JP2021122205A - エクソソーム回収方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】糖を含有する培地で三次元構造の不織布を足場として間葉系幹細胞を三次元培養する、三次元培養工程と、間葉系幹細胞の糖消費量がプラトーとなってから更に一定時間培養する、プラトー状態後培養工程と、間葉系幹細胞からのエクソソームを回収する、エクソソーム回収工程と、を有することを特徴とする。間葉系幹細胞は例えば脂肪由来間葉系幹細胞である。
【選択図】図3
Description
三次元培養工程では、間葉系幹細胞に代謝される培地中の物質量を計測しながら、不織布を足場として、培地中で間葉系幹細胞を三次元培養する(なお本明細書では三次元を3Dと記載することがある。)。
プラトー状態後培養工程では、間葉系幹細胞の培地中の物質量がプラトーとなってから更に一定時間培養を行う。
最後に間葉系幹細胞からのエクソソームを回収する。前述のプラトー状態後培養工程の完了後は大量のエクソソームが産生しており、産生した大量のエクソソームの回収は通常用いられる手法を利用できる。エクソソームの回収法としては、特に限定されるものではなく、例えば超遠心法が挙げられる。超遠心法としては例えばペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法等が挙げられる。
以下に、不織布(3D)を足場として培養してその後糖消費量がプラトー状態での培養後のエクソソーム大量回収にかかる実施例を記載する。
三次元培養工程では、細胞の糖消費量(本実施例では培地中のグルコース消費量)がプラトーになるまで不織布を足場として細胞を三次元培養した。
プラトー状態後培養工程では、細胞の糖消費量がプラトーになってから一定時間細胞を三次元培養した。
BMSC及びADSCにおいて48時間後の培養上清1.5 ml全量を回収した。回収した培養上清から超遠心法にてエクソソームを回収した。また足場から細胞を剥離して最終細胞数を計測した。
以下に、培養皿(2D)を足場として培養してその後糖消費量がプラトー状態での培養後のエクソソーム回収にかかる比較例を記載する。
以下に、糖消費量がプラトー前での培養後のエクソソーム回収にかかる比較例を記載する。
4-1. 三次元構造体である不織布を使用した効果
全量回収した培養上清1.5 mlの内、評価項目当り50 μlずつをExoCounter(JVCKENWOOD)にて測定(CD63及びCD81をエクソソームマーカーとして定量)した。
BMSC及びADSCともに、不織布足場(3D)及び培養皿足場(2D)において、細胞の糖消費量がプラトーになる前の段階であるDay7まで培養した場合、不織布足場では細胞数は1.11±0.04 x 105個であり、培養皿足場では1.43±0.12 x 105個であった。細胞数の比率は不織布足場(3D)/培養皿足場(2D)ratio = x 0.776であった。
Claims (8)
- 間葉系幹細胞からのエクソソームの回収方法であって、
前記間葉系幹細胞に代謝される培地中の物質量を計測しながら、不織布を足場として前記培地中で間葉系幹細胞を三次元培養する、三次元培養工程と、
前記培地中の前記物質量がプラトーになった後に更に一定時間培養する、プラトー状態後培養工程と、
前記一定時間培養の後に、前記間葉系幹細胞からエクソソームを回収する、エクソソーム回収工程と、
を有することを特徴とするエクソソーム回収方法。 - 前記間葉系幹細胞に代謝される前記培地中の物質は糖であり、
前記間葉系幹細胞の培養時間に対する糖消費量を計測し、
前記プラトー状態後培養工程は、前記糖消費量がプラトー状態となってから更に一定時間培養することを特徴とする請求項1に記載のエクソソーム回収方法。 - 前記プラトー状態後培養工程において、前記間葉系幹細胞の培養時間に対する糖消費量の計測ではグルコースの消費量を計測することを特徴とする請求項2に記載のエクソソーム回収方法。
- 前記プラトー状態後培養工程において、前記物質量がプラトー状態となってからの培養時間は、24時間以上72時間以下であることを特徴とする請求項1乃至3の何れか1項に記載のエクソソーム回収方法。
- 前記間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項1乃至4の何れか1項に記載のエクソソーム回収方法。
- 前記間葉系幹細胞が脂肪由来間葉系幹細胞である場合、前記三次元培養工程における脂肪由来間葉系幹細胞の培養時間は7日以上9日以下であることを特徴とする請求項5に記載のエクソソーム回収方法。
- 前記間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項1乃至4の何れか1項に記載のエクソソーム回収方法。
- 前記間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である場合、前記三次元培養工程における骨髄由来間葉系幹細胞の培養時間は9日以上11日以下であることを特徴とする請求項7に記載のエクソソーム回収方法。
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