KR101467109B1

KR101467109B1 - Ｂｉｘ02189 화합물을 유효성분으로 포함하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101467109B1
Application number: KR1020130081164A
Authority: KR
Inventors: 우창훈; 김수지
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2014-12-01

Abstract

본 발명은 BIX02189 화합물을 유효성분으로 포함하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물 및 섬유아세포의 발현을 억제하는 물질을 스크리닝하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 TGF-β1의 섬유화반응을 억제하고, Smad3의 아세틸화를 조절하는 효과가 있어 폐섬유증의 예방 또는 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＢＩＸ02189 화합물을 유효성분으로 포함하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating pulmonary fibrosis comprising BIX02189 compound}

본 발명은 BIX02189 화합물을 유효성분으로 포함하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물 및 섬유아세포의 발현억제 여부를 통한 폐섬유증 치료제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

폐섬유증(fibroid lung)은, 폐포벽에 미만성 섬유 증식을 특징으로 하는, 건성 기침이나 노동 시, 호흡 곤란을 주증상으로 하는 질환이다. 협의로는 간질성 폐렴의 말기의 형태를 가리키지만, 광의로는 협의의 폐섬유증과 간질성 폐렴과의 병존상태를 의미한다. 모든 간질성 폐렴이 폐섬유증의 원인이 될 수 있다. 간질성 폐렴은, 폐의 간질(협의로는 폐포 격벽, 광의로는 소잎간간질, 흉막 근방 등을 포함한다)에 염증을 일으키는 질환의 총칭이며, 감염, 교원병, 방사선, 약제, 분진 등 특정의 원인에 의하는 것과 원인이 불명의 특발성간질성 폐렴을 포함한다. 특발성간질성 폐렴은, 흉강경하폐생검(VATS)이나 고 분해능 컴퓨터 단층 사진(HRCT) 소견 등에 기초를 두어, 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis：IPF), 비특이성 간질성 폐렴(nonspecific interstitial pneumonia：NSIP), 급성간질성 폐렴(acute interstitial pneumonia：AIP), 특발성 기질화 폐렴(cryptogenic organizing pneumonia：COP), 호흡계기관지염 관련성간질성폐질환(respiratory bronchiolitisassociated interstitial lung disease：RB－ILD), 박리성간질성 폐렴(desquamative interstitial pneumonia：DIP), 임파구성간질성 폐렴(lymphoid interstitial pneumonia：LIP) 등으로 분류된다. 원인을 특정할 수 있는 간질성 폐렴은, 그 원인의 제거나, 스테로이드제 등의 항염증제의 투여 등에 의해 치유되는 경우가 많지만, 특발성 간질성 폐렴에 대해서는 현재로서는 근치 요법이 존재하지 않는다. 특발성 간질성 폐렴 증상 악화 시에 스테로이드제나 아자치오프린, 시크로호스파미드 등을 투여하고, 저산소혈증 발생 시에는 산소 요법을 하는 등의 치료만 있을 뿐이다.

이러한 상황 때문에 연구자들은 폐섬유증 치료제 개발에 많은 노력을 쏟았는데 그 결과, 예를 들면, 콜히친, D－페니실라민(D-penicillamine), 피르페니돈(Pirfenidone)(5－메틸-1－페닐-2－［1H］－피리돈), 인터페론(Interferon)β1 a, 릴렉신(relaxin), 로바스타틴, Beractant, N－아세틸시스테인(Acetyl Cysteine), 케라티노사이트(keratinocyte) 증식 인자, 켑토프릴(captopril), 간세포 증식 인자, Rho 키나제 저해제, 트롬보모듈린(thrombomodulin)모양 단백질, 빌리루빈, PPARγ활성화(activated), 이매티닙(imatinib), 인터페론γ 등의 약제가 폐섬유증에 효과가 있다는 사실을 밝혀낼 수 있었다.

그러나 상기 약제는 폐섬유증 동물모델 및 임상실험에서 폐섬유증 억제 효과가 낮아 아직까지 만족할만한 수준이 아니다. 따라서, 새로운 폐섬유증 치료제의 개발이 요구되고 있다.

