发明内容
发明目的:
本发明是为了解决结核分枝杆菌抗体检测时,所用的抗原如16kDa抗原、38kDa抗原、LAM等的漏检问题,提供一种抗原,可以补充现有抗原的漏检,提高结核抗体检测的检出率。
发明详述:
针对上述目的,本发明提供一种结核分枝杆菌的蛋白,其来源于天然结核分枝杆菌,分子量在55000Da至115000Da之间。更进一步,本发明提供的结核分枝杆菌蛋白,其来源于天然结核分枝杆菌,分子量在55000Da至75000Da之间。
为了弥补16kDa抗原、38kDa抗原、LAM等抗原的漏检,于是从天然培养的结核分枝杆菌菌体裂解物作为候选抗原,从中选择效果最佳的蛋白来辅助现有几种抗原用于结核分枝杆菌抗体。结核分枝杆菌的培养,选取37℃左右的培养条件。培养基的选择,推荐采用L-J培养基和Middlebrook 7H9培养基,本领域的技术员可以从前人的资料中得到其具体配方和培养方法:WHO.Laboratory services intuberculosis control,1998.以及Flourny D,Twilley J.ModifiedMiddlebrook 7H9 broth for the rapid detection ofmycobacteria.Clin Lab Sci 2001;14:85-88.
不经纯化的结核分枝杆菌菌体裂解物,其纯度很差,在免疫检测时,容易引起本底过高和假阳等不利因素。所以,本发明将裂解物制备的粗抗原,经不同分子量区段的考察,确定灵敏度较高并且本底和假阳反应相对最低的蛋白分子量区段。为了实现将不同分子量蛋白区分的目的,采用的纯化方式可以是凝胶过滤纯化或者聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白按照分子量区分开来,本发明优选凝胶过滤的方法,此法可以尽可能的保持结核分枝杆菌的天然结构和免疫反应性。这里所指的蛋白,可以是单一分子量的蛋白,或者是一种以上分子量的蛋白混合物,这点差异对于TB抗体的检测没有影响。
经过实验证实,分子量在55000Da至115000Da之间的结核分枝杆菌天然蛋白,对结核分枝杆菌阳性的病人血清样本,有相对较好的检出率,同时可以补充16kDa抗原、38kDa抗原、LAM等抗原的漏检达13%左右,且仅有少量的假阳性反应,具体数据将在实施例里面体现。因此,本发明要求保护的是天然结核分枝杆菌分子量在55000Da至115000Da之间。这里有一个情况,进一步缩小和限制天然结核分枝杆菌分子量区间,会得到相对前者更好的结果。分子量在55000Da至75000Da之间时,会得到反应性稍有差异的结果:分子量在55000Da至75000Da之间的蛋白混合物,其检测出的阳性标本数量会比分子量在55000Da至115000Da之间的蛋白混合物少,但是假阳性标本的数量会比后者也少,原因在于被减少的蛋白中,有同时对结核分枝杆菌阳性标本和对假阳性标本起反应的蛋白。因此,分子量在55000Da至75000Da之间的蛋白可以适用于对假阳性要求更加严格的情况下,对16kDa抗原、38kDa抗原、LAM等抗原的漏检进行补充。
本发明的蛋白用于结核分枝杆菌抗体的检测,可以适用于一切免疫检测法,优选为ELISA或者金标法。检测的方法优选间接法或者双抗原夹心法。本发明的蛋白用于ELISA的间接法、ELISA的夹心法、金标法的间接法、金标法的夹心法,其操作步骤和普通传染病抗体检测方法例如HIV、HCV、TP等项目的检测方法基本一致,本领域的技术人员应该熟知,这里不再赘述。
本发明的蛋白来源于天然结核分枝杆菌,是指采用天然结核分枝杆菌的菌体,包括毒株、低毒株或者无毒株,例如毒株HRv37,无毒株HRa37,将其置于结核分枝杆菌适宜的培养条件下,培养出一定量的菌体,然后经过破碎,可选择性的纯化或者不纯化,得到的蛋白,其和来源于基因工程重组或者化学合成法得到的蛋白是制备方法上的区别。
发明优点:
本发明的结核分枝杆菌蛋白,其应用于免疫检测结核分枝杆菌抗体时,可以补充现有抗原例如16kDa抗原、38kDa抗原、LAM等在检测时的漏检,提高结核分枝杆菌抗体检测的检出率。
