CN104678096B - 链霉素、四环素类二合一金标微孔试纸条 - Google Patents

链霉素、四环素类二合一金标微孔试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种链霉素、四环素类二合一金标微孔试纸条。本发明提供的试剂盒，包括至少具有一个样品槽的样品板和至少一个试纸条；样品槽的底部附着有链霉素特异性抗体的胶体金标记物和四环素特异性抗体的胶体金标记物；试纸条包括底板（1）、反应膜（2）、样品吸收垫（3）和吸水垫（4）；样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上；反应膜上由始端至末端依次具有T2线、T1线和C线；T2线和T1线上分别包被如下两种偶联物：四环素‑载体蛋白偶联物、链霉素‑载体蛋白偶联物；C线上包被抗抗体。本发明提供的试剂盒具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

Description

链霉素、四环素类二合一金标微孔试纸条
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种同时检测动物源性食品（如牛奶等）中链霉素、四环素类残留量的链霉素、四环素类二合一金标微孔试纸条。
背景技术
链霉素（Streptomycin）为氨基糖甙类抗生素，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素，它有抗结核杆菌的特效作用。链霉素为白色无定形粉末，有吸湿性。易溶于水，不溶于大多数有机溶剂，强酸、强碱条件下不稳定。链霉素对各种革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌均有良好的抗菌作用，适用于治疗细菌性痢疾或其他细菌性肠道感染，其机理为与细菌核糖体30S亚单位的特殊受体蛋白结合，抑制蛋白合成。其主要毒性为耳毒性和肾毒性，可引起眩晕，听力减退，耳鸣或耳部胀满感，肾功能损害等，也可致神经肌肉阻滞和神经毒性反应。因此，其在动物性食品中的残留会严重影响人类健康。为了保障动物源性食品的安全，我国规定链霉素药物在动物源性食品中的最大残留限量（MRL）牛奶为200μg/kg，肌肉、脂肪、肝组织中为600μg/kg，肾组织中为1000μg/kg。
四环素类药物(tetracyclines，TCs)为广谱抗生素，由放线菌产生，在化学结构上属于氢化并四苯环衍生物。主要包括四环素、土霉素、金霉素、强力霉素和多西环素等。另外，四环素、金霉素和土霉素还可在动物体内经代谢而转化为差向四环素、差向金霉素和差向土霉素，差向四环素类药物的药效极低或消失，但它们的毒副作用增加，已经被欧盟确定为四环素、金霉素和土霉素的残留标识物。四环素类抗生素含有许多羟基、烯醇羟基及羰基，在酸性和碱性条件下均不稳定，，在中性条件下能与多种金属离子形成不溶性螯合物。四环素类药物抗菌作用强，抗菌谱广，对革兰氏阴性需氧菌和厌氧菌、立克次体、螺旋体、支原体、衣原体及某些原虫等有抗菌作用，被广泛用于临床各种感染性疾病的治疗。但其在动物性食品中的残留可导致诸多不良反应如胃肠道反应、肝损害、肾损害及二重感染等。临床广泛应用也可导致对四环素类药物的耐药菌株迅速增加。因此对动物性食品中四环素类药物的残留检测非常重要也很必要。我国规定奶、肉中四环素类抗生素的最大残留限量为100μg/kg，蛋中最大残留限量为200μg/kg，肝中最大残留限量为300μg/kg，肾中最大残留限量为600μg/kg。
现有的链霉素和四环素类药物检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响较大，再者这些方法需要复杂的仪器，过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。目前尚无同时检测链霉素和四环素类药物的残留量的产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种链霉素、四环素类二合一金标微孔试纸条。
本发明提供的用于检测链霉素和四环素类的试剂盒，包括至少具有一个样品槽的样品板和至少一个试纸条；
所述样品槽的底部附着有链霉素特异性抗体的胶体金标记物和四环素特异性抗体的胶体金标记物；
所述试纸条包括底板1、反应膜2、样品吸收垫3和吸水垫4；所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；所述反应膜上由始端至末端依次具有T2线、T1线和C线，所述T2线、T1线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；所述T2线和T1线上分别包被如下两种偶联物（两种偶联物可任意排序）：四环素-载体蛋白偶联物、链霉素-载体蛋白偶联物；所述C线上包被可与链霉素特异性抗体和/或四环素特异性抗体结合的抗抗体。
