CZ20031165A3

CZ20031165A3 - Neomezené somatické kmenové buňky (unrestricted somatic stem cells, USSC) získané z lidské pupečníkové krve

Info

Publication number: CZ20031165A3
Application number: CZ20031165A
Authority: CZ
Inventors: Peter Wernet
Original assignee: Kourion Therapeutics Gmbh
Priority date: 2000-11-03
Filing date: 2001-11-03
Publication date: 2003-10-15
Also published as: DE60123293D1; DE60123293T2; US20090238803A1; JP4799804B2; US7560280B2; CY1106287T1; ES2272563T3; US7556801B2; HUP0301600A3; EA200300536A1; AU2953302A; NO20031999L; WO2002036751A2; PT1404815E; MXPA03003844A; IL155608A; HUP0301600A2; JP4805960B2; NO20031999D0; CA2426987A1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká somatické kmenové buňky, plurality kmenových buněk, léčiva obsahujícího kmenové buňky podle vynálezu a způsobu pro jejich purifikaci, izolaci, a jedinečného diferenciačního potenciálu kmenové buňky podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Ačkoliv kmenové buňky se neustále obnovují svojí záměnou, všeobecně mají velice pomalou cyklizaci. Obecně se předpokládá, že tyto buňky dávají vzniknout krátkodobě se amplifikující buněčné populaci s omezenou sebeobnovovací kapacitou ke zvýšení počtu diferencovaných buněk. Až dosud bylo úsilí zaměřeno na lokalizaci kmenových buněk v dospělém člověku, a proto se v existující literatuře uvádí množství náhradních markérů (např. testy tvorby kolonií pro hematopoetické linie).

Řada	US	patentů, např.	US 5 486 359, 5	591 625,
736 396,	5	811 094, 5 827	740, 5 837 539,	5 908 782,
908 784,	5	942 225, 5 965	436, 6 010 696,	6 022 540,
087 113,	5	858 390, 5 804	446, 5 846 796,	5 654 186,
054 121,	5	827 735, 5 906	934 se zabývá mezenchymálními

kmenovými buňkami (mesenchymal stem cells, MSC), které mohou být difencovány na několik typů progenitorových buněk, jako např. svalových progenitorových buněk, progenitorových buněk pojivových tkání a oválných buněk.

skeletální buňky, stejně jako na buňky hladkého svalstva,

Svalové progenitorové buňky se dále diferencují na srdeční, • · · · · · • · · · · · zatímco progenitorové buňky pojivových tkání se mohou diferencovat na buňky kostí, chrupavky a tukové buňky. Oválné buňky se mohou diferencovat na jaterní nebo pankreatické buňky (Grompe et al, 2001) . Dosud je diskutována přítomnost nehematopoetických kmenových buněk v pupečníkové krvi (Mayani et al., 2000; Mareschi et al., 2001). Německá patentová přihláška DE 198 03 267 Al jako první popisuje progenitory osteoblastů a tvorbu kostí z lidské pupečníkové krve.

Nicméně, použití těchto mezenchymálních progenitorových buněk podle dosavadního stavu techniky je často omezeno, neboť tyto buňky jsou příliš vyvinuté, aby mohly být užitečnými prostředky pro generování orgánů a tkání. Jinými slovy, zdá se, že jsou již příliš předurčené a specializované k poskytnutí funkčního regenerujícího se orgánu nebo tkáně.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je poskytnutí kmenové buňky, která je schopna se diferencovat na odlišné progenitorové buňky, jako jsou mezenchymální buňky, neurální buňky, krevní buňky a endoteliální buňky.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí kmenové buňky, která nemá nevýhody embryonálních kmenových buněk.

Bylo zjištěno, že nově identifikovaná kmenová buňka je schopna řešit výše uvedené cíle vynálezu. Somatická kmenová buňka podle vynálezu je získána z lidské pupečníkové krve, placentální krve a/nebo z krve novorozence, přičemž tato kmenová buňka je odlišná, ale schopná diferencovat se na mezenchymální kmenové nebo progenitorové buňky, na hematopoetickou linii kmenových nebo progenitorových buněk, na neurální kmenové nebo progenitorové buňky, nebo na • · endoteliální kmenové nebo jaterní progenitorové buňky. Tyto buňky představují progenitory hematopoetických linií, mezenchymálních kmenových buněk, stejně jako neurálních kmenových buněk. Jedinečná multifukční kapacita a technologie expanze těchto neomezených somatických kmenových buněk (unrestricted somatic stem cells, USSC) z pupečníkové krve (cord blood, CB), buďto jako somatických kmenových buněk jako takových, nebo jako buněk nasměrovaných za odlišných diferenciační protokolů, umožňují přesnou charakterizaci, standardizaci a využití k produkci a k realizaci terapie pomocí kmenových buněk v regenerativní medicíně.

Obr. 1 uvádí mikrofotografii primární USSC kultury, buňky jsou vysety v nízké hustotě.

Obr. 2 uvádí mikrofotografii konfluentní USSC kultury. Obr. 3 uvádí FACS analýzu pro antigen CD45 během kultivace in vitro.

Obr. 4 uvádí FACS analýzu pro embryonální markér SSEA4 .

Obr. 5 uvádí FACS analýzu pro HLA-třídu I (A,B,C), HLA DR a CD14.

Obr. 6 uvádí kinetiku FACS pro povrchový markér CD34.

Obr. 7 uvádí mikrofotografii buněk USSC po neuronální indukci.

Obr. 8 uvádí, že USSC podle vynálezu exprimují nestin jako markér neurálních kmenových buněk v anti-nestin imunobarvení.

Obr. 9 uvádí buňky USSC generující neuronální linii.

Obr. 10 uvádí buňky USSC generující gliální linii.

Obr. 11 uvádí tvorbu mineralizovaných nodulů po osteogenní indukci a po barvení s alizarinovou červení (B).

Obr. 12 uvádí barvení peletové kultury, odvozené z USSC, pomocí alcianové modře.

Obr. 13 uvádí barvení kolagenu typu II (zelená) kultur

USSC po chondrogenní diferenciaci.

Obr. 14 uvádí adipogenní diferenciaci kultur USSC, jak je prokázáno barvením olejovou červení.

Obr. 15 uvádí mikrofotografii kultur USSC před a po myogenní diferenciaci.

Obr. 16 uvádí imunocytochemii pro slow-acting myosin po ošetření azacytidinem.

Obr. 17 uvádí fenotyp oválných buněk derivátů USSC.

Obr. 18 uvádí přežívání a integraci kultur USSC po injekci do SCID myšího jaterního parenchymu.

Somatické kmenové buňky podle překládaného vynálezu mohou být izolovány a purifikovány různými metodami, včetně kroků zahrnujících izolaci v hustotním gradientu, kultivaci adherentních buněk a subkultivaci s použitím růstových faktorů, jak je popsáno v příkladu 1. Po vytvoření konfluentní buněčné vrstvy je izolační proces k odvození buněk podle vynálezu rutinně řízen pomocí morfologie (fibroblastoidní morfologie) a analýzy fenotypu s použitím protilátek proti povrchovým antigenům CD13 (pozitivní),

CD14 (negativní), CD45 (negativní) a CD29 (pozitivní; viz příklad 2).

