CN116406422A

CN116406422A - 生产β-胰蛋白酶的方法

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Publication number: CN116406422A
Application number: CN202180067315.6A
Authority: CN
Inventors: P·M·H·马克思; M·梅维斯; C·D·威尔逊; A·A·布加杰夫斯卡-沃勒; D·E·格鲁伯; G·刘易斯
Original assignee: Ipsen Biopharm Ltd
Current assignee: Ipsen Biopharm Ltd
Priority date: 2020-10-01
Filing date: 2021-10-01
Publication date: 2023-07-07
Also published as: JP2023545000A; AU2021352147A1; GB202015618D0; EP4222255A1; WO2022069903A1

Abstract

一种生产β‑胰蛋白酶的方法，所述方法包含：a)使变性胰蛋白酶原复性，从而生产复性胰蛋白酶原，其中所述复性在包含L‑精氨酸的缓冲液中进行；b)通过阴离子交换层析对复性胰蛋白酶原进行纯化，从而提供纯化的复性胰蛋白酶原；和c)在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下对纯化的复性胰蛋白酶原进行孵育，其中胰蛋白酶原通过所述蛋白水解活性裂解成β‑胰蛋白酶；其中步骤a)和b)在不促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下进行；其中所述方法不包含加入用于将胰蛋白酶原裂解成β‑胰蛋白酶的另外的蛋白酶；其中至少步骤c)在不包含L‑精氨酸的缓冲液中进行；并且其中在步骤c)之前，当存在于不包含L‑精氨酸的缓冲液中时，不使胰蛋白酶原经受>8℃的温度超过38小时。

Description

生产β-胰蛋白酶的方法

技术领域

本发明涉及生产重组胰蛋白酶的方法、重组胰蛋白酶组合物及其用途。

背景技术

胰蛋白酶是一种发现于许多脊椎动物的消化系统中的丝氨酸蛋白酶，其功能是水解蛋白，通过在氨基酸赖氨酸和精氨酸的羧基侧裂解肽链将它们分解成更小的肽(除了其中任一个随后是脯氨酸)。胰蛋白酶来源于胰腺，在胰腺中以无活性(酶原)形式产生，称为胰蛋白酶原。在胰腺中产生后，胰蛋白酶原进入小肠(通过胆管)，在小肠中它被转化为活性胰蛋白酶。然后胰蛋白酶(预先由胰蛋白酶原活化，例如通过肠激酶)从胰蛋白酶原裂解末端六肽以产生被称为β-胰蛋白酶的单链胰蛋白酶蛋白。随后的自溶产生具有两个或更多个肽链的其它活性形式，诸如α-胰蛋白酶，其具有通过二硫键结合的两个肽链。活化的胰蛋白酶然后可以执行其消化功能。

胰蛋白酶广泛用于生物技术和研究。例如，它与羧肽酶B组合用于生产胰岛素，用于将胰岛素原前体加工成胰岛素。胰蛋白酶也用于制备非细胞毒性梭菌神经毒素，诸如肉毒杆菌神经毒素(BoNT)。BoNT为无活性的单链多肽，其通过蛋白水解裂解事件在翻译后活化以形成通过二硫键连接的两条多肽链。裂解发生在特定的裂解位点，通常称为活化位点，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。胰蛋白酶通常用于催化这种裂解事件，因此，有利的是，不必将外源裂解位点改造到BoNT中。

大多数市售的胰蛋白酶产品由动物胰腺纯化而来，通常由牛或猪胰腺纯化得到。然而，由此类动物来源纯化涉及胰蛋白酶产物被病原体(诸如病毒或朊病毒)污染的风险，需要对胰蛋白酶进行过量纯化，这将使生产产率降低。此外，动物来源的胰蛋白酶通常不能用于制造药剂，诸如胰岛素和BoNT，因为此类胰蛋白酶无法满足优质生产规范(GMP)要求。

因此，缺少以高产率和足够纯度生产胰蛋白酶的合适方法用于活化药物组合物或化妆品组合物中使用的蛋白。

本发明解决了一个或多个上述问题。

发明内容

更详细地，本发明基于令人惊讶的发现，即可以通过原核表达系统以高纯度和高产率生产β-胰蛋白酶，其中胰蛋白酶原酶原被表达，并且随后被纯化，之后再被活化以提供胰蛋白酶。本发明人已经发现，使用原核表达系统(例如，原核宿主细胞)有利地克服了当使用真核表达系统时发生的生产规模扩大和蛋白产率不足的问题。例如，胰蛋白酶在酵母中的表达通常导致产率低且不经济。

通过表达胰蛋白酶原而非活性形式(胰蛋白酶)，本发明人已经发现，该蛋白在表达和纯化过程中不表现出自溶，这减轻了自裂解的问题以及所致的生产产率/纯度的降低。有利地，当表达胰蛋白酶原时，该蛋白形成不溶性包涵体，其包含蛋白水解无活性的聚集的胰蛋白酶原(不代表活性分子的最终三级结构)，从而增强避免自溶的能力。不溶性包涵体是所表达的蛋白的不溶性(但是稳定的)聚集体(通常是核或细胞质聚集体)。表达胰蛋白酶原形成包涵体的优点极为令人惊讶，这是因为通常认为当表达蛋白时应避免形成不溶性包涵体，而对存在于此类包涵体中的蛋白进行溶解和复性所需的下游方法被认为显著有损生产产率。

有利地，本发明使用阳离子交换层析(在使胰蛋白酶原复性之前)和阴离子交换层析(在使胰蛋白酶原复性之后)的组合。阴离子交换层析步骤合适地在低于胰蛋白酶原pI的pH下进行(例如，使得胰蛋白酶原具有净正电荷)。本发明人已经令人惊讶地发现，在这些条件下，杂质/污染物(净负电荷)与胰蛋白酶原(净正电荷)之间的净电荷差异可使得杂质/污染物保留在阴离子交换柱中并使胰蛋白酶原快速流通以进行收集，从而导致宿主细胞来源的污染物(例如细菌内毒素、宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA)的去除增加，由此得到高纯度的胰蛋白酶产物。实际上，本发明人已经表明，通过本发明的方法可容易地实现>90％的纯度水平。因此，本发明符合优质生产规范(GMP)要求，并且有利地可使得生产胰蛋白酶，该胰蛋白酶可用于对用作药物或化妆品组合物的部分的蛋白进行活化。有利地，应用于阴离子交换层析(AEX)步骤的“流通(flow through)”方法可使得目标多肽(胰蛋白酶原)的高产率(相对于AEX输入)的回收，同时污染物保持与柱结合。作为实例，图4A采用“第一次确认运行”，其概述了遵循本文所述方法的各个步骤的蛋白产率表。值得注意的是，在所述“第一次确认运行”中，AEX/Eshmuno Q之后的“步骤产率”(相对于输入的产率)高于任何其它“纯化步骤”之后的产率，而“总产率”仅降低3％。该观察结果指示，由于去除了污染物，胰蛋白酶原的有利的“阳性富集”。

此外，本发明人已经表明某些步骤，特别是活化步骤(例如，其中胰蛋白酶原通过自动裂解被裂解成β-胰蛋白酶)在不存在聚集抑制剂(诸如L-精氨酸)的情况下对结果有所改善。在所述活化步骤的情况下，认为省略L-精氨酸可使得多肽更容易地相互作用，导致活化/裂解所需的胰蛋白酶原-胰蛋白酶原(或胰蛋白酶-胰蛋白酶原)相互作用改善。也就是说，在早期步骤(例如，复性)中，L-精氨酸的存在是有利的。因此，本发明的方法中，使胰蛋白酶原复性的步骤在L-精氨酸存在下进行(其中L-精氨酸的存在有利于帮助重折叠)，该方法涉及在不存在L-精氨酸的情况下进行的后续步骤。此类方法涉及/需要胰蛋白酶原存在于缓冲液(buffer)中持续一定的时间段(例如，在活化步骤的制备期间)，该缓冲液中不存在L-精氨酸，本发明人已经表明这可以导致胰蛋白酶原制剂的稳定性降低(参见实施例2)。不希望受理论束缚，认为在不存在L-精氨酸，聚集抑制剂的情况下，(未活化的)胰蛋白酶原分子形成聚集体和沉淀。然而，有利地，本发明人已经表明，通过遵守某些温度阈值和/或最大“保持时间(hold-times)”(在不存在L-精氨的情况下保持胰蛋白酶原的时间)，可以抑制或甚至避免此类聚集。

因此，本发明人不仅发现了与L-精氨酸不存在时进行活化的方法所相关的问题，而且还证明了克服所述问题的有利方案。因此，仍然可以在L-精氨酸存在下进行复性(其中它是有利的)，而在活化步骤之前去除L-精氨酸(其中它是不利的)同时不损害胰蛋白酶原制剂的稳定性。

具体实施方式

在第一方面，提供了一种生产β-胰蛋白酶的方法，该方法包含：

a)使变性胰蛋白酶原复性(或使纯化的变性胰蛋白酶原复性)，从而生产复性胰蛋白酶原，其中复性在包含L-精氨酸的缓冲液中进行；

b)通过阴离子交换层析对复性胰蛋白酶原进行纯化，从而提供纯化的复性胰蛋白酶原；和

c)在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原，其中胰蛋白酶原通过所述蛋白水解活性裂解成β-胰蛋白酶；

其中步骤a)和b)在不促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下进行；

其中该方法不包含加入用于将胰蛋白酶原裂解成β-胰蛋白酶的另外的蛋白酶；

其中至少步骤c)在不包含L-精氨酸的缓冲液中进行；并且

其中在步骤c)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原不经受>8℃的温度超过38小时。

在一个优选的实施方案中，术语“其中在步骤c)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原不经受>8℃的温度超过38小时”是指在使变性胰蛋白酶原复性的步骤(例如，所述第一方面的步骤a.)之后的步骤，任选地包括使变性胰蛋白酶原复性的所述步骤。

技术人员将理解，多肽(胰蛋白酶原)可经受>8℃的温度的时间可作为温度的函数而变化。例如，随着温度升高(例如，升高至>10℃、>15℃等)，可优选同时减少多肽经受此类温度的时间。

在某些实施方案中，在步骤c)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原不经受：

≥10℃的温度超过30小时；或

≥15℃的温度超过20小时；或

≥20℃的温度超过15小时；或

≥25℃的温度超过5小时。

在一个实施方案中，在步骤c)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原不经受15-30℃的温度超过20小时；优选胰蛋白酶原不经受15-30℃的温度超过10小时；更优选胰蛋白酶原不经受15-30℃的温度超过5小时。

在又一个优选的实施方案中，在步骤c)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原不经受15-30℃的温度超过2小时。

例如，在步骤c)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原可以不经受>8℃的温度。

胰蛋白酶原优选是在原核生物中表达的胰蛋白酶原。换言之，变性胰蛋白酶原(例如，步骤a))优选来源于原核宿主细胞。

以下步骤中的一个或多个可以在(例如，所述第一方面的)步骤a)之前进行：

i.培养原核宿主细胞，该原核宿主细胞包含编码胰蛋白酶原的核苷酸序列，其中该核苷酸序列与诱导型启动子可操作地连接；

ii.诱导该宿主细胞表达胰蛋白酶原，从而形成一种或多种包含胰蛋白酶原的不溶性包涵体；

iii.从宿主细胞中分离一种或多种不溶性包涵体；

iv.溶解一种或多种不溶性包涵体，从而生产变性胰蛋白酶原；和/或

v.通过阳离子交换层析对变性胰蛋白酶原进行纯化，从而提供纯化的变性胰蛋白酶原。

优选地，在(例如，所述第一方面的)步骤a)之前，可通过阳离子交换层析对变性胰蛋白酶原进行纯化，从而提供纯化的变性胰蛋白酶原。然后，在所述方法的步骤a)中，可以使所述纯化的变性胰蛋白酶原复性。

以下步骤可以在(例如，所述第一方面的)步骤a)之前进行：

ii.诱导宿主细胞表达胰蛋白酶原，从而形成一种或多种包含胰蛋白酶原的不溶性包涵体；

iii.从宿主细胞中分离一种或多种不溶性包涵体；

iv.溶解一种或多种不溶性包涵体，从而生产变性胰蛋白酶原；和

(例如，所述第一方面的)步骤a)和b)可以在不存在钙的情况下进行。附加地或可替代地，(例如，如前一段落所述，所述第一方面的)步骤ii)、iii)、iv)和/或v)可以在不存在钙的情况下进行。

在第二方面，提供了一种生产β-胰蛋白酶的方法，该方法包含：

a)培养原核宿主细胞，该原核宿主细胞包含编码胰蛋白酶原的核苷酸序列，其中核苷酸序列与诱导型启动子可操作地连接；

b)诱导宿主细胞表达胰蛋白酶原，从而形成包含胰蛋白酶原的一种或多种不溶性包涵体；

c)从宿主细胞中分离一种或多种不溶性包涵体；

d)溶解一种或多种不溶性包涵体，从而生产变性胰蛋白酶原；

e)通过阳离子交换层析对变性胰蛋白酶原进行纯化，从而提供纯化的变性胰蛋白酶原；

f)使纯化的变性胰蛋白酶原复性，从而生产复性胰蛋白酶原，任选地其中复性在包含L-精氨酸的缓冲液中进行；

g)通过阴离子交换层析对复性胰蛋白酶原进行纯化，从而提供纯化的复性胰蛋白酶原；

h)在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原，其中所述蛋白水解活性将胰蛋白酶原裂解成β-胰蛋白酶；和

i)通过亲和层析分离β-胰蛋白酶，

其中步骤f)和g)在不促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下进行；并且其中该方法不包含加入用于将胰蛋白酶原裂解成β-胰蛋白酶的另外的蛋白酶；

任选地，其中至少步骤h)在不包含L-精氨酸的缓冲液中进行；

任选地，其中在步骤h)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原不经受>8℃的温度超过38小时。

