CZ298034B6

CZ298034B6 - Izolovaný polypeptid OMP106, sekvence genu, protilátka a vakcína

Info

Publication number: CZ298034B6
Application number: CZ0352498A
Authority: CZ
Inventors: Tucker@Kenneth; Plosila@Laura
Original assignee: Antex Biologics, Inc.
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-04-28
Publication date: 2007-05-30
Also published as: CA2253636C; CZ352498A3; EP0900025A1; US20100021492A1; US20070087019A1; US20020177200A1; GEP20022695B; AU3118097A; EA002743B1; US6214981B1; NO985113D0; ES2202624T3; DE69723254T2; BG64832B1; CN1223549A; BR9711090A; EA199800973A1; PL330935A1; PL189375B1; EP0900025B1

Abstract

Rešení se týká polypeptidu OMP106 (vnejší membránový protein - 106) z Moraxella catarrhalis, polypeptidu z nej odvozených (OMP106-odvozené polypeptidy), nukleotidových sekvencí kódujících tyto polypeptidy, a protilátek, které se specificky vážou k polypeptidu OMP106 a/nebo OMP106-odvozeným polypeptidum. Rovnež se týká imunogenních, profylaktickýchnebo terapeutických prostredku, vcetne vakcín, které obsahují polypeptid OMP106 a/nebo OMP106-odvozené polypeptidy. Vynález je využitelný pro vyvolání imunitní odpovedi u zvírat proti M.catarrhalis aproti polypeptidum OMP106 a OMP106-odvozeným polypeptidum M.catarrhalis.

Description

Izolovaný polypeptid OMP106, sekvence genu, protilátka a vakcína

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká polypeptidu vnějšího membránového proteinu-106 (OMP106, outer membrane protein) z mikroorganizmu Moraxella catarrhalis. Vynález zahrnuje purifikovaný polypeptid OMP106 a polypeptidy zněj odvozené (OMPlOó-odvozené polypeptidy). Vynález též zahrnuje protilátky, včetně cytotoxických, které se specificky vážou k polypeptidu OMP106 a/nebo k OMPlOó-odvozeným polypeptidům. Vynález dále zahrnuje profylaktické nebo terapeutické prostředky, včetně vakcín, které obsahují polypeptid OMP106 a/nebo OMPlOó-odvozené polypeptidy. Vynález je využitelný pro navození imunitní odpovědi na M. catarrhalis u savců. Vynález dále poskytuje izolované nukleotidové sekvence kódující polypeptid OMP106 a OMPlOó-odvozené polypeptidy, vektory obsahující uvedené sekvence a hostitelské buňky obsahující uvedené vektory.

Dosavadní stav techniky

Moraxella catarrhalis, rovněž známá jako Moraxella (Branhamella) catarrhalis nebo branhamella catarrhalis a dříve známá jako Neisseria catarrhalis nebo micrococcus catarrhalis, je gramnegativní baktérie, často se vyskytující v dýchacím traktu lidí. O M. catarrhalis, původně považované za neškodný symbiotický organizmus, se nyní ví, že je důležitým patogenem způsobujícím u zvířat infekce horních a dolních dýchacích cest. U lidí M. catarrhalis způsobuje vážné infekce dolních cest dýchacích u dospělých a chronickými plicními chorobami, systémové infekce u pacientů s oslabenou imunitou, a zánět středního ucha a zánět dutin u kojenců a dětí. Viz Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Catlin, B.W., 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3: 293-320; a odkazy zde citované.

2.1. Vnější membránové proteiny a ochranné protilátky

K pochopení patogenního procesu při infekcích bakterií Moraxella catarrhalis a pro vyvinutí užitečných terapeutických postupů a profylaktických opatření proti těmto infekcím byly studovány složky vnějšího povrchu M. catarrhalis. Zvláštní pozornost byla věnována vnějším membránovým proteinům (OMP, outer membrane protein), jakožto možným faktorům virulence a potenciálním vakcinačním antigenům. M. catarrhalis má asi 10 až 20 různých proteinů OMP, přičemž 6 až 8 z nich, proteiny OMP A až H představují převlékací typ (Murphy a Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174). Molekulové hmotnosti proteinů OMP A až H se pohybují v rozmezí od 97 do 20 kDa. Viz Bartoš a Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765; Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Murphy et al., 1993, Molecul. Microbiol. 10:87-97; Sarwar et al., 1992, Infect. Immun. 60:804-809. Srovnání proteinů v preparátech vnějších membrán z 50 kmenů M. catarrhalis pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) ukazuje téměř shodné profily proteinů OMP A až H (Bartoš a Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765).

Vedle proteinů OMP A až H byl v mnoha kmenech M. catarrhalis pozorován jako další významná složka povrchu též OMP o vysoké molekulové hmotnosti, označovaný jako HMW-OMP, mající podle SDS-PAGE zdánlivou velikost 350 až 720 kDa. Po denaturaci kyselinou mravenčí poskytuje HMW-OMP v elektroforéze jediný pruh o velikosti 120 až 140 kDa, takže se patrně jedná o oligomemí proteiny (Klingman a Murphy, 1949, Infect. Immun. 62:11501155). HMW-OMP je zřejmě totožný s proteinem UspA, který takto označil Helminen et al. (1994, J. Infect. Dis. 170:867-872) a který byl prokázán u řady kmenů M. catarrhalis.

Na povrchu intaktních bakterií nebo vezikulů vytvořených z vnější bakteriální membrány jsou přístupné epitopy několika výše uvedených proteinů OMP, které mohou vyvolat tvorbu protilátek

-1 CZ 298034 B6 schopných vazby k proteinům OMP. Mezi tyto antigenní proteiny OMP patří OMP E a OMP G (Murphy a Bartoš, 1989, Infect. Immun. 57:2938-2941); OMP C/D (Sarwar et al., 1992, Infect. Immun. 60:804-809); CopB, 80 kDa OMP, (Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010); a UspA (Helminen et al., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).

Terapeutický potenciál protilátek proti povrchově přístupným epitopům proteinů CopB a UspA byl studován na zvířecím modelu. Plíce myší kmene Balb/c VAF/Plus byly přímo jednorázově inokulovány regulovaným počtem buněk M. catarrhalis a poté byla sledována rychlost vymizení bakterií v plicích (Unhanand et al., 1929, J. Infect. Dis. 165:644-650). Různé klinické izoláty M. catarrhalis vykazovaly různé rychlosti vymizení, jež korelovaly s hladinou akumulace granulocytů v místě infekce. Pasivní imunizace monoklonální protilátkou namířenou proti povrchově přístupnému epitopu CopB nebo UspA zvýšila rychlost vymizení M. catarrhalis v plících (Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Helminen et al., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).

2.2. Adherence bakterie / hostitelská buňka a hemaglutinace

Adherence bakteriálních patogenů k povrchu hostitelské buňky podporuje kolonizaci a zahajuje patogenezi. Viz E H. Baechey, 1981, J. Infect. Dis. 143:325-345. Gramnegativní bakterie typicky exprimují povrchové lektiny, které se vážou k specifickým oligosacharidům glykoproteinů a/nebo glykolipidů na povrchu hostitelské buňky. Tyto lektiny jsou často asociovány spili a fimbriemi. Bakteriální adherence může být též způsobena nespecifickou hydrofobní a/nebo nábojem zprostředkovanou interakcí s povrchem hostitelské buňky.

Mechanizmus adherence M. catarrhalis k buňkám dýchacího traktu není přesně znám. Bakterie se přichytávají na lidské orofaryngální epitelové buňky v kultuře (Mbaki et al., 1987, Tohuku

J. Exp. Med. 153:111-121). V adherenci k těmto buňkám mohou hrát roli fímbriím lze snížit adherenci kmenů majících fimbrie (Rikitomi et al., 1991, Scand. J. Infect. Dis. 23:559-567). Vazba zprostředkovaná fibriemi však může být jediná zodpovědná za tuto adherenci, protože z několika studovaných kmenů se nejvíce vázal kmen bez fimbrií.

Pro klasifikaci bakteriálních adhesinů se často používají hemaglutinační reakce namísto komplikovanějších testů adherence. Rikitomi et al., však nenalezli u kmenů M. catarrhalis žádnou korelaci mezi adhrencí k lidským oiyfaryngálním epitelovým buňkám a hemaglutinací (tamtéž). To jest, tři vysoce adherující kmeny neaglutinovaly lidské aerytrocyty. Při adherenci k lidským orofaryngálním epitelovým buňkám a při hemaglutinací se tedy uplatňují rozdílné vazebné mechanizmy.

Naproti tomu Kellens et al. v nedávné studii dokládají, že hemaglutinace bakteriemi M. catarrhalis koreluje s adherenci k hostitelským buňkám (Kellens et al., 1995, Infection 23:37-41). Jako testu adherence však byla v této práci použita vazba bakterií k prasečím tracheálním řezům. Není jasné, zda prasečí tracheální tkáň lze považovat za homologní s tkání lidského dýchacího traktu, co se týká adherence patogenních kmenů M. catarrhalis.

Nehledě na problematický adherenční test, Kellens et al., vyšetřili hemaglutinační aktivitu více jak osmdesáti klinických izolátů M. catarrhalis (Kellens et al, 1995, Infection 23:37 41). Téměř tři čtvrtiny zkoumaných kmenů aglutinovaly lidské, králičí, morčecí, psí nebo krysí erytrocyty, zatímco zbývající kmeny neaglutinovaly. Aglutinační aktivita některých hemaglutinujících kmenů byla dále charakterizována a bylo prokázáno, že je závislá na vápenatých iontech a že je inhibována tryptickým štěpením nebo působením vysoké teploty nebo přidáním D-glukosaminu nebo D-galaktosaminu.

V přehledu hemaglutinujících a nehemaglutinujících kmenů M. catarrhalis uvádí Tucker et al, že všechny kmeny vážou glykolipid gangliotetraosylceramid, ale pouze hemaglutinující kmeny vážou glykolipid globotetraosylceramid (Tucker et al., 1994, Annal. Meeting of Amer. Soc.

