CN105732808A - 一种结核分枝杆菌单克隆抗体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种结核分枝杆菌单克隆抗体制备方法，该技术方案利用人型菌株制备出结核分枝杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，其所分泌的抗体为只针对人型菌株，与牛型结核分枝杆菌均不发生反应，从而保证了该单抗能够专门针对人型血清型疾病。与此同时，本发明利用该株单克隆抗体的特性，建立ELISA方法和免疫胶体金的方法，其特异性和敏感性好。可用于临床检测。此外，本发明制备的单抗效价高、特异性较好，尤其适用于进一步制备人型结核分枝杆菌抗原诊断试剂盒或人型结核分枝杆菌抗原诊断胶体金试纸。本发明以创新性的技术改进实现了突出的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有突出的推广前景。

Description

一种结核分枝杆菌单克隆抗体制备方法

技术领域

本发明涉及医学领域，具体涉及一种结核分枝杆菌单克隆抗体制备方法。

背景技术

结核分枝杆菌俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌，可侵犯全身多种器官，严重威胁人类健康。

现有技术中针对结核分枝杆菌的检测方法主要包括涂片法、培养法、噬菌体扩增法等，其中涂片法操作简便且成本低廉，但是其敏感性低，且无法区分结核与非结核分枝杆菌，因此检测结果易发生偏差。而噬菌体扩增法虽然在敏感性和特异性等方面具有优势，但是其检测周期较长、步骤较繁琐且需要较苛刻的实验条件，因此该方法推广应用存在一定的局限性。而培养法是指将待测样本接种至适宜的培养基，使其中的结核分枝杆菌(如果存在的话)扩增，而后检测菌体本身或其代谢产物，该方法检测时间较长且受环境影响较大，可重复性不佳。

近年来针对特定病原微生物的检测试剂盒得到了广泛的应用，多数基于抗原抗体反应，再配合相关显色试剂，因此检测较快且结果判别容易。现有技术中结核分枝杆菌检测试剂盒的质量很大程度上由抗体性能所决定，一种敏感性强、结合速度快的抗体将有助于提升试剂盒的准确性和检测速度。此外，由于导致人类患病的病原菌主要包括人型结核分枝杆菌和牛型结核分枝杆菌两类，而这两类病原菌的生物学特性相似性较强，现有技术的单克隆抗体普遍难以区分上述两种分型。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种结核分枝杆菌单克隆抗体制备方法，以解决现有技术中结核分枝杆菌单克隆抗体不能单一的针对人型菌株。

本发明解决的再一技术问题是现有技术中结核分枝杆菌单克隆抗体效价较低。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种结核分枝杆菌单克隆抗体制备方法，包括以下步骤：

1)取人型结核分枝杆菌菌液作为抗原，与弗氏完全佐剂乳化后皮下注射小鼠，再于2周后、4周后以相同方法各免疫1次，6周后以相同剂量抗原腹腔注射小鼠；

2)3天后，取上述小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞按5∶1的细胞量比混合在一支融合管中，1000rpm离心10min，混匀，在37℃水浴中45s内加入1mLPEG到融合管中，混匀，而后在90s内滴加30mL的DMEM培养基，37℃静止10min，而后1000rpm离心10min；弃上清，用60mLHAT培养基悬浮沉淀细胞，再加入腹腔巨噬细胞，置37℃5％CO₂培养箱内培养；

3)利用间接ELISA检测的方法，对步骤2)上清液中的抗体进行检测，筛选出抗体阳性杂交瘤细胞；

4)取小鼠，以0.5mL/只的剂量腹腔注射灭菌液体石蜡，1周后以1×10⁶CFU/只的剂量对小鼠腹腔注射步骤3)得到的杂交瘤细胞，而后从小鼠腹腔采集腹水，离心取上清，即得到结核分枝杆菌单克隆抗体。

作为优选，步骤2)中所述的DMEM培养基是不完全DMEM培养基。

作为优选，步骤2)中置37℃5％CO₂培养箱内培养5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基，10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基。