优选地，复性(例如，步骤f))在包含L-精氨酸的缓冲液中进行。

在一个优选的实施方案中，术语“其中在步骤h)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原不经受>8℃的温度超过38小时”是指在使变性胰蛋白酶原复性步骤(例如，所述第二方面的步骤f.)之后的步骤，任选地包括使变性胰蛋白酶原复性的所述步骤。

在某些实施方案中，在步骤h)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原不经受：

≥10℃的温度持续30小时以上；或

≥15℃的温度持续20小时以上；或

≥20℃的温度持续15小时以上；或

≥25℃的温度持续5小时以上。

在一个实施方案中，在步骤h)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原不经受15-30℃的温度超过20小时；优选胰蛋白酶原不经受15-30℃的温度超过10小时；更优选胰蛋白酶原不经受15-30℃的温度超过5小时。

在又一个优选的实施方案中，在步骤h)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原不经受15-30℃的温度超过2小时。

例如，在步骤h)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，胰蛋白酶原可以不经受>8℃的温度。

术语“不包含L-精氨酸的缓冲液”是指基本上不包含L-精氨酸的缓冲液。基本上不包含L-精氨酸的缓冲液可以具有小于50mM、25mM、10mM的L-精氨酸浓度，优选小于1mM。更优选地，本文所用的术语“不包含L-精氨酸的缓冲液”是指不包含L-精氨酸的缓冲液。

在一个实施方案中，通过阴离子交换层析对复性胰蛋白酶原进行纯化的步骤在不包含氧化型谷胱甘肽(GSSG)和/或还原型谷胱甘肽(GSH)的缓冲液中进行。例如，通过阴离子交换层析对复性胰蛋白酶原进行纯化的步骤可以在不包含GSSG或GSH的缓冲液中进行。

术语“不包含GSSG的缓冲液”是指基本上不包含GSSG的缓冲液。基本上不含GSSG的缓冲液可以具有小于50mM、25mM、10mM的GSSG浓度，优选小于1mM。更优选地，本文所用的术语“不包含GSSG的缓冲液”是指不包含GSSG的缓冲液。术语“不包含GSH的缓冲液”是指基本上不包含GSH的缓冲液。基本上不包含GSH的缓冲液可以具有小于50mM、25mM、10mM的GSH浓度，优选小于1mM。更优选地，本文所用的术语“不包含GSH的缓冲液”是指不包含GSH的缓冲液。

(例如，所述第二方面的)步骤f)和g)可以在不存在钙的情况下进行。附加地或可替代地，(例如，所述第二方面的)步骤b)、c)、d)和/或e)可以在不存在钙的情况下进行。

本发明的方法可以包含一个或多个另外的纯化步骤，该纯化步骤可以在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下进行，也可以不在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下进行。然而，优选所述另外的步骤也在不促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下进行。

在一个实施方案中，在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的胰蛋白酶原的步骤(例如，上述第一方面的步骤c、第二方面的步骤h)从提供纯化的复性胰蛋白酶原开始进行长达120分钟(例如，从第一方面的步骤b、第二方面的步骤g开始长达120分钟)；优选从提供纯化的复性胰蛋白酶原开始长达75分钟。

在更优选的实施方案中，在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的胰蛋白酶原的步骤从提供纯化的复性胰蛋白酶原开始进行长达60分钟。在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤之前，将纯化的复性胰蛋白酶原保持在15-25℃(例如，20℃)的温度，这可能是特别有利的。

在阴离子交换层析于不存在L-精氨酸(或其它稳定性增强赋形剂)的情况下进行的实施方案中，从提供纯化的复性胰蛋白酶原开始，在120分钟内(优选在75分钟内；更优选在60分钟内)进行所述步骤可能是特别有利的。通过在该时间范围内进行，可以避免胰蛋白酶原的沉淀/聚集(伴随着蛋白水解活性的丧失和自裂解成β-胰蛋白酶)(例如，否则，由于纯化的复性胰蛋白酶原制剂中缺乏L-精氨酸，其可能发生)。

例如，在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤可以从提供纯化的复性胰蛋白酶原开始进行长达45、30或15分钟。此外，当在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤之前，将纯化的复性胰蛋白酶原保持在15-25℃(例如，20℃)的温度时，这可能是特别有利的。

有利地，本发明人已经发现，当与缺乏所述(附加的)层析步骤的现有技术的β-胰蛋白酶制剂相比时，通过提供通过阴离子交换层析对复性胰蛋白酶原进行纯化的所述步骤(例如，步骤g)，可以获得更高纯度和产率的β-胰蛋白酶制剂。该技术效果是完全难以预料的，因为阴离子交换层析(通常用于纯化具有低等电点pI的蛋白)在纯化具有9.3的高pI的胰蛋白酶原(并因此在纯化过程中所使用的典型pH值具有净正电荷或中性电荷，使得胰蛋白酶原不会结合阴离子交换树脂)的过程中不会被期望具有优势。然而，本发明人已经发现，可以利用高pI的胰蛋白酶原，因为它允许蛋白简单地(simply)流通阴离子交换柱，而杂质(例如，具有净负电荷的杂质)被保留并因此与胰蛋白酶原分离。因此，阴离子交换层析步骤可以在提供具有净正电荷的复性胰蛋白酶原，允许与净负电荷杂质分离的条件下进行。如上所述，应用于阴离子交换层析(AEX)步骤的“流通”方法可使得目标多肽(胰蛋白酶原)的高产率(相对于AEX输入)的回收，同时污染物保持与柱结合。作为实例，图4A采用“第一次确认运行”，其概述了遵循本文所述方法的各个步骤的蛋白产率表。值得注意的是，在所述“第一次确认运行”中，AEX/Eshmuno Q之后的“步骤产率”(相对于输入的产率)高于任何其它“纯化步骤”之后的产率，而“总产率”仅降低3％。该观察结果指示，由于去除了污染物，胰蛋白酶原的有利的“阳性富集”。

在一个实施方案中，阴离子交换层析步骤在复性胰蛋白酶原具有净正电荷的条件下进行。

通过阳离子交换层析对变性胰蛋白酶原进行纯化的步骤可以(附加地或可替代地)在其中复性胰蛋白酶原具有净正电荷的条件下进行。例如，在此类条件下，胰蛋白酶原结合阳离子交换树脂(其具有负电荷)。

不希望受理论束缚，据信通过在活化步骤(例如，步骤h)之前采用该附加的纯化步骤，活化步骤不受阴离子交换树脂保留的杂质妨碍，从而可使活化的β-胰蛋白酶的产率提高。这与现有技术方法相反，在现有技术方法中，仅在活化后采用最终纯化或“精制”步骤(即，对实际胰蛋白酶制剂本身进行精制)。

在一个优选的实施方案中，复性胰蛋白酶原存在于与阴离子交换层析介质无相互作用或仅微弱相互作用的级分中。例如，该级分可以包含小于复性胰蛋白酶原的等电点(pI)的pH(例如，pH可以小于9.2，优选≤9.0，更优选≤8.5)。特别优选pH的范围为约pH6.5-7.5。

等电点(pI)是给定蛋白的特定性质。更详细地，等电点(pI)定义为蛋白显示零净电荷时的pH值。pI增加是指蛋白显示零净电荷需要更高的pH值。因此，pI增加表示在给定pH，蛋白的净正电荷增加。相反，pI降低是指蛋白显示零净电荷需要更低的pH值。因此，pI降低表示在给定pH，蛋白的净正电荷降低。

测定蛋白pI的方法是本领域已知的，并且是本领域技术人员所熟悉的。例如，蛋白的pI可以由蛋白中存在的每个氨基酸的平均pKa值(“计算出的pI”)计算。此类计算可以使用本领域已知的计算机程序进行，例如来自ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)，这是根据本发明计算pI的优选方法。应使用相同的计算技术/程序比较不同分子之间的pI值。在适当的情况下，可以使用等电聚焦技术(“观察到的pI”)通过实验证实蛋白的计算出的pI。该技术使用电泳根据蛋白的pI对蛋白进行分离。等电聚焦通常使用具有固定pH梯度的凝胶进行。当施加电场时，蛋白通过pH梯度迁移直至它达到具有零净电荷的pH，这一点是蛋白的pI。由等电聚焦提供的结果在性质上通常是相对低分辨率的，因此本发明人相信由计算出的pI(如上所述)提供的结果更适合使用。在本说明书中，除非另有说明，“pI”是指“计算出的pI”。

例如，“复性胰蛋白酶原具有净正电荷的条件”可以指阴离子交换层析步骤在小于9.2，优选≤9.0，更优选≤8.5的pH进行。例如，pH可以合适地为≥pH 6.5且≤pH 8.0，甚至更合适地为≥pH 6.5且≤pH 7.5。例如，复性胰蛋白酶原(例如，通过阴离子交换层析纯化)可以存在于具有pH小于9.2，优选≤9.0，更优选≤8.5的缓冲液中。

在优选的实施方案中，本文所述方法中，阴离子交换期间的pH可以是≥pH 7.3且≤pH 7.6。

本发明的方法可以包含缓冲液交换步骤，以提供存在于缺乏稳定性增强赋形剂(诸如L-精氨酸)的缓冲液中的复性胰蛋白酶原；任选地，其中缓冲液交换步骤在通过阴离子交换层析对胰蛋白酶原进行纯化的步骤之前进行，以获得纯化的胰蛋白酶原。此类缓冲液(例如，缺乏稳定性增强赋形剂)的实例是25-100mM Tris，优选50mM Tris。缓冲液可以具有7.0-8.0的pH，优选约pH 7.4。

在一个实施方案中，通过阴离子交换层析对复性胰蛋白酶原进行纯化的步骤，从而提供纯化的复性胰蛋白酶原(例如，步骤g))在低于15℃的温度进行。例如，温度为1-10℃；更优选温度为2-8℃。可替代地，通过阴离子交换层析对复性胰蛋白酶原进行纯化从而提供纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤g))可以在至少15℃的温度进行。例如15-25℃的温度；更优选20-25℃的温度。

有利地，可以在阴离子交换层析之前减少复性胰蛋白酶原的体积，从而减少要进行纯化的体积。

在一个实施方案中，所述方法包含使复性胰蛋白酶原(例如，在阴离子交换层析之前)经受体积减小步骤，例如，从而提供体积减小的复性胰蛋白酶原。附加地或可替代地，该方法可包含使纯化的复性胰蛋白酶原(例如，在阴离子交换层析之后)经历体积减小步骤，例如，从而提供体积减小的纯化的复性胰蛋白酶原。

“体积减小步骤”使复性胰蛋白酶原的体积相对于体积减小步骤之前的复性胰蛋白酶原体积减小。相对于体积减小步骤之前的体积，体积可以减小至少1/2、1/4、1/10、1/15或1/20。优选地，体积减小步骤使复性胰蛋白酶原的体积相对于体积减小步骤之前的复性胰蛋白酶原体积减小至少1/10。

在优选的实施方案中，在通过阴离子交换层析纯化复性胰蛋白酶原的步骤之前进行体积减小步骤。

所述方法可进一步包含使复性胰蛋白酶原经受过滤步骤(例如，在阴离子交换层析之前)的步骤，该过滤步骤去除具有大小小于20kDa的分子，优选小于15k Da，更优选小于10kDa。附加地或可替代地，该方法可进一步包含使纯化的复性胰蛋白酶原经受过滤步骤(例如，在阴离子交换层析之后)的步骤，该过滤步骤去除具有大小小于20kDa的分子，优选小于15kDa，更优选小于10kD。

过滤步骤优选具有从复性胰蛋白酶原(例如，在阴离子交换层析之前)或纯化的复性胰蛋白酶原(例如，在阴离子交换层析之后)中去除L-精氨酸的效果。因此，该方法可进一步包含使复性胰蛋白酶原经受去除L-精氨酸的过滤步骤(例如，在阴离子交换层析之前)的步骤。附加地或可替代地，该方法还可以包含使纯化的复性胰蛋白酶原经受去除L-精氨酸的过滤步骤(例如，在阴离子交换层析之后)的步骤。

附加地或可替代地，过滤步骤可以具有去除GSSG或GSH的效果。

在一个优选的实施方案中，过滤步骤在通过阴离子交换层析对复性胰蛋白酶原进行纯化的步骤之前进行。

体积减小步骤可以在所述过滤步骤之前、与其同时或之后进行。例如，可以对复性胰蛋白酶原进行切向流过滤以同时减小体积，例如提供体积减小步骤，并去除具有大小小于20kDa(优选小于15kDa，更优选小于10kDa)的分子，例如过滤步骤。

“过滤步骤”包括用于去除具有本文所述大小(例如，小于20kDa)的分子的任何合适的工具。例如，过滤步骤可以用过滤器进行，例如截留分子量为20kDa(优选15kDa，更优选10kDa)的过滤器。例如，过滤器可以保留大小≥20kDa的分子，优选≥15kDa，更优选≥10kDa。

附加地或可替代地，过滤步骤可以通过透析进行，例如通过基于其通过半透膜(诸如透析管)的扩散速率的差异，从大小小于20kDa(优选小于15kDa，更优选小于10kDa)的分子中分离复性胰蛋白酶原。

“变性”胰蛋白酶原是不折叠成蛋白天然结构(例如，二级结构和/或三级结构)的胰蛋白酶原，使得该胰蛋白酶原不具有折叠的胰蛋白酶原所具有的基本水平的蛋白水解活性。变性胰蛋白酶原可以通过使胰蛋白酶原与变性剂(诸如尿素)和/或还原剂(诸如1,4-二硫苏糖醇(DTT)接触来提供。

有利地，变性胰蛋白酶原在本发明的纯化步骤中不会自裂解(自溶)，从而可以获得更高产率的胰蛋白酶原(并且因此获得β-胰蛋白酶)。

参考“使纯化的变性胰蛋白酶原复性”是指将变性胰蛋白酶原折叠成蛋白的天然结构(例如二级结构和/或三级结构，从而提供折叠/复性胰蛋白酶原)。可以通过使变性胰蛋白酶原与聚集抑制剂(诸如精氨酸(例如L-精氨酸)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和/或还原型谷胱甘肽(GSH)，优选L-精氨酸)接触，使变性胰蛋白酶原复性。