所述链霉素特异性抗体可为链霉素单克隆抗体或链霉素多克隆抗体。所述四环素特异性抗体可为四环素单克隆抗体或四环素多克隆抗体。所述链霉素单克隆抗体具体可为链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株STR-6A2CGMCC No.8404分泌的单克隆抗体。所述四环素单克隆抗体具体可为四环素单克隆抗体杂交瘤细胞株TC-4C3CGMCC No.8408分泌的单克隆抗体。
以上任一所述的载体蛋白可为牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白或人血清白蛋白。
所述链霉素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白具体可为BSA，链霉素与BSA的摩尔结合比具体可为8:1。
所述四环素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白具体可为BSA，四环素与BSA的摩尔结合比具体可为12:1。
所述链霉素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：
（1）取2.544g碳酸钠，溶于24ml水；
（2）取432mg硫酸链霉素，溶于12ml步骤（1）得到的碳酸钠溶液；
（3）取300mg BSA，溶于12ml步骤（1）得到的碳酸钠溶液；
（4）将步骤（2）得到的链霉素溶液加入步骤（3）得到的BSA溶液中并混匀，然后加入2.4ml10%（体积比）戊二醛水溶液并室温搅拌45min，然后加入6ml20mg/mlNaBH4水溶液并4℃静置过夜，然后用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析，然后4500rpm离心6min并取上清液（链霉素-载体蛋白偶联物溶液）。
所述四环素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：
（1）取50mg四环素，溶于2ml甲醇；
（2）取60mg BSA，溶于3ml醋酸钠缓冲液（pH4.5、0.1mol/L）；
（3）将步骤（1）得到的四环素溶液加入步骤（2）得到的BSA溶液中，然后加入140μL10%(体积比)甲醛水溶液并室温搅拌8h，然后用纯水进行透析，然后4500rpm离心6min并取上清液（四环素-载体蛋白偶联物溶液）。
链霉素特异性抗体的胶体金标记物和四环素特异性抗体的胶体金标记物的制备方法均如下：
（1）在沸腾的100mL的0.01g/100ml氯金酸水溶液中加入2-4mL的1%柠檬酸三钠水溶液，获得终浓度为0.01%的胶体金溶液（胶体金的直径为15-20nm）；
（2）用0.1mol/L的K2CO3水溶液调胶体金溶液的pH至8.5；
（3）将1μL10mg/mL的特异性抗体溶液（链霉素特异性抗体溶液或四环素特异性抗体溶液）加入1mL步骤（2）得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10μL20g/100ml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10μL10g/100ml的PEG8000水溶液并搅拌15分钟，然后4℃、4000g离心15min取上清液，然后4℃、12000g离心20分钟取沉淀；
（4）用PBS缓冲液（pH7.2、2mM）溶解步骤（3）得到的沉淀，4℃、12000g离心20分钟取沉淀，然后用200μL含1g/100ml BSA的PBS缓冲液（pH7.2、2mM）重悬沉淀，得到特异性抗体的胶体金标记物。
所述链霉素特异性抗体的胶体金标记物和所述四环素特异性抗体的胶体金标记物均可以冻干品的形式附着于于所述样品槽底部。这样做的优势是简化样品前处理过程，提高产品的检测的灵敏度。所述样品板的制备方法具体如下：取微孔反应板（如8联ELISA微孔反应板），向每个样品槽中加入链霉素特异性抗体的胶体金标记物和四环素特异性抗体的胶体金标记物各25μl，然后将样品板放入冷冻干燥机中，预冻4h后冻干14h，得到样品槽底部附着有两种特异性抗体的胶体金标记物的样品板。
所述试纸条还可包括覆盖于所述样品吸收垫上和覆盖于所述吸水垫上的固定膜5。所述固定膜可以促进试纸条中各组件的稳固性，优选为防水材质。所述固定膜还具有避免样品或试剂与外界环境中的物质发生反应的作用。
所述样品吸收垫和所述反应膜具有2mm的重叠区；所述吸水垫和所述反应膜具有2mm的重叠区。重叠区保证了样品液流动的连续性，使反应能够充分发生，有效地降低了实验误差。
所述T2线和T1线上依次包被如下两种偶联物：四环素-载体蛋白偶联物、链霉素-载体蛋白偶联物。
所述试纸条中，所述样品吸收垫的始端与所述底板的始端对齐，所述吸水垫的末端与所述底板的末端对齐。
所述试纸条的始端为检测端，末端为手柄端。
