TWI644682B

TWI644682B - 一種纖溶酶原在製備促進胰島細胞損傷修復的藥物上的用途

Info

Publication number: TWI644682B
Application number: TW106120482A
Authority: TW
Inventors: 李季男
Original assignee: 深圳瑞健生命科學硏究院有限公司
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2017-06-19
Publication date: 2018-12-21
Also published as: DK3556383T3; EP3556390A4; JP7554048B2; TW201822800A; TWI763680B; WO2018107703A1; US20190314463A1; EP3556390A1; US20190307861A1; US11129880B2; EP3556384B1; TWI738799B; JP2022166026A; JP7175270B2; CN110139667A; EP3556383B1; JP2020502140A; EP3556384A1; JP2020502150A; TW201822802A

Abstract

本發明涉及一種促進胰島β細胞損傷修復和減少胰島纖維化的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原，同時本發明涉及用於促進胰島β細胞損傷修復和減少胰島纖維化的藥物。

Description

一種纖溶酶原在製備促進胰島細胞損傷修復的藥物上的用途

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種常見的具有遺傳傾向的葡萄糖代謝異常和內分泌障礙性疾病，是由絕對性或相對性胰島素分泌不足所引起。2015年，全世界有4.15億糖尿病患者，預計到2040年，糖尿病患病人數將達到6.42億^[1]。糖尿病是嚴重危害人類健康的重大疾病之一。

糖尿病的主要表現為糖代謝異常以及脂肪、蛋白質等物質的代謝紊亂，而長期的高血糖狀態會導致嚴重的糖尿病併發症，包括微血管併發症、糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病神經系統病變、糖尿病皮膚病變和糖尿病合併感染等。其中糖尿病腎病以及糖尿病神經系統病變對患者生活品質影響巨大，危害嚴重。

臨床上常見的糖尿病可以分為四種類型：1型糖尿病(type 1 diabetes，T1DM)、2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)、妊娠期糖尿病、特殊類型糖尿病。其中，以T1DM和T2DM患者最為多見，妊娠期糖尿病和特殊類型糖尿病患者相對較少。

T1DM被認為與遺傳因素、環境因素(如病毒感染、致糖尿病化學物質、飲食因素)和自身免疫因素相關。研究表明，T1DM相關的基因位點至少有17個，定位在不同的染色體。環境因素方面，對T1DM發病有影響的環境因素包括病毒感染、致糖尿病化學物質及飲食因素，其中病毒因素最為重要。目前已經發現腮腺炎、風疹病毒、巨細胞病毒等與T1DM發病有關。其機制在於病毒可以直接破壞胰島β細胞，並在病毒損傷胰島β細胞後激發自身免疫反應進一步損傷胰島β細胞。致糖尿病的化學物質如四氧嘧啶、鏈脲佐菌素(STZ)、噴他脒等作用於胰島β細胞，導致胰島β細胞的破壞。自身免疫因素包括體液免疫和細胞免疫。體液免疫表現為患者血液迴圈中存在多種抗胰島β細胞的自身抗體。細胞免疫主要表現為在胰島炎症浸潤細胞和胰島β細胞表面可以觀察到HLA-DA抗原的異常表達和IL-2受體與胰島細胞表面HLA-1類抗原的過度表達，而外周血的CD4+/CD8+比例，以及IL-1、TNF-α、INF-γ水準升高。這些因素導致的病理變化集中於胰島β細胞破壞，使得體內胰島素水準絕對降低，引起T1DM，因此T1DM被考慮是一種自身免疫性疾病。

T2DM是一種多基因遺傳性疾病，一般認為它的發生是多源性的，其中環境因素和遺傳因素共同作用導致胰島素抵抗，表現為相同水準濃度的胰島素因為機體的抵抗作用而無法起到正常水準的作用。而機體為了達到正常血糖水準，將會過量分泌胰島素以緩解胰島素使用的“低效”狀態，長此以往對胰島β細胞的要求越來越高，最終導致胰島β細胞“過度工作”而自身損傷，進展為胰島素絕對缺乏。

DM的發病機制

DM發病機制複雜，主要與家族遺傳傾向、種族異質性、胰島素受體缺陷、胰島素受體底物損傷、蛋白酪氨酸磷酸酶相關基因上調、過度免疫炎性反應、脂毒性、氧化應激、及線粒體損傷等相關^[2-3]。

1. 游離脂肪酸

游離脂肪酸水準升高既是胰島素抵抗的發病原因之一，也是胰島素抵抗狀態的重要特徵之一。在遺傳因素或環境因素的作用下，血液中的游離脂肪酸水準升高，當超過脂肪組織的存儲能力就會導致胰島素抵抗的發生。研究顯示，長期的高脂飲食將會導致胰島β細胞發生功能異常，這是因為高脂飲食除了引發外周胰島素抵抗還會使腹腔脂肪含量升高和胰島素抑制脂肪分解能力降低，從而促使游離脂肪酸含量升高，繼而抑制胰島素受體及其底物IRS-1、1RS-2的酪氨酸位點磷酸化，抑制P13K的活性，導致胰島素信號轉導通路受阻形成胰島素抵抗。

2. 炎性反應

1)炎症與胰島素抵抗

T2DM是一種輕度非特異性炎性疾病。近年來的研究顯示，炎症導致胰島素抵抗的主要機制是炎性因數與胰島素受體底物的信號轉匯出現交叉，一方面非特異性炎症產生的炎性因數對IRS/PI3K信號通路出現了阻礙作用，而另一方面炎性因數啟動的一系列激酶會誘導IRS的絲、蘇氨酸位點的磷酸化從而對正常的酪氨酸磷酸化產生阻礙，最終使得胰島素信號轉導能力下降誘發胰島素抵抗^[2-3]。

在靶細胞中，胰島素與其受體結合能啟動受體，之後細胞內的信號轉導通路產生一系列細胞內轉導分子與酶促級聯反應完成信號在胞內的逐級傳遞並放大，信號最後傳至靶器官而產生一系列的生物學效應。信號傳導通路主要有兩條，一個是IRS-1-PI3K-PKB/AKT途徑，另一個是絲裂原活化蛋白激酶(Shc/Raf/MAPK)途徑。在第一條通路中，首先是在外源性胰島素和/或葡萄糖刺激下發生胰島素與其受體結合，從而啟動了受體的內源性酪氨酸激酶。啟動的酪氨酸激酶在實現自身的磷酸化的同時誘導了胰島素受體底物IRS的酪氨酸位點磷酸化。活化的IRS遷移至細胞膜上，通過磷酸酪氨酸結合域(PTB)將磷酸酪氨酸錨定在IRS酪氨酸激酶上，酪氨酸磷酸化的IRS通過其SH2結構域招募到PI3K的調節亞單位P85。P85與磷酸肌醇的3磷酸分子結合，將磷脂醯肌醇一磷酸(PIP)轉化為磷脂醯肌醇二磷酸(PIP2)及磷脂醯肌醇三磷酸(PIP3)，它們是胰島素和其他生長因數的第二信使，是下游信號分子磷酸肌醇依賴的蛋白激酶-1(PDK1)和(或)蛋白激酶c(PKC)的某一亞型的錨定位點。PDK1可以啟動蛋白激酶B(PKB，也稱為Akt)和某一非典型PKC亞型。啟動的PKB一邊通過絲/蘇氨酸磷酸化讓糖原合成激酶-3(GSK3)失活，另一方面啟動哺乳動物的雷帕黴素靶點(mTOR)蛋白激酶，從而誘導其下游70ku-S6激酶(p70S6K)磷酸化啟動。mTOR蛋白激酶可作為“ATP感受器”，啟動p70s6K而不需要通過Ca₂ ⁺/cAMP，實現控制蛋白的合成、加強基因的轉錄、促使胰島β細胞肥大及其他生物效應。PKB可以直接誘導某些轉錄因數絲/蘇氨酸磷酸化促進細胞有絲分裂的發生^[4-5]。在第二條通路中，Ras的啟動可通過兩條通路實現。1)活化的胰島素受體啟動IRS-2蛋白，而IRS-2蛋白可將信號傳遞給適配蛋白生長因數受體結合蛋白2(Grb2)，再與信號蛋白GDP/GTP交換因數(mSOS)相互作用進而能活化失活的Ras-GDP轉變成的Ras-GT從而實現啟動Ras。胰島素受體直接作用使信號蛋白Shc的酪氨酸磷酸化，然後Shc與Grb2結合經mSOS途徑啟動Ras。啟動的Ras-GTP招募Raf絲氨酸激酶，依次使MAPK激酶、MAPK磷酸化。啟動的MAPK可啟動其他蛋白激酶參與誘導基因轉錄、調控細胞凋亡等過程^[6]。

目前已證實IRS-1的絲氨酸殘基可被多種炎症激酶磷酸化，如c-Jun氨基末端激酶(JNK)、IκB激酶β(IκKβ)和蛋白激酶C(PKC)-θ。放射免疫分析法顯示絲氨酸307位點是JNK磷酸化IRS-1的主要位點，它的突變會使JNK誘導的IRS-1磷酸化和TNF對胰島素引起的IRS-1酪氨酸磷酸化的抑制作用消失。JNK通過磷酸化IRS-1的絲氨酸307，減少了胰島素受體底物酪氨酸磷酸化，抑制胰島素信號的轉導^[7]。Hiorsumi等發現飲食型肥胖鼠和ob/ob鼠的肝臟、肌肉、脂肪組織中JNK活性顯著升高。基因敲除(JNK1-/-)能夠使飲食誘型肥胖鼠胰島素抵抗現象減弱，緩解ob/ob鼠的肥胖、高血糖和高胰島素血症。肥胖鼠肝臟組織IRS-1絲氨酸307位點的磷酸化水準比瘦鼠高，可是在基因敲除(JNK1-/-)的肥胖鼠中並未見升高，可見IRS-1的絲氨酸307位點是JNK在體內作用的靶點^[,8]。研究顯示TNFα刺激誘導肝細胞胰島素抵抗的模型中，JNK抑制劑可以完全阻斷絲氨酸307的磷酸化。IκKβ可通過至少兩個途徑影響胰島素信號傳導，可以是直接誘導IRS-1的Ser307位點磷酸化，也可以通過IκB的磷酸化，進而活化NF-κB，通過刺激多種炎症因數的表達間接引發胰島素抵抗。

