TW201625788A - 基質金屬蛋白酶７（ｍｍｐ－７）聚集體之單體化方法 - Google Patents

基質金屬蛋白酶７（ｍｍｐ－７）聚集體之單體化方法 Download PDF

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Abstract

提供一種MMP-7聚集體之單體化方法。MMP-7單體化方法係包含將MMP-7聚集體以含有低濃度的1價陽離子氯化物(氯化鈉、氯化鉀等)的緩衝液，或者是不含有1價陽離子氯化物之相同緩衝液進行處理。本發明亦提供併入該單體化方法之MMP-7製造方法及含有經溶解於前述緩衝液之MMP-7之(醫藥)組成物。調製含有低濃度MMP-7之(醫藥)組成物時，使用經添加糖醇或糖類之上述緩衝液。

Description

基質金屬蛋白酶7(MMP-7)聚集體之單體化方法
本發明乃有關基質金屬蛋白酶7(下文稱作「MMP-7」)聚集體之單體化方法。詳細而言，係關於包含將MMP-7聚集體於含有低濃度的1價陽離子化合物溶液，或者是未含該化合物之相同溶液中進行處理的MMP-7單體化方法、併入該單體化方法的MMP-7製造方法以及於前述溶液中進一步溶解糖醇或糖類之含MMP-7的(醫藥)組成物。
MMP-7係屬於活性部位具有鋅分子之鋅型基質金屬蛋白酶家族之基質金屬蛋白酶之一者(下文稱作「MMP」)(參照非專利文獻1)。MMP係作為前驅物被生成，細胞外分泌時，經訊號序列加工，隨後前序列經加工成為活性型。相對於經分泌至細胞外的MMP負責細胞基質的代謝，報告指出MMP-7主要由癌細胞分泌，與浸潤、轉移有關(參照非專利文獻2)。MMP-7不具有其他多數MMP所具有之絞鏈、類血紅素蛋白域，在MMP中係以包含最少的分子單位之構成膠原或細胞外基質的成分(纖維黏連 蛋白、玻璃黏連蛋白、層黏連蛋白、蛋白聚醣)作為基質。
根據MMP-7係以軟骨組織的主成分蛋白聚醣作為基質及來自椎間盤突出的手術檢體中的巨噬細胞表現MMP-7(參照非專利文獻3)等事實，推測MMP-7與突出塊的自然削減有關。隨後，波呂等人觀察到於椎間盤突出的狗的椎間盤投藥MMP-7，椎間盤突出髓核的體積減小，顯示作為椎間盤突出治療藥的可能性(參照非專利文獻4)。雖然期望MMP-7作為醫藥品的開發，然而MMP-7在活體中僅以微量存在，由活體分離純化MMP-7極為困難，且使用活體成分時，有潛在性病毒汙染等安全方面的問題之疑慮。雖然MMP-7亦可自癌細胞取得，然而癌細胞作為製造株係不適合(參照非專利文獻5)。
為解決上述之問題，係嘗試以基因重組技術的方式取得MMP-7。相關報告如下：在中國倉鼠卵巢細胞(CHO)細胞中表現MMP-7之Barnett等人的報告(參照非專利文獻6)；藉由使用將鹼性磷酸酶的訊息序列的鹼基序列及大腸菌的密碼子使用頻率經最適化之原基質金屬蛋白酶7(下文稱作proMMP-7)的基因序列予以連結的核酸片段，而表現在34℃係可溶性的proMMP-7，在42℃係不可溶性的proMMP-7的報告(參照專利文獻1)；以及藉由使用將改變型訊息肽及proMMP-7的基因序列予以連結的核酸片段，係作為內含體大量地表現的報告(參照專利文獻2)等。
報告指出自proMMP-7至活性型MMP-7的 轉換，係在1mM(4-胺基苯基)醋酸汞(APMA)或者是0.2μM胰蛋白酶存在下，於37℃保溫的方法及/或將含有proMMP-7的溶液於53℃保溫的方法的報告(參照非專利文獻7)，由該等報告可知，經活性化的低濃度(1mg/ml以下)的MMP-7(別名Matrilysin)在-20℃保存6個月的情況及在室溫保存28天的情況，其活性及電泳不會產生變化。關於此變化並無明確的記載，然而從電泳的結果認為暗示未見到Matrilysin的分解。除此之外，關於proMMP-7或MMP-7的純化，以Kihira,Oneda等人的方法(參照專利文獻1及非專利文獻8)為開端亦有各式相關的報告，達到實驗層級之規定的MMP-7的純化方法已被確立。一般而言，係將實驗層級的MMP-7純化方法的規模放大而進行大量生產。然而，大量地製造MMP-7的方法，難以說已被確立，且幾乎未見關於MMP-7大量製造的問題點或解決方法的報告。
又，關於含有MMP-7的組成物，已有包含三(羥甲基)胺基甲烷鹽酸鹽(托利斯(Tris)-HCl)、氯化鈣及氯化鈉者的報告(參照專利文獻3至5及非專利文獻7至9)；已知如同MMP-7的金屬蛋白酶為溶液組成物時，藉由在氯化鈣及氯化鈉的共存下而安定化(參照專利文獻6)。特別是醫藥品主要的安全性觀點係使其接近一般體液的滲透壓，氯化鈉一般而言作為溶液組成物的滲透壓調整劑，但實際於此等文獻所揭示的組成物，幾乎係以與體液等張或以上的濃度含有以氯化鈉為主的1價陽離子化合物者。又，於此等文獻所揭示的組成物，不含糖醇或者是糖類。
[先前技術文獻] (專利文獻)
專利文獻1：日本專利第2938352號公報
專利文獻2：WO 2010/047347A1號公報
專利文獻3：特開2000-344672號公報
專利文獻4：特開2000-226329號公報
專利文獻5：特開2002-173424號公報
專利文獻6：特開2005-6509號公報
(非專利文獻)
非專利文獻1：Soler et al., Biochem Biophys Res Commun, 1994, vol. 201, p. 917-923
非專利文獻2：Ii et al., Exp Bio Med (Maywood), 2006, vol.203, p. 20-27
非專利文獻3：Haro et al., J Spinal Disord, 1999, vol. 13, p. 245-249
非專利文獻4：Haro et al., J Orthop Res, 2005, vol.23, p. 412-419
非專利文獻5：Miyazaki et al., Cancer Research, 1990, vol.50, p. 7758-7764
非專利文獻6：Barnett et al., Protein Exp Purif, 1994, vol. 5, p.27-36
非專利文獻7：Crabbe et al., Biochemistry, 1992, vol. 31, 8500-8507
非專利文獻8：Oneda et al., J Biochem, 1999, vol. 126, 905-911
非專利文獻9：Browner et al., Biochemistry, 1995, vol. 34,6602-6610
本案發明者係在含有MMP-7之醫藥品的開發檢討過程中注意到，在過去的醫藥品製劑，特別是如同前述的金屬蛋白酶的溶液組成物，氯化鈉等1價陽離子化合物為與體液等張的150mM程度以上的情況，MMP-7會形成聚集體，以及，MMP-7會吸附於在蛋白質或其製劑的製造時通常使用之裝置中的膠體或是製劑的保存時通常使用之小瓶等容器，而以下述者為本發明之課題：提供在製造MMP-7時，對於MMP-7的製造裝置的吸附受到抑制之MMP-7聚集體的單體化方法，採用該單體化方法的MMP-7製造方法，以及MMP-7聚集體的形成與吸附受到抑制之含有MMP-7的(醫藥)組成物。
本發明者等，為解決上述課題經過精心研討的結果，係發現下述(1)至(4)以完成本發明。
(1)MMP-7聚集體係藉由以含有低濃度的1價陽離子氯化物(氯化鈉及氯化鉀等)的托利斯(Tris)緩衝液(pH6至8) 等溶液處理，解離後形成單體。在以不含1價陽離子氯化物的相同溶液進行處理時亦同樣地形成單體。
(2)藉由在MMP-7的製造步驟中併入依據上述處理之MMP-7聚集體之單體化方法(下文稱作「單體化方法」)，可提升MMP-7的製造效率。特別的是，藉由自活化將proMMP-7轉化成MMP-7立即進行的超濾膜處理步驟中併入單體化方法，藉此可獲致更大之效果。
(3)MMP-7單體係維持高的酵素活性。
(4)藉由令上述的托利斯(Tris)緩衝液含有甘露醇、乳糖等糖類或是糖醇，不僅係抑制MMP-7的聚集體形成，亦抑制MMP-7對膠體及藥瓶器壁的吸附。亦即，藉由設為在作為水溶液時含有較與體液等張的150mM左右更低濃度的1價陽離子氯化物、以及糖醇或者是糖類之組成物，可成為MMP-7的聚集體形成及吸附受到抑制的醫藥製劑。
因此，本發明係包含MMP-7聚集體之單體化方法(單體化方法)、採用單體化方法之MMP-7製造方法及以使用上述的緩衝液所調製的含有MMP-7的(醫藥)組成物，如下所述：
(1)一種基質金屬蛋白酶7(MMP-7)聚集體之單體化方法，包括以含有130mM以下的1價陽離子化合物的溶液或不含有1價陽離子化合物的溶液處理MMP-7聚集體。
(2)如同(1)項所述之單體化方法，係以含有130mM以下的1價陽離子化合物之溶液處理MMP-7聚集體。