Somatická kmenová buňka podle vynálezu negativně reaguje s markéry specifickými pro hematopoetickou linii, jako je CD45, a proto je odlišitelná od hematopoetických kmenových buněk, které rovněž mohou být izolovány z placentální pupečníkové krve. CD14 je dalším povrchovým antigenem, který nemůže být detekován na USSC. Déle je kmenová buňka podle vynálezu charakterizována souborem antigenů, které jsou přítomny na buněčném povrchu, jako je CD13, CD29, CD44 a CD49e. Preparáty USSC jsou dále charakterizovány přítomností transkriptů mRNA pro molekuly určitých receptoru, jako je receptor epidermálního růstového faktoru (EGF-R), alfa receptor destičkového růstového faktoru (PSGF-RA) a receptor inzulínového růstového faktoru (IGF-R). Tyto buňky jsou rovněž typické svojí expresí transkripčních faktorů, jako je YBl (X-box transkripční faktor 1), Runxl („runt related transkripční faktor 1) a AML1C (transkripční faktor akutní myeloidní leukemie 1 ), detekovatelných pomocí RT-PCR. Nicméně preparáty USSC jsou typicky negativní pro transkripty pro chondrogenní transkripční faktor Cart-1 a neurální markéry, jako je neurofilament, synaptophysin, tyrosin hydroxyláza (TH) a gliální fibrilární kyselý protein (glial fibrillary acidic protein, GFAP).

Tabulka 1: Analýza transkripčních vzorků z USSC pomocí RT-PCR

Výsledky RT-PCR získané s předpokládanými oligonukleotidovými primery a mRNA z USSC a s pozitivními kontrolními mRNA z jiných tkání, jako jsou buňky kostní, chrupavkové, mozkové a mononukleární buňky z pupečníkové krve.

Název	PCR výsledek pro USSC	PCR výsledek (jiné tkáně)
PDGFR	+	+ (dospělá kost)
IGFR	+	+ (dospělá kost)
neurofilament	-	+ (dospělá játra)
CD105	+	+ (mononukleární buňky z pupečníkové krve
GFAP	-	+ (fetální mozek)
synaptophysin	-	+ (fetální mozek)
tyrosin hydroxyláza	-	+ (fetální mozek)
YBl	+	+ (fetální kozek)
Runxl	+	+ (dospělá kost)
AMLlc	+	+ (dospělá kost)

BMPR II	+	+ (dospělá chrupavka)
kolagen typu I	+	+ (dospělá kost)
Cart-1	-	+ (mononukleární buňky z pupečníkové krve)
chondroadherin	-	+ (dospělá kost)
CD49e	+	+ (dospělá kost) .

Byla přímo srovnávána exprese RNA v preparátech USSC a buněk MSC odvozených z kostní dřeně (Caplan, 1991) s použitím kvantitativní Affymetrix GeneChip ™ microarrays. Transkript genu pro fibulin-2 (číslo v genové bance X82494) byl detekován v USSC o vysokých hladinách exprese, avšak nikoliv u MSC. Produkce fibulinu-2 byla dříve prokázána ve fibroblastech (Pan et al., 1993). Northern blottová analýza mRNA z různých lidských tkání prokazuje převahu transkriptů o 4,5 kb v tkáních srdce, placenty a ovarií (Zhang et al., 1994). Protein byl lokalizován světelným mikroskopem u lidských embryí ve 4-10 týdnu těhotenství s použitím polyklonálních protilátek. Fibulin-2 byl primárně detekován uvnitř neuroepitelia, spinálních ganglií a periferních nervů (Miosge et al.,

1996).

Na krysím zvířecím modelu jsou krysí jaterní myofibroblasty (rMF) kolokalizovány s fibulinem-2. Tyto buňky jsou umístěny v portálním poli, stěnách centrálních žil a pouze příležitostně v parenchymu. V raných stadiích fibrosy byly rMF detekovány uvnitř vyvíjejících se jizev.

V pokročilých stádiích fibrosy představují rMF většinu buněk umístěných uvnitř jizev (Knittel et al., 1999).

V jiném zvířecím modelu je myší protein fibulin-2 exprimován během epiteliálně-mesenchymální transformace v endokardiální polštářové matrix během embryonálního vývoje srdce. Fibulin-2 je rovněž syntetizován • · · ·«· ···· •· · » · ·· · ·· ·· prekursorovými buňkami hladkého svalstva vyvíjejících se cév oblouku aorty a koronárními endoteliálními buňkami pocházejícími z buněk neurálních lišty a epikardiálních buněk (Tsuda et al., 2001).

Transkripty genu pro hyaluronan syntázu (D84424), fibromodulinového genu (U05291) a transkript 1NFLS (WO3746) nebyly v USSC detekovány, zatímco v MSC byly detekovány ve vysokých hladinách. Northern blott analýza prokázala, že hyaluronan syntéza je všudypřítomně exprimována v lidských tkáních (Itano and Kimata, 1996) . Produkt tohoto enzymu, hyaluronan, má řadu funkcí včetně výplňové a lubrikační pro klouby, a poskytuje matrix, kterou mohou buňky migrovat (Halí et al., 1995). Fibromodulin je členem rodiny malých intersticiálních (vmezeřených) proteoglykanů. Protein vykazuje širokou tkáňovou distribuci, s nejvyšším množstvím pozorovaným v kloubní chrupavce, šlaše a vazivu (Sztrolovics et al., 1994). Transkript 1NFLS byl klonován z lidských fetálních jater.

Gen CD24 (L33930) je exprimován o velmi nízké hladině v USSC ve srovnání s úrovní exprese v MSC. CD24 je exprimován v mnohých buňkách B-linií a na zralých granulocytech (Van der Schoot et al., 1989).

Ve srovnání s MSC jsou somatické buňky podle vynálezu odlišné na základě tkáňového zdroje, ze kterého jsou izolovány. Dále jsou USSC charakterizovány tím, že neexprimují žádný lidský leukocytární antigen třídy I (HLAclass I). Na rozdíl od somatických kmenových buněk podle vynálezu, dříve popsané MSC izolované z kostní dřeně a svalových tkání exprimují na svém povrchu velmi vysoké hladiny antigenu HLA-třídy I. Buňka podle vynálezu rovněž exprimuje stadiově specifický časný antigen 4 (SSEA4) (viz obr. 4).

·· · ·· ···· ·· ···« • · · ·· · ·· · • · · · · ···· ·· ··· ·· · ·· «·

Somatická kmenová buňka podle vynálezu typicky vykazuje fibroblastoidní buněčný povrch a proliferuje adherentním způsobem.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je somatická kmenová buňka podle vynálezu (USSC) přítomna v pluralitě nebo směsích představujících prekursory jiných somatických kmenových buněk, jako jsou hematopoetická linie přednostně exprimující AC133 a CD34, mezenchymální progenitorové somatické kmenové buňky, neuronální progenitorové somatické kmenové buňky, nebo jejich kombinace. Toto provedení je výhodné proto, že představuje vysoký regenerativní potenciál, založený na schopnosti diferencovat se na jiné odlišné somatické kmenové buňky, nebo přítomnost takových somatických kmenových buněk, jako výhodné provedení vynálezu.

Podle vynálezu je poskytnuto léčivo (regenerativní terapeutikum) obsahující somatické kmenové buňky podle vynálezu, stejně jako pluralitu nebo směsi somatických kmenových buněk podle vynálezu. Léčivo může dále obsahovat substance nosičů nebo pomocné látky, které jsou léčebně a farmakologicky akceptovatelné. Předkládaný vynález se rovněž týká způsobu použití USSC nebo plurality nebo směsí kmenových buněk podle vynálezu v genové terapii, náhradě orgánů, testování farmaceutik, růstu krevních cév in vitro a v terapii vaskulárních, kostních, jaterních, pankreatických a neurálních onemocnění.

