ES2272563T3

ES2272563T3 - Celulas madre somaticas no restringidas (ussc) obtenidas de sangre del cordon umbilical humano.

Info

Publication number: ES2272563T3
Application number: ES01990388T
Authority: ES
Inventors: Peter Wernet
Original assignee: KOURION THERAPEUTICS AG
Current assignee: KOURION THERAPEUTICS AG
Priority date: 2000-11-03
Filing date: 2001-11-03
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2021-11-03
Also published as: DE60123293D1; US20050142118A1; CN1553951A; HUP0301600A2; IL155608A; EA200300536A1; CA2426987C; US20090238803A1; SK5242003A3; EA008619B1; DE60123293T2; CA2426987A1; EE200300205A; AU2953302A; BG107770A; CN100480375C; CZ20031165A3; PT1404815E; DK1404815T3; US7556801B2

Abstract

El uso de células madre somáticas no restringidas (USSC) para la preparación de un medicamento para tratar enfermedad vascular, enfermedad cardiaca o del músculo liso, enfermedad hepática, diabetes mellitus de tipo 1, enfermedad neural, enfermedad de Parkinson o enfermedades hematológicas, en el que dichas USSC se aíslan de sangre del cordón umbilical, sangre de la placenta o muestras de sangre de recién nacidos y son: (i) negativas para los antígenos de superficie CD45 y CD14; (ii) positivas para los antígenos CD13, CD29, CD44, y CD49e; (iii) expresan YB1, AML-1, RUNX-1, y fibulina-2; y (iv) no expresan hialuronano sintasa, fibromodulina, y 1NFLS.

Description

Células madre somáticas no restringidas (USSC) obtenidas de sangre del cordón umbilical humano.

La presente invención se refiere al uso de, una célula madre somática o una pluralidad de células madre, para la preparación de un medicamento.

Aunque las células madre se están auto-remplazando permanentemente, generalmente son de ciclo lento. De manera convencional, se piensa que estas células dan origen a una población transitoria de células en aumento con capacidad de auto renovación limitada para aumentar la cantidad de células diferenciadas. Hasta ahora, el desafío ha sido localizar células madre en el ser humano adulto y, por lo tanto, se han empleado varios marcadores sustitutos (por ejemplo, ensayos de formación de colonias para el linaje hematopoyético) en la bibliografía existente.

Varias Patentes de Estados Unidos, por ejemplo US 5.486.359; 5.591.625; 5.736.396; 5.811.094; 5.827.740;
5.837.539; 5.908.782; 5.908.784; 5.942.225; 5.965.436; 6.010.696; 6.022.540; 6.087.113; 5.858.390; 5.804.446;
5.846.796; 5.654.186; 6.054.121; 5.827.735; 5.906.934 tratan con células madre mesenquimáticas (MSC), que pueden diferenciarse en varias células progenitoras, por ejemplo, células progenitoras del músculo, células progenitoras del tejido conectivo o células ovales. Las células progenitoras del músculo pueden diferenciarse adicionalmente en células de músculo cardiaco, esquelético así como liso, mientras que la célula progenitora del tejido conectivo puede diferenciarse en hueso, cartílago así como grasa. Las células ovales pueden diferenciarse en células del hígado o el páncreas (Grompe y col, 2001).

Erices A. y col. ("Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood", British Journal of Haematology (2000), 109, págs. 235-242) describen que las células mononucleares obtenidas de sangre del cordón umbilical, cuando se ponen en cultivo, dan origen a células adherentes, que muestran un fenotipo similar al de un osteoclasto o al mesenquimático. Este último muestra una morfología similar a un fibroblasto y expresa varios antígenos relacionados con la célula progenitora mesenquimática (SH2, SH3, SH4, ASMA, MAB 1470, CD13, CD29 y CD49e).

La presencia de células madre no hematopoyéticas en la sangre del cordón umbilical todavía está en discusión (Mayani y col. 2000, Mareschi y col. 2001). La Solicitud de Patente Alemana DE 198 03 267 A1 fue la primera en describir progenitores de osteoblastos y formación de hueso a partir de sangre del cordón umbilical humano.

Sin embargo, el uso de estas células progenitoras mesenquimáticas de la técnica anterior está a menudo limitado, puesto que están demasiado desarrolladas para ser herramientas útiles para generar órganos o tejidos. En otras palabras, parecen estar ya demasiado comprometidas y especializadas para producir un órgano o tejido en regeneración funcional.

Es por lo tanto objeto de la invención proporcionar el uso de una célula madre que sea capaz de diferenciarse en diferentes células progenitoras tales como células mesenquimáticas, células neurales, células sanguíneas o células endoteliales para la preparación de un medicamento. Otro objeto de la invención es proporcionar el uso de, una célula madre que no tenga las desventajas de las células madre embrionarias para la preparación de un medicamento.

Se ha descubierto que una célula madre somática recién identificada es capaz de solucionar los objetos abordados anteriormente. La célula madre somática de la invención se obtiene de sangre del cordón umbilical humano, sangre de la placenta y/o la sangre de un recién nacido, siendo dicha célula madre somática distinta de pero capaz de diferenciarse en células madre o progenitoras mesenquimáticas, células madre o progenitoras de linaje hematopoyético, células madre o progenitoras neurales o células madre endoteliales o progenitoras del hígado. Estas células representan el progenitor del linaje hematopoyético, las células madre mesenquimáticas así como las células madre neurales. Esta capacidad multifuncional única y la tecnología para multiplicar estas células madre somáticas no restringidas (USSC) derivadas del cordón umbilical (CB), en forma de dichas células madre somáticas o en forma de células comprometidas en diferentes protocolos de diferenciación, permite una caracterización, normalización y utilización precisas para la producción e implementación de terapia de células madre en medicina regenerativa.

La Fig. 1 muestra un fotomicrográfico de un cultivo primario de USSC, las células situadas en la placa a baja densidad

La Fig. 2 muestra un fotomicrográfico de un cultivo confluente de USSC.

