CN104678100B - 庆大霉素、喹诺酮类二合一金标微孔试纸条 - Google Patents

庆大霉素、喹诺酮类二合一金标微孔试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种庆大霉素、喹诺酮类二合一金标微孔试纸条。本发明提供的试剂盒，包括至少具有一个样品槽的样品板和至少一个试纸条；样品槽的底部附着有庆大霉素特异性抗体的胶体金标记物和诺氟沙星特异性抗体的胶体金标记物；试纸条包括底板（1）、反应膜（2）、样品吸收垫（3）和吸水垫（4）；样品吸收垫、反应膜和吸水垫依次附着于底板上；反应膜上由始端至末端依次具有T2线、T1线和C线，T2线和T1线上分别包被如下两种偶联物：诺氟沙星‑载体蛋白偶联物、庆大霉素‑载体蛋白偶联物；C线上包被抗抗体。本发明提供的试剂盒具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

Description

庆大霉素、喹诺酮类二合一金标微孔试纸条
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种同时检测动物源性食品（如牛奶等）中庆大霉素、喹诺酮类残留量的庆大霉素、喹诺酮类二合一金标微孔试纸条。
背景技术
庆大霉素（Gentamycin，GM），是氨基糖苷类抗生素的一种，庆大霉素呈碱性、易溶于水、性状稳定，与硫酸结合成临床上使用的硫酸庆大霉素。它的抗菌谱较广，对绿脓杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、克雷白杆菌、奇异变形杆菌、某些吲哚变形杆菌、某些奈瑟菌、某些无色素雷杆菌和志贺菌等革兰氏阴性菌有抗菌作用，而且对革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌也有很强的抗菌作用；其抗菌作用机理是直接与30S核糖体亚单位16rRNA的解码区的A部位结合，从而导致菌体死亡。但是，随着庆大霉素的广泛使用，一些细菌逐渐对其产生了耐药性。虽然庆大霉素对奶牛乳房炎、子宫内膜炎等有很好的疗效，常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂，但不规范用药会引起畜产品，尤其是泌乳动物的乳汁中有药物残留，对人类的健康构成潜在危害，造成耳毒性和肾脏毒性。国内外相继规定了其在动物性食品中的最高残留限量。我国农业部235号公告规定，庆大霉素在肌肉、脂肪中的最高残留限量为100ppb，在肝中的最高残留限量为2000ppb，在肾中的最高残留限量为5000ppb，在牛奶中的最高残留限量为200ppb。
喹诺酮类（Quinolones，QNs），是一类人工合成的含4-喹诺酮基本结构，对细菌DNA螺旋酶具有选择性抑制的抗生素。1962年最早的喹诺酮类药物萘啶酸首先用于临床，由于其抗菌谱窄、口服吸收差、副作用高等原因现在已很少使用。当前应用的喹诺酮大多为含有氟原子的氟喹诺酮类。这类药物抗菌谱广，对革兰氏染色呈阴性杆菌活性较高，对其他抗生素耐药的德细菌也具有良好的抗菌作用，无交叉耐药性；在体内分布广，体内和组织中药物浓度高；口服吸收好，半衰期长，使用方便；与头孢菌素类药物相比，抗菌作用相似，但价格便宜。目前在兽医临床上常用的药物主要有诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、氟甲喹等十几种，随着应用的增加，其各种毒副作用也逐渐显现出来，主要体现在头晕、低血糖、恶心、胃肠道症状、中枢神经系统和过敏反应。特别是近几年，严重的不良反应发生率约为1.6%～1.8%，引起了全世界的关注。为了保障动物源性食品的安全，欧盟、美国及我国等很多国家都对喹诺酮类药物在动物源性食品中残留制定了最大残留限量（MRL）。我国农业部文件（农质发[2009]3号文件）中规定了2009年我国畜禽产品监测项目，禽肉中4种喹诺酮类药物残留是重要的监测项目之一。
现有的庆大霉素和喹诺酮类药物检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响较大，再者这些方法需要复杂的仪器，过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。目前尚无同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的残留量的产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种庆大霉素、喹诺酮类二合一金标微孔试纸条。
本发明提供了一种用于检测庆大霉素和喹诺酮类的试剂盒，包括至少具有一个样品槽的样品板和至少一个试纸条；
所述样品槽的底部附着有庆大霉素特异性抗体的胶体金标记物和诺氟沙星特异性抗体的胶体金标记物；