Tak například, USSC podle předkládaného vynálezu mohou být aplikovány lokálně v místě potřeby, tj. s nebo bez biomateriálů.

Lokální a/nebo systémové podání USSC je vhodné v závislosti na typu onemocnění. USSC mohou být aplikovány přímo nebo společně s farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo adjuvanty. S výhodou mohou být přidány další látky, které podporují léčbu onemocnění. Tak například, společně s USSC mohou být ortopedických aplikacích použity látky, které zlepšují regeneraci kostí.

V zásadě, metody, které jsou známé pro aplikaci MSC, mohou být aplikovány analogickým způsobem, jestliže jsou použity USSC. Dále, použití kmenových buněk je popsáno například v B.E.Strauer et al.M „Intrakoronare, humane autologe Stammzelltransplantation zur Myokardregeneration nach Herzinfarkt, Dtsch med Wochenschr 2001; 126:932-938; Quarto R., et al. „Repair of Large Bone Defects with the Use of Autologous Bone Marrow Stromal Cells, N Engl J Med 2001; 344:385-386; Vacanti C.A., „Brief Report: Replacement of an Avulsed Phalanx with Tissue-Engineered Bone N Engl J Med 2001; 344:1511-1514, May 17, 2001; Hentz V.R., „Tissue Engineering for Reconstruction of the Thump, N Engl J Med 2001; 344:1547-1548; Brittberg M., „Treatment of Deep Cartilage Defects in the Knee with Autologous Chondrocyte Transplantation, N Engl J Med 1994; 331:889-895, Oct 6, 1994; Freed C.R., „Transplantation of Embryonic Dopamine Neurons for Severe Parkinson's Disease, N Engl J Med 2001; 344:710-719; Shin'oka T., „Transplantation of a TissueEngineered Pulmonary Artery, N Engl J Med 2001; 344:532533; Shapiro A.M.J., „Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a

Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen, N Engl J Med 2000; 343:230-238. Tyto reference jsou zde zahrnuty jako odkazy.

Dále jsou podrobněji popsány kmenové buňky podle vynálezu.

Kmenové buňky podle vynálezu jsou adherentní buňky s fibroblastoidním buněčným povrchem a dvěma nebo třemi jádry (viz Obr. 1), získané po ošetření trypsinem-EDTA a vysetí za příslušných kultivačních podmínek (příklad 1), rychle expandují ke konfluenci s morfologií typu „long stretched(Obr.2). Obr. 1 ukazuje mikrofotografii primární USSC kultury. Buňky vyseté o nízké hustotě vykazují fibroblastoidní morfologii USSC. Tyto buňky mohou být snadno pěstovány přes více než 14 kultivačních pasáží. Obr.

ukazuje mikrofotografii konfluentní USSC kultury. Téměř konfluentní buněčná vrstva USSC vykazuje paralelní orientaci buněk.

Fenotypové povrchové markéry primární adherentní buněčné vrstvy, stejně jako jejích derivátů v následných pasážích, jsou a zůstávají negativní pro markér CD45. Obr.

ukazuje FACS analýzu pro antigen CD45 během kultivace in vitro. CD45, charakteristický markerový antigen pro hematopoetickou buňku, je téměř nedetekovatelný v USSC z pozdějších pasáží (Obr. 3 ve dnech 48, 54, 82) .

Po in vitro kultivaci s použitím metody A (příklad 1) se preparáty USSC staly pozitivními pro stadiově-specifický časný antigen 4 (SSEA4) a vykazovaly homogenní expresi tohoto embryonálního markéru. Obr. 4 ukazuje FACS analýzu pro SSEA4 embryonální markér. Buňky produkované metodou A (příklad 1) silně vykazují expresi stadiově-specifického časného antigenu 4 (SSEA4). Ve shodnou dobu jsou USSC kultury negativní pro expresi povrchového antigenu HLAtřídy I. (Obr. 5A), expresi HLA-DR antigenu (Obr. 5B) stejně jako je negativní CD14 (Obr. 5C). Obr. 5 ukazuje FACS analýzu pro HLA-třídu I (A,B,C), HLA DR a CD14.

Kultury USSC podle vynálezu po expanzi in vitro jsou negativní pro antigen HLA-třídy I (Panel A). Tyto buňky jsou rovněž negativní pro povrchové antigeny HLA-DR (Panel B) a CD14 (Panel C), které jsou charakteristické pro buňky prezentující antigen (HLA-DR) a monocyty (CD14).

Obr. 6 ukazuje kinetiku FACS pro povrchový markér CD34. USSC byly pěstovány v H5100/PEI přes 10 pasáží. Během této kultivační doby bylo pozorováno signifikantní zvýšení exprese antigenu CD34. Pokud se jedná o markér hematopoetických kmenových buněk CD34, ukazuje Obr. 6, že v pasáži 3 až do dne 54 nebyly detekovány žádné CD34 pozitivní buňky. Naopak, v sedmé pasáži ve dni 82 se objevila nová CD34 pozitivní subpopulace. Na druhé straně, jestliže takové CD34 a/nebo FIKl pozitivní progenitory byly kultivovány v médiu kondicionovaném cytokinem specifickém pro hematopoetickou difenciaci, vyvinuly se typické smíšené nebo hematopoetické kolonie pro prekursory červených a bílých krevních buněk (CFU-GM a BFU-E) srovnatelné s CD45⁺hematopoetickými progenitorovými buňkami.

Na druhé straně, jestliže jsou kultivovány mononukleární buňky z pupečníkové krve postrádající CD14 v médiu s vysokým obsahem glukózy, vykazují tyto buňky typické charakteristiky neurálních kmenových buněk. Obr. 7 ukazuje mikrofotografii USSC po neuronální indukci. USSC podle vynálezu, kultivované v „Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) high glucose, vykazují morfologii podobnou astrocytům. Obr. 7 ukazuje příklad takových kultivovaných buněk vykazujících gliální morfologii, získanou v kultuře po 13 dnech (příklad 6). Po expanzi pomocí PEI exprimují USSC nestin, markér neurálních kmenových buněk. První pozorování naznačuje, že nestinové barvení je méně zřetelné po té, kdy buňky byly stimulovány neurálně indukčním činidlem, jako je kyselina retinová (RA) , bazický fibroblastový růstový faktor bFGF a nervový růstový faktor β (NGF-β) (McKay, 1997).

Podrobněji, Obr. 8 ukazuje USSC podle vynálezu exprimující markér neurálních kmenových buněk nestin. (A) USSC byly inkubovány v H5100/PEI médiu po 7 dnů a podrobeny standardní anti-nestin imunohistochemii. (B) Buňky byly inkubovány po 7 dnů v H5100/PEI s následující 9denní .

indukcí v H5100 s RA, bFGFa NGF. Je třeba si povšimnout, že nestinové barvení je sníženo ve srovnání s buňkami pěstovanými za podmínek podle (A).