La Fig. 3 muestra un análisis FACS (Separación de Células Activadas por Fluorescencia) para el antígeno CD45 durante el transcurso de un cultivo in vitro.

La Fig. 4 muestra un análisis FACS para el marcador embrionario SSEA4.

La Fig. 5 muestra un análisis FACS para HLA-clase I (A, B, C), HLA DR y CD14.

La Fig. 6 muestra una cinética de FACS para el marcador de superficie CD34.

La Fig. 7 muestra un fotomicrográfico de células USSC después de inducción neuronal.

La Fig. 8 muestra que las USSC de la invención expresan el marcador de células madre neurales de inmunotinción nestina anti-nestina.

La Fig. 9 muestra USSC que generan células del linaje neuronal.

La Fig. 10 muestra USSC que generan células del linaje glial.

La Fig. 11 muestra formación de nódulos mineralizados después de inducción osteogénica y después de teñir con rojo de alizarina.

La Fig. 12 muestra una tinción de azul alcián de un cultivo sedimentado obtenido de USSC.

La Fig. 13 muestra una tinción de colágeno de tipo II (verde) de cultivos de USSC después de la diferenciación condrogénica.

La Fig. 14 muestra la diferenciación adipogénica de cultivos de USSC según se demuestra mediante tinción con Aceite Rojo.

La Fig. 15 muestra fotomicrográficos de cultivos de USSC antes y después de la diferenciación miogénica.

La Fig. 16 muestra inmunocitoquímica para miosina de acción lenta después del tratamiento con azacitidina.

La Fig. 17 muestra el fenotipo de células ovales de derivados de USSC.

La Fig. 18 muestra la supervivencia e integración de cultivos de USSC después de la inyección en parénquima del hígado de ratones SCID.

Las células madre somáticas de la invención pueden aislarse y purificarse mediante varios procedimientos que comprenden las etapas de aislamiento por gradiente de densidad, cultivo de células adherentes y subcultivo aplicando factores de crecimiento como se describe en el ejemplo 1. Después de que se ha establecido una capa de células confluentes, el procedimiento de aislamiento para obtener células de esta invención se controla de forma rutinaria mediante análisis de morfología (morfología fibroblastoide) y fenotípicos usando anticuerpo dirigidos contra los antígenos de superficie CD13 (positivo), CD14 (negativo), CD45 (negativo), y CD29 (positivo; véase el ejemplo 2).

La célula madre somática de la invención reacciona de forma negativa con marcadores específicos para el linaje hematopoyético tales como CD45 y por tanto, es distinta de las células madre hematopoyéticas que también pueden aislarse a partir de sangre del cordón placentario. CD14 es otro antígeno de superficie que no puede detectarse en USSC. Además, la célula madre de esta invención se caracteriza por una serie de antígenos que están presentes en la superficie celular tales como CD13, CD29, CD44, y CD49e. Las preparaciones de USSC se caracterizan además por la presencia de transcritos de ARNm para ciertas moléculas receptoras como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R), receptor alfa del factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF-RA), y receptor del factor de crecimiento de insulina (IGF-R). Estas células expresan también típicamente factores de transcripción tales como YB1 (factor de transcripción caja-Y 1), Runx1 (factor de transcripción relacionado con runt 1) y AML1C (factor de transcripción de leucemia mieloide aguda 1) de acuerdo con lo detectado por RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa-Transcriptasa Inversa). Sin embargo, las preparaciones de USSC son típicamente negativas para transcritos para el factor de transcripción condrogénico Cart-1 y marcadores neurales tales como neurofilamentos, sinaptofisina, tirosina hidroxilasa (TH) y proteína ácida fibrilar glial (GFAP).

TABLA 1

Análisis de los patrones de transcripción de USSC mediante RT-PCR Resultados de RT-PCR conseguidos con cebadores de oligonucleótidos predichos y ARNm de USSC y ARNm de control positivo de otros tejidos como células mononucleares de hueso, cartílago, cerebro o sangre del cordón umbilical

1

2

La expresión de ARN de preparaciones de USSC y MSC obtenidas de médula ósea (Caplan, 1991) se comparó directamente usando microseries cuantitativas Affymetrix GeneChip^{TM}. El transcrito para el gen Fibulina-2 (número de banco de genes X82494) se detectó en USSC a niveles de expresión altos pero no en MSC. La producción de Fibulina-2 se demostró previamente en fibrolastos (Pan y col., 1993). El análisis de transferencia de Northern de ARNm de diversos tejidos humanos muestra un transcrito de 4,5 kb abundante en tejidos cardiacos, de placenta y ovario (Zhang y col., 1994). La proteína se ha localizado a nivel de microscopio óptico en embriones humanos de 4-10 semanas de gestación, usando anticuerpos policlonales. La Fibulina-2 se detectó principalmente en el neuroepitelio, ganglios espinales y nervios periféricos (Miosge y col., 1996).

En el modelo animal de ratas, se colocalizan miofibroblastos de hígado de rata (rMF) con fibulina-2. Estas células se situaron en el campo portal de las venas centrales, y sólo ocasionalmente en el parénquima. En etapas tempranas de fibrosis se detectaron rMF en las cicatrices en desarrollo. En etapas avanzadas de fibrosis los rMF suponían la mayoría de las células situadas en la cicatriz (Knittel y col., 1999). En otro modelo animal, la proteína Fibulina-2 de ratón se expresa durante la transformación epitelial-mesenquimática en la matriz de la banda endocárdica durante el desarrollo cardiaco embrionario. La Fibulina-2 se sintetiza también por las células precursoras del músculo liso de vasos del arco aórtico en desarrollo y las células coronarias endoteliales que se originan a partir de células de las crestas neurales y células epicárdicas, respectivamente (Tsuda y col., 2001).