炎症反應是感染、組織損傷和應激反應後人體免疫系統對抗這些損傷的防禦性反應，同時也是糖尿病、心血管疾病和腫瘤的病因或發病機制。

早在1993年，Hotmamisligil等^[9]通過動物實驗證明，胰島素抵抗的肥胖大鼠其脂肪組織中促炎性細胞因數、TNF-α水準高。從此，眾多研究者開始探討炎症與肥胖、胰島素抵抗之間的關係，並探究其分子發病機制。2006年Hotmamisligil^[10]第一次提出代謝性炎症(metabolic inflammation)這一新的醫學定義，強調這種低度、慢性的全身炎症主要是由多餘的營養物質和代謝物質導致的。代謝性炎症可能存在與典型炎症相類似的分子與信號的傳導通路，與既往我們所認識的典型炎症不同的是，代謝性炎症並不存在紅、腫、熱、痛和功能障礙的症狀。正常情況下，機體內環境處於穩態水準，炎症和代謝各自及相互之間均保持一種動態平衡狀態。當機體發生代謝紊亂時，打破了機體這種平衡狀態，引起免疫系統的失衡，激發炎症信號傳導通路，促使機體釋放一系列炎症因數，某些炎症因數甚至放大自身炎症反應，形成炎症瀑布效應，進一步使機體發生胰島素抵抗，從而導致代謝症候群的發生。

研究證明TNF-α與代謝症候群有密切關係。TNF又叫惡液質素，主要由活化的巨噬細胞、自然殺傷(NK)細胞及T淋巴細胞產生，把由巨噬細胞產生分泌的TNF稱為TNF-α，把由T淋巴細胞產生分泌的淋巴毒素叫做TNF-β。TNF-α的生物學活性占TNF總活性的70%~ 95%，因此目前經常涉及的TNF大多指的是TNF-α。經過多年的研究探討，目前已明確TNF-α與胰島素抵抗、自身免疫性疾病、腫瘤、慢性乙型肝炎等多種疾病有關。在胰島素抵抗的發生發展過程中TNF-α起到至關重要的作用。Swaroop等^[11]通過檢測50例T2DM患者的血清TNF-α水準，得出T2DM患者TNF-α水準升高，並且與BMI、空腹胰島素水準以及穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)顯著相關，提示TNF-α在T2DM發病機制中起重要作用。還有研究指出，TNF-α可以使胰島素受體的磷酸化受到抑制，當胰島素受體的磷酸化受到抑制時可以減少葡萄糖轉運蛋白的基因表達，從而使脂蛋白脂酶的活性降低，最終可以造成脂肪的分解^[12]。

2)炎症與胰島β細胞的凋亡

慢性低度炎症反應與胰島β細胞功能障礙密切相關。β細胞數量減少導致的胰島β細胞功能障礙是T2DM發病的另一重要原因，而β細胞的凋亡又是β細胞數量減少最重要的原因。由於遺傳或飲食的原因，T2DM患者易發生胰島素抵抗，患者血糖升高，高血糖狀態又能促進IL-6產生，IL-6不僅可以減少GLUT4表達，降低脂肪細胞對葡萄糖的轉運，阻礙糖原合成，降低胰島素的敏感性；同時也可以促進胰島細胞分泌IL-6，造成惡性循環。高血糖誘導IL-1β大量產生，通過啟動NF-κB、MAPK、Fas、NO等通路導致胰島細胞凋亡，多種炎症通路相互交叉促進，加劇了胰島細胞的凋亡，最終導致胰島功能的衰竭^[13]。此外，IL-1β還可以介導白細胞間的相互作用，並與其他細胞因數如IFN-γ、TNF-α等相互影響制約，在β細胞損傷過程中起著重要的作用。T2DM的血脂異常會引起激素類物質如瘦素和IL-6水準增加。瘦素可增加IL-1β的釋放來誘導β細胞凋亡，還可負相調控胰島素的分泌^[14]。ROS除導致胰島素抵抗外，對於胰島β細胞的損傷也有作用，氧化應激狀態下，胰島素基因轉錄因數的表達以及胰島素結合位點明顯減少，從而影響胰島素的產生及分泌。其他脂肪細胞因數如TNF-α和瘦也能降低β細胞的功能^[15]。這些細胞因數的聯合作用，對胰島β細胞功能造成更明顯的損傷。此外，部分炎症因數還可作用於胰島素受體底物2的關鍵部位，使其絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，導致胰島素受體底物2的降解加快，促進胰島β細胞的凋亡。

3. 氧化應激

研究表明，氧化應激是引起T2DM的發生及發展的重要因素。氧化應激是指活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)的產生與機體內抗氧化防禦系統的清除之間失衡，導致ROS和RNS產生過多，造成機體組織細胞及蛋白和核酸等生物大分子損傷^[13]。高血糖是產生氧化應激的主要原因，其通過線粒體電子傳遞鏈^[14]、葡萄糖自氧化和多元醇通路等途徑^[15]增加機體內的ROS與RNS含量，其中線粒體電子傳遞鏈是產生ROS的主要途徑。線粒體電子傳遞鏈主要涉及酶複合物I~IV、細胞色素c和輔酶Q，在酶複合物I和III中會持續產生少量的超氧產物，包括超氧陰離子，過氧化氫和羥基自由基，而超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶會將超氧產物催化轉化成氧氣和水。但在肥胖或高血糖條件下，超氧產物會大幅增加，當超氧產物的產生速率超過其移除速率時即會產生氧化應激。

多項研究^[16-18]表明，ROS可直接損傷β細胞，特別是破壞細胞線粒體結構，促進β細胞凋亡；ROS還可通過影響胰島素信號轉導通路間接抑制β細胞功能，如啟動核轉錄因數κB(nuclear transcription factor κB,NF-κB)信號通路，引起β細胞炎症反應；抑制胰十二指腸同源盒因數1(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX-1)的核質易位，抑制線粒體能量代謝，減少胰島素合成與分泌等。氧化應激通過NF-κB通路引起β細胞損傷NF-κB為p50和RelA兩個亞基組成的二聚體，在靜息細胞中，與抑制蛋白IκB結合，以無活性的三聚體形式存在於胞漿中，主要參與細胞對應激、細胞因數、自由基及細菌病毒等刺激的應答及暫態調控基因表達等^[19]。研究表明，高血糖誘導生成的ROS會通過擾亂細胞內信號轉導啟動NF-κB，誘導β細胞損傷^[20]。Mariappan等^[21]用吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)抑制肥胖db/db小鼠體內NF-κB表達，發現氧化應激對小鼠β細胞線粒體的損傷程度明顯減輕；Hofmann等^[22]利用抗氧化藥物α-硫辛酸對糖尿病患者進行治療，發現患者體內NF-κB活性顯著降低，患者病情也有改善；Eldor等^[23]利用轉基因技術特異性地抑制小鼠NF-κB的表達，明顯降低了STZ誘導後小鼠的糖尿病發病率。

NF-κB作為一種多向核轉錄因數，啟動後參與細胞增殖、細胞凋亡及炎症和免疫等多種基因的調節^[24]。在糖尿病機體中，NF-κB通過調控細胞因數和趨化因數的基因表達，如IL-1(interleukin-1)和MCP-1(monocyte/macrophage chemoattractant protein-1)因數等，引起胰島白細胞增多，導致β細胞損傷^[25]。另外NF-κB調控的許多基因產物如腫瘤壞死因數α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等又會進一步啟動NF-κB，加重β細胞損傷^[26]。

Mahadev等^[27]研究顯示，ROS對胰島素信號傳導有調控作用，且這種作用有多面性。在胰島素刺激下，機體會通過Nox(NADPH oxidase)依賴機制快速產生微量的ROS，後者作為第二信使，主要通過氧化作用抑制PTP1B的活性促進胰島素級聯反應^[28]，而用DPI(diphenyleneiodonium)抑制Nox後，胰島素刺激的胰島素受體(insulin receptor,InsR)與胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)磷酸化下降48%^[29]。Loh等^[30]的研究顯示生理性ROS可促進機體對胰島素的敏感性。雖然在生理狀態下，由胰島素刺激產生的微量ROS會促進胰島素的作用，但是長期高血糖會使機體通過線粒體途徑產生大量ROS^[31]，引起胰島素抵抗。

InsR和IRS是胰島素信號傳導通路中重要的信號元件：前者是胰島素信號傳導的起始元件，而IRS是前者與通路下游元件的連接橋樑。大量研究表明，氧化應激可通過多個途徑干擾InsR和IRS的磷酸化反應，阻礙胰島素信號傳導。IKK是NF-κB的抑制亞基IκB的啟動劑，在ROS刺激下IKK可作為InsR和IRS的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化激酶，促使InsR和IRS發生絲氨酸磷酸化，正常的酪氨酸磷酸化受抑制，阻礙胰島素信號傳導^[32]。Brownlee^[33]研究顯示，IKK可直接磷酸化IRS 307位的絲氨酸殘基，導致IRS正常的酪氨酸磷酸化減弱，阻礙InsR與IRS的結合，從而引起胰島素抵抗。

除IKK外，MAPK家族中的多個成員對InsR和IRS也有影響。JNK、細胞外調節蛋白激酶(extracellularregulated protein kinases,ERK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)是MAPK家族成員，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，在受到氧化應激、細胞因數和G-蛋白偶聯受體激動劑等作用下可被啟動。多項研究表明，JNK、ERK和p38 MAPK的啟動會加重InsR和IRS的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化程度，使InsR與IRS之間的蛋白結合能力及IRS活化下游含有SH-2結構域的信號分子的能力降低^[34-36]。

糖尿病高糖狀態所致的氧化應激是多種慢性併發症形成的關鍵原因之一，也是誘發DNA損傷的重要因素^[37]。糖尿病發生時，細胞外液可見持續高糖。在該狀態下，線粒體電子傳遞鏈產生的電子明顯增多，產生過多ROS，造成細胞內環境和脂質、蛋白質和DNA等生物大分子損傷。機體在有氧代謝途徑中產生的活性氧作為一種突變誘導劑，可將DNA鏈上的鳥嘌呤氧化為8-羥基鳥嘌呤(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)。在DNA複製過程中，8-OHdG易與腺嘌呤錯配，導致G：C到T：A顛換突變，形成DNA損傷。此外，ROS還會引起其他形式的DNA損傷，包括DNA鏈斷裂、DNA位點突變、DNA雙鏈畸變和原癌基因與腫瘤抑制基因突變等。同時，DNA損傷也可能加劇ROS及氧化應激過程，如DNA損傷可通過H2AX-還原型輔酶II氧化酶1(Nox1)/Rac1通路誘導ROS產生。ROS進一步促使大量Ca₂ ⁺進入線粒體，引起細胞壞死和凋亡，或直接損傷線粒體，引起線粒體功能障礙，進而損傷胰島β細胞，加劇糖尿病的病理過程^[38]。