(3)如同(1)項所述之單體化方法，係以不含有1價陽 離子化合物之溶液處理MMP-7聚集體。
(4)如同(1)或(2)項所述之單體化方法，前述1價陽離子化合物的濃度係100mM以下。
(5)如同(1)、(2)或(4)項所述之單體化方法，前述1價陽離子化合物的濃度係80mM以下。
(6)如同(1)、(2)、(4)或(5)項所述之單體化方法，前述1價陽離子化合物的濃度係40mM以下。
(7)如同(1)、(2)、(4)、(5)或(6)項所述之單體化方法，前述1價陽離子化合物係擇自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉及磷酸鉀之所成群組。
(8)如同(1)、(2)、(4)、(5)或(6)項所述之單體化方法，前述1價陽離子化合物係源自1價陽離子氯化物。
(9)如同前述(8)項所述之單體化方法，前述1價陽離子氯化物係擇自由氯化鈉及氯化鉀之所成群組。
(10)如同(1)至(9)任一項所述之單體化方法，前述溶液係進一步含有氯化鈣。
(11)如同(10)項所述之單體化方法，前述氯化鈣的濃度係30mM以下。
(12)如同(1)至(11)任一項所述之單體化方法，前述溶液係緩衝液。
(13)如同(12)項所述之單體化方法，前述緩衝液係5至25mM的托利斯(Tris)緩衝液。
(14)如同(1)至(13)任一項所述之單體化方法，前述MMP-7的濃度係20mg/ml以下。
(15)如同(13)或(14)項所述之單體化方法，前述溶液係含有30至40mM氯化鈉及5至30mM氯化鈣之5至25mM托利斯(Tris)緩衝液(pH6至8)。
(16)如同(1)至(15)任一項所述之單體化方法，前述溶液係進一步含有糖醇及/或糖類。
(17)如同(16)項所述之單體化方法，前述糖醇及/或糖類係擇自蔗糖、乳糖、麥芽糖、木糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇及寡糖醇所成群組。
(18)如同(16)或(17)項所述之單體化方法，前述糖醇及/或糖類係2%以上。
(19)如同(18)項所述之單體化方法，前述糖醇及/或糖類係2至7%。
(20)如同(17)至(19)任一項所述之單體化方法，前述糖醇及/或糖類係甘露醇或蔗糖。
(21)如同(20)項所述之單體化方法，前述甘露醇係2至5%，前述蔗糖係2至7%。
(22)一種MMP-7之製造方法，其包含：包括如同(1)至(21)任一項所述之單體化方法之步驟。
(23)如同(22)項所述之製造方法，前述步驟係在使用含有130mM以上1價陽離子的化合物之液體之處理步驟後進行者。
(24)如同(22)或(23)項所述之製造方法，係包含下述步驟[1]至[5]：[1]破碎proMMP-7內含體產生細胞之步驟； [2]溶解/再摺疊proMMP-7內含體之步驟；[3]純化proMMP-7之步驟；[4]自活化proMMP-7成MMP-7之步驟；及[5]包含[1]至[21]中任一項所述之單體化方法之步驟。
(25)如同(24)項所述之製造方法，前述步驟[5]的步驟係使用超濾膜之濃縮步驟。
(26)含有MMP-7之(醫藥)組成物，係於含有130mM以下1價陽離子化合物之溶液或不含有1價陽離子化合物之溶液中含有基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)作為有效成分。
(27)如同(26)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，係於含有130mM以下1價陽離子化合物之溶液中含有MMP-7作為有效成分。
(28)如同(26)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，係於不含有1價陽離子化合物之溶液中含有MMP-7作為有效成分。
(29)如同(26)或(27)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述1價陽離子係擇自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉及磷酸鉀所成群組。
(30)如同(26)或(27)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述1價陽離子係源自1價陽離子氯化物。
(31)如同(30)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述1價陽離子氯化物係擇自氯化鈉及氯化鉀所成群組。
(32)如同(26)至(31)中任一項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，進一步含有氯化鈣。
(33)如同(32)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述氯化鈣之濃度係30mM以下。
(34)如同(26)至(33)中任一項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述溶液係緩衝液。
(35)如同(34)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述緩衝液係5至25mM的托利斯(Tris)緩衝液。
(36)如同(26)至(35)中任一項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述MMP-7的濃度係20mg/ml以下。
(37)如同(36)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物前述MMP-7的濃度係1μg/ml至1mg/ml。
(38)如同(35)、(36)或(37)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述溶液係含有30至40mM氯化鈉及5至30mM氯化鈣之5至25mM的托利斯(Tris)緩衝液(pH6至8)。
(39)如同(26)至(38)中任一項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述溶液係進一步含有糖醇及/或糖類。
(40)如同(39)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述糖醇及/或糖類係擇自蔗糖、乳糖、麥芽糖、木糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇及寡糖醇所成群組。
(41)如同(39)或(40)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述糖醇及/或糖類係2%以上。
(42)如同(41)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述糖醇及/或糖類係2至7%。
(43)如同(40)至(42)中任一項所述之含有MMP-7之(醫 藥)組成物，前述糖醇及/或糖類係甘露醇或蔗糖。
(44)如同(43)項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物，前述甘露醇係2至5%，前述蔗糖係2至7%。
(45)一種含有MMP-7之(醫藥)固體組成物，係可溶解於溶劑，且其溶解時之組成物係如同(26)至(44)中任一項所述之組成物。
(46)一種椎間盤突出之治療劑，係含有如同(26)至(45)中任一項所述之含有MMP-7之(醫藥)組成物。
根據本發明，係提供容易地單體化MMP-7聚集體之方法，在MMP-7的製造步驟中併入此方法，可提升MMP-7的生產性或回收效率。
又，藉由該方法經單體化的MMP-7，與MMP-7的聚集體存在相比之MMP-7酵素的比活性高，可成為用於獲得高品質的MMP-7製劑之適合的材料。
再者，本發明的一種形態，係藉由將MMP-7保存於包含低濃度氯化鈉，以及糖醇或者是糖類的緩衝液中，不僅是維持MMP-7單體的形狀，亦可維持高的酵素活性，及抑制MMP-7對於保存容器的吸附。因此，本發明之單體化方法使用之緩衝液，係有用於作為MMP-7製劑的保存液。又，本發明的MMP-7組成物作為水溶液包含低濃度的氯化鈉，以及糖醇或是糖類時，MMP-7的聚集體形成受到抑制，再者MMP-7對於容器等的吸附受到抑制，有用於作為醫藥用途的溶液組成物及其調製用組成物。
第1圖係根據動態光散射法測定之MMP-7分子量的解析結果，顯示藉由氯化鈉(NaCl)及氯化鉀(KC1)之MMP-7聚集體的形成抑制效果。
第2圖係根據動態光散射法測定之MMP-7分子量的解析結果，顯示在MMP-7聚集體的形成抑制中氯化鈣(CaCl2)之影響。
