CN108593941A - 一种NT-proBNP免疫法测定试剂制备和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是公开了一种基于均相酶测定技术，用于测定样品中脑钠肽前体N‑末端肽（N‑terminal pro‑brain natriuretic peptide,NT pro‑BNP）的含量。该试剂包含抗NT pro‑BNP特异性抗体、酶‑NT pro‑BNP复合物，利用酶‑NT pro‑BNP复合物与抗NT pro‑BNP特异性抗体免疫学反应，形成抗原抗体复合物后，酶‑NT pro‑BNP复合物活性受到抑制，通过测定反应体系中酶活性的变化，从而得到结合的酶标记物数量，从而得到待测样品中NT pro‑BNP的含量。该方法可应用于半自动或全自动生化分析仪，操作简单，检测时间短，灵敏度高，符合临床的需求。

Description

一种NT-proBNP免疫法测定试剂制备和检测方法
技术领域
本发明涉及到小分子与蛋白质定向连接、抗原抗体反应的检测方法，属于医学生物学领域。是基于均相的免疫学酶法测定。尤其涉及一种检测NT pro-BNP的方法和试剂盒的制备。
背景技术
脑钠肽前体N-末端肽(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT pro-BNP)是一种心脏分泌的神经激素，当心室壁张力增加时,心室肌细胞受到牵拉刺激，就会以激素原的形式爆发式合成，NT-proBNP由脑利纳肽原(pro-brain natriuretic peptide，pro-BNP1-108)代谢生成的氨基末端1-76个氨基酸组成，如图1所示。
1988年日本学者Tetsuji Sudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽，命名为BNP1。目前用于临床检测的BNP包括BNP77-108和NT-proBNP两种。虽然两者有相同的生物学来源，但生物学效应和临床意义不完全相同。心肌细胞受刺激后，产生初始基因产物前BNP前体(pre-proBNP)，该肽的一个26氨基信号肽被立即去除，形成含108个氨基酸的的BNP前体(proBNP)，后者在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的脑钠肽前体N-末端肽(NT-proBNP)和含有32个氨基酸、有活性的B型利钠肽(BNP)。BNP的清除主要通过与BNP清除受体结合，而NT-proBNP则主要由肾小球滤过，因此其血浓度受肾功能影响大于BNP。BNP半衰期短(22分钟)，体外稳定性差，而NT-proBNP半衰期较长(120分钟),体外稳定性强，在心衰患者中的浓度较BNP高，与BNP相比更有利于心衰的诊断。大量基础和临床研究表明，血液中的BNP水平在心力衰竭时显著升高，作为一种新的生物标记物，对心力衰竭的诊断和预后评估具有重要的价值。因此，最早在ESC慢性心力衰竭指南2(2001年)，继而在美国ACC/AHA慢性心力衰竭指南3(2005年)中推荐将血液BNP水平测定作为心力衰竭的诊断和预后指标。2008年ESC的急性和慢性心力衰竭指南4和2009年AHA心力衰竭指南5对此作了进一步的推荐。因此，NT-proBNP不仅仅用于诊断和筛查(早期)心功能不全，对多种疾病的预后、危险度分层、手术时间选择也有较高的价值，在临床上具有重要的应用价值。
目前，定量测定NT pro-BNP的方法，有高效液相色谱法(HPLC)，液质联用法(HPLC-MS)，放射性免疫分析法(RIA)、床旁检测(POCT)、电化学发光免疫分析法(ECLIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)以及。其中高效液相色谱法(HPLC)，液质联用法(HPLC-MS)需要设备比较昂贵，操作复杂，通量小，不适合大规模应用；放射性免疫分析法(RIA)则容易对操作者造成辐射损伤，也不利于广泛应用；酶联免疫吸附法(ELISA)存在操作复杂，检测时间长，自动化程度低，重复性较差，不利于仪器自动化和标准化；目前的床旁检测POCT速度较快，但是需要特定仪器，并且准确性较低，重复性差，并且其测定的全血样本，参考值没有明确的标准；电化学发光免疫分析法(ECLIA)是现在的主流技术，但是主要是以罗氏为代表的国际厂商所垄断，没有国产厂家，需要配套的仪器和试剂盒，成本较高，难以普及。
