CN114269900A - 心肌细胞的富集方法 - Google Patents

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Abstract

提供在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞的方法，其作为用于在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞的技术，包括以CD151的表达量为指标从所述细胞群中回收心房肌细胞或心室肌细胞的步骤。

Description

心肌细胞的富集方法
技术领域
本发明涉及在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞的方法等。
背景技术
已经尝试了由诱导多潜能干细胞(iPSC)及胚胎干细胞(ESC)等干细胞诱导心肌细胞，并用于心脏病的再生医学。
心房肌细胞和心室肌细胞具有不同的功能。在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中，含有包括心房肌细胞及心室肌细胞在内的多种心肌细胞，也可能含有未分化细胞等非心肌细胞。因此，由干细胞诱导含有心肌细胞的细胞群而应用于再生医学时，期望根据治疗目的在细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞中的一者。
非专利文献1中记载了使用整合素6作为标志物，从由小鼠胚胎及新生小鼠的组织中分离出的心肌细胞中对心室肌细胞与心房肌细胞进行分离的技术。
另外，非专利文献2中记载了使用CD235a及RALDH2作为标志物，将由iPSC诱导的心肌细胞分离成心室肌细胞与心房肌细胞的技术。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1："Differential Expression Levels of Integrin α6 Enable theSelective Identification and Isolation of Atrial and VentricularCardiomyocytes",PLoS One,2015,10(11):e0143538.
非专利文献2："Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial andVentricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations",CellStem Cell,2017,21(2):179-194.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的主要目的在于提供用于在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞的技术。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明提供以下的[1]～[20]。
[1]方法，其为在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
以CD151的表达量为指标，从上述细胞群中回收心房肌细胞或心室肌细胞。
[2]方法，其为富集心房肌细胞的[1]的方法，
所述方法包括从上述细胞群中回收CD151低表达细胞的步骤。
[3]方法，其为富集心室肌细胞的[1]的方法，
所述方法包括从上述细胞群中回收CD151高表达细胞的步骤。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，上述干细胞为诱导多潜能干细胞。
[5]心房肌细胞或心室肌细胞经富集的细胞群，其是通过[1]的方法而得到的。
[6]心房肌细胞经富集的细胞群，其是通过[2]的方法而得到的。
[7]心室肌细胞经富集的细胞群，其是通过[3]的方法而得到的。
[8]医药，其含有通过[5]～[7]中任一项所述的细胞群。
[9]制备方法，其为由干细胞制备心房肌细胞或心室肌细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
步骤(A)，由上述干细胞诱导含心肌细胞的细胞群；及
步骤(B)，以CD151的表达量为指标，从上述细胞群中回收心房肌细胞或心室肌细胞。
[10]制备方法，其为制备心房肌细胞的[9]的方法，所述方法包括下述步骤：
步骤(A)，在心房肌细胞分化条件下，由上述干细胞诱导含有心肌细胞的细胞群；及
步骤(B)，从上述细胞群中回收CD151低表达细胞。
[11]制备方法，其为制备心室肌细胞的[9]的方法，所述方法包括下述步骤：
步骤(A)，在心室肌细胞分化条件下，由上述干细胞诱导含有心肌细胞的细胞群；及
步骤(B)，从上述细胞群中回收CD151高表达细胞。
[12]如[9]～[11]中任一项所述的方法，其中，上述干细胞为诱导多潜能干细胞。
[13]心房肌细胞或心室肌细胞，其是通过[9]的制备方法而得到的。
[14]心房肌细胞，其是通过[10]的制备方法而得到的。
[15]心室肌细胞，其是通过[11]的制备方法而得到的。
[16]医药，其含有通过[9]～[11]中任一项所述的制备方法而得到的心房肌细胞或心室肌细胞。
[17]试剂，其用于在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞，所述试剂含有CD151检测探针。
[18]如[17]的试剂，其中，CD151检测探针为抗CD151抗体。
[19]CD151检测探针的应用，其用于在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞。
[20]CD151的应用，其作为用于在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞的标志物。
[定义]
本发明中，“细胞群(cell population)”是指不同种类的2个以上细胞的集合。“细胞亚群(cell subpopulation)”是指构成细胞群的相同或不同细胞的集合，其为具有至少1个共通的性状的一组细胞。
所谓“进行富集(enrich)”及“富集(enrichment)”是指使细胞的组合物等组合物中特定的构成成分的量增加。所谓“经富集的(enriched)”，在用于说明细胞的组合物、例如细胞群的情况下，是指特定的构成成分的量与被富集前的细胞群中的该构成成分的比例相比有所增加。例如，可以按靶细胞型富集细胞群等组合物，因此，靶细胞型的比例与被富集前的细胞群内存在的靶细胞的比例相比有所增加。细胞群可以通过本技术领域中已知的细胞的选择及筛选方法针对靶细胞型进行富集。细胞群也可以通过本说明书中记载的特定的选择或筛选工艺进行富集。本发明的特定的实施方式中，相对于被富集前的细胞群，经富集后的细胞群中针对靶细胞群富集至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。另外，本发明的特定的实施方式中，经富集后的细胞群至少含有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的靶细胞群。
