PT1404815E

PT1404815E - Células estaminais somáticas não restritas (ussc) derivadas do sangue do crodão umbilical humano

Info

Publication number: PT1404815E
Application number: PT01990388T
Authority: PT
Inventors: Peter Wernet
Original assignee: Kourion Therapeutics Ag
Priority date: 2000-11-03
Filing date: 2001-11-03
Publication date: 2006-12-29
Also published as: CZ20031165A3; JP4799804B2; EA008619B1; JP2004521617A; DE60123293T2; CN1553951A; ATE340255T1; AU2002229533B2; DK1404815T3; NO20031999D0; US20020164794A1; US7560280B2; IL155608A0; EP1404815B1; EP1404815A2; US20090238803A1; CA2426987C; IL155608A; CA2426987A1; EE200300205A

Description

DESCRIÇÃO "CÉLULAS ESTAMINAIS SOMÁTICAS NÃO RESTRITAS (USSC) DERIVADAS DO SANGUE DO CORDÃO UMBILICAL HUMANO" A presente invenção refere-se à utilização de uma célula estaminal somática ou uma pluralidade de células estaminais, para a preparação de um medicamento.

Embora as células estaminais estejam permanentemente em auto-substituição, elas têm geralmente um ciclo lento. Convencionalmente, crê-se que estas células originam uma população celular de amplificação transitória com capacidade limitada de auto-renovação, para aumentar o número de células diferenciadas. Até agora, o desafio tem sido em localizar células estaminais no ser humano adulto e, deste modo, foi utilizada uma variedade de marcadores sucedâneos (e. g., testes de formação de colónia para a linhagem hematopoiética) na literatura existente.

Uma variedade de Patentes US, e. g., US 5486359; 5591625; 5736396; 5811094; 5827740; 5837539; 5908782; 5908784; 5942225; 5965436; 6010696; 6022540; 6087113; 5858390; 5804446; 5846796; 5654186; 6054121; 5827735; 5906934 é relativa a células estaminais mesenquimais (MSC), que podem ser diferenciadas em diversas células progenitoras, por exemplo células progenitoras do músculo, células progenitoras do tecido conjuntivo ou células ovais. As células progenitoras do músculo são ainda diferenciadas em células do músculo cardiaco, esquelético assim como liso, enquanto que o progenitor celular do tecido conjuntivo pode diferenciar-se em osso, cartilagem assim como 1 gordura. As células ovais podem diferenciar-se em células do fígado ou pâncreas (Grompe et al., 2001).

Erices A. et al. ("Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood", British Journal of Haematology (2000), 109, pp. 235-242) divulga que células mononucleares derivadas do sangue do cordão umbilical, quando estabelecidas em cultura, originam células aderentes, que apresentam quer um fenótipo de tipo osteoclasto ou mesenquimal. O último apresenta uma morfologia de tipo fibroblasto e expressa diversos antigénios relacionados com a célula progenitora mesenquimal (SH2, SH3, SH4, ASMA, MAB 1470, CD13, CD29 e CD49e). A presença de células estaminais não hematopoiéticas no sangue do cordão umbilical está ainda sob discussão (Mayani et al. 2000, Mareschi et al. 2001) . O pedido de patente Alemã DE 19803267 Al foi o primeiro a descrever progenitores de osteoblastos e a formação de osso a partir do sangue do cordão umbilical humano.

Contudo, a utilização destas células progenitoras mesenquimais da técnica anterior está frequentemente limitada uma vez que estão demasiado desenvolvidas a fim de serem ferramentas úteis para gerar órgãos ou tecidos. Por outras palavras, elas parecem já estar demasiado comprometidas e especializadas para produzir um órgão ou tecido regenerador funcional. É, deste modo, um objectivo da invenção proporcionar a utilização de uma célula estaminal que seja capaz de se diferenciar em células progenitoras diferentes, tais como células mesenquimais, células neuronais, células sanguíneas ou células endoteliais, para a preparação de um medicamento. É 2 outro objectivo da invenção proporcionar a utilização de uma célula estaminal que não tenha os inconvenientes de células estaminais embrionárias para a preparação de um medicamento.

Foi descoberto que uma célula estaminal somática recentemente identificada é capaz de resolver os objectivos abordados acima. A célula estaminal somática da invenção é derivada do sangue do cordão umbilical humano, do sangue da placenta e/ou do sangue de uma criança recém nascida, sendo a referida célula estaminal somática distinta de mas capaz de se diferenciar em células estaminais ou progenitoras mesenquimais, células estaminais ou progenitoras de linhagem hematopoiética, células estaminais ou progenitoras neuronais ou células estaminais endoteliais ou progenitoras do figado. Estas células representam o progenitor da linhagem hematopoiética, as células estaminais mesenquimais assim como células estaminais neuronais. Esta capacidade multifuncional única e a tecnologia para expandir estas células estaminais somáticas não restritas (USSC) derivadas do sangue do cordão umbilical (CB), quer como essas células somáticas estaminais ou como células comprometidas sob protocolos de diferenciação distintos, permite caracterização precisa, padronização e utilização para a produção e implementação de terapia de célula estaminal em medicina regenerativa. A Fig. 1 mostra uma fotomicrografia de células de cultura de USSC primárias plaqueadas a baixa densidade. A Fig. 2 mostra uma fotomicrografia de cultura confluente de USSC. A Fig. 3 mostra uma análise por FACS para o antigénio CD45 ao longo de cultura in vitro. 3 A Fig. 4 mostra uma análise por FACS para o marcador embrionário SSEA4. A Fig. 5 mostra uma análise por FACS para HLA-classe I (A, B, C), HLA DR e CD14. A Fig. 6 mostra um FACS cinético para o marcador de superfície CD34. A Fig. 7 mostra uma fotomicrograf ia de células USSC após indução neuronal. A Fig. 8 mostra que as USSCs da invenção expressam o marcador da célula estaminal neuronal nestina, por imunocoloração com anti-nestina. A Fig. 9 mostra células geradoras de USSCs da linhagem neuronal. A Fig. 10 mostra células geradoras de USSCs da linhagem glial. A Fig. 11 mostra a formação de nódulos mineralisados após indução osteogénica e após coloração com vermelho de alizarina (B). A Fig. 12 mostra coloração Alcian Blue de cultura sedimentar derivada de USSC. A Fig. 13 mostra coloração de colagénio tipo II (verde) de culturas de USSC após diferenciação condrogénica. A Fig. 14 mostra diferenciação adipogénica de culturas de USSC como demonstrado por coloração de Oil Red. 4 A Fig. 15 mostra fotomicrografias de culturas de USSC antes e depois de diferenciação miogénica. A Fig. 16 mostra imunocitoquimica para a miosina de actuação lenta após tratamento com azacitidina. A Fig. 17 mostra o fenótipo celular oval de derivados de USSC. A Fig. 18 mostra a sobrevivência e a integração de culturas de USSC após injecção no parênquima de figado de murganho SCID.