抗NT pro-BNP抗体的制备难度较高，存在特异性不好和线性范围小的缺点。与pro-BNP存在较大的交叉反应，特异性差，制备的试剂特异性差。有文献报道类似NT pro-BNP这种多肽的半抗原制备方法决定了制备的抗体的特异性和亲和力。多肽同载体蛋白的连接位点决定了制备抗体的特异性，要保证多肽的特异性抗原决定簇不在半抗原偶联过程中被破坏。载体蛋白同半抗原合适的连接臂长度能够保证多肽的充分暴露，如果过长，会大大降低多肽的免疫原性，太短，载体蛋白会影响多肽的结构。本发明采用特异性的连接臂，通过连接位点的定向选择，羧基端或者氨基端，充分暴露NT pro-BNP的免疫位点，从而获得高亲和力及高特异性的抗体。目前市场上缺乏灵敏度高、特异性强、尤其是适合自动化检验的的NT-proBNP检测试剂。
本发明采用酶偶联NT-proBNP复合物，与NT-proBNP特异性抗体免疫学反应，形成抗原抗体复合物后，酶-NT pro-BNP复合物的活性就受到抑制。样品中的NT pro-BNP与酶-NT pro-BNP复合物竞争性结合抗NT pro-BNP特异性抗体。样品中的NT pro-BNP越多，结合的抗体就越多。酶-NT pro-BNP复合物结合的抗体就越少，通过测定反应体系中酶活性的变化,可以得到样品中NT pro-BNP的含量。检测速度快、操作简单、灵敏度高、特异性强且可以在全自动生化分析仪上实现对小分子物质的高通量快速化检测的优点，具有较高的应用价值。
发明内容
本检测方法基于免疫学反应，采用均相免疫的酶学测定方法，将小分子NT pro-BNP与酶通过蛋白质连接技术形成复合物，与样品中的待测NT pro-BNP与抗NT pro-BNP特异性抗体竞争结合，通过酶活性的高低来实现样品中NT pro-BNP浓度的检测。该方法可以提供一种既安全又可快速、高效、灵敏、准确检测出待测样本中NT pro-BNP含量的均相酶免疫检测试剂及其制备方法。该试剂可应用于临床中广泛使用的各种类型的自动生化分析仪，从而达到大规模样品的测定要求，提高了实用性。
本发明提供了检测NT pro-BNP的试剂盒，包含试剂R1，试剂R2，缓冲液，稳定剂，NTpro-BNP参考标准品的液体试剂盒。
进一步的，一个优选的技术方案是：
一种NT pro-BNP均相免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗NT pro-BNP特异性抗体、用于检测抗NT pro-BNP特异性抗体-NT pro-BNP复合物的检测试剂制备及检测方法；上述NT pro-BNP均相免疫检测试剂盒基于以下原理：含有NT pro-BNP的生物样品同NT pro-BNP-G6PDH酶复合物竞争结合抗NT pro-BNP特异性抗体；NT pro-BNP-G6PDH酶复合物与抗NT pro-BNP特异性抗体形成免疫结合物后，其催化底物葡萄糖-6-磷酸的活性降低或丧失，反应产物NADH的量也降低；测定样品中NT pro-BNP的浓度量越高，竞争到的抗NT pro-BNP特异性抗体越多，抗NT pro-BNP特异性抗体对NT pro-BNP-G6PDH酶复合物的活性抑制越低，则反应生成的NADH量越多；根据测定NADH的量计算，从而得到样品中的NT pro-BNP含量。
根据这一发明目的，进一步的一个优选实施方案：其中制备NT pro-BNP免疫原用于制备抗NT pro-BNP特异性抗体。优选的利用NT pro-BNP多肽的羧基端同载体蛋白交联，优选的连接臂基团为-NH-(CH2)3-S-；载体蛋白优选兔白蛋白；免疫动物优选新西兰大白兔；化学偶联方式优选Ellman试剂法；上述优选方法制备的抗NT pro-BNP特异性抗体对NTpro-BNP亲和力高，特异性好，同proBNP、BNP77-108无交叉反应。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中制备NT pro-BNP-酶复合物用于测定NT pro-BNP测定试剂盒。优选的酶为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)；优选的采用NT pro-BNP氨基基团同葡萄糖-6-磷酸脱氢酶交联；NT pro-BNP与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的交联方法优选戊二醛法；NT pro-BNP与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶交联的酶活保护剂优选葡萄糖-6-磷酸NADH；上述保护剂葡萄糖-6-磷酸优选浓度10mM-100mM，NADH优选浓度为10-100mM；采用合理的酶保护剂，优先占据G6PDH的酶活性中心，避免NT pro-BNP-G6PDH偶联过程中酶活中心的破坏而导致的酶活丧失。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中NT pro-BNP测定试剂盒中R1试剂缓冲液优选磷酸盐缓冲液；PH优选6.0-8.0；葡萄糖-6-磷酸浓度优选10-100mM；NaCl浓度优选10-200mM；NAD+浓度优选10-100mM；0.001％-0.01％叠氮钠；吐温-20浓度优选的为0.01％-0.1％；BSA优选的为0.1％-0.5％；