第3圖係根據尺寸篩析層析法測定之MMP-7分子量的解析結果，顯示在MMP-7聚集體形成中MMP-7濃度的影響。
第4圖係顯示將0.1mg/ml、2mg/ml、20mg/ml的各MMP-7以含有150mM氯化鈉(NaCl)或40mM氯化鈉的托利斯(Tris)緩衝液稀釋時，該濃度的氯化鈉對MMP-7酵素活性之影響。
第5圖係顯示藉由甘露醇之MMP-7對膠體之吸附抑制效果。A：5mM托利斯(Tris)緩衝液/10mMCaCl2/40mMNaCl，B：5mM托利斯(Tris)緩衝液/10mM CaCl2/40mMNaCl/3.5%甘露醇。
第6圖係顯示藉由甘露醇及蔗糖之MMP-7對藥瓶器壁之吸附抑制效果。
第7圖係顯示於各濃度的甘露醇及蔗糖之MMP-7對藥瓶器壁的吸附抑制效果。
第8圖係顯示於各濃度的甘露醇及蔗糖之MMP-7酵素 活性之影響。
第9圖係顯示在MMP-7聚集體的形成抑制中甘露醇的影響。
本發明係提供MMP-7聚集體之單體化方法、經併入該單體化方法之MMP-7製造方法及含有MMP-7之(醫藥)組成物，特徵為MMP-7聚集體以含有低濃度1價陽離子化合物、進一步之糖醇或糖類之溶液(下文亦稱作「單體化用溶液」)處理、同溶液中保存MMP-7及作為水溶液之含有低濃度的1價陽離子化合物以及糖醇或糖類之MMP-7組成物。
MMP-7的檢驗係使用動態光散射法、尺寸篩析層析法、超高速離心分析法等方法，測定MMP-7的分子量，與由胺基酸序列求得之MMP-7單體的分子量(約19kDa)進行比較。本發明中，以動態光散射法所測定試樣中的分子量顯示為19kDa至38kDa之間的數值時，判定MMP-7以單體存在，顯示為38kDa以上的數值時，判定MMP-7形成聚集體。上述的判定基準，由於係考量藉由動態光散射法之測定值的正確性，顯示為二聚體以上的值時判定係形成聚集體，較此值小時為單體。
MMP-7之單體化，係藉由以單體化用溶液處理MMP-7聚集體而進行。本發明中，「以單體化用溶液處理MMP-7聚集體」，意指包含將MMP-7聚集體暴露於單體化用溶液中，以該溶液溶解。又包含，MMP-7聚集體係 溶解於含有超過130mM之高濃度陽離子化合物之溶液時，用單體化溶液以超濾膜或透析膜等進行緩衝液交換。作為用於保持該單體化用溶液的pH固定的緩衝劑，可使用托利斯(Tris)緩衝液、磷酸緩衝液、甘胺酸緩衝液及碳酸鹽緩衝液等。可由其等之中適合的選擇與進行單體化處理時的pH相符。該緩衝液的濃度係5至25mM，較佳的是5至20mM的範圍。pH係5至9，較佳的是6至8的範圍。更較佳的是選擇發揮金屬蛋白酶安定性提升效果的托利斯(Tris)緩衝液，該托利斯(Tris)緩衝液的濃度係5至10mM，pH係6至8的範圍(參照特表2011-521906)。
本發明的「1價陽離子化合物」意指包含1價陽離子與陰離子配對的化合物，例如，可列舉：氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉及磷酸鉀等。又，「1價陽離子氯化物」意指包含1價陽離子與氯化物離子的化合物，1價陽離子氯化物的情況，例如，本發明中使用的1價陽離子化合物使用任意者皆可，然較適合的是使用1價陽離子氯化物。具體而言係氯化鈉及氯化鉀，最適合的係氯化鈉。
為使MMP-7聚集體解離成單體係使用低濃度的1價陽離子化合物。解離成單體的MMP-7，在含有低濃度的1價陽離子化合物的單體化用溶液中維持單體。使用不含有1價陽離子化合物的單體化用溶液及水等液時亦可得相同效果。因此，本發明亦包含使用不含有1價陽離子化合物的單體化用溶液(本發明中，該單體化用溶液包含 水等液體)之MMP-7聚集體單體化方法。下文，含有低濃度的1價陽離子化合物的溶液及不含有1價陽離子化合物的相同溶液亦簡稱為「單體化用溶液」。
單體化用溶液中，藉由添加多價陽離子化合物，可擴大1價陽離子化合物處理濃度的範圍。較佳的是2價陽離子化合物，更較佳的是2價鈣離子化合物，最佳的是氯化鈣。又，「多價陽離子化合物」和上述1價陽離子化合物相同，意指包含多價陽離子和陰離子配對的化合物。
具體而言，使用水作為單體化用溶液時，使用40mM以下的1價陽離子化合物，藉由於單體化用溶液中添加氯化鈣，可以含有40mM以上的1價陽離子化合物的單體化用溶液處理。較具體而言，可使用含有5mM至10mM氯化鈣時80mM以下的1價陽離子化合物，含有10mM至30mM氯化鈣時100mM以下的1價陽離子化合物及含有30mM氯化鈣時130mM以下的1價陽離子化合物之單體化用溶液。其結果係顯示，藉由氯化鈣的添加，MMP-7聚集體解離成單體的效果及抑制MMP-7單體的聚集體形成的效果增強。又，依據實施例2的結果(第2圖)，可知本效果係和氯化鈣之濃度成比例關係。亦即，依照使用高濃度的氯化鈣，可預期對MMP-7的單體化及MMP-7單體的維持具更大之效果。根據上述，作為1價陽離子化合物的濃度，在水溶液的情況係130mM以下，較佳是100mM以下，更較佳是80mM以下，最佳是40mM以下。又，雖可為不 含有一價陽離子化合物，以作為醫藥組成物時的品質的觀點而言，較佳是含有者。
本發明中，較佳使用含有30至40mM氯化鈉及5至30mM氯化鈣之包含托利斯(Tris)緩衝液(pH6至8)的單體化用溶液，又較佳的是使用去除氯化鈉的相同單體化用溶液。
本發明的MMP-7聚集體之單體化方法，為了效率更好、製造高品質的MMP-7單體，可併入於MMP-7的製造步驟。藉由基因重組技術所得之MMP-7的一般製造方法係藉由菌體的培養、內含體的放出、內含體的溶解及再摺疊、proMMP-7的純化、藉由自活化之proMMP-7成為MMP-7的轉換、MMP-7的純化及濃縮等步驟而進行。
更具體的係使用下述的MMP-7的製造步驟。首先，製備產生proMMP-7的大腸桿菌。一般而言，根據常規方法可將經插入proMMP-7基因的載體導入大腸桿菌而製備。然而，因proMMP-7對大腸桿菌具強烈毒性，生產效率極低。雖然為解決此問題而進行於proMMP-7的N末端附加訊息肽等加工，然而於proMMP-7的情況，僅於附加訊息肽，proMMP-7的表現量未上升，且確認所表現之一部分的MMP-7被蛋白酶分解的現象。該等現象係效率的MMP-7製造方法的確立的妨礙。因此，較佳於MMP-7製造的原料使用proMMP-7的表現量增大或藉由蛋白酶的proMMP-7的分解抑制效果經增強之產生proMMP-7的大腸桿菌。上述產生proMMP-7的大腸桿菌係可參照WO2010/ 047347所記載之方法調製(更具體地，係參照調製例)。
依上述而得之產生proMMP-7的大腸桿菌係經反覆選殖(cloning)純化後作為工作細胞庫(working cell bank)保存，使用作為MMP-7製劑化用的大量培養的種菌。作為工作細胞庫的保存液，通常，於重組大腸桿菌的保存所使用的條件，例如，於包含7至10%的二甲亞碸及含有10至50%甘油的溶液中，保存於-80至-20℃的冷凍庫或液態氮中，或是於安瓿內凍結乾燥後保存於2至10℃的冷藏室。
於產生proMMp-7的大腸桿菌之製造規模的培養，係以小規模的前培養及以大規模的主培養的2階段進行。前培養時，產生proMMP-7的大腸桿菌的增殖雖可使用重組大腸桿菌使用之一般的LB培養基(為保有質體有添加胺苄青黴素等抗生素的情況)，於主培養時，較佳使用經盡量排除為副作用原因的物質的培養基。作為該等培養基，例如，可列舉包含各種微量金屬(鎂、鈣、銅、鈉等)的葡萄糖培養基、LB培養基、M9培養基等。作為培養條件，使用適合大腸桿菌增殖的範圍，例如，可能係pH(pH6至8)、溫度(30至45℃)、時間(4至16小時)的培養條件。上述的條件係根據培養規模或誘導表現的處理等而適當地調整。為有效率地進行proMMP-7的表現而使用表現誘導劑，作為該表現誘導劑可列舉異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)、乳糖等。
由主培養經大量地培養、增殖的產生proMMP-7 的大腸桿菌回收MMP-7係採用以下的方法。。首先，以適當方法將產生proMMP-7的大腸桿菌使經培養、增殖的菌體破碎，令包含proMMP-7的內含體釋出於菌體外。菌體的破碎係採用藉由以化學物質(例如，作為螯合劑的EDTA)、界面活性劑(例如，采酮(Triton)X100)、酵素(例如，溶菌酶)等予以溶解的方法以及法式壓碎機或超音波處理等物理處理的方法，上述任一方法皆適合。藉由將上述數種方法組合，可更有效率地破碎菌體。藉由將含有內含體的破碎液以超濾膜截留或離心分離、重複濃縮及洗淨將大部分的菌體成分去除。洗淨係使用托利斯(Tris)緩衝液、磷酸鹽緩衝液、甘胺酸緩衝液、碳酸鹽緩衝液等一般的緩衝液。又，超濾膜的孔徑或離心分離的條件已被多數報告，可參考該等條件。大量處理時較佳的是以超濾膜回收內含體。