한국공개특허 제2001-7008828호 한국공개특허 제1999-7012519호

따라서 본 발명의 목적은 BIX02189 화합물을 유효성분으로 포함하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 섬유아세포의 발현억제 여부를 통한 폐섬유증 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 ERK5 또는 MEK5 억제제일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 TGF-β에 의해 유도되는 세포외 기질 분자 또는 전섬유화(profibrotic) 유전자의 발현을 억제 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포외 기질 분자는 피브로넥틴(fibronectin) 또는 타입 1 콜라겐(type 1 collagen)이고, 상기 전섬유화(profibrotic) 유전자는 PAI-1(type 1 plasminogen activator inhibitor) 또는 CTGF(connective tissue growth factor)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 TGF-β1에 의해 유도된 Smad3의 전사 활성을 억제 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 TGF-β1에 의해 유도된 Smad3의 아세틸화를 억제 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 Smad3의 378번 아미노산의 아세틸화를 억제 또는 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 섬유아세포에 시험물질을 처리하여 전배양하는 단계; (b) 전배양된 섬유아세포에서 섬유화인자의 발현 정도를 분석하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 섬유화인자의 발현정도가 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소되는 경우, 상기 시험물질은 ERK5 또는 MEK5 억제활성을 통해 폐섬유증질환의 치료제로 판정하는 단계를 포함하는, 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약제를 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 화합물은 TGF-β1의 섬유화반응을 억제하고, Smad3의 아세틸화를 조절하는 효과가 있어 폐섬유증의 예방 또는 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1A,B는 섬유아세포인 10T1/2와 폐상피세포인 A549에 BIX02189 처리와 siRNA-ERK5를 처리하여 TGF-β에 의해 유도된 콜라겐과 피브로넥틴(fibronectin) 발현양을 측정한 결과이다.
도 1C,D는 섬유아세포인 10T1/2와 폐상피세포인 A549에 BIX02189 처리 따른 섬유화 관련 유전자인 CTGF와 PAI-1의 발현양을 확인한 결과이다.
도 2는 10T1/2 세포와 A549 세포에 BIX02189 처리에 따른 Smad3의 전사활성도를 알아보기 위하여 SBE-Luc과 p800-Luc를 이용하여 전사활성을 측정한 결과이다.
도 3A,B는 A549 세포와 10T1/2 세포에 BIX02189를 처리한 뒤 세포용해물을 Smad3 인산화 및 ERK5 항체를 넣어 면역블러팅하여 BIX02189 처리에 의한 Smad3의 C-terminal 인산화 여부를 확인한 결과이다.
도 3C는 BIX02189 처리에 의한 Smad3의 핵 전좌(nuclear translocation) 여부를 알아보기 위하여 A549 세포에 BIX02189를 처리하고, 항-Smad3 항체를 넣은 뒤 DAPI 염색을 한 결과이다.
도 4는 A549 세포에 FLAG-Smad를 주입하고 BIX02189를 처리한 뒤 세포 용해물에 항-Flag 항체 또는 컨트롤 IgG를 주입한 후 면역블롯팅을 통하여 Smad3의 양을 확인한 결과이다.
도 5A,B는 BIX02189 처리에 의한 폐섬유증의 조직학적 변화 및 콜라겐 축적여부를 알아보기 위하여 헤마톡시린 & 에오신(H&E) 및 MTC 염색을 한 결과이다.
도 5C는 폐섬유증 유발 마우스에서 BIX02189 화합물 처리에 따른 COL1A2, COL3A1, CTGF 및 PAI-1의 mRNA 발현을 측정한 결과이다.
도 6은 BIX02189 처리에 의한 폐섬유증 유도 동물군의 생존률을 측정한 결과이다.

본 발명은 BIX02189 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

폐섬유증은 만성적으로 폐간질과 폐포에 염증반응 및 섬유화가 진행되는 질환으로서 아직 뚜렷한 원인이 밝혀져 있지 않다. 특히, 폐섬유증은 고령인구에서 사망률이 높아지는데 우리나라와 같이 초고령화 사회로 접어든 경우 막대한 사회적 비용이 예상된다. 전세계적으로 이 분야의 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 현재까지 유효한 치료약이 없으며 그나마 알려진 치료약들도 부작용이 심한 스테로이드나 면역억제제 밖에 없는 실정이다.

이제 본 발명자들은 부작용이 없으면서도 폐섬유증의 치료효과가 좋은 약품을 개발하기 위해 노력하던 중 BIX02189 화합물이 Smad3의 아세틸화를 조절하는 기작을 통해 폐섬유증을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.

