attcgcgcgcagcttgaag cctggtaggaggcaatgtc 265
GFAP ctctccctggctcgaatgc cctcctgataactggccg 871
Synaptophysin cctgcagaacaagtaccgag ccttgctgcccatagtcgc 516
Tyrosine hydroxylase caccttcgcgcagttctcg ctgtccagcacgtcgatgg 387
YB1 ggtgaggaggcagcaaatgt agggttggaatactgtggtc 279
Runxl gcaagctgaggagcggcg gaccgacaaacctgaagtc 296
AMLlc cagtgcttcatgagagaatgc gaccgacaaacctgaagtc 453
Cart-1 ggagacgctggacaatgag ggtagctgtcagtccttggc 560
CD105 cctgccactggacacagg atggcagctctgtggtgttg 411
Collagen Тур I ggacacaatggattgcaagg aaccactgctccactctgg 441
Collagen Тур II tttcccaggtcaagatggtc cttcagcacctgtctcacca 377
Osteocalcin agtccagcaaaggtgcagc ggccgtagaagcgccgat 231
alkaline phosphatase gcttcagaagctcaacacca cgttgtctgagtaccagtcc 454
beta actin gagaaaatcttgcaccacac ctcggtgaggatcttcat 340
ЦИТИРАНА ЛИТЕРАТУРА
Bruder S., Fink DJ., and Caplan Al. (1994). Mesenchymal stem cells in bone formation, bone repair, and skeletal regeneration therapy. J. Cell. Biochem. 56: 284.
Caplan, AL, Mesenchymal stem cells. (1991) J. Orthop. Res. 9: 641-50.
Grompe, M and Finegold MJ. Liver Stem Cells. / p. 455 - 497 from Stem Cell Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
Grompe, M. and Finegold MJ. Liver stem cells . p. 455-497 from Stem Cell Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
Ф Hall, C. L.; Yang, B.; Yang, X.; Zhang, S.; Turley, M.; Samuel, S.; Lange, L.
A.; Wang, C.; Curpen, G. D.; Savani, R. C.; Greenberg, A. H.; Turley, E. A. :
Overexpression of the hyaluronan receptor RHAMM is transforming and is also required for H-ras transformation. Cell 82: 19-26, 1995.
Itano, N.; Kimata, K. Expression cloning and molecular characterization of HAS protein, a eukaryotic hyaluronan synthase. J. Biol. Chem. 271: 9875-9878, 1996
Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan Al, Bruder SP. Osteogenic differentiation of · purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 1997 Feb;64(2):295-312.
ф Johnstone B, Hering TM, Caplan Al, Goldberg VM, Yoo JU. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp Cell Res. 1998 Jan 10;238(l):265-72.
Knittel T, Kobold D, Piscaglia F, Saile B, Neubauer K, Mehde M, Timpl R, Ramadori G. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol 1999 Nov;112(5):387-401 .30
Kritzik M.R. and Sarvetnick N. Pancreatic Stem Cells, p. 499 - 513 from Stem Cell Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
Mareschi K, Biasin E, Piacibello W, Aglietta M, Madon E, Fagioll F. Haematologlca 2001 Oct;86(10) :1099-100. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood.
Pan, T.-C.; Sasaki, T.; Zhang, R.-Z.; Fassler, R.; Timpl, R.; Chu, M.-L. : Structure and expression of fibulin-2, a novel extracellular matrix protein with multiple EGF-like repeats and consensus motifs for calcium binding. J. Cell Biol. 123: 1269-1277, 1993.
Ramirez-Zacarias JL, Castro-Munozledo F, Kuri-Harcuch W. Histochemistry 1992 Jul;97(6):493-7. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with Oil red O.
Rosenbaum, C., Kluwe, L., Mautner, VF., Friedrich, R.E., Muller, HW., Hanemann, CO. (1998): Enhanced proliferation and potassium conductance of Schwann cells isolated from NF2 schwannomas can be reduced by quinidine. Neurobiol Dis 5, 55-64.
Rungby J, Kassem M, Eriksen EF, Danscher G. Histochem J. 1993 Jun;25(6):446-51. The von Kossa reaction for calcium deposits: silver lactate staining increases sensitivity and reduces background.