Další analýza těchto buněk odhalila rovněž expresi proteinů charakteristických pro neurální buňky, jako je kyselina γ-aminomáselná (GABA, Obr. 9 B), tyrosin hydroxyláza (Obr. 9 B), synaptophysin (Obr. 9 D), neurofilament (Obr. 9 F), nebo typické gliové antigeny, jako galaktocerebrosid (GalC, Obr. 10 B) a gliový fibrilární kyselý protein (GFAP Obr. 10 D). Obr. 9 ukazuje USSC podle vynálezu generující buňky neuronální linie. USSC podle vynálezu byly pěstovány v H51008PEI po 7 dnů a udržovány po 27 dnů na H5100 obsahujícím RA, bFGF a NGF. Po provedení standardního fixačního protokolu, byly aplikovány neuronálně specifické protilátky.(A,C,D)fotografie s fázovým kontrastem, (B,D,F) fluorescenční fotografie stejných preparátů jako v A,C,D. DAPI (modrá), barvivo pro DNA, je použito k barvení jader buněk. (B) Dvojitá imunofluorescenční fotografie používající anti-GABA (červená) a anti-tyrosinhydroxyláza (TH, zelená). (D) Antisynaptophysinové barvení (zelená). (F)Je znázorněno neuron specifické anti-neurofilamentové barvení (červená). Byla použita směs protilátek proti odlišným subtypům neurofilamentu. Obr. 10 uvádí USSC podle vynálezu generující buňky gliové linie. Buňky byly podrobeny stejným kultivačním podmínkám, jako je uvedeno v Obr. 9. DAPI je v modré barvě.(A,C) Předvedení fotografií s fázovým kontrastem. (B) Shodné buňky, jako pozorované v (A), které byly podrobeny anti-GalC imunobarvení (červená). Shodné buňky jako v (C) barvené s využitím protilátky proti gliovému fibrilárnímu kyselému proteinu (GFAP, červená).

Nicméně, jestliže jsou výše popsané univerzální kmenové buňky odebrány z jakékoliv expanzní pasáže a jsou * · * · ··· ·· ···· ··· ·· · · · · ·· · · · ··· • · · · · · ··· · ·· · · · ···· ··· ·· · ·· ·· indukovány v kultivačních podmínkách s DAG (dexamethason, kyselina askorbová, β-glycerol fosfát) nebo v médiu obsahujícím fibronektin, je indukována difenciace osteogenní linie (příklad 3). Jak je uvedeno v Tabulce 2, specifické kostní markerové geny (alkalická fosfatáza, osteokalcin, kolagen typu I) jsou snadno indukovány a jsou detekovatelné pomocí RT-PCR.

	kontrola	den 7	den 14
β-aktin (pozitivní kontrola)	+	+	+
alkalická fosfatáza	-	+	+
kolagen typu II	-	+	+
osteokalcin	+	+	-

Tabulka 2: RT-PCR analýza během osteogenní diferenciace USSC.

Všechny tři markerové geny pro osteogenní diferenciaci vykazují zvýšenou expresi mRNA v 7. dni indukce DAG, βaktin slouží jako pozitivní kontrola.

Obr. 11 ukazuje tvorbu mineralizovaných nodulů po osteogenní indukci a po barvení alizarinovou červení (B). Byla indukována osteogenní diferenciace téměř konfluentních USSC vrstev přidáním dexamethasonu, kyseliny askorbové a βglycerol fosfátu do kultivačního média H5100. V 10. dnu stimulace se objevily charakteristické kostní noduly (11A). Ukládání minerálů v těchto nodulech může být demonstrováno barvením alizarinovou červení (11B). Za těchto osteogenních indukčních podmínek se buňky podle vynálezu podrobují kompletní osteogenní diferenciaci, jak je prokázáno akumulací mineralizované kosti v jednotlivých nodulech (Obr. 11A), které mohou být barveny alizarinovou červení (Obr. 11B). Jinak řečeno, akumulace hydroxyapatitu v buněčné kultuře může být detekována po šesti dnech pomocí barvení podle von Kossa.

• · · ··· ···· • · · · · ·· · ·· · ·

Z těchto výsledků je zřejmé, že pupečníková krev obsahuje až dosud nedetekovanou velmi časnou kmenovou buňku, která může být expandována do rozsáhlých množství. Kromě toho, tato buňka může být indukována k diferenciaci na MSC a odtud na osteoblasty, jak bylo již prokázáno v Obr. 11A. Po kompletní indukci pomocí DAG a další diferenciaci mohou být získány mineralizované kostní noduly, jak je uvedeno v Obr. 11B s barvením alizarinovou červení.

Mnohostrannost buněk podle vynálezu je dokonce větší,, jak je demonstrováno chondrogenní diferenciací po kultivaci v „DMEM high glucose, obsahujícím dexamethason, prolin, pyruvát sodný, ITS+ Premix a TGF-βΙ (Johnstone et al.,

1998). Ve dni 0 a 14 těchto diferenciačních pokusů byly buňky sklizeny a analyzovány pomocí RT-PCR (Tabulka 3, příklad 4).

	kontrola	14.den
β-aktin (pozitivní kontrola)	+	+
Cart-1	-	+
kolagen typu II (neštěpený)	-	+
chondroadherin	-	+

Tabulka 3: RT-PCR analýza během chondrogenní diferenciace USSC.

Ve 14. dnu chondrogenní stimulace jsou exprimovaný tři charakteristické markerové geny probíhající chondrogeneze.

Výsledky těchto studií jasně prokazují zvýšení Cart-1, specifického chondrogenního transkripčního faktoru 14 dnů po chondrogenní stimulaci. Kromě toho transkripty mRNA pro dva typické extracelulární proteiny chrupavky (kolagen typu II a chondroadherin) byly rovněž zvýšeny. Kromě toho buňky podle vynálezu zřetelně produkovaly molekuly extracelulárního proteoglykanu typického pro chondrocytární

15* diferenciaci, jak bylo prokázáno barvením alcianovou modří. Obr. 12 ukazuje barvení peletové kultury ,odvozené z USSC, alcianovou modří. USSC byly pěstovány v sedimentační kultuře v chondrogenním diferenciačním médiu. Po 6 dnech v indukčním médiu nebylo barvením alcianovou modří detekovatelné žádné signifikantní množství proteoglykanů (PG), jako charakteristických markérů chondrogenní diferenciace (Panel A). Naopak, PG jsou snadno detekovatelné, jak je naznačeno modrou/zelenou barvou (Panel B).

Kromě toho přítomnost kolagenu typu II, specifického pro chrupavku, může být prokázána na úrovni proteinu. Obr. 13: Barvení kolagenu typu II (zelená) kultur USSC po chondrogenní diferenciaci.

USSC byly kultivovány v chondrogenním diferenciačním médiu. Ve 14. dnu byla prokázána exprese kolagenu typu II, proteinu extracelulární matrix, flurescenční mikroskopií s použitím primární protilátky anti-kolagen typu II a sekundární protilátky FITC anti-mouse. (Obr. 13B).

Další mnohostrannost neomezené kmenové buňky je zde prokázána diferenciací takové předchozí kultury, expandované podle PEI protokolu, na tukové buňky s použitím vyšších koncentrací dexamethasonu (příklad 5).

Obr. 14 ukazuje tukové buňky, které mohou být specificky barveny olejovou červení (Sigma). Adipocyty jsou charakteristické vysokým množstvím intracelulárních vesikul a specifickým barvením olejovou červení.

Kromě toho, když jsou USSC kultivovány po 24 hodin v H5100 s 10 μΜ 5'-azacytidinu a následně s 100 ng/ml bFGF, vykazují zřejmý důkaz svalové diferenciace. Změna v buněčné morfologii je doprovázena expresí slow-acting myosinu (Obr. 15 a 16).

·· · *» 4··· ·*»· • · · · * · · · · 9 • · » «4» < · · • » 4 · · 9 · ··· » • · · · 4 · ··»· » · * · ♦ · · C · ··

Kromě toho je pravidelně pozorováno objevení se a proliferace typických oválných buněk v pozdních pasážích (Obr. 17), jestliže USSC indukované PEI jsou subklonovány ze subpopulace CD34⁺, která je znázorněna na Obr. 6 (příklad 8). Tyto buňky v různých stupních exprimují enzym dipeptidyl peptidázu IV, což znamená, že takové oválné buňky mohou dále diferencovat na jaterní buňky.