ROS除導致胰島素抵抗外，對於胰島β細胞的損傷也有作用，氧化應激狀態下，胰島素基因轉錄因數的表達以及胰島素結合位點明顯減少，從而影響胰島素的產生及分泌。其他脂肪細胞因數如TNF-α也能降低β細胞的功能^[15]。這些細胞因數的聯合作用，對胰島β細胞功能造成更明顯的損傷。此外，部分炎症因數還可作用於胰島素受體底物2的關鍵部位，使其絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，導致胰島素受體底物2的降解加快，促進胰島β細胞的凋亡。

從以上可見，氧化應激在糖尿病發生和發展過程中的作用十分複雜。ROS除直接損傷胰島β細胞外，還可作為信號分子啟動一些應激敏感通路，調節相關因數的表達，引起β細胞凋亡或壞死，抑制胰島素分泌，誘發胰島素抵抗，最終引發或加重糖尿病。

DM的治療

糖尿病通常採用藥物治療，傳統的藥物治療包括胰島素類藥物和口服類降糖藥物。

胰島素早期主要是從豬牛等動物的胰臟中提取而來，在人體應用後會發生明顯的過敏反應。20世紀90年越來越成熟，使得胰島素類似物逐漸應用起來，這種胰島素能明顯改變傳統類胰島素的藥代動力學，有著低血糖發生率低、起效快、作用持久等優勢。目前，隨著胰島素製劑探索的不斷深入，一些口服胰島素製劑已步入試驗階段，但因為技術上的困難，至今尚無有效的口服製劑應用在臨床。

傳統口服類降糖藥物較多，常見的有如下幾種：(1)雙胍類如二甲雙胍。二甲雙胍有良好的心血管保護作用，降糖效果也不錯，目前已有多個國家將其作為一線藥物治療T2DM。(2)磺脲類：磺脲類屬於一種胰島素促泌劑，刺激胰島β細胞，使其分泌出胰島素，達到改善血糖水準的效果。目前，中國允許上市的該類胰島素主要有格列美脲、格列本脲、格列吡嗪、格列齊特、格列喹酮等，不過從一些研究中顯示若長期服用該類藥物可能會造成降糖效果失敗，極易發生低血糖與體質量增加等併發症。(3)噻唑烷二酮(thiazolidinedionecompounds，TZD)類：1999年FDA將羅格列酮與吡格列酮批准用在T2DM中，前者可能加重心臟病風險，為此之後被限制作為二線治療藥物使用，同時禁用於心衰病症。2013年6月FDA對羅格列酮進行重新審核，指出該藥物可繼續用於臨床，甚至放鬆或完全解除此藥及其複方製劑的應用。(4)α-糖苷酶抑制劑：這類胰島素會抑制小腸黏膜上皮細胞的糖苷酶，進而緩解碳水化合物的吸收作用，導致餐後血糖水準降低。此類藥物常用的有伏格列波糖、阿卡波糖及米格列醇等。

現階段治療糖尿病的藥物主要為傳統抗糖尿病藥物，包括磺醯脲類、格列奈類、雙胍類、噻唑烷二酮類(thiazolidinediones，TZD)、α-葡萄糖苷酶抑制劑及胰島素等，這些藥物均存在不同程度的不良反應，如引發低血糖、胃腸道不適、肥胖等。隨著對糖尿病基礎理論研究的深入，為了避免傳統降糖藥物的副作用、對胰島β細胞帶來保護作用，人們也在積極地尋找新的糖尿病治療靶點。目前發現與糖尿病發病機制相關的靶點主要包括胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)、二肽基肽酶-4(dipeptide peptidase-4，DPP-4)、鈉-葡萄糖共轉運蛋白-2(sodium-glucose cotransporter-2，SGLT-2)、糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)、蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphates，PTP)、葡萄糖激酶(glucokinase，GK)等。其中基於調整胰高血糖素的藥物如胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)類似物、GLP-1受體激動劑及二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)抑制劑被認為可有效維持血糖穩態、改善β細胞功能、延緩糖尿病發展，甚至逆轉糖尿病病程。

對於糖尿病目前尚沒有一種有效的藥物或手段能完全治癒，目前的藥物治療集中在通過控制血糖在一定的範圍降低並延緩併發症的發生。隨著對糖尿病發病機制更深入、全面的瞭解，對於糖尿病的治療藥物研究，也從對傳統機制的藥物研究過渡到對具有新靶點和新作用機制的藥物研究，其中有些已上市，如GLP-1受體激動劑、DPP-4抑制劑及SGLT-2抑制劑等，還有一些藥物處在臨床或臨床前研究階段，如GPR119受體激動劑、11β-HSD1抑制劑、PTP1B抑制劑及GK激動劑等，其療效和安全性還有待進一步臨床驗證。儘管近年來新靶點抗糖尿病藥物的出現為DM治療提供了更多的選擇，但由於糖尿病的發病機制複雜，涉及的激素、酶和受體眾多，新藥物研究領域還存在諸如單靶點藥物作用範圍較窄、降糖作用較弱、作用於全身系統引起不良反應等問題均有待於進一步研究。因此，人們需要尋找可作用於糖尿病發病機制諸多方面的、更加有效的治療藥物。

本發明發現纖溶酶原能夠減輕糖尿病實驗小鼠胰腺組織的損傷、控制炎症、減少胰島β細胞凋亡、修復胰腺組織、恢復胰島β細胞的分泌功能、降低血糖，是一種有望成為全面針對糖尿病發病機制諸多方面的全新藥物。

發明簡述

本發明包括下述各項：

1. 一種促進糖尿病受試者胰島細胞損傷修復的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

2. 項1的方法，其中所述纖溶酶原促進胰島素受體底物2(IRS-2)的表達。

3. 項1或2的方法，其中所述纖溶酶原促進細胞因數TNF-α的表達。

4. 項1-3任一項的方法，其中所述纖溶酶原促進受試者多向核轉錄因數NF-κB的表達。

5. 項1-4任一項的方法，其中所述胰島細胞損傷為胰島β細胞合成和分泌胰島素的功能損傷。

6. 項1-5任一項的方法，其中所述胰島細胞損傷為胰島組織結構損傷。

7. 項1-6任一項的方法，其中所述胰島細胞損傷為胰島膠原沉積。

8. 項1-7任一項的方法，其中所述胰島細胞損傷為胰島的纖維化。

9. 項1-8任一項的方法，其中所述胰島細胞損傷為胰島細胞凋亡。

10. 項1-9任一項的方法，其中所述胰島細胞損傷為胰島分泌胰高血糖素和胰島素的平衡紊亂。

11. 項1-10任一項的方法，其中所述胰島細胞損傷為胰島分泌胰高血糖素和胰島素的水準不能與受試者血糖水準相適應。

12. 項1-11任一項的方法，其中所述纖溶酶原使所述糖尿病受試者胰高血糖素分泌減少，胰島素分泌增加。

13. 項12的方法，其中所述胰島胰高血糖素和胰島素分泌的正常平衡得到修復。

14. 一種促進糖尿病受試者胰島炎症修復的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

15. 項14的方法，其中所述纖溶酶原促進細胞因數TNF-α的表達。

16. 項14或15的方法，其中所述纖溶酶原促進受試者多向核轉錄因數NF-κB的表達。

17. 項14-16任一項的方法，其中所述纖溶酶原減少胰島膠原沉積。

18. 項17的方法，其中所述纖溶酶原減輕胰島的纖維化。

19. 項14-18任一項的方法，其中所述纖溶酶原抑制胰島細胞凋亡。

20. 項14-19的方法，其中所述糖尿病患者為T1DM或T2DM。

21. 項20的方法，其中所述T1DM受試者為PLG活性正常或PLG活性受損受試者。

22. 項1-21任一項的方法，其中所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物或治療方法聯用。

23. 項22的方法，其中所述纖溶酶原可與一種或多種選自如下的藥物聯用：抗糖尿病藥物、抗心腦血管疾病藥物、抗血栓藥物、抗高血壓藥物，抗血脂藥物、抗凝藥物、抗感染藥物。

24. 項1-23任一項的方法，其中所述纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。

25. 項1-24任一項的方法，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。

26. 項1-25任一項的方法，所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。

27. 項1-26任一項的方法，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。

28. 項1-27任一項的方法，所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。

29. 項1-27任一項的方法，所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。

30. 項1-29任一項的方法，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。

31. 項1-30任一項的方法，其中所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

32. 項1-31任一項的方法，其中所述受試者是人。

33. 項1-32任一項的方法，其中所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。

34. 項1-33任一項的方法，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。

35. 一種用於項1-34任一項的方法的纖溶酶原。

36. 一種藥物組合物，其包含藥學上可接受的載劑和用於項1-34中任一項所述方法的纖溶酶原。

37. 一種預防性或治療性試劑盒，其包含：(i)用於項1-34中任一項所述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)。

38. 根據項37所述的試劑盒，其中所述構件為注射器或小瓶。

39. 項37或38的試劑盒，其還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施項1-29中任一項所述方法。

40. 一種製品，其包含：含有標籤的容器；和包含(i)用於項1-34中任一項所述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施項1-34中任一項所述方法。

41. 項37-39中任一項的試劑盒或項40的製品，還包含另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其他藥物。

42. 項41的試劑盒或製品，其中所述其他藥物選自下組：抗糖尿病藥物、抗心腦血管疾病藥物、抗血栓藥物、抗高血壓藥物，抗血脂藥物、抗凝藥物、抗感染藥物。

一方面，本發明涉及一種預防和治療糖尿病的方法，包括給藥受試者有效量的纖維蛋白溶酶原或纖溶酶。

另一方面，本發明涉及一種降低糖尿病受試者血糖的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於降低糖尿病受試者血糖的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備降低糖尿病受試者血糖的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於降低糖尿病受試者血糖的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述血糖選自如下的一項或多項：血清葡萄糖水平、血清果糖胺水準、血清糖化血紅蛋白水準。在另一些實施方案中，所述血糖為血清葡萄糖水平。在上述實施方案中，所述糖尿病為T1DM或T2DM。

另一方面，本發明涉及一種提高糖尿病受試者糖耐量的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於提高糖尿病受試者糖耐量的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備提高糖尿病受試者糖耐量的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於提高糖尿病受試者糖耐量的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述糖尿病為T2DM。

一方面，本發明涉及一種促進糖尿病受試者餐後血糖下降的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於促進糖尿病受試者餐後血糖下降的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備促進糖尿病受試者餐後血糖下降的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於促進糖尿病受試者餐後血糖下降的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原在受試者餐前30分鐘至1.5小時給予。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原在受試者餐前30分鐘至1小時給予。

