JP7213553B2 - 肺の繊維化を予防及び治療するための方法 - Google Patents
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Description
(i)項1~33のいずれか1項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であって、前記ラベルは、項1~33のいずれか1項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する、製品。
「繊維化」とは、肺、肝臓、腎臓、血管、腹膜、膵臓、皮膚などの組織、器官が炎症、感染、免疫反応、虚血、化学物質、放射線などの様々な原因で持続的な損傷を受けた後、繊維芽細胞が活性化して増殖し、組織器官内繊維結合組織が増加し、実質細胞が減少し、組織、器官構造の破壊と機能喪失に至る病変のことである。この用語と「繊維化病変」とを置き換えて使用することができる。この繊維化病変という用語は、様々な原因による心臓の繊維化、肺の繊維化、肝の繊維化、腎の繊維化、血管の繊維化、皮膚の繊維化などの組織器官の繊維化病変を含み、また、各種の疾患の発生、発展の過程に伴う心臓の繊維化、肺の繊維化、肝の繊維化、腎の繊維化、血管の繊維化、皮膚の繊維化などの組織器官の繊維化病変をも含む。
プラスミンはプラスミノーゲン活性化系(PA系)の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス(ECM)の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む[5]。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ(pro-MMP)を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である[6、7]。プラスミンはプラスミノーゲンが二種類の生理性のPA:組織型プラスミノーゲン活性化剤(tPA)またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤(uPA)をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノーゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはPA系の調節は主にPAの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。PA系成分の合成は異なる要素によって厳密な制御を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとPAsの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα2-抗プラスミン(α2-antiplasmin)である。PAsの活性は、uPAとtPAのプラスミノーゲン活性剤阻害剤-1(PAI-1)に同時に阻害され、uPAを主に阻害するプラスミノーゲン活性剤阻害剤-2(PAI-2)によって調節される。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるuPA特異性細胞表面受容体(uPAR)がある[8、9]。
分数X/Y×100
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、さらには標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成(SPPS)(配列のC末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する)はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のSPPS、例えばFmoc及びBocは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている:Barany及びSolid-Phase Peptide Synthesis;3-284ページ、The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第二巻:Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,tら J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963);Stewartら,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984);及びGanesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10及びCamarero JAら 2005Protein Pept Lett.12:723-8。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング/脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離N末端アミンと単一のN保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいN末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
所望の純度のプラスミノーゲンと選択可能な薬用担体、賦形剤、または安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.ed.(1980))を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む;防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメチレンジアミン;塩化ベンザルコニウム(benzalkonium chloride)、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール;アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル;ピロカテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;m-クレゾール);低分子量ポリペプチド(少なくとも10個の残基を有するもの);タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性重合体、例えばポリゼニールピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである;単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む;キレート剤は例えばEDTAである;糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである;塩形成イオン、例えばナトリウム;金属複合体(例えば亜鉛-タンパク複合体);及び/または非イオン界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(PEG)である。