In vitro expandované USSC přežívají a persistují po injekci do regenerujících jater myší SCID s částečnou 50% hepatektomií stejně, jako do nehepatektomizovaných jater, kde mononukleární buňky nemohou být detekovány, i když je transplantován 25krát vyšší počet buněk. Obr. 18 ukazuje přežívání a integraci kultur USSC po injekci do jaterního parenchymu myší SCID. Obr. 18 A: Červená fluorescence 7 dnů po transplantaci indikuje přežívání a integraci lidských USSC podle vynálezu značených PKH26 do jaterní tkáně myší (bez hepatektomie). Naopak, po transplantaci mononukleárních buněk odvozených z pupečníkové krve (MNC) nebyla detekovatelná žádná červená fluorescence naznačující integraci lidských MNC. Obr. 18 B: Kryo-řezy myší jaterní tkáně odpovídající A: Transmisní světelná mikrofotografie myší jaterní tkáně s integrovanými lidskými USSC.

Vzhledem k tomu, že prekursory pro jaterní buňky a pro pankreatické buňky β-ostrůvků jsou identické, mohou takové oválné buňky odvozené z pupečníkové krve (CB) také být diferencovány na inzulín produkující β-ostrůvkové buňky, což je činí užitečnými jako prostředky pro buněčnou terapii u diabetických pacientů nebo u pacientů se selháním jater.

Kromě těchto zřejmých klinických aplikací jakékoliv z dobře charakterizovaných a za standardních podmínek expandovaných komponent kmenových buněk a jejich potomstvo mohou být použity k monitorování a stanovení působení a molekulárních, jakož i celulárních účinků nově vyvíjených ·· * *r ***» ·· ··»« • ♦ · « 4 · t · · >

• Φ Φ · u Φ • « · · « 4 » • «« Φ Φ » Φ φ farmakologických látek, čímž mohou být nahrazeny určité pokusy na zvířatech.

Proto zde popsané dobře standardizovnaé kmenové buňky a diferencované buňky odvozené z kultur lidské pupečníkové krve mohou být použity jako cenné reagenty pro farmaceutický průmysl a pro průmysl s biomateriály.

Preparáty USSC za vhodných kultivačních podmínek vytvářely mnohonásobné kolonie odlišných hematopoetických linií, poskytujících důkaz, že tyto buňky mohou vést k hematopoese.

Ve vhodném kondicionovaném kultivačním médiu s definovanými koncentracemi VRGF, Fit 3L, SCGF (stem cell growth factor, růstový faktor kmenových buněk) a v methylcelulóze takové buňky vytvářejí smísené kolonie s buňkami rovněž pozitivními na FLK1+ a AC133+, Tiel a Tie2 markéry. Po další diferenciaci se vyvinuly charakteristiky markerového profilu pro endoteliální buňky s negativním AC133, CD31 ⁺ , CD54 ⁺ , VWF⁺, VE-Catherin⁺.

Je nárokována zřejmá použitelnost takových endoteliálních buněk pro růst autologních a allogeních krevních cév in vitro pro terapii vaskulárních onemocnění.

Současně je zřejmé, že všechny tyto in vitro generované a homogenně expandované progenitory a jejich diferencované buňky budou na úrovni klonů sloužit jako mimořádně významné prostředky pro stanovení role specifických genů a jejich produktů v buněčné biologii a pro všechny následující léčebné aplikace, založené na buňkami nebo molekulami zprostředkovaných terapiích.

Pouze malý počet těchto jedinečných buněčných typů je postačující pro tvorbu rozsáhlého počtu adherentně rostoucích USSC podle vynálezu a více diferencovaných mezenchymálních kmenových buněk pro produkci léčebně aplikovatelných regenerativních buněčných typů.

4« ··*· ·· ··· *

Zcela novým aspektem tohoto poznání je skutečnost, že takové progenitory se mohou asymetricky vyvíjet do dvou odlišně se diferencujících typů. Toto odhaluje nový biologický princip společné regulace komponentami ve funkčně orientované buněčné regeneraci, která probíhá dokonce i in vitro.

Přínosem tohoto vynálezu je, že terapie založené na kmenových buňkách mohou být navrženy podle tohoto principu a nespočívají pouze v jednom typu klonovaných buněk. Vynález je dále popsán v následujících neomezujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Odběr pupečníkové krve (cord blood - CB)

Odběr pupečníkové krve byl v porodnickém oddělení prováděn se souhlasem matky. Po narození dítěte, když byla placenta dosud v děloze, byla pupečníkové šňůra dvakrát zasvorkována a odříznuta 7 - 10 cm od pupíku. Po dezinfekci šňůry byla napíchnuta umbilikální žíla a CB byla odebrána do sběrných vaků obsahujících citrát-fosfát-dextrózu (CPD) jako antikoagulant.

Izolace mononukleárních buněk z pupečníkové krve

Pupečníkové krev byla opatrně převedena do roztoku

Ficcolu (o hustotě 1,077 g/cm³ ). Byla provedena hustotní gradientově centrifugace (450 g, teplota místnosti, 25 min). Mononukleární buňky (MNC) z interfáze byly odebrány a • · • · · · · · ···· «· ··· · · * ·· ·· dvakrát byly promyty fosfátovým fyziologickým roztokem, pH

7,3 (PBS).

Příprava adherentních vrstev fibroblastoidní morfologie

Mononukleární buňky byly vysety o hustotě přibližně 5xl0³ buněk/cm² do kultivačních lahví T25 (Nuncion) [A. ) ,

B.), C.)]. Pro iniciaci růstu adherentních kmenových buněk byly použity čtyři odlišné kultivační metody:

A). MNC z pupečníkové krve byly z počátku kultivovány v Myelocult H5100 médiu (StemCell Technologies, Vancouver/Canada) obsahujícím 10⁷ M dexamethasonu.

B. ) MNC z pupečníkové krve byly z počátku kultivovány v Mesencult médiu (StemCell Technologies, Vancouver/Canada) obsahujícím 10⁷ M dexamethasonu.

C. ) MNC z krve byly zpočátku kultivovány v DMEM low glucose (BioWhittaker) s 30% FCS obsahujícím 10⁷ M dexamethasonu.

D. ) MNC z pupečníkové krve byly vysety o hustotě 5xl0⁶/ml do 10 ml média Myelocult H5100 (StemCell technologies, Vancouver, Canada) do 50ml kultivačních láhví (Nuncion) bez dexamethasonu.

Všechny kultury byly kultivovány při 37 °C v 5% CO2 v plně nasycené atmosféře, byly vyživovány odstraněním veškerého média s neadherentními buňkami jednou za týden a přidáním 10 ml čerstvého média. V určitých časových intervalech byly adherentní vřetenovité buňky odstraněny použitím 0,05% trypsinu a 0,53 mM EDTA po 2 min, promyty médiem obsahujícím 50% sérum, shromážděny centrifugací při 780 g a analyzovány průtokovou cytometrií nebo RT-PCR. Po dvou až třech týdnech se objevily adherentní buňky s fibroblastoidní morfologií přibližně ve 30 % všech buněčných kultur.