一方面，本發明涉及一種促進糖尿病受試者對葡萄糖的利用的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於促進糖尿病受試者對葡萄糖的利用的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備促進糖尿病受試者對葡萄糖的利用的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於促進糖尿病受試者對葡萄糖的利用的纖溶酶原。另一方面，本發明涉及一種促進糖尿病受試者胰島素分泌的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原還促進糖尿病受試者胰島素的表達。在上述實施方案中，所述糖尿病為T1DM或T2DM。在一些實施方案中，所述纖溶酶原促進糖尿病受試者進食後的胰島素分泌。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原促進糖尿病受試者禁食狀態下的胰島素分泌。在一些實施方案中，所述纖溶酶原促進糖尿病受試者應答血糖升高刺激的胰島素分泌，使血糖回復到正常或接近正常水準。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原在促進所述胰島素表達和/或分泌的同時，降低受試者胰高血糖素的表達和/或分泌，具體地，所述纖溶酶原通過促進所述胰島素表達和/或分泌的同時，降低受試者胰高血糖素的表達和/或分泌，實現使受試者血糖回復到正常或接近正常水準。

一方面，本發明涉及一種降低糖尿病受試者胰高血糖素分泌的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於降低糖尿病受試者胰高血糖素分泌的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備降低糖尿病受試者胰高血糖素分泌的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於降低糖尿病受試者胰高血糖素分泌的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原還降低糖尿病受試者胰高血糖素的表達。在上述實施方案中，所述糖尿病為T1DM或T2DM。在一些實施方案中，所述纖溶酶原降低糖尿病受試者進食後的胰高血糖素分泌。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原降低糖尿病受試者禁食狀態下的胰高血糖素分泌。在一些實施方案中，所述纖溶酶原在糖尿病受試者血糖升高狀態下降低胰高血糖素的分泌，使血糖回復到正常或接近正常水準。在一些實施方案中，所述纖溶酶原在糖尿病受試者血糖升高狀態下降低胰高血糖素的分泌，使血糖回復到正常或接近正常水準。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原在降低受試者胰高血糖素的表達和/或分泌的同時，促進所述胰島素表達和/或分泌，具體地，所述纖溶酶原通過降低受試者胰高血糖素的表達和/或分泌的同時，促進所述胰島素表達和/或分泌，實現使受試者血糖回復到正常或接近正常水準。在上述實施方案中，所述纖溶酶原促進胰島素受體底物2(IRS-2)的表達。

一方面，本發明涉及一種促進糖尿病受試者胰島細胞損傷修復的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於促進糖尿病受試者胰島細胞損傷修復的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備促進糖尿病受試者胰島細胞損傷修復的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於促進糖尿病受試者胰島細胞損傷修復的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原促進胰島素受體底物2(IRS-2)的表達。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原促進細胞因數TNF-α的表達。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原促進受試者多向核轉錄因數NF-κB的表達。在一些實施方案中，所述胰島細胞損傷為選自下述的一種或多種：胰島β細胞合成和分泌胰島素的功能損傷、胰島組織結構損傷、胰島膠原沉積、胰島的纖維化、胰島細胞凋亡和胰島分泌胰高血糖素、胰島素的平衡紊亂、胰島分泌胰高血糖素和胰島素的水準不能與受試者血糖水準相適應。在一些實施方案中，所述纖溶酶原使所述糖尿病受試者胰高血糖素分泌減少，胰島素分泌增加，具體地，所述胰島胰高血糖素和胰島素分泌的正常平衡得到修復。

另一方面，本發明涉及一種保護受試者胰島的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於保護受試者胰島的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備保護受試者胰島的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於保護受試者胰島的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原減少胰島膠原沉積。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原減輕胰島的纖維化。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原減輕胰島細胞凋亡。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原促進胰島胰島素受體底物2(IRS-2)的表達。在一些實施方案中，所述纖溶酶原促進胰島炎症的修復。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原促進細胞因數TNF-α的表達。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原促進受試者多向核轉錄因數NF-κB的表達。在上述實施方案中，所述受試者為糖尿病患者，具體地，所述糖尿病患者為T1DM或T2DM。在一些實施方案中，所述T1DM受試者為PLG活性正常或PLG活性受損受試者。

另一方面，本發明涉及一種促進糖尿病受試者胰島炎症修復的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於促進糖尿病受試者胰島炎症修復的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備促進糖尿病受試者胰島炎症修復的藥物的用途。此外，本發明還涉及促進糖尿病受試者胰島炎症修復的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原促進細胞因數TNF-α的表達。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原促進受試者多向核轉錄因數NF-κB的表達。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原減少胰島膠原沉積。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原減輕胰島的纖維化。在另一些實施方案中，所述纖溶酶原抑制胰島細胞凋亡。在上述實施方案中，所述糖尿病患者為T1DM或T2DM，具體地，所述T1DM受試者為PLG活性正常或PLG活性受損受試者。

一方面，本發明涉及一種促進糖尿病受試者細胞因數TNF-α表達的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於促進糖尿病受試者細胞因數TNF-α表達的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備促進糖尿病受試者細胞因數TNF-α表達的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於促進糖尿病受試者細胞因數TNF-α表達的纖溶酶原。

另一方面，本發明涉及促進糖尿病受試者多向核轉錄因數NF-κB表達的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於促進糖尿病受試者多向核轉錄因數NF-κB表達的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備促進糖尿病受試者多向核轉錄因數NF-κB表達的藥物的用途。

另一方面，本發明涉及一種促進胰島胰島素受體底物2(IRS-2)表達的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於促進胰島胰島素受體底物2(IRS-2)表達的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備促進胰島胰島素受體底物2(IRS-2)表達的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於促進胰島胰島素受體底物2(IRS-2)表達的纖溶酶原。

另一方面，本發明涉及一種促進糖尿病受試者胰島素分泌的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原促進胰島素受體底物2(IRS-2)的表達。本發明還涉及纖溶酶原用於促進糖尿病受試者胰島素分泌的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備促進糖尿病受試者胰島素分泌的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於促進糖尿病受試者胰島素分泌的纖溶酶原。

另一方面，本發明涉及一種促進糖尿病受試者胰島β細胞數量增加的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於促進糖尿病受試者胰島β細胞數量增加的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備促進糖尿病受試者胰島β細胞數量增加的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於促進糖尿病受試者胰島β細胞數量增加的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原促進胰島素受體底物2(IRS-2)表達。

另一方面，本發明涉及一種減少胰島β細胞凋亡的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於減少胰島β細胞凋亡的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備減少胰島β細胞凋亡的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於減少胰島β細胞凋亡的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原促進胰島素受體底物2(IRS-2)表達。

另一方面，本發明涉及一種促進胰島β細胞損傷修復的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於促進胰島β細胞損傷修復的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備促進胰島β細胞損傷修復的藥物的用途。本發明還涉及用於促進胰島β細胞損傷修復的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原促進胰島素受體底物2(IRS-2)表達。

另一方面，本發明涉及一種促進胰島β細胞功能恢復的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於促進胰島β細胞功能恢復的用途。本發明還涉及纖溶酶原用於製備促進胰島β細胞功能恢復的藥物的用途。此外，本發明還涉及用於促進胰島β細胞功能恢復的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原促進胰島素受體底物2(IRS-2)表達。

在上述實施方案中，所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物或治療方法聯用。具體地，所述纖溶酶原可與一種或多種選自如下的藥物聯用：抗糖尿病藥物、抗心腦血管疾病藥物、抗血栓藥物、抗高血壓藥物，抗血脂藥物、抗凝藥物、抗感染藥物。

在上述實施方案中，所述纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。

在上述實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。

在上述實施方案中，所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。具體地，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。

在上述實施方案中，纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。例如，來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、馬，狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最優選，本發明的纖維蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在上述實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，其中所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。具體地，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。

在一個實施方案中，所述纖維蛋白溶酶原通過全身或局部給藥，優選通過以下途徑施用：表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內、局部注射、關節內注射或通過直腸。在一個實施方案中，所述局部給藥為直接向骨質疏鬆區域給藥，例如通過敷料，導管等方式來進行。

在一個實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800 mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，優選至少重複一次，優選至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。一方面，本發明涉及一種藥物組合物，其包含藥學上可接受的載劑和用於本發明所述方法的纖溶酶原。

另一方面，本發明涉及一種預防性或治療性試劑盒，其包含：(i)用於本發明所述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)，具體地，所述構件為注射器或小瓶。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施本發明所述的方法。

另一方面，本發明還涉及一種製品，其包含：含有標籤的容器；和(i)用於本發明所述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施本發明所述方法。

在上述實施方案中，所述試劑盒或製品還包含另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其他藥物。在一些實施方案中，所述其他藥物選自下組：抗糖尿病藥物、抗心腦血管疾病藥物、抗血栓藥物、抗高血壓藥物，抗血脂藥物、抗凝藥物、抗感染藥物。

發明詳述

“糖尿病”是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因數作用於機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂症候群，臨床上以高血糖為主要特點。

“糖尿病併發症”是由糖尿病過程中血糖控制不良導致的身體其他器官或組織的損害或功能障礙，其中包括肝臟、腎臟、心臟、視網膜、神經系統的損害或功能障礙等。據世界衛生組織統計，糖尿病併發症高達100多種，是目前已知併發症最多的一種疾病。

“胰島素抵抗”是指各種原因使胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降，機體代償性的分泌過多胰島素產生高胰島素血症，以維持血糖的穩定。

“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，其能夠降解纖維蛋白多聚體。

“纖溶酶原(plasminogen，plg)”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源plasminogen氨基酸序列(序列4)計算由810個氨基酸組成，分子量約為90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中迴圈的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的PLG包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI資料，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成(不含有19個氨基酸的信號肽)，編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。δ-plasminogen(δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域^[39,40]，有文獻報導了δ-plasminogen的氨基酸序列(序列8)^[40]，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7。Mini-plasminogen由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791(以不含有信號肽的Glu-plg序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[41]，其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而Micro-plasminogen僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791(以不含有信號肽的Glu-plg序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[42]，也有專利CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791(以不含有信號肽的Glu-plg序列的Glu殘基為起始氨基酸)，本專利序列參考專利CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖維蛋白溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

在本申請中，所述纖溶酶原“缺乏”的含義為受試者體內纖溶酶原的含量或活性比正常人低，低至足以影響所述受試者的正常生理功能；所述纖溶酶原“缺失”的含義為受試者體內纖溶酶原的含量或活性顯著低於正常人，甚至活性或表達極微，只有通過外源提供才能維持正常生理功能。

本領域技術人員可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。

在本發明的實施方案中，“衰老”和“早衰”可以互換使用，表示同樣的含義。

在迴圈過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在PLG啟動劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變為呈開放性構象的活性PLM。具有活性的PLM可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中PLG的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。已知多種能夠作為PLG啟動劑的酶，包括：組織纖溶酶原啟動劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原啟動劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因數XII(哈格曼因數)等。