Los transcritos del gen de la Hialuronano Sintasa (D84424), gen de la Fibromodulina (U05291) y el transcrito 1NFLS (W03946) no se detectaron en USSC pero si a niveles altos en MSC. El análisis de transferencia de Northern indicó que la Hialuronano Sintasa se expresa en todos los tejidos humanos (Itano y Kimata, 1996). El producto de esta enzima, hialuronano, cumple diversas funciones, incluyendo rellenado de espacios, lubricación de articulaciones, y suministro de una matriz a través de la que las células pueden migrar (Hall y col., 1995). La Fibromodulina es un miembro de la familia de los proteoglicanos intersticiales pequeños. La proteína muestra una amplia distribución tisular, con la mayor abundancia observada en cartílago, tendón, y ligamento articular (Sztrolovics y col., 1994). El transcrito 1NFLS se clonó de hígado fetal humano.

El gen CD24 (L33930) se expresa a un nivel muy bajo en las USSC comparado con el nivel de expresión en las MSC. El CD24 se expresa en muchas células de linaje-B y en granulocitos maduros (Van der Schoot y col., 1989).

Cuando se comparan con MSC, las células somáticas de esta invención son distintas en base al tejido fuente del que se han aislado. Además, las USSC se caracterizan por la no expresión de la clase I de antígenos leucocitarios humanos (HLA-clase I). A diferencia de las células madre somáticas de esta invención, las MSC previamente descritas aisladas de médula ósea y tejido muscular, expresan niveles muy altos de antígeno HLA-clase I en su superficie. La célula de esta invención también expresa el antígeno específico del estado embrionario 4 (SSEA4) (véase Fig. 4).

Típicamente, la célula madre somática de la invención muestra forma celular fibroblastoide y prolifera de manera adherente.

En una realización preferida de la presente invención la célula madre somática de la invención (USSC) está presente en una pluralidad de mezclas que representan precursores de otras células madre somáticas por ejemplo del linaje hematopoyético que expresan preferiblemente AC133 y CD34, células madre somáticas progenitoras mesenquimáticas, células madre somáticas progenitoras neuronales o combinaciones de las mismas. Esta realización es ventajosa puesto que comprende un alto potencial de regeneración en base a la capacidad de diferenciarse en otras células madre somáticas diferentes o a la presencia de dichas células madre somáticas como realización preferida de la invención. Preferiblemente las células madre somáticas progenitoras mesenquimáticas o las células madre somáticas progenitoras neurales se producen mediante diferenciación a partir de una célula madre de la invención.

Dependiendo del tipo de enfermedad es adecuada la administración local y/o sistémica de las USSC. Las USSC pueden aplicarse directamente o junto con vehículos o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Puede ser ventajoso añadir otras sustancias que fomenten la curación de las enfermedades.

Básicamente, los procedimientos conocidos para la aplicación de MSC pueden aplicarse de manera análoga cuando se aplican USSC. Además, la aplicación de células madre se describe por ejemplo en B. E. Strauer y col., "Intrakoronare, humanae autologe Stammzelltransplantation zur Myokardrengeneration nach Herzinfarkt", Dtsch med Wochenschr 2001; 126: 932-938; Quarto R., y col. "Repair of Large Bone Defects with the Use of Autologous Bone Marrow Stromal Cells", N Engl J Med 2001; 344: 385-386; Vacanti C. A., "Brief Report: Replacement of an Avulsed Phalanx with Tissue-Engineered Bone" N Eng J Med 2001; 344: 1511-1514, 17 de mayo de 2001; Hentz V. R., "Tissue Engineering for Reconstruction of the Thumb", N Engl J Med 2001; 344: 1547 - 1548; Brittberg M., "Treatment of Deep Cartilage Defects in the Knee with Autologous Chondrocyte Transplantation", N Engl J Med 1994; 331: 889-895, 6 de octubre de 1994; Freed C. R., "Transplantation of Embryonic Dopamine Neurons for Severe Parkinson's Disease", N Engl J Med 2001; 344: 710-719; Shin'oka T., "Transplantation of a Tissue-Engineered Pulmonary Artery", N Engl J Med 2001; 344: 532-533. Shapiro A. M. J., Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen N Engl J Med 2000; 343: 230-238.

Las células madre de la invención se describen en gran detalle más adelante

Las células madre de la invención son células adherentes con una forma celular fibroblastoide y dos o tres nucleolos (véase Fig.1) obtenidas después de tratamiento con tripsina EDTA y resiembra en condiciones de cultivo apropiadas (ejemplo 1) que se multiplican rápidamente hasta confluencia a una morfología alargada (Fig. 2). La Fig. 1 muestra un fotomicrográfico de un cultivo primario de USSC. Las células situadas en la placa a baja densidad demuestran la morfología fibroblastoide de las USSC. Estas células pueden cultivarse fácilmente durante más de 14 pasos de cultivo. La Fig. 2 muestra un fotomicrográfico de un cultivo confluente de USSC. La capa de células USSC casi confluente muestra una orientación de células paralela.

El fenotipo marcador de superficie de la capa de células adherentes principal así como todos los derivados de la misma en pasos posteriores son y permanecen negativos para el marcador CD45. La Fig. 3 muestra un análisis FACS para antígeno CD45 durante el transcurso de un cultivo in vitro. El CD45 un antígeno marcador característico para células hematopoyéticas es casi indetectable en USSC de los últimos pasos (Fig. 3 en los días 48, 54, 82).

Después del cultivo in vitro usando el procedimiento A (ejemplo 1), las preparaciones de USSC se vuelven positivas para el antígeno específico del estado embrionario 4 (SSEA4) y muestran la expresión homogénea de este marcador embrionario. La Fig. 4 muestra un análisis FACS para el marcador embrionario SSEA4. Las células multiplicadas mediante el procedimiento A (ejemplo 1) muestran fuertemente expresión del antígeno específico del estado embrionario 4 (SSEA4). Al mismo tiempo, los cultivos de USSC son negativos para expresión del antígeno de superficie HLA-clase I. (Fig. 5A), expresión del antígeno HLA-DR (Fig. 5B) así como CD14 negativos (Fig. 5C). La Fig. 5 muestra un análisis FACS para HLA-clase I (A, B, C), HLA DR y CD14. Los cultivos de USSC de la invención después de la expansión in vitro son negativos para antígenos HLA-clase I (Panel A). Estas células también son negativas para antígenos de superficie HLA-DR (Panel B) y CD14 (Panel C), característicos para células que presentan antígenos (HLA-DR) y monocitos (CD14).