Stanford CM, Jacobson PA, Eanes ED, Lembke LA, Midura RJ. J Biol Chem 1995 Apr 21;270(16):9420-8. Rapidly forming apatitic mineral in an osteoblastic cell line (UMR 106-01 BSP).
Shapiro A.M. J., Lakey J. R.T., Ryan E. A., Korbutt G. S., Toth E., Warnock G. L., Kneteman Ν. M., Rajotte R. V. N Engl J Med 2000 Jul 27; (343):230-238. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.
Sztrolovics, R.; Chen, X.-N.; Grover, J.; Roughley, P. J.; Korenberg, J. R. :
Localization of the human fibromodulin gene (FMOD) to chromosome lq32 and completion of the cDNA sequence. Genomics 23: 715-717, 1994.
Tsuda T, Wang H, Timpl R, Chu ML. Fibulin-2 expression marks transformed mesenchymal cells in developing cardiac valves, aortic arch vessels, and coronary vessels. Dev Dyn 2001 Sep;222(1).'89-100
Van der Schoot, C. E.; Huizinga, T. W. J.; Gadd, S. K.; Majdic, 0.; Wijmans, R.; Knapp, W.; Von dem Borne, A. E. G. : Identification of three novel PIlinked proteins on granulocytes.In: Knapp, W.; Dorken, B.; Gilks, W. R.; Rieber, Е. P.; Schmidt, R. E.; Stein, H.; Von dem Borne, A. E. G. K. : Leukocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens. Oxford: Oxford Univ. Press (pub.) 1989. Pp. 887-891
Yoo JU, Barthel TS, Nishimura K, Solchaga L, Caplan Al, Goldberg VM, Johnstone B. The chondrogenic potential of human bone-marrow-derived mesenchymal progenitor cells,. J Bone Joint Surg Am. 1998 Dec;80(12) :174557.
Zhang, R.-Z.; Pan, T.-C.; Zhang, Z.-Y.; Mattei, M.-G.; Timpl, R.; Chu, M.-L. : Fibulin-2 (FBLN2): human cDNA sequence, mRNA expression, and mapping of the gene on human and mouse chromosomes. Genomics 22: 425-430, 1994.
ИЗПОЛЗУВАНИ СЪКРАЩЕНИЯ
DAG остеогенна среда за диференциация, съдържаща
дексаметазон, аскорбинова киселина и β-глицеролфосфат
HLA антиген на човешки левкоцит
MSC мезенхимна стволова клетка
PEI среда, съдържаща PDGF-BB, EGF и IGF
SSEA4 начален антиген 4 на специфичен етап
USSC свободна соматична стволова клетка
PG протеогликани
RNA рибонуклеинова киселина
MNC моноядрена клетка
FACF активиран от флуоресценцията анализ на клетка
EGF-R рецептор на епидермалния фактор на растеж
PDGF-RA плоскостен рецептор на извлечен фактор на растеж
IGF-R рецептор на инсулинов фактор на растеж
AML1C фактор на копиране на остра миелоидна левкемия
TH тироксин хидроксилаза
GFAP глиален фибрален киселинен протеин
EDTA етилендиаминтетраоцетна киселина
DMEM Dilbecco’s modified eagle medium
RA ретиноидна киселина
FGF фибробластен фактор на растеж
NGF нервен фактор на растеж
GABA гама-аминобутирична киселина
GalC глактоцереброзид
ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

Claims (11)

  1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
    1. Свободни соматични стволови клетки (USSC) извлечени от кръв на човешка пъпна връв, кръв на плацента и/или кръвни проби от новородено, които са различни от и са в състояние да диференцират вътре в мезенхимни стволови или протогениторни клетки, в стволови с кръвотворен произход или протогениторни клетки, в нервни стволови или протогениторни клетки или в ендотелиални стволови или протогениторни клетки.
  2. 2. Свободни соматични стволови клетки съгласно претенция 1, реагиращи отрицателно с маркери, специфични за CD45 и CD 14, и положително с маркери за повърхностните антигени CD13, CD29, CD44 и CD49e.
  3. 3. Свободни соматични стволови клетки съгласно претенция 1, реагиращи положително с маркера SSEA4 на ембрионална стволова клетка след култивиране в подходяща среда и изявяващи факторите на транскрипция YB1, AML-1 и RUNX-1.