具体实施方式
本发明的目的、特征及优点将结合实施例作进一步详细阐述。应当理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,可以按照结核分枝杆菌的常规培养方法,以及结核分枝杆菌抗体检测试剂盒生产厂家推荐的方法来实现,本领域的技术人员应该熟知,这里不再赘述。
实施例1 天然结核分枝杆菌的培养以及高分子量蛋白的制备
1.1 培养基的配制
L-J培养基,参照文献WHO.Laboratory services intuberculosis control,1998.成分:谷氨酸钠,7.2g;磷酸二氢钾,2.4g;硫酸镁.7H2O,0.24g;柠檬酸镁,0.6g;丙三醇,12ml;蒸馏水,600ml;马铃薯淀粉,30g;新鲜全卵液(鸡蛋),1000ml;2%孔雀石绿水溶液,20ml。制备方法:基础液中的各成分溶解后,加入马铃薯淀粉,混匀,水浴锅内间接加热,并不断搅拌,直至淀粉变成半透明糊状,待以上液体冷却后加入新鲜鸡卵液和2%孔雀石绿水溶液,充分混匀用3层消毒纱布过滤,分装18mm*180mm试管,每管9~10ml,电热恒温干燥箱内85℃,1h间歇灭菌两次。
Middlebrook 7H9液体培养基,参照文献Flourny D,TwilleyJ.Modified Middlebrook 7H9 broth for the rapid detection ofmycobacteria.Clin Lab Sci 2001;14:85-88.成分:(NH4)2SO4,0.5g;Na2HPO4,2.5g;KH2PO4,1.0g;MgSO4*7H2O,0.05g;CaCl2,0.0005g;ZnSO4,0.001g;CuSO4*5H2O 0.01g;谷氨酸钠,0.5g;柠檬酸钠*2H2O,0.1g;盐酸吡哆醇,0.001g;生物素,0.0005g;柠檬酸铁铵,0.04g;Tween-80,0.5g;蒸馏水。配制方法:将以上各成分溶于水,分装于1L三角瓶,每瓶450ml,121℃高压灭菌15min,使用前每瓶加入牛血清白蛋白葡萄糖溶液50ml,过氧化氢酶溶液0.75ml。其中,牛血清白蛋白葡萄糖溶液成分:葡萄糖,0.2g;牛血清白蛋白V,0.25g;蒸馏水,10ml;配制方法:将上述成分溶于蒸馏水内,过虑除菌,分装小瓶,4℃保存备用。其中,过氧化氢酶溶液成分:过氧化氢酶,10mg;蒸馏水,10ml;配制方法:将上述成分溶于蒸馏水内,过虑除菌,分装小瓶,4℃保存备用。
1.2 结核分枝杆菌的培养
将结核分枝杆菌H37Ra(ATCC 25177)原始菌从-70度冰箱取出,室温融化,用接种环挑取少许菌体,用1ml菌种稀释液(即0.05%tween-80生理盐水溶液)冲洗,使其均匀的分散于稀释液。吸取10ul上述的菌液,滴在L-J培养基斜面上,用接菌环将菌液均匀的分散在培养基的表面。37℃培养5周之后,挑取菌落于5ml菌种稀释液,分散均匀后,取250ul转接到500ml Middlebrook 7H9培养基。37℃培养4周,每隔3天轻摇一次。收集菌液,5000g离心20min,弃去上清,收集菌体。
1.3 高分子量蛋白的制备
取2g菌体,5ml含有5mM EDTA,0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬,用超声破碎仪冰浴超声破碎,条件为45%×950W,4min×2次,每次间隔2min。上述菌液于4℃,12000g离心20分钟,收集上清。再次用5mM EDTA,0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬颗粒,重复两次以上操作,合并3次离心后的上清,4℃暂存。采用美国GE公司Superdex 20010/300GL(Tricorn)(货号17-5175-01)纯化介质,美国伯乐公司的Biologic Chromatography systems_(DuoFlow 40)纯化系统进行蛋白纯化。