-2CZ 298034 B6

Microbiol, Abstract N. Dl234). Kromě toho bylo prokázáno, že hemaglutinační aktivita M. catarrhalis je inhibována různými monosacharidy, které jsou součástí cukerného zbytku globotetraosylceramidu. tyto nálezy vedly Tuckera et al. k závěru, že M. catarrhalis hemaglutinuje tím, že se váže ke globotetraosylceramidům v buněčné membráně vhodných erytrocyt, včetně lidských červených krvinek. Žádné dosavadní výzkumy neidentikovaly nějakou molekulu na vnějším povrchu M. catarrhalis, jež by byla zodpovědná za adherenci k hostitelské buňce nebo za hemaglutinaci.

Uvedení citace nebo odkazu v této části nebo v kterékoli jiné části této přihlášky nemá být rozuměno tak, že takovýto odkaz znamená dostupnost poznatků před tímto vynálezem.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká polypeptidů MOP 106 iM. catarrhalis a polypeptidů zOMPÍOó odvozených a způsobů výroby uvedených polypeptidů. Vynález se též týká antisér a protilátek, včetně cytotoxických protilátek, spefických pro polypeptid OMP106 a/nebo OMP106-odvozené polypeptidy. Vynález se dále týká imunogenních, profylaktických nebo terapeutických prostředků, včetně vakcín, obsahujících jeden nebo více uvedených polypeptidů. Vynález se dále týká nukleotidových sekvencí, které kódují uvedené polypeptidy. Dále se vynález týká imunogenních, profylaktických nebo terapeutických prostředků, včetně vakcín, které obsahují atenuovaný nebo inaktivovaný nehemaglutinující kultivar M. catarrhalis.

Předkládaný vynález má mnohá využití. Například, polypeptid OMP106 a OMP106-odvození polypeptidy mohou být použity jako ligandy k detekci protilátek vytvořených jako odpověď na infekce M. catarrhalis (např. v diagnostice infekcí M. catarrhalis). Polypeptid OMP106 a OMP106-odvozené polypeptidy též mohou být použity jako imunogeny pro vyvolání tvorby protilátek specifických kM. catarrhalis. Takovéto protilátky jsou užitečné pro imunologická stanovení M. catarrhalis v biologických vzorcích. Cytotoxické protilátky podle vynálezu jsou užitečné pro pasivní imunizaci proti infekcím M. catarrhalis. Polypeptid ΘΜΡ106 a OMP106-odvozené polypeptidy mohou dále být použity jako aktivní součástí vakcín proti infekcím M. catarrhalis.

Vynález vychází z překvapujícího objevu, že hemaglutinující kmeny a kultivary M. catarrhalis mají vnější membránový protein, OMP106, který má molekulovou hmotnost asi 180 až 230 kDa, a že nehemaglutinující kmeny a kultivary M. catarrhalis buď nemají polypeptid OMP106, nebo mají OMP106 nevhodně modifikovaný tak, že je neaktivní v hemaglutinaci a není barvitelný stříbrem. Vynález dále vychází z objevu, že polyklonální antisérum indukované polypeptidem OMP106, který byl izolován z hemaglutinujícího kmene M. catarrhalis, má cytotoxickou aktivitu proti jinému hemaglutinujícímu kmeni M. catarrhalis, nikoli však proti nehemaglutinujícímu kmeni M. catarrhalis.

3.1 Definice a zkratky anti-OMP 106 = protilátka nebo antisérum proti polypeptidů OMP106

ATCC = Američan Type Culture Collection (sbírka kmenů) měchýřky (blebs)= přirozeně se vyskytující vazikuly vnější membrány u M. catarrhalis

Gb₄ = GalNAcpl-3Galal-4Gaipi-4Glcl-lCeramid

HA = hemaglutinující imunoreaktivní = schopný vyvolat buněčnou nebo humorální imunitní odpověď

-3 CZ 298034 B6

kDa	= kilodaltony
M. catarrhalis	= Mc; Moraxella catarrhalis Moraxella (Branhamella) catarrhalis; Branhamella catarrhalis; Neisserie catarrhalis; nebo Micrococcus catarrhalis
NHA	= nehemaglutinující
OG	= n-oktyl-fi-D-glukopyranosid nebo oktylglukosid
OMP 106	= polypeptid vnějšího membránového proteinu-106 z Moraxella catarrhalis mající podle SDS-PAGE molekulovou hmotnost asi 180 až 230 kDa; extrahovatelný z měchýřků nebo intaktních buněk M. catarrhalis pomocí detergentů OG nebo sarkosylu

OMPlOó-odvozený = fragment polypeptidů OMP106; varianta OMP106 divokého

polypeptid	typu nebo její fragment, mající jednu nebo více aminokyselinových delecí, insercí nebo záměn; nebo chimémí protein obsahující heterologní polypeptid fúzovaný k C-koncovému nebo N-koncovému nebo vnitřnímu segmentu celého polypeptidů OMP 106 nebo jeho části
OMP	= vnější membránový protein
PBS	= fosfátem pufrovaný fyziologický roztok
PAG	= polyakrylamidový gel
polypeptid	= peptid libovolné délky s výhodou takový, který má deset nebo více aminokyselinových zbytků
SDS	= dodecylsulfát sodný
SDS-PAGE	= elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného

Sekvence nukleotidů nebo nukleových kyselin zde uvedených jsou vyjádřeny pomocí níže uvedených jednopísmenových symbolů pro nukleotidové báze:

A	(adenin)
C	(cytosin)
G	(guanin)
T	(thymin)
U	(uráčil)
M	(A nebo C)
R	(A nebo G)
W	(A nebo T/U)
s	(C nebo G)
Y	(C nebo T/U)
K	(G nebo T/U)

-4CZ 298034 B6

V (A nebo C nebo G; ne T/U)

H (A nebo C nebo T/U; ne G)

D (A nebo G nebo T/U; ne C)

B (C nebo G nebo T/U; ne A)

N (A nebo C nebo G nebo T/U) nebo (nazvaný)

Peptidové a polypeptidové sekvence zde uvedené jsou vyjádřené pomocí jednopísmenových symbolů pro aminokyselinové zbytky:

A	(alanin)
R	(arginin)
N	(asparagin)
D	(kyselina asparagová)
C	(cystein)
Q	(glutamin)
E	(kyselina glutamová)
G	(glycin)
H	(histidin)
I	(isoleucin)
L	(leucin)
K	(lysin)
M	(methionin)
F	(fenylalanin)
P	(prolin)
S	(serin)
T	(threonin)
w	(tryptofan)
Y	(tyrosin)
v	(valin)
X	(neznámý)

Lepšímu pochopení předkládaného vynálezu může napomoci následující podrobný popis, nijak neomezující příklady konkrétních provedení vynálezu a připojené obrázky.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: Srovnání elektroforetických profilů vnějších membránových proteinů změchýřků M. catarrhalis nebo oktylglukosidových (OG) extraktů celých buněk M. catarrhalis v denaturující PAGE. Čísla nad jednotlivými dráhami odkazují na označení kmenů ve sbírce ATCC. Jako markérů molekulových hmotností byla použita směs předbarvených SDS-PAGE standardů (BioRad, katalogové # 161-0305). Standardy obsahovaly následující polypeptidy (přibližná molekulová hmotnost je uvedena v závorkách): fosforyláza B králičího svalu (106 kDa); hovězí sérum albumin (80 kDa); ovalbumin slepičího bílku (49,5 kDa); hovězí anhydráza kyseliny uhličité (32,5 kDa); sojový inhibitor trypsinu (27,5 kDa); lysozym slepičího vaječného bílku (18,5 kDa). Pozice odpovídající na gelu markérům molekulových hmotností jsou označeny šipkami na levé straně obrázku, přičemž pro některé markéry je nad šipkou uvedena molekulové hmotnost v kDa.

Obr. 2 Chromatogramy glykolipidů na tenké vrstvě po převrstvení ¹²⁵I-značenými měchýřky vnější membrány. V panelech A - C, dráha 1 obsahuje standardy glykolipidů, označené vlevo; dráha 2 obsahuje asialo-GMi; dráha 3 obsahuje Gb₃, Gb₄ a Forssmanův antigen; dráha 4 obsahuje Folchův extract lidských erytrocytů. Chromatogram ukázaný v panelu A byl obarven orcinolem, chromatogram ukázaný v panelu B byl převrstven ¹²⁵I-značenými měchýřky kmene ATCC 8176 (nehemaglutinující kmen), a chromatogram ukázaný v panelu C byl převrstven

-5CZ 298034 B6 ¹²⁵I-značenými měchýřky kmene ATCC 49143 (hemaglutinující kmen). Pouze hemaglutinující kmen se vázal ke glykolipidovému pruhu Gb₄ ve třetí a čtvrté dráze.

Obr. 3: Stříbrem obarvené elektroforetické profily proteinů oktylglukosidových extraktů vnější membrány po digesci buněk M. catarrhalis proteázami uvedenými v obrázku. Hemaglutinační aktivita buněk po digesci je uvedena pod obrázkem v řádce označené HA. Markéry molekulových hmotností jsou jako v Obr. 1.

Obr. 4: srovnání stříbrem obarvených proteinových profilů po elektroforetickém rozdělení proteinů vnější membrány různých kmenů M. catarrhalis ze sbírky ATCC. Označení kmenů je uvedeno nad jednotlivými dráhami. Hemaglutinační aktivita kmenů je uvedena v řádce označené HA pod obrázkem. Všimněte si proteinu se zdánlivou molekulovou hmotností větší než přísluší fosforyláze B králičího svalu (106 kDa), který je společný pro hemaglutinující kmeny, ale je nepřítomen v nehemaglutinujících kmenech. Tento polypeptid byl označen OMP106. Markéry molekulových hmotností jsou jako v Obr. 1.

Obr. 5: Srovnání stříbrem obarvených proteinových profilů po elektroforetickém rozdělení proteinů vnější membrány dvou kultivarů M. catarrhalis ATCC 49143: 49143 (hemaglutinující kultivar) a 49143-NHA (nehemaglutinující kultivar). Hemaglutinační aktivity kultivarů jsou uvedeny pod obrázkem v řádce označené HA. Všimněte si nepřítomnosti polypeptidu OMP106 (označeno symbolem <) u nehemaglutinujícího kultivaru. Markéry molekulových hmotností jsou jako v Obr. 1.