所述样品吸收垫的长度（自始端至末端）可为18mm，所述反应膜的长度（自始端至末端）可为20mm，所述吸水垫的长度（自始端至末端）可为20mm。所述T2线距离所述样品吸收垫的垂直距离可为6mm，所述T1线距离所述T2线的垂直距离可为3.5mm；所述C线距离所述吸水垫的垂直距离可为6mm。
所述链霉素-载体蛋白偶联物的包被浓度可为1mg/mL、包被宽度可为1mm、包被量可为0.8μL/cm。所述四环素-载体蛋白偶联物的包被浓度可为1mg/mL、包被宽度可为1mm、包被量可为0.8μL/cm。
所述抗抗体具体可为羊抗鼠二抗。所述抗抗体的包被浓度可为0.2mg/mL、包被宽度可为1mm，包被量可为1μL/cm。
所述底板可为PVC板。所述样品吸收垫可为玻璃纤维棉。所述反应膜可为硝酸纤维素膜。所述吸水垫可为吸水纸。所述保护膜可为PE保护膜。所述样品板可为塑料材质。
所述试剂盒还可包括铝箔袋，所述样品板和所述试纸条封装于所述铝箔袋中。
每个试剂盒具体可包括具有8个样品槽的样品板和8个试纸条。
本发明提供的试剂盒中，特异性抗体与胶体金颗粒之间无价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率，因此具有较高的特异性和灵敏度。
本发明还保护链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株STR-6A2（简称杂交瘤细胞STR-6A2）。杂交瘤细胞STR-6A2已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCCNo.8404。
本发明还保护杂交瘤细胞STR-6A2分泌的单克隆抗体。
本发明还保护四环素单克隆抗体杂交瘤细胞株TC-4C3（简称杂交瘤细胞TC-4C3）。杂交瘤细胞TC-4C3已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8408。
本发明还保护杂交瘤细胞TC-4C3分泌的单克隆抗体。
以上任一所述四环素类可为四环素和/或金霉素和/或多西霉素和/或土霉素。
本发明提供的试剂盒的检测原理基于免疫分析法，能同时待测样本中是否含有链霉素和四环素类，具有前处理简单、不需任何仪器、灵敏度高、特异性强、适用范围广、操作简便（对操作人员没有专业要求）、快捷（可在5-10min内获取结果）、成本低廉、仅通过T线和C线的显色即可读取结果及现场适应能力强等优点，非常适合现场大批量样本的筛选，可用于专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
图1为试纸条的结构示意图。
图2为试剂盒的使用状态示意图。
图3为试剂盒的结果判读示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
硫酸链霉素：Sigma-Aldrich，型号：85884。四环素：Sigma-Aldrich，型号：T3258。牛血清白蛋白(BSA)：Sigma-Aldrich，A2058。
链霉素的结构式如下：
四环素的结构式如下：
实施例1、偶联物、特异性抗体和特异性抗体的的胶体金标记物的制备
一、偶联物的制备
1、链霉素-载体蛋白偶联物的制备
（1）取2.544g碳酸钠，溶于24ml水，400rpm搅拌至溶解完全。
（2）取432mg硫酸链霉素，溶于12ml步骤（1）得到的碳酸钠溶液。
（3）取300mg BSA，溶于12ml步骤（1）得到的碳酸钠溶液。
（4）将步骤（2）得到的链霉素溶液逐滴加入步骤（3）得到的BSA溶液中并混匀，然后加入2.4ml10%（体积比）戊二醛水溶液并室温搅拌（400rpm）45min，然后滴加6ml20mg/mlNaBH4水溶液并4℃静置过夜，然后置于透析袋中用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析（透析过程参数：室温、100rpm搅拌、3天、每天换液2次)，然后4500rpm离心6min并取上清液（链霉素-载体蛋白偶联物溶液），1ml/管分装，-20℃保存。
（5）采用紫外分光光度法测定链霉素-载体蛋白偶联物溶液中链霉素与载体蛋白的摩尔结合比（方法参考文献：罗舜菁，钟寒燕，刘成梅，陈婷婷，陈发荣，严杰琳；氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备；食品科学；2010,Vol.31,No.10，91-94），链霉素与BSA的摩尔结合比为8:1。
2、四环素-载体蛋白偶联物的制备
（1）取50mg四环素，溶于2ml甲醇。
（2）取60mg BSA，溶于3ml醋酸钠缓冲液（pH4.5、0.1mol/L）。
（3）将步骤（1）得到的四环素溶液逐滴加入步骤（2）得到的BSA溶液中，然后加入140μL10%(体积比)甲醛水溶液并室温搅拌8h，然后置于透析袋中用纯水进行透析（透析过程参数：4℃、100rpm搅拌、3天、每天换液2次)，然后4500rpm离心6min并取上清液（四环素-载体蛋白偶联物溶液），1ml/管分装，-20℃保存。