条件如下,样品:12000rpm,30min离心处理过结核杆菌裂解液的上清;上样量:750ul;流动相:0.05M磷酸盐,0.15M NaCl,pH7.4,流速:0.5ml/min,在25℃条件下,检测OD280。洗脱回收,得到各蛋白峰,并进行SDS-PAGE确认55000Da至75000Da之间的蛋白,55000Da至115000Da,等比合并区间组分。得到55000Da至75000Da之间的目的蛋白以及分子量在55000Da至115000Da之间的目的蛋白,下一步使用。
1.4 对照抗原的制备
16kDa抗原、38kDa抗原、LAM对照抗原的制备,采用基因工程重组的方式进行,按照常规条件,Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,本领域的技术人员应该熟知。16kDa抗原,参见文献Mycobacterium tuberculosis 16-kDa Antigen(Hsp16.3)Functionsas an Oligomeric Structure in Vitro to Suppress ThermalAggregation,Zengyi Chang,Todd P.Primm,Joanita Jakana,IrwinH.Lee,Irina Seryshevai,Wah Chiu,Hiram F.Gilbert,andFlorante A.Quiocho,THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.271,No.12,Issue of March 22,pp.7218-7223,1996.,制备其基因工程重组抗原。38kDa抗原,参见文献Immunological Activityof a 38-Kilodalton Protein Purified from Mycobacteriumtuberculosis,D.YOUNG,L.KENT,A.REES,J.LAMB,AND J.IVANYI,INFECTION AND IMMUNITY,Oct.1986,p.177-183.以及Structureand Mapping of Antigenic Domains of Protein Antigen b,a38,000Da-Molecular-Weight Protein of Mycobacteriumtuberculosis,ASE BENGARD ANDERSEN AND EGON BECHHANSEN,INFECTION AND IMMUNITY,Aug.1989,p.2481-2488,Vol.57,No.8.制备其基因工程重组抗原。LAM抗原,参见文献StructuralAnalysis of the Mannan Region of Lipoarabinomannan fromMycobacterium bovis BCG,Anne Venisse,Michel Rivière,JosephVercauteren,Germain Puzo,Volume 270,Number 25,Issue of June23,pp.15012-15021,1995.,制备其抗原。
实施例2 用结核分枝杆菌高分子量蛋白检测结核分枝杆菌抗体
2.1 间接ELISA法检测结核分枝杆菌抗体
2.1.1 间接ELISA法高分子量蛋白的包被
将抗原用碳酸盐缓冲液(50mM,pH9.51)稀释到1ug/ml,100ul/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司辐照酶标板),4℃包被24小时,次日用PBST(10mM PB,150mM NaCl,0.05% Tween-20,pH7.4)洗涤液洗板二次,拍干,120ul/孔加入含30%新生牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所),8%蔗糖,5‰酪蛋白(美国Sigma-Aldrich公司,货号C-8645),150mM NaCl的pH7.4,10mM PB封闭液,37℃封闭2小时,甩掉孔内液体,拍干,置室温20-25℃、湿度55%-65%、有通风设备的房间内风干,包被完毕。16kDa抗原、38kDa抗原、LAM等抗原的包被也按照同样过程进行,作为本发明抗原的对照。