이러한 사실을 입증하기 위해 본 발명자들은 본 발명의 일실시예를 통해 다음과 같은 실험을 수행하였는데 섬유아세포인 10T1/2와 폐상피세포인 A549에 BIX02189 처리와 siRNA-ERK5를 처리한 결과, TGF-β에 의해 유도된 콜라겐과 피브로넥틴(fibronectin) 발현이 BIX02189 처리와 siRNA-ERK5에 의하여 현저히 감소하였음을 알 수 있었다(도 1A, 1B 참조).

또한, 섬유아세포인 10T1/2와 폐상피세포인 A549에 섬유화 관련 유전자인 CTGF와 PAI-1를 조사한 결과, 블레오마이신에 의해 유도된 폐섬유화가 BIX02189 처리에 의해서 억제되었음을 알 수 있었다(도 1C, 1D 참조).

다른 일실시예에 따라서, ERK5의 타겟을 이해하기 위하여 TGF-β의 대표적인 신호전달 물질인 Smad3의 활성도를 Smad binding Element reporter gene(SBE-Luc)과 PAI-1 프로모터 리포터(p800-Luc)를 이용하여 전사활성(transcriptional activity)을 조사한 결과, TGF-β에 의해 유도된 SEB와 PAI-1 프로모터 활성이 BIX02189 처리에 의하여 저해되었음을 섬유아세포(fibroblasts)와 폐상피세포라인 모두에서 확인할 수 있었다(도 2 참조).

또한 다른 일실시예에 따라서, ERK5 신호체계가 TGF-β-Smad 전사활성(transcriptional activity)에 영향을 미친다는 것을 확인하고, 어떠한 단계에서 ERK5 신호전달계가 작동하였는지를 알아보기 위하여 대표적인 메카니즘으로 알려진 Smad3의 C-terminal 인산화를 조사한 결과, TGF에 유도된 C-terminal Smad3 인산화는 BIX02189 처리나 siRNA-ERK5 형질전환 모두에 전혀 영향을 받지 않았음을 알 수 있었으며(도 3A, 3B 참조), Smad3의 핵 전좌(nuclear translocation) 또한 ERK5 억제에 의하여 거의 영향 받지 않았음을 알 수 있었다(도 3C 참조).

HDAC 억제제를 처리한 경우 디아세틸라아제(deacetylase) 효소반응을 억제하고 아세틸화를 유도하여 TGF-β에 의한 SBE 전사활성이 증가되었고, 이렇게 증가된 SBE 활성이 ERK5 억제에 의하여 현저히 저해됨을 확인하였다.

실제로 ERK5 억제제를 처리하여 확인한 결과, TGF-β에 의하여 유도된 Smad3 아세틸화가 감소됨을 알 수 있었으며(도 4A,4B 참조), 이러한 결과는 ERK5 신호전달계가 아세틸화를 유도하여 TGF-β-Smad 신호전달계에 작용함을 나타내는 것이다.

나아가 본 발명자들은 실제로 ERK5 억제가 폐섬유증의 치료에 효과가 있는지를 알아보기 위하여 폐섬유증 동물을 제작한 뒤, ERK5 억제제인 BIX02189를 주입하여 폐 섬유증에 미치는 영향을 분석한 결과, BIX02189화합물은 폐섬유증 유발 동물모델에서 섬유증의 조직학적 변화를 억제하였으며(도 5A참조), 콜라겐 축적 또한 억제하였음을 알 수 있었다(도 5B 참조).

또한, BIX02189 화합물의 처리는 블레오마이신에 의해 죽는 폐섬유증 동물모델의 생존률도 폐섬유증에 걸리지 않은 동물모델군의 생존률 수준으로 높일 수 있음을 알 수 있었다(도 6 참조).