好ましくは凍結乾燥された抗-VEGF抗体配合剤であり、WO 97/04801に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内(例えば頸動脈)、筋肉内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、糖尿病による心血管病およびその関連疾患の治療に用いられる本発明のプラスミンまたはプラスミノーゲンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはプロトコルを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する(例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む)。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン/プラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記糖尿病によって引き起こされる心血管病及びその関連疾患の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びブドウ糖溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
実施例1は、プラスミノーゲンが全身性硬化症モデルマウスの肺の繊維化を減少させることに関するものである。
12週齢のC57オスマウス17匹を取り、ランダムに二つの群に分け、溶媒PBS投与対照群に11匹とプラスミノーゲン投与群に6匹とした。実験開始当日を0日目として体重をはかって群分けし、1日目からモデルを構築して投薬し、二つの群のマウスに0.1mg/0.1mL/匹/日でブレオマイシンを皮下注射して全身性硬化症を誘発させ[26]、当日からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、21日間連続してモデル構築ための投与をした。プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与した。22日目にマウスを殺処分して肺組織を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の肺組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、ブレオマイシンにより誘発された全身性硬化症モデルマウスにおいて、溶媒PBS投与対照群(図1A)のコラーゲン繊維化(矢印に表記される)の程度がプラスミノーゲン投与群(図1B)より高く;プラスミノーゲン投与群マウスの肺部肺胞壁の形態は正常に近く、炎症細胞は明らかに減少し、繊維化程度は溶媒PBS投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である(図1C)ことは観察された。これは、プラスミノーゲンがブレオマイシンにより誘発された全身性硬化症マウスの肺組織の繊維化を効果的に減少させることができることを示している。
実施例2は、プラスミノーゲンがApoEアテローム性動脈硬化マウスの大動脈洞の繊維化を改善することに関するものである。
6週齢のApoEオスマウス13匹に高コレステロール食(南通トロフィー、TP2031)を16週間給餌してアテローム性動脈硬化モデルを誘発した[31,32]。投薬の3日前にモデル化した各マウスから50μLの血液を採取し、総コレステロール(T-CHO)含有量を測定し、T-CHO含有量によってマウスをランダムに二つの群に分け、溶媒PBS投与対照群に7匹とプラスミノーゲン投与群に6匹とした。投薬し始めた日を1日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、投与期間は30日間である。31日目にマウスを殺処分して心臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24~48時間固定を行って、それぞれ15%、30%スクロース中において4℃で終夜沈めさせ、OCTで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは8μmであり、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で40(2A、2B)、200倍(2C、2D)にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図2B、D)の大動脈洞の管壁内膜のコラーゲンの沈着(矢印に表記される)面積は溶媒PBS投与対照群(図2A、C)より明らかに小さいことは示されている。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化モデルマウスの大動脈洞の繊維化レベルを減少させることができることを示している。
実施例3は、プラスミノーゲンが四塩化炭素により誘発された肝臓の繊維化を改善することに関するものである。
9週齢のC57メスマウスを15匹取り、ランダムに三つの群に分け、それぞれブランク対照群と溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群とで、各群5匹ずつである。溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスに1mL/kg体重で経腹腔注射により四塩化炭素を投与し、週に三回で連続的に二週間投与し、肝臓繊維化モデルを構築し[36,37]、ブランク対照群マウスに同じ体積のトウモロコシ油を同じ注射方式により投与した。四塩化炭素をトウモロコシ油で希釈する必要があり、四塩化炭素とトウモロコシ油との希釈割合は1:3である。モデルを構築してから投薬し始め、投薬開始当日を1日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを同じ方法で投与し、ブランク対照群に対して注射処理をしなかった。連続的に14日間投与して15日目にマウスを殺処分し、肝臓を取って4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の肝臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッドで60分間染色した後、流水で流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図3C)のコラーゲンの沈着は溶媒PBS投与対照群(図3B)より明らかに少なく、しかも溶媒PBS投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群のコラーゲン沈着のレベルはブランク対照群マウス(図3A)により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが肝臓のコラーゲン沈着を減少させ、肝臓組織化モデルマウスの肝臓線維化を改善できることを示している。
実施例4は、プラスミノーゲンが16週齢の高脂血症モデルマウスの大動脈洞の繊維化を低下させることに関するものである。