Obr. 6: Odhad molekulové hmotnosti OMP106 v 6% denaturujícím polyakrylamidovém gelu s použitím OG extraktu kmene ATCC 49143. Před aplikací na gel byl extrakt inkubován ve vzorkovém pufru buď při 25 °C, nebo 100 °C. Proteiny byly v gelu vizualizovány pomocí reduktivního barvení stříbrem. Pruh odpovídající polypeptidu OMP106 (označený symbolem <) je vidět pouze ve vzorku, jenž byl inkubován při 100 °C. Jako markér molekulových hmotností byl použit širokospektrý SDS-PAGE standard (BioRad, katalogové č. 161-0317). Standard obsahoval následující polypeptidy (přibližné molekulové hmotnosti jsou uvedeny v závorkách): myosin králičího kosterního svalu (200 kDa); E coli β-galaktosidáza (116 kDa); fosforyláza B králičího svalu (97,4 kDa); hovězí sérum albumin (66,2 kDa). Pozice markérů molekulových hmotností v gelu jsou vyznačeny šipkami na pravé straně obrázku, hodnota molekulové hmotnosti v kDa a je uvedena nad šipkami.

Obr. 7. Southemova analýza chromozomální DNA M. catarrhalis, štěpení restrikčními endonukleosami Dral a HindlI, s použitím sondy Mc5-72. DNA zM. catarrhalis, kmene 49143, byla štěpena enzymy Dral nebo HindlI. Southemova analýza štěpené DNA byla provedena s použitím sondy Mc5-72 (SEQ ID NO:4). Filtr byl promyt za vysoce stringentních podmínek, tj. roztokem 2x SSC, 1% SDS při 50 °C, po dobu asi 20 až 30 minut. Dráha 1 obsahuje digest enzymem HindlII; hybridizující pruh má přibližnou velikost 8,0 kB. Dráha 2 obsahuje digest enzymem Dral; hybridizující pruh má přibližnou velikosti 4,2 kB.

Obr. 8A a 8B: Srovnání westernových přenosů proteinových extraktů M. catarrhalis a příbuzných druhů s použitím králičího antiséra proti OMP106 jako sondy (Obr. 8A), a králičího séra před imunizací proteinem OMP106 (obr. 8B). Vzorky v jednotlivých dráhách na obrázku 8A a 8B jsou: dráha A, M. catarrhalis; dráha B, Moraxella ovis; dráha C, Moraxella lacunata; dráha D, Moraxella osloensis; dráha E, Moraxella bovis; dráha F, Neisseria meningitidis; dráha G, Neisseria gonorrhoeae. Markéry molekulových hmotností jsou v Obr. 1.

Obr. 9A: Westernový přenos dokládající, že králičí antisérum proti polypeptidu OMP106 zM. catarrhalis kmene ATCC 49143 křížově reagují s polypeptidem o podobně molekulové hmotnosti v řadě HA a NHA kmenů M. catarrhalis (poloha polypeptidu OMP106 je označena šipkou). Analýza westernovým přenosem byly podrobeny oktylglukosidové extrakty různých kmenů M. catarrhalis. Čísla přiřazená kmenům v ATCC sbírce jsou uvedena nad jednotlivými

-6CZ 298034 B6 dráhami. Westernový přenos a další postup byly provedeny stejně jako v analýze uvedené v obr. 8.

Obr. 9B: Westernový přenos stejných extraktů jako v obr. 9A s použitím neimunního séra, příslušejícího k séru použitému v obr. 9A.

Podrobný popis vynálezu

5.1 Hemaglutinující a nehemaglutinující kultivary

Vynález poskytuje izolovaný nebo v podstatě čistý polypeptid OMP106 zM. catarrhalis. Polypeptid OMP106 zahrnuje celý protein nebo podjednotku proteinu, který je zanořen nebo se nachází na vnějším povrchu vnější membrány hemaglutinujících (HA) kmenů a mnoha nehemaglutinující ch (NHA) kmenů a kultivarů M. catarrhalis. OMP106 přímo nebo nepřímo přispívá k hemaglutinujícímu fenotypu HA kmenů a kultivarů. Podle vynálezu HA buňky M. catarrhalis aglutinují lidské nebo králičí erytrocyty v jakémkoli standardním hemaglutinačním testu, jako je i test uvedený v Soto-Hemandez et al., 1989, J. Clin. Microbiol. 27:903-908. Současná představa, i když se nemíní omezovat na žádný konkrétní mechanismus, předpokládá, že M. catarrhalis aglutinuje erytrocyty tím, že se váže ke globotetrosovým (Gb₄) zbytkům glykolipidových a glykoproteinových receptorů na povrchu hostitelské buňky, a že hemaglutinační aktivita je částečně zprostředkována vhodně modifikovaným polypeptidem OMP106, který se specificky vyznačuje tím, že je barvitelný stříbrem. Naproti tomu, nemodifikovaný nebo nevhodně modifikovaný polypeptid ΘΜΡ106 není aktivní ve zprostředkování hemaglutinace, ani není barvitelný stříbrem. Kromě toho je polypeptid OMP106 jediný polypeptid, mající v SDS-PAGE zdánlivou molekulovou hmotnost kolem 180 až 230 kDa, který je extrahovatelný oktylukosidem nebo sarkosylem z měchýřků nebo intaktních buněk HA nebo NHA M. catarrhalis.

Hemaglutinační aktivita buněk HA M.catarrhalis je inhibována globotetrosou (GalNAcpi3Galal-4Gal31^1Glcpi; Gb₄) a monosacharidy, které jsou v Gb₄ obsaženy, včetně N-acetyl-Dgalaktosaminu, D-galaktózy a glukózy, a jejich derivátů, jako jsou metyl-a-galaktóza nebo metyl-P-galaktóza. Hemaglutinační aktivita buněk HA M. catarrhalis je rovněž inhibována relativně vyššími koncentracemi řady dalších cukrů zahrnujících, ale bez omezení, D-monnosu, Lfukosu, D-glukózu a N-acetyl-D-glukosamin.

Hemaglutinační aktivita a polypeptid OMP106 aktivních buněk HA. M. catarrhalis jsou sníženy nebo zničeny digescí intaktních buněk M. catarrhalis různými proteázami zahrnujícími, ale bez omezení, TLCK - opracovaný chymotrypsin (TLCK = Να-tosyl-L-lysyl-chlormetylketon, též známý jako l-chloro-3-tosylamino-L-2-heptanon), proteinázu K a TPCK - ošetřený trypsin (TPCK = N-tosyl-L-fenylalanyl-chlormetylketon). Digesce intaktních buněk HA M. catarrhalis proteázou V8 však hemaglutinační aktivitu ani fyzickou integritu polypeptidu OMP106 neovlivňuje.

Nehemaglutinující (NHA) kultivar může být odvozen z HA kmene nebo kultivaru M. catarrhalis postupným pasážováním ve statických tekutých kulturách (tj. v tekutých kulturách udržovaných při 35 °C bez třepání). Například, kmen nebo kultivar HA M. catarrhalis je pěstován v MuellerHintonově médiu a každých pět dnů je z povrchu statické kultury odebráno inokulum, kterým je zaočkována následující statická kultura. Výhodným inokulem je jakýkoli plovoucí shluk buněk na povrchu kultury. NHA kultivar podle vynálezu může být použit k výrobě ochranných vakcín, jako jsou celobuněčné vakcíny, proti infekcím M. catarrhalis.

Naproti tomu, hemaglutinující fenotyp HA M. catarrhalis kmene nebo kultivaru může být udržován pasážováním kmene nebo kultivaru v tekutých kulturách s třepáním. V třepaných tekutých kulturách. V takovém provedení je kmen nebo kultivar HA M. catarrhalis pěstován v MuellerHintonově médiu při 35 až 37 °C, třepání asi 200 ot/min a pasážování každých 24 až 48 hodin.

-7 CZ 298034 B6

Hemaglutinující fenotyp HA M. catarrhalis kmene nebo kultivaru může být rovněž udržován pasážováním na tuhém médiu. Například kmen nebo kultivar HA M. catarrhalis je pěstován na miskách obsahujících krevní agar nebo Mueller-Hintonů agar.

5.2 Polypeptid OMP106

Polypeptid OMP106 podle vynálezu je jediný protein vnější membrány HA kmene nebo kultivaru M. catarrhalis, který má v SDS-PAGE zdánlivou molekulovou hmotnost asi 180 kDa až 230 kDa, s výhodou asi 190 kDa. Podle vynálezu je vnější membránový protein M. catarrhalis polypeptid, který je přítomen v měchýřcích M. catarrhalis, nebo který může být z měchýřků nebo intaktních buněk M. catarrhalis extrahován při pokojové teplotě pufrovaným roztokem detergentu n-oktyl-p-D-glukopyranosidu (OG) nebo sarkosylu. Viz Murphy a Loeb, 1989, Microbiol Pathogenesis 6:159-174, kde jsou diskutovány měchýřky M. catarrhalis, což jsou přirozeně se vyskytující vezikuly sestávající z vnější membrány M. catarrhalis. NHA M. catarrhalis kmeny nebo kultivary buď nemají polypeptid OMP 106, nebo mají OMP 106 polypeptid ve formě, která váže anti-OMP106 protilátky (viz část 5.5., níže), ale nereaguje se stříbrným barvivém (tj. při použití Silver Stain Plus firmy BioRad [Richmond, CA] nebo podle postupu uvedeným v Gottlieb a Chauko, 1987, Anal. Biochem. 165:33). Naproti tomu, polypeptid OMP 106 z HA M. catarrhalis kmenů nebo kultivarů váže anti-OMP106 protilátky a reaguje se stříbrným barvivém.