回收的內含體係一旦置於含有還原劑及變性劑的溶液中將溶解。作為如此的還原劑係可使用半胱氨酸、穀胱甘肽、二硫蘇糖醇及2-巰基乙醇等。上述亦可數種組合使用。還原劑的濃度係依據溶解內含體的量，於10至200mM的範圍使用。作為變性劑，可使用尿素、胍鹽酸鹽等。該等尿素及胍鹽酸鹽，分別於4至8M及2至6M的濃度範圍使用。又，作為緩衝液，係與內含體回收使用者為相同的緩衝液，例如，使用磷酸鹽緩衝液或托利斯(Tris)緩衝液(pH7.0至9)。溶解時的溫度係40℃以下不必特別的限制。溶解時間可視內含體的溶解狀況設定，通常，攪拌 30分鐘至1小時。
其次，內含體的溶解液中，藉由添加含有界面活性劑、金屬離子的再摺疊緩衝液，可進行proMMP-7的再摺疊，亦即正常立體構造的構築。此時使用作為界面活性劑的Brij-35、作為金屬離子的乙酸鋅、氯化鈷等，個別於0.5至2%及0.05mM至0.2mM的濃度範圍使用。再摺疊時的緩衝液的種類及濃度係可使用溶解內含體時之相同者。再摺疊處理係藉由靜置一天以上而進行。
自再摺疊溶液中純化proMMP-7時，一般使用在蛋白質化學使用的純化方法，例如，組合使用離心分離、鹽析法、超過濾法、等電點沉澱法、電泳法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法、親和層析法、疏水層析法、羥基磷灰石層析法等方法。本發明的proMMP-7可藉由使用包含離子交換層析、疏水層析及超濾膜處理的步驟而純化。兩層析可照常規進行。所得之蛋白質或多肽的量，使用BCA蛋白質定量分析試劑套組(Pierce Biotechnology,Inc)、蛋白質定量分析套組(BIO-RAD,Inc)等蛋白質測定試劑測定。
其次，進行proMMP-7成為MMP-7的轉換。作為轉換方法係可列舉將含有proMMP-7的溶液在1mM(4-胺基苯基)醋酸汞(APMA)或0.2μM胰蛋白酶存在下，保溫於37℃的方法或是將含有proMMP-7的溶液保溫於53℃的方法(Crabbe等，Biochemistry,1992,vol.31,8500-8507)，任一方法皆可使用。此時，添加30至200mM的氯化鈉(Crabbe 等，Biochemistry,1992,vol.31,8500-8507、WO 2010/047347 A1)。保溫時間可於1至5小時的範圍進行，依照試劑及proMMP-7的濃度或處理量等適當調整。胰蛋白酶係使用經N-甲苯磺醯基-L-苯丙胺酸氯甲基酮(TPCK)處理者。
作為測定MMP-7的酵素活性的方法，有藉由螢光測定裝置測定螢光基質(Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Try-Ala-D-Arg-NH2；序列編號7)經由MMP-7切斷之方法(Crabbe等，Biochemistry,1992,vol.31,8500-8507)。實際上，上述原理係基於市售之MMP-7活性測定套組(ANASPEC公司)，使用該套組，依照附帶的操作指南進行活性測定。使用上述的蛋白質純化方法，自proMMP-7中分離純化轉換後之MMP-7。
轉換後之MMP-7在高鹽濃度的溶液中形成聚集體，MMP-7的溶液中的濃度係1mg/ml以上時此傾向強烈。MMP-7聚集體的存在，係與MMP-7的製造、製劑化中的生產性或品質低下相關連。如前述，氯化鈣的共存下，在含有130mM以下的1價陽離子化合物的單體化用溶液中，MMP-7聚集體單體化，並維持作為MMP-7單體，然而，在含有超過130mM的1價陽離子化合物的溶液中，顯示形成MMP-7聚集體的可能性高。因此，藉由在130mM以上的1價陽離子化合物處理步驟後併入本發明的單體化方法。更具體而言，較佳的是在藉由proMMP-7自活化轉換為MMP-7後立即併入。
以本發明的單體化方法的處理，較佳的是 針對20mg/ml以下的MMP-7進行，處理20mg/ml以上的MMP-7時，如前述，藉由調節氯化鈣的濃度，可期待同樣的MMP-7聚集體形成抑制效果。
由此而得之含有MMP-7單體的溶液，根據必要，經過藉由超濾膜等MMP-7的純化及濃縮步驟而成為製劑化的原料。在上述步驟中，使用本發明的單體化用溶液。一旦，經單體化之MMP-7只要保存於單體化用溶液中，將維持作為單體，且，歷經長期亦不會確認酵素活性的降低。因此，本發明的單體化用溶液，藉由於製劑化前MMP-7的保存及含有MMP-7作為有效成分之(醫藥)組成物的製造時使用，可維持高品質的MMP-7。
本發明的MMP-7聚集體之單體化方法及經併入該單體化方法的MMP-7製造方法中，糖醇或糖類係具有對MMP-7製造中常用之膠體的吸附抑制效果及對製劑化中使用之藥瓶等的器壁的吸附抑制效果。作為該等糖醇及糖類，可列舉蔗糖、乳糖、麥芽糖、木糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、低聚糖醇等。較佳的是甘露醇及蔗糖，特別較佳的是甘露醇。
製劑化低濃度(例如，1μg/ml至1mg/ml)的MMP-7時，由於推定MMP-7對藥瓶器壁的吸附為損失，因此使單體化用溶液含有上述糖醇或糖類係特別有效。針對MMP-7，添加顯示對藥瓶器壁的吸附阻止效果之2%以上，較佳的是於體內滲透壓的可調節範圍之2至7%的糖醇或糖類。在本發明中，較佳的是使用可維持MMP-7活性之 經添加2至5%的甘露醇或2至7%的蔗糖之單體化用溶液。更較佳係使用含有2至5%甘露醇、30至40mM氯化鈉及5至30mM氯化鈣，且包含5至25mM托利斯(Tris)緩衝液。
經溶解在該單體化用溶液中的MMP-7，可直接使用作為本發明的含有MMP-7的(醫藥)組成物，由MMP-7的聚集體形成抑制、MMP-7的活性維持、MMP-7對容器等的吸附抑制、作為醫藥水溶液組成物的品質確保等觀點而言，含有MMP-7的(醫藥)組成物，較佳係含有2%以上的糖醇及/或糖類與30至40mM的1價陽離子化合物(氯化鈉或氯化鉀)者。更具體而言，MMP-7的濃度係20mg/ml以下時，本發明的含有MMP-7的(醫藥)組成物較佳的是含有2至5%甘露醇或2至7%的蔗糖、30至40mM氯化鈉及5至30mM氯化鈣者。本發明的含有MMP-7的(醫藥)組成物，可為液狀、凍結乾燥或凍結後保存。此時，為維持作為含有MMP-7的(醫藥)組成物的安定性或等張性，追加的添加安定劑、等張劑及保存劑等容許對人或其他動物投藥的化合物。本發明的含有MMP-7的(醫藥)組成物，包含於溶劑中可溶解而得該溶解時的組成物係為上述之本發明的液體之含有MMP-7的(醫藥)組成物所成之固體組成物。該固體組成物係將本發明的液體之含有MMP-7的(醫藥)組成物藉由凍結乾燥等去除溶劑而可得。溶劑係在醫藥品添加物辭典中作為溶劑者，可列舉水、乙醇等。
由此而得之本發明的含有MMP-7的(醫藥) 組成物，係具有MMP-7聚集體形成或吸附經抑制之特異性MMP-7的酵素活性者，可使用作為椎間盤突出的治療藥或診斷藥者。
以下，根據實施例，本發明進行更詳細的說明，但不限定為下述實施例。
《調製例》
(1)具有APSP之proMMP-7表現載體(pETMMP7)之構築
於腎臟的cDNA庫(HumanMTC Panel I,Catalog#：K1420-1,BD公司)使用引子P1(序列編號1)及P2(序列編號2)，以聚合酶連鎖反應(PCR)擴增proMMP-7基因。經擴增之DNA插入選殖載體(pCRII-TOPO,Invitrogen)並確認所得之DNA的鹼基序列。鹼基序列的確認係使用DNA定序儀進行。該鹼基序列與數據庫(Accession Numbers：NM002423)中登錄之proMMP-7核苷酸序列進行同源性檢索，獲得經插入proMMP-7基因的質體(pCRproMMP-7)。
其次，以pCRproMMP-7為模板，使用包含編碼限制酵素NdeI辨識序列、PhoA-鹼性磷酸酶訊息肽(APSP)序列的鹼基序列及編碼proMMP-7的N末端序列的鹼基序列之引子P3(序列編號3)，以及包含編碼限制酵素BamHI辨識序列及proMMP-7的C末端序列的鹼基序列的引子P4(序列編號4)，進行PCR。與上述同樣方式將經擴增的DNA插入選殖載體，確定所得DNA的鹼基序列。確 定鹼基序列中無變異後，所得質體，以限制酵素NdeI及BamHI切斷，插入至預先以相同的限制酵素切斷的表現載體pET22b表現載體(默克公司，產品編號：69744-3)中，獲得經插入proMMP-7基因之質體(pETMMP7)。
(2)具有改變型APSP之表現載體pETMMP7(L13P-A21E)之構築及表現