6週齢のオスマウスC5711匹に高脂肪高コレステロール食(南通トロフィー、TP2031)を16週間給餌して高脂血症モデルを誘発し[30,31]、このモデルを16週高脂血症モデルとした。モデル構築後のマウスに高コレステロール食を給餌し続けた。投薬の3日前に各マウスから50μLの血液を採取し、総コレステロール(T-CHO)含有量を測定し、T-CHO含有量によってマウスをランダムに二つの群に分け、溶媒PBS投与対照群に6匹とプラスミノーゲン投与群に5匹とした。投薬し始めた日を1日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、投与期間は30日間である。31日目にマウスを殺処分して心臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24~48時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。大動脈洞の切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で40(4A、4B)、200倍(4C、4D)にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図4B、4D)の大動脈洞の管壁内膜のコラーゲン沈着(矢印に表記される)の面積は溶媒PBS投与対照群(図4A、4C)より明らかに小さいことは示されている。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの大動脈洞の繊維化レベルを低減できることを示している。
実施例5は、プラスミノーゲンが全身性硬化症モデルマウスの皮膚繊維化を減少させることに関するものである。
12週齢のC57オスマウス15匹を取り、ランダムに三つの群に分け、それぞれブランク対照群と溶媒PBS(PBSはリン酸緩衝塩水(Phosphate Buffer Saline)であり、本文ではプラスミノーゲンの溶媒である。)投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつとした。さらに13週齢のPLG活性が損傷したマウス5匹を取った。実験開始当日を0日目として体重をはかって群分けし、次の日からモデルを構築して投薬し、溶媒PBS投与対照群、プラスミノーゲン投与群、及びPLG活性損傷マウスに0.1mg/0.1mL/匹/日でブレオマイシンを皮下注射して全身性硬化症を誘発した[26]。ブランク対照群に0.1mg/0.1mL/匹/日で生理食塩水を皮下注射すると同時に、プラスミノーゲンまたはPBSを投与し、その日を1日目として、21日間連続してモデル構築ための投与をした。プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを投与し、正常マウス群とPLG活性損傷マウスに対して投薬処置をしなかった。22日目にマウスを殺処分して背部皮膚組織を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の皮膚組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で100倍にて観察した。
シリウスレッド染色は、コラーゲンを長期的に染色することができ、病理学的切片の特殊染色法として、シリウスレッド染色はコラーゲン組織を特異的に表示することができる。
その結果、ブレオマイシンにより誘発された全身性硬化症モデルマウスにおいて、溶媒PBS投与対照群(図5B)とPLG活性損傷群マウス(図5D)の真皮上部のコラーゲン繊維束は明らかに増加し、コラーゲン繊維は粗くなり、排列が緻密になり、真皮層は厚くなり;プラスミノーゲン投与群(図5C)の真皮層における繊維芽細胞は溶媒PBS投与対照群より明らかに少なく、しかも皮膚真皮層の厚さは正常レベルに近い(図5A)ことは観察された。これは、プラスミノーゲンがブレオマイシンにより誘発された皮膚繊維化を効果的に低下させることができることを示している。
実施例6は、プラスミノーゲンが全身性硬化症モデルマウスの心臓繊維化を減少させることに関するものである。
12週齢のC57オスマウス10匹を取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつとした。実験開始当日を0日目として体重をはかって群分けし、1日目からモデルを構築して投薬し、0.1mg/0.1mL/匹/日でブレオマイシンを皮下注射して全身性硬化症を誘発させ[26]、当日からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、21日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与した。22日目にマウスを殺処分して心臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の心臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、ブレオマイシンにより誘発された全身性硬化症モデルマウスにおいて、溶媒PBS投与対照群(図6A)の心臓コラーゲン沈着がプラスミノーゲン投与群(図6B)より高いことは観察された。これは、プラスミノーゲンがブレオマイシンにより誘発された心臓繊維化を効果的に減少させることができることを示している。
実施例7は、プラスミノーゲンが全身性硬化症モデルマウスの腎臓繊維化を減少させることに関するものである。
12週齢のC57オスマウス10匹を取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつとした。実験開始当日を0日目として体重をはかって群分けし、1日目からモデルを構築して投薬し、0.1mg/0.1mL/匹/日でブレオマイシンを皮下注射して全身性硬化症を誘発させ、当日からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、21日間連続してモデル構築ための投与をした。プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与した。22日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、ブレオマイシンにより誘発された全身性硬化症モデルマウスにおいて、溶媒PBS投与対照群(図7A)の腎臓コラーゲン繊維化(矢印に表記される)の程度がプラスミノーゲン投与群(図7B)より高いことは示されている。これは、プラスミノーゲンがブレオマイシンにより誘発された腎臓繊維化を効果的に減少させることができることを示している。
実施例8は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの腎臓コラーゲンの沈着を低下させることに関するものである。
24~25週齢のdb/dbオスマウス10匹を取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつとした。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、1日目からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、31日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに2mg/0.2mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを投与した。プラスミノーゲンを31日間投与した後にマウスを殺処分して腎臓組織を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは4μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水洗った。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。10%の健常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングし、時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。IVコラーゲンのウサギ抗マウスポリクローナル抗体(Abcam)に対して4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗った。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒間複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水させてキシレンで透徹にして中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