La Fig. 6 muestra una cinética de FACS para el marcador de superficie CD34. Las USSC se cultivaron en H5100/PEI durante 10 pasos. Durante este periodo de cultivo se observó un aumento significativo de la expresión del antígeno CD34. Con respecto al marcador de células madre hematopoyéticas CD34, la Fig. 6 muestra que en el paso 3 hasta el día 54 no se pueden detectar células positivas para CD34. Por el contrario, en el séptimo paso en el día 82 está apareciendo una nueva subpoblación CD34 positiva. Por otro lado, si dichos progenitores CD34 o/y FIK1 positivos se cultivaron con medio acondicionado con citoquinas específico para diferenciación hematopoyética, se desarrollaron las típicas colonias mezcladas o hematopoyéticas para precursores de hematíes o leucocitos (CFU-GM y BFU-E) comparables a las células progenitoras hematopoyéticas CD45^{+} (Ejemplo 9).

Por otro lado, si se cultivan células mononucleares de sangre del cordón umbilical empobrecidas en CD14 en medio con alto contenido en glucosa, muestran las características típicas de células madre neurales. La Fig. 7 muestra un fotomicrográfico de células USSC después de inducción neuronal. USSC de la invención cultivadas en medio eagle modificado de Dulbecco (DMEM) rico en glucosa demostraron una morfología similar a astrocitos. La Fig. 7 muestra un ejemplo de dichas células cultivadas que muestran morfología glial obtenidas después de 13 días en cultivo (ejemplo 6). Después de multiplicarse con PEI, las USSC expresan el marcador de células madre neurales nestina. Una primera observación indica que la tinción de nestina es menos pronunciada después de que las células se han estimulado con agentes inductores neurales como el ácido retinoico (RA), factor de crecimiento básico de fibroblastos bFGF, y factor de crecimiento nervioso \beta (NGF-\beta) (McKay, 1997).

En detalle, la Fig. 8 muestra USSC de la invención que expresan el marcador de células madre neurales nestina. (A) las USSC se incubaron en medio H5100/PEI durante 7 días y se sometieron a inmunohistoquímica anti-nestina convencional. (B) Las células se incubaron en H5100/PEI durante 7 días después de 9 días de inducción en H5100 con RA, bFGF, y NGF. Nótese que la tinción de nestina es reducida en comparación con células cultivadas en las condiciones de (A).

El análisis adicional de estas células muestra también expresión de proteínas características para células neurales como ácido \gamma-aminobutírico (GABA, Fig. 9 B), tirosina hidroxilasa (Fig. 9 B), sinaptofisina (Fig. 9 D), neurofilamento (Fig. 9 F), o antígenos gliales típicos como galactocerebrósido (GalC, Fig. 10 B) y proteína ácida fibrilar glial (GFAP, Fig. 10 D). La Fig. 9 muestra USSC de la invención que generan células del linaje neuronal. Las USSC de la invención se cultivaron en H5100/PEI durante 7 días y se mantuvieron durante 27 días en H5100 que contenía RA, bFGF y NGF. Después de los protocolos de fijación convencionales, se aplicaron anticuerpos neuronales específicos. (A, C, D) Fotografías de contraste de fases, (B, D, F) fotografías de fluorescencia de las misma preparaciones que en A, C, D. El tinte de ADN DAPI (azul) se usa para teñir los núcleos de las células. (B) Fotografía de doble-inmunofluorescencia usando anti-GABA (rojo), y anti-tirosina hiodroxilasa (TH, verde). (D) Un tinte anti-sinaptofisina (verde). (F) Se muestra un tinte anti-neurofilamento específico de neuronas (rojo). Se usó un cóctel de anticuerpos contra diferentes subtipos de neurofilamentos. La Fig. 10 muestra USSC de la invención que generan células del linaje glial. Las células se sometieron a las mismas condiciones de cultivo celular que se muestran en la Fig. 9. el DAPI está en azul. (A, C) Representación de fotografías de contraste de fases. (B) Las mismas células que las observadas en (A) que se han sometido a inmunotinción anti-GalC (rojo). (D) Las mismas células que en (C) teñidas con el anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP, rojo).

Sin embargo, si las células madre universales descritas anteriormente se toman de cualquiera de los pasos de multiplicación y se inducen en condiciones de cultivo que contengan DAG (dexametasona, ácido ascórbico, fosfato de \beta-glicerol) o en medio que contenga fibronectina, se induce diferenciación a lo largo del linaje osteogénico (ejemplo 3). Como se muestra en la Tabla 2, los genes marcadores específicos de hueso (fosfatasa alcalina, osteocalcina, colágeno de tipo I) se inducen y detectan fácilmente por RT-PCR.Tabla 3:

TABLA 2 Análisis de RT-PCR durante la diferenciación osteogénica de USSC

	control	día 7	día 14
\beta-actina (control positivo)	+	+	+
fosfatasa alcalina	-	+	+
colágeno de tipo II	-	+	+
osteocalcina	+	+	-

Los tres genes marcadores de la diferenciación osteogénica muestran una expresión de ARNm aumentada en el día 7 de inducción con DAG. La \beta-actina sirve como control positivo.

La Fig. 11 muestra la formación de un nódulo mineralizado después de inducción osteogénica y después de teñir con rojo de alizarina (B). La diferenciación osteogénica de capas de USSC casi confluentes se indujo mediante la adición de dexametasona, ácido ascórbico y \beta-glicerolfosfato al medio de cultivo H5100. El día 10 de estimulación aparecen nódulos óseos característicos (11A). La deposición mineral de estos nódulos puede demostrarse mediante tinción de Rojo de Alizarina (11B). En estas condiciones de inducción osteogénica, las células de la invención experimentan diferenciación osteogénica completa como se demuestra por la acumulación de hueso mineralizado en distintos nódulos (Fig. 11A) que pueden teñirse con Rojo de Alizarina (Fig. 11B). Como alternativa, la acumulación de hidroxiapatita en el cultivo celular puede detectarse después de seis días mediante tinción de Von Kossa. A partir de estor resultados es evidente, que la sangre del cordón umbilical contiene una célula madre muy temprana indetectada hasta ahora que puede multiplicarse hasta grandes cantidades. Además, puede inducirse esta célula a diferenciarse en MSC y desde aquí en osteoblastos, como ya se ha demostrado en la Figura 11A. Después de la inducción completa con DAG, puede obtenerse una diferenciación adicional en nódulos óseos mineralizados como se muestra en la Figura 11B con tinción de Rojo de Alizarina.