抗NT pro-BNP抗体优选的为0.01-2％。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中NT pro-BNP测定试剂盒中R2试剂缓冲液优选TRIS缓冲液；PH优选6.0-9.0。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中R2的稳定剂是0.2％-0.5％牛血清白蛋白，5％-20％甘油，1％-5％甘露醇，0.001％-0.01％叠氮钠，0.1-2mM EDTA，0.1％-1％PEG20000。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中所述的NT pro-BNP标准品为添加了NT pro-BNP纯品人血清或其它类似血清基质的液体。优选地，选择添加了NT pro-BNP纯品的人血清的液体。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，利用NT pro-BNP免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)将持测样本与抗NT pro-BNP特异性抗体接触；
2)根据待测样本中NT pro-BNP与抗NT pro-BNP特异性抗体的结合情况；
优选利用自动分析仪测定NADH产生速率，判断样本中NT pro-BNP的含量；
所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液。
本发明的有益之处在于：本发明中通过蛋白质定向连接技术所获得的NT pro-BNP免疫原特异性强、免疫原性高。通过载体蛋白的优选，采用兔白蛋白定向偶联NT pro-BNP小分子，获得抗NT pro-BNP多克隆抗体。所制备出的抗NT pro-BNP特异性抗体特异性强、亲和力高。本发明通过将载体蛋白与NT pro-BNP羧基端和氨基端的定向选择性连接，同时中间加入连接臂，大大提高了NT pro-BNP抗体的特异性识别能力。含有上述抗NT pro-BNP特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的NT pro-BNP含量，本试剂为液体双试剂，可用于检测血清或血浆中NT pro-BNP的浓度，适用于临床全自动生化分析仪。
附图说明
图1：NT pro-BNP免疫原的合成；
图2：抗NT pro-BNP多克隆抗体特异性检测；
图3：NT pro-BNP均相酶免疫反应标准曲线图；
图4：NT pro-BNP均相酶免疫相关性分析图。
具体实施方式
实施例一：NT pro-BNP免疫原的制备
本发明实例采用人工合成的NT pro-BNP的多肽并在其羧基端引入-NH-(CH2)3-S-基团，同兔白蛋白通过Ellman试剂法合成得到免疫原，如图1所示。
1)称取900mg NT pro-BNP衍生物溶解于100ml偶联缓冲液中(0.1M磷酸钠，0.001MEDTA，pH7.2)，加入50mg 5,5-二硫基-双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，将此溶液在室温下搅拌30分钟。
2)称取100mg兔白蛋白溶解于10ml偶联缓冲液中(0.1M磷酸钠，0.001M EDTA，pH7.2)，加入到1)中的溶液中，室温继续搅拌2小时，4度过夜反应。将上述搅拌后的混合溶液经过中性PBS缓冲液透析纯化，得到兔白蛋白-NT pro-BNP免疫原，储存于-70℃。
类似的，当NT pro-BNP衍生物的连接基团为-NH-(CH2)n-S-时，用同样的方法可以制备出如图2所示的NT pro-BNP免疫原。当然，载体仍为具有免疫原性的蛋白质。
本发明仅公开了连接基团为-NH-(CH2)3-S-连接到NT pro-BNP羧基端的免疫原的合成实施例并进行了相关后续实验，连接基团主要起多肽与载体的连接作用，但是不同长度连接臂对NT pro-BNP结构暴露程度不同；免疫原性强弱与所合成的NT pro-BNP衍生物分子结构及所选载体种类有关，并且不同的载体类型对多肽的结构影响也不同，另外使用不同的连接臂制备出的抗原，相应制备的特异性抗体均具有不同的性能。