（4）采用紫外分光光度法测定四环素-载体蛋白偶联物溶液中四环素与载体蛋白的摩尔结合比（方法参考文献：罗舜菁，钟寒燕，刘成梅，陈婷婷，陈发荣，严杰琳；氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备；食品科学；2010,Vol.31,No.10，91-94），四环素与BSA的摩尔结合比为12:1。
二、特异性抗体的制备
1、链霉素鼠单克隆抗体的制备
（1）动物免疫程序
采用BALB/c小鼠作为免疫动物，以链霉素-载体蛋白偶联物为免疫原，单次免疫剂量为50-100μg/只（以载体蛋白计）。首次免疫时将免疫原溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射。首次免疫后，每间隔2周将免疫原溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，进行加强免疫，颈背部皮下多点注射。第三次加强免疫2周后将免疫原剂量减半用0.5ml灭菌生理盐水稀释后，采用腹腔注射的方法加强免疫一次，3天后取脾细胞。
（2）细胞融合与克隆化
步骤（1）得到的脾细胞，按（4-8）：1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
（3）杂交瘤细胞株的保藏
将一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞命名为链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株STR-6A2（简称杂交瘤细胞STR-6A2）。杂交瘤细胞STR-6A2已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8404。
（4）细胞冻存和复苏
用冻存液将杂交瘤细胞STR-6A2制成细胞浓度为（1-5）×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。
（5）单克隆抗体的制备与纯化
细胞培养基（7.4）的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20%（质量百分含量），碳酸氢钠的终浓度为0.2%（质量百分含量）。
将杂交瘤细胞STR-6A2置于细胞培养基中，37℃培养2天，采用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的细胞培养上清液进行纯化，得到链霉素单克隆抗体溶液（-20℃保存）。
单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度（mg/ml）=1.45×OD280-0.74×OD260。
采用以上公式计算链霉素单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度，为0.5mg/ml。
2、四环素鼠单克隆抗体的制备
用四环素-载体蛋白偶联物代替链霉素-载体蛋白偶联物，其他同步骤1。
将一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞命名为四环素单克隆抗体杂交瘤细胞株TC-4C3（简称杂交瘤细胞TC-4C3）。杂交瘤细胞TC-4C3已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8408。
四环素单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度（mg/ml）=0.7mg/ml。
三、特异性抗体的胶体金标记物的制备
1、在沸腾的100mL的0.01g/100ml氯金酸水溶液中加入2-4mL的1%柠檬酸三钠水溶液，获得终浓度为0.01%的胶体金溶液（胶体金的直径为15-20nm）。
2、用0.1mol/L的K2CO3水溶液调胶体金溶液的pH至8.5。
3、将1μL10mg/mL的单克隆抗体溶液（步骤二制备的链霉素单克隆抗体溶液或四环素单克隆抗体溶液；预实验已得到最佳标记浓度）加入1mL步骤2得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10μL20g/100ml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10μL10g/100ml的PEG8000水溶液并搅拌15分钟，然后4℃、4000g离心15min取上清液，然后4℃、12000g离心20分钟取沉淀。
4、用PBS缓冲液（pH7.2、2mM）溶解步骤3得到的沉淀，4℃、12000g离心20分钟取沉淀，然后用200μL含1g/100ml BSA的PBS缓冲液（pH7.2、2mM）重悬沉淀，得到单克隆抗体的胶体金标记物。
5、取8联ELISA微孔反应板，向每个样品槽中加入链霉素单克隆抗体的胶体金标记物和四环素单克隆抗体的胶体金标记物各25μl，然后将样品板放入冷冻干燥机中，预冻4h后冻干14h，得到样品槽底部附着有两种单克隆抗体的胶体金标记物的样品板。