“纖溶酶原活性片段”是指在纖溶酶原蛋白中，能夠與底物中的靶序列結合並發揮蛋白水解功能的活性片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。本發明所述的纖溶酶原活性片段為包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域的蛋白質，優選，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列的蛋白質。因此，本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。

目前，對於血液中纖維蛋白溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖維蛋白溶酶原啟動劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg)、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法為發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖維蛋白溶酶原活性成正比。此外也可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖維蛋白溶酶原活性進行測定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性(如酸性，鹼性，疏水性，等)的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是眾所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN演算法的70%至99%的相似度(同一性)。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA演算法確定具有 60%以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達75%以上更好，最好能達85%以上，甚至達90%以上為最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99%(按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原也包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。

關於參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分數(%)”定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公眾可得到的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員能決定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何演算法。然而，為了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生的。

在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算：分數X/Y乘100

其中X是由序列比對程式ALIGN-2在該程式的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情況下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得的。

如本文中使用的，術語“治療”和“預防”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀，和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀，並且包括：(a)預防疾病在受試者體內發生，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷為具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退。

術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠，小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。“治療有效量”會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

2. 本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，也可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支援物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284頁於The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield，等J.Am.Chem.Soc.,85：2149-2156(1963)；Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006 Mini Rev.Med Chem.6：3-10和Camarero JA等2005 Protein Pept Lett.12：723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複迴圈後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生產本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子(例如天然關聯的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水準表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於複製主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統，色氨酸(trp)啟動子系統，beta-內醯胺酶啟動子系統，或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情況中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啟動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母也可用於表達。酵母(例如釀酒酵母 (S.cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。

在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)也可以用於表達本發明的纖溶酶原。參見Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啟動子和增強子(Queen等，Immnol.Rev.89：49(1986))，以及必需的加工資訊位元點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱，親和柱，柱層析，高效液相層析(HPLC)，凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除主題抗體以外的大分子，等等。

3. 藥物配製劑

可以通過將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。優選凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作為參考。

本發明的配製劑也可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，優選活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗高血壓的藥物，抗心律失常的藥物，治療糖尿病的藥物等。

本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或介面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15：167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

4. 給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過靜脈內，腹膜內，皮下，顱內，鞘內，動脈內(例如經由頸動脈)，肌內，鼻內，表面或皮內施用或脊髓或腦投遞來實現本發明藥物組合物的施用。氣溶膠製劑如鼻噴霧製劑包含活性劑的純化的水性或其它溶液及防腐劑和等滲劑。將此類製劑調節至與鼻粘膜相容的pH和等滲狀態。

在一些情況中，可以以下方式修飾或配製本發明的纖溶酶原藥物組合物，從而提供其穿過血腦屏障的能力。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

在一些實施方案中，本發明的纖溶酶原與促進穿過血腦屏障的藥劑配製在一起。在一些情況中，本發明的纖溶酶原直接或經接頭與促進穿過血腦屏障的載體分子、肽或蛋白質融合。在一些實施方案中，本發明的纖溶酶原與結合內源血腦屏障(BBB)受體的多肽融合。連接纖溶酶原與結合內源BBB受體的多肽，促進穿過BBB。結合內源BBB受體的合適的多肽包括抗體，例如單複製抗體，或其抗原結合片段，其特異性結合內源BBB受體。合適的內源BBB受體包括但不限於胰島素受在一些情況中，抗體是囊封於脂質體中的。參見例如美國專利公開文本No.2009/0156498。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取決於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以例如為例如每天約0.0001至2000mg/kg，或約0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或50mg/kg體重或在1-50mg/kg的範圍，或至少1mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量也涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量也包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要即時評估、定期評估血栓和血栓相關疾病的治療效果和安全性。

5. 治療效力和治療安全性

本發明的一個實施方案涉及使用纖溶酶原治療受試者後，對治療效力和治療安全性的判斷。常用的骨質疏鬆症治療效果監測與評估內容包括隨訪(不良反應、規範服藥、基礎措施以及骨折風險因數再評估等)，新發骨折評估(臨床骨折、身高降低和影像學檢查)、骨密度(bone mineral density，BMD)測量和骨轉換生化標誌物(bone turnover markers，BTM)檢測，以及基於這些資料的綜合再評估等。其中BMD是目前應用最廣泛的療效監測和評估方法。例如，可以通過雙能X線骨密度儀(dual energy X-ray absorptiometry，DXA)、定量CT(quantitative computed tomography，QCT)、單光子吸收測定法(SPA)、或超聲波測定法來測量BMD。治療開始後可每年檢測1次BMD，在BMD達到穩定後可以適當延長間隔，例如2年監測1次。針對BTM，目前在血清學指標中較多使用的骨形成指標是血清1型原膠原N端前肽(procollagen type 1 n-terminal propeptide，PINP)，骨吸收指標是血清1型原膠原C末端肽(serum C-terminal telopeptide，S-CTX)。可根據研究進展，適時調整更合理的檢測指標。應在開始治療前檢測基線值，應用促形成藥物治療後3個月、應用抑制吸收藥物治療後3~6個月時進行檢測。BTM能夠提供骨骼的動態資訊，在作用和功能上獨立於BMD，同時也與BMD成為互為補充的監測手段，二者結合起來具有更高的臨床價值。一般地，如果治療後BMD上升或穩定，BTM有預期變化，同時治療期間無骨折發生，可認為治療反應良好。此外，本發明還涉及使用纖溶酶原及其變體對受試者進行治療過程中和治療後，所述該治療方案安全性的判斷，包括但不限於對藥物在受試者體內的血清半衰期、治療半衰期、半數中毒量(TD50)、半數致死量(LD50)進行統計，或對在治療過程中或治療後發生的各種不良事件如致敏反應進行觀察。

6. 製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含本發明纖溶酶原。所述製品優選包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖溶酶原。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述衰老或衰老相關病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

圖1 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰臟的HE染色圖片及胰島面積比。A、B為給溶媒PBS對照組，C、D為給纖溶酶原組，E為胰島面積定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組大部分的胰島發生萎縮，萎縮的胰島細胞被腺泡(↓標示)所代替，胰島邊緣的腺泡增生，致胰島與腺泡之間分界不清；給纖溶酶原組大部分的胰島較之於對照組面積大，且胰島內未有腺泡增生，只有少數的胰島內殘存有少量的腺泡，胰島與腺泡之間邊界清晰。比較給纖溶酶原組和對照組的胰島占胰腺的面積比發現，給藥組比對照組大近乎一倍。說明纖溶酶原能促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島損傷的修復，從而通過修復損傷的胰島治療糖尿病。

圖2 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島天狼星紅染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠胰島膠原沉積(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能改善糖尿病動物胰島的纖維化。

圖3 18周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島胰島素免疫組化染色結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異接近顯著(P=0.15)。說明纖溶酶原能夠促進胰島功能修復，促進胰島素的產生和分泌。

圖4 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島的胰島素免疫組化染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能促進胰島功能修復，促進胰島素的產生和分泌。

圖5 26周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島的胰島素免疫組化染色結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異極顯著(**表示P<0.01)。說明纖溶酶原能有效促進胰島功能修復，促進胰島素的產生和分泌。

圖6 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰腺組織NF-κB免疫組化染色觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因數NF-κB的表達，從而促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島炎症的修復。

圖7 18周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島胰高血糖素免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，胰高血糖素在正常對照小鼠中表達在胰島周邊α細胞區域。與給纖溶酶原組相比，給溶媒PBS對照組胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，胰高血糖素陽性細胞浸潤到胰島的中央區域，且平均光密度定量分析結果統計差異極顯著(**表示P<0.01)；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組與PBS組相比，胰島形態更接近正常小鼠。說明纖溶酶原能夠顯著抑制胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，從而促進胰島損傷的修復。

圖8 24-25周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島胰高血糖素免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，胰高血糖素在正常對照小鼠中表達在胰島周邊α細胞區域。與給纖溶酶原組相比，給溶媒PBS對照組胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，陽性細胞浸潤到胰島的中央區域；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組與PBS組相比，胰島形態更接近正常小鼠。說明纖溶酶原能夠顯著抑制胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，從而促進胰島損傷的修復。

圖9 26周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島胰高血糖素免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，胰高血糖素在正常對照小鼠中表達在胰島周邊α細胞區域。與給纖溶酶原組相比，給溶媒PBS對照組胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，陽性細胞浸潤到胰島的中央區域，且平均光密度定量分析結果具有統計學差異(*表示P<0.05)；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組與PBS組相比，其形態更接近正常小鼠。說明纖溶酶原能夠顯著抑制胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，從而促進胰島損傷的修復。

圖10 給予纖溶酶原28天後PLG活性正常小鼠在T1DM模型中胰島胰高血糖素免疫組化觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組胰高血糖素陽性表達明顯多於給溶纖溶酶原組，且平均光密度定量分析結果統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能夠顯著減少糖尿病小鼠胰島α細胞分泌胰高血糖素，促進胰島損傷的修復。

圖11 18周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島IRS-2免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組，且統計差異極顯著(**表示P<0.01)；給纖溶酶原組IRS-2表達水準較給溶媒PBS組更接近正常對照組小鼠。說明纖溶酶原能有效增加胰島細胞IRS-2的表達，改善胰島素信號轉導，減少糖尿病小鼠胰島β細胞損傷。

圖12 24-25周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島IRS-2免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)；給纖溶酶原組IRS-2表達水準較給溶媒PBS組更接近正常對照組小鼠。說明纖溶酶原能有效增加胰島細胞IRS-2的表達，改善胰島素信號轉導，減少糖尿病小鼠胰島β細胞損傷。

圖13 26周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島IRS-2免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組；給纖溶酶原組IRS-2表達水準較給溶媒PBS組更接近正常對照組小鼠。說明纖溶酶原能有效增加胰島細胞IRS-2的表達，改善胰島素信號轉導，減少糖尿病小鼠胰島β細胞損傷。

圖14給予纖溶酶原28天後PLG活性正常T1DM小鼠胰島IRS-2免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組；給纖溶酶原組IRS-2表達水準較給溶媒PBS組更接近正常對照組小鼠。說明纖溶酶原能有效增加胰島細胞IRS-2的表達，改善胰島素信號轉導，減少PLG活性正常T1DM小鼠胰島β細胞損傷。

圖15 26周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島中性粒細胞免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組陽性表達細胞(箭頭標識)少於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組。說明纖溶酶原能減少中性粒細胞的浸潤。