所述试纸条包括底板1、反应膜2、样品吸收垫3和吸水垫4；所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；所述反应膜上由始端至末端依次具有T2线、T1线和C线，所述T2线、T1线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；所述T2线和T1线上分别包被如下两种偶联物（两种偶联物可任意排序）：诺氟沙星-载体蛋白偶联物、庆大霉素-载体蛋白偶联物；所述C线上包被可与庆大霉素特异性抗体和/或诺氟沙星特异性抗体结合的抗抗体。
所述庆大霉素特异性抗体可为庆大霉素单克隆抗体或庆大霉素多克隆抗体。所述诺氟沙星特异性抗体可为诺氟沙星单克隆抗体或诺氟沙星多克隆抗体。所述庆大霉素单克隆抗体具体可为庆大霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株GEN-2A1CGMCC No.8406分泌的单克隆抗体。所述诺氟沙星单克隆抗体具体可为对11种喹诺酮类化合物（恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星、依诺沙星）都有交叉反应的诺氟沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株QNs CGMCC No.3779分泌的单克隆抗体。
任一所述的载体蛋白可为牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白或人血清白蛋白。
所述庆大霉素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白具体可为BSA，庆大霉素与BSA的摩尔结合比具体可为8:1。
所述诺氟沙星-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白具体可为BSA，诺氟沙星与BSA的摩尔结合比具体可为7:1。
所述庆大霉素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：
（1）取26mg庆大霉素原料药，溶于4ml碳酸盐缓冲液（取63.6mg无水NaCO3和117.6mg NaHCO3,用纯水定容至20mL)；
（2）取BSA60mg，溶于6ml所述碳酸盐缓冲液；
（3）将步骤（1）得到的庆大霉素溶液加到步骤（2）得到的BSA溶液中并室温混匀10min，然后加入487μl1%（体积比）戊二醛水溶液并室温搅拌过夜，然后加入NaBH4溶液（5mgNaBH4溶于500μl纯水）并室温搅拌1h，然后用纯水透析，再然后用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析，然后4500rpm离心6min并取上清液。
所述诺氟沙星-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：
（1）取诺氟沙星原料药15.9mg，溶于3ml DMF，然后依次加入19.2mg N-羟基琥珀酰亚胺和19.2mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，室温搅拌2h；
（2）取100mg BSA和132mg碳酸氢钠，溶于12ml水；
（3）在冰水浴中，将步骤（2）得到的BSA溶液加入步骤（1）得到的溶液中，室温搅拌24h，然后用纯水进行透析，再然后用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析，然后4500rpm离心6min并取上清液（诺氟沙星-载体蛋白偶联物溶液）。
庆大霉素特异性抗体的胶体金标记物和诺氟沙星特异性抗体的胶体金标记物的制备方法均如下：
（1）在沸腾的100mL的0.01g/100ml氯金酸水溶液中加入2-4mL的1%柠檬酸三钠水溶液，获得终浓度为0.01%的胶体金溶液（胶体金的直径为15-20nm）；
（2）用0.1mol/L的K2CO3水溶液调胶体金溶液的pH至8.5；
（3）将1μL10mg/mL的特异性抗体溶液（庆大霉素特异性抗体溶液或诺氟沙星特异性抗体溶液）加入1mL步骤（2）得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10μL20g/100ml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10μL10g/100ml的PEG8000水溶液并搅拌15分钟，然后4℃、4000g离心15min取上清液，然后4℃、12000g离心20分钟取沉淀；
（4）用PBS缓冲液（pH7.2、2mM）溶解步骤（3）得到的沉淀，4℃、12000g离心20分钟取沉淀，然后用200μL含1g/100ml BSA的PBS缓冲液（pH7.2、20mM）重悬沉淀，得到特异性抗体的胶体金标记物。