优选使大部分或全部变性胰蛋白酶原复性，以增加待裂解的变性胰蛋白酶原的产率，从而使β-胰蛋白酶产率提高。本发明人发现了可以进行复性步骤的特别有利的条件，其提高了复性胰蛋白酶原的产率。

在一个实施方案中，在复性纯化的变性胰蛋白酶原的步骤中，L-精氨酸以0.6M至<1M的浓度存在。例如，L-精氨酸可以优选以约0.75M的浓度存在。本发明人已经意外地发现，在该范围(0.6M至<1M)内的L-精氨酸浓度对于提高复性胰蛋白酶原产率是特别有利的(参见图6A)。

附加地或可替代地，在复性纯化的变性胰蛋白酶原的步骤中，变性胰蛋白酶原可以以<0.2mg/mL的浓度存在。例如，变性胰蛋白酶原可以以>0.06mg/mL至<0.2mg/mL的浓度存在；优选0.08mg/mL至0.15mg/mL；更优选约0.1mg/mL的浓度。本发明人已经意外地发现，以此类范围(<0.2mg/mL)的(起始)变性胰蛋白酶原浓度进行复性步骤对于提高复性胰蛋白酶原的产率是特别有利的(参见图6B)。

此类条件(L-精氨酸和变性胰蛋白酶原浓度)都可以联合使用以协同提高变性胰蛋白酶原的产率(参见图6B)。

可选择地或附加地，变性胰蛋白酶原可以通过去除变性剂来进行复性，例如，去除在溶解一种或多种不溶性包涵体的步骤(例如，步骤d))中使用的变性剂。可以通过过滤和/或渗滤去除变性剂。

术语“生产变性胰蛋白酶原”是指生产不包含在不溶性包涵体中的变性胰蛋白酶原。例如，“生产变性胰蛋白酶原”优选包含生产可溶性(例如，溶解的)变性胰蛋白酶原。

可用于形成此类不溶性包涵体的特别有利的原核宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。因此，在一个实施方案中，原核宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞(诸如大肠杆菌BL21(DE3))。

已知胰蛋白酶原可以经历自活化、自扩增生物分子反应，其中胰蛋白酶原被自活化以提供胰蛋白酶，这又可以活化胰蛋白酶原分子以产生两种胰蛋白酶分子。此外，已知这种自催化活性可以被促进，或者另一方面被干扰，这取决于因素，诸如局部pH、金属离子的存在或不存在和/或胰蛋白酶原抑制剂的存在或不存在。作为实例(关于后者)，据信某些蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶原)的抑制剂存在于胰腺(其中生产胰蛋白酶原)中，以抑制蛋白水解活性，从而预防可导致胰腺炎的胰腺自身消化。此外，据信胰腺中的金属离子(特别是钙)浓度保持低于阈值，否则其会促进蛋白水解酶(诸如胰蛋白酶原和胰蛋白酶)的蛋白水解活性。实际上，已经表明，高钙血症(导致异常高的血清钙浓度)可能由于胰腺中的蛋白水解酶的过度活化而诱发胰腺炎。

术语“促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”是指胰蛋白酶原在有利于/刺激胰蛋白酶原中的基本水平的蛋白水解活性的条件下孵育，使得其自裂解/自溶为胰蛋白酶，例如孵育条件可包括存在加速(例如，促进)胰蛋白酶原的自溶的试剂。因此，术语“促进”可以与术语“刺激”、“诱导”和/或“加速”同义使用。

促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件是本领域公知的，包括在金属离子存在下培养胰蛋白酶原。例如，显示50mM钙、Ca⁺⁺(在0.1M Tris-HCl缓冲液中，pH 8.1)即使在胰蛋白酶抑制剂的存在下也允许胰蛋白酶原的自活化(J Kay,B Kassell,J Biol Chem.1971年11月；246(21):6661-5)。也已知其它金属离子(例如锶、钡、镁、钠、锂、钾、铵、铷、铯和钕)的存在提供了促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的合适条件。

脊椎动物胰蛋白酶原的氨基端含有序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO：4，在脊椎动物进化过程中高度保守)。胰蛋白酶原可以自裂解(例如，在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下)保守序列的赖氨酸残基和随后的氨基酸残基(通常为异亮氨酸)之间的肽键。得到的N末端肽被称作“胰蛋白酶原活化肽”，然后被释放(参见图3)。胰蛋白酶原活化肽(TAP)是胰蛋白酶原(自)活化过程的副产物。

本文中，自活化胰蛋白酶原，缺乏胰蛋白酶原活化肽可称作“裂解的胰蛋白酶原”(或者可替代地，简单地称为“胰蛋白酶”)。

通过在所述条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原之后检测裂解的胰蛋白酶原(缺乏胰蛋白酶原活化肽)，可以证实该条件适合于促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性，任选地在胰蛋白酶抑制剂的存在下，例如在抑制胰蛋白酶活性的浓度。

由于去除了胰蛋白酶原活化肽，活化的胰蛋白酶原分子的大小被减小，通常从约24kDa减小至约23.8kDa。因此，通过鉴定胰蛋白酶原分子大小的减小，可以方便地检测到胰蛋白酶原活化肽的裂解，这表明从非活性/酶原形式(包含胰蛋白酶原活化肽)到缺少胰蛋白酶原活化肽的裂解的胰蛋白酶原(例如，胰蛋白酶)形式有所改变。可以通过SDS-PAGE分析或层析方便地测量此类大小(size)的减小(参见图3A)。合适的层析技术包括高效液相层析，例如反相高效液相层析。

附加地或可替代地，可以检测(裂解的)胰蛋白酶原活化肽的存在，以确认胰蛋白酶原的蛋白水解活性，例如，通过用于特异性检测裂解的胰蛋白酶原活化肽的合适的免疫测定(优选ELISA)。用于进行ELISA以定量TAP的合适的商购试剂盒的实例是“牛胰蛋白酶原活化肽(TAP)ELISA试剂盒”(MyBiosource公司，货号MBS2609836)。

“促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”可以是在1小时后，样品中存在的至少20％的胰蛋白酶原已经释放(例如，自裂解)其胰蛋白酶原活化肽并因此转化为胰蛋白酶的条件。例如，在1小时后，样品中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(优选至少40％)的胰蛋白酶原释放其胰蛋白酶原活化肽并因此转化为胰蛋白酶的条件。优选地，“促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”可以是在1小时后，样品中至少50％的胰蛋白酶原释放(例如，自裂解)其胰蛋白酶原活化肽并因此转化为胰蛋白酶的条件。所述百分比(％)值是指相对于胰蛋白酶原的基线水平，例如在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤开始后≤1分钟、≤0.5分钟或≤0.1分钟(优选0分钟)的胰蛋白酶原水平。

“促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”可以是在1小时后，样品中存在的至少20％的胰蛋白酶原已经释放(例如，自裂解)其胰蛋白酶原活化肽，并因此转化为胰蛋白酶。例如，在5小时后，样品中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(优选至少40％)的胰蛋白酶原释放其胰蛋白酶原活化肽并因此转化为胰蛋白酶的条件。优选地，“促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”可以是在5小时后，样品中至少50％的胰蛋白酶原已释放(例如，自裂解)其胰蛋白酶原活化肽并因此转化为胰蛋白酶的条件。所述百分比(％)值是指相对于胰蛋白酶原的基线水平，例如在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤开始后≤1分钟、≤0.5分钟或≤0.1分钟(优选0分钟)的胰蛋白酶原水平。

“促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”可以是在1小时后，样品中存在的至少20％的胰蛋白酶原已经释放(例如，自裂解)其胰蛋白酶原活化肽并因此转化为胰蛋白酶的条件。例如，在10小时后，样品中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(优选至少40％)的胰蛋白酶原释放其胰蛋白酶原活化肽并因此转化为胰蛋白酶的条件。优选地，“促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”可以是在5小时后，样品中至少50％的胰蛋白酶原已释放(例如，自裂解)其胰蛋白酶原活化肽并因此转化为胰蛋白酶的条件。所述百分比(％)值是指相对于胰蛋白酶原的基线水平，例如在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤开始后≤1分钟、≤0.5分钟或≤0.1分钟(优选0分钟)的胰蛋白酶原水平。

“促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”可以是在10小时后，样品中存在的至少20％的胰蛋白酶原已经释放(例如，自裂解)其胰蛋白酶原活化肽并因此转化为胰蛋白酶的条件。例如，在15小时后，样品中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(优选至少50％)的胰蛋白酶原释放其胰蛋白酶原活化肽因此被转化为胰蛋白酶的条件。优选地，“促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”可以是在20小时后，样品中至少50％(优选至少80％)的胰蛋白酶原已释放(例如，自裂解)其胰蛋白酶原活化肽并因此转化为胰蛋白酶的条件。所述百分比(％)值是指相对于胰蛋白酶原的基线水平，例如在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤开始后≤1分钟、≤0.5分钟或≤0.1分钟(优选0分钟)的胰蛋白酶原水平。

优选地，所述测定在胰蛋白酶抑制剂(例如，以抑制胰蛋白酶活性的浓度)存在下进行。合适的胰蛋白酶抑制剂的实例包括二异丙基氟磷酸、3,4-二氯异香豆素丝氨酸蛋白酶抑制剂、苄脒盐酸盐和4-脒苯基甲磺酰基氟化物盐酸盐丝氨酸蛋白酶抑制剂。优选的胰蛋白酶抑制剂是二异丙基氟磷酸，优选浓度为0.05-0.15mM(更优选约0.10mM)。

相反，“不促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”可以是其中胰蛋白酶原基本上不具有蛋白水解活性的条件。因此，“不促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”可以是这样的条件，其中在1小时后，样品中存在的胰蛋白酶原的少于20％已经释放(例如，自动裂解)其胰蛋白酶原活化肽并因此被转化为胰蛋白酶。例如，在1小时后，样品中少于15％、10％、5％、1％或0.01％的胰蛋白酶原释放其胰蛋白酶原活化肽并因此转化为胰蛋白酶的条件。优选地，“促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件”可以是这样的条件，其中在1小时后，样品中的胰蛋白酶原的0％已经释放(例如，自裂解)其胰蛋白酶原活化肽并且因此被转化为胰蛋白酶。

可以通过在合适的金属离子(诸如碱金属离子、碱土金属离子和/或镧系元素离子)存在下孵育胰蛋白酶原来促进(例如，加速)胰蛋白酶原的蛋白水解活性。合适的金属离子的具体实例包括钙、锶、钡、镁、钠、锂、钾、铵、铷、铯和/或钕的阳离子。为了便于使用，阳离子可以与适当的阴离子结合，诸如硫酸根、柠檬酸根、乙酸根、氯化物和/或氟化物阴离子。可以加入金属离子(例如，阳离子)(例如在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤中)至终浓度为至少10mM；更优选至少20mM。例如，可以加入金属离子至终浓度为20-150mM。在一个优选的实施方案中，加入金属离子至终浓度为50-100mM。

在一个实施方案中，通过加入钙(例如，Ca⁺⁺)来促进复性胰蛋白酶原和/或胰蛋白酶原的蛋白水解活性。

在一个实施方案中，在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，第一方面的步骤c、第二方面的步骤h)中，可以加入钙至终浓度为至少10mM，优选至少20mM。例如，在所述步骤中，可以加入钙至终浓度为20-150mM，优选50-100mM。

在一个实施方案中，在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，第一方面的步骤c、第二方面的步骤h)中，将样品孵育5-48小时，优选5-20小时。(在步骤c)中)样品可以在15-30℃(优选约25℃)的温度孵育。有利地，此类温度可以促进胰蛋白酶/胰蛋白酶原的催化活性。

附加地或可替代地，此类促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件可以包括存在有利于胰蛋白酶原自溶的最佳pH，从而刺激胰蛋白酶原中的基础水平的蛋白水解活性。因此，可以以适当的方式调节pH以促进所述蛋白水解活性。

通过提高用于自溶的胰蛋白酶原的基础水平(使得胰蛋白酶原自身转化为完全活性的胰蛋白酶)，所得的胰蛋白酶可进一步有助于剩余的胰蛋白酶原的蛋白水解裂解，从而允许胰蛋白酶的有效产生。有利地，这避免了提供外源胰蛋白酶(或其它非胰蛋白酶原蛋白水解肽)以促进/催化活化的需要，其可以是低纯度的和/或具有危害该方法的GMP状态的污染物。

在一个优选的实施方案中，通过加入钙来促进(例如，刺激)复性胰蛋白酶原的蛋白水解活性。

可以加入钙(在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下将纯化的复性胰蛋白酶原孵育的步骤中，例如在步骤h中)至终浓度为至少10mM；更优选至少20mM。例如，可以加入钙(在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下将纯化的复性胰蛋白酶原孵育的步骤中，例如在步骤h中)至终浓度为20-150mM。

在一个优选的实施方案中，加入钙(在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下将纯化的复性胰蛋白酶原孵育的步骤，例如在步骤h中)至终浓度为50-100mM。

本发明人已经鉴定了活化步骤(例如，步骤h)的有利的孵育时间和温度，例如其使得活化的β-胰蛋白酶产量良好，但是没有可导致β-胰蛋白酶自裂解的“过度活化”(例如，变成不太优选的α-胰蛋白酶)。

在一个实施方案中，在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h)(活化步骤)中，样品孵育5-48小时；优选5-20小时。

在在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下将纯化的复性胰蛋白酶原孵育的步骤中(例如，步骤h))，样品可以在15-30℃(例如，约25℃)的温度孵育。

为了确保胰蛋白酶原在纯化过程中不表现出蛋白水解活性，该方法步骤可以有利地在不促进(复性)胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下进行。