“CD151”为4次跨膜蛋白，是属于四次跨膜蛋白家族的蛋白质。CD151在与细胞的分化、增殖及运动有关的信号转导中发挥重要的作用。另外，已知CD151与整合素形成复合物而参与细胞的黏附及融合等功能。
本发明中，CD151被用作用于在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞的标志物。
“标志物”是指“标志蛋白”或“标志基因”，是在特定的细胞型的细胞表面、细胞质内及/或细胞核内等特异性表达的蛋白质或其基因。标志物可以是阳性选择标志物或阴性选择标志物。优选的是，标志物为细胞表面标志物，利用细胞表面选择标志物，能够实施存活细胞的浓缩、分离及/或检测。
标志蛋白的检测可利用使用了该标志蛋白的特异性抗体的免疫学分析、例如ELISA、免疫染色、流式细胞术等来进行。作为标志蛋白的特异性抗体，可使用与标志蛋白中的特定氨基酸序列、或结合于标志蛋白的特定糖链等进行结合的抗体。另外，于细胞内表达且不出现在细胞表面的标志蛋白(例如转录因子或其亚基等)的情况下，可使报告蛋白与该标志蛋白一同表达，通过检测该报告蛋白来检测作为对象的标志蛋白。该方法优选用于未能确认合适的细胞表面标志物的情况。标志基因的检测可利用该领域中已知的核酸扩增方法及/或核酸检测方法、例如RT-PCR、微阵列、生物芯片及RNAseq等来进行。
“表达(expression)”定义为由启动子驱动的特定的核苷酸序列的转录及/或转录产物的翻译。
“阳性(positive)”或“表达”是指蛋白质或mRNA以可通过该领域中已知的方法检测到的量表达。蛋白质的检测可利用使用了抗体的免疫学分析、例如ELISA、免疫染色、流式细胞术来进行。另外，于细胞内表达且不出现在细胞表面的蛋白质(例如转录因子或其亚基等)的情况下，可使报告蛋白与该蛋白一同表达，通过检测该报告蛋白来检测作为对象的蛋白质。mRNA的检测可利用例如RT-PCR、微阵列、生物芯片及RNAseq等核酸扩增方法及/或核酸检测方法来进行。
“阴性(negative)”或“不表达”是指蛋白质或基因的表达量低于上述已知方法中的全部或任意一种的检测下限值。蛋白质或基因的表达的检测下限值根据各方法而有所不同。
“多潜能性(pluripotency)”是指能够分化成具有各种不同的形态、功能的组织、细胞、可分化成三胚层中的任何一个谱系的细胞的能力。“多潜能性(pluripotency)”不能分化成胚盘，因此没有形成个体的能力，在这一点上与能分化成包括胚盘在内的生物体的任何组织的“全能性(totipotency)”有所区别。
“多能性(multipotency)”是指能够分化成多个有限数量的谱系的细胞的能力。例如，间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞是多能性的，但不是多潜能性的。
“培养”是指在体外环境中维持细胞，使其增殖(生长)、且/或分化。“进行培养”是指在组织外或体外，例如细胞培养皿、板、瓶或培养槽(罐)中维持细胞，使其增殖(生长)、且/或分化。
“维持培养(Sustain)”是指对所期望的细胞群在维持其数量的同时进行培养。细胞数量的维持可通过使细胞以不增殖的方式存活而达成，也可通过使细胞的增殖导致的增加数量与死亡导致的减少数量相抵消而达成。对于细胞数量的维持，并不需要将细胞的数量维持为完全相同，只要根据本发明的目的而将细胞的数量维持为实质相同即可。
“扩大培养(Expand)”是指以使所期望的细胞群增殖、使细胞数量增加为目的进行培养。细胞数量的增加只要通过使细胞的增殖导致的增加数量超过死亡导致的减少数量而达成即可，并不需要细胞群的所有细胞都增殖。与开始扩大培养前相比，细胞数量的增加可以为1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1000倍、3000倍、5000倍、10000倍、100000倍、1000000倍以上。
“含有(comprise(s)或comprising)……”是指包括但不限于该短语后面的要素。因此，暗示了包含该短语后面的要素，但并没有暗示排除其他任意的要素。
“约”或“大约”表示在相对于基准值分别增加或减少30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％而波动的值。优选的是，“约”或“大约”这样的术语表示相对于基准值分别增加或减少15％、10％、5％、或1％的范围。
发明效果
根据本发明，提供用于在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞的技术。
附图说明
图1为示出了心室肌细胞及心房肌细胞所呈现的典型的动作电位波形的图。
图2为示出了用流式细胞仪对在心室肌细胞诱导条件下由iPSC诱导的、含有心肌细胞的细胞群中的CD151的表达进行分析的结果的图。横轴表示EmGFP的荧光强度，纵轴表示Alexa(注册商标)647的荧光强度。图中，“Q2”表示“CD151-高”的细胞亚群，“Q4”表示“CD151-低”的细胞亚群。
图3为示出了用流式细胞仪对在心房肌细胞诱导条件下由iPSC诱导的、含有心肌细胞的细胞群中的CD151的表达进行分析的结果的图。横轴表示EmGFP的荧光强度，纵轴表示Alexa(注册商标)647的荧光强度。图中，“Q2”表示“CD151-高”的细胞亚群、“Q4”表示“CD151-低”的细胞亚群。
图4为示出了在心室肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-高”及在心房肌细胞分化条件下得到的“CD151-低”中的心房肌细胞的标志基因(KCNA5、KCNJ3、NPPA、NR2F1、NR2F2、TBX5)及心室肌细胞的标志基因(HEY2、MYL2)的表达量的图表。心房肌细胞的标志基因的表达量以将在心房肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-高”中的表达量设为1时的相对值(平均值±标准误差)表示。心室肌细胞的标志基因的表达量以将在心室肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-高”中的表达量设为1时的相对值(平均值±标准误差)表示。
图5为在心室肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-高”及在心房肌细胞分化条件下得到的“CD151-低”对心房肌特异性的通道的抑制剂及激动剂的应答的图表。(A)表示对抑制剂(4-氨基吡啶)的应答，(B)表示对激动剂(氨甲酰胆碱)的应答。
具体实施方式
以下，对本发明的合适的实施方式进行说明。需要说明的是，以下所说明的实施方式示出了本发明的典型的实施方式的一个例子，而非基于此对本发明的范围进行限定性解释。
1.由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中的心房肌细胞或心室肌细胞的富集方法，
本发明的心房肌细胞或心室肌细胞的富集方法包括以下的步骤。