圖16 T1DM模型中PLG活性受損小鼠給予纖溶酶原28天後胰島中性粒細胞免疫組化觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組陽性表達細胞(箭頭標識)少於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組。說明纖溶酶原纖溶酶原能減少PLG活性受損小鼠在T1DM模型中胰島中性粒細胞的浸潤。

圖17 PLG活性正常小鼠在T1DM模型中給予纖溶酶原28天後胰島中性粒細胞免疫組化觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組陽性表達細胞(箭頭標識)少於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組。說明纖溶酶原能促進PLG活性正常小鼠在T1DM模型中胰島中性粒細胞的浸潤。

圖18 PLG活性受損小鼠在T1DM模型中給予纖溶酶原28天後胰島NF-κB免疫組化觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能促進炎症修復因數NF-κB的表達，從而促進胰島炎症的修復。

圖19 18周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島NF-κB免疫組化觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。實驗結果顯示，給纖溶酶原組NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因數NF-κB的表達，從而促進相對年輕(18周齡)糖尿病小鼠胰島炎症的修復。

圖20 26周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島NF-κB免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。本發明實驗結果顯示，給纖溶酶原組NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因數NF-κB的表達，從而促進相對年老(26周齡)糖尿病小鼠胰島炎症的修復。

圖21 24-25周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島TNF-α免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。研究結果顯示，給纖溶酶原組TNF-α的陽性表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組。說明纖溶酶原能促進TNF-α的表達，從而促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島損傷修復。

圖22 26周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島TNF-α免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。研究結果顯示，給纖溶酶原組TNF-α的陽性表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組。說明纖溶酶原能促進TNF-α的表達，從而促進26周齡糖尿病小鼠胰島損傷修復。

圖23 顯示PLG活性受損小鼠T1DM模型中給予纖溶酶原28天後胰島TNF-α免疫組化觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。研究結果顯示，給纖溶酶原組TNF-α的陽性表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能促進TNF-α的表達，從而促進PLG活性受損小鼠T1DM模型中胰島損傷修復。

圖24 顯示PLG活性受損T1DM模型小鼠給予纖溶酶原28天後胰島IgM免疫組化觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。本實驗研究結果顯示，給纖溶酶原組IgM的陽性表達(箭頭標識)明顯低於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組。說明纖溶酶原能降低IgM的表達，從而減少PLG活性受損小鼠在T1DM模型中胰島損傷。

圖25 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原10、31天後血糖檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠的血糖明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。此外，隨著給藥時間的延長，給溶媒PBS對照組小鼠血糖有升高趨勢，而給纖溶酶原組血糖逐漸降低。說明纖溶酶原具有降血糖的作用。

圖26 給予纖溶酶原對糖尿病鼠血清果糖胺濃度的影響。檢測結果顯示，給予纖溶酶原後血清果糖胺的濃度明顯降低，與給藥前相比，統計差異極顯著(**表示P<0.01)。說明纖溶酶原能顯著降低糖尿病小鼠的血糖。

圖27 26周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後血漿糖化血紅蛋白檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠糖化血紅蛋白的OD值明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異極顯著(**表示P<0.01)。說明纖溶酶原具有降低糖尿病小鼠血糖的作用。

圖28 26周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原10天後IPGTT檢測結果。結果顯示，腹腔注射葡萄糖後，給纖溶酶原組小鼠血糖水準低於給溶媒PBS對照組，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組糖耐受曲線更加接近正常小鼠組。說明纖溶酶原能明顯改善糖尿病小鼠糖耐受能力。

圖29 T1DM模型PLG活性正常小鼠給予纖溶酶原10天後禁食後血糖檢測結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠血糖明顯高於給纖溶酶原組，且統計差異極顯著(***表示P<0.001)。說明纖溶酶原能顯著降低PLG活性正常小鼠在T1DM模型中的血糖水準。

圖30 T1DM模型PLG活性正常小鼠給予纖溶酶原28天後IPGTT檢測結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠注射葡萄糖後血糖濃度明顯高於給纖溶酶原組，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組糖耐受曲線更加接近正常小鼠。說明纖溶酶原能提高SPLG活性正常小鼠在T1DM模型中的糖耐受能力。

圖31 26周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後血清胰島素檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組血清胰島素水準明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能有效促進胰島素的分泌。

圖32 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島Caspase-3免疫組化染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組Caspase-3的表達(箭頭標識)明顯低於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能減少胰島細胞的凋亡，保護糖尿病小鼠胰臟組織。

圖33 T1DM模型中PLG活性受損小鼠給予纖溶酶原28天後胰島胰島素免疫組化觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組胰島素陽性表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組。說明纖溶酶原能促進在T1DM模型中的PLG活性受損小鼠胰島素的合成與分泌。

圖34 PLG活性正常小鼠在T1DM模型中給予纖溶酶原28天後胰島胰島素免疫組化觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組胰島素陽性表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組。說明纖溶酶原促進T1DM模型中PLG活性正常小鼠胰島素的合成與表達。

圖35 24-25周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島TUNEL染色觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。本實驗結果顯示，給纖溶酶原組的陽性細胞數(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組。正常對照組TUNEL陽性染色極低。正常對照組凋亡率約為8%，給溶媒PBS組凋亡率約為93%，給纖溶酶原組凋亡率為約16%。說明纖溶酶原組能顯著減少糖尿病小鼠胰島細胞的凋亡。

圖36 26周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後血清果糖胺檢測結果。檢測結果顯示，給纖溶酶原組血清果糖胺的濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，統計差異接近顯著(P=0.06)。說明纖溶酶原能顯著降低糖尿病小鼠的血糖水準。

圖37 顯示T1DM模型小鼠給予纖溶酶原20天後血糖檢測結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠血糖明顯高於給纖溶酶原組小鼠，且統計差異顯著(P=0.04)。說明纖溶酶原能促進T1DM小鼠葡萄糖分解能力，從而降低血糖。

圖38 顯示T1DM模型小鼠給予纖溶酶原20天後血清胰島素檢測結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠血清胰島素濃度明顯低於給纖溶酶原組小鼠，且統計差異接近顯著(P=0.08)。說明纖溶酶原能促進T1DM小鼠胰島素的分泌。

實施例

實施例1 纖溶酶原對糖尿病小鼠胰腺的保護作用

24-25周齡db/db雄性小鼠7隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻和給溶媒PBS對照組3隻。，第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水封片，切片在200和400倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖1A，1B)大部分的胰島發生萎縮，萎縮的胰島細胞被腺泡(箭頭標示)所代替，胰島邊緣的腺泡增生，致胰島與腺泡之間分界不清；給纖溶酶原組(圖1C，1D)大部分的胰島較之於對照組面積大，且胰島內未有腺泡增生，只有少數的胰島內殘存少量的腺泡，胰島與腺泡之間邊界清晰。比較給藥組和對照組的胰島占胰腺的面積比發現，給藥組比對照組大近乎一倍(圖1E)。說明纖溶酶原可促進糖尿病小鼠胰島損傷的修復，提示纖溶酶原有可能通過促進胰島損傷的修復，從而從根本上治癒糖尿病。

實施例2 纖溶酶原減少糖尿病小鼠胰島膠原沉積

24-25周齡db/db雄性小鼠16隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組10隻，給溶媒PBS對照組6隻。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第32天犧性小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟至水後水洗1次，以0.1%天狼星紅染色60分鐘後，流水沖洗，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精和氨水分化返藍，流水沖洗，烘乾後封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

天狼星紅染色可使膠原持久染色，作為病理切片特殊染色方法，天狼星紅染色可以特異顯示膠原組織。

染色結果顯示，給纖溶酶原組小鼠(圖2B)胰島膠原沉積(箭頭標識)明顯低於給溶媒PBS對照組(圖2A)，且統計差異顯著(圖2C)。說明纖溶酶原能降低糖尿病動物胰島的纖維化。

實施例3 纖溶酶原促進18周齡進糖尿病小鼠胰島素的表達和分泌

18周齡db/db雄性小鼠8隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各4隻。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；之後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠胰島素抗體(Abcam)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖3A)胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組(圖3A)，且統計差異接近顯著(P=0.15)(圖3C)。說明纖溶酶原能夠促進胰島功能修復，促進胰島素的表達和分泌。

實施例4 纖溶酶原促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島素的表達和分泌

24-25周齡db/db雄性小鼠8隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻和給溶媒PBS對照組3隻。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；之後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠胰島素抗體(Abcam)4℃孵育過夜，PBS 洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

結果顯示，給纖溶酶原組胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(P=0.02)(圖4)。說明纖溶酶原能有效修復胰島功能，促進胰島素的表達和分泌。

實施例5 纖溶酶原促進糖尿病小鼠胰島素合成分泌功能的修復

26周齡db/db雄性小鼠9隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻給溶媒PBS對照組5隻。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第35天小鼠禁食16小時後，在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；之後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠胰島素抗體(Abcam)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

結果顯示，給纖溶酶原組胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異極顯著(P=0.005)(圖5)。說明纖溶酶原能有效修復糖尿病鼠胰島功能，提高胰島素的表達和分泌。

實施例6 纖溶酶原促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島多向核轉錄因數NF-κB的表達

24-25周齡db/db雄性小鼠10隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻和給溶媒PBS對照組6隻，另取4隻db/m作為正常對照組，正常對照組不做處理。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；之後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠NF-κB(Abcam)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

NF-κB為轉錄因數蛋白家族成員，在炎症修復過程中發揮著重要作用^[45]。

本發明實驗結果顯示，給纖溶酶原組NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(圖6)。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因數NF-κB的表達。

實施例7 纖溶酶原減少18周齡糖尿病小鼠胰島α細胞的增殖，恢復胰島α細胞的正常分佈和降低胰高血糖素的分泌

18周齡db/db雄性小鼠8隻以及db/m雄性小鼠3隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各4隻，db/m小鼠作為正常對照組。第1天開始給纖溶酶原或PBS。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

胰島α細胞合成分泌胰高血糖素，主要散在分佈於胰島周邊區域。

結果顯示，與給纖溶酶原組(圖7C)相比，給溶媒PBS對照組(圖7B)胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，陽性細胞浸潤到胰島的中央區域，且平均光密度定量分析結果具有統計學差異(**表示P<0.01)(圖7D)；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組的胰島形態比給溶媒PBS組更接近正常對照組(7A)。說明纖溶酶原能夠顯著抑制18周齡糖尿病小鼠胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，提示纖溶酶原促進胰島損傷的修復。