在(例如，所述第一方面的)一个实施方案中，步骤a)和b)在不存在促进蛋白水解活性的金属离子(例如，使得钙不能用于促进蛋白水解活性)的情况下进行。附加地或可替代地，(例如，所述第一方面的)步骤ii)、iii)、iv)和/或v)在不存在此类金属离子的情况下进行。此类金属离子包括钙、锶、钡、镁、钠、锂、钾、铵、铷、铯和钕的阳离子。

在(例如，第二方面的)一个实施方案中，步骤f)和g)在不存在促进蛋白水解活性的金属离子(例如，使得钙不能用于促进蛋白水解活性)的情况下进行。附加地或可替代地，(例如，第二方面的)步骤b)、c)、d)和/或e)在不存在此类金属离子的情况下进行。此类金属离子包括钙、锶、钡、镁、钠、锂、钾、铵、铷、铯和钕的阳离子。

术语“不存在促进蛋白水解活性的金属离子”是指基本上没有此类金属离子(例如，此类金属离子的浓度低于促进蛋白水解活性所需的阈值)。参考“基本上没有此类金属离子”可以指金属离子浓度≤2mM、≤1mM或≤0.5mM；优选≤0.1mM。在一个更优选的实施方案中，“基本上没有金属离子”是指没有此类金属离子存在。

在(例如，第一方面的)一个实施方案中，步骤a)和b)在不存在钙(例如，因此钙不能用于促进蛋白水解活性)的情况下进行。附加地或可替代地，(例如，第一方面的)步骤ii)、iii)、iv)和/或v)在不存在钙的情况下进行。

在(例如，第二方面的)的一个优选的实施方案中，步骤a)、b)、ii)、iii)、iv)和/或v)在不存在钙的情况下进行。例如，(例如，第二方面的)步骤a)、b)、ii)、iii)、iv)和v)中的每一个可以在不存在钙的情况下进行。

在(例如，第二方面的)一个实施方案中，步骤f)和g)在不存在钙(例如，因此钙不能用于促进蛋白水解活性)的情况下进行。附加地或可替代地，(例如，第二方面的)步骤b)、c)、d)和/或e)在不存在钙的情况下进行。

在(例如，第二方面的)一个优选的实施方案中，步骤b)、c)、d)、e)、f)和/或g)在不存在钙的情况下进行。例如，步骤b)、c)、d)、e)、f)和g)中的每一个可以在不存在钙的情况下进行。

术语“不存在钙”是指基本上没有钙(例如，钙的浓度低于促进蛋白水解活性所需的阈值)。参考“基本上没有钙”可以指钙浓度为≤2mM、≤1mM或≤0.5mM；优选≤0.1mM。在一个更优选的实施方案中，“基本上没有钙”是指没有钙存在。

适当地，(例如，第一方面的)步骤b)和/或步骤c)可以在1-10℃的温度进行；优选2-8℃。合适地，(例如，第二方面的)步骤ii)和/或步骤iii)可以在1-10℃的温度进行；优选2-8℃。

本发明人已经发现，通过本发明的方法生产的β-胰蛋白酶制剂比现有技术的β-胰蛋白酶制剂具有更高的纯度，并且表现出更高的蛋白水解活性水平。

本发明提供了一种β-胰蛋白酶组合物(例如，可通过本文所述的方法获得)，其中组合物中包含的总多肽的至少80％是β-胰蛋白酶，并且其中组合物的活性水平为至少3000USP单位/mg总多肽，任选地其中通过测定来确定活性水平，该测定包含：

a)将0.075mLβ-胰蛋白酶组合物(例如，试验样品)与3.125mL包含底物N_α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)、磷酸钠和盐酸(或由其组成)的反应缓冲液混合，反应缓冲液的温度为25℃，以提供一种混合物，该混合物具有：

i.0.25mM BAEE；

ii.67mM磷酸钠缓冲液；

iii.0.031-0.063mM盐酸；

iv.在25℃pH为7.6；和

v.体积为3.2mL；

b)在25℃孵育4分钟；

c)通过紧接在制备混合物之后和步骤b)孵育之后检测混合物在253nm的吸光度(A₂₅₃)，来测量底物BAEE的裂解量；并且使用下式计算β-胰蛋白酶组合物中酶的BAEE单位(U)/ml：

其中：A₁是紧接在制备混合物之后的A₂₅₃；

A₂是孵育4分钟后混合物的A₂₅₃，

t是孵育的持续时间；

DF是稀释因子；

A_253/分钟是0.001；和

V是混合物中β-胰蛋白酶组合物的体积0.075mL；和

通过将BAEE U/ml除以β-胰蛋白酶组合物的浓度(例如，多肽的mg/ml(mg/ml ofpolypeptide))，随后除以3，将BAEE单位/ml转化为USP单位/mg。

另一方面，本发明提供了一种β-胰蛋白酶组合物(例如，可通过本文所述的方法获得)，其中组合物中包含的总多肽的至少80％是β-胰蛋白酶，并且其中组合物的活性水平为至少3000USP单位/mg总多肽，任选地其中通过测定来确定活性水平，该测定包含：

i.0.25mM BAEE；

ii.67mM磷酸钠缓冲液；

iii.0.031-0.063mM盐酸；

iv.在25℃pH为7.6；和

v.体积为3.2mL；

b)在25℃孵育5分钟；

其中：A₁是紧接在制备所述混合物之后的A₂₅₃；

A₂是孵育后混合物的A₂₅₃，

t是孵育的持续时间；

DF是稀释因子；

A_253/分钟是0.001；以及

V是混合物中β-胰蛋白酶组合物的体积0.075mL；和

通过将BAEE U/ml除以β-胰蛋白酶组合物的浓度(例如，多肽的mg/ml)，随后除以3，将BAEE单位/ml转化为USP单位/mg。

另一方面，本发明提供了一种β-胰蛋白酶组合物(例如，可通过本文所述的方法获得)，其中该组合物中包含的总多肽的至少80％是β-胰蛋白酶，并且其中该组合物的活性水平为至少3000USP单位/mg总多肽，任选地，其中通过测定来确定活性水平，该测定包含：

i.0.075mlβ-胰蛋白酶组合物；

ii.0.25mM BAEE；

iii.67mM磷酸钠缓冲液；

iv.0.031-0.063mM盐酸；

v.在25℃pH为7.6；和

vi.体积为3.2mL；

b)提供不与β-胰蛋白酶组合物混合的对照样品，该对照样品包含(或由其组成)：

i.0.25mM BAEE；

ii.67mM磷酸钠缓冲液；

iii.0.031-0.063mM盐酸；

iv.在25℃pH为7.6；

v.体积为3.2mL；和

vi.无β-胰蛋白酶组合物；

c)将步骤a)的混合物和步骤b)的对照样品在25℃孵育5分钟；

d)通过以下测量底物BAEE的裂解量：每分钟检测步骤a)的混合物在253nm的吸光度(A₂₅₃)，持续5分钟；每分钟检测步骤b)的对照品在253nm的吸光度(A₂₅₃)，持续5分钟；使用步骤a)的混合物和步骤b)的对照样品的最大线性速率获得ΔA₂₅₃/分钟；以及使用下式计算β-胰蛋白酶组合物中酶的BAEE单位(U)/ml：

其中：df是稀释因子；

0.001＝基于单位定义的A₂₅₃/分钟的变化；

0.075ml＝混合物中β-胰蛋白酶组合物的体积；

通过将BAEE U/ml除以β-胰蛋白酶组合物(例如，多肽的mg/ml)的浓度，然后除以3，将BAEE单位/ml转化为USP单位/mg。

术语“紧接在制备混合物之后”可以指在制备混合物后≤15秒、≤10秒、≤5秒或≤1秒。

测量吸光度A₂₅₃时(例如，用分光光度计)，光路优选为1cm。测量吸光度A₂₅₃时(例如，用分光光度计)，包含待测样品的容器(例如，比色皿)中的体积优选为3.2ml。

胰蛋白酶活性的一个BAEE单位产生每分钟0.001的A₂₅₃变化(例如，增加)，其中以BAEE作为底物，在25℃、pH 7.6，在3.20ml的反应体积中。因此，0.001是基于单位定义的A₂₅₃/分钟的变化。

使用稀释因子(DF)，这是因为通常通过在较大体积(例如，缓冲液)中稀释混合物的等分试样以提供稀释的样品同时在所述稀释样品中测量A₂₅₃来检测A₂₅₃。例如，当混合物的10μl等分试样以1mL的体积稀释时，稀释系数为100。

所述β-胰蛋白酶组合物(例如，可通过本文所述的方法获得)的活性水平可以是至少3500USP单位/mg、4000USP单位/mg、4500USP单位/mg或5000USP单位/mg总多肽。

在一个实施方案中，包含在组合物中的总多肽的至少85％(优选至少90％；更优选至少95％)是β-胰蛋白酶。

通过本发明的方法生产的β-胰蛋白酶特别有利于通过裂解单链梭菌神经毒素生产活性的双链梭菌神经毒素来活化梭菌神经毒素(例如BoNT，诸如BoNT/E)。

在一个实施方案中，本发明的方法还包括使具有活化环的单链梭菌神经毒素与β-胰蛋白酶(例如，通过本文所述方法生产的β-胰蛋白酶)接触，其中β-胰蛋白酶水解单链梭菌神经毒素的活化环的肽键，从而生产双链梭菌神经毒素。

本发明的一个方面提供了一种生产双链梭菌神经毒素的方法，该方法包含：

a.提供具有活化环的单链梭菌神经毒素；和

b.使单链梭菌神经毒素与本文公开的β-胰蛋白酶组合物(例如可通过本文所述的方法获得)接触；

c.其中β-胰蛋白酶水解单链梭菌神经毒素活化环的肽键，从而生产双链梭菌神经毒素。

本发明还包括可通过此类方法(本文公开的生产双链梭菌神经毒素的方法)获得的双链梭菌神经毒素。

优选地，所述梭菌神经毒素是肉毒杆菌神经毒素。合适的肉毒杆菌神经毒素血清型的实例包括A、B、C1、D、E、F和G。在一个优选的实施方案中，肉毒杆菌神经毒素是肉毒杆菌神经毒素血清型E(BoNT/E)。

肉毒杆菌神经毒素(BoNT)由肉毒杆菌(C.botulinum)以大蛋白复合物的形式生产，该复合物由BoNT本身与多种辅助蛋白复合组成。有七种不同类型的肉毒杆菌神经毒素，即：肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，它们都具有相似的结构和作用模式。不同的BoNT血清型可基于通过特异性中和抗血清的灭活来加以区分，此类血清型分类与氨基酸水平上的百分比序列同一性相关。基于氨基酸百分比序列同一性，将给定血清型的BoNT蛋白进一步分成不同亚型。

在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其在翻译后被蛋白水解裂解事件修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。裂解发生在特定的裂解位点，通常称为活化位点，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。这种双链形式正是毒素的活性形式。这两条链被称为重链(H链)(分子量为约100kDa)和轻链(L链)(分子量为约50kDa)。H链包含C末端靶向部分(H_C结构域)和N末端易位组分(H_N结构域)。裂解位点位于L链和易位组分之间。在H_C结构域与其目标神经元结合并且结合的毒素通过内体内化至细胞中之后，H_N结构域使L链易位穿过内体膜并进入胞质溶胶，并且L链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解裂解被称为SNARE蛋白(例如，SNAP-25、VAMP或Syntaxin)的细胞内转运蛋白起作用——参见Gerald K(2002)《细胞分子生物学(Cell andmolecular biology)》(第4版)约翰威利父子出版公司(John wiley and Sons)。首字母缩略词SNARE来源于术语可溶性NSF附着受体，其中NSF是指N-乙基马来酰亚胺敏感因子。SNARE蛋白与细胞内囊泡融合体整合，并因此通过囊泡转运从细胞分泌分子。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，并表现出对SNARE蛋白的高底物特异性。因此，一旦递送至期望的目标细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制目标细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L链蛋白酶是裂解SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。

当单链BoNT/E1蛋白(例如)与胰蛋白酶接触时，胰蛋白酶的蛋白水解作用在L链蛋白酶组分和易位组分之间的位点裂解单链蛋白以产生双链蛋白，其中两个链通过二硫桥连接。更详细地说，在活化位点裂解单链BoNT/E后形成的两条链是氨基酸残基1-419的第一链和氨基酸残基423-1252的第二链，通过裂解事件去除残基420、421和422。因此，β-胰蛋白酶可用于通过将单链多肽转化为活性二链形式来活化单链多肽。因此，有利地，使用β-胰蛋白酶是指不需要将外源(非天然)裂解位点工程化至本发明的BoNT/E1。

BoNT/E的示例性L链参考序列包括BoNT/E的氨基酸残基1-422。然而，该参考序列应当被认为是指导，因为可以根据亚血清型发生轻微变化。例如，US 2002/0166332(通过引用将其整体并入本文)引用了氨基酸残基M1-R422的略微不同的BoNT/E L链序列。

BoNT/E H_C结构域参考序列的实例包括氨基酸残基R846-K1252。

BoNT/E的L链可以如下(SEQ ID NO：2)：

BoNT/E的H链可以如下(SEQ ID NO：3)：

BoNT/E的H_C结构域包含两个不同的结构特征，称为H_CC和H_CN结构域。认为参与受体结合的氨基酸残基主要位于H_CC结构域中。BoNT/E H_CN结构域参考序列的实例包括氨基酸残基846-1085。

上述序列位置可根据亚型略有不同，合适的(参考)BoNT/E H_CN结构域的其它实例包括氨基酸残基848-1085。

BoNT/E可以由肉毒杆菌(C.botulinum)或丁酸杆菌(C.butyricum)生产，优选肉毒杆菌。在一个实施方案中，在非梭菌细胞中生产BoNT/E。可替代地(优选地)可以以重组形式(例如，在大肠杆菌中)生产BoNT/E。因此，在一个实施方案中，用于本发明的BoNT/E在异源表达系统(诸如大肠杆菌)中生产。在一个实施方案中，大肠杆菌细胞是大肠杆菌BLR(DE3)。