步骤(1)，以CD151的表达量为指标，从含有心肌细胞的细胞群中回收心房肌细胞或心室肌细胞。
本发明的方法中，富集心房肌细胞时，步骤(1)具体为以下的步骤(1-1)。
步骤(1-1)，从含有心肌细胞的细胞群中回收CD151低表达细胞。
由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中，与基于CD151低表达鉴定的细胞亚群相比，基于CD151高表达鉴定的细胞亚群以更高的比率含有心室肌细胞。因此，通过从由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中去除基于CD151高表达鉴定的细胞亚群、或从含有心肌细胞的细胞群中回收基于CD151低表达鉴定的细胞亚群，能够在细胞群中富集心房肌细胞。
另一方面，本发明的方法中，富集心室肌细胞时，步骤(1)具体为以下的步骤(1-2)。
步骤(1-2)，从含有心肌细胞的细胞群中回收CD151高表达细胞。
由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中，与基于CD151低表达鉴定的细胞亚群相比，基于CD151高表达鉴定的细胞亚群以更高的比率含有心室肌细胞。因此，通过从由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中去除基于CD151低表达鉴定的细胞亚群、或从含有心肌细胞的细胞群中回收基于CD151高表达鉴定的细胞亚群，能够在细胞群中富集心室肌细胞。
[CD151检测探针]
细胞中的CD151的表达水平可使用具有针对CD151的结合性的CD151检测探针(以下也简称为“探针”)来确定。
探针例如可以为抗体及核酸(适配体等)等，优选为抗体。
优选探针进行了可被光学、电或磁方式检测到的标记。此时，可使细胞与探针接触，通过光、电或磁方式检测来自与CD151结合的探针的标记的信号，基于该信号强度确定细胞中的CD151的表达水平。
另外，例如当探针为抗体时，也可使用与该抗体进行结合的标记二抗确定细胞中的CD151的表达水平。
本发明还提供用于在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞的试剂，所述试剂含有上述探针。
对于细胞中的CD151的表达水平而言，可基于细胞群中的表达水平的分布设定一定的基准值，将呈现该基准值以上的表达水平的细胞确定为高表达，将呈现低于该基准值的表达水平的细胞确定为低表达。作为这种情况下的基准值，例如可以为各细胞的表达水平的最大值、平均值、中值或众数，优选为最大值。基准值可根据作为目标的细胞富集率而适当设定，例如可设定为与各细胞的表达水平的最大值、平均值、中值或众数(优选最大值)相比大或小1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或者更大或更小的值。
另外，对于细胞中的CD151的表达水平而言，也可将干细胞中的表达水平设定为基准值，将呈现该基准值以上的表达水平的细胞确定为高表达，将呈现低于该基准值的表达水平的细胞确定为低表达。作为这种情况下的基准值，例如可以为干细胞中的表达水平的最大值、平均值、中值或众数，优选为最大值。基准值可根据作为目标的细胞富集率而适当设定，例如可设定为与干细胞中的表达水平的最大值、平均值、中值或众数(优选最大值)相比大或小1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或者更大或更小的值。
或者，对于细胞中的CD151的表达水平而言，还可将针对未接触探针的细胞(阴性对照)以与接触了探针的细胞同样的方式检测到的信号强度设定为基准值，将呈现该基准值以上的信号强度的细胞确定为高表达，将呈现低于该基准值的信号强度的细胞确定为低表达。基准值可根据作为目标的细胞富集率而适当设定，例如可设定为与阴性对照的表达水平的最大值、平均值、中值或众数(优选最大值)相比大或小1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或者更大或更小的值。
目标的细胞亚群的回收或非目标的细胞亚群的去除可适用以往已知的条件，可适宜地适用例如利用流式细胞仪的细胞分选。作为一个例子，首先，使抗CD151一抗与细胞反应。洗涤细胞以去除未与细胞结合的抗CD151一抗后，使荧光标记二抗与细胞反应。进一步洗涤细胞以去除未与一抗结合的荧光标记二抗后，用流式细胞仪测定细胞的荧光强度，分选出呈现上述基准值以上的表达水平的细胞作为CD151高表达细胞亚群(CD151-高)，分选出呈现低于基准值的表达水平的细胞作为CD151低表达细胞亚群(CD151-低)。
2.心房肌细胞或心室肌细胞经富集的心肌细胞群
本发明还提供通过上述富集方法得到的、心房肌细胞经富集的细胞群及心室肌细胞经富集的细胞群。
心房肌细胞或心室肌细胞在细胞群中所占的比例没有特别限定，与由干细胞诱导的含有心肌细胞的最初的细胞群中的比例相比，回收的目标细胞亚群中的比例高例如5％、10％、20％、30％、40％、50％，优选高60％、70％、80％、90％，更优选高100％、150％、200％、300％、400％，最优选高500％以上。心房肌细胞或心室肌细胞在心房肌细胞经富集的细胞群中或心室肌细胞经富集的细胞群中所占的比例为例如5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上，优选为60以上、70％以上、80％以上、90％以上，更优选为99.5％以上、99.9％以上。
可通过以往已知的方法来鉴定细胞是心房肌细胞或是心室肌细胞，可采用例如基于以下所述的电生理学分析、标志物表达分析及药剂反应分析的鉴定。
基于电生理学分析的鉴定可采用例如基于膜片钳法的以下(1)～(7)中的任一者。图1示出了心室肌细胞及心房肌细胞的典型的动作电位波形。
(1)将呈现30％复极化时的动作电位持续时间(APD30)与90％复极化时的动作电位持续时间(APD90)之比(APD30/90)为0.3以上、且波形上升的最大速度(dv/dtmax)为10以上的动作电位波形的细胞定义为心室肌细胞。另一方面，将呈现APD30/90小于0.3、且dv/dtmax为10以上的动作电位波形的细胞定义为心房肌细胞。这种情况下，将呈现dv/dtmax小于10、且自发性动作电位周期为1s以上的动作电位波形的细胞定义为不被归类为心室肌细胞及心房肌细胞中任一者的未成熟心肌细胞(Cell Stem Cell,2017,21,179-194)。
(2)将呈现50％复极化时的动作电位持续时间(APD50)或APD90的值显著较长的动作电位波形的细胞定义为心室肌细胞，将呈现APD50或APD90的值显著较短的动作电位波形的细胞定义为心房肌细胞(JCI Insight,2018；3(12):e99941、Eur.Heart J.2017,38,292-301)。
(3)将呈现20％复极化时的动作电位持续时间(APD20)或APD50或APD90的值显著较长、动作电位平台期的振幅(APAPlat)显著较大的动作电位波形的细胞定义为心室肌细胞，将呈现APD20或APD50或APD90的值显著较短、APAPlat显著较小的动作电位波形的细胞定义为心房肌细胞(Stem Cell Reports.2017 Dec 12；9(6):1765-1779)。