實施例8纖溶酶原減少24-25周齡糖尿病小鼠胰島α細胞的增殖，恢復胰島α細胞的正常分佈和降低胰高血糖素的分泌

24-25周齡db/db雄性小鼠11隻以及db/m雄性小鼠5隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠稱重後隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻，給溶媒PBS對照組6隻，db/m小鼠作為正常對照組。第1天開始給纖溶酶原或PBS。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS或不注射任何液體，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，與給纖溶酶原組相(圖8C)比給溶媒PBS對照組(圖8B)胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，陽性細胞浸潤到胰島的中央區域；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組的胰島形態比給溶媒PBS組更接近正常對照組(8A)。說明纖溶酶原能夠顯著抑制24-25周齡糖尿病小鼠胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，提示纖溶酶原能促進胰島損傷的修復。

實施例9 纖溶酶原抑制26周齡糖尿病小鼠胰島α細胞的增殖，恢復胰島α細胞的正常分佈和降低胰高血糖素的分泌

26周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m雄性小鼠3隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠稱重後隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。第1天開始給纖溶酶原或PBS。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1 小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，與給纖溶酶原組相(圖9C)比給溶媒PBS對照組(圖9B)胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，陽性細胞浸潤到胰島的中央區域，且平均光密度定量分析結果具有統計學差異(**表示P<0.01)(圖9D)；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組的胰島形態比給溶媒PBS組更接近正常對照組(9A)。說明纖溶酶原能夠顯著抑制26周齡糖尿病小鼠胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，提示纖溶酶原能促進胰島損傷的修復。

實施例10 纖溶酶原減少PLG活性正常小鼠T1DM模型中胰高血糖素的分泌

9-10周齡PLG活性正常雄性性小鼠15隻，隨機分為三組，空白對照組、給溶媒PBS對照組以及給纖溶酶原組，每組各5隻。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg STZ(Sigma，貨號S0130)誘導T1DM模型^[43]，空白對照組不做處理。注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

胰島α細胞合成分泌胰高血糖素，主要分佈於胰島周邊區域。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖10B)胰高血糖素陽性表達明顯多於給纖溶酶原組(圖10C)，且平均光密度定量分析結果統計差異顯著(圖10D)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(10A)。說明纖溶酶原能夠顯著減少STZ誘導的糖尿病小鼠胰島α細胞分泌胰高血糖素。

實施例11 纖溶酶原促進18周齡糖尿病小鼠胰島胰島素受體底物2(IRS-2)的表達

18周齡db/db雄性小鼠7隻以及db/m雄性小鼠3隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組3隻，給溶媒PBS對照組4隻，db/m小鼠作為正常對照組。第1天開始給纖溶酶原或PBS。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

胰島素受體底物2((Insulin Receptor Substrate-2,IRS-2)是一種能夠被啟動的胰島素受體酪氨酸激酶作用的底物，是胰島素信號轉導途徑中重要分子，且對胰島β細胞的生存非常重要。IRS-2在胰島β細胞表達增加時對其具有保護效應，且對功能性胰島β細胞的維持至關重要^[46,47]。

IRS-2免疫組化結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠(圖11B)胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組(圖11C)，且統計差異極顯著(圖11D)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(11A)。說明纖溶酶原能有效增加18周齡糖尿病小鼠胰島細胞IRS-2的表達。

實施例12 纖溶酶原促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島IRS-2的表達

24-25周齡db/db雄性小鼠11隻以及db/m雄性小鼠5隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻，給溶媒PBS對照組6隻，db/m小鼠作為正常對照組。第1天開始給纖溶酶原或PBS。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS或不注射任何液體，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

IRS-2免疫組化結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠(圖12B)胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組(圖12C)，且統計差異顯著(圖12D)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組(12A)。說明纖溶酶原能有效增加24-25周齡糖尿病小鼠胰島細胞IRS-2的表達。

實施例13 纖溶酶原促進26周齡糖尿病小鼠胰島IRS-2的表達

26周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m雄性小鼠3隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。第1天開始給纖溶酶原或PBS。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

IRS-2免疫組化結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠(圖13B)胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組(圖13C)；給纖溶酶原組IRS-2表達水準接近正常對照組小鼠(圖13A)。說明纖溶酶原能有效增加26周齡糖尿病小鼠胰島細胞IRS-2的表達。

實施例14 纖溶酶原促進PLG活性正常T1DM小鼠胰島IRS-2的表達

9-10周齡PLG活性正常雄性性小鼠15隻，隨機分為三組，空白對照組、給溶媒PBS對照組以及給纖溶酶原組，每組各5隻。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg STZ(Sigma，貨號S0130)誘導I型糖尿病^[43]，空白對照組不做處理。注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28 天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

IRS-2免疫組化結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠(圖14B)胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組(圖14C)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(14A)。說明纖溶酶原能有效增加9-10周齡PLG活性正常小鼠胰島細胞IRS-2的表達。

實施例15 纖溶酶原減少24-26周齡糖尿病小鼠胰島中性粒細胞的浸潤

24-26周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m小鼠3隻，db/db小鼠隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠中性粒細胞抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

中心粒細胞是非特異性細胞免疫系統中重要成員，當炎症發生時，它們被趨化性物質吸引到炎症部位。

中心粒細胞免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖15C)陽性表達細胞少於給溶媒PBS對照組(圖15B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組(15A)。

實施例16 纖溶酶原減少PLG活性受損小鼠在T1DM模型中胰島中性粒細胞的浸潤

9-10周齡PLG活性受損雄性小鼠10隻，隨機分為三組，空白對照組3隻，給PBS對照組3隻，給纖溶酶原組4隻。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[43]，空白對照組不做處理。注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠中性粒細胞抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

中心粒細胞免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖16C)陽性表達細胞(箭頭標識)少於給溶媒PBS對照組(圖16B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(16A)。

實施例17 纖溶酶原減少PLG活性正常小鼠在T1DM模型中胰島中性粒細胞的浸潤

9-10周齡PLG活性正常雄性性小鼠11隻，隨機分為三組，空白對照組3隻，給溶媒PBS對照組4隻，給纖溶酶原組4隻。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[43]，空白對照組不做處理。注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。 PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠中心粒細胞抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

中心粒細胞免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖17C)陽性表達細胞(箭頭標識)少於給溶媒PBS對照組(圖17B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(17A)。

實施例18 纖溶酶原促進PLG活性受損小鼠T1DM模型中胰島多向核轉錄因數NF-κB的表達

9-10周齡PLG活性受損雄性性小鼠10隻，隨機分為三組，空白對照組3隻，給PBS對照組3隻，給纖溶酶原組4隻。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[43]，空白對照組不做處理。注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗體(Cell Signal)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

NF-κB作為一種多向核轉錄因數，啟動後參與細胞增殖、細胞凋亡及炎症和免疫等多種基因的調節^[24]。

實驗結果顯示，給纖溶酶原組(圖18C)NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組(圖18B)。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因數NF-κB的表達。

實施例19 纖溶酶原促進18周齡糖尿病小鼠胰島多向核轉錄因數NF-κB的表達

18周齡db/db雄性小鼠7隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組3隻，給溶媒PBS對照組4隻。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗體(Cell Signal)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

本發明實驗結果顯示，給纖溶酶原組(圖19B)NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組(圖19A)。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因數NF-κB的表達。

實施例20 纖溶酶原抑制26周齡糖尿病小鼠多向核轉錄因數NF-κB的表達

26周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m雄性小鼠3隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。第1天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗體(Cell Signal)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

實驗結果顯示，給纖溶酶原組(圖20C)NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組(圖20B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組(20A)。說明纖溶酶原能促進相對年老(26周齡)糖尿病小鼠多向核轉錄因數NF-κB的表達。

實施例21 纖溶酶原促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島TNF-α的表達

24-25周齡db/db雄性小鼠11隻以及db/m雄性小鼠5隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻，給溶媒PBS對照組6隻，db/m小鼠作為正常對照組。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS或不注射任何液體，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠TNF-α抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

腫瘤壞死因數α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)主要由活化的單核/巨噬細胞產生，是一種重要的促炎症因數^[48]。

本實驗研究結果顯示，給纖溶酶原組(圖21C)TNF-α的陽性表達明顯高於給溶媒PBS對照組(圖21B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組(21A)。說明纖溶酶原能促進24-25周齡糖尿病小鼠TNF-α的表達。

實施例22 纖溶酶原抑制26周齡糖尿病小鼠胰島TNF-α的表達

26周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m雄性小鼠3隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。第1天開始給纖溶酶原或PBS。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS或不注射任何液體，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠TNF-α抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

研究結果顯示，給纖溶酶原組(圖22C)TNF-α的陽性表達明顯高於給溶媒PBS對照組(圖22B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組(圖22A)。說明纖溶酶原能26周齡糖尿病小鼠促進TNF-α的表達。

實施例23 纖溶酶原促進PLG活性受損小鼠在T1DM模型中胰島TNF-α的表達

9-10周齡PLG活性受損雄性性小鼠7隻，隨機分為兩組，給PBS對照組3隻，給纖溶酶原組4隻。兩組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[43]。注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠抗體TNF-α(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

本實驗研究結果顯示，給纖溶酶原組(圖23B)TNF-α的陽性表達明顯高於給溶媒PBS對照組(圖23A)。說明纖溶酶原能促進PLG活性受損小鼠T1DM模型TNF-α的表達。

實施例24 纖溶酶原減輕PLG活性受損小鼠在T1DM模型中胰島損傷

9-10周齡PLG活性受損雄性性小鼠10隻，隨機分為三組，空白對照組3隻，給PBS對照組3隻，給纖溶酶原組4隻。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[43]，空白對照組不做處理。注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.lml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加山羊抗鼠IgM(HRP)抗體(Abcam)室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

IgM抗體在清除凋亡和壞死細胞過程中發揮著重要作用，組織器官損傷局部IgM抗體的水準與損傷程度呈正相關^[49,50]。因此，檢測組織器官局部IgM抗體的水準能夠反映該組織器官的損傷情況。

研究結果顯示，給纖溶酶原組(圖24C)IgM的陽性表達明顯低於給溶媒PBS對照組(圖24B)給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(圖24A)。說明纖溶酶原能降低IgM的表達，提示纖溶酶原能減輕PLG活性受損小鼠T1DM模型中的胰島損傷。

實施例25 纖溶酶原降低糖尿病小鼠血糖

24-25周齡db/db雄性小鼠8隻，隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻和給溶媒PBS對照組3隻。實驗開始當天記為第0天並稱重分組，第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第10、31天禁食16小時後，用血糖試紙(Roche，Mannheim，Germany)進行血糖檢測。

結果顯示，給纖溶酶原組小鼠的血糖明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。此外，隨著給藥時間的延長，給溶媒PBS對照組小鼠血糖有升高趨勢，而給纖溶酶原組血糖逐漸降低(圖25)。說明纖溶酶原具有降低糖尿病動物血糖的作用。