所述庆大霉素特异性抗体的胶体金标记物和所述诺氟沙星特异性抗体的胶体金标记物均可以冻干品的形式附着于于所述样品槽底部。这样做的优势是简化样品前处理过程，提高产品的检测的灵敏度。所述样品板的制备方法具体如下：取微孔反应板（如8联ELISA微孔反应板），向每个样品槽中加入庆大霉素特异性抗体的胶体金标记物和诺氟沙星特异性抗体的胶体金标记物各25μl，然后将样品板放入冷冻干燥机中，预冻4h后冻干14h，得到样品槽底部附着有两种特异性抗体的胶体金标记物的样品板。
所述试纸条还可包括覆盖于所述样品吸收垫上和覆盖于所述吸水垫上的固定膜5。所述固定膜可以促进试纸条中各组件的稳固性，优选为防水材质。所述固定膜还具有避免样品或试剂与外界环境中的物质发生反应的作用。
所述样品吸收垫和所述反应膜具有2mm的重叠区；所述吸水垫和所述反应膜具有2mm的重叠区。重叠区保证了样品液流动的连续性，使反应能够充分发生，有效地降低了实验误差。
所述T2线和T1线上依次包被如下两种偶联物：诺氟沙星-载体蛋白偶联物、庆大霉素-载体蛋白偶联物。
所述试纸条中，所述样品吸收垫的始端与所述底板的始端对齐，所述吸水垫的末端与所述底板的末端对齐。
所述试纸条的始端为检测端，末端为手柄端。
所述样品吸收垫的长度（自始端至末端）可为18mm，所述反应膜的长度（自始端至末端）可为20mm，所述吸水垫的长度（自始端至末端）可为20mm。所述T2线距离所述样品吸收垫的垂直距离可为6mm，所述T1线距离所述T2线的垂直距离可为3.5mm；所述C线距离所述吸水垫的垂直距离可为6mm。
所述庆大霉素-载体蛋白偶联物的包被浓度可为1mg/mL、包被宽度可为1mm、包被量可为0.8μL/cm。所述诺氟沙星-载体蛋白偶联物的包被浓度可为1mg/mL、包被宽度可为1mm、包被量可为0.8μL/cm。
所述抗抗体具体可为羊抗鼠二抗。所述抗抗体的包被浓度可为0.2mg/mL、包被宽度可为1mm，包被量可为1μL/cm。
所述底板可为PVC板。所述样品吸收垫可为玻璃纤维棉。所述反应膜可为硝酸纤维素膜。所述吸水垫可为吸水纸。所述保护膜可为PE保护膜。所述样品板可为塑料材质。
所述试剂盒还可包括铝箔袋，所述样品板和所述试纸条封装于所述铝箔袋中。
每个试剂盒具体可包括具有8个样品槽的样品板和8个试纸条。
本发明提供的试剂盒中，特异性抗体与胶体金颗粒之间无价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此具有较高的特异性和灵敏度。
本发明还保护庆大霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株GEN-2A1（简称杂交瘤细胞GEN-2A1）。杂交瘤细胞GEN-2A1已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCCNo.8406。
杂交瘤细胞GEN-2A1分泌的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。
对11种喹诺酮类化合物（恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星、依诺沙星）都有交叉反应的诺氟沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株QNs（简称杂交瘤细胞株QNs）已于2010年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.3779。
以上任一所述喹诺酮类可为诺氟沙星和/或恩诺沙星和/或噁喹酸和/或环丙沙星和/或达氟沙星和/或氟甲喹和/或洛美沙星和/或依诺沙星和/或培氟沙星和/或麻保沙星和/或氧氟沙星
本发明提供的试剂盒的检测原理基于免疫分析法，能同时待测样本中是否含有庆大霉素和喹诺酮类，具有前处理简单、不需任何仪器、灵敏度高、特异性强、适用范围广、操作简便（对操作人员没有专业要求）、快捷（可在5-10min内获取结果）、成本低廉、仅通过T线和C线的显色即可读取结果及现场适应能力强等优点，非常适合现场大批量样本的筛选，可用于专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
图1为试纸条的结构示意图。
图2为试剂盒的使用状态示意图。
图3为试剂盒的结果判读示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
庆大霉素原料药：Sigma-Aldrich，G1397。诺氟沙星原料药：Sigma-Aldrich，型号：N9890。牛血清白蛋白(BSA)：Sigma-Aldrich，A2058。
庆大霉素的结构式如下：
诺氟沙星的结构式如下：
实施例1、偶联物、特异性抗体和特异性抗体的的胶体金标记物的制备