作为优选，步骤3)中用免疫小鼠血清作为阳性对照，用非免疫小鼠血清作为阴性对照。

作为优选，步骤3)筛选出抗体阳性杂交瘤细胞后，先制备其亚克隆细胞株，再利用所述亚克隆细胞株执行步骤4)。

作为优选，所述离心的操作条件是2500rpm离心10min。

本发明技术方案利用人型菌株制备出结核分枝杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，其所分泌的抗体为只针对人型菌株，与牛型结核分枝杆菌均不发生反应，从而保证了该单抗体能够专门针对人型血清型疾病。与此同时，本发明利用该株单克隆抗体的特性，建立ELISA方法和免疫胶体金的方法，其特异性和敏感性好。可用于临床检测。此外，本发明制备的单抗体效价高、特异性较好，尤其适用于进一步制备人型结核分枝杆菌抗原诊断试剂盒或人型结核分枝杆菌抗原诊断胶体金试纸。本发明以创新性的技术改进实现了突出的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有突出的推广前景。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1(一种结核分枝杆菌单克隆抗体制备方法)

1)取人型结核分枝杆菌菌液作为抗原，与弗氏完全佐剂乳化后皮下注射小鼠，再于2周后、4周后以相同方法各免疫1次，6周后以相同剂量抗原腹腔注射小鼠；

2)3天后，取上述小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞按5∶1的细胞量比混合在一支融合管中，1000rpm离心10min，混匀，在37℃水浴中45s内加入1mLPEG到融合管中，混匀，而后在90s内滴加30mL的DMEM培养基，37℃静止10min，而后1000rpm离心10min；弃上清，用60mLHAT培养基悬浮沉淀细胞，再加入腹腔巨噬细胞，置37℃5％CO₂培养箱内培养；

3)利用间接ELISA检测的方法，对步骤2)上清液中的抗体进行检测，筛选出抗体阳性杂交瘤细胞；

4)取小鼠，以0.5mL/只的剂量腹腔注射灭菌液体石蜡，1周后以1×10⁶CFU/只的剂量对小鼠腹腔注射步骤3)得到的杂交瘤细胞，而后从小鼠腹腔采集腹水，离心取上清，即得到结核分枝杆菌单克隆抗体。

在以上技术方案中，步骤2)中所述的DMEM培养基是不完全DMEM培养基。

步骤2)中置37℃5％CO₂培养箱内培养5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基，10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基。

步骤3)中用免疫小鼠血清作为阳性对照，用非免疫小鼠血清作为阴性对照。

步骤3)筛选出抗体阳性杂交瘤细胞后，先制备其亚克隆细胞株，再利用所述亚克隆细胞株执行步骤4)。

所述离心的操作条件是2500rpm离心10min。

实施例2(实施例1所制备单抗的特性鉴定)

2.1单抗腹水效价的测定

采用间接ELISA的方法，将所制得腹水先按1∶1000稀释，再按2倍倍比稀释，依次加入包被抗原的酶标孔内，其他步骤同前。结果本株单抗效价为1∶6.4*10⁴。

2.2单抗亚类的鉴定

按单克隆抗体亚类试剂盒说明书介绍的方法进行。具体方法如下：酶标板内分别加入四种单抗腹水1∶5000稀释100uL/孔，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次，每次5min；分别加入工作浓度羊抗鼠IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM、IgA亚类血清100μL/孔，每株单抗加每种亚类两孔，37℃孵育30min，PBST洗涤3次，每次5min；加入1∶1000稀释的兔抗羊辣根过氧化物酶结合物100uL/孔，37℃孵育15min，PBST洗涤3次，每次5min；加TMB显色液100μL/孔，37℃避光显色5-10min；用2MH₂SO₄100uL/孔终止反应；在450nm波长下测定OD值。以OD值明显高于其他孔者所加亚类血清为单抗亚类。结果本单抗为IgG₃。

2.3单抗的特异性鉴定

将人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌进行包被在96孔酶标板中按照实施例一中方法进行间接ELISA检测。结果如表1所示，表明纯化后的腹水只与人型结核分枝杆菌反应，与其他菌株均不反应。

表1单抗与不同抗原特异性反应结果

表1中数值为ELISA实验OD值。

以上实施例中间接ELISA试验所需相关溶液配方如下：

洗涤液(PBST)：0.01MPBS(0.2gKH₂PO4、0.2gKCl、2.92gNa₂HPO₄、8.0gNaCl)。加0.5mlTween-20加超纯水至1000ml。

封闭液：10％小牛血清PBS。

酶标抗体稀释液：4％小牛血清PBS。

显色液：进口TMB显色液。

终止液(2MH₂SO₄)：浓硫酸22.2ml、蒸馏水177.8ml。

实施例3(人型结核分枝杆菌抗原诊断试剂盒的制备)

以实施例1制备的单抗作为原料，利用抗原检测试剂盒制备技术领域的公知技术制备得到人型结核分枝杆菌抗原诊断试剂盒，该试剂盒诊断原理为ELISA法。

1.1特异性试验

用确立的ELISA方法，加样时分别加入相同菌数(10⁹CFU/ml)的人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌，同时设空白对照。结果如表2所示：