2.1.2 间接ELISA法检测结核分枝杆菌抗体
在上述包被好的酶标板中先加入100ul待测样品、阴性参照样品(正常人阴性血清)、阳性参照样品对照,其中结核痰菌涂片观察阳性病人血清,来自深圳市慢性病防治医院以及深圳市疾病控制中心,37℃温育30分钟;用PBST洗涤液洗板五次,拍干。再100ul/孔加入含有20%新生牛血清,以1:5000稀释的鼠抗人IgG-HRP标记物的pH7.4的20mM PB缓冲液,37℃温育30分钟;用PBST洗涤液洗板五次,拍干。
每孔加入含0.5‰过氧化氢尿素(生工,货号UB1753)、4.76‰三水合乙酸钠、0.9‰冰醋酸的显色剂A及含0.32‰ TMB(生工,货号TB0514)、5mM柠檬酸、0.5mM EDTA-2Na、5%甲醇、2‰二甲基甲酰胺的显色剂B各50ul,37℃避光显色10分钟。每孔加50ul,含2M硫酸的终止液终止反应,酶标仪450nm波长(参考波长630nm)空白孔校零后读取OD值。
截值(Cutoff Value(COV))计算:COV=阴性对照平均OD值×2.0(阴性对照OD值低于0.15按0.15计算,高于0.15按实际OD值计算),待测样品OD值≥COV为阳性,待测样品OD值<COV为阴性。
2.1.3 间接ELISA法检测结核分枝杆菌抗体的结果
间接ELISA法一共检测了1000份结核分枝杆菌痰菌涂片观察阳性病人血清,以及200份正常人血清,16Kda+38Kda+LAM抗原组合在1000份阳性血清中检测出阳性711份,漏检289份,在200份阴性血清中检出假阳48份。本发明的分子量在55000Da至115000Da之间的抗原在1000份阳性血清中检测出阳性487份,漏检513份,补充16Kda+38Kda+LAM抗原组合的漏检138份,在200份阴性血清中检出假阳45份。本发明的分子量在55000Da至75000Da之间的抗原在1000份阳性血清中检测出阳性455份,漏检545份,补充16Kda+38Kda+LAM抗原组合的漏检126份,在200份阴性血清中检出假阳32份。无论16Kda+38Kda+LAM抗原组合还是本发明的抗原,都有一些假阳性,这是结核分枝杆菌血清学检测不可避免的。从上面数据可以说明,本发明的抗原,对现有技术的16Kda+38Kda+LAM抗原组合,有补充漏检的作用。
2.2 夹心ELISA法检测结核分枝杆菌抗体
2.2.1 夹心ELISA法高分子量蛋白的包被
包被方式参见本发明的1.2.1部分。
2.2.2 夹心ELISA法第二抗原的标记
第二抗原-HRP标记物的制备采用NaIO4氧化法。称取10mg辣根过氧化物酶(HRP,英国Biozyme laboratories公司,货号:HRP4)溶解于1ml超纯水中,再缓慢滴加1ml超纯水新鲜配制的5mg/mlNaIO4(生工,货号ST1244)溶液,室温下避光轻柔搅拌40分钟后加入20%乙二醇(生工,货号E0582)溶液0.05ml,室温下避光搅拌40分钟。然后立即加入事先对100mM,pH 9.51碳酸盐缓冲液透析2小时,2.5mg/ml的纯化好的本发明的分子量在55000Da至115000Da之间的蛋白1ml,4℃避光对100mM,pH 9.51碳酸盐缓冲液透析过夜。次日,向混合物中滴加0.1ml新鲜配制的4mg/ml NaBH4(生工,货号ST1268)溶液,混匀,4℃静置2小时。将上述溶液装入透析袋中,对PBS缓冲液(150mM,pH7.4)透析,4℃过夜。加入酶保护剂及终浓度50%的甘油混匀后-20℃避光保存备用。本发明的分子量在55000Da至75000Da之间的抗原,以及16kDa抗原、38kDa抗原、LAM等抗原跟HRP标记物的制备,也采用相同办法进行。