그러므로 본 발명은 BIX02189 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 BIX02189 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

<화학식 1>

또한, 본 발명에 따른 화학식1로 표시되는 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 폐섬유증의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 화학식1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 폐섬유증의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 BIX02189 화합물 또는 그의 염의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 폐섬유증 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 폐섬유증의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 폐섬유증의 예방 또는 치료용 조성물은 폐섬유증의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 BIX02189 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 섬유아세포에 시험물질을 처리하여 전배양하는 단계; (b) 전배양된 섬유아세포에서 섬유화인자의 발현 정도를 분석하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 섬유화인자의 발현정도가 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소되는 경우, 상기 시험물질은 ERK5 또는 MEK5 억제활성을 통해 폐섬유증질환의 치료제로 판정하는 단계를 포함하는, 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약제를 스크리닝방법을 제공한다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 준비예 1>

세포배양

A549 세포는 10% FBS, 50U/mL 페니실린 및 50㎍/mL 스트렙토마이신으로 보충된 F12-K 배지(GIBCO)에서 배양하였고, HEK293 및 10T 1/2 세포는 10% FBS, 50U/mL 페니실린 및 50㎍/mL 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포들은 5% CO₂, 37℃의 환경에서 배양하였다.

< 준비예 2>

시약 및 항체

재조합 TGF-β1은 R&D 시스템(Wiesbaden Nordenstdt, 독일)에서 수득하였으며, BIX02189, MEK5 억제제는 Selleck Chemicals(Houston, TX, 미국), 블레오마이신(bleomycin) 및 DMSO는 Sigma(St.Louis,MO, 미국)에서 구입하였다. ERK5, phospho-C-terminal Smad3, 아세틸레이트-라이신 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, 미국)에서, Smad3 항체는 Invitrogen(Carlsbad, CA, 미국), 피브로넥틴 대응 항체 및 콜라겐 타입1 항체는 Santa Cruz(Delaware, CA) 및 Millipore(Billerica, MA, 미국)에서 각각 구입하였으며, 항-튜불린 항체는 Sigma에서 구입하였다.

< 준비예 3>

siRNA

ERK5의 발현 억제를 위하여 세포들을 일시적으로 100pM의 인간 또는 마우스 siRNA를 리포펙타민 2000 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국)을 이용하여 형질전환시켰으며, siRNA 타겟 시퀀스는 하기 표 1과 같다.

불특정 siRNA 대조군은 Bioneer에서 구입하여 음성 대조군으로 사용하였다. 세포들은 siRNA 형질전환 이후 48~72시간이 지난 다음에 수득하였으며, 단백질 발현은 항체를 이용한 면역블롯팅(immunoblotting) 확인하였고, mRNA 발현은 qRT-PCR로 확인하였다.

< 준비예 4>

플라스미드 제작

리포터 플라스미드는 p800-Luc와 SBE-Luc를 사용하였다. Gal4-융합 Smad3는 pBIND 벡터에 서브클로닝하여 제조하였으며, pCMV5-Flag-Smad3은 Addgene plasmid repository에서 수득하였고, pXpress-ERK5 및 pHA-CA-MEK5는 일반적으로 사용하는 클로닝 방법을 이용하여 제작하였다. pcDNA3.1-p300은 Addgene plasmid repository에서 수득하였고, Smad3 K378R 돌연변이 제조는 QuikChang Ⅱ Site-Directed Mutagenesis 키트에 기재된 방법에 의하여 수행하였다.

< 준비예 5>

통계처리

실험결과는 평균± 표준편차로 표기하였고, 그 결과들은 차이를 분석하기 위하여 Kaplan-Meier method로 각 군 간의 생존율을 분석하였다. p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

< 실시예 1>

ERK5 억제제의 폐섬유화 억제효과 분석

<1-1> ERK5 억제제에 의한 피브로넥틴 및 타입 1 콜라겐 단백질 발현 분석

중요한 섬유형성 인자로 알려진 TGF-β1은 ECM 분자와 전섬유형성 유전자의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 ERK5 억제제의 폐섬유화 억제효과의 기전을 알아보기 위하여 ERK5 억제가 TGF-β1에 의해 유도되는 ECM분자와 전섬유 형성 유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.

이를 위하여 섬유아세포인 10T1/2 세포에 ERK5 특이적 억제제로 알려진 BIX02189 화합물을 1시간 동안 처리하고 TGF-β1(2ng/ml)의 24시간 처리에 의해 유도된 피브로넥틴(fibronectin)과 타입 1 콜라겐(type 1 collagen)의 단백질 발현량 변화를 알아보기 위하여 웨스턴 블라팅을 실시하였다.