糖尿病腎症は糖尿病慢性合併症であり、糸球体の硬変および腎間質の繊維化はその典型的な病理的変化である[27]。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図8B)のIVコラーゲン陽性着色が溶媒PBS投与対照群(図8A)より明らかに多いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが腎臓組織のコラーゲン沈着(矢印に表記される)を低下させることができるは示され、プラスミノーゲンが腎臓組織のコラーゲン沈着を低下させることにより糖尿病による腎臓組織の線維化を阻止できることを示唆している。
実施例9は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの腎臓繊維化を改善することに関するものである。
26週齢のdb/dbオスマウス10匹を取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつとした。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、1日目からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、35日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに2mg/0.2mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与した。36日目にマウスを殺処分して腎臓組織を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは4μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから重クロム酸カリウム溶液に終夜置いた。鉄ヘマトキシリンで3~5分間染色して流水で流した。1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水で1秒間処理してから水で洗った。ポンソー酸性マゼンタ溶液にて8分間染色し、水中で素早く濯いだ。1%リンモリブデン酸水溶液で約2分間処理し、アニリンブルー溶液にて6分間複染色した。1%氷酢酸で約1分間濯いだ。無水エタノールで脱水させてキシレンで透徹にしてから封入し、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
マッソン(Masson)染色は組織の線維症を示すことができる。その結果、溶媒PBS投与対照群(図9A)の糸球体メサンギウムが増殖し、メサンギウム基質が増加し、腎間質に軽度な繊維化(矢印に表記される)があり、増殖した繊維化は青色に呈する。プラスミノーゲン投与群(図9B)の糸球体メサンギウム細胞及び基質は対照群より明らかに少なく、腎間質の繊維化は明らかに減少した。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの腎臓繊維化を改善できることを示している。
実施例10は、プラスミノーゲンが24~25週齢の糖尿病マウスの心臓繊維化を改善することに関するものである。
24~25週齢のdb/dbオスマウス10匹を取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつとした。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、1日目からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、31日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに2mg/0.2mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを投与した。プラスミノーゲンを31日間投与した後にマウスを殺処分して心臓組織を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の心臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは4μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから重クロム酸カリウム溶液に終夜置いた。鉄ヘマトキシリンで3~5分間染色して流水で流した。1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水で1秒間処理してから水で洗った。ポンソー酸性マゼンタ溶液にて8分間染色し、水中で素早く濯いだ。1%リンモリブデン酸水溶液で約2分間処理し、アニリンブルー溶液にて6分間複染色した。1%氷酢酸で約1分間濯いだ。無水エタノールで脱水させてキシレンで透徹にしてから封入し、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
糖尿病の最も一般的な合併症は結合組織の過度累積(病理的繊維化)であり、心筋間質の繊維化は糖尿病の心筋病変の特徴性病理的変化であるかもしれない[28-29]。
マッソン(Masson)染色は組織の線維化を示すことができる。その結果、溶媒PBS投与対照群(図10A)の心筋繊維間に青色の増殖したコラーゲン繊維(矢印に表記される)が見えられ、軽度の心筋繊維化が呈されている。プラスミノーゲン投与群(図10B)の心筋繊維間に少量の水色の増殖したコラーゲン繊維が見えられ、対照群と比べ、心筋繊維化は明らかに軽減されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心臓の繊維化を改善することができることを示している。
実施例11は、プラスミノーゲンが17~18週齢の糖尿病マウスの心臓のコラーゲン沈着を減少させることに関するものである。
17~18週齢のdb/dbオスマウス8匹を取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群4匹ずつとした。実験開始当日を0日目として体重をはかって群分けし、1日目からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、35日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに2mg/0.2mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを投与した。プラスミノーゲンを35日間投与した後にマウスを殺処分して心臓組織を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の心臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図11B)マウスのコラーゲン繊維の沈着(矢印に表記される)は溶媒PBS投与対照群(図11A)より明らかに少ないことは示されている。これは、プラスミノーゲンが心臓組織のコラーゲン沈着を減少させることができることを示し、プラスミノーゲンが心臓組織のコラーゲン沈着を減少させることにより、比較的に若い(17~18週齢)糖尿病マウスの心臓組織の線維化を減少させることができることを示唆している。