實施例26 纖溶酶原降低糖尿病小鼠果糖胺水準

24-25周齡db/db雄性小鼠5隻，給藥前一天每隻小鼠眼球靜脈叢取血50μl用以檢測血清果糖胺濃度，並記為第0天，第一天開始給予纖溶酶原，連續給藥31天。第32天摘除眼球取血，檢測血清果糖胺的濃度。果糖胺濃度使用果糖胺檢測試劑盒(南京建成，A037-2)進行檢測。

果糖胺濃度反映1~3周內血糖的平均水準。結果顯示，給予纖溶酶原後血清果糖胺的濃度明顯降低，與給藥前相比統計差異極顯著(圖26)。說明纖溶酶原能有效降低糖尿病動物血糖。

實施例27 纖溶酶原降低糖尿病小鼠糖化血紅蛋白水準

26周齡db/db雄性小鼠9隻，實驗開始當天記稱重後根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第35天小鼠禁食16小時，第36天摘眼球取血，用以檢測血漿糖化血紅蛋白的濃度。

糖化血紅蛋白含量通常可以反映患者近8~12周的血糖控制情況。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠糖化血紅蛋白的濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(圖27)。說明纖溶酶原能有效降低糖尿病動物血糖水準。

實施例28 纖溶酶原改善糖尿病小鼠糖耐受能力

26周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m小鼠3隻。實驗開始當天，db/db小鼠稱重後並根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻和給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥10天。第11天小鼠禁食16小時後，每隻小鼠按5g/kg體重腹腔注射5%葡萄糖溶液，在0，30，60，90，120，180分鐘用血糖試紙(Roche，Mannheim，Germany)檢測血糖濃度。

腹腔糖耐受檢測(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)可檢測機體對葡萄糖的耐受能力。現有技術已知糖尿病患者糖耐量是下降的。

實驗結果顯示，腹腔注射葡萄糖後給纖溶酶原組小鼠血糖水準要低於給溶媒PBS對照組，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組糖耐受曲線更加接近正常小鼠組(圖28)。說明纖溶酶原能明顯改善糖尿病小鼠糖耐受能力。

實施例29 纖溶酶原降低PLG活性正常小鼠在T1DM模型中血糖水準

9-10周齡PLG活性正常雄性小鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組以及給纖溶酶原組，每組各5隻。兩組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)(sigma S0130)誘導T1DM^[43]。STZ注射12天後開始給藥並記為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥10天。在第11天小鼠禁食6小時後，用血糖試紙(Roche，Mannheim，Germany)測定血糖。

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠血糖明顯高於給纖溶酶原組小鼠，且統計差異極顯著(圖29)。說明纖溶酶原能顯著降低PLG活性正常小鼠T1DM模型的血糖水準。

實施例30 纖溶酶原改善T1DM模型小鼠糖耐受水準

9-10周齡PLG活性正常雄性性小鼠15隻，隨機分為三組，空白對照組、給溶媒PBS對照組以及給纖溶酶原組，每組各5隻。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)誘導T1DM^[43]，空白對照組不做處理。STZ注射12天後開始給藥並記為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。第28天小鼠禁食6小時後，按照5g/kg體重腹腔注射5%葡萄糖溶液，在注射後0、15、30、60、90分鐘用血糖試紙(Roche，Mannheim，Germany)檢測血糖濃度。

腹腔糖耐受檢測(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)可檢測機體對葡萄糖的耐受能力。現有技術已知糖尿病患者糖耐量下降。

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠注射葡萄糖後血糖濃度明顯高於給纖溶酶原組，且與給溶媒PBS對照組相比，給纖溶酶原組糖耐受曲線更加接近正常小鼠(圖30)。說明纖溶酶原能提高PLG活性正常小鼠T1DM模型的糖耐受能力。

實施例31 纖溶酶原促進糖尿病小鼠胰島素分泌功能

26周齡db/db雄性小鼠9隻，實驗開始當天記為第0天，稱重並根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第35天小鼠禁食16小時後，在第36天摘眼球取血，離心取上清，運用胰島素檢測試劑盒(Mercodia AB)按照使用說明檢測血清胰島素水準。

檢測結果顯示，給纖溶酶原組血清胰島素水準明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(圖31)。說明纖溶酶原能顯著提高糖尿病小鼠胰島素的分泌。

實施例32 纖溶酶原減少糖尿病小鼠胰島細胞凋亡

24-25周齡db/db雄性小鼠6隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻和給溶媒PBS對照組2隻。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；之後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠Caspase-3(Abcam)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，其表達越多表明處於凋亡狀態的細胞越多^[44]。

本發明的實驗結果顯示，給纖溶酶原組(圖32B)Caspase-3的表達(箭頭標識)明顯低於給溶媒PBS對照組(圖32A)。說明纖溶酶原能夠減少胰島細胞的凋亡。

實施例33 溶酶原促進在T1DM模型中的PLG活性受損小鼠胰島素的合成與分泌

9-10周齡PLG活性受損雄性性小鼠10隻，隨機分為三組，空白對照組3隻，給PBS對照組3隻，給纖溶酶原組4隻。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[43]，空白對照組不做處理。注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰島素抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖33C)胰島素陽性表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組(圖33B，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(33A))。說明纖溶酶原能促進在T1DM模型中的PLG活性受損小鼠胰島素的合成與分泌。

實施例34 纖溶酶原促進T1DM模型中PLG活性正常小鼠胰島素的合成與表達

9-10周齡PLG活性正常雄性性小鼠11隻，隨機分為三組，空白對照組3隻，給溶媒PBS對照組4隻，給纖溶酶原組4隻。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[43]，空白對照組不做處理。注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰島素抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖34C)胰島素陽性表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組(圖34B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(34A)。說明纖溶酶原促進T1DM模型中PLG活性正常小鼠胰島素的合成與表達。

實施例35纖溶酶原減少24-25周齡糖尿病小鼠胰島細胞的凋亡

24-25周齡db/db雄性小鼠11隻以及db/m雄性小鼠5隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻，給溶媒PBS對照組6隻，db/m小鼠作為正常對照組。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS或不注射任何液體，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，室溫孵育7min，0.01M PBS洗3次，每次3分鐘。滴加TUNEL試劑盒(羅氏)試劑1和試劑2混合液體(5：45)，於37℃恒溫孵育40min，0.01M PBS洗3次，每次3分鐘。滴加甲醇配製的3%雙氧水溶液(過氧化氫：甲醇=1：9)室溫避光孵育20分鐘，0.01M PBS洗3次，每次3分鐘。滴加tunel試劑盒試劑3，37℃恒溫孵育30min，0.01M PBS洗3次，DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

TUNEL染色可以用來檢測組織細胞在凋亡晚期過程中細胞核DNA的斷裂情況。

本實驗結果顯示，給纖溶酶原組(圖35C)的陽性細胞數(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組(圖35B)。正常對照組TUNEL陽性染色極低(圖35A)。正常對照組凋亡率約為8%，給溶媒PBS組凋亡率約為93%，給纖溶酶原組凋亡率約為16%。說明纖溶酶原組能顯著減少糖尿病小鼠胰島細胞的凋亡。

實施例36 纖溶酶原降低26周齡糖尿病小鼠血清果糖胺水準

26周齡db/db雄性小鼠9隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。第1天開始給纖溶酶原或PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，檢測血清果糖胺的濃度。果糖胺濃度使用果糖胺檢測試劑盒(南京建成，A037-2)進行檢測。

檢測結果顯示，給纖溶酶原組血清果糖胺的濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，統計差異接近顯著(P=0.06)(圖36)。說明纖溶酶原能降低26周齡糖尿病小鼠的血糖果糖胺。

實施例37 纖溶酶原提高T1DM模型小鼠葡萄糖分解能力

9-10周齡C57雄性小鼠8隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組以及給纖溶酶原組，每組各4隻。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)(sigma S0130)誘導T1DM[43]。STZ注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。連續給藥19天，在第20天小鼠禁食6小時後，以2g/kg體重灌胃20%的葡萄糖，60分鐘後，眼眶靜脈叢采血並離心取上清，以葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛361500)測定血糖。

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠血糖明顯高於給纖溶酶原組小鼠血糖，且統計差異顯著(P=0.04)(圖37)。說明纖溶酶原能提高T1DM小鼠葡萄糖分解能力，從而降低血糖。

實施例38 纖溶酶原改善T1DM模型小鼠胰島素分泌

9-10周齡C57雄性小鼠6隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各3隻。兩組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)(sigma S0130)誘導T1DM^[43]。STZ注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。連續給藥20天，在第21天小鼠禁食6小時後，眼球靜脈叢取血，離心取上清，運用胰島素檢測試劑盒(Mercodia AB)，按照使用說明檢測血清胰島素濃度。

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島素濃度明顯低於給纖溶酶原組小鼠，且統計差異接近顯著(P=0.08)(圖38)。說明纖溶酶原能促進T1DM小鼠胰島素的分泌。

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<110> 深圳瑞健生命科學研究院有限公司

<120> 一種促進胰島β細胞損傷修復和減少胰島纖維化的方法

<130> F17WO392TW

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 2433

<212> DNA

<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的核酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 810

<212> PRT

<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的氨基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 2145

<212> DNA

<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)核酸序列

<400> 5

<210> 6

<211> 714

<212> PRT

<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)氨基酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 1245

<212> DNA

<213> delta-plg(delta-纖溶酶原)核酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 414

<212> PRT

<213> delta-plg(delta-纖溶酶原)氨基酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 1104

<212> DNA

<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 9

<210> 10

<211> 367

<212> PRT

<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 750

<212> DNA

<213> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 11

<210> 12

<211> 249

<212> PRT

<213> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 12

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的核酸序列

<400> 13

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的氨基酸序列

<400> 14

Claims

一種纖溶酶原在製備促進糖尿病受試者胰島細胞損傷修復的藥物上的用途。
如請求項1所述之用途，其中該纖溶酶原促進胰島素受體底物2(IRS-2)的表達。
如請求項1或2所述之用途，其中該纖溶酶原促進細胞因數TNF-α的表達。
如請求項1或2所述之用途，其中該纖溶酶原促進受試者多向核轉錄因數NF-κB的表達。
如請求項1或2所述之用途，其中該胰島細胞損傷為胰島β細胞合成和分泌胰島素的功能損傷。
如請求項1或2所述之用途，其中該胰島細胞損傷為胰島組織結構損傷。
如請求項1或2所述之用途，其中該胰島細胞損傷為胰島膠原沉積。
如請求項1或2所述之用途，其中該胰島細胞損傷為胰島的纖維化。
如請求項1或2所述之用途，其中該纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。
如請求項1或2所述之用途，其中該纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。
如請求項1或2所述之用途，其中該纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。