    Ф
  4. 4. Свободни соматични стволови клетки съгласно претенция 1, различаващи се от мезенхимните стволови клетки, базирани на източник на тъкани за изолиране и изявяване на проби с повърхностни антигени (HLA I), както и с фактори на транскрипция.
  5. 5. Свободни соматични стволови клетки съгласно претенция 1, различаващи се от MSC клетките, базирани на изявяване с fibulin-2 (генна банка № Х82494) и липса на изявяване с хиалуронен синтез (D84424), фибромодулин (U05291), 1NFLS (WO3846), както е установено чрез афиметричен анализ.
  6. 6. Свободни соматични стволови клетки съгласно претенция 1, имащи фибробластна форма на клетките с изисквания за свързано израстване.
  7. 7. Серия или смеси от свободни соматични стволови клетки съгласно претенция 1, като соматичните стволови клетки са с кръвотворен произход, изявявани, за предпочитане, с АС 133 и CD34, мезенхимни протогениторни соматични стволови клетки, нервни протогениторни соматични стволови клетки или комбинация от тях.
  8. 8. Серия или смеси от свободни соматични стволови клетки съгласно претенция 7, в които мезенхимните протогениторни клетки или нервните протогениторни клетки са диференцирали от стволови клетки съгласно претенция 1.
  9. 9. Медикамент, съдържащ свободни соматични стволови клетки съгласно коя и да е претенция от 1 до 6 или серия или смеси от свободни соматични стволови клетки съгласно претенция 7 и/или 8.
  10. 10. Метод за използуване на свободни соматични стволови клетки съгласно коя и да е претенция от 1 до 6 или серия или смеси от свободни соматични стволови клетки съгласно претенция 7 и/или 8 в генната терапия, замяната на органи, тестуването на медикаменти, тестуването на биоматериали, съдържащи ортопедични устройства, отглеждането in vitro на кръвоносни съдове, лечението на болести на кръвоносната система, сърцето или гладката мускулатура, хепатит, болести на костите, панкреаса или нервите.
  11. 11. Метод за изолиране и пречистване на свободни соматични стволови клетки съгласно коя и да е претенция от 1 до 6, който се свежда до операциите изолиране в плътност градиент, култивиране на слепени клетки и използуване на фактори на растеж на субкултури.
BG107770A 2000-11-03 2003-04-30 Извлечени от кръв на човешка пъпна връв свободни соматични стволови клетки BG107770A (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US24516800P 2000-11-03 2000-11-03
PCT/EP2001/012768 WO2002036751A2 (en) 2000-11-03 2001-11-03 Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (ussc)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG107770A true BG107770A (bg) 2004-02-27

Family

ID=22925565

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG107770A BG107770A (bg) 2000-11-03 2003-04-30 Извлечени от кръв на човешка пъпна връв свободни соматични стволови клетки

Country Status (25)

Country Link
US (3) US7560280B2 (bg)
EP (1) EP1404815B1 (bg)
JP (2) JP4799804B2 (bg)
CN (1) CN100480375C (bg)
AT (1) ATE340255T1 (bg)
AU (2) AU2953302A (bg)
BG (1) BG107770A (bg)
CA (1) CA2426987C (bg)
CY (1) CY1106287T1 (bg)
CZ (1) CZ20031165A3 (bg)
DE (1) DE60123293T2 (bg)
DK (1) DK1404815T3 (bg)
EA (1) EA008619B1 (bg)
EE (1) EE200300205A (bg)
ES (1) ES2272563T3 (bg)
HK (1) HK1071771A1 (bg)
HU (1) HUP0301600A3 (bg)
IL (2) IL155608A0 (bg)
MX (1) MXPA03003844A (bg)
NO (1) NO20031999L (bg)
PL (1) PL362293A1 (bg)
PT (1) PT1404815E (bg)
SK (1) SK5242003A3 (bg)
UA (1) UA81390C2 (bg)
WO (1) WO2002036751A2 (bg)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE292473T1 (de) * 1998-07-30 2005-04-15 Us Gov Health & Human Serv Thymosin beta 4 stimuliert wundheilung
US8609412B2 (en) * 1999-08-05 2013-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mapc generation of lung tissue
ATE514772T1 (de) * 1999-08-05 2011-07-15 Abt Holding Co Multipotente erwachsene stammzellen und verfahren zu deren isolierung