As células estaminais somáticas da invenção podem ser isoladas e purificadas através de diversos métodos, compreendendo os passos de isolamento em gradiente de densidade, cultura de células aderentes e subcultura aplicando factores de crescimento, como descrito no exemplo 1. Após estar estabelecida uma camada de células confluentes, o processo de isolamento para derivar células desta invenção é rotineiramente controlada através de morfologia (morfologia fibroblastóide) e análises fenotipicas utilizando anticorpos dirigidos contra os antigénios de superficie CD13 (positivo), CD14 (negativo), CD45 (negativo) e CD29 (positivo; ver exemplo 2) . A célula estaminal somática da invenção é feita reagir negativamente com marcadores específicos para a linhagem hematopoiética, tal como CD45 e, por esse motivo, é distinta de células estaminais hematopoiéticas que também podem ser isoladas a partir do sangue do cordão umbilical placentário. O CD14 é outro antigénio de superficie que não pode ser detectado em USSCs. Adicionalmente, a célula estaminal desta invenção é caracterizada por um conjunto de antigénios que estão presentes 5 na superfície celular, tais como CD13, CD29, CD44 e CD49e. As preparações de USSC são ainda caracterizadas através da presença de transcriptos de ARNm para determinadas moléculas receptoras como o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGF-R), receptor alfa do factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF-RA) e o receptor do factor de crescimento da insulina (IGF-R). Estas células estão também tipicamente a expressar factores de transcrição, tais como YB1 (factor de transcrição 1 da Y-box), Runxl (factor de transcrição 1 relacionado com runt) e AML 1C (factor de transcrição 1 da leucemia mielóide) como detectado através de RT-PCR. Contudo, as preparações de USSC são tipicamente negativas para transcriptos para o factor de transcrição condrogénico Cart-1 e marcadores neuronais, tais como neurofilamento, sinaptofisina, tirosina hidroxilase (TH) e proteína glial fibrilar acídica (GFAP).

Tabela 1.: Análise dos padrões de transcrição de USSCs através de RT-PCR

Os resultados de RT-PCR realizados com iniciadores oligonucleotídicos previstos e ARNm de USSCs e ARNm de controlo positivo de outros tecidos como osso, cartilagem, cérebro ou células mononucleadas do sangue do cordão umbilical. 6

Nome Resultado de PCR de USSC Resultado de PCR (outro tecido) PDGFR Alfa + + (osso de adulto) IGFR + + (osso de adulto) Neurofilamento - + (figado de adulto) CD105 + + (células mononucleares de CB) GFAP - + (cérebro fetal) Sinaptofisina - + (cérebro fetal) Tirosina hidroxilase + (cérebro fetal) YB1 + + (cérebro fetal) Runxl + + (osso de adulto) AML lc + + (osso de adulto) BMPR II + + (cartilagem de adulto) Colagénio Tipo I + + (osso de adulto) Cart-1 + (células mononucleares de CB) Condroaderina - + (osso de adulto) CD4 9e + + (osso de adulto) A expressão de ARN de preparações de USSC e MSCs derivadas de medula óssea (Caplan, 1991) foi comparada directamente através da utilização de microarrays quantitativos Affymetrix GeneChip™. 0 transcripto do gene Fibulina-2 (número X82494 do gene bank) foi detectado em USSCs a niveis de expressão elevados mas não em MSCs. A produção de Fibulina-2 foi previamente demonstrada em fibroblastos (Pan et al., 1993). A análise de transferência de Northern de ARNm de vários tecidos humanos revela um transcripto de 4,5-kb abundante em tecidos do coração, placenta e ovário (Zhang et al., 1994). A proteína foi 7 localizada ao nível do microscópio óptico em embriões humanos de 4-10 semanas de gestação, utilizando anticorpos policlonais. A Fibulina-2 foi detectada principalmente dentro do neuroepitélio, gânglios espinais e nervos periféricos (Miosge et al., 1996)

No modelo animal de rato, os miofibroblastos do fígado de rato (rMF) estão colocalizados com fibulina-2. Estas células foram localizadas na área portal, nas paredes das veias centrais, e apenas ocasionalmente no parênquima. Em fases precoces de fibrose, os rMF foram detectados dentro das cicatrizes em desenvolvimento. Em fases avançadas de fibrose, os rMF são responsáveis pela maioria das células localizadas dentro da cicatriz (Knittel et al., 1999). Num outro modelo animal, a proteína Fibulina-2 de murganho é expressa durante a transformação epitelial-mesenquimal na matriz do coxim endocárdico durante o desenvolvimento embrionário do coração. A Fibulina-2 é também sintetizada através das células precursoras do músculo liso de vasos do arco aórtico em desenvolvimento e das células coronárias endoteliais que são originadas de células da cristã neural e de células epicárdicas, respectivamente (Tsuda et al., 2001).

Os transcriptos do gene da Hialuronano Sintase (D84424), gene da Fibromodulina (U05291) e o transcripto de 1NFLS (W03846) não foram detectados em USSCs mas em níveis elevados em MSC. A análise de transferência de Northern indicou que a Hialuronano Sintase é ubiquamente expressa em tecidos humanos (Itano e Kimata, 1996). O produto desta enzima, hialuronano, serve uma variedade de funções, incluindo enchimento de espaço, lubrificação das articulações, e provisão de uma matriz através das quais as células podem migrar (Hall et al., 1995). A fibromodulina é um membro de uma família de pequenos proteoglicanos intersticiais. A proteína apresenta uma vasta distribuição tecidular, com a maior abundância observada na cartilagem articular, tendão e ligamento (Sztrolovics et al., 1994) . O transcripto de 1NFLS foi clonado a partir de figado fetal humano. O gene CD24 (L33930) é expresso num nivel muito baixo nas USSCs comparado com o nivel de expressão nas MSCs. O CD24 é expresso em muitas células de linhagem B e em granulócitos maduros (Van der Schoot et al., 1989).