Polypeptid OMP 106 může být v měchýřcích nebo intaktních buňkách HA M. catarrhalis identifikován pomocí své citlivosti na proteolytické štěpení, které současně vede ke zrušení nebo snížení hemaglutinační aktivity tohoto HA kmene (viz výše, v části 5.1. příklady proteáz, které ničí nebo neničí hemaglutinační aktivitu intaktních buněk M. catarrhalis). Jinými slovy, digesce proteázou, která zničí nebo sníží hemaglutinační aktivitu daného HA kmene nebo kultivaru, současně změní, viděno v SDS-PAGE, relativní zastoupení nebo migraci polypeptidu OMP 106 izolovaného z tohoto kmene nebo kultivaru po takovéto digesci, ve srovnání s polypeptidem izolovaným z téhož kmene nebo kultivaru před digesci.

Polypeptid OMP 106 může být rovněž identifikován v OG nebo sarkosylovém extraktu z měchýřků nebo intaktních buněk M. catarrhalis jako polypeptid, který má zdánlivou molekulovou hmotnost větší než 106 kDa při stanovení pomocí elektroforézy v denaturujícím 12% PAG v přítomnosti SDS, podle návodu popsaného v manuálu Harlow a Lané (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, NY, Appendix 1, 1988). Tepelné působení na OG nebo sarkosylový extrakt po dobu 5 minut při 100 °C může způsobit, že polypeptid OMP 106 bude mít při SDS-PAGE v 6% PAG v nepřítomnosti redukčních činidel, podle návodu popsaného v Harlow a Lané (tamtéž), zdánlivou molekulovou hmotnost kolem 180 kDa až 230 kDa. V konkrétním provedení má polypeptid OMP106 v tepelně zpracovaném OG nebo sarkosylovém extraktu M. catarrhalis, ATCC kmene 49143, zdánlivou molekulovou hmotnost kolem 190 kDa.

V konkrétních provedeních je polypeptid OMP106 připraven z kteréhokoli z kmenů M. catarrhalis zahrnujících, ale bez omezení ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628. Výhodným zdrojem polypeptidu OMP106 je HA kultivar takovýchto kmenů. Ještě výhodnějším zdrojem je HA kultivar kmene ATCC 49143.

V konkrétním provedení polypeptid OMP 106 obsahuje, s výhodou na amino-konci, aminokyselinovou sekvenci IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID NO:1) nebo sekvenci s ní podstatně homologní. Polypeptid OMP 106 může navíc obsahovat, od výše uvedené sekvence směrem ke karboxylu, oktapeptid mající aminokyselinovou sekvenci GTLVGGKK (SEQ ID NO: 2) nebo sekvenci jí podstatně homologní. Jak se zde užívá, podstatně homologní aminokyselinová sekvence je alespoň z 80%, s výhodou ze 100%, identická s uváděnou aminokyselinou sekvencí.

-8CZ 298034 B6

Polypeptidy podle vynálezu se z různých aspektů vynálezu vyznačují svými zdánlivými molekulovými hmotnostmi, jež vyplývají z pohyblivosti polypeptidů při SDS-PAGE v porovnání s pohyblivostí známých markérů molekulové hmotnosti. I když v SDS-PAGE lze použít jakýchkoli standardů molekulové hmotnosti známých v oboru, výhodné markéry molekulové hmotnosti zahrnují alespoň myosin králičího kosterního svalu, E coli β-galaktosidázu a fosforylázu B králičího svalu. Pracovníci zběhlí v oboru si jsou vědomi toho, že polypeptidy podle vynálezu mohou mít rozdílnou pohyblivost v různých typech gelových systémů (např. různé pufry; různé koncentrace gelu, síťovadla nebo SDS). Znalci v oboru jsou si rovněž vědomi toho, že polypeptidy mohou mít jiné zdánlivé molekulové hmotností, používají-li se v SDS-PAGE jiné markéry molekulové hmotnosti. Proto je charakterizace molekulové hmotnosti polypeptidů podle vynálezu míněna tak, aby postihla tytéž polypeptidy v jakémkoli systému SDS-PAGE a sjakýmikoli markéry molekulových hmotností, jež by mohly poskytovat poněkud odlišnější zdánlivé molekulové hmotnosti polypeptidů oproti těm, jaké jsou zde uváděny.

5.3. OMPlOó-odvozené polypeptidy

OMPlOó-odvozené polypeptid podle vynálezu může být fragment polypeptidu OMP106. Intaktní polypeptid OMP106 může obsahovat jeden nebo více aminokyselinových zbytků, které nejsou nezbytné pro jeho imunogenitu. Může například platit, že pro imunogenní aktivitu polypeptidu OMP106 jsou nezbytné pouze aminokyselinové zbytky tvořící jeden konkrétní epitop. Nepotřebné aminokyselinové sekvence mohou být odstraněny technikami dobře známými v oboru. Nechtěné aminokyseliny mohou být například odstraněny omezeným proteolytickým působením enzymy jako jsou trypsin, papain nebo příbuzné proteolytické enzymy, nebo chemickým štěpením činidly jako je bromkyan a následnou frakcionací produktů enzymové digesce nebo chemického štěpení.

OMPlOó-odvozený polypeptid podle vynálezu může též být modifikovaný polypeptid ΘΜΡ106 nebo jeho fragment (tj. polypeptid ΘΜΡ106 nebo jeho fragment, mající jednu nebo více aminokyselinových substitucí, insercí a/nebo delecí oproti sekvenci OMP106 divokého typu). Takovéto modifikace mohou imunogenitu výsledného polypeptidového produktu zesilovat nebo nemusí mít na tuto aktivitu žádný účinek. Modifikační techniky, které mohou být použity zahrnují i ty, jež byly zveřejněny v Patentu US 4 526 716.

OMP106-odvozený polypeptid může dále být chimémí polypeptid obsahující jeden nebo více heterologních polypeptidů fúzovaných k amino-konci nebo karboxy-konci nebo vnitřní části úplného polypeptidu OMP 106 nebo jeho části nebo jeho fragmentu. Užitečné heterologní polypeptidy obsažené v takovémto chimémím polypeptidu zahrnují, ale bez omezení, a) pre- a/nebo pro-sekvence, jež usnadňují transport, translokaci a/nebo zpracování OMP106-odvozeného polypeptidu v hostitelské buňce, b) sekvence pro afinitní purifikaci, a c) libovolné užitečné imunogenní sekvence (např. sekvence kódující jeden nebo více epitopů povrchově přístupného proteinu nějakého mikrobiálního patogenu).

Je výhodné, když OMPlOó-odvozené polypeptidy podle vynálezu mají s polypeptidem OMP106 zkříženou imunologickou reaktivitu, takže mohou vyvolat ve zvířeti imunitní odpověď proti M. catarrhalis. Ještě výhodnější je, když OMPlOó-odvozené polypeptidy podle vynálezu obsahují sekvence, které vytvářejí jeden nebo více epitopů vnějšího povrchu nativního polypeptidu OMP 106 M. catarrhalis (tj. povrchově přístupné epitopy polypeptidu OMP 106, jak se nachází v intaktních buňkách M. catarrhalis). Takovéto výhodné OMPlOó-odvozené polypeptidy mohou být identifikovány podle schopnosti specificky vázat protilátky získané proti intaktním buňkám M. catarrhalis (např. protilátky vyvolané proti buňkám M. catarrhalis fixovaným formaldehydem nebo glutaraldehydem; takové protilátky jsou zde označovány jako „anti-celobuněčné“ protilátky). Například, polypeptidy nebo peptidy pocházející z omezeného nebo úplného proteolytického štěpení polypeptidu OMP 106 jsou frakcionovány standardními postupy a zkoušeny na schopnost vázat „anti-celobuněčné“ protilátky. Reaktivní polypeptidy představují výhodné

-9CZ 298034 B6

OMPlOó-odvozené polypeptidy. Tyto jsou izolovány a jejich aminokyselinové sekvence určeny pomocí postupů známých v oboru.

Rovněž výhodné je, když OMPlOó-odvozené polypeptidy podle vynálezu obsahují sekvence, tvořící jeden nebo více epitopů nativního polypeptidů OMP106, které zprostředkovávají hemaglutinaci buňkami HA M. catarrhalis. Takovéto výhodné OMPlOó-odvozené polypeptidy mohou být identifikovány podle schopnosti bránit hemaglutinaci způsobené buňkami HA M. catarrhalis. Například, polypeptidy pocházející z omezeného nebo úplného proteolytického nebo chemického štěpení polypeptidů OMP106 jsou frakcionovány standardními postupy a zkoušeny na schopnost bránit hemaglutinaci způsobené buňkami M. catarrhalis. Po identifikaci a izolaci takovýchto výhodných OMPlOó-odvozených polypeptidů jsou určeny jejich aminokyselinové sekvence s použitím standardních sekvenačních technik. Stanovená sekvence může umožnit výrobu takovýchto polypeptidů metodami chemické syntézy a/nebo genového inženýrství.

Tyto výhodné OMPlOó-odvozené polypeptidy mohou být též identifikovány tak, že se pomocí anti-celobuněčných protilátek systematicky testují bakteriální knihovny exprimující náhodné fragmenty genomové DNA M. catarrhalis, nebo klonované nukleotidové sekvence kódující polypeptid OMP106. Viz např. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Press, NY, sv. 1, Kapitola 12. Z pozitivních klonů jsou izolovány a ty jsou sekvenovány, aby se určily aminokyselinové sekvence takovýchto výhodných OMPlOó-odvozených polypeptidů.

5.4. Izolace a purifikace polypeptidů OMP 106 a OMPlOó-odvozených polypeptidů

Vynález poskytuje izolované polypeptidy OMP106 a OMPlOó-odvozené polypeptidy. Termín „izolovaný“, jak se zde používá, znamená, že produkt je v podstatě zbaven jiných biologických materiálů, se kterými se přirozeně společně vyskytuje. To například znamená, že prostředek s izolovaným polypeptidem OMP 106 představuje asi 70 až 94% (váhově) čistý polypeptid OMP106. Je výhodné, když jsou polypeptidy OMP106 a OMPlOó-odvozené polypeptidy podle vynálezu purifikované. Termín „purifikovaný“, jak se zde používá, znamená, že produkt je v podstatě zbaven jiného biologického materiálu, snímž se přirozeně společně vyskytuje. To znamená, že prostředek s purifíkovaným polypeptidem OMP 106 je váhově alespoň 95% čistý polypeptid OMP106, s výhodou alespoň 98% čistý polypeptid OMP106 a nejvýhodněji alespoň 99% čistý polypeptid OMP106.