(4)将呈现APD20与80％复极化时的动作电位持续时间(APD80)之比(APD20/80)的值显著较大的动作电位波形的细胞定义为心室肌细胞，将呈现APD20/80的值显著较小的动作电位波形的细胞定义为心房肌细胞(JCI Insight,2018；3(12):e99941)。
(5)将呈现APD90与APD50之比(APD90/50)的值显著较小的动作电位波形的细胞定义为心室肌细胞，将呈现APD90/50的值显著较大的动作电位波形的细胞定义为心房肌细胞(Eur.Heart J.,2017,38,292-301、Eur.Heart J.,2011,32,952-962)。
(6)将呈现APD90/50小于1.4的动作电位波形的细胞定义为心室肌细胞，将呈现APD90/50大于1.7的动作电位波形的细胞定义为心房肌细胞。这种情况下，将呈现APD90/50为1.4以上且1.7以下的动作电位波形的细胞定义为起搏细胞(Eur.Heart J.,2011,32,952-962)。
(7)将呈现伴有20mV以内的膜电位变化的平台期为50ms以上、dv/dtmax大于50、动作电位振幅(APA)大于85mV、且APD90/50小于2.3的动作电位波形的细胞定义为心室肌细胞。将呈现相对于同动作电位波形，区别仅在于没有平台期这一点的动作电位波形的细胞定义为心房肌细胞，将呈现区别在于没有平台期、且APD90/50超过2.3的动作电位波形的细胞定义为起搏细胞(PNAS,2017,E8372-E8381)。
对于基于标志物表达分析的鉴定而言，测定标志蛋白、标志基因的表达，只要细胞表达心房肌细胞标志物，优选还不表达心室肌细胞标志物，即可判断该细胞为心房肌细胞。反之，只要细胞表达心室肌细胞标志物，优选还不表达心房肌细胞标志物，即可判断该细胞为心室肌细胞。作为心房肌细胞的标志基因，已知有KCNA5(Potassium voltage-gatedchannel subfamily A member 5，钾电压门控通道A亚家族成员5)、KCNJ3(Potassiumvoltage-gated channel subfamily J member 3，钾电压门控通道J亚家族成员3)、NPPA(Natriuretic peptide A，A型钠尿肽)、NR2F1(Nuclear receptor subfamily 2group Fmember 1，核受体2亚家族F组成员1)、NR2F2(Nuclear receptor subfamily 2group Fmember 2，核受体2亚家族F组成员2)、TBX5(T-Box 5)，作为心室肌细胞的标志基因，已知有HEY2(Hes related family BHLH transcription factor with YRPW motif 2，含有YRPW基序2的Hes相关家族BHLH转录因子)、MYL2(Myosin light chain2，肌球蛋白轻链2)。
需要说明的是，包含心房肌细胞及心室肌细胞的心肌细胞是指表达了选自至少由心肌肌钙蛋白(cTNT)、αMHC(αmyosin heavy chain，α肌球蛋白重链、MYH6)及βMHC(MYH7)组成的组中的至少一种标志物的细胞。对于cTNT基因而言，人的情况下，可示例NCBI登录号NM_000364，小鼠的情况下，可示例NM_001130176。对于αMHC基因而言，人的情况下，可示例NCBI登录号NM_002471，小鼠的情况下，可示例NM_001164171。对于βMHC基因而言，人的情况下，可示例NCBI登录号NM_000257，小鼠的情况下，可示例NM_080728。
标志蛋白的检测可利用使用了该标志蛋白的特异性抗体的免疫学分析、例如ELISA、免疫染色、流式细胞术等来进行。标志基因的检测可利用该领域中已知的核酸扩增方法及/或核酸检测方法、例如RT-PCR、微阵列、生物芯片等来进行。
作为基于药物反应分析的鉴定，可举出检测细胞针对激活或抑制于心房肌细胞或心室肌细胞特异性表达的通道的药物的应答的方法。例如，氨甲酰胆碱(carbachol)为激活于心房肌细胞特异性表达的毒蕈碱型钾通道(IK,Ach)的药物，将其添加至细胞时，仅在心房肌细胞中观察到动作电位持续时间(APD)的缩短，但不会影响心室肌细胞的APD。另外，4-氨基吡啶(4-aminopyridine)为抑制超快激活延迟整流钾通道(IKur)的药物，将其添加至细胞时，仅在心房肌细胞中观察到APD20的延长，但不会影响心室肌细胞的APD(Stem CellReports,2018；11(6):1378-1390.)。可通过检测细胞针对这些药物的应答性来进行心房肌细胞或心室肌细胞的鉴定。
3.由干细胞制备心房肌细胞或心室肌细胞的方法
由本发明的干细胞制备心房肌细胞或心室肌细胞的方法包括以下步骤。
步骤(A)，由上述干细胞诱导含有心肌细胞的细胞群。
步骤(B)，以CD151的表达量为指标，从上述细胞群中回收心房肌细胞或心室肌细胞。
本发明的制备方法中，制备心房肌细胞时，步骤(A)、(B)具体为以下的步骤(A-1)、(B-1)。
步骤(A-1)，在心房肌细胞分化条件下，由上述干细胞诱导含有心肌细胞的细胞群。
步骤(B-1)，从上述细胞群中回收CD151低表达细胞。
另一方面，本发明的制备方法中，制备心室肌细胞时，步骤(A)、(B)具体为以下的步骤(A-2)、(B-2)。
步骤(A-2)，在心室肌细胞分化条件下，由上述干细胞诱导含有心肌细胞的细胞群，
步骤(B-2)，从上述细胞群中回收CD151高表达细胞。
[诱导步骤]
步骤(A)、(A-1)、(A-2)中，由干细胞诱导含有心肌细胞的细胞群。
[干细胞]
作为“干细胞(stem cell)”，可举出例如多潜能干细胞(pluripotent stemcell)。
可在本发明中使用的“多潜能干细胞(pluripotent stem cell)”是指具有能够分化成生物体的具有各种不同的形态、功能的组织、细胞、可分化成三个胚层(内胚层、中胚层、外胚层)中的任何一个谱系的细胞的能力的干细胞。其没有特别限定，可举出例如胚胎干细胞(ESC)、源自通过核移植而获得的克隆胚胎的胚胎干细胞、精原干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多潜能干细胞(本说明书中有时也称为“iPSC”)等。另外，可在本发明中使用的“多能干细胞(multipotent stem cell)”是指具有能够分化成多个有限数量的谱系的细胞的能力的干细胞。作为可在本发明中使用的“多能干细胞(multipotent stemcell)”，可举出例如牙髓干细胞、源自口腔粘膜的干细胞、毛囊干细胞、源自培养的成纤维细胞、骨髓干细胞的成体干细胞等。优选的多潜能干细胞(pluripotent stemcell)为ESC及iPSC。