Quando comparadas com MSCs, as células somáticas desta invenção são distintas com base na fonte de tecido de onde são isoladas. Além disso, as USSCs são caracterizadas pela não expressão da classe I do antigénio do leucócito humano (HLA-classe I). Em contraste com as células estaminais somáticas desta invenção, as MSCs previamente descritas isoladas a partir de medula óssea e tecido muscular, expressam niveis muito elevados do antigénio HLA-classe I na sua superfície celular. A célula desta invenção também expressa o antigénio precoce 4 específico da fase (SSEA4) (ver Fig. 4).

Tipicamente, a célula estaminal somática da invenção mostra forma celular fibroblastóide e prolifera de um modo aderente.

Numa forma de realização preferida da presente invenção a célula estaminal somática da invenção (USSC) está presente numa pluralidade ou misturas representando precursores de outras células estaminais somáticas, e. g., da linhagem hematopoiética, de um modo preferido, expressando AC133 e CD34, células estaminais somáticas progenitoras mesenquimais, células estaminais somáticas progenitoras neuronais ou suas combinações. Esta forma de realização é vantajosa uma vez que compreende um elevado potencial regenerativo baseado na capacidade para 9 diferenciar noutras células estaminais somáticas diferentes ou a presença dessas células estaminais somáticas como forma de realização preferida da invenção. De um modo preferido, as células estaminais somáticas progenitoras mesenquimais ou as células estaminais somáticas progenitoras neuronais são produzidas por diferenciação a partir de uma célula estaminal da invenção.

Dependendo do tipo de doença, é adequada administração local e/ou sistémica das USSCs. As USSCs podem ser aplicadas directamente ou conjuntamente com veiculos ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Pode ser vantajoso adicionar substâncias adicionais que promovam a cura das doenças.

Basicamente, os métodos conhecidos para a aplicação de MSCs podem ser aplicados de um modo análogo quando se aplicam USSCs. Além disso, a aplicação de células estaminais é descrita, por exemplo, em B. E. Strauer et al., "Intrakoronare, humane autologe Stammzelltransplantation zur Myokardregeneration nach Herzinfarkt", Dtsch med Wochenschr 2001/ 126: 932-938/ Quarto R., et al. "Repair of Large Bone Defects with the Use of Autologous Bone Marrow Stromal Cells", N Engl J Med 2001/ 344:385-386/ Vacanti C. A., "Brief Report: Replacement of an Avulsed Phalanx with Tissue-Engineered Bone" N Engl J Med 2001/ 344:1511-1514, 17 de Maio de 2001/ Hentz V. R., "Tissue Engineering for Reconstruction of the Thumb", N Engl J Med 2001/ 344:1547-1548/ Brittberg M., "Treatment of Deep Cartilage Defects in the Knee with Autologous Chondrocyte Transplantation", N Engl J Med 1994/ 331:889-895, 6 de Outubro de 1994/ Freed C. R., "Transplantation of Embryonic Dopamine Neurons for Severe Parkinson's Disease",N Engl J Med 2001/ 344:710-719/ Shin'oka T., "Transplantation of a Tissue-Engineered Pulmonary Artery", N Engl J Med 2001/ 344:532-533. Shapiro A. M. J., Islet Transplantation in Seven Patients with 10

Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free

Iminunosuppressive Regímen N Engl J Med 2000; 343:230-238.

As células estaminais da invenção são adicionalmente descritas em maior detalhe.

As células estaminais da invenção são células aderentes com uma forma celular fibroblastóide e dois ou três nucléolos (ver Fig. 1) obtidas após tratamento de EDTA e tripsina e re-inonulação sob condições de cultura apropriadas (exemplo 1), expandindo rapidamente até à confluência de uma morfologia longa esticada (Fig. 2) . A Fig. 1 mostra uma fotomicrografia de uma cultura primária de USSC. As células plaqueadas a baixa densidade demonstram a morfologia fibroblastóide das USSCs. Estas células podem ser prontamente cultivadas para além de mais de 14 repicagens. A Fig. 2 mostra uma f otomicrograf ia de uma cultura confluente de USSC. Uma camada de USSC de células quase confluentes mostra uma orientação paralela das células. O fenótipo marcador de superfície da camada primária de células aderentes assim como todos os seus derivados em repicagens subsequentes, é e permanece negativo para o marcador CD45. A Fig. 3 mostra uma análise por FACS para o antigénio CD45 ao longo de cultura in vitro. O CD45, um antigénio marcador característico para a célula hematopoiética é quase não detectável em USSCs de repicagens mais tardias. (Fig. 3 nos dias 48, 54, 82) .

Após cultura in vitro utilizando o método A (exemplo 1), as preparações de USSC tornam-se positivas para o antigénio precoce 4 específico de fase (SSEA4) e mostram a expressão homogénea deste marcador embrionário. A Fig. 4 mostra uma análise por FACS para o marcador embrionário SSEA4. As células expandidas através do método A (exemplo 1) mostram fortemente expressão do 11 antigénio precoce 4 específico de fase (SSEA4). Ao mesmo tempo, as culturas de USSC são negativas para a expressão do antigénio de superfície HLA-classe I. (Fig. 5A) , expressão de antigénio HLA-DR. (Fig. 5B) assim como negativo para CD14 (Fig. 5C) . A Fig. 5 mostra uma análise por FACS para HLA-classe I (A, B, C) , HLA DR e CD14. As culturas de USSC da invenção após expansão in vitro são negativas para antigénios HLA-classe I (Painel A) . Estas células são também negativas para os antigénios de superfície HLA-DR (Painel B) e CD14 (Painel C) , características para células apresentadoras de antigénio (HLA-DR) e monócitos (CD14). A Fig. 6 mostra um FACS cinético para o marcador de superfície CD34. As USSCs foram cultivadas em H5100/PEI durante mais de 10 repicagens. Durante este período de cultura foi observado um aumento significativo de expressão do antigénio CD34. Relativamente ao marcador da célula estaminal hematopoiética CD34, a Fig. 6 revela que na repicagem 3 até ao dia 54 não podem ser detectadas células positivas a CD34. Em contraste, na sétima repicagem no dia 82, está a aparecer uma nova subpopulação positiva a CD34. Por outro lado, se esses progenitores positivos a CD34 ou/e FIK1 forem cultivados com meio condicionado por citocina, específico para diferenciação hematopoiética, as colónias hematopoiéticas ou mistas típicas para os precursores de glóbulos sanguíneos vermelhos e brancos (CFU-GM e BFU-E) desenvolveram-se compararavelmente às células progenitoras hematopoiéticas CD45+ (Exemplo 9).