关于在异源表达系统(诸如大肠杆菌)中生产的BoNT/E的进一步详细信息被描述于WO 2014/068317 A1中，其通过引用并入本文。

在一个实施方案中，提及β-胰蛋白酶包括在与胰蛋白酶相同蛋白酶裂解位点处裂解的胰蛋白酶样酶。

胰蛋白酶裂解蛋白序列，其中特定氨基酸位于裂解肽键任一侧的某些位置。此类序列可由命名P4-P3-P2-P1-裂解键-P’1-P’2-P’3-P’4表示；其中P1至P4分别表示位于裂解的肽键的N末端侧的1至4个位置的氨基酸，并且P’1至P’4分别表示裂解的肽键的C末端的1至4个位置。

最特别地，胰蛋白酶裂解其中Arg或Lys氨基酸占据P1位置的蛋白序列。当Lys处于P1位置时，有三种主要类型的序列对胰蛋白酶不敏感：

(1)P’1位置的Pro通常降低对胰蛋白酶裂解的敏感性(但当Trp处于P2位置时不降低)；

(2)P2位置的Cys或Asp连同P’1位置的Asp降低对胰蛋白酶裂解的敏感性；和

(3)P2位置的Cys与P’1位置的His或Try一起降低对胰蛋白酶裂解的敏感性。

当Arg处于P1位置时，还有三种主要类型的序列对胰蛋白酶不敏感：

(1)P’1位置的Pro通常降低对胰蛋白酶裂解的敏感性(但当Met或可能Glu处于P2位置时不降低)；

(2)P2位置的Cys与P’1位置的Lys一起降低对胰蛋白酶裂解的敏感性；和

(3)P2位置的Arg与P’1位置的His或Arg一起降低对胰蛋白酶裂解的敏感性。

生产双链梭菌神经毒素的方法可进一步包括从β-胰蛋白酶分离双链梭菌神经毒素的步骤。

合适的方法描述于WO2014/068317中，其通过引用并入本文。例如，所述方法还可包含通过使含有双链梭菌神经毒素蛋白和β-胰蛋白酶的溶液与疏水性表面接触来从β-胰蛋白酶分离双链梭菌神经毒素蛋白，其中双链梭菌神经毒素蛋白优先结合至疏水性表面。

胰蛋白酶原是一种无活性的酶原，其通过裂解和去除前导序列而转化为胰蛋白酶。例如，胰蛋白酶原可以具有存在于蛋白N末端的包含序列Val(Asp)₄Lys(SEQID NO：5)的前导序列。合适的胰蛋白酶原的实例包括牛、人、猪、绵羊和/或鼠胰蛋白酶原。

在一个实施方案中，胰蛋白酶原是野生型胰蛋白酶原(并且因此，β-胰蛋白酶是野生型胰蛋白酶)。

在一个优选的实施方案中，胰蛋白酶原(且因而还有β-胰蛋白酶)是牛胰蛋白酶原。因此，本文所述方法的原核宿主细胞可包含编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列。

编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1具有至少80％或90％的序列同一性。

编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1具有至少70％的序列同一性，优选条件是该序列的5’端的核苷酸1-45对应于SEQ ID NO：1的5’端的核苷酸1-45。在一个实施方案中，编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1具有至少80％或90％的序列一致性，优选条件是该序列的5’端的核苷酸1-45对应于SEQ ID NO：1的5’端的核苷酸1-45。

优选地，编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO：1的序列(或由SEQID NO：1的序列组成)。

胰蛋白酶原序列可进一步包含或融合于促进重组蛋白纯化的序列。例如，胰蛋白酶原序列可包含His-标签(多组氨酸标签)，其是具有至少4个(优选至少6个)连续组氨酸残基的氨基酸基序。此类His-标签可合适地用于所标记的胰蛋白酶原的亲和纯化。

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，其催化碱性氨基酸残基(诸如赖氨酸和精氨酸)的羧基末端上的肽键的裂解。胰蛋白酶蛋白分类为EC 3.4.21.4。丝氨酸蛋白酶催化水解肽(和酯)底物的详细机理已经建立并且是本领域已知的，胰蛋白酶是这类酶中特别熟知的成员。胰蛋白酶的优选形式是β-胰蛋白酶，也称为胰蛋白酶原活化后提供的天然形式的胰蛋白酶。β-胰蛋白酶(其可以在牛序列中的Lys131-Ser132处裂解)的自溶产生通过二硫键结合在一起的α-胰蛋白酶。

胰蛋白酶是自催化的，因此自身裂解(例如，裂解成α-胰蛋白酶和/或裂解成无活性肽)。有利地，一旦产生胰蛋白酶，可以加入蛋白水解活性(例如，钙介导的蛋白水解活性)的抑制剂，以防止进一步裂解。

在一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包含加入螯合剂(其可以结合并螯合金属离子)以抑制胰蛋白酶原和/或β-胰蛋白酶的蛋白水解活性。有利地，一旦产生β-胰蛋白酶，这可以通过防止金属离子(例如，钙)介导的蛋白水解活性的促进来减轻β-胰蛋白酶的自溶。例如，螯合剂(诸如钙螯合剂)的加入可用于停止/猝灭在第一方面的步骤c)和第二方面的步骤h)中促进的蛋白水解活性。

优选地，所述螯合剂是钙螯合剂。

优选的螯合剂包括EDTA、HEDTA、EDG、EDDS、GLDA、MGDA、其异构体或其组合，特别是EDTA。

可以进行进一步的纯化(或“精制”)步骤以进一步提高β-胰蛋白酶产物的纯度水平。例如，本发明人已经发现，使β-胰蛋白酶进行亲和层析步骤可用于从α-胰蛋白酶中分离β-胰蛋白酶。

在一个实施方案中，本发明的方法(例如，第二方面)可进一步包含分离β-胰蛋白酶。

在一个实施方案中，通过亲和层析分离β-胰蛋白酶，优选苄脒亲和层析。

“诱导型启动子”是一旦启动子的活性被诱导就促进与启动子可操作连接的核苷酸序列(例如，基因)转录的核酸序列。加入合适的诱导因子可以调节(诱导)诱导型启动子。因此，通过引入诱导因子将启动子从“关”状态转换到“开”状态，诱导型启动子可用于调节可操作地连接的基因的转录/表达。一种合适的诱导因子是异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)。

通过与诱导型启动子“可操作地连接”，与诱导型启动子可操作地连接的核苷酸序列(例如，基因)的转录处于诱导型启动子的控制下，使得核苷酸序列将在引入诱导因子后转录(将启动子从“关”状态切换至“开”状态)。

有利地，通过诱导表达(根据步骤b))，可以提供转录和表达的“突发(burst)”，这导致表达的胰蛋白酶原在不溶性包涵体中的比例增加。

在一个实施方案中，通过加入IPTG诱导胰蛋白酶原的表达。优选地，加入IPTG以提供0.25-0.75mM的终浓度，更优选约0.5mM。

优选胰蛋白酶原的表达被诱导至少4小时；更优选胰蛋白酶原的表达被诱导至少6小时。

在一个实施方案中，胰蛋白酶原的表达被诱导至少4-12小时。例如，胰蛋白酶原的表达可被诱导至少6-10小时。

在一个特别优选的实施方案中，胰蛋白酶原的表达被诱导约8小时。

发明人已经发现监测培养物的生长是有利的，并且已经发现从特定生长阶段(例如，如通过光密度测量)的培养物中纯化β-胰蛋白酶使产率提高。

在一个实施方案中，将宿主细胞培养至600nm(OD₆₀₀)为35-65；或更优选为OD(OD₆₀₀)为40-60。

本文所述的一个或多个方法步骤之后可以是过滤步骤，优选渗滤步骤。

例如，可以在本发明所述的用于生产β-胰蛋白酶的方法的使纯化的变性胰蛋白酶原复性的步骤(例如，步骤f)之后，对复性胰蛋白酶原进行过滤(例如，渗滤)，从而生产复性胰蛋白酶原。

在一个实施方案中，可以对β-胰蛋白酶(通过本发明的方法生产)进行过滤(例如，渗滤)步骤。例如，其中该方法还包含分离β-胰蛋白酶(例如，通过亲和层析)，纯化的β-胰蛋白酶可以进行过滤(例如，渗滤)步骤。

所述过滤优选包含使复性胰蛋白酶原、β-胰蛋白酶和/或亲和层析纯化的β-胰蛋白酶经受过滤步骤，该过滤步骤去除具有大小小于约0.2微米的分子。

附加地或可替代地，所述过滤步骤可以包含切向流过滤，例如使用0.5m²或0.2m²盒。

此外，本发明人已经为本文所述的许多方法步骤揭示了特别合适的操作条件，这可以优化纯化方案，使得β-胰蛋白酶产率和纯度进一步提高。这些优化条件的实例概述于下文，其中提到步骤是指在本文所述的第二方面的方法中的相应步骤。在实施例中提供了所提及的缓冲液的详情。

例如，从宿主细胞中分离一种或多种不溶性包涵体的步骤(例如，步骤c)可包含以下步骤中的一个或多个(或全部)：从原核细胞的培养物提供细菌沉淀(例如，通过使原核细胞的培养物经受离心作用)；将沉淀重悬于合适的缓冲液中，诸如SM-E01缓冲液(在实施例中描述)；裂解细菌细胞以提供裂解物，例如通过匀浆，优选在650-750巴的压力；由裂解物提供沉淀(例如，通过使裂解物离心)；洗涤裂解物，优选通过裂解物在SM-F01和/或SM-F02缓冲液中的重悬(在实施例中描述)。所述步骤中的一个或多个(优选全部)的温度可以是2-8℃。

溶解一种或多种不溶性包涵体从而生产变性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤d))可以包含以下步骤中的一个或多个(或全部)：将IB重悬于合适的缓冲液中，诸如S-F01缓冲液(在实施例中描述)，例如通过匀浆(例如，以250-400rpm的转速搅拌12-15小时，以提供溶解的变性胰蛋白酶原；将溶解的变性胰蛋白酶原进行离心(例如，以700-900rpm保持50-50分钟)，并保留上清液；将上清液进行过滤，例如用孔径为0.2μm的过滤器进行过滤。所述步骤中的一个或多个(或全部)的温度可以是2-8℃。

通过阳离子交换层析对变性胰蛋白酶原进行纯化从而提供纯化的变性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤e))可以包含以下步骤中的一个或多个(或全部)：用合适的缓冲液(如实施例中所述的S-F02缓冲液)平衡柱，优选其中柱体积为1492-1649mL和/或床高为15-25cm(优选20cm)和/或填充有Eshmuno S树脂；将变性胰蛋白酶原装载至柱上；用合适的缓冲液(如实施例中所述的S-F02缓冲液)洗涤柱；用合适的缓冲液(如实施例中所述的S-G01缓冲液)从柱上洗脱变性胰蛋白酶原，以提供纯化的变性胰蛋白酶原。

使纯化的变性胰蛋白酶原复性从而生产复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤f))可以包含以下步骤中的一个或多个(或全部)：向纯化的变性胰蛋白酶原中加入合适的缓冲液(如实施例中所述的S-H01缓冲液)，以提供0.05-0.5mg/ml(优选约0.1mg/ml)的纯化的变性胰蛋白酶原浓度；例如以200rpm搅拌该溶液；将溶液孵育48-168小时；对溶液进行过滤，例如用孔径为0.2μm和/或0.5μm的过滤器。所述步骤中的一个或多个(或全部)的温度可以是2-8℃。

通过阴离子交换层析对复性胰蛋白酶原进行纯化从而提供纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤g))可以包含以下步骤中的一个或多个(或全部)：用合适的缓冲液(如实施例中所述的S-H02缓冲液)平衡柱，优选其中柱体积为177-216ml和/或床高为5-15cm(优选10cm)和/或填充有Eshmuno Q树脂；将复性胰蛋白酶原装载至柱上；收集流通液，得到纯化的复性胰蛋白酶原；用合适的缓冲液(如实施例中所述的S-H02缓冲液)洗涤柱。所述步骤中的一个或多个(或全部)的温度可以是2-8℃。

在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育纯化的复性胰蛋白酶原的步骤，其中胰蛋白酶原通过所述蛋白水解活性裂解成β-胰蛋白酶(例如，步骤h))，可以包含以下步骤中的一个或多个(或全部)：在钙(例如S12缓冲液，如实施例中所述)存在下孵育纯化的复性胰蛋白酶原，其中钙以60-90mM(优选约75mM)的浓度存在；加入钙螯合剂(例如S-K01缓冲液，如实施例中所述)，优选调节pH至7.2-7.6(例如用S-01缓冲液，如实施例中所述)；对溶液进行过滤，例如用孔径为0.2μm和/或0.5μm的过滤器。所述孵育可以在20-25℃的温度进行。

序列同源性

可以使用多种序列比对方法中的任一种来确定百分比同一性，包括但不限于全局方法、局部方法和杂交方法，例如片段接近方法。确定百分比同一性的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法将序列从分子的开始到末端进行比对，并通过将单个残基对的分数相加并施加缺口罚分来确定最佳比对。限制性方法包括例如CLUSTAL W，例如参见Julie D.Thompson等人,“CLUSTAL W：通过序列加权、位置特定缺口罚分和权重矩阵选择来提高渐进多序列比对的灵敏度(CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of ProgressiveMultiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific GapPenalties and Weight Matrix Choice)”，22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；以及迭代细化，例如参见Osamu Gotoh,“多蛋白准确度显著提高。通过参照结构比对评估的迭代细化的序列比对(Significant Improvement in Accuracy of MultipleProtein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Referenceto Structural Alignments)”,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴定所有输入序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括例如Match-box，例如参见Eric Depiereux和Ernest Feytmans，“Match-Box：用于多个蛋白序列的同时比对的全新算法(Match-Box:A Fundamentally New Algorithm for the SimultaneousAlignment of Several Protein Sequences)”,8(5)CABIOS 501 -509(1992)；吉布斯抽样(Gibbs sampling)，例如参见C.E.Lawrence等人,“检测细微序列信号：用于多重比对的吉布斯抽样策略(Detecting Subtle Sequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy forMultiple Alignment)”，262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，例如参见Ivo VanWaIIe等人,“Align-M——高度趋异序列多重比对的新算法(Align-M-A New Algorithmfor Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences)”,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。