• · ···· ·· ···· • · · · · • · · • · · · ·

Kultivační podmínky pro expanzi USSC podle, vynálezu

USSC podle vynálezu mohou být expandovány v médiu H5100 obsahujícím 10 ng/ml IGF I (Insulin-like growth factor-I, inzulínu podobný růstový faktor I), 10 ng/mlPDGFBB (Platelet-derived growth factor-BB, destičkový růstový faktor BB)a 10 ng/ml rh-human EGF (Recombinant Human epidermal growth factor, lidský rekombinantní epidermální růstový faktor) (PEI médium) o hustotě v rozmezí lxlO⁴ až lxlO⁵ buněk/ml (expanzní metoda A). Alternativně, preparáty USSC mohou být expandovány v iniciačním růstovém médiu A, B a C.

Příklad 2

Imunofenotypizace buněk cytofluorometrií

Aby mohl být stanoven imunofenotyp USSC, byly buňky barveny s anti-CD45 konjugovanou s FITC (Becton Dickinson, Coulter), anti-CDl4 konjugovanou s PE (PharMingen,

Coulter), antiSSEA-4 (MC-813-70) značenou kozím F(ab')₂anti-Mouse IgG+IgM (H + 1)-FITC (Coulter), anti-CD10-PE (CALLA, PharMingen), anti-HLA-class I (Coulter) značenou kozím F(ab')ž anti-Mouse IgG+IgM (H + 1)-FITC, anti-CD13-PE (Becton Dickinson, Coulter), anti-CD29 (Coulter), anti-CD44 (Coulter), anti-CD49e (Coulter), anti-CD90 (Coulter), antiHLA-class II-FITC (Coulter). Buňky byly analyzovány s použitím EPICS XL (Coulter) nebo FACS analyzéru (Becton Dickinson).

Příklad 3 • · • · · ·

Průkaz osteogenního diferenciačního potenciálu USSC

USSC získané tak, jak bylo popsáno v příkladu 1, byly kultivovány ve standardním médiu dokud nedosáhly 70% konfluence. Osteogenní diferenciace těchto buněk byla indukována přidáním 10’⁷ M dexamethasonu, 50 pg/ml kyseliny askorbové a 10 mM β-glycerolfosfátu (Bruder et al. 1994, Jaiswal et al., 1977). V 10.dnu stimulace vykazovaly buňky ukládání fosfátů vedoucí ke kostním nodulům. Mineralizované kostní noduly byly detekovány barvením alizarinovou červení následovně: Adherentní buňky v kultuře byly dvakrát promyty PBS, pH 7,3 a barveny s 5 ml 0,1% roztoku alizarinové červeně po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti, a následně s 0,1% kyselinou octovou a absolutním ethanolem, stejně jako PBS. Barvení vápníku alizarinovou červení a podle von Kossa prokazuje mineralizační potenciál těchto buněk (Stanford et al., 1995, Rungby et al., 1993). Osteogenní diferenciace byla rovněž prokázána pomocí RT-PCR s použitím diferenciačních markérů specifických pro kost, jako je osteokalcin (OC), osteopontin (OP), kostní specifická alkalická fosfatáza (AP), kostní sialo-protein (BSP), recetor alfa destičkového růstového faktoru (PDGFRa), receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR) a kolagen typu I.

Příklad 4

Průkaz chondrogenního diferenciačního potenciálu USSC.

Pro chondrogenní diferenciaci bylo 2xl0⁵ adherentních buněk umístěno do sedimentační kultury v 15ml propylenových zkumavkách. Jako kultivační médium bylo použito médium „DMEM high glucose obsahující dexamethason, prolin, • · · · puruvát sodný, ITS+ Premix a TGF-βΙ (Johnstone et al.,

1998, Yoo et al., 1998). V 7., 14. a 21. dnu byly buněčné frakce analyzovány pomocí RT-PCR na specifické genové produkty chrupavky kódující Cart-1, kolagen typu II a chondroadherin. Kromě toho byly USSC použity v sedimentačních kulturách. Po dvou týdnech byly řezy Dewax fixovány se 4% paraformaldehydem po dobu 15 min při teplotě místnosti a promyty ethanolem. Řezy byly barveny v 1% alcianová modř/3% kyselina octové, pH 2,5 (Sigma)po dobu 5 min a promyty destilovanou vodou. Jasně vykazovaly pozitivní barvení specifických proteoglykanů, jak bylo prokázáno barvením alcianovou modří (Obr. 12) (Chao, G. Et al., 1993). Po chondrogenní indukční periodě 14 dnů byly buňky fixovány podle standardního protokolu a analyzovány fluorescenční mikroskopií (Rosenbaum et al., 1998), která prokázala přítomnost kolagenu typu II ve specifické extracelulární matrix (Obr. 13 B).

Příklad 5

Průkaz adipogenního diferenciačního potenciálu USSC

USSC byly kultivovány v H5100 obsahujícím 10^-6 M dexamethasonu, 50 μή/ml kyseliny askorbové a 10 mM βglycerolfosfátu, což vedlo k částečné diferenciaci USSC na adipocyty, jak bylo prokázáno barvením olejovou červení (Ramirez-Zacarias et al., 1992).

Příklad 6

Průkaz neurogenního diferenciačního potenciálu USSC

Izolace buněk a kultivační podmínky pro gliální buňky

Mononukleární buňky z pupečníkové krve získané tak, jak bylo popsáno, byly zbaveny buněk CD14 + pomocí izolačního systému „CD14/magnetic activated cell sorting (MACS) využívajícího VS+ separační sloupce podle návodu výrobce (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach). Mononukleární buňky zbavené CD14 byly kultivovány o hustotě 2xl0⁶/ml v 10 ml High Glucose Medium (Dulbecco's MEM s 4 500 g/1 glukózy)v T25 kultivačních lahvích (Nunclon) a inkubovány při 37 °C v 5% CO₂ v plně nasycené atmosféře. Po 10 - 15 dnech byly detekovány buňky gliálního tvaru.

Diferenciace k neurálním buňkám

A) Buňky byly expandovány po 7 dnů buďto v H5100 médiu samotném, nebo v přítomnosti 40 pg/ml PDGFB, 10 pg/ml EGF, 10 pg/ml IGF-I. Buňky byly ošetřeny trypsinem a vysety o hustotě přibližně 3,5xl0³ buněk/cm² do 24-jamkových kultivačních ploten na víčka potažená póly D-lysinem (PDL) a lamininem (PDL/lam). Následně byla iniciována diferenciace přidáním indukčních agens, jako je all-trans kyselina retinová (10^-5 M) , bGFG (20 ng/ml) a NGF-β (50 ng/ml).

Fluorescenční mikroskopie

Po indukční periodě (27 dnů) byly buňky fixovány podle standardního protokolu (Rosenbaum et al., 1998) a barveny s protilátkami proti neurálním specifickým antigenům.

Vzorky byly analyzovány s použitím fluorescenční a transmisní světelné mikroskopie.

• · · ·

Příklad 7

Průkaz diferenciačního potenciálu na myocytickou linii lxlO⁴ USSC bylo kultivováno v H5100 médiu (StemCell Technology), doplněném 10 ng/ml PDGFBB, 10 ng/ml EGF, 10 ng/ml IGF, při 37 °C, 5% CO₂, dokud nebylo dosaženo 70% konfluence. Pak byly buňky inkubovány s 10 μΜ 5'azacytidinu (Sigma) po 24 h, dvakrát promyty PBS a kultivovány v H5100 médiu doplněném 100 ng/ml bFGF (Sigma). Po 1 týdnu v diferenciačním médiu došlo ke změně morfologie buněk (Obr. 15). Po 10 dnech byly buňky ošetřeny trypsinem a přeneseny do fibronektinem potažené skleněné komůrky pro imunobarvení.