Por outro lado, se as células mononucleares do sangue do cordão umbilical empobrecidas em CD14 forem cultivadas em meio contendo elevada glucose, revelam as características típicas de células estaminais neuronais. A Fig. 7 mostra uma fotomicrografia de células de USSC após indução neuronal. As USSCs da invenção cultivadas em meio de Eagle modificado por 12

Dulbecco (DMEM) de elevada glucose demonstram uma morfologia de tipo astrócito. A Fig. 7 mostra um exemplo dessas células cultivadas mostrando morfologia glial obtida após 13 dias em cultura (exemplo 6) . Após serem expandidas com PEI, as USSCs expressam o marcador de célula estaminal neuronal nestina. Uma primeira observação indica que a coloração de nestina é menos pronunciada após as células serem estimuladas com agentes indutores neuronais como ácido retinóide (RA), factor de crescimento do fibroblasto básico bFGF, e factor de crescimento nervoso β (NGF-β) (McKay, 1997).

Em detalhe, a Fig. 8 mostra USSCs da invenção que expressam o marcador da célula estaminal neuronal nestina. (A) As USSCs foram incubadas em meio H5100/PEI durante 7 dias e submetidas a imuno-histoquimica anti-nestina convencional. (B) As células foram incubadas durante 7 dias em H5100/PEI seguindo 9 dias de indução em H510 0 com RA, bFGF e NGF. Deve ser notado que a coloração de nestina é reduzida comparativamente às células cultivadas sob condições em (A) .

Uma análise adicional destas células também revela a expressão de proteínas características para os células neuronais como ácido γ-aminobutírico (GABA, Fig. 9 B) , tirosina hidroxilase (Fig. 9 B) , sinaptofisina (Fig. 9 D) , neurofilamento (Fig. 9 F) , ou antigénios gliais típicos como galactocerebrósido (GalC, Fig. 10B) e proteína glial fibrilar acídica (GFAP, Fig. 10 D) . A Fig. 9 mostra USSCs da invenção gerando células da linhagem neuronal. As USSCs da invenção foram cultivadas em H5100/PEI durante 7 dias e mantidas durante 27 dias em H5100 contendo RA, bFGF e NGF. Após protocolos de fixação convencionais, foram aplicados os anticorpos específicos neuronais. (A, C, D) Fotografias em contraste de fase, (B, D, F) fotografias de fluorescência das mesmas preparações como em A, C, D. O corante de ADN DAPI (azul) é utilizado para corar o 13 núcleo das células. (B) Fotografia de dupla-imunofluorescência utilizando anti-GABA (vermelho), e anti-tirosina hidroxilase (TH, verde). (D) Uma coloração anti-sinaptofisina (verde). (F) É mostrada uma coloração anti-neurofilamento específico de neurónio (vermelho). Foi utilizado um cocktail de anticorpos contra diferentes subtipos de neurofilamento. A Fig. 10 mostra USSCs da invenção gerando células da linhagem glial. As células foram submetidas às mesmas condições de cultura celular como mostrada na Fig. 9. O DAPI é em azul. (A, C) Representação de fotografias em contraste de fase. (B) As mesmas células que vistas em (A) que foram submetidas a imunocoloração anti-GalC (vermelho) . (D) A mesma célula que em (C) corada com anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP, vermelho).

Se, contudo, as células estaminais universais descritas acima são retiradas de qualquer das repicagens de expansão e induzidas em condições de cultura contendo DAG (dexametasona, ácido ascórbico, β-glicerolfosfato) ou meio contendo fibronectina, é induzida diferenciação ao longo da linhagem osteogénica (exemplo 3) . Como mostrado na Tabela 2, os genes marcadores específicos de osso (fosfatase alcalina, osteocalcina, colagénio tipo I) são prontamente induzidos e detectáveis por RT-PCR.

Tabela 2: Análise de RT-PCR durante a diferenciação osteogénica de USSCs. controlo dia 7 dia 14 β-actina (controlo + + + positivo) fosfatase alcalina - + + colagénio tipo II - + + osteocalcina + + — 14

Todos os três genes marcadores da diferenciação osteogénica mostram uma expressão aumentada de ARNm no dia 7 da indução por DAG. A β-actina serve como controlo positivo. A Fig. 11 mostra a formação de um nódulo mineralizado após indução osteogénica e após coloração com vermelho de alizarina (B). A diferenciação osteogénica de camadas quase confluentes de USSC foi induzida através da adição de dexametasona, ácido ascórbico e β-glicerolfosfato ao meio de cultura H5100. No dia 10 de estimulação, apareceram nódulos ósseos caracteristicos (11A) . A deposição mineral destes nódulos pode ser demonstrada através de coloração de vermelho de alizarina (11B). Sob estas condições de indução osteogénica, as células da invenção sofrem diferenciação osteogénica completa como demonstrado através da acumulação de osso mineralizado em nódulos distintos (Fig. 11A) que podem ser corados com vermelho de alizarina (Fig. 11B) . Alternativamente, a acumulação de hidroxiapatite na cultura celular pode ser detectada após seis dias através de coloração de von Kossa. A partir destes resultados é evidente, que o sangue do cordão umbilical contém uma célula estaminal muito precoce até agora não detectada que pode ser expandida em grandes quantidades. Além disso, esta célula pode ser induzida para se diferenciar em MSC e a partir dai em osteoblastos, como já demonstrado nas Figuras 11A. Após indução completa com DAG, pode ser obtida uma diferenciação adicional em nódulos ósseos mineralizados, como mostrado na Figura 11B com coloração de vermelho de alizarina. A versatilidade das células desta invenção é ainda maior como demonstrado através da diferenciação condrogénica após cultivo em DMEM de elevada glucose contendo dexametasona, prolina, piruvato de sódio, ITS+ Premix, e TGF-61 (Johnstone et 15 al., 1998). No dia 0, e 14, destas experiências de diferenciação, as células foram recolhidas e analisadas através de RT-PCR (Tabela 3, exemplo 4).