表2实施例1所制备单抗的特异性实验结果

1.2敏感性试验

将已计数好的人型结核分枝杆菌，其浓度为10⁹CFU/ml，连续10倍稀释，用所建立的ELISA方法测定，同时设阴性和空白对照，以确定最低检出量。结果如表3所示：

表3实施例1所制备单抗的敏感性实验结果

	108	107	106	105	104	103	102	阴性对照
									OD值	1.782	1.017	0.611	0.352	0.248	0.221	0.151	0.111

根据阳性判定依据为样品OD值/阴性对照值＞2.1，最低检出浓度为10⁴CFU/ml，由于每孔加样量为100ul，因此最低检测量可定为10³CFU。

实施例4(人型结核分枝杆菌抗原诊断胶体金试纸的制备)

以实施例1制备的单抗作为原料，利用抗原检测试纸制备技术领域的公知技术制备得到人型结核分枝杆菌抗原诊断胶体金试纸，该试纸的诊断原理为胶体金法。

1.1免疫胶体金试纸的特异性检测

将人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌(均为10⁸CFU/mL)每孔各60ul，同时设空白对照。结果表明只有人型结核分枝杆菌试纸出现阳性标记。

1.2免疫胶体金试纸的敏感性检测

将已计数好的人型结核分枝杆菌，其浓度为10⁹CFU/ml，连续10倍稀释，用所建立的方法测定，同时设阴性和空白对照，以确定最低检出量。结果表明在10⁵CFU/ml仍存在相应条带，但10⁴CFU/ml已无任何印迹。由于每孔加样50ul，因此其最低检出量为5*10³CFU。

实施例5(一种结核分枝杆菌单克隆抗体制备方法)

1)取人型结核分枝杆菌菌液作为抗原，与弗氏完全佐剂乳化后皮下注射小鼠，再于2周后、4周后以相同方法各免疫1次，6周后以相同剂量抗原腹腔注射小鼠；

2)3天后，取上述小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞按5∶1的细胞量比混合在一支融合管中，1000rpm离心10min，混匀，在37℃水浴中45s内加入1mLPEG到融合管中，混匀，而后在90s内滴加30mL的DMEM培养基，37℃静止10min，而后1000rpm离心10min；弃上清，用60mLHAT培养基悬浮沉淀细胞，再加入腹腔巨噬细胞，置37℃5％CO₂培养箱内培养；

3)利用间接ELISA检测的方法，对步骤2)上清液中的抗体进行检测，筛选出抗体阳性杂交瘤细胞；

4)取小鼠，以0.5mL/只的剂量腹腔注射灭菌液体石蜡，1周后以1×10⁶CFU/只的剂量对小鼠腹腔注射步骤3)得到的杂交瘤细胞，而后从小鼠腹腔采集腹水，离心取上清，即得到结核分枝杆菌单克隆抗体。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种结核分枝杆菌单克隆抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取人型结核分枝杆菌菌液作为抗原，与弗氏完全佐剂乳化后皮下注射小鼠，再于2周后、4周后以相同方法各免疫1次，6周后以相同剂量抗原腹腔注射小鼠；

2)3天后，取上述小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞按5∶1的细胞量比混合在一支融合管中，1000rpm离心10min，混匀，在37℃水浴中45s内加入1mLPEG到融合管中，混匀，而后在90s内滴加30mL的DMEM培养基，37℃静止10min，而后1000rpm离心10min；弃上清，用60mLHAT培养基悬浮沉淀细胞，再加入腹腔巨噬细胞，置37℃5％CO₂培养箱内培养；

3)利用间接ELISA检测的方法，对步骤2)上清液中的抗体进行检测，筛选出抗体阳性杂交瘤细胞；

4)取小鼠，以0.5mL/只的剂量腹腔注射灭菌液体石蜡，1周后以1×10⁶CFU/只的剂量对小鼠腹腔注射步骤3)得到的杂交瘤细胞，而后从小鼠腹腔采集腹水，离心取上清，即得到结核分枝杆菌单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述的DMEM培养基是不完全DMEM培养基。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)中置37℃5％CO₂培养箱内培养5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基，10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)中用免疫小鼠血清作为阳性对照，用非免疫小鼠血清作为阴性对照。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)筛选出抗体阳性杂交瘤细胞后，先制备其亚克隆细胞株，再利用所述亚克隆细胞株执行步骤4)。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述离心的操作条件是2500rpm离心10min。