US8075881B2 (en) * 1999-08-05 2011-12-13 Regents Of The University Of Minnesota Use of multipotent adult stem cells in treatment of myocardial infarction and congestive heart failure
US7015037B1 (en) 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
US10638734B2 (en) 2004-01-05 2020-05-05 Abt Holding Company Multipotent adult stem cells, sources thereof, methods of obtaining and maintaining same, methods of differentiation thereof, methods of use thereof and cells derived thereof
US7927587B2 (en) * 1999-08-05 2011-04-19 Regents Of The University Of Minnesota MAPC administration for the treatment of lysosomal storage disorders
US8252280B1 (en) 1999-08-05 2012-08-28 Regents Of The University Of Minnesota MAPC generation of muscle
IL157332A0 (en) * 2001-02-14 2004-02-19 Multipotent adult stem cells, sources thereof, methods of obtaining and maintaining same, methods of differentiation thereof, methods of use thereof and cells derived thereof
JP2005502672A (ja) * 2001-08-29 2005-01-27 リジェナークス・バイオファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド サイモシンβ４、類似体、アイソフォームおよびその他の誘導体を用いて心筋障害の発生前、発生中または発生後に発生する炎症、損傷およびその他の変化を治癒または予防する方法
DE10144326B4 (de) * 2001-09-10 2005-09-22 Siemens Ag Verfahren und System zur Überwachung eines Reifenluftdrucks
DE10158680B4 (de) * 2001-11-30 2004-04-08 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Verfahren zur ex vivo-Expansion und -Differenzierung von multipotenten Stammzellen
US20050214940A1 (en) * 2002-01-23 2005-09-29 Rao Mahendra S Pure populations of astrocyte restricted precursor cells and methods for isolation and use thereof
WO2003070922A1 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 Medipost Co., Ltd. Isolation and culture-expansion methods of mesenchymal stem/progenitor cells from umbilical cord blood, and differentiation method of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem/progenitor cells into various mesenchymal tissues
CN1717177A (zh) 2002-11-26 2006-01-04 人类起源公司 细胞治疗剂、细胞治疗单元及其用于治疗的方法
US20060228798A1 (en) 2002-11-27 2006-10-12 Catherine Verfaillie Homologous recombination in multipotent adult progenitor cells
JP4672370B2 (ja) * 2002-12-05 2011-04-20 ケース ウエスタン リザーブ ユニバーシティ 虚血の細胞ベースの治療
US7470538B2 (en) * 2002-12-05 2008-12-30 Case Western Reserve University Cell-based therapies for ischemia
JP3762975B2 (ja) * 2003-03-18 2006-04-05 学校法人慶應義塾 単球由来多能性細胞ｍｏｍｃ
US20040203142A1 (en) * 2003-04-14 2004-10-14 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Growth of neural precursor cells using umbilical cord blood serum and a process for the preparation thereof for therapeutic purposes
ATE510005T1 (de) 2003-06-27 2011-06-15 Univ Laval Verfahren zur isolierung von zellen aus der nabelschnur
WO2005001079A2 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Ethicon, Incorporated Soft tissue repair and regeneration using postpartum-derived cells
US8790637B2 (en) 2003-06-27 2014-07-29 DePuy Synthes Products, LLC Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
DE602004031033D1 (de) * 2003-10-09 2011-02-24 Core Dynamics Ltd Verfahren zum tiefgefrieren, auftauen und transplantieren von lebensfähigem knorpel
AU2004296848A1 (en) 2003-12-04 2005-06-23 Regents Of The University Of Minnesota Compositions and methods for the treatment of lysosomal storage disorders
EP1708757A4 (en) * 2003-12-19 2007-01-17 Viacell Inc USE OF PLURIPOTENTIAL CELLS TAKEN FROM HUMAN CORDIAL BLOOD BLOOD FOR THE TREATMENT OF DISEASE
EP1544290A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-22 Yu-Show Fu A cell system for generating somatic cells
GB0329449D0 (en) * 2003-12-19 2004-01-28 Omnicyte Ltd Stem cells
WO2005072790A1 (en) * 2004-02-02 2005-08-11 I.M.T. Interface Multigrad Technology Ltd. Device for directional cooling of biological matter