作为“ESC”，若为小鼠ESC，则可利用inGenious targeting laboratory公司、理研(理化学研究所)等建立的各种小鼠ESC株，若为人ESC，则可利用威斯康星大学、NIH、理研、京都大学、国立成育医疗研究中心及Cellartis公司等建立的各种人ESC株。例如，作为人ESC株，可利用ESI Bio公司出售的CHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WiCell Research出售的H1株、H9株等、理研出售的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
“诱导多潜能干细胞”是指通过在哺乳动物体细胞或未分化干细胞中导入特定的因子(核重编程因子)并进行重编程而得到的细胞。现在，“诱导多潜能干细胞”的种类很多，除了山中等人通过在小鼠成纤维细胞中导入Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc这4种因子而建立的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)以外，还可使用将同样的4种因子导入人成纤维细胞中而建立的源自人细胞的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.等，Cell,(2007)131:861-872.)、导入上述4种因子后以Nanog的表达为指标进行筛选而建立的Nanog-iPSC(Okita,K.,Ichisaka,T.,andYamanaka,S.(2007).Nature448,313-317.)、以不含c-Myc的方法制作的iPSC(NakagawaM,YamanakaS.等，Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)、用无病毒法(virus-free method)导入6种因子而建立的iPSC(Okita K等，Nat.Methods 2011May；8(5):409-12,Okita K等，Stem Cells.31(3):458-66.)等。另外，还可使用由Thomson等制作的导入OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28这4种因子而建立的诱导多潜能干细胞(Yu J.,Thomson JA.等，Sc ience(2007)318:1917-1920.)、由Daley等制作的诱导多潜能干细胞(Park IH,Daley GQ.等，Nature(2007)451:141-146)、由樱田等制作的诱导多潜能干细胞(日本特开2008-307007号)等。
除此以外，也可使用已公开的所有论文(例如，Shi Y.,Ding S.等，Cell StemCell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.等，Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.等，Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)、或专利(例如，日本特开2008-307007号、日本特开2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)中记载的本领域中已知的诱导多潜能干细胞中的任一种。
作为诱导多潜能干细胞株，可利用NIH、理研、京都大学等建立的各种iPSC株。例如，若为人iPSC株，则可举出理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等、京都大学的253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、1390D4株及1390C1株等，更优选为1390D4株及1390C1株。或者，也可使用由京都大学、Cellular Dynamics International等提供的临床级的细胞株以及使用这些细胞株制作的研究用途及临床用途的细胞株等。
[心房肌细胞分化条件]
心房肌细胞分化条件可适用以往已知(例如参考EMBO Mol Med(2015)7:394-410)的条件。例如，将由iPSC制成的类胚体在含有BMP4、激活素A及bFGF的基础培养基中培养2天，然后在含有VEGF、Wnt抑制剂、TGF-β抑制剂及视黄酸的基础培养基中培养3天。进一步，在含有VEGF的基础培养基中进行培养，从而能够得到含有心房肌细胞的细胞群。
分化诱导时间没有特别限定，例如为7-40天，根据目的，也可以为例如120天、90天、60天、30天、28天、21天、14天或7天。
[心室肌细胞分化条件]
心室肌细胞分化条件可适用以往已知(例如参考Cell Stem Cell.(2011) 8(2):228-40)的条件。例如，将由iPSC制成的类胚体在含有BMP4、激活素A及bFGF的基础培养基中培养2天，然后在含有VEGF、Wnt抑制剂、BMP4抑制剂及TGF-β抑制剂的基础培养基中培养3天。进一步，在含有VEGF的基础培养基中进行培养，从而能够得到含有心室肌细胞的细胞群。
分化诱导时间没有特别限定，例如为7-40天，根据目的，也可以为例如120天、90天、60天、30天、28天、21天、14天或7天。
作为基础培养基，没有特别限定，可适宜地使用例如StemPro-34 SFM(ThermoFisher)、STEMdiff APEL2培养基(STEMCELL Technologies、ST-05275)、TeSR1培养基以及ChemicallyDefined Medium(限定化学成分培养基)(CDM)培养基。除此以外，也可使用BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM(IMEM)培养基、Improved MDM(IMDM)培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基(高糖、低糖)、DMEM/F12培养基、Ham培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、及它们的混合培养基等。
作为CDM培养基，没有特别限定，可使用例如由Iscove’s modified Dulbecco’smedium(GE Healthcare公司制造)配制的培养基。
基础培养基中可添加Ham’s F-12营养混合物、人血清白蛋白等白蛋白、聚乙烯醇(PVA)、去离子化的BSA、亚油酸、亚麻酸、胆固醇、胰岛素、脱铁运铁蛋白、硒、乙醇胺、硫代甘油、无蛋白杂交瘤混合物II(Protein-free hybridoma mixture II)(PFHMII)、抗坏血酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺及/或抗生素等常规的细胞培养中使用的物质。
Wnt抑制剂(Wnt信号转导抑制剂)是抑制Wnt介导的信号转导通路的物质，可使用例如IWP-2、IWP-3、IWP-4、2-(4-三氟甲基苯基)-7,8-二氢-5H-硫代噻喃并[4,3-d]嘧啶-4(3H)-酮、IWR1、G-CSF、IGFBP4、Dkk1、Cerberus、抗Wnt抗体、Wnt激动剂(Wnt受体抑制剂)、可溶性Wnt受体蛋白(Frzb-1等)、显性负性突变体等。这些Wnt抑制剂也可以组合使用两种以上。