La versatilidad de las células de esta invención es aún mayor como se ha demostrado mediante la diferenciación condrogénica después del cultivo en DMEM rico en glucosa que contenía dexametasona, prolina, piruvato sódico, ITS+ Premix, y TGF-61 (Johnstone y col., 1998). En el día 0, y 14, de estos experimentos de diferenciación, las células se recogieron y analizaron mediante RT-PCR (Tabla 3, ejemplo 4).

TABLA 3 Análisis de RT-PCR durante la diferenciación condrogénica de USSC

	Control	día 14
\beta-actina (control positivo)	+	+
Cart-1	-	+
colágeno de tipo II (sin empalme)	-	+
Condroadherina	-	+

El día 14 de la estimulación condrogénica se expresan tres genes marcadores característicos de condrogénesis en curso.

Los resultados de estos estudios demuestran claramente la regulación positiva de Cart-1 un factor de transcripción condrogénico específico 14 días después de la estimulación condrogénica. También se regularon positivamente otros transcritos de ARNm para dos proteínas extracelulares típicas de cartílago (colágeno de tipo II y condroadherina). Además, las células de esta invención producían claramente moléculas de proteoglicano extracelulares típicas para la diferenciación condrocítica como se demostró mediante tinción de Azul de Alcián. La Fig. 12 muestra una tinción de Azul de Alcián de un cultivo sedimentado obtenido de USSC. Las USSC se cultivaron en cultivo de sedimentación en un medio de diferenciación condrogénica. Después de 6 días en medio de inducción, no son detectables cantidades significativas de proteoglicanos (PG) como marcadores característicos de diferenciación condrogénica mediante tinción de Azul de Alcián (Panel A). Por el contrario los PG se detectan fácilmente como indica el color azul/verde (Panel B).

Además, la presencia del colágeno de tipo II específico de cartílago podía demostrarse en el nivel de proteína. Fig. 13: tinción de colágeno de tipo II (verde) de cultivos de USSC después de la diferenciación condrogénica.

Las USSC se cultivaron en un medio de diferenciación condrogénica. La expresión de la proteína colágeno de tipo II de la matriz extracelular en el día 14 se demostró mediante microscopía de fluorescencia usando un anticuerpo primario anti-colágeno de tipo II y un anticuerpo secundario FITC anti-ratón (Fig. 13B).

La versatilidad adicional de las células madre no restringidas se muestra en este documento mediante diferenciación de dichos cultivos previamente multiplicados en el protocolo PEI en células adiposas con mayores concentraciones de dexametasona (ejemplo 5).

La Fig. 14 muestra células adiposas que pueden teñirse específicamente con Aceite Rojo (Sigma). Los adipocitos se caracterizan por una alta cantidad de vesículas intracelulares y una tinción roja específica con Aceite Rojo.

Además, las USSC cuando se cultivan durante 24 h en H5100 con 5'-azacitidina 10 \muM y posteriormente con 100 mg/ml de bFGF muestra pruebas firmes de diferenciación muscular. Un cambio en la morfología celular se acompaña por la expresión de miosina de acción lenta (Fig. 15 y 16).

Además, la aparición y proliferación de células ovales típicas se observa regularmente en los últimos pasos (Fig. 17) cuando USSC inducidas con PEI se subclonan de la subpoblación CD34^{+}, lo que se ha mostrado en la Figura 6 (ejemplo 8). Estas células expresan en grados variables la enzima dipeptidil peptidasa IV, lo que significa que dichas células ovales pueden diferenciarse adicionalmente en células el hígado.

Las USSC expandidas in vitro sobreviven y persisten después de la inyección en hígados en regeneración de ratones SCID con hepatectomía parcial del 50% así como en hígados no hepatectomizados mientras que las células mononucleares obtenidas de la sangre del cordón umbilical no pueden detectarse ni siquiera cuando se transplantan cantidades celulares 25 veces mayores. La Fig. 18 muestra la supervivencia e integración de cultivos de USSC después de la inyección de parénquima del hígado de ratón SCID. Fig. 18 A: Fluorescencia roja 7 días después del transplante indica la supervivencia e integración de USSC marcadas con PKH26 humanas de la invención en el tejido del hígado del ratón (sin hepatectomía). Por el contrario, después del transplante de células mononucleares (MNC) obtenidas de sangre del cordón umbilical, no fue detectable fluorescencia roja que indicara la integración de MNC humanas. Fig. 18 B: Criosección de tejido de hígado de ratón correspondiente a A: micrográfico de transmisión óptica de tejido de hígado de ratón con USSC humanas integradas.

Puesto que el precursor para las células del hígado y las islas \beta pancreáticas es idéntico, dichas células ovales obtenidas de la sangre del cordón umbilical también pueden diferenciarse en células islas \beta productoras de insulina, lo que les hace herramientas útiles para terapia celular en pacientes diabéticos o en pacientes con fallo hepático.

Además de estas aplicaciones clínicas obvias, puede usarse cualquiera de los componentes de células madre multiplicadas en condiciones normalizadas bien caracterizadas y su progenie, para controlar y definir acciones y efectos moleculares así como celulares de agentes farmacológicos recién desarrollados y de este modo sustituir también cierta experimentación basada en animales.

Por tanto, estas células madre bien normalizadas y células diferenciadas obtenidas de los cultivos de sangre del cordón umbilical humano descritas en este documento pueden usarse como un valioso reactivo de ensayo para la industria farmacéutica y de biomateriales.