因此，通过常规方法确定序列同一性百分比。例如，参见Altschul等人，Bull.Math.Bio.48:603-16，1986以及Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-19,1992。简而言之，使用缺口开放罚分10、缺口延伸罚分1以及Henikoff和Henikoff(同上)的“blosum 62”评分矩阵，对两个氨基酸序列进行比对以优化比对得分，如下所示(氨基酸用标准一字母代码表示)。

两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是序列共有的相同位置数目的函数。因此，同一性百分比可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数乘以100。序列同一性百分比的计算还可以考虑缺口的数量，以及为了优化两个或更多个序列的比对而需要引入的每个缺口的长度。可以使用专业人员熟悉的特定数学算法，诸如BLAST，来进行序列比较以及确定两个或更多个序列之间的同一性百分比。

用于确定序列同一性的比对分数

然后，百分比同一性被计算为：

被引入到较长序列中以使

两个序列对齐的缺口数目]

基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些改变优选具有较小的性质，即保守氨基酸取代(参见下文)以及不显著影响多肽的折叠或活性的其它取代；小的缺失，通常为1至约30个氨基酸；以及小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基、至多约20-25个残基的小接头肽或亲和标签。

保守氨基酸取代

碱性：精氨酸

赖氨酸

组氨酸

酸性：谷氨酸

天冬氨酸

极性：谷氨酰胺

天冬酰胺

疏水性：亮氨酸

异亮氨酸

缬氨酸

芳香族：苯丙氨酸

色氨酸

酪氨酸

小：甘氨酸

丙氨酸

丝氨酸

苏氨酸

甲硫氨酸

除20种标准氨基酸外，非标准氨基酸(诸如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、未被遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。

非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基同型半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌可酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域已知几种将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质中的方法。例如，可使用体外系统，其中使用化学氨基酰化抑制型tRNA来抑制无义突变。合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译在包含大肠杆菌S30提取物和市售酶及其它试剂的无细胞系统中进行。通过层析来纯化蛋白。例如，参见Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman等人,Methods Enzymol.202:301,1991；Chung等人,Science 259:806-9,1993；以及Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9，1993)。在第二种方法中，在非洲爪蟾卵母细胞中通过显微注射突变的mRNA和化学氨基酰化的抑制型tRNA进行翻译(Turcatti等人,J.Biol.Chem.271:19991-8，1996)。在第三方法中，在不存在待替换的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)和存在所需的非天然存在的氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。非天然存在的氨基酸代替其天然对应物掺入多肽中。参见Koide等人，Biochem.33:7470-6,1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化成非天然存在的种类。化学修饰可与定点诱变结合以进一步扩大取代的范围(Wynn和Richards，Protein Sci.2:395-403,1993)。

有限数量的非保守氨基酸、未被遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可取代本发明多肽的氨基酸残基。

可以根据本领域已知的方法来鉴定本发明多肽中的必需氨基酸，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，Science 244:1081-5，1989)。还可以通过结构的物理分析来确定生物相互作用的位点，如通过诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记的技术连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。例如，参见de Vos等人,Science 255:306-12,1992；Smith等人,J.Mol.Biol.224:899-904,1992；Wlodaver等人,FEBS Lett.309:59-64，1992。也可以从与本发明多肽的相关组分(例如易位或蛋白酶组分)的同源性分析来推断必需氨基酸的同一性。

可以使用已知的诱变和筛选方法进行和测试多个氨基酸取代，诸如Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241:53-7，1988)或Bowie和Sauer(美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-6，1989)。简而言之，这些作者公开了用于同时随机化多肽中的两个或更多个位置、选择功能性多肽、然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置上允许的取代谱的方法。可使用的其它方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner等人,美国专利号5,223,409；Huse,WIPO公开号WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,Gene 46:145,1986；Ner等人,DNA 7:127，1988)。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同。Singleton等人，《微生物和分子生物学词典(DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)》，第20版，约翰威利父子出版公司(John wileyand Sons),纽约(1994)；以及Hale和Marham,《哈珀·柯林斯生物学词典(THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)》,Harper Perennial出版社,纽约(1991)为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。

本公开不限于本文公开的示例性方法和材料，并且与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实践或试验本公开的实施方案。数值范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列以5’至3’取向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。

本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制。

本文使用氨基酸的名称三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。本文所用的术语“蛋白”包括蛋白、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换使用。在本发明和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。符合IUPACIUB生物化学命名联合委员会(JCBN)定义的氨基酸的3字母代码。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由一个以上的核苷酸序列编码。

在整个说明书中可以出现术语的其它定义。在更详细地描述示范性实施方案之前，应了解，本发明不限于所描述的特定实施方案，并且因此可变化。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不希望为限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书进行限定。

在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另外清楚地指出，在该范围的上限值和下限值之间的每一个中间值，直到下限值单位的十分之一也被具体地公开。在所述范围中的任何所述值或中间值与所述范围中的任何其它所述值或中间值之间的每个较小范围包括在本发明中。这些较小范围的上限值和下限值可以独立地包括在该范围中或被排除在该范围之外，并且该较小范围中包括任一个限值、不包括任一个限值或包括两个限值的每个范围也包括在本发明之内，受到所述范围中的任何具体排除的限制。当所述范围包括限值中的一个或两个时，排除那些包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本发明中。

必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种蛋白”包括多种此类蛋白，提及“该蛋白”包括提及一种或多种蛋白及其本领域技术人员已知的等价物，等等。

本文所讨论的出版物仅提供它们在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被解释为承认这些出版物构成所附权利要求的现有技术。

附图说明

现在将参考以下附图和实施例，仅以举例的方式描述本发明的实施方案。

图1示出了用于生产β-胰蛋白酶的制备方法的概述。

图2示出了SDS-PAGE凝胶(考马斯蓝染色)，其表明胰蛋白酶原已经成功表达(泳道1)，存在于阳离子交换层析(CEX)后的洗脱中(泳道2)，以及存在于复性和过滤后的滤液中(泳道3)。

图3示出了SDS-PAGE凝胶(考马斯蓝染色)，其表明亲和层析纯化期间β-胰蛋白酶存在于第二峰中，并且因此可与存在于第一峰中的α-胰蛋白酶分离。

图4示出了在所要求保护的方法的不同步骤中提供的蛋白产率和纯度。其表明了三次独立运行的结果。A：表格表明了蛋白产率。B：SDS-PAGE凝胶(考马斯蓝染色)表明随着方法的进行纯度增加，当在CEX之后进行AEX时显示污染物显著减少(比较泳道5和7)。EsmunoS＝CEX；EsmunoQ＝AEX。

图5示出了胰蛋白酶原的RP-HPLC图，其表明在2-8℃长达40小时的稳定性，以及在较高温度(环境/室温)缺乏稳定性。A：当在环境温度重折叠时，胰蛋白酶原的RP-HPLC导致重折叠的胰蛋白酶原聚集和产率降低。如实施例所述进行重折叠(0.1mg/ml重折叠缓冲液，具有20mM Tris、1.5mM GSH、1.5mM GSSG、0.75M L-精氨酸，pH 8)。B：在SH-02缓冲液中重折叠的过滤的胰蛋白酶原的RP-HPLC图表明在2-8℃稳定长达40小时。

图6A示出了在不同L-精氨酸浓度(起始蛋白浓度为约0.1mg/ml)重折叠后复性胰蛋白酶原的RP-HPLC图。B：在用不同(变性的)胰蛋白酶原浓度(在2-8℃，在具有0.75M L-Arg的重折叠缓冲液中)重折叠之后复性胰蛋白酶原的RP-HPLC图。

图7A示出了苄脒亲和层析迹线(trace)，其表明α-胰蛋白酶(第一峰)和β-胰蛋白酶(第二峰)的峰的分离。B：SDS-PAGE分析表明通过苄脒亲和层析的α-胰蛋白酶与β-胰蛋白酶的分离。

实施例

材料和方法

菌株

将大肠杆菌BL21(DE3)用牛胰蛋白酶原表达载体(pET-28b+质粒，其含有在IPTG诱导型启动子控制下的SEQ ID NO：1的序列)转化。为方便起见，在整个实施例中将该菌株称为“RCB”。

缓冲液和培养基

接种物培养基：

接种物(预培养物)培养基组成概述如下。该培养基包含四种溶液，分别通过高压灭菌(121℃，1个标准大气压，20分钟)制备和灭菌。然后在使用前将溶液混合(在层流下)以提供接种物培养基：

/>

生产培养基：

生产培养基(例如，基本发酵罐培养基)组成概述如下。使用前，通过高压灭菌(121℃，1个标准大气压，20分钟)对P1和C1进行灭菌。为了制备生产培养基，将1100mL的N1溶液在发酵罐中通过高压灭菌(在121℃，1个标准大气压，30分钟)进行灭菌。在接种之前，将生产培养基预热至+37℃。生产培养基为(溶液M与上表中相同)：

/>

C2+P2+M溶液

在生物合成过程中使用附加的葡萄糖、镁和微量元素补料溶液(称为C2+P2+M溶液)。在使用之前，将制备的溶液通过高压灭菌(121℃，1个标准大气压，20分钟)灭菌。然后在使用前将溶液P2、C2和M各自混合(在层流(laminar flow)下)。“C2+P2+M”溶液为(溶液M与上表中相同)：

N2溶液

在使用之前通过高压灭菌(121℃，1个标准大气压，20分钟)将N2溶液灭菌。在生产培养期间，在固定时间(fixed times)加入N2溶液(如下所述)。如下加入N2溶液四次(体积用于1.2L w/v发酵过程，并且对于更大规模的发酵过程成比例地增加)：(1)OD600nm为60-70O.U.时，25mL；(2)OD600nm为120-140O.U.时，25mL；(3)诱导(IPTG)后1.5小时，12.5mL；(4)诱导后2小时，12.5mL。N2溶液为：

/>

缓冲液

下表概述了在本发明的各个方法步骤中使用的缓冲液。为方便起见，在实施例全文中提及“缓冲液标识符”。

/>

/>

实施例1

使用大肠杆菌异源表达系统制备β-胰蛋白酶

根据图1中提供的制备方法制备β-胰蛋白酶。下面提供关于制备过程的进一步详情。

1.1.细菌培养和培养过程

首先制备接种物培养物(使用接种物培养基)。提供三个1000mL摇瓶，并将460mL(+/-10mL)接种物培养基添加到每个烧瓶中并加热至30℃。将一小瓶RCB悬浮液(冷冻)解冻(5-20分钟)，并将1-1.5mL RCB接种到烧瓶中的接种培养基中。将烧瓶在30℃(+/-2℃)孵育17-18小时，以300(+/-50)RPM振荡以提供接种物培养物。

然后制备生产培养物。用接种物培养物接种10mL生产培养基，以提供0.5O.U.的(生产培养物的)初始OD600nm。发酵条件如下：

-温度设定点37+/-2℃

-DO设定点20％

-空气流(Air flow)0.3-7L/分钟

-搅动(搅拌)300rpm

-氧气0-7L/分钟

-pH设定点6.8+/-0.2(通过添加NH₄OH调节)

在培养期间，取样用于光密度和葡萄糖浓度测量。当OD600nm达到20O.U.时，开始加入葡萄糖(P2+C2+M溶液)。当OD600nm达到60O.U.时，开始加入N2溶液(进一步的详情在上面标题“N2溶液”下提供)。当生产培养物的OD600nm为约50时，通过加入IPTG(至终浓度为0.5mM)诱导胰蛋白酶原的表达。诱导进行约7小时。

诱导后7小时，通过以8000rpm离心20-30分钟(在4℃)收获生产培养物。收集细胞沉淀并于-20+/-5℃储存直至进一步使用。

进行三次10L生产运行(批次)，以监测生物质产率与胰蛋白酶原表达的一致性。三次运行的结果概述如下：

1.2.包涵体(IB)提取和洗涤

将沉淀以1：4的比率重悬于SM-E01缓冲液(在2-8℃的温度)中。重悬进行20-40分钟。使用GEA Panda匀浆器在650-750巴的压力、在2-8℃进行细胞破碎(以提取IB)持续2个循环。然后当裂解物的温度达到5-15℃时，将pH调节至7.4-7.6。然后将裂解物(包括IB)以8000rpm(Avanti J-26XPI)离心50-55分钟(温度：2-8℃)。

首次IB洗涤：然后用SM-F01缓冲液以1：15的稀释比洗涤(裂解物的)沉淀，并重悬于SM-F01缓冲液中(通过匀浆器15-25分钟)。然后将重悬的材料以8000rpm(Avanti J-26XPI)离心25-35分钟(温度：2-8℃)。

第二次和第三次IB洗涤：然后用SM-F02缓冲液以1：15的稀释比洗涤沉淀，并重悬于SM-F02缓冲液中(通过匀浆器15-25分钟)。然后将重悬的材料以8000rpm(Avanti J-26XPI)离心15-25分钟(温度：2-8℃)。对于第三次IB洗涤重复该步骤。然后将IB于20+/-5℃储存(在袋中)直至进一步使用。

1.3.IB溶解

将IB以1：19的比率(例如，1g IB/19g缓冲液)重悬于S-F01缓冲液中。通过匀浆器重悬12-15小时，以250-400rpm混合直至完全溶解。然后将溶解的物质以800rpm(Avanti J-26XPI-JLA-8.1000转子)离心50-60分钟(温度2-8℃)。然后保留上清液用于进一步使用，并用0.2μm过滤器(Opticap XL300或更大，过滤速度为50-100LHM，过滤器通过量为约4L/m²)过滤。