먼저, 1mM PMSF와 0.01mM PIC가 첨가된 RIPA 버퍼를 이용하여 세포를 용해하고, 용해된 세포를 15분간 얼음에서 반응시켰으며, 4℃에서 10분간 15,000g의 속도로 원심분리하였다. 단백질은 원심분리된 세포의 상청액을 브래드포드 어세이로 정량하였으며, 단백질은 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, PVDF 멤브레인으로 옮긴 뒤, 멤브레인에 도 1A 및 도 2에 기재된 1차 항체(1:1000) 및 이에 대응하는 2차 항체(1:5000)를 결합시켜 그 발현 정도를 관찰하였다. 발현 정도는 화학 발광 검출 시약(ECL, Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 제조자 지시에 따라 가시화하였다.

그 결과, 피브로넥틴과 타입 1 콜라겐 단백질의 발현량이 BIX02189 화합물에 의해 현저히 감소되었음을 알 수 있었다(도 1A).

또한, 섬유아세포인 10T1/2 세포 및 폐상피세포인 A549 세포에 ERK5 특이적 siRNA (100pM)를 3일 동안 처리하고 TGF-β1(2ng/ml)을 24시간 처리한 후, 상기 기술된 것과 같은 웨스턴 블라팅 방법으로 단백질 발현량을 관찰한 결과, 상기 두 세포 모두에서 TGF-β1에 의해 유도된 피브로넥틴(fibronectin) 발현이 현저히 감소되었음을 확인할 수 있었다(도 1B 참조).

<1-2> ERK5 억제제에 의한 PAI -1 및 CTGF 의 mRNA 발현 분석

본 발명자들은 섬유아세포인 10T1/2 세포와 폐상피세포인 A549 세포에서 섬유화 관련 유전자인 PAI-1와 CTGF의 mRNA 양을 조사하기 위하여 RT-PCR 분석을 하였다.

이를 위하여 우선, 10T1/2 세포와 A549세포를 BIX02189(5 또는 10μM)을 TGF-β1(2ng/ml) 존재 하에서 6시간 동안 처리하였다. PAI-1 및 CTGF의 mRNA 양은 qRT-PCR을 이용하여 측정하였는데, 총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen)으로 분리하였으며, 역전사반응은 TaqMan 역전사 시약(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조자 방식에 따라 실시하였다. 1ul의 cDNA를 주형으로 Power SYBR Green(Applied biosystems)을 이용하여 ABI PRISM 7500(Applied Biosystems)으로 RT-PCR을 실시하였다. 정량화는 efficiency-corrected △△Cq 방법에 의해 도출하였다. 상대적 발현량은 GAPDH를 이용하여 정규화하였다.

본 발명에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.

그 결과, TGF-β1에 의해 유도된 PAI-1 및 CTGF의 mRNA 발현이 A549 세포 및 10T1/2 세포에서 모두 BIX02189 처리에 의해서 현저히 억제되었음을 알 수 있었다(도 1C, 1D 참조).

상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 BIX02189가 TGF-β1에 의해 유도된 ECM 및 전섬유 형성 유전자 발현을 저해함으로써 폐섬유화 억제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2>

BIX02189 처리에 의한 Smad3 의 전사활성 분석

Smad3는 TGF-β1에 의해 유도된 전섬유 형성 반응에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있는바, 본 발명자들은 BIX02189의 폐섬유화 억제 기전이 Smad3의 활성을 저해함으로써 유도되는지 확인해 보고자, 루시퍼라제 분석을 시도해 보았다.

먼저, A549 세포를 5 × GAL4-Luc 리포터 유전자와 GAL4-Smad3(pBIND-Smad3) 로 형질전환 시켰으며, 이후 TGF-β(2ng/ml)를 처리한 상태 또는 처리하지 않은 상태에서 각각 5μM의 BIX02189를 6시간 동안 처리하였다.

또한, 섬유아세포인 10T1/2 세포와 폐상피세포인 A549 세포에 PAI-1 프로모터 일부가 도입된 SBE-Luc 또는 p800-Luc으로 형질전환하였다. 형질전환된 세포는 5μM 또는 10μM의 BIX02189를 전처리 한 후, TGF-β1(2ng/ml)를 처리하고 6시간동안 배양한 뒤 전사활성을 조사하였다.