WO2005072523A2 (en) * 2004-02-02 2005-08-11 I.M.T. Interface Multigrad Technology Ltd. Biological material and methods and solutions for preservation thereof
AU2004316477B2 (en) 2004-02-11 2010-10-07 Aldagen, Inc. Stem cell populations and methods of use
EP1747265B1 (en) * 2004-04-23 2011-04-20 BioE LLC Multi-lineage progenitor cells
US7622108B2 (en) 2004-04-23 2009-11-24 Bioe, Inc. Multi-lineage progenitor cells
US20070298015A1 (en) * 2004-04-28 2007-12-27 Viacell, Inc. Treatment of Muscular Dystrophy with Mobilized Peripheral Blood Pluripotent Cells
US20050265980A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Becton, Dickinson And Company Cell culture environments for the serum-free expansion of mesenchymal stem cells
WO2005120591A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-22 I.M.T. Interface Multigrad Technology Ltd. Method for sterilization of biological preparations
EP1778007A1 (en) * 2004-08-12 2007-05-02 I.M.T. Interface Multigrad Technology Ltd. Method and apparatus for freezing or thawing of a biological material
WO2006074308A2 (en) * 2005-01-07 2006-07-13 Wake Forest University Health Sciences Regeneration of pancreatic islets by amniotic fluid stem cell therapy
WO2006086639A1 (en) * 2005-02-10 2006-08-17 Regents Of The University Of Minnesota Vascular/lymphatic endothelial cells
EP1850661A2 (en) * 2005-02-22 2007-11-07 Interface Multigrad Technology (IMT) Ltd. Preserved viable cartilage, method for its preservation, and system and devices used therefor
CN101575590B (zh) * 2005-02-28 2012-05-23 中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心 人脐带间充质干细胞的制备方法
EP1874922A4 (en) * 2005-04-19 2009-10-28 Univ Johns Hopkins METHOD USING STROMA CELLS FROM UMBILICAL CORD BLOOD TO DEVELOP AND GRAFT NUCLEAR CELLS DERIVED FROM UMBILICAL CORD BLOOD
US20080311084A1 (en) * 2005-05-05 2008-12-18 Verfaillie Catherine M Mapc Engraftment in the Hematopoietic System
AU2005331559B2 (en) * 2005-05-05 2012-04-19 Regents Of The University Of Minnesota Use of NK cell inhibition to facilitate persistence of engrafted MHC-I negative cells
JP2008545703A (ja) * 2005-05-27 2008-12-18 バイアセル インコーポレーティッド 幹細胞を用いた虚血の処置
WO2007117262A2 (en) * 2005-07-29 2007-10-18 Athersys, Inc. Culture of non-embryonic cells at high cell density
WO2007015252A2 (en) 2005-08-03 2007-02-08 I.M.T. Interface Multigrad Technology Ltd. Somatic cells for use in cell therapy
JP2007528229A (ja) * 2005-08-26 2007-10-11 ソウル ナショナル ユニバーシティ インダストリー ファウンデーション 臍帯血から分離された多能性幹細胞及びこれを含有する虚血性壊死疾患治療用細胞治療剤
JP2009511061A (ja) 2005-10-14 2009-03-19 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 膵臓表現型を有する細胞への非胚性幹細胞の分化
AU2006325710B2 (en) 2005-12-16 2012-05-17 Ethicon, Inc. Compositions and methods for inhibiting adverse immune response in histocompatibility-mismatched transplantation
US9125906B2 (en) 2005-12-28 2015-09-08 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells
EP2471904B1 (en) 2005-12-29 2018-10-24 Celularity, Inc. Placental stem cell populations
CA2646491A1 (en) * 2006-04-17 2007-10-25 Bioe, Inc. Differentiation of multi-lineage progenitor cells to respiratory epithelial cells
US7875453B2 (en) * 2006-06-14 2011-01-25 Bioe Llc Differentiation of multi-lineage progenitor cells to hepatocytes
CN101611139B (zh) * 2006-11-13 2012-07-04 伊西康公司 利用微载体的产后来源的细胞的体外扩增
WO2008085229A2 (en) * 2006-11-15 2008-07-17 Arteriocyte Inc. Cell-based therapies for treating liver disease
AU2007321928A1 (en) * 2006-11-24 2008-05-29 Regents Of The University Of Minnesota Endodermal progenitor cells
MX2009005496A (es) 2006-11-30 2009-06-03 Medipost Co Ltd Uso de una composicion que contiene una celula madre mesenquimal derivada de sangre del cordon umbilical humano para inducir diferenciacion y proliferacion de celulas precursoras neurales o celulas madre neurales a celulas neurales.