实施例二：抗NT pro-BNP特异性多克隆抗体的制备
将上述制得的兔白蛋白-NT pro-BNP免疫原采用常规方法免疫新西兰大白兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
用PBS将上述合成的兔白蛋白-NT pro-BNP免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对新西兰大白兔背部皮下多点免疫。
2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述新西兰大白兔免疫一次，之后每隔三周免疫一次，共计免疫4次。
对上述新西兰大白兔取血，分离纯化得到抗NT pro-BNP特异性抗体。
以往的抗NT pro-BNP抗体存在特异性抗差的问题，主要是同proBNP之间存在交叉反应，而获得抗NT pro-BNP的高特异性抗体是制备高质量的NT pro-BNP免疫检测试剂的关键点。本发明对制备的抗NT pro-BNP特异性多抗进行了特异性验证，如图2所示。
结果表明，本发明实例制备的抗NT pro-BNP多克隆抗体特异性的识别NT pro-BNP分子，对pro-BNP交叉反应率很低。
实施例三：NT pro-BNP-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶复合物的制备
本发明实例中，制备NT pro-BNP-G6PDH酶复合物由NT pro-BNP多肽直接同G6PDH酶偶联得到，不同于本发明实施例一中合成NT pro-BNP免疫原所用到的NT pro-BNP衍生物。大量文献及试验数据表明，在制备小分子多克隆抗体时候，会产生一部分抗体是识别载体蛋白与小分子的连接处的，因此这部分抗体能够同小分子免疫原结合，但是却不能识别测定样品中的小分子，因此会大大影响小分子免疫检测试剂的性能，在进行免疫原和酶偶联物的制备时不产生同样的连接臂则可以避免该问题发生。
戊二醛法制备NT pro-BNP-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶复合物
1)称取20mg规格为300KU的G6PDH，室温溶解于5ml含有0.1M MES、3mM MgCl2、100mg NADH、150mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)和0.9％NaCl的溶液中，该溶液pH＝8.0；
2)称取20mg的NT pro-BNP多肽，溶于1mL的PBS；
3)将NT pro-BNP溶液同G6PDH溶液混合；
4)缓慢滴加1％的戊二醛50ul；
5)加入8mL的PBS，并继续搅拌反应2h；
6)纯化产物。
通过透析纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-NT pro-BNP酶复合物，于2-8℃下储存。
实施例四：NT pro-BNP免疫检测试剂的制备
NT pro-BNP均相酶免疫检测试剂，包括：上述抗NT pro-BNP特异性抗体、用于检测抗NT pro-BNP特异性抗体-NT pro-BNP复合物的酶试剂，包括：NT pro-BNP-G6PDH酶复合物和酶的底物。
NT pro-BNP均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免酶试剂中的酶复合物和酶的底物发生反应，酶复合物和酶的底物是分开放置的，不混合，所以将酶的底物与上述抗NTpro-BNP特异性抗体混合在一起。也就是说，NT pro-BNP均相酶免疫检测试剂包括两种分开设置的试剂，具体如下:
试剂R1的制备：20mM NAD，30mM葡萄糖-6-磷酸G6P、100mMpH＝6.0的甘氨酸缓冲液溶解制成均相酶底物；加入0.1％-1％的抗NT pro-BNP特异性多克隆抗体到上述均相酶底物中，在本实施例中具体比例为0.5％；加入0.2％BSA、0.01％Twen 20、0.01％叠氮钠。
试剂R2的制备：0.1M、pH＝9的Tris缓冲液中加入0.01％-1％制备的NT pro-BNP-G6PDH酶复合物，在本实施例中具体比例为0.05％；加入0.2％BSA、2％甘油、1mM EDTA、0.1％PEG20000、叠氮钠0.01％。
上述NT pro-BNP免疫检测试剂的使用方法，包括以下步骤:
1)将持测样本与抗NT pro-BNP特异性抗体接触；
2)根据待测样本中NT pro-BNP与抗NT pro-BNP特异性抗体的结合情况，利用酶试剂判断样本中NT pro-BNP的含量；