Tabela 3: Análise de RT-PCR durante a diferenciação condrogénica de USSCs.

Controlo dia 14 β-actina (controlo + + positivo) Cart-1 - + colagénio tipo II (não - + submetido a splicing) Condroaderina — +

No dia 14 da estimulação condrogénica são expressos três genes marcadores caracteristicos de condrogénese em curso.

Os resultados destes estudos demonstram claramente a regulação positiva de Cart-1, um factor de transcrição condrogénico especifico, 14 dias após a estimulação condrogénica. Além disso, os transcriptos de ARNm para duas proteínas extracelulares de cartilagem tipicas (colagénio tipo II e condroaderina) foram também regulados positivamente. Além disso, as células desta invenção produziram claramente moléculas de proteoglicano extracelular tipicas para diferenciação condrocitica como demonstrado por coloração de Alcian Blue . A Fig. 12 mostra a coloração de Alcian Blue de cultura de sedimento derivado de USSC. As USSCs foram cultivadas sob cultura de sedimentação num meio de diferenciação condrogénica. Após 6 dias em meio de indução, não foram detectáveis 16 quantidades significativas de proteoglicanos (PG) como marcadores caracteristicos da diferenciação condrogénica por coloração de Alcian Blue (Painel A) . Em contraste, os PG são prontamente detectáveis como indicado através da cor azul/verde (Painel B).

Além disso, a presença do colagénio tipo II especifico de cartilagem podia ser demonstrado ao nivel da proteina. Fig. 13: Coloração de colagénio tipo II (verde) de culturas de USSC após diferenciação condrogénica.

As USSCs foram cultivadas num meio de diferenciação condrogénica. A expressão da proteina de matriz extracelular, colagénio tipo II, no dia 14 foi demonstrada através de microscopia de fluorescência utilizando anticorpo primário anti-colagénio tipo II e um anticorpo secundário anti-FITC de murganho (Fig. 13B). A versatilidade adicional da célula estaminal não restrita é aqui mostrada através da diferenciação daquelas previamente sob as culturas expandidas de protocolo PEI em células gordas com concentrações superiores de dexametasona (exemplo 5). A Fig. 14 mostra células gordas que podem ser coradas especificamente com Oil Red (Sigma) . Os adipócitos são caracterizados através de uma quantidade elevada de vesículas intracelulares e de uma coloração vermelha específica com Oil Red.

Além disso, as USSCs quando cultivadas durante 24 h em H5100 com 10 μΜ de 5'-azacitidina e subsequentemente com 100 ng/mL de bFGF, mostram forte evidência de diferenciação muscular. Uma alteração na morfologia celular é acompanhada pela expressão de miosina de actuação lenta (Fig. 15 e 16). 17

Além disso, é regularmente observado o aparecimento e a proliferação de células ovais típicas em repicagens tardias (Fig. 17) quando as USSCs induzidas por PEI são subclonadas a partir da subpopulação de CD34+, que foi mostrado na Figura 6 (exemplo 8). Estas células expressam a enzima dipeptidilo peptidase IV em graus variáveis, significando que essas células ovais podem ainda diferenciar em células do fígado.

As USSCs expandidas in vitro sobrevivem e persistem após injecção em fígados em regeneração de murganhos SCID com hepatectomia parcial a 50%, assim como fígados não submetidos a hepatectomia, enquanto que células mononucleares derivadas do sangue do cordão umbilical não podem ser detectadas mesmo quando são transplantados números celulares 25 vezes mais elevados. A Fig. 18 mostra a sobrevivência e integração de culturas de USSC após injecção no parênquima do fígado de murganho SCID. Fig. 18 A: Fluorescência vermelha 7 dias após a transplantação indica sobrevivência e integração de USSCs humanas da invenção marcadas com PKH26 no tecido do fígado de murganho (sem hepatectomia). Em contraste, após transplantação de células mononucleares derivadas do sangue do cordão umbilical (MNCs) não foi detectada fluorescência vermelha indicadora de integração de MNCs humanas. Fig. 18 B: Crio-secção de tecido do fígado de murganho correspondente a A: Micrografia óptica de transmissão de tecido do fígado de murganho com USSC humanas integradas.

Uma vez que é idêntico o precursor para as células do fígado e dos ilhéus β pancreáticos, essas células ovais derivadas do CB também podem ser diferenciadas em células β dos ilhéus produtores de insulina tornando-as ferramentas úteis para terapia celular em doentes diabéticos ou em doentes com insuficiência hepática. 18

Para além destas aplicações clínicas óbvias quaisquer das condições bem caracterizadas e sob padronização, componentes da célula estaminal expandida e sua progenia podem ser utilizados para monitorizar e definir acções e efeitos moleculares assim como celulares de agentes farmacológicos recentemente desenvolvidos e assim também substituir determinada experimentação baseada em animais.

Assim, estas células estaminais e células diferenciadas bem padronizadas derivadas das culturas do sangue do cordão umbilical humano aqui descritas podem ser utilizadas como um reagente de teste valioso para a indústria farmacêutica e de biomateriais.

As preparações de USSC sob condições de cultura apropriadas desenvolveram colónias múltiplas de diferentes linhagens hematopoiéticas, proporcionando evidências de que estas células podem originar hematopoiese.

Sob meio de cultura apropriadamente condicionado com concentrações definidas de VEGF, Flt 3L, SCGF (factor de crescimento da célula estaminal) e em metilcelulose, essas células desenvolvem colónias mistas com células também positivas para marcadores FLK1+ e AC133+, Tiel e Tie2. Após diferenciação adicional, desenvolveu-se o perfil do marcador característico para células endoteliais com AC133 negativo, CD31+, CD54+, VWF+, VE-Caterina+. É aqui reivindicada a utilidade óbvia dessas células endoteliais para o crescimento in vitro de vasos sanguíneos autólogos e alogénicos para a terapia de doenças vasculares. 19

Ao mesmo tempo é claro que todos estes progenitores gerados in vitro e homogeneamente expandidos e as suas células diferenciadas irão - a um nivel clonal - servir como ferramentas extremamente importantes para a definição do papel de genes específicos e seus produtos em biologia celular e em todas as aplicações médicas seguintes baseadas em terapias mediadas por moléculas ou células.