CN101835479A (zh) * 2007-07-25 2010-09-15 佰欧益有限公司 多系祖细胞分化为软骨细胞
CA2714777A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Cryo-Cell International, Inc. Methods for co-culturing cord blood derived cells with menstrual stem cells
US20120156134A1 (en) 2007-12-20 2012-06-21 Shayne Squires Compositions and methods for detecting or eliminating senescent cells to diagnose or treat disease
AU2009205886B2 (en) 2008-01-18 2015-08-27 Katholieke Universiteit Leuven Stem cell aggregates and methods for making and using
US20090202978A1 (en) * 2008-02-13 2009-08-13 Ginadi Shaham Method and apparatus for freezing of a biological material
US20090233993A1 (en) * 2008-03-06 2009-09-17 Burnham Institute For Medical Research Compositions and methods for inhibiting gsk3 activity and uses thereof
CN101543644B (zh) * 2008-03-27 2012-07-25 中国人民解放军总医院 无支架工程软骨组织的构建方法及其产品
WO2009143241A2 (en) * 2008-05-21 2009-11-26 Bioe, Inc. Differentiation of multi-lineage progenitor cells to pancreatic cells
US8728805B2 (en) 2008-08-22 2014-05-20 Anthrogenesis Corporation Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations
PL3006459T3 (pl) 2008-08-26 2022-01-17 City Of Hope Sposób i kompozycje dla wzmocnionego działania efektorowego komórek t przeciw guzowi nowotworowemu
GB0818725D0 (en) 2008-10-13 2008-11-19 Habib Nagy A Pharmaceutical composition
EP2182055A1 (en) 2008-10-14 2010-05-05 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (USSC)
US9057051B2 (en) 2008-10-31 2015-06-16 Katholieke Universiteit Leuven Optimized methods for differentiation of cells into cells with hepatocyte progenitor phenotypes, cells produced by the methods, and methods of using the cells
KR20100054711A (ko) 2008-11-14 2010-05-25 메디포스트(주) 간엽 줄기세포 또는 이의 배양액을 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물
US10179900B2 (en) 2008-12-19 2019-01-15 DePuy Synthes Products, Inc. Conditioned media and methods of making a conditioned media
US20110020292A1 (en) * 2009-07-21 2011-01-27 Abt Holding Company Use of Stem Cells to Reduce Leukocyte Extravasation
CN102625829B (zh) * 2009-07-21 2015-05-06 Abt控股公司 干细胞用于减少白细胞外渗的用途
US8759098B2 (en) 2009-12-04 2014-06-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Method for cloning pluripotent stem cells
WO2011069093A1 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Detecting and counting tissue-specific stem cells and uses thereof
US20110206647A1 (en) * 2010-02-25 2011-08-25 Abt Holding Company Modulation of Angiogenesis
WO2011106476A1 (en) * 2010-02-25 2011-09-01 Abt Holding Company Modulation of microglia activation
EP3940060A1 (en) 2010-02-25 2022-01-19 ABT Holding Company Modulation of macrophage activation
WO2011127113A1 (en) 2010-04-08 2011-10-13 Anthrogenesis Corporation Treatment of sarcoidosis using placental stem cells
CA3128483A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Abt Holding Company Modulation of splenocytes in cell therapy
US9090878B2 (en) 2010-06-17 2015-07-28 Katholieke Universiteit Leuven Methods for differentiating cells into hepatic stellate cells and hepatic sinusoidal endothelial cells, cells produced by the methods, and methods for using the cells
WO2012027358A1 (en) 2010-08-23 2012-03-01 President And Fellows Of Harvard College Optogenetic probes for measuring membrane potential
AU2011293440B2 (en) 2010-08-24 2016-05-05 Katholieke Universiteit Leuven Non-static suspension culture of cell aggregates
WO2012048275A2 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Caridianbct, Inc. Configurable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
WO2012092485A1 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Anthrogenesis Corporation Enhancement of placental stem cell potency using modulatory rna molecules