使用GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司)，依照附帶的操作指南，在依上述(1)獲得之pETMMP7的APSP序列(Met-Lys-Gln-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-Phe-THr-Pro-Val-Thr-Lys-Ala；序列編號8)的訊息肽酶辨認部位導入變異(將APSP序列所示胺基酸序列的第13個亮胺酸(Leu)置換成脯胺酸(Pro)；第21個丙胺酸置換成谷胺酸(Glu))。APSP的改變，係使用M2(序列編號5)作為5’端引子及P6(序列編號6)的序列作為3’端引子。以所得之具有改變型APSP之pETMMP7(L13P-A21E)轉形大腸桿菌(BL21(DE3))中，獲得表現proMMP-7之重組大腸桿菌(MMP7L13P-A21E)。
表現誘導係使用Overnight Express Autoinduction System 1(默克公司，產品編號71300-3)，依照附帶的操作指南進行。簡單而言，將125mL的三角燒瓶中之含有50μg/mL氨芐青黴素(和光純藥工業股份有限公司)的LB培養基50mL中懸浮各純株，加入套組的試劑，以37℃培養16小時。測定該菌體液的OD600nm，OD600nm等於20時將相當於1mL的菌體藉由離心分離而回收沉澱物。沉澱物 以200μL的BugBuster進行破碎，藉由離心分離而獲得沉澱物。沉澱物以SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)用的Sample Buffer可溶化，施用至15%丙烯醯胺凝膠SDS-PAGE，並進行考馬斯亮藍染色(CBB染色)。其結果，確認proMMP-7表現量的增加及分解的抑制效果的增強。
在本調製例係使用含有以下序列的引子。
P1：ccataggtcc aagaacaatt gtctctg(序列編號1)
P2：caatccaatg aatgaatgaa tggatg(序列編號2)
P3：catatgaaac aaagcactat tgcactggca ctcttaccgt tactgtttac ccctgtgacc aaggccctgc cgctgcctca g(序列編號3)
P4：ggatccctat ttctttcttg aattac(序列編號4)
M2：ctgtttaccc ctgtgaccaa ggaactgccg ctgcc(序列編號5)
P6：cttggtcaca ggggtaaaca gtggcggtaa gag(序列編號6)
[實施例1] 《藉由1價陽離子氯化物之MMP-7聚集體的形成抑制效果》 (1)MMP-7的製造
由調製例所記載的方法而得之產生proMMP-7的大腸桿菌(MMP7L13P-A21E菌)作為菌種，培養、增殖於葡萄糖培養基，以異丙基-β-半乳糖苷(IPTG)進行proMMP-7的表現誘導。自培養液回收菌體，以法式壓碎機破碎。將該破碎液離心分離，回收沉澱之內含體。其次，內含體在含有0.1MTris-HCl(pH7.5)及0.1M二硫蘇糖醇的6M胍鹽酸鹽中 溶解，於含有0.1mM醋酸鋅、10mM氯化鈣、0.2M氯化鈉及1.0% Brij35的50mM HEPES緩衝液(pH7.5)中再摺疊後，根據常法，proMM-7以離子交換層析和疏水層析進行純化。所得之proMMP-7於47至48℃加熱處理進行自活化，獲得MMP-7。所得之MMP-7，使用含有40mMNaCl、10mMCaCl2及3.5%甘露醇的5mMTris緩衝液(pH7)，以超濾膜反覆進行稀釋及濃縮，保存於-80℃。
(2)MMP-7聚集體的測定
上述(1)所得之高濃度的MMP-7溶液，以含有5mM氯化鈣(CaCl2)的水中經溶解氯化鈉(NaCl)或氯化鉀(KCl)之溶液稀釋，調製試樣1和試樣2。
試樣1：1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/各濃度NaCl(10至160mM)
試樣2：1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/各濃度KCl(10至160mM)
MMP-7聚集體的形成中氯化鈉及氯化鉀的影響，係將100μl的上述各試樣使用動態光散射法(機器：Wyatt Technology Dynapro(Protein Solutions)Titan、樣品槽：Wyatt Technology 12μL Cell 8.5mm Centre Height、測定溫度：20℃)研究。測定、解析各試樣中的MMP-7的分子量，根據MMP-7單體的分子量(約19kDa)，分子量係38kDa以下時判定為單體。其結果，10至80mMNaCL溶液中，MMP-7的分子量係20至29kDa，確認係作為單體存在。 使用氯化鉀時亦同樣地得到在10至80mMKCl溶液中以單體存在的結果(第1圖)。圖中的虛線係表示分子量38kDa。
[實施例2] 《MMP-7聚集體的形成抑制中氯化鈣的影響》
實施例1-(1)所得之MMP-7溶液，以水中經溶解氯化鈣及氯化鈉的溶液稀釋，調製試樣3。
試樣3：1mg/ml MMP-7/各濃度CaCl2(0至30mM)/各濃度NaCl(0至160mM)
各濃度的氯化鈣存在下，對MMP-7聚集體形成抑制的影響，係依照實施例1-(2)的方法研究。
其結果，在0mMCaCl2時40mM以下的NaCl、5mMCaCl2時80mM以下的NaCl、10mMCaCl2時100mM以下的NaCl、20mMCaCl2時120mM以下的NaCl及30mMCaCl2時130mM以下的NaCl時分別顯示MMP-7形成單體。又，單以水稀釋時亦確認到MMP-7單體的形成。根據上述，130mM以上的NaCl存在下形成MMP-7聚集體，然而使其與30mM以下(~30mM)的CaCl2共存時，確認MMP-7聚集體的形成受到抑制。換言之，該濃度的氯化鈣係更有效果地維持MMP-7單體，且具有使其安定化之效果。
[實施例3] 《MMP-7聚集體形成中MMP-7濃度的影響》
實施例1-(1)所得之MMP-7溶液以含有10mMCaCl2及各濃度氯化鈉的溶液稀釋，調製含有各濃度MMP-7的試樣4。
試樣4：各濃度MMP-7(10、15、20mg/ml)/10mM CaCl2/各濃度NaCl(50至250mM)
MMP-7的濃度對MMP-7聚集體形成抑制效果的影響係以尺寸篩析層析法(HPLC機器：HEWLETT PACKED系列1100，載體：TOYORARL HW50S，處理溫度：25℃，流速：0.5ml/min，檢測波長280nm)研究。管柱尺寸係使用直徑5mm、長度150mm者，管柱的平衡化係以5mM Tris-HCl(pH7)、10mMCaCl2、3.5%甘露醇中含有40至500mMNaCl的溶液進行。
在本條件，分子量60至80kDa的蛋白質係於空隙體積出現(層析開始後1.8分鐘)。因此，層析開始後2分左右的峰值(或前延峰)係MMP-7的聚集體，以該峰值的面積作為指標，計算形成MMP-7聚集體時氯化鈉的濃度。
其結果，因依賴於MMP-7濃度的氯化鈉減弱MMP-7聚集體的形成抑制效果，確認20mg/ml以下的MMP-7，在0至80mM的NaCl，MMP-7係以單體存在(第3圖)。由實施例2的結果(第2圖)可知，藉由增加氯化鈣的濃度，可維持MMP-7單體的氯化鈉濃度亦成比例性增加在本實施例使用30mMCaCl2的濃度時，推測即使於100mMNaCl存在下，20mg/ml的MMP-7係以單體存在。再 者，使用20mg/ml以上的MMP-7時，推測藉由增加氯化鈣的濃度，可維持MMP-7為單體。
將試樣4於4℃放置一晚後，進行與上述相同之實驗，可得與第3圖相同之結果。
[實施例4] 《因MMP-7聚集體的形成對酵素活性的影響》
於實施例1-(1)所得之MMP-7溶液，以含有40mMNaCl、10mMCaCl2的5mMTris緩衝液(pH7)稀釋，調製含有各濃度MMP-7的試樣5。
試樣5：各濃度MMP-7(0.1、2、20mg/ml)/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)
各濃度的MMP-7溶液，以含有150mMNaCl、10mMCaCl2的50mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)或者是含有40mMNaCl、10mMCaCl2的10mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)稀釋成0.1mg/ml後(1次稀釋)；其次，各溶液以含有150mMNaCl、10mMCaCl2的50mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)稀釋成5ng/ml(2次稀釋)；關於該等稀釋液，使用MMP-7活性測定套組(ANASPEC公司)，依照附帶之操作指南，測定對螢光基質(Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Try-Ala-D-Arg-NH2；序列編號7)的切斷活性。