Las preparaciones de USSC en condiciones de cultivo apropiadas desarrollaron múltiples colonias de diferentes linajes hematopoyéticos, proporcionado pruebas de que estas células pueden dar origen a hematopoyesis.

En un medio de cultivo acondicionado de forma apropiada con concentraciones de VEGF, Flt 3L, SCGF (factor de crecimiento de las células madre) definidas y en metilcelulosa dichas células desarrollan colonias mixtas con células también positivas para marcadores FLK1+ y AC133+, Tiel y Tie2. Después de la diferenciación adicional se desarrolló el perfil de marcadores característico para células endoteliales con AC133 negativo, CD31^{+}, CD54^{+}, VWF^{+}, VE-caterina^{+}.

La utilidad obvia de dichas células endoteliales para el cultivo in vitro de vasos sanguíneos autólogos y alogénicos para terapia de enfermedades vasculares se reivindica en este documento.

Al mismo tiempo esta claro que todos estos progenitores generados in vitro y multiplicados de forma homogénea y sus células diferenciadas servirán -a nivel clonal- como herramientas extremadamente importantes para la definición del papel de genes específicos y sus productos en biología celular y todas las siguientes aplicaciones médicas basadas en terapias mediadas por células o moléculas.

Es suficiente solamente una pequeña cantidad de este tipo celular único para generar grandes cantidades de USSC de la invención que crecen de forma adherente y la célula madre mesenquimática más diferenciada para la producción de tipos celulares regenerativos aplicables en medicina.

Un aspecto completamente nuevo sobre estos conocimientos es el hecho de que dichos progenitores pueden desarrollarse de forma asimétrica en dos o más tipos celulares que se diferencian de distinta forma. Esto muestra un nuevo principio biológico de regulación de co-componentes en regeneración celular orientada a la funcionalidad, que tiene lugar incluso in vitro.

La consecuencia de esta invención es que los productos terapéuticos basados en células madre tienen que manipularse de acuerdo con este principio y no están constituidos solamente por un tipo de célula clonal.

Ejemplo 1 Recogida de sangre del cordón umbilical (CB)

La recogida del cordón umbilical en el Departamento de Obstetricia se realizó con el consentimiento informado de la madre. Después del parto del bebé con la placenta aún en el útero, se pinzó doblemente el cordón umbilical y se cortó a 7-10 cm del ombligo. Después de la desinfección del cordón, se pinchó la vena umbilical y se recogió CB en bolsas de recogida que contenían citrato-fosfato-dextrosa (CPD) como anticoagulante.

Aislamiento de células mononucleares de sangre del cordón umbilical

La sangre del cordón umbilical se cargó cuidadosamente en solución Ficoll (densidad 1,077 g/cm^{3}). Se realizó un centrifugado con gradiente de densidad (450 g, temperatura ambiente, 25 min). Las células mononucleares (MNC) de la interfase se recogieron y se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,3 (PBS).

Generación de capas adherentes de morfología fibroblastoide

Las células mononucleares se colocaron en placas a una densidad de aproximadamente 5 x 10^{3} células/cm^{2} en matraces de cultivo T25 (Nunclon) [A.), B.), C.)]. Se usaron cuatro procedimientos de cultivo diferentes para iniciar el cultivo de células madre adherentes:

A.) MNC obtenidas de sangre del cordón umbilical se cultivaron inicialmente en medio Myelocult H5100 (StemCell Technologies, Vancouver/Canada) que contenía dexametasona 10^{-7} M.

B.) MNC obtenidas de sangre del cordón umbilical se cultivaron inicialmente en Mesencult (StemCell Technologies, Vancouver/Canada) que contenía dexametasona 10^{-7} M.

C.) MNC obtenidas de sangre del cordón umbilical se cultivaron inicialmente en DMEM bajo en glucosa (Bio-Whittaker) con FCS al 30% que contenía dexametasona 10^{-7} M.

D.) MNC obtenidas de sangre del cordón umbilical se colocaron en placas a una densidad de 5 x 10^{6}/ml en medio Myelocult H5100 (StemCell Technologies, Vancouver/Canada) en matraces de cultivo de 50 ml (Nunclon) sin dexametasona.

Todos los cultivos se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% en una atmósfera completamente humidificada, y se alimentaron una vez por semana retirando el medio completo con las células no adherentes y añadiendo 10 ml de medio recién preparado. Después de varios puntos temporales las células adherentes en forma de huso se retiraron mediante tratamiento con tripsina al 0,05% y EDTA 0,53 mM durante 2 min, se aclararon con medio que contenía suero al 50%, se recogieron mediante centrifugado a 780 g y se analizaron mediante citometría de flujo o RT-PCR. Después de dos o tres semanas, aparecen células adherentes de morfología fibroblastoide en aproximadamente el 30% de todos los cultivos celulares.

Condiciones de cultivo para la expansión de USSC de la invención

Pueden expandirse USSC de la invención en medio H5100 que contiene 10 ng/ml de IGF I (factor de crecimiento I similar a insulina), 10 ng/ml de PDGF-BB (factor de crecimiento BB obtenido de plaquetas) y 10 ng/ml de EGF rh-humano (Factor de Crecimiento Epidérmico Humano Recombinante) (medio PEI) a una densidad que varía de 1 x 10^{4} a 1 x 10^{5} células/ml (procedimiento de multiplicación A). como alternativa, las preparaciones de USSC pueden multiplicarse en el medio de cultivo inicial A, B, y C.

Ejemplo 2 Inmunofenotipado de células mediante citofluorometría

Para determinar el inmunofenotipo de las USSC, las células se tiñeron con FITC - conjugado anti-CD45 (Becton Dickinson, Coulter), PE conjugado anti-CD14 (PharMingen, Coulter), anti-SSEA-4 (MC-813-70) marcado con FITC-IgG+IgM (H+L) anti-ratón de cabra F(ab')_{2} (Coulter), anti-CD10-PE (CALLA, PharMingen), anti-HLA-clase I (Coulter) marcado con FITC-IgG+IgM (H+L) anti-ratón de cabra F(ab')_{2}, anti-CD13-PE (Becton Dickinson, Coulter); anti-CD29 (Coulter), anti-CD44 (Coulter), anti-CD49e (Coulter), anti-CD90 (Coulter), anti-HLA-clase II-FITC (Coulter). Las células se analizaron usando un EPICS XL (Coulter) o un analizador FACS (Becton Dickinson).