一、偶联物的制备
1、庆大霉素-载体蛋白偶联物的制备
（1）取26mg庆大霉素原料药，溶于4ml碳酸盐缓冲液（取63.6mg无水NaCO3和117.6mg NaHCO3,用纯水定容至20mL)中。
（2）取BSA60mg，溶于6ml所述碳酸盐缓冲液。
（3）将步骤（1）得到的庆大霉素溶液滴加到步骤（2）得到的BSA溶液中并室温混匀10min，然后加入487μl1%（体积比）戊二醛水溶液并室温搅拌（400rpm）过夜，然后滴加NaBH4溶液（5mg NaBH4溶于500μl纯水，新制）并室温搅拌1h，然后置于透析袋中用纯水透析（透析参数：4℃、100rpm搅拌、2天、每天换液2次），再然后用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析（透析过程参数：4℃、100rpm搅拌、2天、每天换液2次)，然后4500rpm离心6min并取上清液（庆大霉素-载体蛋白偶联物溶液），1ml/管分装，-20℃保存。
（4）采用紫外分光光度法测定庆大霉素-载体蛋白偶联物溶液中庆大霉素与载体蛋白的结合比（方法参考文献：罗舜菁，钟寒燕，刘成梅，陈婷婷，陈发荣，严杰琳；氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备；食品科学；2010,Vol.31,No.10，91-94），庆大霉素与BSA的摩尔结合比为8:1。
2、诺氟沙星-载体蛋白偶联物的制备
（1）取诺氟沙星原料药15.9mg，溶于3ml DMF，然后依次加入19.2mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和19.2mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)，室温搅拌2h。
（2）取100mg BSA和132mg碳酸氢钠，溶于12ml水。
（3）在冰水浴中，将步骤（2）得到的BSA溶液逐滴加入到步骤（1）得到的溶液中，室温搅拌24h，然后置于透析袋中用纯水透析（透析参数：4℃、100rpm搅拌、2天、每天换液2次），再然后用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析（透析过程参数：4℃、100rpm搅拌、2天、每天换液2次)，然后4500rpm离心6min并取上清液（诺氟沙星-载体蛋白偶联物溶液），1ml/管分装，-20℃保存。
（4）采用紫外分光光度法测定诺氟沙星-载体蛋白偶联物溶液中诺氟沙星与载体蛋白的结合比（方法参考文献：罗舜菁，钟寒燕，刘成梅，陈婷婷，陈发荣，严杰琳；氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备；食品科学；2010,Vol.31,No.10，91-94），诺氟沙星与BSA的摩尔结合比为7:1。
二、特异性抗体的制备
1、庆大霉素鼠单克隆抗体的制备
（1）动物免疫程序
采用BALB/c小鼠作为免疫动物，以庆大霉素-载体蛋白偶联物为免疫原，单次免疫剂量为50-100μg/只（以载体蛋白计）。首次免疫时将免疫原溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射。首次免疫后，每间隔2周将免疫原溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，进行加强免疫，颈背部皮下多点注射。第三次加强免疫2周后将免疫原剂量减半用0.5ml灭菌生理盐水稀释后，采用腹腔注射的方法加强免疫一次，3天后取脾细胞。
（2）细胞融合与克隆化
步骤（1）得到的脾细胞，按（4-8）：1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
（3）杂交瘤细胞株的保藏
将一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞命名为庆大霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株GEN-2A1（简称杂交瘤细胞GEN-2A1）。杂交瘤细胞GEN-2A1已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8406。
（4）细胞冻存和复苏
用冻存液将杂交瘤细胞GEN-2A1制成细胞浓度为（1-5）×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。
（5）单克隆抗体的制备与纯化
细胞培养基（7.4）的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20%（质量百分含量），碳酸氢钠的终浓度为0.2%（质量百分含量）。