Polypeptid OMP 106 podle vynálezu může být izolován z proteinového extraktu, včetně extraktu z celých buněk, jakéhokoli kmene nebo kultivaru M. catarrhalis. Proteinový extrakt je s výhodou oktylglukosidový nebo sarkosylový extrakt vezikulů vnější membrány (tj. měchýřků) nebo celých buněk M. catarrhalis, zahrnujících, ale bez omezení, kterýkoli z kmenů ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628. Výhodným zdrojem takovýchto extraktů jsou HA kultivary těchto kmenů. Ještě výhodnějším zdrojem takovýchto extraktů je HA kultivar kmene ATCC 49143. Jiným zdrojem polypeptidů ΘΜΡ106 jsou proteinové produkty systémů genové exprese, které exprimují klonované sekvence, jež kódují polypeptid ΘΜΡ106 nebo OMPlOó-odvozené polypeptidy (viz část 5.8., níže).

Polypeptid OMP106 může být izolován a purifikován z výchozího materiálu s použitím kteréhokoli biochemické techniky nebo přístupu, které jsou dobře známy pracovníkům zběhlým v oboru. Podle jednoho přístupu se získá standardními technikami vnější membrána M. catarrhalis a proteiny vnější membrány jsou solubilizovány s použitím solubilizující sloučeniny, jako je detergent. Výhodný solubilizující roztok obsahuje asi 1,25% (hmotnost/objem) oktylglukopyranosid (OG). Jiný výhodný solubilizující roztok obsahuje asi 1,25% sarkosyl. Polypeptid OMP 106 se nachází v solubilizované frakci. Buněčné zbytky a nerozpustný materiál v extraktu jsou s výhodou odděleny a odstraněny eentrifugaci. Polypeptidy v extraktu jsou zahuštěny, inkubovány 5 min při 100 °C v Laemmliho vzorkovém pufru s obsahem SDS, a poté frakcinovány elektroforézou v 6% denaturujícím polyakrylamidovém gelu (PAG), v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS), bez

-10CZ 298034 B6 redukčního činidla. VizLaemmli, 1970, Nátuře 227:680-685. Polypeptid OMP106, identifikovaný v pruhu nebo frakci jak bylo popsáno výše (např. stříbrem obarvený polypeptidový pruh, který je přítomen v OG nebo sarkosylovém extraktu HA kultivaru, ale nikoli v odpovídajícím NHA kultivaru nebo HA kultivaru po štěpení proteázou, které zrušilo hemaglutínační aktivitu) může pak být izolován přímo z této, polypeptid ΘΜΡ106 obsahující, frakce nebo plátku gelu. Ve výhodném provedení má polypeptid ΘΜΡ106 zdánlivou molekulovou hmotnost 190 kDa, jak plyne ze srovnání jeho elektroforetické pohyblivosti v denaturující SDS-PAGE s pohyblivostí myosinu králičího kosterního svalu (200 kDa) a E. coli β-galaktosidázy (116 kDa).

Jiný způsob purifikace polypeptidu OMP106 spočívá vafinitní chromatografii s použitím anti-OMP106 protilátek (viz část 5.5). Výhodné je použití monoklonálních anti-OMP106 protilátek. Protilátky jsou kovalentně navázány na agarózový gel, aktivovaný bromkyanem nebo esteiy sukcinamidu (Affi-Gel, BioRad, lne.) nebo jinými metodami, známými v oboru. Proteinový extrakt je nanesen na výše popsaný gel a ponechán v kontaktu po dobu a za standardních reakčních podmínek, které postačují na vazbu polypeptidu OMP106 k protilátce. Gelová matrice je s výhodou umístěna v chromatografické koloně. Polypeptid OMP106 je poté uvolněn z protilátky, čímž se získá v izolované nebo, s výhodou, purifikované formě.

OMP106-odvozený polypeptid podle vynálezu může být získán chemickým a/nebo enzymatickým štěpením nebo degradací izolované nebo purifíkovaného polypeptidu OMP106. OMP106odvozený polypeptid může být též chemicky syntetizován, metodami v oboru dobře známými, na základě známé aminokyselinové sekvence polypeptidu ΘΜΡ106 a v případě chimémího polypeptidu též známé sekvence heterologního polypeptidu. Viz např. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecula Principles, W H. Freeman and Co., NY.

OMP106-odvozený polypeptid může být též produkován v systému genové exprese, v němž je exprimován rekombinantní nukleotidový konstrukt, obsahující sekvence kódující OMP106odvozené polypeptidy. Nukleotidové sekvence kódující polypeptidy podle vynálezu mohou být syntetizovány a/nebo klonovány a exprimovány pomocí technik dobře známých v oboru. Viz např. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, svazky 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY, kapitola 9.

OMP106-odvozené polypeptidy podle vynálezu mohou být frakcinovány a purifikovány standardními technikami užívanými při purifikaci proteinů, modifikovanými a použitými v souladu s objevy a nálezy zde popsanými. Konkrétně, výhodné OMP106-odvozené polypeptidy podle vynálezu, které tvoří epitop na vnějším povrchu nativního polypeptidu OMP106 mohou být izolovány a purifikovány pomocí afínitních postupů, uvedených výše pro izolaci a purifikaci polypeptidu ΘΜΡ106 (např. afinitní purifikace s použitím anti-OMP106 protilátek).

Je-li to žádoucí, polypeptidy podle vynálezu mohou být dále purifikovány pomocí standardních technik pro purifikaci proteinů a peptidů, které zahrnují, ale bez omezení, elektroforézu, centrifugaci, gelovou filtraci, srážení, dialýzu, chromatografii (včetně ionexové chromatografíe, afinitní chromatografíe, imunoadsorbční afinitní chromatografíe, vysokovýkonné kapalinové chromatografíe (HPLC) s reverzní fází, a gelové permeační HPLC), izoelektrickou fokusaci, a jejich variace a kombinace.

Jedna nebo více těchto technik může být použita v návaznosti po sobě, v postupu navrženém pro separaci molekul na základě jejich fyzikálních nebo chemických vlastností. Tyto vlastnosti zahrnují hydrofobicitu, náboj, vazebné schopnosti a molekulovou hmotnost proteinu. Různé frakce získané po aplikaci každé z těchto technik jsou testovány na schopnost vázat OMP106 receptor nebo ligand, schopnost vázat anti-OMP106 protilátky, nebo schopnost bránit hemaglutinaci buňkami HA M. catarrhalis („testovací“ aktivity). Frakce vykazující takovou aktivitu jsou pak podrobeny další separační technice v návazné proceduře a nové frakce jsou opět testovány. Postup je opakován, až zůstane jediná frakce, která má výše popsané „testovací“ aktivity a přitom

-11 CZ 298034 B6 poskytuje jediný pruh při elektroforéze v polyakrylamidovém gelu nebo jediný vrchol při chromatografíi.

5.5 OMP106 imunogeny a anti-OMP106 protilátky

Předkládaný vynález poskytuje protilátky, které specificky vážou polypeptid ΘΜΡ106 nebo OMPlOó-odvozené polypeptidy. K výrobě takovýchto protilátek se jako imunogen používají izolované nebo, výhodněji, purifíkované preparáty polypeptidu OMP106 nebo OMPlOó-odvozených polypeptidů.

V konkrétním provedení je polypeptid OMP106 separován od ostatních proteinů vnější membrány, přítomných v OG nebo sarkosylovém extraktu vnější membrány buněk nebo měchýřků HA M. catarrhalis, pomocí SDS-PAGE (viz část 5.2. výše) a gelový plátek obsahující polypeptid ΘΜΡ106 je použit jako imunogen a injikován do králíka, za účelem získání antiséra obsahující polyklonální anti-OMP106 protilátky. Stejný imunogen může být použit na imunizaci myší k vytvoření hybridomových linií, které produkují monoklonální anti-OMP106 protilátky.

V konkrétních provedeních je jako imunogen použit PAG plátek obsahující izolovaný nebo purifikovaný polypeptid OMP106 z kteréhokoli z kmenů ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628. Ve výhodných provedeních je použit PAG plátek obsahující izolovaný nebo purifikovaný OMP106 z HA kultivaru těchto kmenů. Ve výhodnějším provedení je jako imunogen použit PAG plátek obsahující izolovaný nebo purifikovaný OMP106 z HA kultivaru kmene ATCC 49143.

V jiných provedeních jsou jako imunogen použity peptidové fragmenty polypeptidu OMP106. S výhodou se použijí peptidové fragmenty purifíkované polypeptidu ΘΜΡ106. Peptidy mohou být získány štěpením proteázou, chemickým štěpením izolovaného nebo purifikovaného polypeptidu ΘΜΡ106 nebo chemickou syntézou a poté mohou být izolovány nebo purifikovány. Takovéto izolované nebo purifíkované peptidy mohou být přímo použity jako imunogeny.

V konkrétních provedeních užitečné peptidové fragmenty zahrnují, ale bez omezení, peptidy mající sekvenci IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID NO: 1) nebo jakoukoli její část, která je 6 nebo více aminokyselin dlouhá. V jiném provedení má peptidový fragment sekvenci GTVLGGKK (SEQ ID NO: 2).

Užitečné imunogeny mohou též obsahovat tyto peptidy nebo peptidové fragmenty konjugované s nosičovými molekulami, výhodně s nosičovým proteinem. Nosičové proteiny mohou být kterékoli z běžně užívaných v imunologii, které zahrnují, ale bez omezení, hovězí sérum albumin (BSA), kuřecí albumin, hemocyanin mořského měkkýše (KHL, kyehole limpet, tj. šášeň lodní) a podobně. Pro diskusi konjugátů hepten-protein viz např. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, nebo standardní učebnici imunologie, jako je Roitt, I. et al., IMMUNOLOGY, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1985), nebo Klein, J. IMMUNOLOGY, Blackwell Scientific Publications, lne., Cambridge, MA (1990).