具体的，检测时，将待测样本加到试剂R1中，待测样本中的NT pro-BNP与试剂A中的抗NT pro-BNP特异性抗体发生特异性结合，生成抗NT pro-BNP特异性抗体-NT pro-BNP复合物；再加入试剂R2，此时试剂R2中的NT pro-BNP-G6PDH酶复合物与试剂R1中抗NT pro-BNP特异性抗体发生特异性结合，未与抗NT pro-BNP特异性抗体结合的NT pro-BNP-G6PDH酶复合物与底物混合、接触，发生酶促反应，构成检测抗NT pro-BNP特异性抗体-NT pro-BNP复合物的酶试剂，酶试剂根据待测样本中NT pro-BNP上述抗NT pro-BNP特异性抗体的结合情况判断待测样本中NT pro-BNP的含量。
由于NT pro-BNP-G6PDH酶复合物与待测样本中的NT pro-BNP竞争性结合抗NTpro-BNP特异性抗体，所以，待测样本中NT pro-BNP的量越多，均相酶溶液中游离的NT pro-BNP-G6PDH酶复合物的量越多，酶促反应越快，导致OD340上升。
上述待测样本为生理样本，例如血清、血浆、尿液、唾液等。
作为一种优选的方案，上述待测样本为血清或血浆。
实施例五：NT pro-BNP均相酶免疫检验
1、获得标准曲线：设置日立7060全自动生化分析仪反应参数(见表1)。操作过程为：先加试剂R1，再加入标准品，37度孵育5min，最后加入试剂R2。加入试剂R2后，测定不同时间点的OD340吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，得到较理想的反应曲线如图3所示。
表1日立7060全自动生化分析仪反应参数
2、样本的测定、精密度和回收率评估
通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高浓度质控样本10次，本实例中，质控样本为NT pro-BNP标准品溶解在人血清中，浓度至分别为250.0、2000.0、10000ng/L，结果如表2所示。
表2NT pro-BNP均相酶免试剂的分析性能评价
检测结果表明：本发明制备的NT pro-BNP均相酶免试剂精密度高，CV<4％，准确度高，回收率在95％-105％之间。
实施例六：干扰物试验
内源性的pro-BNP、BNP77-108、血红蛋白、未结合胆红素、结合胆红素以及常用药物重组人B型利钠肽(rhBNP)是影响NT pro-BNP准确测定的几种重要干扰物。用本发明中的NTpro-BNP均相酶免试剂测定上述干扰物，结果见表3
表3干扰物试验
检测结果说明上述干扰物的几乎不影响NT proBNP的测定，表明本发明制备的NTpro-BNP均相酶免试剂能够准确测定NT pro-BNP的含量。
实施例七：相关性分析
将本发明的NT pro-BNP均相酶免测定试剂与高效液相色谱法测定人血清中NTpro-BNP方法比较，结果见表4。
表4NT pro-BNP均相酶免测定同高效液相色谱测定结果相关性分析
相关性曲线见图4，可见二者拟合良好。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种测定样品中NT pro-BNP的方法，其特征在于：由试剂R1、试剂R2和NT pro-BNP参考标准品的组成；所述试剂R1中含有抗NT pro-BNP特异性抗体、酶反应底物、稳定剂；所述试剂R2含有酶-NT pro-BNP复合物、稳定剂。
2.根据权利要求1所述的抗NT pro-BNP特异性抗体，由采用Ellman试剂法将NT pro-BNP同兔血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫动物得到。
3.根据权利要求1所述的酶-NT pro-BNP复合物的制备，其特征在于，NT pro-BNP加入MES缓冲液中，再加入氨基活化剂进行氨基活化，活化完成的NT pro-BNP溶液中再加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（EC 1.1.1.49）进行偶联反应，反应完成后脱盐到PB缓冲液中得到酶-NT pro-BNP粗品。
4.根据权利要求1所述的检测NT pro-BNP的试剂盒，
试剂R1：磷酸盐100mM、葡萄糖-6-磷酸 50mM、NAD+ 30mM、BSA 0.5%、抗NT pro-BNP抗体0.1%、PH 8.0；
试剂R2：TRIS 50mM、0.2% 牛血清白蛋白、G6PDH-NT pro-BNP复合物 0.2%、PH9.0。
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