BMP4抑制剂可使用例如Dorsomorphin(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-A]嘧啶，6-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-ylpyrazolo[1,5-A]pyrimidine)、靛玉红-3’-肟、盐酸苯乙双胍、GSK621、WZ4003、HTH-01-015等。这些BMP4抑制剂也可以组合使用两种以上。
TGF-β抑制剂可举出SB431542(4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺，4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide)、A83-01(4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺，4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide)、LDN193189(4-[6-[4-(1-哌嗪基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉，4-[6-[4-(1-Piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-quinoline)、GW788388(4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺，4-[4-[3-(2-Pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-2-pyridinyl]-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)-benzamide)、SM16(4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-二环[2.2.2]辛烷-1-甲酰胺，4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-bicyclo[2.2.2]octane-1-carboxamide)、IN-1130(3-[[5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-(6-喹喔啉基)-1H-咪唑-2-基]甲基]-苯甲酰胺，3-[[5-(6-Methyl-2-pyridinyl)-4-(6-quinoxalinyl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]-benzamide)、GW6604(2-苯基-4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶，2-Phenyl-4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]pyridine)及SB505124(2-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-6-甲基-吡啶，2-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-2-(1,1-dimethylethyl)-1H-imidazol-5-yl]-6-methyl-pyridine)等。这些TGF-β抑制剂也可以组合使用两种以上。
[分离步骤]
步骤(B)、(B-1)、(B-2)中，以CD151的表达量为指标从得到的细胞群中回收心房肌细胞或心室肌细胞。
本步骤与上述的心房肌细胞或心室肌细胞的富集方法相同。
4.心房肌细胞及心室肌细胞
本发明还提供通过上述制备方法而得到的心房肌细胞及心室肌细胞经富集的细胞群。
[医药]
本发明的细胞群、以及心房肌细胞及心室肌细胞可适用于含有其的心脏病治疗用途的细胞医药、及基于施予该细胞医药的心脏病的治疗方法。另外，本发明还提供用于制造上述细胞医药的上述细胞群以及心房肌细胞及心室肌细胞的应用、及用于治疗心脏病的上述细胞群以及心房肌细胞及心室肌细胞。
细胞医药可用于心肌梗塞、心力衰竭、缺血性心脏病、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、扩张期肥厚型心肌病、扩张型心肌病等心脏病的再生医学。
细胞医药中所含有的细胞可以为例如将培养中的细胞剥离并回收而得的细胞，也可以为冷冻在冷冻保存液中的细胞。使用将扩大培养而得到的同批次的细胞分成小份冷冻保存的细胞时，在能够稳定地得到同样的作用效果的方面、操作性优异的方面等是优选的。
细胞医药可以为将细胞悬浮于适宜的溶剂中而成的悬浮液、细胞凝集块、及形成为单层或2层以上的细胞片等任意的形态。溶剂可使用水、生理盐水或各种缓冲液、细胞保存液。另外，细胞凝集块及细胞片可以仅由细胞形成，也可以由适宜的生物相容性的材料和细胞形成。作为生物相容性材料，可举出胶原蛋白、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸、海藻酸盐、聚环氧乙烷、聚乳酸-聚乙醇酸的共聚物、蛋白聚糖、糖胺聚糖、人真皮、或这些材料的组合。生物相容性材料可以为片等膜、海绵等多孔体、或织物、布及无纺布等网状体等。
细胞医药可根据用途、形态而按照常规方法含有药学上可接受的载体、添加剂等其他成分。作为载体、添加剂，可举出例如等渗剂、增稠剂、糖类、糖醇类、防腐剂(保存剂)、杀菌剂或抗菌剂、pH调节剂、稳定剂、螯合剂、油性基剂、凝胶基剂、表面活性剂、混悬剂、流化剂、分散剂、缓冲剂、抗氧化剂等。
利用细胞医药，提供包括对患者施予治疗有效量的该细胞医药的、上述疾病的治疗方法。
所谓治疗有效量，是指对患者施予细胞时，与未施予的对照相比能够获得针对上述疾病的治疗效果的细胞的量。作为具体的治疗有效量，可根据施予形态、施予方式、使用目的及患者的年龄、体重、症状等而适当选择。人(例如成人)每1次治疗的有效量为例如200,000～1,000,000个/kg体重。
作为细胞医药的施予方式，例如可举出腹腔注射、皮下注射、淋巴结注射、静脉注射、胸腔注射或基于开腹的局部直接注射等。
[冷冻储液]
本发明还提供含有利用本步骤得到的细胞群以及/或者心房肌细胞及/或心室肌细胞的冷冻储液。
冷冻储液可通过利用离心分离将所得到的细胞群以及/或者心房肌细胞及/或心室肌细胞从培养基中分离、使其悬浮于冷冻保存液中进行冷冻而制备。对于冷冻保存液，只要使用以往细胞的冷冻保存中使用的试剂即可。例如，市售的Cryostem Freezing Medium(商品名称)及CELLBANKER(注册商标)等。
冷冻储液可用于例如制作以心房肌细胞及心室肌细胞为构成要素的组织模型(人工心脏)。
实施例
[试验例1：由iPSC诱导心肌细胞群]