实施例2、试剂盒的组装
图1为试纸条的结构示意图。图2为试剂盒的使用状态示意图。图3为试剂盒的结果判读示意图。
本发明提供的用于检测链霉素和四环素类的试剂盒，包括实施例1的步骤三制备的样品板和8个完全相同的试纸条。试剂盒还包括铝箔袋，所述样品板和所述试纸条封装于所述铝箔袋中。每个试纸条包括底板1、反应膜2、样品吸收垫3和吸水垫4。所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连。所述试纸条的始端为检测端，末端为手柄端。所述样品吸收垫和所述反应膜具有2mm的重叠区，所述吸水垫和所述反应膜具有2mm的重叠区。所述样品吸收垫的始端与所述底板的始端对齐，所述吸水垫的末端与所述底板的末端对齐。所述试纸条还包括覆盖于所述样品吸收垫上和覆盖于所述吸水垫上的固定膜5。所述反应膜上由始端至末端依次具有T2线、T1线和C线，所述T2线、T1线和C线均与所述反应膜的轴线（即自始端至末端的中轴线）垂直。所述T2线和T1线上依次包被如下两种偶联物：实施例1的步骤一中制备的四环素-载体蛋白偶联物（包被浓度为1mg/mL，包被宽度为1mm，包被量为0.8μL/cm）和实施例1的步骤一中制备的链霉素-载体蛋白偶联物（包被浓度为1mg/mL,包被宽度为1mm，包被量为0.8μL/cm）。所述C线上包被抗抗体（羊抗鼠二抗，杭州格朗瑞生物科技有限公司，产品型号：GRBT-044；包被浓度为0.2mg/mL,包被宽度为1mm，包被量为1μL/cm）。
所述样品吸收垫的长度（自始端至末端）为18mm，所述反应膜的长度（自始端至末端）为20mm，所述吸水垫的长度（自始端至末端）为20mm。所述T2线距离所述样品吸收垫的垂直距离为6mm，所述T1线距离所述T2线的垂直距离为3.5mm，所述C线距离所述吸水垫的垂直距离为6mm。
所述底板为PVC板。所述样品吸收垫为玻璃纤维棉。所述反应膜为硝酸纤维素膜。所述吸水垫为吸水纸。所述保护膜为PE保护膜。
所述试剂盒的应用方法如下：
将待检样品溶液200μ1滴加到样品板的一个样品槽中，反复吹打至孔底的紫红色颗粒完全溶解，室温孵育3min，然后将试纸条的样品吸收垫端插入该样品槽中，反应5-8min，按照如下标准判断结果：
阴性：C线、T1线和T2线均显红色；待检样品中不含链霉素和四环素类；
阳性：C线显红色、T2线显红色、T1线不显色，待检样品中含链霉素，不含四环素类；C线显红色、T1线显红色、T2线不显色，待检样品中含四环素类，不含链霉素；C线显红色、T1线和T2线均不显色，待检样品中含链霉素和四环素类；
无效：C线不显色。
所述不含链霉素包括如下两种含义：第一种，不含有；第二种，含有，但含量低于检测限。所述不含四环素类包括如下两种含义：第一种，不含有；第二种，含有，但含量低于检测限。
所述试剂盒的检测原理如下：
待检样品中链霉素和四环素类的含量高于或等于检测限时，微孔中的链霉素单克隆抗体的胶体金标记物和/或四环素单克隆抗体的胶体金标记物均与待测样品中的抗原结合，结合有待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物无法与反应膜上的链霉素-载体蛋白偶联物和/或四环素-载体蛋白偶联物结合，T1线和/或T2线不显红色，结合有待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物可以与抗抗体结合，C线显红色；
待检样品中链霉素和四环素类的含量低于检测限时，微孔中的链霉素单克隆抗体的胶体金标记物和/或四环素单克隆抗体的胶体金标记物并不全与待测样品中的抗原结合，未结合待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物可以与反应膜上的链霉素-载体蛋白偶联物和/或四环素-载体蛋白偶联物结合，T1线和/或T2线显红色，结合有待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物或未结合待测样品中的抗原的的单克隆抗体的胶体金标记物均可以与抗抗体结合，C线显红色。
用硫酸链霉素、四环素、金霉素（上海楚柏公司，货号：C11509100）、多西霉素（济南天宇兽药原料公司，型号：A001）和土霉素（Sigma-Aldrich，型号：1491004）分别制备梯度稀释液，作为待检样品溶液，应用上述试剂盒进行检测。各个稀释液采用的溶剂均为PB缓冲液(pH7.2、0.02M)。
本发明提供的试剂盒对链霉素、四环素、金霉素、多西霉素和土霉素的检测限见表1。
表1检测限
药物名称 检测限μg/L(kg)
金霉素 20
多西霉素 30
四环素 50
土霉素 100
链霉素 50

Claims (6)

1.一种用于检测链霉素和四环素类的试剂盒，包括至少具有一个样品槽的样品板和至少一个试纸条；
所述样品槽的底部附着有链霉素特异性抗体的胶体金标记物和四环素特异性抗体的胶体金标记物；