将杂交瘤细胞GEN-2A1置于细胞培养基中，37℃培养2天，采用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的细胞培养上清液进行纯化，得到庆大霉素单克隆抗体溶液（-20℃保存）。
单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度（mg/ml）=1.45×OD280-0.74×OD260。
采用以上公式计算庆大霉素单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度，为0.8mg/ml。
2、诺氟沙星鼠单克隆抗体的制备
用诺氟沙星-载体蛋白偶联物代替庆大霉素-载体蛋白偶联物，其他同步骤1。
将一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞命名为对11种喹诺酮类化合物（恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星、依诺沙星）都有交叉反应的诺氟沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株QNs（简称杂交瘤细胞株QNs）。杂交瘤细胞株QNs已于2010年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCCNo.3779。
诺氟沙星单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度（mg/ml）=0.6mg/ml。
三、特异性抗体的胶体金标记物的制备
1、在沸腾的100mL的0.01g/100ml氯金酸水溶液中加入2-4mL的1%柠檬酸三钠水溶液，获得终浓度为0.01%的胶体金溶液（胶体金的直径为15-20nm）。
2、用0.1mol/L的K2CO3水溶液调胶体金溶液的pH至8.5。
3、将1μL10mg/mL的单克隆抗体溶液（步骤二制备的庆大霉素单克隆抗体溶液或诺氟沙星单克隆抗体溶液；预实验已得到最佳标记浓度）加入1mL步骤2得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10μL20g/100ml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10μL10g/100ml的PEG8000水溶液并搅拌15分钟，然后4℃、4000g离心15min取上清液，然后4℃、12000g离心20分钟取沉淀。
4、用PBS缓冲液（pH7.2、2mM）溶解步骤3得到的沉淀，4℃、12000g离心20分钟取沉淀，然后用200μL含1g/100ml BSA的PBS缓冲液（pH7.2、20mM）重悬沉淀，得到单克隆抗体的胶体金标记物。
5、取8联ELISA微孔反应板，向每个样品槽中加入庆大霉素单克隆抗体的胶体金标记物和诺氟沙星单克隆抗体的胶体金标记物各25μl，然后将样品板放入冷冻干燥机中，预冻4h后冻干14h，得到样品槽底部附着有两种单克隆抗体的胶体金标记物的样品板。
实施例2、试剂盒的组装
图1为试纸条的结构示意图。图2为试剂盒的使用状态示意图。图3为试剂盒的结果判读示意图。
本发明提供的用于检测庆大霉素和喹诺酮类的试剂盒，包括实施例1的步骤三制备的样品板和8个完全相同的试纸条。所述试剂盒还包括铝箔袋，所述样品板和所述试纸条封装于所述铝箔袋中。每个试纸条包括底板1、反应膜2、样品吸收垫3和吸水垫4。所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连。所述试纸条的始端为检测端，末端为手柄端。所述样品吸收垫和所述反应膜具有2mm的重叠区，所述吸水垫和所述反应膜具有2mm的重叠区。所述样品吸收垫的始端与所述底板的始端对齐，所述吸水垫的末端与所述底板的末端对齐。所述试纸条还包括覆盖于所述样品吸收垫上和覆盖于所述吸水垫上的固定膜5。所述反应膜上由始端至末端依次具有T2线、T1线和C线，所述T2线、T1线和C线均与所述反应膜的轴线（即自始端至末端的中轴线）垂直。所述T2线和T1线上依次包被如下两种偶联物：实施例1的步骤一中制备的诺氟沙星-载体蛋白偶联物（包被浓度为1mg/mL，包被宽度为1mm，包被量为0.8μL/cm）和实施例1的步骤一中制备的庆大霉素-载体蛋白偶联物（包被浓度为1mg/mL,包被宽度为1mm，包被量为0.8μL/cm）。所述C线上包被抗抗体（羊抗鼠二抗，杭州格朗瑞生物科技有限公司，产品型号：GRBT-044；包被浓度为0.2mg/mL,包被宽度为1mm，包被量为1μL/cm）。
所述样品吸收垫的长度（自始端至末端）为18mm，所述反应膜的长度（自始端至末端）为20mm，所述吸水垫的长度（自始端至末端）为20mm。所述T2线距离所述样品吸收垫的垂直距离为6mm，所述T1线距离所述T2线的垂直距离为3.5mm，所述C线距离所述吸水垫的垂直距离为6mm。