WO2012141571A1 (en) * 2011-04-11 2012-10-18 M Abdullah Jaffar Ali Bin Protein-free culture media products
CN102776150A (zh) * 2011-05-13 2012-11-14 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法
AU2012262273B2 (en) 2011-06-01 2017-09-14 Celularity Inc. Treatment of pain using placental stem cells
SG10201604543PA (en) 2011-06-06 2016-07-28 ReGenesys BVBA Expansion of stem cells in hollow fiber bioreactors
GB201119335D0 (en) 2011-11-09 2011-12-21 Univ Leuven Kath Hepatitis virus infectable stem cells
KR102161726B1 (ko) 2013-04-12 2020-10-06 사베리오 라프란체스카 이식용 장기의 개선
DK2992088T3 (da) 2013-04-30 2019-11-11 Univ Leuven Kath Celleterapi for myelodysplastiske syndromer
JP6633522B2 (ja) 2013-11-16 2020-01-22 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド バイオリアクターにおける細胞増殖
EP2952578A1 (de) 2014-06-03 2015-12-09 Peter Wernet Epigenetische Reprogrammierung von fötalen Stammzellen
IL292650B2 (en) 2014-09-19 2024-04-01 Hope City IL13RA2-targeted chimeric antigen receptor T cells
TW201613622A (en) * 2014-10-14 2016-04-16 Bionet Corp Composition for skincare and pharmaceutical composition and preparation method thereof
SG11201806245TA (en) 2016-01-21 2018-08-30 Abt Holding Co Stem cells for wound healing
CN106377547B (zh) * 2016-09-30 2019-05-31 孔五一 脐带血再生粒子的提取方法及其用途
CN113637633B (zh) * 2021-08-16 2023-11-03 浙江大学 一种促进间充质干细胞向成骨细胞分化的方法
CA3232099A1 (en) 2021-09-23 2023-03-30 Adam Ezra Cohen Genetically encoded voltage indicators and uses thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3639949A1 (de) 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren
US5192553A (en) * 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5486359A (en) * 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
US5851832A (en) * 1991-07-08 1998-12-22 Neurospheres, Ltd. In vitro growth and proliferation of multipotent neural stem cells and their progeny
US5672346A (en) * 1992-07-27 1997-09-30 Indiana University Foundation Human stem cell compositions and methods
US6482231B1 (en) * 1995-11-20 2002-11-19 Giovanni Abatangelo Biological material for the repair of connective tissue defects comprising mesenchymal stem cells and hyaluronic acid derivative
US5842477A (en) * 1996-02-21 1998-12-01 Advanced Tissue Sciences, Inc. Method for repairing cartilage
AU2730497A (en) * 1996-04-17 1997-11-07 Case Western Reserve University Cryopreservation and extensive subculturing of human mesenchymal stem cells
US5843633A (en) * 1996-04-26 1998-12-01 Amcell Corporation Characterization of a human hematopoietic progenitor cell antigen
JPH10295369A (ja) 1997-02-26 1998-11-10 Japan Tobacco Inc 造血幹細胞の製造方法
JPH10306027A (ja) 1997-03-07 1998-11-17 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 免疫寛容誘導剤
AU8401498A (en) * 1997-07-14 1999-02-10 Osiris Therapeutics, Inc. Cardiac muscle regeneration using mesenchymal stem cells
DE19833476B4 (de) 1998-07-24 2005-08-25 Huss, Ralf, Dr. Genetisch modifizierte CD34-Negative, adhärent wachsende hämatopoetische Stammzellen und deren Verwendung in der Gentherapie
CA2371017A1 (en) 1999-04-27 2000-11-02 Layton Bioscience, Inc. Cell therapy for chronic stroke
US20020142457A1 (en) * 1999-12-28 2002-10-03 Akihiro Umezawa Cell having the potentiality of differentiation into cardiomyocytes
WO2003070922A1 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 Medipost Co., Ltd. Isolation and culture-expansion methods of mesenchymal stem/progenitor cells from umbilical cord blood, and differentiation method of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem/progenitor cells into various mesenchymal tissues
US20040197310A1 (en) * 2003-02-12 2004-10-07 Sanberg Paul R. Compositions and methods for using umbilical cord progenitor cells in the treatment of myocardial infarction

Also Published As