所述试纸条包括底板(1)、反应膜(2)、样品吸收垫(3)和吸水垫(4)；所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；所述反应膜上由始端至末端依次具有T2线、T1线和C线，所述T2线、T1线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；所述T2线和T1线上分别包被如下两种偶联物：四环素-载体蛋白偶联物、链霉素-载体蛋白偶联物；所述C线上包被可与链霉素特异性抗体和/或四环素特异性抗体结合的抗抗体；
所述链霉素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白为BSA，链霉素与BSA的摩尔结合比为8∶1；
所述四环素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白为BSA，四环素与BSA的摩尔结合比为12∶1；
所述链霉素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：
(1)取2.544g碳酸钠，溶于24ml水；
(2)取432mg硫酸链霉素，溶于12ml步骤(1)得到的碳酸钠溶液；
(3)取300mg BSA，溶于12ml步骤(1)得到的碳酸钠溶液；
(4)将步骤(2)得到的链霉素溶液加入步骤(3)得到的BSA溶液中并混匀，然后加入2.4ml体积比为10％戊二醛水溶液并室温搅拌45min，然后加入6ml 20mg/ml NaBH4水溶液并4℃静置过夜，然后用pH7.2、0.01M PBS缓冲液进行透析，然后4500rpm离心6min并取上清液；
所述四环素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：
(1)取50mg四环素，溶于2ml甲醇；
(2)取60mg BSA，溶于3ml pH4.5、0.1mol/L醋酸钠缓冲液；
(3)将步骤(1)得到的四环素溶液加入步骤(2)得到的BSA溶液中，然后加入140μL体积比为10％甲醛水溶液并室温搅拌8h，然后用纯水进行透析，然后4500rpm离心6min并取上清液；
所述链霉素特异性抗体的胶体金标记物和所述四环素特异性抗体的胶体金标记物的制备方法均如下：
(1)在沸腾的100mL的0.01g/100ml氯金酸水溶液中加入2-4mL的1％柠檬酸三钠水溶液，获得终浓度为0.01％、直径为15-20nm的胶体金溶液；
(2)用0.1mol/L的K2CO3水溶液调胶体金溶液的pH至8.5；
(3)将1μL 10mg/mL的链霉素特异性抗体溶液或四环素特异性抗体溶液加入1mL步骤(2)得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10μL 20g/100ml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10μL 10g/100ml的PEG8000水溶液并搅拌15分钟，然后4℃、4000g离心15min取上清液，然后4℃、12000g离心20分钟取沉淀；
(4)用pH7.2、2mM PBS缓冲液溶解步骤(3)得到的沉淀，4℃、12000g离心20分钟取沉淀，然后用200μL含1g/100ml BSA pH7.2、2mM的PBS缓冲液重悬沉淀，得到特异性抗体的胶体金标记物；
所述四环素类为四环素和/或金霉素和/或多西霉素。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述链霉素特异性抗体为链霉素单克隆抗体或链霉素多克隆抗体；所述四环素特异性抗体为四环素单克隆抗体或四环素多克隆抗体。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述链霉素单克隆抗体为链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株STR-6A2 CGMCC No.8404分泌的单克隆抗体；所述四环素单克隆抗体为四环素单克隆抗体杂交瘤细胞株TC-4C3 CGMCC No.8408分泌的单克隆抗体。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试纸条还包括覆盖于所述样品吸收垫上和覆盖于所述吸水垫上的固定膜(5)。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述样品吸收垫和所述反应膜具有2mm的重叠区；所述吸水垫和所述反应膜具有2mm的重叠区。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述T2线和T1线上依次包被如下两种偶联物：四环素-载体蛋白偶联物、链霉素-载体蛋白偶联物。
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