V ještě jiném provedení jsou pro produkci protilátek, jež specificky vážou jeden nebo více epitopů vnějšího povrchu nativního polypeptidu OMP106, použity jako imunogen intaktní buňky HA, M. catarrhalis nebo měchýřky z nich připravené. Buňky nebo měchýřky mohou být před imunizací fixovány činidly jako jsou formaldehyd nebo glutaraldehyd. Viz Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, kapitola 15. Je výhodné, když takovéto anti-celobuněčné protilátky jsou monoklonální. Hybridomové linie produkující požadované monoklonální protilátky mohou být identifikovány pomocí purifikovaného polypeptidu OMP106 jako testovacího ligandů. Jako imunogen k indukci těchto protilátek lze použít buňky nebo měchýřky kteréhokoli z M. catarrhalis kmenů zahrnujících, ale bez omezení, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628. S výhodou se jako imunogen použijí buňky nebo měchýřky

- 12CZ 298034 B6 z HA kultivaru těchto kmenů. Ještě výhodnější imunogen na indukci těchto protilátek jsou buňky nebo měchýřky HA kultivaru kmene ATCC 49143.

Polyklonální protilátky, vzniklé imunizací celými buňkami nebo měchýřky, obsahují protilátky, které vážou další proteiny vnější membrány M. catarrhalis („ne-anti-OMP106 protilátky“), ajejich použití je tudíž méně pohodlné u vzorků, o kterých je známo nebo u kterých je podezření, že obsahují jiné proteiny vnější membrány M. catarrhalis nebo obsahují materiály, které mají s těmito jinými proteiny vnější membrány zkříženou reaktivitu. Za těchto okolností je v daném vzorku nebo elektroforetickém pruhu nutné každou vazbu anticelobuněčných protilátek potvrdit vtémže vzorku nebo pruhu současnou vazbou protilátky, jež specificky váže polypeptid ΘΜΡ106 (např. anti-OMP106) a/nebo OMPlOó-odvozený polypeptid, anebo kompetičními testy s použitím anti-OMP106 protilátek a polypeptidu OMP106 nebo OMPlOó-odvozeného polypeptidu jako kompetitoru (tzn. přídavek anti-OM106 protilátek, polypeptidu ΘΜΡ106 nebo OMPlOó-odvozeného polypeptidu kreakční směsi, sníží nebo zruší vazbu anti-celobuněčných protilátek ke vzorku). Jinou možností je takováto polyklonální antiséra, jež obsahují „ne-anti-OMP106“ protilátky, vyčistit standardními postupy a metodami. Ne-anti-OMP106 protilátky mohou být například odstraněny vysrážením buňkami NHA kultivarů M. catarrhalis nebo buňkami kmenů M. catarrhalis, o nichž je známo, že nemají polypeptid OMP106 (např. ATCC 8176, výhodněji NHA kultivar kmene ATCC 49143); nebo adsorpcí ke kolonkám, které obsahují takovéto buňky nebo které obsahují proteiny vnější membrány takovýchto buněk.

V dalších provedeních sestává užitečné imunogeny na indukci protilátek podle vynálezu ze směsi dvou nebo více shora zmíněných jednotlivých imunogenů.

Imunizace savců, s výhodou lidí, králíků, kiys, myší, ovcí, koz, krav nebo koní, imunogeny zde popsanými, se provádí postupy dobře známými v oboru, za účelem získání antisér obsahujících polyklonální protilátky, nebo za účelem získání hybridomových linií secemujících monoklonální protilátky.

Monoklonální protilátky mohou být připraveny standardními technikami, při zohlednění poznatků zde uvedených. Takové techniky jsou zveřejněny např. v Patentu US 4 271 145 a Patentu US 4 196 265. Stručně: zvíře je imunizovány imunogenem a fúzí buněk sleziny imunizovaného zvířete s myelomovými buňkami se připraví hybridomy. Mezi hybridomy se systematickým testováním vyhledají ty, které vytvářejí protilátky, jež se vážou k imunogenu. Tyto pozitivní hybridomové klony se izolují a z nich se pak získávají monoklonální protilátky.

Imunizační schémata pro tvorbu polyklonálních i monoklonálních protilátek jsou v oboru dobře známá. K injekci imunogenu může být použito celé řady cest, včetně podkožní, nitrožilní, intraperotoneální, nitrokožní, nitrosvalové, slizniční nebo jejich kombinací. Imunogen může být injikovaný ve formě rozpustné nebo agregované, připojený k fyzickému nosiči nebo smíchaný s adjuvans, přičemž použité způsoby a materiály jsou dobře známé v oboru. Antiséra a protilátky mohou být purifikovány pomocí metod sloupcové chromatografie, dobře známých pracovníkům v oboru.

Podle předkládaného vynálezu mají polypeptidy OMP106 z kmenů M. catarrhalis, HA nebo NHA, zkříženou imunoreaktivitu. Protilátky namířené proti polypeptidu OMP106 jednoho kmene nebo kultivaru M. catarrhalis tedy specificky vážou polypeptid OMP 106 a OMPlOó-odvozené polypeptidy jiných kmenů a kultivarů M. catarrhalis. Například, polyklonální anti-OMP106 protilátky indukované polypeptidem OMP106 z kmene ATCC 49143 se specificky vážou nejen khomolognímu polypeptidu OMP106 (tzn. polypeptidu OMP106 kmene ATCC 49143), ale též k polypeptidu OMP 106 a/nebo OMP 106-odvozených polypeptidů jiných kmenů M. catarrhalis zahrnujících, ale bez omezení, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240 a ATCC 25238.

-13 CZ 298034 B6

Protilátky podle vynálezu včetně, ale bez omezení, anti-OMP106 protilátek, mohou být použity k usnadnění izolace a purifikace polypeptidu OMP106 a OMPlOó-odvozených polypeptidů. Protilátky mohou být též použity jako sondy při identifikaci klonů v expresních knihovnách, jež nesou inserty kódující polypeptid OMP106 nebo jeho fragmenty. Protilátky mohou být rovněž použity v imunostanoveních (nap. ELISA, RIA, westerny) ke specifické detekci a/nebo kvantifikaci M. catarrhalis v biologických vzorcích. Anti-OMP106 protilátky podle vynálezu specificky vážou polypeptid OMP106 a vážou proteiny příbuzných bakteriálních patogenů, jako jsou Moraxella ovis, Moraxella lacunata, Moraxella osloensis, moraxella bovis, Neisserie meningitidis, Neisseria gonorrhoeae. Anti-OMP106 protilátky tedy mohou být použity pro diagnostiku infekcí M. catarrhalis.

Protilátky podle vynálezu, zejména cytotoxické protilátky, mohou být též použity pro pasivní imunizaci s cílem zabránit nebo zmírnit infekce M. catarrhalis u zvířat, včetně lidí. (Cytotoxická protilátka, jak se zde užívá, je taková protilátka, která po navázání na bakterii zvyšuje její opsonizaci a/nebo její zabití komplementem). K dosažení takovýchto účinků je nutné hostiteli podat účinnou koncentraci polyklonálních nebo monoklonálních protilátek namířených proti imunogenům podle vynálezu. Přesná koncentrace podávaných protilátek se u jednotlivých preparátů protilátek bude lišit, může však být určena pomocí standardních technik, dobře známých a běžných v oboru. Podávání protilátek lze uskutečnit řadou technik zahrnujících, ale bez omezení, techniky popsané v části 5.6. pro podávání vakcín.

Profýlaktická a terapeutická účinnost protilátek podle vynálezu může být určena na experimentální zvířatech standardními farmaceutickými postupy. Údaje získané z testů na zvířatech mohou být použity pro stanovení rozsahu dávkování pro lidi.

5.6. Vakcíny

Předkládaný vynález rovněž poskytuje terapeutické a profýlaktické vakcíny proti infekcím M. catarrhalis u zvířat, včetně savců a obzvláště hlodavců, primátů a lidí. Výhodné je použití vakcín u lidí. Vakcíny lze připravit technikami známými v oboru, přičemž budou obsahovat například antigen ve formě imunogenu, farmaceuticky přijatelný nosič, případně vhodné adjuvans a případně další látky obvykle přítomné ve vakcínách. Imunologicky účinné množství imunogenu ve vakcíně je stanoveno způsobem známým v oboru při zohlednění poznatků zde uvedených.

Vakcíny podle vynálezu obsahují imunologicky účinné množství kteréhokoli z imunogenů zveřejněných v části 5.5., ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

V jiném provedení, vakcíny podle vynálezu obsahují imunologicky účinné množství inaktováného nebo oslabeného HA kultivaru M. catarrhalis nebo NHA kultivaru M. catarrhalis podle vynálezu. Inaktivovaný nebo oslabený HA kultivar M. catarrhalis nebo NHA kultivar M. catarrhalis lze získat kteroukoli z metod známých v oboru, které zahrnují, ale bez omezení, působení chemické (např. formalinem), tepelné nebo ozáření.

Termín „imunologicky účinné množství“ se zde užívá ve smyslu množství postačující k indukci imunitní odpovědi, která zabrání infekcím M. catarrhalis, nebo zmírní vážnost již existujících nebo pozdějších infekcí M. catarrhalis. Přesná koncentrace bude záviset na konkrétním aplikovaném imunogenu, může však být určena standardními, v oboru dobře známými technikami užívanými při testování vzniku imunitní odpovědi.