在心房肌细胞分化条件或心室肌细胞分化条件下，由iPSC诱导含有心肌细胞的细胞群。
iPSC使用了作为报告蛋白向TNNI1的基因座中插入EmGFP、向TNNI3的基因座中插入mCherry而得的双敲入人iPS细胞株(1390D4株)。
iPSC的维持培养按照以往已知的方法("An Efficient Nonviral Method toGenerate Integration-Free Human-Induced Pluripotent Stem Cells from CordBlood and Peripheral Blood Cells",Stem Cells,2012)来进行。
将iPSC接种于低粘附性的6孔板(2×106个细胞/1.5ml/孔)，在37℃、5％氧气条件下静置培养，形成类胚体(第0天)。培养基使用了添加有L-谷氨酰胺1％、运铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL、硫代甘油4×10-4M、Rock抑制剂(Y-27632)10μM、BMP4 2ng/mL及Matrigel 0.5％的StemPro-34 SFM(ThermoFisher)。
[心房肌细胞分化条件]
次日(第1天)，向接种有细胞的各孔中添加1.5ml/孔的心房肌细胞诱导培养基1，在37℃、5％氧气条件下进一步培养2天。心房肌细胞诱导培养基1使用了添加有L-谷氨酰胺1％、运铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL、硫代甘油4×10-4M、BMP4 4ng/ml、激活素A 8ng/ml、bFGF 10ng/ml的StemPro-34 SFM。
接着(第3天)，将培养基更换为心房肌细胞诱导培养基2，在37℃、5％氧气条件下培养3天。心房肌细胞诱导培养基2使用了添加有L-谷氨酰胺1％、运铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL、硫代甘油4×10-4M、VEGF 10ng/mL、Wnt抑制剂(IWP-3)1μM、TGF-β抑制剂(SB431542)5.4μM及视黄酸1μM的StemPro-34 SFM。
[心室肌细胞分化条件]
次日(第1天)，向接种有细胞的各孔中添加1.5ml/孔的心室肌细胞诱导培养基1，在37℃、5％氧气条件下进一步培养2天。心室肌细胞诱导培养基1使用了添加有L-谷氨酰胺1％、运铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL、硫代甘油4×10-4M、BMP4 18ng/ml、激活素A12ng/ml、bFGF 10ng/ml的StemPro-34 SFM。
接着(第3天)，将培养基更换为心室肌细胞诱导培养基2，在37℃、5％氧气条件下培养3天。心室肌细胞诱导培养基2使用了添加有L-谷氨酰胺1％、运铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL、硫代甘油4×10-4M、VEGF 10ng/mL、Wnt抑制剂(IWP-3)1μM、BMP4抑制剂(Dorsomorphin)0.6μM及TGF-β抑制剂(SB431542)5.4μM的StemPro-34 SFM。
[共通操作]
在心室肌细胞分化条件下或心房肌细胞分化条件下，于第6天将培养基更换为心肌细胞诱导培养基3，在37℃、5％氧气条件下培养14天(第20天)，由此得到含有心室肌细胞或心房肌细胞的细胞群。心肌细胞诱导培养基3使用了添加有L-谷氨酰胺1％、运铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL、硫代甘油4×10-4M及VEGF 5ng/mL的StemPro-34 SFM。在第8、10、13、15、17天更换培养基。第10天更换培养基以后，在常氧条件下进行培养。
[试验例2：基于CD151表达水平的心肌细胞群的分选]
将培养第20天的、含有心室肌细胞或心房肌细胞的细胞群分散成单个的细胞(single cell)，计数细胞数量。
向细胞悬浮液中添加抗CD151抗体(BD)，于4℃静置30分钟。配制了未添加抗体的试样作为阴性对照。
洗涤操作后，向细胞悬浮液中添加Alexa(注册商标)647标记二抗，于4℃静置30分钟。
用流式细胞仪(BD FACSAria Fusion细胞分选仪)对EmGFP阳性细胞中的CD151的表达进行分析。分选出各细胞亚群，将呈现低于阴性对照细胞的荧光强度的最大值的荧光强度的细胞亚群作为“CD151-低”，将呈现比阴性对照更高的荧光强度的细胞亚群作为“CD151-高”。图2、图3示出了流式细胞仪的图，表1示出了细胞亚群的比例。
[表1]
CD151-高 CD151-低
心室肌细胞分化条件 55.4％ 44.5％
心房肌细胞分化条件 24.7％ 75.0％
[试验例3：确定细胞亚群“CD151-高”及“CD151-低”中的心房肌细胞及心室肌细胞的比例]
对分别在心室肌细胞分化条件及心房肌细胞分化条件下得到的“CD151-高”及“CD151-低”的细胞亚群，使用电生理学方法确定心房肌细胞及心室肌细胞的比例。
在包被有纤连蛋白的盖玻片上培养各细胞亚群。使用添加有L-谷氨酰胺1％、运铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL、硫代甘油4×10-4M、VEGF 5ng/mL的StemPro-34 SFM，于37℃、常氧下进行培养，每隔3天更换培养基。将培养后第13天～第16天的细胞供于电生理学分析。
使用Axopatch 200B amplifier(Molecular Devices)及pCLAMP软件，采用全细胞膜片钳法进行分析。电极是使用玻璃毛细管(WPI)在拉针仪(micropipette puller)中制作的，并充满细胞内液(130mM KOH，130mM L-天冬氨酸，20mM KCl，5mM NaCl，10mM HEPES，5mMMg-ATP，10mM EGTA，1mM MgCl2，pH 7.2)。一边使作为细胞外液的格氏平衡盐溶液(Sigma)回流一边于35-37℃下进行实验。在电流钳模式下记录1分钟各细胞的自发性动作电位。根据连续的8-10个波形的平均波形计算出APD30、APD90、波形上升的最大速度(dv/dtmax)。将呈现出APD30/90≥0.3且dv/dtmax≥10的波形的细胞定义为心室肌细胞，将呈现出APD30/90＜0.3且dv/dtmax≥10的波形的细胞定义为心房肌细胞。将呈现出dv/dtmax＜10的波形的细胞归类为其他细胞。
将结果示于表2。
[表2]
Figure BDA0003503065340000241
在心室肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-高”中以高比率(94.1％)含有心室肌细胞。另外，在心室肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-低”中以心室肌细胞居多(71.4％)，但也含有一定数量(23.8％)的心房肌细胞。因此可知通过从在心室肌细胞分化条件下得到的总细胞群中去除细胞亚群“CD151-低”(含71.4％的心室肌细胞、23.8％的心房肌细胞)、或回收细胞亚群“CD151-高”，可得到心室肌细胞经富集的细胞群。