Imunohistochemie

Buňky byly fixovány pomocí 5% formaldehyd/PBS po dobu 15 min a promyty dvakrát PBS, pH 7,3. S použitím standardního protokolu byly buňky inkubovány se specifickou primární protilátkou anti-skeletální myosin (slow) (klon NOQ7.54D, 1:400) (znázorněno zeleně) a primární protilátkou anti-CDl3. (znázorněno červeně), nebo s monoklonální primární protilátkou anti-skeletální myosin (klon MY-32, 1:4000). Barvení pro USSC kultivované za výše uvedených podmínek bylo pozitivní (Obr. 16).

Příklad 8

Lidské buňky USSC stejně jako mononukleární buňky odvozené z pupečníkové krve (MNC) byly značeny s PKH26 RED

Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, PKH26-GL). 2xl0⁵ USSC a

5xl0⁶ MNC bylo injikovány do jaterního parenchymu myší SCID • · • · • · s a bez 50% hepatektomie. 7 dnů po transplantaci bylo dosaženo kompletní jaterní regenerace u hepatektomizovaných zvířat. Jaterní tkáň byla analyzována fluorescenční mikroskopií kryo-řezů na přítomnost červeně značených lidských buněk (Obr. 18).

Příklad 9

Průkaz potenciálu USSC k diferenciaci na hematopoetickou linii.

Tři odlišné preparáty USSC (USSC^KCB55 v médiu DMEM obsahující 30 % FCS, USSC^KCB121 v médiu H5100 obsahujícím dexamethason, USSC^KCB13 v médiu MesenCult obsahujícím dexamethason a USSC^GK121 v médiu H5100 obsahujícím PEI) rostoucí ve vhodném expanzním médiu po prodlouženou dobu (pasáže 5 až 8) byly vysety v množství 250 μΐ buněčné suspenze (2xl0⁴ - 2xl0⁵ ) buněk trojmo do 24-jamkových destiček v kultivačním médiu specifickém pro hematopoesu. (Methocut 4434). Byly počítány kolonie o více než 50 buňkách a podle zavedených kriterií byly klasifikovány jako buňky odvozené z granulocyt/makrofága (CFU-GM), časného erythroidu (BFU-E) nebo multipotentní (CFU-GEMM) progenitorové buňky. Za diferenciačních podmínek byla zřejmá tvorba kolonií v odlišných kulturách od prvého týdne pozorování až po následující tři týdny. Preparáty USSC vytvářely mnohonásobné kolonie odlišných linií, což poskytlo důkaz o tom, že tyto buňky mohou vést k hematopoese.

Příklad 10 • · · · • · ttt!

Molekulární metody pro analýzu neomezených somatických kmenových buněk a jejich následných diferenciačních produktů

Byly vybrány PCR-primery pro amplifikaci specifických cDNA sekvencí osteokalcinu, osteopontinu, kostního sialoproteinu, alkalické fosfatázy, PDGFRa a EGF receptoru z odlišných příslušných exonů tak, aby bylo možné je rozlišit podle velikosti jejich odpovídajících generovaných fragmentů DNA. Prostřednictvím klonování do vektoru pCRLl (Invitrogen/USA) a následné transformace do kmene E.coli TOP 10F byly získány odpovídající specifické cDNA klony , které byly charakterizovány pomocí cyklického sekvenování na automatickém sekvenátoru (Applied Biosystems).

Reakce RT-PCR byly prováděno ve dvoustupňovém postupu. 200 ng celkové RNA buněk bylo nejdříve reverzně transkribováno s 10 U AMV reverzní transkriptázy (Promega, Mannheim), 1,5 pmol 3'-genově specifickými primery, 1 mM dNTPs a doplňkovým pufrem (Promega, Manheim) v objemu 20 μΐ po 1 h při 50 °C. PCR reakce byla prováděna s 2 μΐ cDNA s 1 U HotStarTaq DNA polymerázou, pufrem a Q-roztokem (Qiagen, Hilden), 1,5 mM dNTPs a 20 pmol 3'- a 5'- genově specifického primeru. Reakce PCR byla prováděna s iniciačním stupněm po dobu 15 min pří 95 °C, 37 cyklů při 94 °C po 30 s, 56 °C po 30 s, 68 °C po 1 min a finálním polymerizačním stupněm po dobu 5 min při 68 °C.

. Tabulka 4: PCR-primery pro amplifikaci specifických cDNA sekvencí

Tabulka ukazuje 5'- a 3'- sekvence primerů vyšetřovaných genů a očekávanou délku PCR fragmentu v bp (párech baží).

• · · ·

název	5 'primerová sekvence	3 'primerová sekvence	bp
PDGFRalfa	acagtggagattacgaatgtg	ca ca rca gtg gtg atctca g	251
IGFR	cgagtggagaaatctgcgg	gaccagggcgtagttgtag	272
EGFR ·'·'··.··.	tg cca ca a cca g tgtg ct	ccacataattacggggacac .	205
Ineurofilament	attcgcgcgcagcttgaag	cctggtaggaggcaatgtc	2€5
GFAP	ctctccctg g ctcg a a tg c	cctcctg ata a ctg g ccg	871
, synaptophysin	cctgcagaacaagtaccgag	ccttg ctg cccata gtcg c	515
tyrosin hydroxyláza	caccttcgcgcagttctcg	ctgtccagcacgtcgatgg	387
VB1 . '	ggtgaggaggcagcaaatgt	agggttggaatactgtggtc	279
Runxl	gcaagctgaggagcggcg	gaccgacaaacctgaagtc	296
AMLlc	cagtgcttcatgagagaatgc	gaccgacaaacctgaagtc	453
Cart-1	ggagacgctggacaatgag	g gta g ctgtcagtccttg g c	560
CD105	cctgccactggacacagg	atggcagctctgtggtgttg	411
kolagen typu I	ggacacaatggattgcaagg	aaccactgctccactctgg	441
kolagen typu II	tttccca g gtca a g atg gtc	cttca gca cctgtctca cca	377
osteokalcin	agtccagcaaaggtgcagc	ggccgtagaagcgccgat	231
alkalická fosfatáza	gcttcagaagctcaacacca	cgttgtctgagtaccagtcc	454
ibeta aktin	gagaaaatcttgcaccacac	ctcg gtg a g g atcttcat	340

• · · ·

Odkazy

Bruder S., Fink DJ., and Caplan AI. (1994). Mesenchymal sterri celíš in bone formation, bone repair, and skeletal regeneration therapy. J. Cell. Biochem. 56: 284.

Caplan, AI., Mesenchymal stem cells. (1991) J. Orthop. Řes. 9: 641-50.

Grompe, M and Fínegold M.J. Liver Stem Cells. / p. 455 - 497 from Stem Cell Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Grompe, M. and Finegold MJ. Liver stem cells . p. 455-497 from Stem Cell Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Halí, C. L.; Yang, B.; Yang, X.; Zhang, S.; Turley, M.; Samuel, S.; Lange, L. A.; Wang, C.; Curpen, G. D.; Sáváni, R. C.; Greenberg, A. H.; Turley, E. A. :

Overexpression of the hyaluronan receptor RHAMM.is transforming and is also required for H-ras transformation. Cell 82: 19-26, 1995.

Itano, N.; Kimata, K. Expression cloning and molecular characterization of HAS protein, a eukaryotic hyaluronan synthase. J. Biol. Chem. 271: 9875-9878, 1996

Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI, Bruder SP. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 1997 Feb;64(2):295-312.