세포 용해물에서의 루시퍼라제 활성은 Dual 루시퍼라제 리포터 어세이 키트(Promega, Madison, WI, USA)와 Glomax 20/20 루미노미터(Promega)를 이용하여 측정하였고, 형질 전환 활성은 pRL-tk 조성물로부터 유도된 레닐라 루시퍼라제 활성으로 정규화하였다.

상기와 같은 루시퍼라제 분석 결과, BIX02189 전처리에 의해 TGF-β1의 Smad3에 대한 신호전달이 차단되었고(도 2A), SBE 프로모터 활성 및 PAI-1의 프로모터 활성을 저해하는 것으로 나타났다(도 2B, 도 2C).

이를 통해 본 발명자들은 BIX02189가 Smad3를 통한 TGF-β1의 전-섬유화 반응을 저해하는 효과를 발휘한다는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

BIX02189 처리에 의한 Smad3 의 C- terminal 인산화 및 Smad3 의 핵 전좌 분석

특이적 리간드에 결합하여 활성화된 TβRII는 TβRI키나아제의 활성화를 유도하고, 상기 키나아제는 Smad3를 인산화하여 활성화시키며, 인산화된 Smad3는 Co-Smad Smad4와 함께 복합체를 형성하여 핵 내부로 이동하여 다양한 유전자의 전사에 관여한다고 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 BIX02189가 Smad3의 활성을 억제함에 있어서 Smad3의 핵 전좌에 중요하다고 알려진 Smad3의 C-말단 SXS 모티프의 인산화를 억제하는지 확인해 보고자 하였다.

이를 위하여 먼저 A549 세포에 5uM의 BIX02189를 1시간동안 전처리 한 후2ng/ml의 TGF-β1를 30분 또는 60분간 처리하고 배양하였다. 또한, 10T1/2 세포에 100pM의 대조군 또는 ERK5 siRNA를 형질전환하고, TGF-β1(2ng/ml)을 10, 30 또는 60분간 처리하였다. 이후 세포를 용해하고, 세포 용해물을 인산화된 Smad3 및 ERK5에 대한 항체를 넣어 면역블러팅 하였다.

그 결과, TGF-β1에 의해 유도된 C-terminal Smad3 인산화는 BIX02189 처리나 siRNA-ERK5 형질전환에 의해 전혀 영향을 받지 않았음을 알 수 있었다(도 3A, 3B 참조).

이에 본 발명자들은 BIX02189가 Smad3의 핵 내부로의 전좌를 저해하는지 추가적으로 확인해 보았다.

이를 위하여, A549 세포에 5uM의 BIX02189를 1시간 동안 처리한 후, 2ng/ml의 TGF-β1를 30분동안 처리하여 배양하였다. 상기 세포를 10% buffered paraformaldehye로 30분간 고정하고 상온에서 5분간 투과화하였다. 이 후, 세포를 PBS-T(0.05% tween-20 in PBS)에 용해된 5% goat serum으로 블로킹하고, 항-Smad3 항체(1:100)를 넣어 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 그 후 FITC-결합된 항-마우스 IgG(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 90분간 반응시키고, 4‘6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 상온에서 10분간 대비염색 하였다. 신호는 공초점 현미경(Leica, Bannockbum, IL, USA)으로 200배 확대하여 관찰하였다.

그 결과, TGF-β1에 의해 Smad3의 핵 전좌가 현저히 증가하였으며, BIX02189 처리는 Smad3의 핵으로의 위치 이동(nuclear translocation)에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 3C 참조).

상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 BIX02189가 TGFβ1에 의해 유도되는 Smad3 신호 전달 경로에 있어 Smad3의 핵 전좌에는 영향을 미치지 않고, 핵 전좌 이후의 하위 단계에 영향을 미치는 것임을 예상할 수 있었다.

< 실시예 4>

BIX02189 처리에 의한 Smad3 아세틸화 감소 분석

Smad3의 다양한 전사 후 변형(post-transcription modification) 중, Smad3의 아세틸화(acetylation)는 핵 내에 존재하는 아세틸전달효소인 CBP(CREB bingd protein)와 p300에 의해 이루어지는 핵 내에서 일어나는 가장 중요한 전사 후 변형 중 하나이다. Smad3의 아세틸화는 Smad3의 전사 조절 기능에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있는바, 본 발명자들은 BIX02189 처리가 Smad3의 아세틸화에 어떠한 영향을 미치는지 관찰해 보고자 하였다.