其結果，在1次稀釋中以含有150mM氯化鈉的托利斯(Tris)緩衝液(pH7)稀釋成2mg/ml以上的MMP-7時，酵素活性降低(第4圖)。該酵素活性降低，與 MMP-7聚集體的形成為一致。另一方面，由於0.1mg/ml以下的濃度時未見酵素活性降低，建議該濃度的MMP-7中，至少因150mMNaCl，未發生聚集體的形成。
[實施例5] 《使用超濾膜的MMP-7濃縮步驟之氯化鈉濃度的影響》
於實施例1-(1)所得之MMP-7溶液，以含有10mMCaCl2的5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)稀釋，調製含有各濃度氯化鈉的試樣6。
試樣6：4mg/ml MMP-7/10mM CaCl2/各濃度NaCl(40mM、80mM、200mM、500mM)/5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)
試樣6各4ml使用超濾膜(Amicon Ultra-4 10K)後進行離心濃縮(2500g)，每隔一定時間間隔測定濾液的容量及濃縮液的吸光度。
其結果，係使用低濃度的氯化鈉，可於短時間濃縮MMP-7，高濃度係需要長時間濃縮(表1)。表1的(-)記號係表示濃縮結束。
[實施例6] 《甘露醇對MMP-7的吸附抑制效果》 (1)MMP-7對膠體之吸附抑制
實施例1-(1)所得之MMP-7溶液，以含有10mMCaCl2及40mMNaCl的5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)稀釋，調製試樣7。
試樣7：5.5mg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl
將1ml的試樣7，施加至事先經以含有10mMCaCl2及40mMNaCl的5mM托利斯(Tris)緩衝液平衡化的管柱(HW40F，26x6cm，TOSOH股份有限公司)，以同樣的托利斯(Tris)緩衝液洗淨後，再以含有3.5%甘露醇之相同托利斯(Tris)緩衝液進行溶出(流速5ml/min)。
其結果，吸附於膠體的MMP-7由於甘露醇而溶出(第5圖)。該結果顯示甘露醇具有MMP-7對膠體的吸附抑制效果。
(2)MMP-7對藥瓶器壁的吸附抑制
實施例1-(1)所得之MMP-7溶液，以含有10mMCaCl2、40mMNaCl及甘露醇、蔗糖的5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)稀釋，在藥瓶中調製試樣8至10的溶液(1ml)。以使各試樣的滲透壓為相同的方式調整該等的濃度。以不含有甘露醇、蔗糖的相同托利斯(Tris)緩衝液稀釋者(試樣10)作為對照組。
試樣8：50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)/3.5%甘露醇
試樣9：50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)/6.6%蔗糖
試樣10：50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)
於室溫放置3小時後，將藥瓶中的各溶液進行2階段的稀釋。1次稀釋係使用含有10mMCaCl2、40mMNaCl的5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)，2次稀釋係使用1%Block Ace(Block Ace粉末：DS Pharma Biomedical公司)/TBS-T(0.05% Tween 20/50mM Tris/150mMNaCl)。溶液中的MMP-7以酵素免疫分析法(ELISA)定量。ELISA係使用兔子以MMP-7免疫所得之兔子抗MMP-7抗體、該兔子抗MMP-7抗體以生物素標識試劑(Biotin(Long Arm)NHS-Water soluble；Vector公司)標識之生物素標識兔子抗MMP-7抗體、西洋辣根過氧化酶(HRP)標識鏈黴親合素(Horseradish Peroxidase Streptavidin,Conentrate：Vectro公司)、以及HRP基質溶液(Peroxidase Substrate Solution B：KPL公司)。作為ELISA反應的對照係使用已知濃度的MMP-7之ELISA用標準品。該MMP-7的濃度，係藉由測定吸光度而算出
其結果，相較於無添加(試樣10)，經添加甘露醇(試樣8)、蔗糖(試樣9)時，MMP-7的回收率高，確認該等的吸附抑制效果(第6圖)。
其次，調查甘露醇及蔗糖對於MMP-7對藥瓶器壁的吸附阻止的有效濃度及對MMP-7的酵素活性的影響。實施例1-(1)所得之MMP-7溶液，以含有甘露醇或蔗糖的10mMCaCl2、40mMNaCl及5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)稀釋，在藥瓶中調製試樣12至16的溶液(1ml)。以不含有甘露醇、蔗糖的相同托利斯(Tris)緩衝液稀釋者(試樣11)作為各試樣的對照組。
試樣11：50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)
試樣12：50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)/1%甘露醇
試樣13：50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)/2%甘露醇
試樣14：50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)/2%蔗糖
試樣15：50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)/5%甘露醇
試樣16：50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)/7%蔗糖
於室溫放置3小時後，藥瓶中的各溶液進行2階段的稀釋。1次稀釋係使用含有0.01% Briji35、0.01% BSA、150mMNaCl、10mMCaCl2的50mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)稀釋成5ng/ml；與實施例4相同方式測定對螢光 基質的切斷活性(MMP-7的酵素活性)。本實驗係使用由Peptide研究所取得之螢光物質(MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A2pr(Dnp)-Ala-Arg-NH2；(7-甲氧基香豆素-4-基)乙醯基-L-脯胺醯基-L-亮胺醯基甘胺醯基-L-亮胺醯基-[N β-(2,4-二硝基苯基)-L-2,3-二胺基丙醯基]-L-丙胺醯基-L-精胺酸醯胺：序列編號9)。其次，2次稀釋係使用1%Block Ace(Block Ace粉末：DS Pharma Biomedical公司)/TBS-T(0.05% Tween 20/50mM Tris/150mMNaCl)，藉由上述ELISA定量溶液中的MMP-7。
其結果，相較於無添加者(試樣11)，經添加2至5%甘露醇(試樣13、15)、2至7%蔗糖(試樣14、16)時，MMP-7的回收率高，確認該等對器壁的吸附抑制效果(第7圖)。又，藉由相同添加並未觀察到MMP-7酵素活性降低(第8圖)
[實施例7] 《MMP-7聚集體的形成抑制中甘露醇的影響》
實施例1-(1)所得之MMP-7溶液，使用旋轉過濾器，以含有各濃度NaCl、5mMCaCl2、3.5%甘露醇之5mM托利斯(Tris)緩衝液(pH7)進行緩衝液交換後，以相同之托利斯(Tris)緩衝液稀釋調製試樣17至22。以不含有甘露醇的相同托利斯(Tris)緩衝液進行相同處理者(試樣17)作為各試樣的對照組。
試樣17：10mM NaCl/1mg/ml MMP-7/5mMCaCl2
試樣18：10mM NaCl/1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/3.5%甘露醇
試樣19：40mM NaCl/1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/3.5%甘露醇
試樣20：80mM NaCl/1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/3.5%甘露醇