Johnstone B, Hering TM, Caplan AI, Goldberg VM, Yoo JU. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp Cell Res. 1998 Jan 10;238(l):265-72.

Knittel T, Kobold D, Piscaglia F, Saile B, Neubauer K, Mehde M, Timpl R, Ramadori G. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normál and diseased rať livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulatlons in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol 1999 Nov;112(5):387-401 • · ·

Kritzik M.R. and Sarvetnick N. Pancreatic Stem Celíš, p. 499 - 513 from Stem

Cell Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Mareschi K, Biasin E, Piacibello W, Aglietta M, Madon E, Fagioli F. Haematologica 2001 0ct;86(10):1099-100. Isolation of human mesenchymal stem celíš: bone marrow versus umbilical cord blood.

Pan, T.-C.; Sasaki, T.; Zhang, R.-Z.; Fassler, R.; Timpl, R.; Chu, M.-L. : Structure and expression of fibulin-2, a novel extracellular matrix protein with multiple EGF-Iike repeats and consensus motifs for calcium binding. 1. Cell Biol. 123: 1269-1277, 1993.

Ramirez-Zacarias JL,Castro-Munozledo F, Kuri-Harcuch W. Histochemistry 1992 Jul;97(6):493-7. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with Oil red O.

Rosenbaum, C., Kluwe, L., Mautner, VF., Friedrich, R.E., Muller, HW., Hanemann, CO. (1998): Enhanced proliferation and potassium conductance of Schwann celíš isolated from NF2 schwannomas can be reduced by quinidine. Neurobiol Dis 5, 55-64.

Rungby J, Kassem M, Eriksen EF, Danscher G. Histochem 3. 1993

3un;25(6):446-51. The von Kossa reaction for calcium deposits: silver lactate staining increases sensitivity and reduces background.

Stanford CM, Jacobson PA, Eanes ED, Lembke LA, Midura R3. 3 Biol Chem 1995 Apr 21;270(16) :9420-8. Rapidly forming apatitic minerál in an osteoblastic cell line (UMR 106-01 BSP).

Shapiro A.M. 3., Lakey 3. R.T., Ryan E. A., Korbutt G. S., Toth E., Warnock G. L., Kneteman N. M., Rajotte R. V. N Engi J Med 2000 3uL 27; (343):230-238. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Giucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.

Sztrolovics, R.; Chen, X.-N.; Grover, 3.; Roughley, P. 3.; Korenberg, J. R. :

Localization of the human fibromodulin gene (FMOD) to chromosome lq32 and completion of the cDNA sequence. Genomics 23: 715-717, 1994.

Tsuda T, Wang H, Timpl R, Chu ML. Fibulin-2 expression marks transformed mesenchymal cells in developing cardiac valves, aortic arch vessels, and coronary vessels. Dev Dyn 2001 Sep;222(l):89-100

Van der Schoot, C. E.; Huizinga, T. W. J.; Gadd, S. K.; Majdic, O.; Wijmans, R.; Knapp, W.; Von dem Borne, A. E. G. : Identification of three novel PIlinked proteins on granulocytes.In: Knapp, W.; Dorken, B.; Gilks, W. R.; Rieber, E. P.; Schmidt, R. E.; Stein, H.; Von dem Borne, A. E. G. K. : Leukocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens. Oxford: Oxford Univ. Press (pub.) 1989. Pp. 887-891

Yoo JU, Barthel TS, Nishimura K, Solchaga L, Caplan AI, Goldberg VM, Johnstone B. The chondrogenic potential of human bone-marrow-derived mesenchymal progenitor cells. J Bone Joint Surg Am. 1998 Dec;80(12) :174557.

Zhang, R.-Z.; Pan, T.-C.; Zhang, Z.-Y.; Mattei, M.-G.; Timpl, R.; Chu, M.-L. : Fibulin-2 (FBLN2): human cDNA sequence, mRNA expression, and mapping of the gene on human and mouše chromosomes. Genomics 22: 425-430, 1994.

Významy použitých zkratek

DAG osteogenní diferenciační médium obsahující dexamethason, kyselinu askorbovou a β-glycerolfosfát

HLA lidský leukocytový antigen

MSC mezenchymální kmenová buňka

PEI médium obsahující PDGF-BB, EGF a IGF

SSEA4 stadiově specifický časný antigen 4

USSC neomezená somatická kmenová buňka

PG proteoglykany

Claims

Patentové nároky i3j

1.Neomezená somatická kmenová buňka (USSC) získaná z lidské pupečníkové krve, placentální krve a/nebo krevních vzorků novorozenců, kde řečená somatická kmenová buňka je odlišitelná od, ale schopná diferencovat na mezenchymální kmenové nebo progenitorové buňky, hematopoetickou linii kmenových nebo progenitorových buněk, neurálních kmenových nebo progenitorových buněk nebo endoteliálních kmenových nebo progenitorových buněk.
2.Somatické kmenové buňky podle nároku 1 reagující negativně s markéry specifickými pro CD45, a CD14 a pozitivně s markérem pro CD13, CD29, CD44 a CD49 povrchových antigenů.
3.Somatická kmenová buňka podle nároku 1 reagující pozitivně s markérem SSEA4 embryonální kmenové buňky po kultivaci ve vhodném médiu a exprimující transkripční faktory YB1, AML-1 a RUNX-1.
4.Somatické kmenové buňky zřetelně odlišitelné od mezenchymálních kmenových buněk na základě tkáňového zdroje pro izolaci a vzorků exprimovaných povrchových antigenů (HLA I), stejně jako transkripčních faktorů.
5.Somatické kmenové buňky podle nároku 1 odlišitelné od MCS na základě exprese fibulinu-2 (číslo v genové bance X82494) a absence exprese hyaluronan syntázy (D84424), fibromodulinu (U05291) a 1NFLS (WO3846), jak je stanoveno Affimetrix analýzou.

·· · · ··*« ·· ····
6.Somatické kmenové buňky podle nároku 1, které mají fibroblastoidní buněčný tvar a požadavky adherentního růstu.

··· ··· ♦ · • · ··· ···· • · * ·· · · · ·· · ·
7. Pluralita nebo směs somatických kmenových buněk podle nároku 1, somatické kmenové buňky pro hematopoetickou linii, přednostně exprimující AC133 a CD34, mezenchymální progenitorové somatické kmenové buňky, neurální progenitorové somatické kmenové buňky nebo jejich kombinace.
8. Pluralita nebo směs somatických kmenových buněk podle nároku 7, kde mezenchymální progenitorové buňky nebo neurální progenitorové buňky jsou diferencovány z kmenové buňky podle nároku 1.
9. Léčivo obsahující somatické kmenové buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo pluralitu nebo směs somatických kmenových buněk podle nároku 7 a/nebo 8.
10. Způsob použití neomezených somatických kmenových buněk podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo plurality nebo směsi kmenových buněk podle nároku 7 a/nebo 8 v genové terapii, náhradě orgánů, testování farmaceutik, testování biomateriálů včetně ortopedických zařízení, in vitro růstu krevních cév, terapii vaskulárních a srdečních nemocí nebo onemocnění hladkého svalstva, kostí a jater, pankreatických a neurálních onemocněních.
11. Způsob pro izolaci a purifikaci neomezených neonatálních kmenových buněk podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 zahrnující kroky hustotní gradientově izolace, kultivace adherentních buněk a subkultivace s použitím růstových faktorů.