Publication number Publication date
CZ20031165A3 (cs) 2003-10-15
JP4799804B2 (ja) 2011-10-26
EA008619B1 (ru) 2007-06-29
JP2004521617A (ja) 2004-07-22
DE60123293T2 (de) 2007-05-10
CN1553951A (zh) 2004-12-08
ATE340255T1 (de) 2006-10-15
AU2002229533B2 (en) 2007-07-26
DK1404815T3 (da) 2007-01-08
NO20031999D0 (no) 2003-05-02
US20020164794A1 (en) 2002-11-07
US7560280B2 (en) 2009-07-14
IL155608A0 (en) 2003-11-23
EP1404815B1 (en) 2006-09-20
EP1404815A2 (en) 2004-04-07
US20090238803A1 (en) 2009-09-24
CA2426987C (en) 2013-06-11
IL155608A (en) 2009-08-03
CA2426987A1 (en) 2002-05-10
EE200300205A (xx) 2003-08-15
CY1106287T1 (el) 2011-10-12
US7556801B2 (en) 2009-07-07
PL362293A1 (en) 2004-10-18
JP2008179642A (ja) 2008-08-07
HUP0301600A2 (hu) 2003-10-28
UA81390C2 (en) 2008-01-10
NO20031999L (no) 2003-07-02
JP4805960B2 (ja) 2011-11-02
AU2953302A (en) 2002-05-15
SK5242003A3 (en) 2003-11-04
ES2272563T3 (es) 2007-05-01
HUP0301600A3 (en) 2005-12-28
WO2002036751A3 (en) 2004-01-08
WO2002036751A2 (en) 2002-05-10
US20050142118A1 (en) 2005-06-30
DE60123293D1 (de) 2006-11-02
CN100480375C (zh) 2009-04-22
HK1071771A1 (en) 2005-07-29
MXPA03003844A (es) 2004-10-15
EA200300536A1 (ru) 2003-12-25
PT1404815E (pt) 2006-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2426987C (en) Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (ussc)
AU2002229533A1 (en) Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (ussc)
Lindroos et al. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine
Dominici et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement
Lodie et al. Systematic analysis of reportedly distinct populations of multipotent bone marrow-derived stem cells reveals a lack of distinction
ES2328460T3 (es) Poblaciones de celulas progenitoras, expansion de las mismas y crecimiento de tipos de celulas no hematopoyeticas y tejidos provenientes de las mismas.
Pascucci et al. Flow cytometric characterization of culture expanded multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) from horse adipose tissue: towards the definition of minimal stemness criteria
Kulus et al. Mesenchymal stem/stromal cells derived from human and animal perinatal tissues—origins, characteristics, signaling pathways, and clinical trials
KR20140143363A (ko) 기질 줄기 세포
KR20170036105A (ko) 치료학적 용도의 줄기 세포 조성물 및 줄기 세포의 제조 방법
Frontini López et al. Adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells: from the lab bench to the basic concepts for clinical translation
Yousaf et al. Multipotent potential of human adult mesenchymal stem cells
Sanna et al. Very Small Embryonic like Stem Cells: A Review of Basic Science, Applications, and Potential Use in Orthopedics
JP2018501189A (ja) 骨欠損を治療するための体性幹細胞
Pavlovic Very small embryonic like cells (VSELs): pros and cons—review and perspectives in the light of critical data and controversies
Manfiolli et al. Stem cells, organoids, and cellular therapy
WO2023227972A1 (en) Process for preparation and cryopreservation of dental pulp from definitive teeth and products thereof based on isolated mesenchymal stem cells
Zheng et al. Bone Marrow Stem Cells: Source, Characterization, Isolation, Culture, and Identification
JP2022103137A (ja) 多能性幹細胞を含む細胞画分の製造方法
CALAVUL et al. The Role of Stem Cell in Plastic Reconstructive and Aesthetic Surgery
Lindroos Characterization and optimization of in vitro culture conditions of adult stem cells for clinical cell therapy
Messaggio MESENCHYMAL STEM CELLS FROM HUMAN ADIPOSE TISSUE: CHARACTERIZATION AND IMMUNOMODULATORY PROPERTIES OF TISSUE AND CELLULAR PRODUCT
Masala et al. AMNIOTIC FLUID-DERIVED STEMS ISOLATION, CHARACTERIZATION AND DIFFERENTIATION
Malagola Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from the canine liver
DIFFERENTIATE et al. Final accepted version