試樣21：120mM NaCl/1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/3.5%甘露醇
試樣22：180mM NaCl/1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/3.5%甘露醇
各試樣以實施例1-(2)所記載的動態光散射法測定MMP-7的分子量。其結果，顯示MMP-7藉由在40mM以上的氯化鈉形成聚集體(第9圖)。
本發明的MMP-7聚集體單體化之方法，係可利用於MMP-7的製造及製劑化。
<110> 一般財團法人化學及血清療法研究所
<120> 基質金屬蛋白酶7(MMP-7)聚集體之單體化方法
<130> 570815
<150> JP 2014-105452
<151> 2014-05-21
<160> 9
<170> PatentIn version 3.4
<210>
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用於選殖前-基質金屬蛋白酶-7基因之引子
<400> 1
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用於選殖前-基質金屬蛋白酶-7基因之引子
<400> 2
<210> 3
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用於獲得由鹼性磷酸酶信號肽及前-基質金屬蛋白酶-7所組成之 DNA片段之引子
<400> 3
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用於獲得由鹼性磷酸酶信號肽及前-基質金屬蛋白酶-7所組成之 DNA片段之引子
<400> 4
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用於獲得由經修飾鹼性磷酸酶信號肽及前-基質金屬蛋白酶-7所組 成之DNA片段之引子
<400> 5
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用於獲得由經修飾鹼性磷酸酶信號肽及前-基質金屬蛋白酶-7所組 成之DNA片段之引子
<400> 6
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 用於測量MMP-7活性之螢光受質的DNP-蛋白質
<400> 7
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Amino acid sequence of a signal peptide of alkaline phosphatase
<400> 8
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 用於測量MMP-7活性之螢光受質的MOCAc-蛋白質
<223> Xaa=NP-(2,4-二硝基苯基)-L-2,3-二胺基丙醯基
<400> 9
本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (46)

  1. 一種基質金屬蛋白酶7(MMP-7)聚集體之單體化方法，包括以含有130mM以下的1價陽離子化合物的溶液或不含有1價陽離子化合物的溶液處理基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)聚集體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之單體化方法，係以含有130mM以下陽離子化合物之溶液處理MMP-7聚集體。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之單體化方法，係以不含有130mM以下陽離子化合物之溶液處理MMP-7聚集體。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之單體化方法，其中，前述1價陽離子化合物的濃度係100mM以下。
  5. 如申請專利範圍第1、2或4項所述之單體化方法，其中，前述1價陽離子化合物的濃度係80mM以下。
  6. 如申請專利範圍第1、2、4或5項所述之單體化方法，其中，前述1價陽離子化合物的濃度係40mM以下。
  7. 如申請專利範圍第1、2、4、5或6項所述之單體化方法，其中，前述1價陽離子化合物係擇自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉及磷酸鉀所成群組。
  8. 如申請專利範圍第1、2、4、5或6項所述之單體化方法，其中，前述1價陽離子化合物係源自1價陽離子氯化物。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之單體化方法，其中，前述1價陽離子氯化物係擇自氯化鈉及氯化鉀所成群組。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之單體化方法，其中，前述溶液係進一步含有氯化鈣。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之單體化方法，其中，前述氯化鈣的濃度係30mM以下。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之單體化方法，其中，前述溶液係緩衝液。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之單體化方法，其中，前述緩衝液係5至25mM的托利斯(Tris)緩衝液。
  14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之單體化方法，其中，前述MMP-7的濃度係20mg/ml以下。
  15. 如申請專利範圍第13或14項所述之單體化方法，其中，前述溶液係含有30至40mM氯化鈉及5至30mM氯化鈣之5至25mM的托利斯緩衝液，其為pH6至8。
  16. 如申請專利範圍第1至15項中任一項所述之單體化方法，其中，前述溶液係進一步含有糖醇及/或糖類。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之單體化方法，其中，前述糖醇及/或糖類係擇自蔗糖、乳糖、麥芽糖、木糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇及寡糖醇所成群組。
  18. 如申請專利範圍第16或17項所述之單體化方法，其中，前述糖醇及/或糖類係2%以上。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之單體化方法，其中，前述糖醇及/或糖類係2至7%。
  20. 如申請專利範圍第17至19項中任一項所述之單體化方 法，其中，前述糖醇及/或糖類係甘露醇或蔗糖。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之單體化方法，其中，前述甘露醇係2至5%，前述蔗糖係2至7%。
  22. 一種MMP-7之製造方法，其係包含：包括如申請專利範圍第1至21項中任一項所述之單體化方法的步驟。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之製造方法，其中，前述步驟係在使用含有130mM以上1價陽離子的化合物之液體的處理步驟之後進行者。
  24. 如申請專利範圍第22或23項所述之製造方法，係包含下述步驟(1)至(5)：(1)破碎proMMP-7內含體產生細胞之步驟；(2)溶解/再摺疊proMMP-7內含體之步驟；(3)純化proMMP-7之步驟；(4)將proMMP-7自活化成MMP-7之步驟；及(5)包含如申請專利範圍第1至21項中任一項所述之單體化方法之步驟。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之製造方法，其中，前述步驟(5)係使用超濾膜之濃縮步驟。
  26. 一種含有MMP-7的(醫藥)組成物，係於含有130mM以下1價陽離子化合物之溶液或不含有1價陽離子化合物之溶液中含有基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)作為有效成分。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，係於含有130mM以下1價陽離子化合物之溶液 中含有MMP-7作為有效成分。