2.2.3 夹心ELISA法检测结核分枝杆菌抗体
在2.2.1中包被好的酶标板中先加入100ul待测样品、阴性参照样品(正常人阴性血清)、阳性参照样品(HIV抗体阳性血清)对照,37℃温育30分钟;用PBST洗涤液洗板五次,拍干。再100ul/孔加入用20%新生牛血清,pH7.4的20mM PB缓冲液以一定比例稀释的2.2.1中的标记物,37℃温育30分钟;用PBST洗涤液洗板五次,拍干。随后的显色步骤和2.1.2一样。
2.2.4 夹心ELISA法检测结核分枝杆菌抗体的结果
夹心ELISA法一共检测了1000份结核分枝杆菌痰菌涂片观察阳性病人血清,以及200份正常人血清,16Kda+38Kda+LAM抗原组合在1000份阳性血清中检测出阳性695份,漏检305份,在200份阴性血清中检出假阳42份。本发明的分子量在55000Da至115000Da之间的抗原在1000份阳性血清中检测出阳性472份,漏检528份,补充16Kda+38Kda+LAM抗原组合的漏检135份,在200份阴性血清中检出假阳39份。本发明的分子量在55000Da至75000Da之间的抗原在1000份阳性血清中检测出阳性455份,漏检545份,补充16Kda+38Kda+LAM抗原组合的漏检126份,在200份阴性血清中检出假阳32份。从上面数据可以说明,本发明的抗原,对现有技术的16Kda+38Kda+LAM抗原组合,有补充漏检的作用。
2.3 间接金标法检测结核分枝杆菌抗体
2.3.1 间接金标法检测条的制备
在三角烧瓶中加入100ml超纯水,磁力加热搅拌器上加热至沸腾,加入1%氯金酸(Sigma-Aldrich公司,货号:16961-25-4)溶液1ml,沸腾后立刻加入1%柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司,货号:6132-04-3)水溶液1ml,继续沸腾10分钟,然后自然冷却即可。
取10ml上述胶体金放入烧杯中,搅拌中加入150ul的0.2M K2CO3调节pH至7.0,继续搅拌20秒;加入一定量的鼠抗人IgG单抗,继续搅拌10分钟;加入0.1ml 10%BSA,继续搅拌5分钟;5000g离心10分钟,吸出上清,将沉淀收集至一合适容器;对上清再用10000g离心15分钟,重复第一次离心的操作;对上清再用12000g离心30分钟,弃掉上清,将三次离心的沉淀收集到同一离心管中,用胶体金稀释液(20mM PB,150mM NaCl,1%BSA,0.1% TritonX-100,2%Sucrose,0.01%Proclin300)定容至1ml此即抗人IgG鼠单抗-胶体金标记物。
将上述金标复合物用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(Watman公司),冻干,即制成金标垫。
用检测线稀释液(10mM PBS+2%蔗糖)稀释本发明的分子量在55000Da至115000Da之间的抗原至0.8mg/ml制成检测线工作液,用同一稀释液稀释羊抗鼠单抗至0.5mg/ml制成对照线工作液,用点膜仪将这两种工作液划到硝酸纤维素膜(Millipore公司,货号:HF135002)的相应位置上,37度干燥1小时。
将上述金标垫、包被好的硝酸纤维素膜以及吸水纸、聚酯板、样品垫等辅料组装成TB间接金标法检测试剂盒。本发明的分子量在55000Da至75000Da之间的抗原,以及对照抗原的包被、标记、组装方法和上面类似。
2.3.2 间接金标法检测
加100ul待测样品到样品垫处,室温放置20分钟之后,判定结果。结果判定标准如下:
①仅质控区出现一条带,在测试区内无条带出现,为阴性(-);
②有两条带出现,其中一条位于质控区,另一条位于测试区,表示阳性(+);
③质控区未出现条带,表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下,应再用新的试纸条重新测试。