이를 위하여 먼저, A549 세포에 SBE-luc로 형질전환하였으며, 형질전환된 세포에 100nM TSA와 5㎛ BIX02189를 1시간동안 처리한 후 pRL-tk 조성물 유래의 레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase)를 이용하여 활성을 정규화하였다.

루시퍼라제 분석 결과, TGF-β1에 의해 유도된 SBE-의존적 프로모터 활성이 히스톤 디아세틸라아제(HDAC) 저해제인 trichostatin A(TSA)에 의해 급격히 증가되었으나, BIX02189는 이러한 프로모터 활성을 저해하는 것으로 나타났다(도 4A 참조).

이러한 결과는, ERK5 저해제가 smad3의 아세틸화를 저해함으로써 TGF-β1에 의해 유도된 TGF-β1-Smad3의 신호전달 경로를 차단하는 것을 나타내는바, 본 발명자들은 Smad3로 형질 전환된 세포에 BIX02189를 전처리하고, TGF-β1으로 자극한 경우, Smad3의 아세틸화를 측정하였다.

이를 위하여, A549 세포에 FLAG-Smad3를 형질전환하고 24시간이 지난 뒤 형질전환 된 세포들에 BIX02189를 1시간동안 전처리하였으며, TGF-β1을 각각 30분, 60분, 2시간 동안 처리하여 배양하였다. 상기 배양된 세포를 용해시키고, 그 용해물에 항-Flag 항체 또는 대조군 IgG 항체를 이용하여 4℃에서 밤새 반응시킨 후, Protein A/G 비드를 이용하여 면역침강하고, 아세틸-라이신(acetyl-lysine) 항체로 블라팅하였다. 총 세포 용해물로부터 Smad3의 양을 면역블라팅으로 분석하였다.

그 결과, 본 발명자들은 TGF-β1에 의해 유도된 Smad3의 아세틸화가 BIX02189에 의해 현저히 저해되는 것을 확인할 수 있었다(도 4B).

한편, Smad3의 378번째 아미노산인 Lysine(K378)이 Smad3의 전사 조절 기능에 중요하다고 알려져 있는바, 본 발명자들은 ERK5가 Smad3의 K378의 아세틸화를 조절하는지 확인해 보았다.

이를 위하여 HEK 293세포에 GAL4 결합된 야생형 Smad3(Smad3 WT) 또는 Smad3 K378R과 GAL-4Luc를 함께 형질전환시켰다, 그 후, pERK5, pCA-MEK5α, p300 존부에 따른 Smad3의 전사 활성을 루시퍼라제로 분석하였다.

그 결과, p300이 Smad3의 전사 활성을 유도하고, CA-MEK5α-ERK5가 야생형 Smad3와 함께 형질전환된 경우 이러한 전사 활성이 더욱 증가되었으나, 돌연변이형인 Smad3 K378R에서는 이러한 활성이 나타나지 않는 것으로 확인되었다(도 4C 참조).

한편, Smad3의 MH1 도메인도 p300에 의해 아세틸화 되는 것으로 알려져 있는바, 본 발명자들은 Smad3의 MH1 도메인이 결손된 Smad3(Smad3 LC)를 이용하여 ERK5가 Smad3의 MH1 도메인을 아세틸화하는지 살펴보았다.

그 결과, 야생형 Smad3에서 p300은 Smad3의 전사활성을 유도하였고, CA-MEK5α-ERK5는 Smad3의 전사 활성을 더욱 증가시켰으며, 이러한 경향은 MH1 도메인이 결손된 돌연변이형 Smad3에서도 동일하게 관찰되었다(도 4D).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 ERK5가 TGFβ-Smad3 신호 전달 경로에서 Smad3의 K378 아미노산의 아세틸화를 유도함으로써 그 활성을 조절한다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

ERK5 억제제에 의한 폐섬유증 유도 동물군의 폐섬유화 치료 효과 관찰

본 발명자들은 실제로 ERK5 억제가 폐섬유증의 치료에 효과가 있는지를 알아보기 위하여 동물 실험을 진행하였다.