所述底板为PVC板。所述样品吸收垫为玻璃纤维棉。所述反应膜为硝酸纤维素膜。所述吸水垫为吸水纸。所述保护膜为PE保护膜。
所述试剂盒的应用方法如下：
将待检样品溶液200μ1滴加到样品板的一个样品槽中，反复吹打至孔底的紫红色颗粒完全溶解，室温孵育3min，然后将试纸条的样品吸收垫端插入该样品槽中，反应5-8min，按照如下标准判断结果：
阴性：C线、T1线和T2线均显红色；待检样品中不含三聚氰胺和喹诺酮类；
阳性：C线显红色、T2线显红色、T1线不显色，待检样品中含庆大霉素，不含喹诺酮类；C线显红色、T1线显红色、T2线不显色，待检样品中含喹诺酮类，不含庆大霉素；C线显红色、T1线和T2线均不显色，待检样品中含庆大霉素和喹诺酮类；
无效：C线不显色。
所述不含庆大霉素包括如下两种含义：第一种，不含有；第二种，含有，但含量低于检测限。所述不含喹诺酮类包括如下两种含义：第一种，不含有；第二种，含有，但含量低于检测限。
所述试剂盒的检测原理如下：
待检样品中庆大霉素和喹诺酮类的含量高于或等于检测限时，微孔中的庆大霉素单克隆抗体的胶体金标记物和/或诺氟沙星单克隆抗体的胶体金标记物均与待测样品中的抗原结合，结合有待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物无法与反应膜上的庆大霉素-载体蛋白偶联物和/或诺氟沙星-载体蛋白偶联物结合，T1线和/或T2线不显红色，结合有待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物可以与抗抗体结合，C线显红色；
待检样品中庆大霉素和喹诺酮类的含量低于检测限时，微孔中的庆大霉素单克隆抗体的胶体金标记物和/或诺氟沙星单克隆抗体的胶体金标记物并不全与待测样品中的抗原结合，未结合待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物可以与反应膜上的庆大霉素-载体蛋白偶联物和/或诺氟沙星-载体蛋白偶联物结合，T1线和/或T2线显红色，结合有待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物或未结合待测样品中的抗原的的单克隆抗体的胶体金标记物均可以与抗抗体结合，C线显红色。
用庆大霉素原料药、诺氟沙星原料药、恩诺沙星（Sigma-Aldrich，型号：17849）、噁喹酸（（湖北楚盛威化工有限公司市场三部，型号：14698-29-4[1]）、环丙沙星（（Sigma-Aldrich，型号：17850）、达氟沙星（（Sigma-Aldrich，型号：33700）、氟甲喹（Sigma-Aldrich，型号：F7016）、洛美沙星（商丘康美达，型号：usp30））、依诺沙星（Sigma-Aldrich，E3764）、培氟沙星（Sigma-Aldrich，32551）、麻保沙星Sigma-Aldrich，34039）和氧氟沙星（Sigma-Aldrich，33703）分别制备梯度稀释液，作为待检样品溶液，应用上述试剂盒进行检测。各个稀释液采用的溶剂均为PB缓冲液（pH7.2、0.02M）。
本发明提供的试剂盒对庆大霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、噁喹酸、环丙沙星、达氟沙星、氟甲喹、洛美沙星、依诺沙星、培氟沙星、麻保沙星和氧氟沙星的检测限见表1。
表1检测限
药物名称 检测限μg/L(kg)
庆大霉素 20
恩诺沙星 20
噁喹酸 20
环丙沙星 20
诺氟沙星 20
达氟沙星 20
氟甲喹 20
洛美沙星 20
依诺沙星 20
培氟沙星 20
麻保沙星 20
氧氟沙星 20

Claims (7)

1.一种用于检测庆大霉素和喹诺酮类的试剂盒，包括至少具有一个样品槽的样品板和至少一个试纸条；
所述样品槽的底部附着有庆大霉素特异性抗体的胶体金标记物和诺氟沙星特异性抗体的胶体金标记物；
所述试纸条包括底板(1)、反应膜(2)、样品吸收垫(3)和吸水垫(4)；所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；所述反应膜上由始端至末端依次具有T2线、T1线和C线，所述T2线、T1线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；所述T2线和T1线上分别包被如下两种偶联物：诺氟沙星-载体蛋白偶联物、庆大霉素-载体蛋白偶联物；所述C线上包被可与庆大霉素特异性抗体和/或诺氟沙星特异性抗体结合的抗抗体；
所述庆大霉素特异性抗体为庆大霉素单克隆抗体；所述庆大霉素单克隆抗体为庆大霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株GEN-2A1No.8406分泌的单克隆抗体；