2.3.3 间接金标法检测结核分枝杆菌抗体的结果
间接金标法一共检测了1000份结核分枝杆菌痰菌涂片观察阳性病人血清,以及200份正常人血清,16Kda+38Kda+LAM抗原组合在1000份阳性血清中检测出阳性662份,漏检338份,在200份阴性血清中检出假阳78份。本发明的分子量在55000Da至115000Da之间的抗原在1000份阳性血清中检测出阳性438份,漏检562份,补充16Kda+38Kda+LAM抗原组合的漏检136份,在200份阴性血清中检出假阳64份。本发明的分子量在55000Da至75000Da之间的抗原在1000份阳性血清中检测出阳性413份,漏检587份,补充16Kda+38Kda+LAM抗原组合的漏检124份,在200份阴性血清中检出假阳51份。从上面数据可以说明,本发明的抗原,对现有技术的16Kda+38Kda+LAM抗原组合,有补充漏检的作用。
2.4 夹心金标法检测结核分枝杆菌抗体
2.4.1 夹心金标法检测条的制备
采用2.3.1相同的方法制备胶体金溶液。取10ml上述胶体金放入烧杯中,搅拌中加入150ul的0.2M K2CO3调节pH至7.0,继续搅拌20秒;加入一定量的本发明的分子量在55000Da至115000Da之间的抗原,继续搅拌10分钟;加入0.1ml 10%BSA,继续搅拌5分钟;5000g离心10分钟,吸出上清,将沉淀收集至一合适容器;对上清再用10000g离心15分钟,重复第一次离心的操作;对上清再用12000g离心30分钟,弃掉上清,将三次离心的沉淀收集到同一离心管中,用胶体金稀释液(20mM PB,150mM NaCl,1%BSA,0.1%TritonX-100,2%Sucrose,0.01%Proclin300)定容至1ml此即本发明的分子量在55000Da至115000Da之间的抗原-胶体金标记物。
将上述金标复合物用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(Watman公司),冻干,即制成金标垫。
用检测线稀释液(10mM PBS+2%蔗糖)稀释本发明的分子量在55000Da至115000Da之间的抗原至0.8mg/ml制成检测线工作液,用同一稀释液稀释鼠抗人单抗至0.5mg/ml制成对照线工作液,用点膜仪将这两种工作液划到硝酸纤维素膜(Millipore公司,货号:HF135002)的相应位置上,37度干燥1小时。
将上述金标垫、包被好的硝酸纤维素膜以及吸水纸、聚酯板、样品垫等辅料组装成TP金标检测试剂盒。本发明的分子量在55000Da至75000Da之间的抗原,以及对照抗原的包被、标记、组装方法和上面类似。
2.4.2 夹心金标法检测
加100ul待测样品到样品垫处,室温放置20分钟之后,判定结果。结果判定标准如下:
①仅质控区出现一条带,在测试区内无条带出现,为阴性(-);
②有两条带出现,其中一条位于质控区,另一条位于测试区,表示阳性(+);
③质控区未出现条带,表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下,应再用新的试纸条重新测试。
2.4.3 夹心金标法检测的结果
夹心金标法一共检测了1000份结核分枝杆菌痰菌涂片观察阳性病人血清,以及200份正常人血清,16Kda+38Kda+LAM抗原组合在1000份阳性血清中检测出阳性638份,漏检362份,在200份阴性血清中检出假阳61份。本发明的分子量在55000Da至115000Da之间的抗原在1000份阳性血清中检测出阳性422份,漏检578份,补充16Kda+38Kda+LAM抗原组合的漏检133份,在200份阴性血清中检出假阳49份。本发明的分子量在55000Da至75000Da之间的抗原在1000份阳性血清中检测出阳性398份,漏检602份,补充16Kda+38Kda+LAM抗原组合的漏检124份,在200份阴性血清中检出假阳40份。从上面数据可以说明,本发明的抗原,对现有技术的16Kda+38Kda+LAM抗原组合,有补充漏检的作用。