  28. 如申請專利範圍第26項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，係於不含有1價陽離子化合物之溶液中含有MMP-7作為有效成分。
  29. 如申請專利範圍第26或27項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述1價陽離子係擇自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉及磷酸鉀所成群組。
  30. 如申請專利範圍第26或27項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述1價陽離子係源自1價陽離子氯化物。
  31. 如申請專利範圍第30項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述1價陽離子氯化物係擇自氯化鈉及氯化鉀所成群組。
  32. 如申請專利範圍第26至31項中任一項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，係進一步含有氯化鈣。
  33. 如申請專利範圍第32項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述氯化鈣之濃度係30mM以下。
  34. 如申請專利範圍第26至33項中任一項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述溶液係緩衝液。
  35. 如申請專利範圍第34項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述緩衝液係5至25mM的托利斯(Tris)緩衝液。
  36. 如申請專利範圍第26至35項中任一項所述之含有 MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述MMP-7的濃度係20mg/ml以下。
  37. 如申請專利範圍第36項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述MMP-7的濃度係1μg/ml至1mg/m1。
  38. 如申請專利範圍第35、36或37項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述溶液係含有30至40mM氯化鈉及5至30mM氯化鈣之5至25mM的托利斯緩衝液，其為pH6至8。
  39. 如申請專利範圍第26至38項中任一項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述溶液係進一步含有糖醇及/或糖類。
  40. 如申請專利範圍第39項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述糖醇及/或糖類係擇自蔗糖、乳糖、麥芽糖、木糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇及寡糖醇所成群組。
  41. 如申請專利範圍第39或40項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述糖醇及/或糖類係2%以上。
  42. 如申請專利範圍第41項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述糖醇及/或糖類係2至7%。
  43. 如申請專利範圍第40至42項中任一項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述糖醇及/或糖類係甘露醇或蔗糖。
  44. 如申請專利範圍第43項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物，其中，前述甘露醇係2至5%，前述蔗糖係2至 7%。
  45. 一種含有MMP-7的(醫藥)固體組成物，係可溶解於溶劑，且其溶解時之組成物係如申請專利範圍第26至44項中任一項所述之組成物。
  46. 一種椎間盤突出之治療劑，係含有如申請專利範圍第26至45項中任一項所述之含有MMP-7的(醫藥)組成物。
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Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2938352B2 (ja) 1994-09-30 1999-08-23 オリエンタル酵母工業株式会社 組換え人マトリライシンの製造方法
US6194189B1 (en) * 1994-12-16 2001-02-27 Washington University Catalytically-active gelatinase mutant
JP3937192B2 (ja) * 1997-04-03 2007-06-27 東洋紡績株式会社 新規な糖化蛋白質および該物質を用いた分析用試薬
JP4507027B2 (ja) 1998-12-04 2010-07-21 明治乳業株式会社 Ｍｍｐ阻害剤
FR2788525B1 (fr) * 1999-01-19 2002-11-29 Commissariat Energie Atomique Pseudo-peptides phosphiniques, utilisables comme inhibiteurs des metalloproteases a zinc matricielles
JP4521894B2 (ja) * 1999-05-28 2010-08-11 明治乳業株式会社 マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤
JP4813652B2 (ja) 2000-12-04 2011-11-09 丸善製薬株式会社 マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤
WO2003102192A1 (en) * 2002-05-30 2003-12-11 Astex Technology Limited Methods of purification of cytochrome p450 proteins and of their crystallizing
US7148046B2 (en) 2001-04-02 2006-12-12 Astex Therapeutics Limited Crystal structure of cytochrome P450
CN100366289C (zh) * 2001-09-12 2008-02-06 维日克斯医药公司 具有固定的血小板结合剂的血管闭塞固相试剂
JP4512038B2 (ja) * 2002-12-25 2010-07-28 小森 博達 椎間板変性治療剤
JP2005006509A (ja) * 2003-06-16 2005-01-13 Arkray Inc メタロプロテアーゼの保存方法、および前記方法を用いたメタロプロテアーゼ試薬溶液
US20060099567A1 (en) * 2004-04-08 2006-05-11 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
JP2008206491A (ja) * 2007-02-28 2008-09-11 Toyobo Co Ltd ｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定化方法
KR101634078B1 (ko) * 2008-10-21 2016-06-29 잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼 봉입체 형성 단백질의 제조방법
WO2011097335A2 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase variants and methods of using compositions thereof
RU2610436C2 (ru) * 2011-06-02 2017-02-10 Баксалта Инкорпорейтед Составы рекомбинантного фурина

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