Apenas pequenos números deste tipo celular único são suficientes para gerar grandes números de USSCs de crescimento aderente da invenção e da célula estaminal mesenquimal mais diferenciada para a produção de tipos celulares regenerativos medicamente aplicáveis.

Um aspecto completamente novo deste conhecimento é o facto de esses progenitores se poderem desenvolver assimetricamente em dois ou mais tipos celulares distintamente diferenciados. Isto revela um novo principio biológico de regulação co-componente em regeneração celular funcionalmente orientada que ocorre mesmo in vitro. A consequência desta invenção é que a terapêutica baseada em células estaminais tem que ser concebida de acordo com este principio e não consiste apenas de um tipo celular clonal.

Exemplo 1

Recolha de Sangue do Cordão Umbilical (CB) A recolha do sangue do cordão umbilical nos Departamentos de Obstetrícia foi realizada com consentimento informado da mãe. Após nascimento do bebé, com a placenta ainda no útero, o cordão 20 umbilical foi duplamente apertado e cortado transversalmente 7-10 cm do umbigo. Após desinfecção do cordão umbilical, a veia umbilical foi perfurada e o CB recolhido em sacos de recolha contendo citrato-fosfato-dextrose (CPD) como anticoagulante.

Isolamento de células mononucleares do sangue do cordão umbilical O sangue do cordão umbilical foi cuidadosamente aplicado sobre uma solução de Ficoll (densidade de 1,077 g/cm3) . Foi realizada uma centrifugação em gradiente de densidade (450 g, temperatura ambiente, 25 min). As células mononucleares (MNC) da interface foram recolhidas e lavadas duas vezes em soro fisiológico tamponado com fosfato, pH 7,3 (PBS).

Produção de camadas aderentes de morfologia do fibroblastóide

As células mononucleares foram plagueadas a uma densidade de cerca de 5 x 103 células/cm2 em balões de cultura T25 (Nunclon) [A.), B.), C.)]. Foram utilizados quatro métodos de cultura diferentes para iniciar o crescimento de células estaminais aderentes: A. ) MNCs derivadas do CB foram inicialmente cultivadas em meio Myelocult H5100 (StemCell Technologyes,

Vancouver/Canadá) contendo dexametasona a 10“7 M. B. ) MNCs derivadas do CB foram inicialmente cultivadas em Mesencult (StemCell Technologies, Vancouver/Canadá) contendo dexametasona a 10“7 M. 21 C. ) MNCs derivadas do CB foram inicialmente cultivadas em

DMEM de baixa glucose (bio-Whittaker) com 30% de FCS contendo dexametasona a 10~7 M. D. ) MNCs derivadas do CB foram plaqueadas a uma densidade de 5xl06/mL em 10 mL de meio Myelocult H5100 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) em balões de cultura de 50 mL (Nunclon) sem dexametasona.

Todas as culturas foram incubadas a 37°C em 5% de C02 numa atmosfera inteiramente humidificada, e foram alimentadas uma vez por semana por remoção do meio completo com as células não aderentes e adição de 10 mL de meio fresco. Após diversos pontos de tempo, as células aderentes fusiformes foram removidas por tratamento com 0,05% de tripsina e 0,53 mM de EDTA durante 2 min, lavadas com 50% de meio contendo soro, recolhidas por centrifugação a 780 g e analisadas através de Citometria de fluxo ou RT-PCR. Após duas a três semanas, apareceram células aderentes de morfologia fibroblastóide em cerca de 30% de todas as culturas celulares.

Condição de cultura para a expansão de USSCs da invenção

As USSCs da invenção podem ser expandidas em meio H5100 contendo 10 ng/mL de IGF I (Factor de crescimento I de tipo insulina), 10 ng/mL de PDGF-BB (Factor de crescimento BB derivado de plaquetas) e 10 ng/mL de EGF rh-humano (Factor de crescimento epidérmico humano recombinante) (meio PEI) a uma densidade que varia de lxlO4 e lxlO5 células/mL (método de expansão A) . Alternativamente, as preparações de USSC podem ser expandidas no meio de crescimento inicial A, B e C. 22

Exemplo 2

Imunofenotipagem de células através de citofluorimetria A fim de determinar o imunofenótipo de USSCs, as células foram coradas com anti-CD45 conjugado com FITC (Becton Dickinson, Coulter), anti-CD14 conjugado com PE (PharMingen, Coulter), anti-SSEA-4 (MC-813-70) marcado com F(ab')2 de cabra anti-IgG+IgM (H+L) de murganho-FITC (Coulter), anti-CD10-PE (CALLA, PharMingen), anti-HLA-classe I (Coulter) marcado com F(ab')2 de cabra anti-IgG+IgM (H+L) de murganho-FITC, anti-CD13-PE (Becton Dickinson, Coulter); anti-CD29 (Coulter), anti-CD44 (Coulter), anti-CD49e (Coulter), anti-CD90 (Coulter), anti-HLA-classe II-FITC (Coulter). As células foram analisadas utilizando um EPICS XL (Coulter) ou um analisador de FACS (Becton Dickinson).