另一方面，在心房肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-低”中以较高的比率(37.5％)含有心房肌细胞。另外，在心房肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-高”中不含心房肌细胞，但含有一定数量(18.8％)的心室肌细胞。因此可知通过从在心房肌细胞分化条件下得到的总细胞群中去除细胞亚群“CD151-高”(含18.8％的心室肌细胞)、或回收细胞亚群“CD151-低”，可得到心房肌细胞经富集的细胞群。
[试验例4：细胞亚群“CD151-高”及“CD151-低”中的心房肌细胞标志物及心室肌细胞标志物的表达分析]
针对试验例2中在心室肌细胞分化条件下得到的“CD151-高”及在心房肌细胞分化条件下得到的“CD151-低”的细胞亚群，分析了心房肌细胞标志物及心室肌细胞标志物的表达。
按照常规方法，从各细胞亚群中提取总RNA，进行心房肌细胞的标志基因(KCNA5、KCNJ3、NPPA、NR2F1、NR2F2、TBX5)及心室肌细胞的标志基因(HEY2、MYL2)的表达分析。将结果示于图4。心房肌细胞的标志基因的表达量为在心房肌细胞分化条件下得到的细胞中的各标志物的表达量，以将在心房肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-高”中的表达量设为1而得的相对值(平均值±标准误差)表示。心室肌细胞的标志基因的表达量为在心室肌细胞分化条件下得到的细胞中的各标志物的表达量，以将在心室肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-高”中的表达量设为1而得的相对值(平均值±标准误差)表示。
在心房肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-低”中确认到高于细胞亚群“CD151-高”的心房肌细胞的标志基因的表达。因此可知通过从在心房肌细胞分化条件下得到的总细胞群中去除细胞亚群“CD151-高”、或回收细胞亚群“CD151-低”，可得到心房肌细胞经富集的细胞群。
在心室肌细胞分化条件下得到的细胞亚群“CD151-高”中确认到高于细胞亚群“CD151-低”的心室肌细胞的标志基因的表达。因此可知从在心室肌细胞分化条件下得到的总细胞群中去除细胞亚群“CD151-低”、或回收细胞亚群“CD151-高”，可得到心室肌细胞经富集的细胞群。
试验例1-4中，人iPS细胞株1390D4使用了作为报告蛋白向TNNI1的基因座中插入EmGFP、向TNNI3的基因座中插入mCherry而得的双敲入细胞株。在使用人iPS细胞株1390C1进行的试验中也得到了同样的结果。
[试验例5：细胞亚群“CD151-高”及“CD151-低”的使用了心房肌特异性通道抑制剂及激动剂的亚型细胞的鉴定]
针对试验例2中在心室肌细胞分化条件下得到的“CD151-高”及在心房肌细胞分化条件下得到的“CD151-低”的细胞亚群，就对作为心房特异性通道抑制剂的4-氨基吡啶、及作为激动剂的氨甲酰胆碱的应答进行了分析。
将各细胞亚群以5×104个细胞/5μL接种于包被有纤连蛋白的玻璃底培养皿中进行培养。使用添加有L-谷氨酰胺1％、运铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL、硫代甘油4×10-4M、VEGF 5ng/mL的StemPro-34 SFM，于37℃、常氧下进行培养，每隔3天更换培养基。将培养后第6天～第10天的细胞供于膜电位分析。
去除培养基后，将每200μL格氏平衡盐溶液(Sigma)中添加有0.2μL电压敏感染料(voltage-sensitive dye)(FluoVolt，Thermofisher scientific，F10488)的溶液滴加于接种有细胞的培养皿的玻璃部分，于37℃、常氧条件下孵育15分钟。去除含电压敏感染料的溶液，在培养皿中添加1mL格氏平衡盐溶液，在显微镜载物台上的培养装置(37℃、常氧)中孵育1小时。对源自“CD151-高”的细胞于1Hz起搏下进行分析，对源自“CD151-低”的细胞于3Hz起搏下进行分析。
分析通过使用AquaCosmos2.6(Hamamatsu Photonics)，在490nm的激发光下每5.9毫秒测定20秒钟的荧光反应来进行。测定范围(ROI)设定为512×64像素。
为了观察添加4-氨基吡啶对动作电位带来的影响，首先取得添加药物之前的动作电位波形。然后，在培养皿中添加4-氨基吡啶(最终浓度50μM，sigma)，静置10分钟后，得到相同ROI中的动作电位波形。
为了观察添加氨甲酰胆碱对动作电位带来的影响，首先取得添加药物之前的动作电位波形。然后，在培养皿中添加氨甲酰胆碱(最终浓度10μM，sigma)，静置1分钟后，得到相同ROI中的动作电位波形。
针对得到的动作电位波形，将连续的6-10个波形平均化。将添加4-氨基吡啶及氨甲酰胆碱前后的波形示于图5。
确认到通过添加4-氨基吡啶，在心房肌分化条件下得到的“CD151-低”的细胞亚群中，动作电位持续时间(APD)延长。另一方面，在心室肌分化条件下得到的“CD151-高”的细胞亚群中未观察到APD的延长(参见图5(A))。
另外，确认到通过添加氨甲酰胆碱，在心房肌分化条件下得到的“CD151-低”的细胞亚群中，APD缩短。另一方面，在心室肌分化条件下得到的“CD151-高”的细胞亚群中，未观察到APD的变化(参见图5(B))。
根据以上的药物应答，确认了在心房肌分化条件下得到的“CD151-低”的细胞亚群为心房肌细胞，在心室肌分化条件下得到的“CD151-高”的细胞亚群为心室肌细胞。

Claims (6)

1.方法，其为在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
以CD151的表达量为指标，从所述细胞群中回收心房肌细胞或心室肌细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞为诱导多潜能干细胞。
3.心房肌细胞或心室肌细胞经富集的细胞群，其是通过权利要求1所述的方法而得到的。
4.制备方法，其为由干细胞制备心房肌细胞或心室肌细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
步骤(A)，由所述干细胞诱导含有心肌细胞的细胞群；及
步骤(B)，以CD151的表达量为指标，从所述细胞群中回收心房肌细胞或心室肌细胞。
5.试剂，其用于在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞，所述试剂含有CD151检测探针。
6.CD151检测探针的应用，其用于在由干细胞诱导的含有心肌细胞的细胞群中富集心房肌细胞或心室肌细胞。
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