実施例12は、プラスミノーゲンが26~27週齢の糖尿病マウスの心臓のコラーゲン沈着を減少させることに関するものである。
26~27週齢のdb/dbオスマウス9匹を取り、ランダムに二つの群に分け、溶媒PBS投与対照群に5匹とプラスミノーゲン投与群に4匹とした。実験開始当日を0日目として体重をはかって群分けし、1日目からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、35日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに2mg/0.2mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを投与した。プラスミノーゲンを35日間投与した後にマウスを殺処分して心臓組織を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の心臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッドで60分間染色した後、流水で流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図12B)マウスのコラーゲン繊維の沈着(矢印に表記される)は溶媒PBS投与対照群(図12A)より明らかに少ないことは示されている。これは、プラスミノーゲンが心臓組織のコラーゲン沈着を減少させることができることを示し、プラスミノーゲンが心臓組織のコラーゲン沈着を減少させることにより、比較的に老齢(26~27週齢)糖尿病マウスの心臓組織の線維化を減少させることができることを示唆している。
実施例13は、プラスミノーゲンがシスプラチンによる腎臓繊維化モデルマウスの腎臓繊維化を軽減することに関するものである。
8~9週齢の健康なオスC57マウスを10匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、10mg/Kg体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射して腎臓繊維化モデルを構築した[30]。モデル構築が完了した後にプラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを投与した。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後3時間以内にプラスミノーゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は7日間である。8日目にマウスを殺処分し、腎臓を取って4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは4μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してから一回水洗いした。クエン酸で30分間修復し、室温にて10分間冷却してから水でやさしく洗い流した。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%のヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングし、時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗マウスIVコラーゲン抗体(Abcam)で4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗った。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒間複染色して、流水で5分間流してからTBSで1回洗った。段階的に脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
シスプラチンは臨床上で応用が広く、治療効果が信頼できる広スペクトル抗腫瘍薬であるが、巨大な腎毒性を持ち、主に尿細管および腎間質の損傷として表され、最終的に腎の繊維化に進展する[30]。この実験の結果、溶媒PBS投与対照群(図13A)の腎臓IV型コラーゲンの陽性発現(矢印に表記される)はプラスミノーゲン投与群(図13B)より明らかに高い。これは、プラスミノーゲンがシスプラチンによる腎臓繊維化モデルマウスの腎臓繊維化を改善できることを示している。
実施例14は、プラスミノーゲンがApoEアテローム性動脈硬化マウスの心臓繊維化レベルを改善することに関するものである。
6週齢のApoEオスマウス13匹に高コレステロール食(南通トロフィー、TP2031)を16週間給餌してアテローム性動脈硬化を誘発した[31,32]。投薬の3日前に各マウスから50μLの血液を採取し、総コレステロール濃度を測定し、測定結果によってマウスをランダムに二つの群に分け、溶媒PBS投与対照群に7匹とプラスミノーゲン投与群に6匹とした。投薬し始めた日を1日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、投与期間は30日間である。その期間中にずっと高脂肪高コレステロール食を給餌した。31日目にマウスを殺処分して心臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24~48時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図14B)マウスのコラーゲンの沈着(矢印に表記される)は溶媒PBS投与対照群(図14A)より明らかに少ないことは示されている。これは、プラスミノーゲンがApoEアテローム性動脈硬化モデルマウスの心臓組織のコラーゲン沈着を減少させることにより、アテローム性動脈硬化による心臓の線維化を阻止し、減少させることができることを示唆している。
実施例15は、プラスミノーゲンが高脂血モデルマウスの心臓繊維化を低下させることに関するものである。
6週齢のC57オスマウス11匹に高脂肪高コレステロール食(南通トロフィー、TP2031)を16週間給餌して高脂血を誘発した[33,34]。投薬の3日前に各マウスから50μLの血液を採取し、総コレステロール濃度を測定し、測定結果によってマウスをランダムに二つの群に分け、溶媒PBS投与対照群に6匹とプラスミノーゲン投与群に5匹とした。投薬し始めた日を1日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、投与期間は30日間である。その期間中にずっと高脂肪高コレステロール食を給餌した。31日目にマウスを殺処分して心臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24~48時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図15B)マウスのコラーゲンの沈着(矢印に表記される)は溶媒PBS投与対照群(図15A)より明らかに少ないことは示されている。これは、プラスミノーゲンが高脂血モデルマウスの心臓組織のコラーゲン沈着を減少させることにより、高脂血による心臓の線維化を阻止し、低下させることができることを示唆している。
実施例16は、プラスミノーゲンが慢性腎不全モデルの腎臓繊維化を修復することに関するものである。