Exemplo 3

Demonstração do potencial de diferenciação osteogénica de USSCs

As USSCs obtidas como descrito no exemplo 1 foram cultivadas num meio convencional até atingirem 70% de confluência. A diferenciação osteogénica destas células foi induzida por adição de dexametasona a 10"7 M, ácido ascórbico a 50 pg/mL, e β-glicerolf osf ato a 10 mM (Bruder et al. 1994, Jaiswal et al., 1997) . No dia 10 da estimulação, as células mostraram depósitos de fosfato de cálcio resultando em nódulos ósseos. Os nódulos ósseos mineralizados foram detectados através de coloração com vermelho de Alizarina como se segue: As células aderentes na cultura foram lavadas duas vezes com PBS, pH 7,3 e coradas com 5 mL de solução a 0,1% de vermelho de Alazarina durante uma hora 23 a temperatura ambiente e subsequentemente com 0,1% de acido acético e etanol absoluto assim como PBS. A coloração do cálcio com vermelho de Alazarina e von Kossa demonstram o potencial de mineralização destas células (Stanford et al., 1995, Rungby et al., 1993). A diferenciação osteogénica foi também demonstrada atarvés de RT-PCR utilizando os específicos do osso, osteocalci fosfatase alcalina especifica de (BSP), receptor alfa do factor plaquetas (PDGF-Ra), receptor epidérmico (EGFR) e colagénio tipo

Exemplo 4

Demonstração do potencial de

USSC marcadores de diferenciação .na (OC) , osteopontina (OP) , osso (AP), sialoproteina óssea de crescimento derivado de do factor de crescimento I. diferenciação condrogénica de

Para a diferenciação condrogénica, 2xl05 células estaminais aderentes foram colocadas em cultura de sedimentação em tubos de polipropileno de 15 mL. Foi utilizado DMEM de elevada glucose contendo dexametasona, prolina, piruvato de sódio, ITS+ Premix, e TGF-βΙ como meio de cultura celular (Johnstone et al., 1998, Yoo et al., 1998) . No dia 7, 14 e 21, as fracções celulares foram analisadas através de RT-PCR para os produtos génicos específicos da cartilagem que codificam Cart-1, colagénio tipo II e condroaderina. Além disso, as USSCs foram utilizadas em culturas de sedimentação. Após duas semanas, secções Dewax foram fixas com 4% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente e lavadas em etanol. As secções foram coradas em 1% de Alcian Blue/3% de acético ácido, pH 2,5 (Sigma) durante 5 min e lavadas em água destilada. Elas demonstram claramente uma coloração positiva de proteoglicanos específicos como 24 demonstrado por coloração de Alcian Blue (Fig. 12) (Chao, G. et al., 1993). Após um período de indução condrogénica de 14 dias, as células foram fixas de acordo com um protocolo convencional e analisadas através de microscopia de fluorescência (Rosenbaum et al., 1998) demonstrando a presença de matriz extracelular específica de colagénio tipo II (Fig. 13B).

Exemplo 5

Demonstração do potencial de diferenciação adipogénica de USSCs

As USSCs foram cultivadas em H5100 contendo dexametasona a ICC6 M, ácido ascórbico a 50 pg/mL e β-glicerolfosfato a 10 mM resultando em diferenciação parcial de USSCs para adipócitos como demonstrado através de coloração de Oil Red (Ramirez-Zacarias et al., 1992).

Exemplo 6

Demonstração do potencial de diferenciação neurogénica de USSCs

Isolamento celular e condições de cultura para células gliais

As células mononucleares do sangue do cordão umbilical, obtidas como descrito, foram empobrecidas de células CD14+ através de sistema de isolamento Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)/CD14+ utilizando colunas de separação VS+ de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyl Biotec, Bergisch 25

Gladbach). As células mononucleares empobrecidas em CD14 foram cultivadas a uma densidade de 2xl06 células/mL em 10 mL de Meio de Elevada Glucose (MEM de Dulbecco com 4500 G/L de Glucose) em balões de cultura T25 (Nunclon) e incubadas a 37 °C em 5% de C02 numa atmosfera inteiramente humidificada. Após 10-15 dias em cultura foram detectadas células de forma glial.

Diferenciação para célula neuronais A) As células foram expandidas durante 7 dias, quer apenas em meio H5100 ou na presença de 40 pg/mL de PDGFB, 10 pg/mL de EGF, 10 pg/mL de IGF-I. As células foram tripsinizadas e plaqueadas a uma densidade de cerca de 3,5 x 103 células/cm2 em placas de cultura de 24 poços em lamelas revestidas com poli D-lisina (PDL) e laminina (PDL/lam). Subsequentemente, a diferenciação neuronal foi iniciada por adição de agentes indutores, tais como ácido retinóide todo-trans (10“5 M) , bFGF (20 ng/mL) e NGF-β (50 ng/mL).

Microscopia de fluorescência

Após o período de indução (27 dias) as células foram fixas de acordo com um protocolo convencional (Rosenbaum et al., 1998) e coradas com anticorpos contra antigénios específicos neuronais. Os espécimes foram analisados utilizando microscopia óptica de transmissão e de fluorescência. 26

Exemplo 7

Demonstração do potencial de diferenciação na linhagem miocitica

Foram cultivadas 1 x 104 USSCs em meio H5100 (StemCell Technology) suplementado com 10 ng/mL de PDGFBB, 10 ng/mL de EGF, 10 ng/mL de IGF a 37 °C, 5% de C02, até alcançarem cerca de 70% de confluência. Posteriormente, as células foram incubadas com 10 μΜ de 5'-azacitidina (Sigma) durante 24 h, lavadas duas vezes com PBS e cultivadas em meio H5100 suplementado com 100 ng/mL de bFGF (Sigma) . Após 1 semana em meio de diferenciação, a morfologia das células mudou (Fig. 15) . Após 10 dias, as células foram tripsinizadas e transferidas para lâminas de vidro revestidas com fibronectina para imunocoloração.

Imuno-histoguímica

As células foram fixas com 5% de formaldeído/PBS durante 15 min e lavadas duas vezes em PBS, pH 7,3. Utilizando um protocolo convencional, as células foram incubadas com um anticorpo primário especifico anti-miosina esquelética (lenta) (clone NOQ7.5.4D, 1:400) (mostrado a verde) e com anticorpo primário anti-CDl3 (mostrado a vermelho) ou um anticorpo monoclonal primário anti-miosina esquelética (clone MY-32, 1:4000). A coloração foi positiva para USSCs cultivadas sob as condições de cultura acima (Fig. 16) .

Exemplo 8

As células USSC humanas assim como as células mononucleares derivadas do sangue do cordão umbilical (MNC) foram marcadas com 27 o Kit ΡΚΗ26 RED Fluorescent Cell Linker (Sigma, PKH26-GL). Foram injectadas 2 x 105 USSCs e 5 x 106 MNC no parênquima do figado de murganhos SCID com e sem 50% de hepatectomia. Após 7 dias da transplantação, foi atingida regeneração completa do figado para os animais submetidos a hepatectomia. O tecido do figado foi analisado através de microscopia de fluorescência de crio-secções para a presença de células humanas marcadas a vermelho (Fig. 18).