将上清液的等分试样在SDS-PAGE凝胶上电泳以确认胰蛋白酶原的存在(参见图2)。

1.4.对变性胰蛋白酶原进行纯化

使用具有EshmunoS树脂(Merck Millipore)的柱，通过阳离子交换层析对变性胰蛋白酶原进行纯化。这使得能够去除宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、细菌内毒素和蛋白相关杂质，并且在重折叠前浓缩胰蛋白酶原。

柱的体积为1492-1649mL，床高为20cm。填充该柱以达到以下参数：HETP(cm)≤0.06，A_S为0.6-1.8。

用S-F02缓冲液平衡该柱——流速(cm/h)：目标＝75，范围＝60-80；柱体积(CV)：目标＝7，范围＝6-8。

根据以下参数进行阳离子交换层析(以结合和洗脱模式运行)：

分级在UV280-0.1开始，在UV280-0.09结束。

用S-G01缓冲液将洗脱的材料稀释至10L的体积。将洗脱物质的等分试样在SDS-PAGE凝胶上电泳以确认胰蛋白酶原的存在(参见图2)。

阳离子交换层析条件的更详细概述如下：

1.5.重折叠胰蛋白酶原和过滤

将洗脱材料冷却至2-8℃(并在该温度进行重折叠)。

通过向洗脱材料中加入S-H01缓冲液进行重折叠，以在缓冲液中提供0.1mg/ml蛋白。将溶液以200rpm混合，并在2-8℃孵育48-168小时。随后使用OpticapXL1500.5/0.2μm过滤器过滤溶液。

有利地，在步骤1.6中使用L-精氨酸作为S-H01中的聚集抑制剂不会引起当使用PEG作为聚集抑制剂时发生的过滤器堵塞。

对于S-H01缓冲液，测试了不同浓度的L-精氨酸，RP-HPLC分析(其中较高的峰指示较高的重折叠效率)揭示了特别有利的L-精氨酸浓度。更详细地，在0.5-0.75M(以0.05M增量)存在下测试了胰蛋白酶原的重折叠(蛋白浓度为0.1mg/ml)，揭示了0.75M是重折叠的最有利浓度(参见图6A)。

此外，与更高(例如，0.2mg/ml)或更低(例如，0.075mg/ml)相比，重折叠期间0.1mg/ml的蛋白浓度产生更高产率的复性胰蛋白酶原，参见图B。

本发明人发现胰蛋白酶原在低温(例如，2-8℃)长时间(≥36h，参见图5A)保持稳定，允许重折叠进行至完成。

重折叠的操作参数概述如下：

1.6.UF/DF之前过滤

将复性胰蛋白酶原以实验室规模的最大可用速度400LHM过滤通过OpticapXL1500.5/0.2μm。最终操作参数如下：

使用追踪缓冲液(50mM Tris，pH 7.4)将任何剩余的重折叠蛋白冲洗出过滤器，操作参数如下：

参数	当前实验室规模	GMP(1克规模)
			用缓冲液洗涤过滤器，L/m²	1	1
过滤，巴	<2	<2
			过滤器洗涤，L/m²	5	5

1.7.超滤/渗滤(切向流过滤，TFF)

使用切向流过滤来减小体积，并且透析到适于活化步骤的缓冲液(缺乏L-精氨酸)中。这在阴离子交换层析(AEX)之前进行，使得(来自AEX柱的)流处于准备用于活化步骤的缓冲液中。

通过在切向流过滤中使用选择性的膜大小，该过滤器装置可用于进行蛋白浓缩(超滤)和透析(渗滤)，通常缩写为UF/DF。使用10kDa(低于目标蛋白2-3倍)的截留分子量(MWCO)。该大小保留了目标蛋白，但允许高粘性的L-精氨酸缓冲液通过。使用“MilliporePellicon 2，A型筛滤器”(MWCO 10kDa)(在渗透物中没有观察到蛋白)。

UF/DF可使得蛋白体积减小10x，以及缓冲液交换(渗滤)。

因此，用截留分子量为10kDa的过滤器(Millipore Pellicon 2)过滤(复性胰蛋白酶原的)溶液。将溶液浓缩10倍。操作条件概述如下：

然后使用渗滤模式实现缓冲液交换(到S-H02缓冲液中)，其中将S-H02缓冲液以与通过渗透物去除当前缓冲液(S-H01)相同的速率加入到渗余物系统中。剩余体积(diavolume)(DV)是当缓冲液的渗余物体积已交换时。当渗透物电导率和pH达到目标值时，渗滤过程结束。操作条件概述如下：

将所得TFF渗余物的等分试样在SDS-PAGE凝胶上电泳以确认胰蛋白酶原的存在(参见图2)。

运行三个批次(根据步骤1.1-1.6)以监测生物质、IB和蛋白生产的一致性。三个批次的结果概述如下：

1.8.对复性胰蛋白酶原进行纯化

使用具有Eshmuno Q树脂(Merck Millipore)的柱，通过阴离子交换层析(以流通(flow through)模式运行)对复性胰蛋白酶原进行纯化。有利地，由于胰蛋白酶原与这些杂质之间的净电荷差异，这可使得进一步去除细菌内毒素和宿主细胞DNA(使得杂质被有效地保留，从而将其从存在于流通中的胰蛋白酶原去除)。

柱的体积为177-216mL，床高为10cm。填充该柱以达到以下参数：HETP(cm)≤0.06，A_S为0.6-1.8。

用S-H02缓冲液平衡该柱——流速(cm/h)：目标＝150cm/h，范围＝100-160cm/h；柱体积(CV)：目标＝7，范围＝6-8。因此，在柱上的停留时间为约4分钟。立即收集流通(包含经纯化的复性胰蛋白酶原)。

根据以下参数进行阴离子交换层析(以流通模式运行)：

阴离子交换层析操作条件的更详细概述如下(CV＝柱体积，例如177-216mL)：

收集流通物质(包含复性胰蛋白酶原)。

1.9.活化(裂解胰蛋白酶原以提供胰蛋白酶)和过滤

在收集流通物质的60分钟内开始活化。有利地，通过在该时间范围内进行，本发明人已经发现能减轻(在阴离子交换层析之后的)胰蛋白酶原蛋白的聚集(参见实施例3)。

在开始活化之前，流通物质为20-25℃。将S-12溶液添加至流通物质(以提供75mM的最终钙浓度)并在20-25℃孵育20-24小时。通过加入S-K01缓冲液(终浓度80mM)来猝灭活化，并用S-01缓冲液调节pH至7.2-7.6。

然后通过Opticap XL150 0.5/0.2μm过滤器过滤溶液。操作参数如下：

参数	当前实验室规模	GMP(1克规模)
			过滤器	Opticap XL150或更大	Opticap XL3或更大
过滤面积，m²	0.015	0.13
			过滤速度LHM	200-400	200-400
过滤器通过量(L/m²)	～2000	～1540
			DSP评述	无堵塞	无堵塞

使用追踪缓冲液(S-H02)将任何剩余的重折叠胰蛋白酶原冲洗出过滤器。操作参数如下：

参数	当前实验室规模	GMP(1克规模)
			用缓冲液洗涤过滤器，L/m²	1	1
过滤，巴(bar)	<2	<2
			冲洗，L/m²	5-8	5-8

1.10.亲和层析(苄脒)

使用具有苄脒琼脂糖FF(Merck Millipore)的柱，通过亲和层析纯化(例如，精制)活化的胰蛋白酶。这可使得进一步去除细菌内毒素和宿主细胞蛋白，以及未活化的胰蛋白酶原和α-胰蛋白酶。P-氨基苄脒是一种胰蛋白酶和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的合成抑制剂，与附接至Sepharose 4快速流(fast flow)的长间隔臂(spacer arm)共价结合。苄脒树脂用于分离胰蛋白酶形式：α和β。该步骤可使得分离两种形式(参见图7)。

用S-H02缓冲液平衡该柱——流速(cm/h)：目标＝150，范围＝100-160；柱体积(CV)：目标＝5，范围＝4.5-5.5。

根据以下参数进行亲和层析：

从40mAu至30mAu收集洗脱液，并且仅收集第二峰级分(其含有β-胰蛋白酶)。将第一峰和第二峰的等分试样在SDS-PAGE凝胶上电泳以确认第二峰级分中β-胰蛋白酶的存在(参见图3)。

苄脒层析条件的详细概述如下：

/>

1.11.最终超滤/渗滤(切向流过滤，TFF)

洗脱液(来自亲和层析)用截留分子量为5kDa(比蛋白小约5倍，以确保蛋白被保留，同时允许缓冲液物质被去除)的过滤器(Millipore Pellicon 2 A型盒)过滤。浓缩洗脱液以提供约2mg/ml的蛋白浓度。操作条件概述如下：

然后使用渗滤模式实现缓冲液交换(进S-M01缓冲液中)，其中将缓冲液以与通过渗透物去除当前缓冲液(S-L02)相同的速率加入到渗余物系统中。剩余体积(DV)是当交换了缓冲液的渗余物体积时。5次DV后，去除99.9％的旧缓冲液。当渗透物电导率和pH达到目标值时，渗滤过程结束。操作条件概述如下：

1.12.终浓度和储存

最终超滤步骤使蛋白浓度达到2.5mg/ml(通过如上使用0.2μm过滤器渗滤)。操作参数如下：

然后将产物分配到30mL PETG瓶中的20mL等分试样中，并且在-80+/-10℃储存。

发现最终滤液中β-胰蛋白酶的纯度>90％(经由SDS-PAGE测量)。

使用以下循环参数将产物冻干成药物产物：

实施例2

阴离子交换层析后胰蛋白酶原不稳定性的抑制

根据实施例1的步骤1-1.8提供复性胰蛋白酶原。

在进行步骤1.9(通过胰蛋白酶原的裂解活化以提供胰蛋白酶)之前，将复性胰蛋白酶原(步骤1.8的输出)在室温(例如，约20℃)保持不同的时间点，即≤60分钟或>60分钟的时间点，并且随后通过目视检查评估蛋白稳定性(其中蛋白制剂中的浑浊指示缺乏稳定性，无浑浊指示稳定性)。有利地，显示了60分钟的最大保持时间以防止混浊的出现，这表明通过在最大60分钟内进行步骤1.9来抑制AEX后胰蛋白酶原不稳定性的能力。

AEX后保持时间	观察到浑浊(例如，沉淀)
		≤60分钟	否
>60分钟	是

实施例3

测量通过本发明的方法生产的β--胰蛋白酶的裂解活性

使用Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)作为底物的纯化的β-胰蛋白酶的胰蛋白酶活性。该程序是基于以下反应的连续分光光度测定速率(A₂₅₃，光程＝1cm)：

BAEE+H₂O(在胰蛋白酶存在下)>Nα-苯甲酰基-L-精氨酸+乙醇

其中：

BAEE-N_α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯

单位定义——胰蛋白酶活性的一个BAEE单位将产生每分钟0.001的ΔA₂₅₃，其中BAEE作为底物，在pH 7.6、25℃，在3.20ml的反应体积中。

试剂和设备：

磷酸二氢钠(例如，Sigma货号S0751)、Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE，例如，Sigma货号B4500)、1M NaOH溶液、1M盐酸。

制备说明

-超纯水(在25℃，≥18MΩxcm电阻率)用于制备试剂。

-缓冲液(67mM磷酸钠缓冲液，pH 7.6，在25℃)——使用磷酸二氢钠在超纯水中制备8.04mg/ml溶液。在25℃用1M NaOH溶液调节至pH 7.6。

-底物溶液(0.25mM Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯)——使用Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE，例如Sigma货号B4500)在缓冲液中制备0.086mg/ml溶液。

-HCl溶液(1mM盐酸)——在超纯水中制备1M盐酸溶液的1000倍稀释液。

-酶溶液(胰蛋白酶)——使用前，立即将胰蛋白酶组合物(试验样品和对照参考样品)在冷(2-8℃)HCl溶液中稀释至1mg(多肽)/ml。

程序：

在3.20ml反应混合物中，终浓度为70mM(例如，62.8mM)磷酸钠、0.23mMNα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯、0.031-0.063mM盐酸、42.5-115.0单位胰蛋白酶。

1.将以下试剂吸移到合适的石英比色皿中：

试剂	空白(ml)	试验(ml)
			底物溶液	3.00	3.00
HCl溶液	0.200	0.125

2.通过倒置混合并使用适当恒温的分光光度计平衡至25℃。然后添加：

试剂	空白(ml)	试验(ml)
			酶溶液	-	0.075

3.通过倒置立即混合并记录A253增加持续5分钟。使用1分钟时间段和4个数据点，使用空白和试验的最大线性速率获得ΔA₂₅₃/分钟。

计算：

A₁是紧接在制备混合物之后的A₂₅₃；

A₂是孵育4分钟后的混合物的A₂₅₃，

t是孵育的持续时间；

DF是稀释因子；

A_253/分钟是0.001；和

V是混合物中的β-胰蛋白酶组合物的体积0.075mL

或者在使用空白和试验的最大线性速率获得ΔA₂₅₃/分钟之后：

其中：df是稀释因子；

0.001＝基于单位定义的A₂₅₃/分钟变化；

0.075ml＝β-胰蛋白酶组合物试验的体积。

结果：

将活性与参考标准(RS)的活性进行直接比较。RS＝胰蛋白酶BRP(欧洲药典(Eur.Ph.))来自EDQM货号T2600000批次2的参考标准品被稀释至1mg/ml。还将试验样品(例如，通过本发明的方法生产的β-胰蛋白酶组合物)稀释至1mg/ml。本发明生产的β-胰蛋白酶的活性为12342 BAEE U/mg。RS的活性为8233BAEE U/mg。因此，要求保护的β-胰蛋白酶组合物的活性比RS高大约50％。

评估β-胰蛋白酶组合物的某些性质(样品1＝液体胰蛋白酶释放，样品2＝溶解胰蛋白酶(lyo trypsin)释放)，参见下表：

上述说明书中提及的所有出版物在此引入作为参考。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是明显的。尽管已经结合特定的优选的实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应当不适当地限于这些特定的实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员来说明显的用于实施本发明的所述模式的各种修改都落在所附权利要求的范围内。