Užitečné polypeptidové imunogeny zahrnují izolovaný polypeptid OMP106 a OMP106-odvozené polypeptidy. Výhodné imunogeny zahrnují puntíkovaný polypeptid OMP106 a puntíkované OMP106-odvozené polypeptidy nebo peptidy. Imunogen smíchaný s nosičem může mít podobu vodného roztoku, emulze nebo suspenze. Obecně se bude množství polypeptidového imunogenu pohybovat mezi 0,1 a 500 mikrogramy na jednu dávku. Nosiče, známé v oboru, zahr

- 14CZ 298034 B6 nují stabilizátory, ředicí roztoky a pufry. Mezi vhodné stabilizátory patří cukry jako sorbitol, laktosa, mannitol, škrob, sacharóza dextran a glukóza, a proteiny jako albumin nebo kaseinin. Vhodné ředicí roztoky zahrnují fyziologický roztok, Hanksův izotonický roztok a Ringerův roztok,. Vhodné pufry zahrnují fosforečnan alkalického kovu, uhličitan alkalického kovu nebo uhličitan kovu alkalických zemin. Vakcína může rovněž obsahovat jedno nebo více adjuvans na zlepšení nebo zvýšení imunologické odpovědi. Vhodná adjuvans zahrnují, ale bez omezení, peptidy; hydroxid hlinitý; fosforečnan hlinitý; oxid hlinitý; přípravek obsahující minerální olej jako Marcol 52, nebo rostlinný olej a jedno nebo více emulgujících činidel, nebo povrchově aktivní látky jako lysolecithin, polykationty, polyanionty; a potenciálně užitečná lidský adjuvans jako BCG a corynobacterium parvum. Vakcína může též obsahovat další imunogeny. Takováto kombinovaná vakcína je výhodná v tom, že jednou imunizací lze dosáhnout imunity proti několika patogenům. Příkladem těchto dalších imunogenů jsou například složky známých DPT (tj. záškrt, černý kašel, tetanus) vakcín.

Vakcíny podle vynálezu, jsou připravovány technikami známými v oboru, s přihlédnutím k poznatkům zde obsaženým. Obecně, imunogen je smíchán s nosičem za vzniku roztoku, suspenze nebo emulze. Jedna nebo více přísad, diskutovaných výše, může být již v nosiči nebo mohou být přidány dodatečně. Preparáty vakcín mohou být pro skladovací účely vysušeny, například lyofilizací. V takovém případě mohou být následně rekonstituovány do tekuté vakcíny přídavkem vhodného tekutého nosiče.

Vakcíny se podávají lidem nebo jiným savcům, včetně hlodavců a primátů. Mohou být aplikovány v jedné nebo více dávkách. Vakcíny mohou být podávány známými cestami. K podání vakcínových prostředků zde popsaných může být použito mnoho způsobů. Tyto způsoby zahrnují, ale bez omezení, cestu orální, intradermální, nitrosvalovou, intraperitoneální, nitrožilní, podkožní a intranazální. Výhodné způsoby jsou nitrosvalové nebo podkožní injekce.

Vakcíny podle vynálezu slouží pro navození imunitní odpovědi vůči M. catarrhalis u savce, s cílem ochránit savce před infekcí a/nebo zmírnit onemocnění způsobené M. catarrhalis. Vakcinace zahrnuje podání imunologicky účinného množství imunogenů podle vynálezu hostiteli a, s výhodou, v podání vakcín podle vynálezu hostiteli.

5.7. Nukleové kyseliny kódující polypeptid ΘΜΡ106 a OMPlOó-odvozené peptidy

Předkládaný vynález rovněž poskytuje nukleové kyseliny, DNA a RNA, kódující polypeptid OMP106 a OMPlOó-odvozené polypeptidy. V jednom aspektu mohou být nukleové kyseliny podle vynálezu syntetizovány metodami známými v oboru. Konkrétně, stanoví se část nebo úplná aminokyselinová sekvence polypeptidu OMP106 nebo OMPlOó-odvozeného polypeptidu pomocí technik dobře známých v oboru, např. Edmanovým odbouráním (viz např. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W H Freeman & Co., N Y., str. 34-49). Získaná aminokyselinová sekvence slouží jako vodítko pro syntézu DNA kódující polypeptid ΘΜΡ106 nebo OMP106-odvozený peptid, přičemž se použijí konvenční chemické přístupy nebo amplifikace překrývajících se oligonukleotidů pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR).

V jiném aspektu může aminokyselinová sekvence posloužit jako vodítko pro syntézu oligonukleotidových směsí, kterými se v genomových knihovnách M. catarrhalis systematicky vyhledávají hybridizaci sekvence kódující polypeptid OMP106. Takovéto knihovny mohou být připraveny izolací DNA z buněk kteréhokoli kmene M. catarrhalis. DNA použitá jako zdroj kódující sekvence polypeptidu OMP 106 pro genomové knihovny i pro PCR amplifikaci je s výhodou připravena z buněk kteréhokoli kmene M. catarrhalis včetně, ale bez omezení, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628.

Při přípravě genomových knihoven se DNA naštěpí na fragmenty, z nichž některé kódují části nebo celý polypeptid OMP 106 M. catarrhalis. DNA může být štěpena na specifických místech pomocí různých restrikčních enzymů. Jinak lze DNA fragmentovat použitím DNAsy v příto

- 15CZ 298034 B6 mnosti manganu anebo mechanicky rozbít, například ultrazvukem. Fragmenty DNA pak mohou být separovány podle velikosti standardními technikami, které zahrnují, ale bez omezení, elektroforézu v agaróze a polyakrylamidovém gelu, sloupcovou chromatografii a centrifugaci v sacharózovém gradientu. DNA fragmenty pak mohou být vloženy do vhodných vektorů, které zahrnují, ale bez omezení, plazmidy, kosmidy, bakteriofágy lambda nebo T4 a kvasinkové umělé chromozomy (YAC, yeast articial chromozome). (Viz například: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, LTd., Oxford, U K. Vol. I, II.) Genomová knihovna může být systematicky prohledána značenou sondou na základy hybridizace nukleových kyselin (Benton a Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein a Hogness, 1975, Proč, Nati. Acad. Sci. USA 72:3961).

Genomové knihovny mohou být systematicky analyzovány směsí značených oligonukleotidů, využívající degenerace genetického kódu, a odpovídající aminokyselinové sekvenci kteréhokoli peptidu obsaženého v polypeptidu OMP106, s použitím optimálních přístupů dobře známých v oboru. V konkrétních provedeních představuje hybridizační sondu degenerovaná oligonukleotidem odpovídající peptidu o sekvenci IGISEADGGKGGANARGDKSIA1GDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID NO: 1) nebo její části. V jiném provedení sonda může být degenerovaná oligonukleotid odpovídající peptidu o sekvenci GTVLGGKK (SEQ ID NO: 2). V dalším provedení se jako sondy použijí oligonukleotidy GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (SEQ ID NO: 3) a GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (SEQ ID NO: 7), které oba odpovídají OMP106 peptidu GTVLGGKK (SEQ ID NO: 2). V dalších provedeních se jako sondy použije sekvence GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATTAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA (SEQ ID NO: 4) nebo jakékoli její fragmenty, nebo jakýkoli komplement této sekvence nebo jejich fragmentů. Každá použitá sonda je s výhodou 15 nebo více nukleotidů dlouhá.

Klony s insertem DNA kódujícím polypeptid OMP106 nebo jeho fragmenty budou v knihovnách hybridizovat s jednou nebo více degenerovaných oligonukleotidových sond. Hybridizace takovýchto oligonukleotidových sond ke genomovým knihovnám se provádí metodami známými v oboru. Hybridizace se dvěma výše uvedenými oligonukleotidovými sondami může například probíhat v roztoku 2X SSC, 1% SDS při 50 °C a následné promytí může být za stejných podmínek. V konkrétním provedení s DNA ATCC 49143 je sekvence kódující celý nebo část polypeptidu ΘΜΡ106 obsažena v 8000 bp dlouhém HindlII restrikčním fragmentu, nebo v 4200 bp dlouhém Dral restrikčním fragmentu.

V dalším aspektu mohou být klony nukleotidových sekvencí kódujících část nebo celý polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozené polypeptidy získány systematickým testováním expresních knihoven M. catarrhalis. Například, DNA M. catarrhalis je izolována a jsou z ní připraveny náhodné fragmenty, které jsou ligovány do vektoru pro expresi (např. bakteriofág, plazmid, phagemid nebo kosmid) takovým způsobem, že vektor je schopen exprese v hostitelské buňce, do které je vnesen. Expresí vytvořený polypeptid OMP106 nebo OMP 106-odvozené polypeptidy mohou být identifikovány pomocí různých testovacích postupů. V jednom provedení mohou být k identifikaci hledaných klonů použity různé anti-OMP106 protilátky podle vynálezu (viz část 5.5) s použitím metod známých v oboru. Viz například Harlow a Lané, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cols Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Dodatek IV. Kolonie nebo plaky v knihovně se přivedou do kontaktu s protilátkami tak, aby byly identifikovány klony s vazebnou schopností.

V konkrétním provedení lze detekovat kolonie nebo plaky obsahující DNA, jež kóduje polypeptid OMP 106 nebo OMP 106-odvozené polypeptidy, pomocí DYNA Beads jak popsal Olsvick et al., 29^th ICAAC, Houston, Tex., 1989 a jak je zde uvedeno odkazem. Anti-OMP106 protilátky jsou přisíťovány k tosylovaným kuličkám DYNA Beands M280 a tyto s navázanou protilátkou jsou pak použity k absorpci na kolonie nebo plaky exprimující polypeptid OMP106 nebo

-16CZ 298034 B6

OMPlOó-odvozený polypeptid. Kolonie nebo plaky, které exprimují polypeptid ΘΜΡ106 nebo OMPlOó-odvozený polypeptid se poznají podle toho, že vážou kuličky.

Jinou možností je nespecifická imobilizace anti-OMP106 protilátek na vhodném nosiči, jako je křemelina nebo pryskyřice Celite^ítm). Tento materiál pak může být použit k absorpci na bakteriální kolonie exprimující polypeptid OMP106 nebo OMPlOó-odvozený polypeptid, jak bylo popsáno v předešlém odstavci.