Ejemplo 3 Demostración del potencial de diferenciación osteogénica de USSC

Las USSC obtenidas como se ha descrito en el ejemplo1 se cultivaron en un medio convencional hasta que alcanzaron el 70% de confluencia. La diferenciación osteogénica de estas células se indujo mediante adición de dexametasona 10^{-7} M, 50 \mug/ml de ácido ascórbico, y \beta-glicerolfosfato 10 mM (Bruder y col. 1994, Jaiswal y col., 1997). En el día 10 de estimulación, las células mostraron depósitos de fosfato cálcico que dieron como resultado nódulos óseos. Se detectaron nódulos óseos mineralizados tiñendo con rojo de Alizarina de la siguiente manera: las células adherentes en cultivo se lavaron dos veces con PBS, pH 7,3 y se tiñeron con 5 ml de solución de Rojo de Alizarina al 0,1% durante una hora a temperatura ambiente y posteriormente con ácido acético al 0,1% y etanol absoluto así como PBS. La tinción de calcio con Rojo de Alizarina y de von Kossa demuestra el potencial de mineralización de estas células (Stanford y col., 1995, Rungby y col., 1993). La diferenciación osteogénica se demostró también mediante RT-PCR usando los marcadores de diferenciación específicos de hueso osteocalcina (OC), osteopontina (OP), fosfatasa alcalina específica de hueso (AP), sialoproteína ósea (BSP), receptor alfa del factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF-Ra), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), y colágeno de tipo I.

Ejemplo 4 Demostración del potencial de diferenciación condrogénica de USSC

Para diferenciación condrogénica se situaron 2 x 10^{5} células madre adherentes en cultivo de sedimentación en tubos de polipropileno de 15 ml. Se usó DMEM rico en glucosa que contenía dexametasona, prolina, piruvato sódico, ITS+ Premix, y TGF-\beta1 como medio de cultivo celular (Johnstone y col., 1998, Yoo y col., 1998). En los días 7, 14, y 21 se analizaron fracciones celulares mediante RT-PCR para los productos génicos específicos de cartílago que codifican Cart-1, colágeno de tipo II y condroadherina. Además, las USSC se usaron en cultivos de sedimentación. después de dos semanas las secciones Dewax se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente y se lavaron en etanol. Las secciones se tiñeron en Azul de Alcián al 1%/ácido acético al 3%, pH 2,5 (Sigma) durante 5 minutos y se lavaron en agua destilada. Se demostró claramente una tinción positiva de proteoglicanos específicos como se ha demostrado mediante tinción de Azul de Alcián (Fig. 12) (Chao, G. y col., 1993). Después de un periodo de inducción condrogénica de 14 días, las células se fijaron de acuerdo con un protocolo convencional y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia (Rosenbaum y col., 1998) demostrando la presencia de una matriz extracelular específica de colágeno de tipo II (Fig. 13B).

Ejemplo 5 Demostración del potencial de diferenciación adipogénica de USSC

Se cultivaron USSC en H5100 que contenía exametasona 10^{-6} M, 50 \mug/ml de ácido ascórbico y \beta-glicerolfosfato 10 mM dando como resultado una diferenciación parcial de USSC a adipocitos como se ha demostrado mediante tinción con Aceite Rojo (Ramirez-Zacarías y col., 1992).

Ejemplo 6 Demostración del potencial de diferenciación neurogénica de USSC Condiciones de aislamiento y cultivo celular para células gliales

Las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical obtenidas como se ha descrito se empobrecieron en células CD14 mediante un sistema de aislamiento de de separación de células activadas por magnetismo/CD14 (MACS) empleando columnas de separación VS+ de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyl Biotec, Bergisch Gladbach). Las células mononucleares empobrecidas en CD14 se cultivaron a una densidad de 2 x 10^{6} células/ml en 10 ml de medio rico en glucosa (MEM de Dulbecco con 4500 g/l de glucosa) en matraces de cultivo T25 (Nunclon) y se incubaron a 37ºC en CO_{2} en una atmósfera completamente humidificada. después de 10-15 días en cultivo, se detectaron células con forma de células gliales.

Diferenciación a células neurales

A) Las células se multiplicaron durante 7 días en medio H5100 en solitario o en presencia de 40 pg/ml de PDGFB, 10 pg/ml de EGF, 10 pg/ml de IGF-I. Las células se tripsinizaron y se situaron en placas a una densidad de aproximadamente 3,5 x 10^{3} células/cm^{2} en placas de cultivo de 24 pocillos sobre cubreobjetos revestidos con poli D-lisina (PDL) y laminina (PDL/lam). Posteriormente, se inició la diferenciación neuronal mediante la adición de agentes inductores tales como ácido all-trans retinoico (10^{-5} M), bFGF (20 ng/ml), y NGF-\beta (50 ng/ml).

Microscopía de fluorescencia

Después del periodo de inducción (27 días) las células se fijaron de acuerdo con un protocolo convencional (Rosenbaum y col., 1998) y se tiñeron con anticuerpos contra antígenos neurales específicos. La muestra se analizó usando microscopia de fluorescencia y óptica de transmisión.

Ejemplo 7 Demostración del potencial de diferenciación en el linaje miocítico

Se cultivaron 1 x 10^{4} USSC en medio H5100 (StemCell Technology) suplementadas con 10 hg/ml de PDGFBB, 10 ng/ml de EGF, 10 ng/ml IGF a 37ºC, CO_{2} al 5% hasta que alcanzaron aproximadamente el 70% de confluencia. A partir de entonces las células se incubaron con 5'-azacitidina 10 \muM (Sigma) durante 24 h, se lavaron dos veces con PBS y se cultivaron en medio H5100 suplementado con 100 ng/ml de bFGF (Sigma). Después de 1 semana en medio de diferenciación, la morfología de las células cambió (Fig. 15). Después de 10 días, las células se tripsinizaron y se transfirieron a una cámara portaobjetos de vidrio revestida con fibronectina para inmunotinción.