序列

SEQ ID NO：1(牛胰蛋白酶原)

SEQIDNO：2(BoNT/E的L链)

SEQID：3(BoNT/E的H链)

/>

SEQ ID：4(TAP的5个c末端残基)

Asp-Asp-Asp-Asp-Lys

SEQ ID：5(TAP的6个c末端残基)

Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys

序列表

<110> 益普生生物制药有限公司(IPSEN BIOPHARM LIMITED)

<120> 生产β-胰蛋白酶的方法

<130> P61492WO

<150> GB2015618.8

<151> 2020-10-01

<160> 5

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 721

<212> DNA

<213> 欧洲牛（Bos taurus）

<400> 1

catatgtaga aggagatata ccatggtgga tgatgatgat aaaattgtgg gcggctatac 60

ctgcggcgcg aacaccgtgc cgtatcaggt gagcctgaac agcggctatc atttttgcgg 120

cggcagcctg attaacagcc agtgggtggt gagcgcggcg cattgctata aaagcggcat 180

tcaggtgcgc ctgggcgaag ataacattaa cgtggtggaa ggcaacgaac agtttattag 240

cgcgagcaaa agcattgtgc atccgagcta taacagcaac accctgaaca acgatattat 300

gctgattaaa ctgaaaagcg cggcgagcct gaacagccgc gtggcgagca ttagcctgcc 360

gaccagctgc gcgagcgcgg gcacccagtg cctgattagc ggctggggca acaccaaaag 420

cagcggcacc agctatccgg atgtgctgaa atgcctgaaa gcgccgattc tgagcgatag 480

cagctgcaaa agcgcgtatc cgggccagat taccagcaac atgttttgcg cgggctatct 540

ggaaggcggc aaagatagct gccagggcga tagcggcggc ccggtggtgt gcagcggcaa 600

actgcagggc attgtgagct ggggcagcgg ctgcgcgcag aaaaacaaac cgggcgtgta 660

taccaaagtg tgcaactatg tgagctggat taaacagacc attgcgagca actagaagct 720

t 721

<210> 2

<211> 421

<212> PRT

<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）

<400> 2

Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg Thr

1 5 10 15

Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser Phe

20 25 30

Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile Gly

35 40 45

Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly Asp

50 55 60

Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys Asp

65 70 75 80

Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn Asn

85 90 95

Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro Tyr

100 105 110

Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp Ala

115 120 125

Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu Leu

130 135 140

Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr Asn

145 150 155 160

Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His Gly

165 170 175

Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe Arg

180 185 190

Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu Thr

195 200 205

Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Lys

210 215 220

Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu Ile

225 230 235 240

Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr Thr

260 265 270

Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys Val

275 280 285

Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu Ala

290 295 300

Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn Ile

305 310 315 320

Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu Phe

325 330 335

Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile Gly

340 345 350

Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile Tyr

355 360 365

Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe Arg

370 375 380

Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr Gly

385 390 395 400

Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val Ser

405 410 415

Val Lys Gly Ile Arg

420

<210> 3

<211> 830

<212> PRT

<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）

<400> 3

Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly Glu Leu Phe Phe Val Ala

1 5 10 15

Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile

20 25 30

Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr Glu Asn Asp Leu Asp Gln

35 40 45

Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala Pro Gly Leu Ser Asp Glu

50 55 60

Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp

65 70 75 80

Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His Asp Val Asn Glu Leu Asn

85 90 95

Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Asn Asn

100 105 110

Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala Leu Leu Glu Gln Pro Lys

115 120 125

Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile Asn Asn Val Asn Lys Pro

130 135 140

Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile Gln Gln Val Leu Val Asp

145 150 155 160

Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr Val Asp Lys Ile Ala Asp

165 170 175

Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu Ala Leu Asn Ile Gly Asn

180 185 190

Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala Leu Glu Leu Leu Gly Ala

195 200 205

Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu Leu Ile Pro Thr Ile Leu

210 215 220

Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser Ser Asp Asn Lys Asn Lys

225 230 235 240

Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys Glu Arg Asp Glu Lys Trp

245 250 255

Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn Trp Met Thr Lys Ile Asn

260 265 270

Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn

275 280 285

Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr

290 295 300

Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn Lys Tyr Asp Ile Lys Gln

305 310 315 320

Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser Ile Ala Met Asn Asn Ile

325 330 335

Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile

340 345 350

Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu Tyr Asp Glu Asn Val Lys

355 360 365

Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His Gly Ser Ile Leu Gly Glu

370 375 380

Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr Asp Thr Leu Asn Asn Ser

385 390 395 400

Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp Asp Lys Ile Leu Ile Ser

405 410 415

Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys Ser Ser Ser Val Leu Asn

420 425 430

Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asp Ser

435 440 445

Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys Tyr Pro Thr Asn Lys Asn

450 455 460

Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser Glu Val Asn Ile Ser Gln

465 470 475 480

Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr Lys Asn Phe Ser Ile Ser

485 490 495

Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn Lys Ile Val Asn Val Asn

500 505 510

Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asp Asn Asn Ser Gly Trp

515 520 525

Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Asn

530 535 540

Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn Tyr Gly Asn Ala Asn Gly

545 550 555 560

Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asp

565 570 575

Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Asp Gln

580 585 590

Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu

595 600 605

Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr

610 615 620

Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu

625 630 635 640

Tyr Ser Asn Glu Pro Asn Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn

645 650 655

Tyr Leu Leu Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro

660 665 670

Asn Asn Phe Ile Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn

675 680 685

Ile Arg Ser Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys

690 695 700

Val Lys Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val

705 710 715 720

Arg Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His

725 730 735

Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys Thr

740 745 750

Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val Val Met

755 760 765

Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn Asn Asn Gly

770 775 780

Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr Val Val Ala Ser

785 790 795 800

Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr Asn Ser Asn Gly Cys

805 810 815

Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly Trp Gln Glu Lys

820 825 830

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TAP的5个c末端残基

<400> 4

Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TAP的6个c末端残基

<400> 5

Val Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

Claims

1.一种生产β-胰蛋白酶的方法，所述方法包含：

a)使变性胰蛋白酶原复性，从而生产复性胰蛋白酶原，其中所述复性在包含L-精氨酸的缓冲液中进行；

b)通过阴离子交换层析对所述复性胰蛋白酶原进行纯化，从而提供纯化的复性胰蛋白酶原；以及

c)在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下对所述纯化的复性胰蛋白酶原进行孵育，其中胰蛋白酶原通过所述蛋白水解活性裂解成β-胰蛋白酶；

其中所述方法不包含加入用于将胰蛋白酶原裂解成β-胰蛋白酶的另外的蛋白酶；

其中至少步骤c)在不包含L-精氨酸的缓冲液中进行；并且

其中在步骤c)之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，不使所述胰蛋白酶原经受>8℃的温度超过38小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤a)之前进行以下步骤：

i.培养原核宿主细胞，所述原核宿主细胞包含编码胰蛋白酶原的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与诱导型启动子可操作地连接；

ii.诱导所述宿主细胞表达所述胰蛋白酶原，从而形成一种或多种包含所述胰蛋白酶原的不溶性包涵体；

iii.从所述宿主细胞分离所述一种或多种不溶性包涵体；

iv.溶解所述一种或多种不溶性包涵体，从而生产变性胰蛋白酶原；和

v.通过阳离子交换层析纯化所述变性胰蛋白酶原，从而提供纯化的变性胰蛋白酶原。

3.一种生产β-胰蛋白酶的方法，所述方法包含：

a)培养原核宿主细胞，所述原核宿主细胞包含编码胰蛋白酶原的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与诱导型启动子可操作地连接；

b)诱导所述宿主细胞表达所述胰蛋白酶原，从而形成一种或多种包含所述胰蛋白酶原的不溶性包涵体；

c)从所述宿主细胞分离所述一种或多种不溶性包涵体；

d)溶解所述一种或多种不溶性包涵体，从而生产变性胰蛋白酶原；

e)通过阳离子交换层析纯化所述变性胰蛋白酶原，从而提供纯化的变性胰蛋白酶原；

f)使所述纯化的变性胰蛋白酶原复性，从而生产复性胰蛋白酶原；

g)通过阴离子交换层析对所述复性胰蛋白酶原进行纯化，从而提供纯化的复性胰蛋白酶原；

h)在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原，其中胰蛋白酶原通过所述蛋白水解活性裂解成β-胰蛋白酶；以及

i)通过亲和层析分离所述β-胰蛋白酶；

其中步骤f)和g)在不促进所述胰蛋白酶原的所述蛋白水解活性的条件下进行；并且其中所述方法不包含加入用于将胰蛋白酶原裂解成β-胰蛋白酶的另外的蛋白酶。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包含使所述复性胰蛋白酶原经受体积减小步骤。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包含使所述复性胰蛋白酶原经受过滤步骤，所述过滤步骤去除具有大小小于20kDa的分子。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述体积减小步骤在所述过滤步骤之前、与其同时或之后进行。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))从提供纯化的复性胰蛋白酶原(例如，根据步骤g))开始进行长达120分钟；优选

从提供纯化的复性胰蛋白酶原(例如，根据步骤g))开始进行长达60分钟。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过加入钙促进所述纯化的复性胰蛋白酶原的所述蛋白水解活性。

9.根据权利要求8所述的方法，进一步包含：

i)加入钙螯合剂以抑制所述胰蛋白酶原或β-胰蛋白酶的蛋白水解活性。

10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中使变性胰蛋白酶原复性的步骤在包含L-精氨酸的缓冲液中进行。

11.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下至少孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))在不包含L-精氨酸的缓冲液中进行。

12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))之前，当存在于不包含L-精氨酸的缓冲液中时，所述胰蛋白酶原不经受15-30℃的温度超过2小时。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在使所述纯化的变性胰蛋白酶原复性的步骤中：

L-精氨酸以0.6M至<1M的浓度存在，优选约0.75M。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在使所述纯化的变性胰蛋白酶原复性的步骤中：变性胰蛋白酶原以<0.2mg/mL的浓度存在。

15.根据权利要求14所述的方法，其中变性胰蛋白酶原以>0.06mg/mL至<0.2mg/mL的浓度存在；优选约0.1mg/mL。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包含分离所述β-胰蛋白酶。

17.根据权利要求16所述的方法，其中通过苄脒亲和层析分离所述β-胰蛋白酶。

18.根据权利要求1、2、4至9或13至17所述的方法，其中步骤a)和b)在不存在钙的情况下进行；任选地，其中步骤ii)、iii)、iv)和/或v)在不存在钙的情况下进行。

19.根据权利要求3至17中任一项所述的方法，其中步骤f)和g)在不存在钙的情况下进行；任选地，其中步骤b)、c)、d)和/或e)在不存在钙的情况下进行。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰蛋白酶原和β-胰蛋白酶分别是野生型胰蛋白酶原和野生型β-胰蛋白酶。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰蛋白酶原和β-胰蛋白酶分别是牛胰蛋白酶原和牛β-胰蛋白酶。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细胞。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.25-0.75mM，优选约0.5mM，来诱导所述胰蛋白酶原的表达。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰蛋白酶原的表达被诱导至少4小时；优选至少6小时；更优选约8小时。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰蛋白酶原的表达被诱导至少4-12小时；优选至少6-10小时。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述宿主细胞培养至在600nm的光密度(OD₆₀₀)为35-65；优选

其中将所述宿主细胞培养至在600nm的光密度(OD₆₀₀)为40-60。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复性胰蛋白酶原存在于与所述阴离子交换层析介质无相互作用或仅微弱相互作用的级分中。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))中，加入钙至终浓度为至少10mM，优选至少20mM。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))中，加入钙至终浓度为20-150mM，优选50-100mM。

30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))中，将所述样品孵育5-48小时，优选5-20小时。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))中，将所述样品在15-30℃的温度孵育。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包含使具有活化环的单链梭菌神经毒素(优选BoNT/E)与β-胰蛋白酶接触，其中所述β-胰蛋白酶水解所述单链梭菌神经毒素的活化环的肽键，从而生产双链梭菌神经毒素。

33.一种β-胰蛋白酶组合物(例如，可通过本文所述的方法获得)，其中所述组合物中包含的总多肽的至少80％是β-胰蛋白酶，并且其中所述组合物的活性水平为至少3000USP单位/mg总多肽，任选地其中通过测定来确定所述活性水平，所述测定包含：

a)将0.075mLβ-胰蛋白酶组合物(例如，试验样品)与3.125mL包含底物N_α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)、磷酸钠和盐酸的反应缓冲液混合，所述反应缓冲液的温度为25℃，以提供一种混合物，所述混合物具有：

i.0.25mM BAEE；

ii.67mM磷酸钠缓冲液；

iii.0.031-0.063mM盐酸；

iv.在25℃pH为7.6；以及

v.体积为3.2mL；

b)在25℃孵育所述混合物4分钟；

c)通过紧接在制备所述混合物之后和步骤b)孵育4分钟之后检测所述混合物在253nm的吸光度(A₂₅₃)来测量底物BAEE的裂解量；并且使用下式计算所述β-胰蛋白酶组合物中酶的BAEE单位(U)/ml：

其中：A₁是紧接在制备所述混合物之后的A₂₅₃；

A₂是孵育4分钟后的所述混合物的A₂₅₃，

t是孵育的持续时间；

DF是稀释因子；

A_253/分钟是0.001；和

V是所述混合物中所述β-胰蛋白酶组合物的体积0.075mL；以及

34.一种生产双链梭菌神经毒素的方法，所述方法包含：

a.提供具有活化环的单链梭菌神经毒素；和

b.使所述单链梭菌神经毒素与根据权利要求33所述的β-胰蛋白酶组合物接触；

其中所述β-胰蛋白酶水解所述单链梭菌神经毒素的活化环的肽键，从而生产双链梭菌神经毒素。

35.一种双链梭菌神经毒素，其可通过权利要求32或34所述的方法获得。