Exemplo 9

Demonstração do potencial de diferenciação de USSC na linhagem hematopoiética

Três preparações diferentes de USSCs (USSCKGB55 em meio DMEM contendo 30% de FCS, USSCKGB12 em meio H5100 contendo dexametasona, USSCKCB13 em meio MesenCult contendo dexametasona e USSCGK12 em meio H5100 contendo PEI) cultivadas em meio de expansão apropriado durante periodos prolongados (repicagem 5 a 8) foram inoculadas em 250 pL (2xl04-2xl05 células) de suspensão celular em triplicado, em placas de 24 poços em meio de cultura especifico hematopoiético (Metocult 4434). As colónias de mais de 50 células foram contadas e classificadas como derivadas de células progenitoras de granulócito/macrófago (CFU-GM), eritróide precoce (BFU-E) ou multipotente (CFU-GEMM) de acordo com critérios estabelecidos. A formação de colónia em culturas diferentes foi evidente começando a partir de 1 semana de observação e seguida até 3 semanas sob condições de diferenciação. As preparações de USSC desenvolveram colónias múltiplas de linhagens diferentes, proporcionando evidências de que estas células podem originar hematopoiese. 28

Exemplo 10 Métodos moleculares para a análise de células estaminais somáticas não restritas e os seus produtos de diferenciação consecutivos

Foram seleccionados iniciadores de PCR para a amplificação de sequências de ADNc especificas de osteocalcina, osteopontina, sialo-proteina óssea, fosfatase alcalina, PDGFRa e receptor de EGF de respectivos exões distintos, a fim de ser capaz de os distinguir em tamanho dos seus fragmentos de ADN respectivamente produzidos.

Através de clonagem no vector pCRLl (Invitrogen/EUA) e transformação consecutiva na estirpe TOP 10F de E. coli, os respectivos clones de ADNc especifico foram obtidos e caracterizados através de sequenciação cíclica num sequenciador automático (Applied Biosystems).

As reacções de RT-PCR foram realizadas num processo de dois passos. São primeiro inversamente transcritos 200 ng de ARN total das células com 10 U de Transcriptase Reversa AMV (Promega, Mannheim) , 1,5 pmol de Iniciadores específicos de gene 3' , 1 mM de dNTPs e tampão fornecido (Promega, Mannheim) num volume de 20 pL durante 1 h a 50 °C. A reacção de PCR foi realizada com 2 pL do ADNc com 1 U de DNA Polimerase HotStarTaq, tampão e solução Q (Qiagen, Hilden) , 1,5 mM de dNTPs e 20 pmol de iniciador específico de gene 3' e 5' . A reacção de PCR foi realizada com um passo de iniciação durante 15 min a 95 °C, 37 ciclos a 94 °C durante 30 seg, 56 °C durante 30 seg, 68 °C durante 1 minuto e um passo de polimerização final durante 5 min a 68 °C. 29

Tabela 4: Iniciadores de PCR para a amplificação de sequências de ADNc específicas A tabela mostra as sequências de Iniciadores 5' e 3' dos genes examinados e o comprimento previsto do fragmento de PCR em pb

Nome sequência do iniciador 5' Sequência do iniciador 3' pb PDGFR alfa acagtggagattacgaatgtg cacarcagtggtgatctcag 251 IGFR cgagtggagaaatctgcgg gaccagggcgtagttgtag 272 EGFR tgccacaaccagtgtgct ccacataattacggggacac 205 Neurofilamento attcgcgcgcagcttgaag cctggtaggaggcaatgtc 265 GFAP ctctccctggctcgaatgc cctcctgataactggccg 871 Sinaptofisina cctgcagaacaagtaccgag ccttgctgcccatagtcgc 516 tirosina hidroxilase caccttcgcgcagttctcg ctgtccagcacgtcgatgg 387 YB1 ggtgaggaggcagcaaatgt agggttggaatactgtggtc 279 Runxl gcaagctgaggagcggcg gaccgacaaacctgaagtc 296 AML lc cagtgcttcatgagagaatgc gaccgacaaacctgaagtc 453 Cart-1 ggagacgctggacaatgag ggtagctgtcagtccttggc 560 CD105 cctgccactggacacagg atggcagctctgtggtgttg 411 Colagénio Tipo I ggacacaatggattgcaagg aaccactgctccactctgg 441 Colagénio Tipo II tttcccaggtcaagatggtc cttcagcacctgtctcacca 377 Osteocalcina agtccagcaaaggtgcagc ggccgtagaagcgccgat 231 fosfatase alcalina gcttcagaagctcaacacca cgttgtctgagtaccagtcc 454 beta actina gagaaaatcttgcaccacac ctcggtgaggatcttcat 340 30

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Abreviaturas DAG meio de diferenciação osteogénica contendo dexametasona, ácido ascórbico e β-glicerolfosfato HLA antigénio de leucócito humano MSC célula estaminal mesenquimal

PEI meio contendo PDGF-BB, EGF e IGF SSEA4 antigénio precoce 4 especifico de fase USSC célula estaminal somática não restrita PG proteoglicanos

Lisboa, 13 de Novembro de 2006 34

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de células estaminais somáticas não restritas (USSCs) para a preparação de um medicamento para tratamento de doença vascular, doença cardíaca ou do músculo liso, doença hepática, diabetes mellitus tipo 1, doença neuronal, doença de Parkinson ou doenças hematológicas, em que as referidas USSC são isoladas do sangue do cordão umbilical, sangue placentário ou amostras de sangue de recém nascidos e são: (i) negativas para os antigénios de superfície CD45 e CD14; (ii) positivas para os antigénios CD13, CD29, CD44 e CD49e; (iii) expressam YB1, AML-l, RUNX-1 e fibulina-2; e (iv) não expressam hialuronano sintase, fibromodulina e 1NFLS.
2. Utilização da reivindicação 1, em que o referido medicamento compreende ainda progenia diferenciada in vitro das referidas USSCs. Lisboa, 13 de Novembro de 2006