8~9週齢のPLG活性が正常であるオスマウス12匹、及びPLG活性が損傷したオスマウス6匹を取り、PLG活性が正常であるマウスをランダムに二つの群に分け、それぞれプラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群で、各群6匹ずつとした。三つの群のマウスに毎日0.25%のプリン飼料(南通トロフィー)を給餌し、慢性腎不全モデルを構築した[35]。モデル構築した当日を1日目として同時に投薬を始めた。プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを同じ方法により投与し、モデル構築投薬を10日間連続し、PLG活性が損傷したマウスは処置しなかった。11日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッドで60分間染色した後、流水で流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図16B)のコラーゲン沈着(矢印に表記される)は溶媒PBS投与対照群(図16A)とPLG活性損傷群(図16C)より明らかに少なく、しかもプラスミノーゲン投与群とPLG活性損傷群のその差が統計学的に有意である(P=0.018)(図16D)ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが慢性腎損傷動物の腎臓組織におけるコラーゲンの沈着を顕著に軽減し、慢性腎損傷による腎臓繊維化を阻止し、軽減することができることを示している。
実施例17は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島のコラーゲン沈着を減少させることに関するものである。
24~25週齢のdb/dbオスマウス16匹を取り、ランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に10匹と溶媒PBS投与対照群に6匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに2mg/0.2mL/匹/日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与した。実験開始当日を0日目として体重をはかって群分けし、1日目からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、31日間連続して投与した。32日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッドで60分間染色した後、流水で流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図17B)マウスの膵島コラーゲンの沈着(矢印に表記される)は溶媒PBS投与対照群(図17A)より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である(図17C)ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵臓組織におけるコラーゲンの沈着を顕著に軽減し、膵臓の損傷と繊維化を阻止し、軽減することができることを示している。
実施例18は、プラスミノーゲンが3%コレステロール高脂血症モデルマウスの腎臓繊維化を低下させることに関するものである。
9週齢のC57オスマウス16匹に3%コレステロール高脂肪食(南通トロフィー)を4週間給餌して高脂血を誘発した[30,31]。このモデルを3%コレステロール高脂血症モデルとし、モデル構築後のマウスに引き続き3%コレステロール高脂肪食を給餌した。また、同じ週齢のオスC57マウス5匹を取ってブランク対照群とし、実験期間中に普通の維持食を給餌した。投薬の3日前に各マウスから50μLの血液を採取し、総コレステロールを測定し、総コレステロール濃度と体重によってモデルマウスをランダムに二つの群に分け、それぞれプラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群で各群8匹ずつとした。投薬し始めた日を1日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、投与期間は30日間である。31日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24~48時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図18C)の腎臓コラーゲン沈着(矢印に表記される)は溶媒PBS投与対照群(図18B)より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である(図18D)。また、プラスミノーゲン投与群の繊維化は基本的に正常レベルに回復した(図18A)。これは、プラスミノーゲンが3%コレステロール高脂血症モデルマウスの腎臓繊維化を効果的に減少させることができることを示している。
実施例19は、プラスミノーゲンが四塩化炭素により誘発された肝臓の繊維化過程における肝臓コラーゲンの沈着を減少させることに関するものである。
7~8週齢のC57メスマウスを20匹取り、ランダムに三つの群に分け、ブランク対照群に5匹、溶媒PBS投与対照群に7匹、及びプラスミノーゲン投与群に8匹とした。溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスに1mL/kg体重で経腹腔注射により四塩化炭素を投与し、週に三回で連続的に四週間投与し、肝臓繊維化モデルを構築し[36,37]、ブランク対照群マウスに同じ体積のトウモロコシ油を経腹腔注射により投与した。四塩化炭素をトウモロコシ油で希釈する必要があり、四塩化炭素とトウモロコシ油との希釈割合は1:3である。モデルを構築した当日から投薬し始め、投薬開始当日を1日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群に同じ体積のPBSを同じ方法で投与し、ブランク対照群に対して注射処理をしなかった。連続的に28日間投与して29日目にマウスを殺処分し、肝臓を取って4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の肝臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水で洗い、0.1%シリウスレッドで60分間染色した後、流水で流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図19C)のコラーゲンの沈着は溶媒PBS投与対照群(図19B)より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である(図19D)。溶媒PBS投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群のコラーゲン沈着(矢印に表記される)のレベルはブランク対照群マウス(図19A)により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが肝臓組織化モデルマウスの肝臓コラーゲンの沈着を減少し、肝臓線維化を改善できることを示している。
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- 有効量の配列2と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンを含む、被験者の肺臓組織の損傷による肺臓繊維化を予防または治療するための薬物組成物。
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