所述诺氟沙星特异性抗体为诺氟沙星单克隆抗体；所述诺氟沙星单克隆抗体为对11种喹诺酮类化合物都有交叉反应的诺氟沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株QNs CGMCC No.3779分泌的单克隆抗体；
所述11种喹诺酮类化合物为恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依诺沙星。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：任一所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白或人血清白蛋白。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试纸条还包括覆盖于所述样品吸收垫上和覆盖于所述吸水垫上的固定膜(5)。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述样品吸收垫和所述反应膜具有2mm的重叠区；所述吸水垫和所述反应膜具有2mm的重叠区。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述T2线和T1线上依次包被如下两种偶联物：诺氟沙星-载体蛋白偶联物、庆大霉素-载体蛋白偶联物。
6.庆大霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株GEN-2A1No.8406，它的保藏编号为CGMCCNo.8406。
7.权利要求6所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104950108A (zh) * 2015-06-26 2015-09-30 广州万孚生物技术股份有限公司 液体检测杯及其中的检测试纸条
CN105738582B (zh) * 2016-04-21 2017-11-21 天津科技大学 一种同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的免疫层析试纸条及其制备方法
CN113985022B (zh) * 2021-10-26 2024-03-12 福建农林大学 一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101315382A (zh) * 2008-07-18 2008-12-03 中国检验检疫科学研究院 用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法
CN102818895A (zh) * 2012-08-09 2012-12-12 河南省农业科学院 林可霉素残留快速检测试纸条及其制备方法
CN102980980A (zh) * 2012-10-30 2013-03-20 北京陆桥技术有限责任公司 多残留金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用
CN203069594U (zh) * 2012-10-22 2013-07-17 北京勤邦生物技术有限公司 检测红霉素的胶体金试纸条

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101315382A (zh) * 2008-07-18 2008-12-03 中国检验检疫科学研究院 用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法
CN102818895A (zh) * 2012-08-09 2012-12-12 河南省农业科学院 林可霉素残留快速检测试纸条及其制备方法
CN203069594U (zh) * 2012-10-22 2013-07-17 北京勤邦生物技术有限公司 检测红霉素的胶体金试纸条
CN102980980A (zh) * 2012-10-30 2013-03-20 北京陆桥技术有限责任公司 多残留金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rapid Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Colloidal Gold Immunoassay for Kanamycin and Tobramycin in Swine Tissues;YIQIANG CHEN et al;《J. Agric. Food Chem.》;20080504;第56卷(第9期);2944–2952 *

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