Inmunohistoquímica

Se fijaron las células con folmaldehído al 5%/PSB durante 15 minutos y se lavaron dos veces en PBS, pH 7,3. Usando un protocolo convencional, se incubaron las células con un anticuerpo primario específico anti-miosina esquelética (lenta) (clon NOQ7.5.4D, 1:400) (mostrado en verde) y con un anticuerpo primario anti-CD13 (mostrado en rojo) o un anticuerpo monoclonal primario anti-miosina esquelética (clon MY-32, 1:4000). La tinción fue positiva para USSC cultivadas en las condiciones de cultivo anteriores (Fig. 16).

Ejemplo 8

Se marcaron células USSC humanas así como células mononucleares (MNC) obtenidas de sangre del condón umbilical con el "PKH26 RED Fluorescent Cell Linker Kit" (Sigma, PKH26-GL). Se inyectaron 2 x 10^{5} USSC y 5 x 10^{6} MNC en el parénquima del hígado de ratones SCID con y sin hepatectomía del 50%. 7 días después del transplante se alcanzó la completa regeneración del hígado para los animales hepatectomizados. El tejido hepático se analizó mediante microscopía de fluorescencia de criosecciones para la presencia de células humanas marcadas en rojo (Fig. 18).

Ejemplo 9 Demostración el potencial de diferenciación de USSC en el linaje hematopoyético

Tres preparaciones de USSC diferentes (USSC^{KBC55} en medio DMEM que contenía FCS al 30%, USSC^{KCB12} en medio H5100 que contenía dexametasona, USSC^{KCB13} en medio MesenCult que contenía dexametasona y USSC^{GK12} en medio H5100 que contenía PEI) cultivadas en medio de multiplicación apropiado durante periodos prolongados (paso 5 a 8) se sembraron en 250 \mul (2 x 10^{4}-2 x 10^{5} células) de suspensión celular por triplicado en placas de 24 pocillos en medio de cultivo específico hematopoyético (Methocult 4434). Las colonias de más de 50 células se contaron y clasificaron como obtenidas de células progenitoras granulocitos/macrófagos (CFU-GM), eritroides tempranos (BFU-E) o multipotentes (CFU-GEMM) de acuerdo con los criterios establecidos. La formación de colonias en cultivos diferentes fue evidente a partir de 1 semana de observación y continuó hasta 3 semanas en condiciones de diferenciación diferentes. Las preparaciones de USSC desarrollaron múltiples colonias de diferentes linajes, proporcionando pruebas de que estas células pueden dar origen a hematopoyesis.

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Ejemplo 10 Procedimientos moleculares para el análisis de células madre somáticas no restringidas y sus productos de diferenciación consecutivos

Se seleccionaron cebadores de PCR para la amplificación de secuencias de ADNc específicas de osteocalcina, osteoporina, sialoproteína ósea, fosfatasa alcalina, PDGFR\alpha y receptor de EGF de distintos exones respectivos, para ser capaces de distinguirlos en tamaño de sus fragmentos de ADN respectivamente generados.

Mediante clonación en el vector pCRL1 (Invitrogen/USA) y transformación consecutiva en la cepa de E. coli TOP 10F, se obtuvieron los respectivos clones de ADNc específicos y se caracterizaron por secuenciación cíclica mediante un secuenciador automatizado (Applied Biosystems).

Las reacciones de RT-PCR se realizaron en un procedimiento de dos etapas. Se transcriben primero de forma inversa 200 ng del ARN total de las células con 10 U de Transcriptasa Inversa AMV (Promega, Mannheim), 1,5 pmoles de Cebadores específicos de genes 3', dNTP 1 mM y el tampón suplementado (Promega, Mannheim) en un volumen de 20 \mul durante 1 h a 50ºC. La reacción de PCR se realizó con 2 \mul del ADNc con 1 U de ADN Polimerasa HotStarTaq, tampón y solución Q (Qiagen, Hilden), dNTP 1,5 mM y 20 pmoles de cebador específico de genes 3' y 5'. La reacción de PCR se realizó con una etapa de iniciación durante 15 minutos a 95ºC, 37 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 1 minuto y una etapa final de polimerización durante 5 minutos a 68ºC.

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TABLA 4 Cebadores de PCR para la amplificación de secuencias de ADNc específicas

La Tabla muestra las secuencias de Cebadores 5'- y 3'- de los genes examinados y la longitud esperada del fragmento de PCR en pb

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Abreviaturas

DAG: medio de diferenciación osteogénica que contiene dexametasona, ácido ascórbico, y \beta-glicerolfosfato

HLA: antígeno leucocitario humano

MSC: célula madre mesenquimática

PEI: medio que contiene PDGF-BB, EGF e IGF

SSEA4: antígeno específico del estado embrionario 4

USSC: célula madre somática no restringida

PG: proteoglicanos

Claims

1. El uso de células madre somáticas no restringidas (USSC) para la preparación de un medicamento para tratar enfermedad vascular, enfermedad cardiaca o del músculo liso, enfermedad hepática, diabetes mellitus de tipo 1, enfermedad neural, enfermedad de Parkinson o enfermedades hematológicas, en el que dichas USSC se aíslan de sangre del cordón umbilical, sangre de la placenta o muestras de sangre de recién nacidos y son:

(i): negativas para los antígenos de superficie CD45 y CD14;

(ii): positivas para los antígenos CD13, CD29, CD44, y CD49e;

(iii): expresan YB1, AML-1, RUNX-1, y fibulina-2; y

(iv): no expresan hialuronano sintasa, fibromodulina, y 1NFLS.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho medicamento comprende además progenie diferenciada in vitro de dichas USSC.