<5-1> 동물모델 제작

BIX02189의 폐섬유화 치료 효과를 분석하기 위하여 마우스 동물모델은 SPF(specific pathogen free) C57BL/6 마우스를 Samtaco(한국, 서울)에서 구입하여 제작하였으며, 마우스(체중 25-30g)의 기도 내로 블레오마이신을 투여(1.5 또는 3 unit/kg body weight in 50㎕ saline)하여 폐섬유증 유도하였다. ERK5 억제제인 BIX02189의 폐섬유화 억제 효과를 확인하기 위하여 실험군에 블레오마이신 투여 2시간 전 및 블레오마이신 투여 후 매일 1회 BIX02189(10mg/kg body weight in 100㎕ saline)을 복강 내로 투여하였다.

<5-2> 조직학적 분석

BIX02189의 폐섬유화 치료 효과를 관찰하기 위하여 상기 동물모델에 BIX02189를 2주간 투여한 후, 폐 조직을 분석해 보았다.

이를 위하여 폐 조직은 10%의 버퍼의 포름알데하이드와 파라핀으로 고정하였으며, 5㎛의 크기로 잘라 헤마톡시린 & 에오신(H&E) 및 MTC 염색한 후, Axiover 200(Zeiss)를 이용하여 관찰하였다.

그 결과, BIO02189이 블레이마이신에 의해 유도된 폐 조직의 섬유화 및 콜라겐 축적을 현저히 억제하는 것으로 확인되었다(도 5A, 도 5B 참조).

<5-3> PAI -1, CTGF , COL1A2 , COL3A1 의 mRNA 발현양 조사

또한, 본 발명자들은 BIX02189에 의해 ECM의 mRNA 발현양이 어떻게 변화되는지 관찰해 보았다.

이를 위하여 상기 2주간 BIX02189를 투여한 마우스의 폐로부터 총RNA를 추출하였으며, PAI-1, CTGF, COL1A2 및 COL3A1의 mRNA 발현은 상기 실시예 1-2에 기재된 방법과 동일하게 qRT-PCR을 이용하였다. 본 발명에서 사용한 프라이머 서열은 하기 표 3과 같다.

그 결과, BIX02189를 투여한 마우스에서 블레오마이신 처리에 의해 증가된 타입1, 타입3 콜라겐, 섬유화 유전자인 PAI-1, CTGF의 mRNA 발현양이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 ERK5의 저해가 in vitro 상에서 섬유화 관련된 신호전달 경로를 차단할 뿐 아니라, 실제로 마우스에서 폐 섬유화를 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6>

ERK5 억제제에 의한 폐섬유증 유도 동물군의 생존률 측정

상기 실시예 1 내지 4의 결과로부터 ERK5 저해제는 Smad3의 아세틸화를 저해하여 TGF-β1-Smad3 신호전달계를 차단하는 것을 알 수 있었다. 이러한 기전은 실제 블레오마이신으로 폐 섬유화가 유도된 동물 모델에서도 적용되는 것으로 상기 실시예 4를 통해 확인되었다. 따라서, 본 발명자들은 ERK5 저해제가 블레오마이신에 의해 폐 섬유화가 유도되어 사망하는 마우스 사망률에 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보고자 하였다.

상기 실시예 5의 마우스 모델의 2 주간 생존율을 관찰해 본 결과, BIX02189 처리한 마우스의 경우 블레오마이신 처리에 의한 마우스 사망률을 개선하는 효과가 있음이 확인되었다(도 6 참조).

상기와 같은 실시예들을 통하여 BIX02189는 ERK5의 TGF-β1-Smad3 신호전달 체계를 억제하여 폐섬유증을 예방 및 치료할 수 있는 신규한 치료제로서 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물;
[화학식 1]

.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 ERK5 또는 MEK5 억제제인 것을 특징으로 하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 TGF-β1에 의해 유도되는 세포외 기질 분자 또는 전섬유화(profibrotic) 유전자의 발현을 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 세포외 기질 분자는 피브로넥틴(fibronectin) 또는 타입 1 콜라겐(type 1 collagen)이고, 상기 전섬유화(profibrotic) 유전자는 PAI-1(type 1 plasminogen activator inhibitor) 또는 CTGF(connective tissue growth factor)인 것을 특징으로 하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 TGF-β1에 의해 유도된 Smad3의 전사 활성을 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 TGF-β1에 의해 유도된 Smad3의 아세틸화를 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 조성물은 Smad3의 378번 아미노산의 아세틸화를 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 폐섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제