V jiném aspektu může být použita PCR amplifikace na to, aby se zgenomové DNA M. catarrhalis namnožila v podstatě čistá DNA, kódující celý polypeptid OMP106 nebo jeho část. Jako primeiy lze použít oligonukleotidy, degenerované nebo ne, které odpovídají známým sekvencím polypeptidu OMP106. V konkrétních provedeních může být jako 5' primer použit oligonukleotid, degenerovaný nebo ne, který kóduje peptid IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID NO: 1) nebo kteroukoli jeho část. Například 5' primer může mít nukleotidovou sekvenci GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA (SEQ ID NO: 4) nebo kteroukoli její část. Nukleotidové sekvence, degenerované nebo ne, které jsou reversními komplementy sekvence kódující GTVLGGKK (SEQ ID NO: 2) mohou být použity jako 3' primer. Například, oligonukleotid, degenerovaný nebo ne, který má degenerovanou nukleotidovou sekvenci YTTYTTNCCNCCNAGNACNGTNCC (SEQ ID NO: 6) nebo YTTYTTNCCNCCYAANACNGTNCC (SEQ ID NO: 8) může být použit jako 3' primer v kombinaci s různými 5' primery diskutovanými výše.

PCR může být provedena například s použitím termálního cykleru firmy Perkin-Elmer Cetus a enzymu Taq polymerázy (Gene Amp^(tm)). Pro použití v PCR reakci lze syntetizovat několik různých degenerovaných primerů. Je též možné obměňovat stringentnost hydridizačních podmínek pro startování PCR reakcí, aby byl zohledněn vyšší nebo nižší stupeň podobnosti nukleotidových sekvencí degenerovaných primerů a odpovídajících sekvencí v DNA M. catarrhalis. Po úspěšné amplifikaci segmentu DNA kódujícího polypeptid OMP106 může být tento segment molekulárně klonován a sekvenován, a využit jako sonda k izolaci úplného genomového klonu. To pak umožní stanovení úplné nukleotidové sekvence genu, analýzu jeho exprese a výrobu proteinového produktu genu pro funkční analýzu, jak je popsáno níže.

Jakmile je izolována kódující sekvence polypeptidu ΘΜΡ106 z jednoho kmene nebo kultivaru M. catarrhalis, je pak možné využít stejného postupu k izolaci kódující sekvence polypeptidu OMP106 z dalších kmenů a kultivarů M. catarrhalis. Osoby znalé oboru vědí, že s použitím obecných technik známých v oboru, může být DNA nebo RNA sekvence, kódující polypeptid OMP106 (nebo jeho fragmenty) podle vynálezu, využita pro získání jiných DNA nebo RNA sekvencí, které s ní hybridizují za mírně až vysoce stringentních podmínek. Hybridizace se sekvencí OMP106 z jednoho kmene nebo kultivaru M. catarrhalis za vysoce stringentních podmínek povede k identifikaci odpovídající sekvence v jiných kmenech a kultivarech. Podmínky vysoké stringentnosti se liší podle délky sondy a podle složení nukleotidových bází. Vzorec pro stanovení takovýchto podmínek je dobře znám v oboru. Viz Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, kapitola 11. Podmínky hybridizace při vysoké stringentnosti, jak se zde používá, zahrnují u sond delších než 300 baží závěrečné promytí v 0,lX SSC/0,1% SDS při 68 °C po dobu alespoň 1 hodiny (Ausbel, et al., Eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol, I, Greene Publishing Associates, lne. A John Wiley & Sons, lne., New York, strana 2.10.3). V konkrétních provedeních hybridizace se sondou, která má sekvenci SEQ ID NO: 4 nebo sekvenci jí komplementární, znamená promytí při vysoké stringentnosti promytí v roztoku 2X SSC, 1% SDS při 50 °C po dobu 20 až 30 minut.

Pracovním znalý oboru bude schopen pomocí postupů dobře známých v oboru identifikovat klony obsahující úplnou kódující sekvenci polypeptidu OMP106. Rozsah sekvence kódující polypeptid ΘΜΡ106, obsažené v izolovaném klonu, může být zjištěn sekvenováním příslušného klonovaného insertu a srovnáním dedukované velikosti polypeptidu kódovaného otevřenými

-17CZ 298034 B6 čtecími rámci (ORFs, open reading frames) s velikostí polypeptidu OMP106 a/nebo srovnáním dedukované aminokyselinové sekvence se známou aminokyselinou sekvencí purifíkovaného polypeptidu OMP106. Pokud byl izolován parciální klon, který kóduje část sekvence polypeptidu OMP106, může být jeho insert použit jako hybridizační sonda pro izolaci úplných klonů. Jinou, možností, jak rekonstruovat úplnou kódující sekvenci polypeptidu OMP106, je pospojovat navzájem inserty překrývajících se parciálních klonů.

Úplnými klony mohou být ty, jejich otevřený čtecí rámec (ORF) s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí odpovídá polypeptidu OMP106 nebo, tam kde úplná aminokyselinová sekvence polypeptidu OMP106 není k dispozici, odpovídá polypeptidové fragmentu polypeptidu OMP106, a má molekulovou hmotnost odpovídající molekulové hmotnosti polypeptidu OMP106. Dále, úplné klony mohou být identifikovány tak, že jejich inserty mají schopnost, po vložení do expresního vektoru, produkovat polypeptid, který váže protilátky specifické pro amino-konec polypeptidu OMP106 a protilátky specifické pro karboxy-konec polypeptidu ΘΜΡ106.

Sekvence nukleových kyselin, kódující OMP-106 odvozené polypeptidy mohou být připraveny metodami dobře známými v oboru. V jednom aspektu mohou být sekvence kódující OMPlOó-odvozené polypeptidy odvozené ze sekvencí kódujících polypeptid OMP106 metodami rekombinantní DNA s přihlédnutím k poznatkům zde uvedeným. Kódující sekvence polypeptidu ΘΜΡ106 může být například pozměněna zavedením aminokyselinových substitucí, které neovlivní imunogenicitu polypeptidu OMP106 nebo které zlepší jeho imunogenicitu. Mohou být použity různé metody, zahrnující, ale bez omezení, oligonukleotidově cílenou místně specifickou mutagenézu. Tyto a další, v oboru známé techniky mohou být použity k vytvoření jednoduchých nebo vícečetných mutací, jako jsou výměny, inserce, delece a transpozice, jak je popsáno v Botstein a Shortle, 1985, Science 229:1193-1210.

Sekvence DNA kódující polypeptid ΘΜΡ106 mohou být dále zkracovány štěpením restrikčními enzymy nebo exonukleázovým štěpením. K sekvenci kódující polypeptid ΘΜΡ106 může být ligací nebo PCR amplifíkací přidána heterologní kódující sekvence. Kromě toho, může být DNA kódující celý nebo část OMP-odvozeného polypeptidu syntetizována chemicky nebo pomocí PCR amplifíkace, a to na základě známé nebo dedukované aminokyselinové sekvence polypeptidu OMP106 a jakýmkoli požadovaných změn také sekvence.

Identifikovaná a izolovaná DNA, obsahující kódující sekvenci pro polypeptid OMP106 nebo OMPlOó-odvozený polypeptid, může být vložena do vhodného klonovacího vektoru. Může být použita řada v oboru známých systémů vektor-hostitel. Možné vektory zahrnují, ale bez omezení, plazmidy nebo upravené viry, avšak vektorový systém může být kompatibilní s použitím buněčným hostitelem. Takovéto vektory zahrnují, ale bez omezení, bakteriofágy, jako jsou deriváty fága lambda, nebo plazmidy jako jsou pBR322 nebo deriváty plazmidu pÚC. Inserce do klonovacího vektoru může být provedena například ligací DNA fragmentu do klonovacího vektoru, který má komplementární kohezní konce. Pokud nejsou v klonovacím vektoru přítomná restrikční místa, kterých bylo použito k fragmentaci DNA, konce DNA molekul mohou být enzymaticky modifikovány. Jinou možností je vytvořit libovolné žádoucí místo ligací oligonukleotidových úseků (linkerů) na konce DNA; tyto ligované linkery mohou obsahovat specifické chemicky syntetizované oligonukleotidy, které kódují rozpoznávací místa restrikčních endonukleáz. Další metodou modifikace štěpené DNA může být připojení homopolymemích úseků na konce molekul DNA. Rekombinantní molekuly mohou být vneseny do hostitelských buněk pomocí transformace, transfekce, infekce, elektroporace atd.. čímž lze získat mnoho kopií dané genové sekvence.

Jinou alternativou je identifikace a izolace žádoucí DNA, jež obsahuje kódující sekvenci pro polypeptid OMP106 nebo OMPlOó-odvozený polypeptid, až po inserci DNA do vhodného klonovacího vektoru při použití tzv. „shot gun“ postupu. Při inserci do klonovacího vektoru lze obohatit směs fragmentů DNA o žádoucí sekvenci, například frakcionací podle velikosti.

-18CZ 298034 B6

V konkrétním provedeních umožňuje transformaci hostitelských buněk molekulami rekombinantní DNA, které obsahují sekvenci kódující polypeptid OMP106 nebo OMPlOó-odvozený polypeptid, vytvoření mnohonásobného počtu kopií takovéto kódující sekvence. Kódující sekvence tedy může být získána ve velkých množstvích kultivací transformantů, izolací molekul rekombinantní DNA z transformantů a, je-li to potřebné, opětovným vynětím insertu s kódující sekvencí z izolované rekombinantní DNA.

5.8. Rekombinantní výroba polypeptidů OMP106 a OMPlOó-odvozených polypeptidů

Polypeptid ΘΜΡ106 a OMPlOó-odvozený polypeptidy podle vynálezu mohou být vyrobeny technikami genového inženýrství. V takovém případě jsou produkována hodnou hostitelskou buňkou, jež byla transformována DNA, která kóduje polypeptid. Nukleotidová sekvence kódující polypeptid OMP106 nebo OMPlOó-odvozené polypeptidy podle vynálezu může být vložena do vhodného expresního vektoru, tj. do vektoru, který obsahuje nezbytné elementy pro transkripci a translaci vložené sekvence kódující polypeptid. Nukleotidové sekvence kódující polypeptid OMP106 nebo OMPlOó-odvozené polypeptidy jsou vloženy do vektorů takovým způsobem (např. ve správné orientaci a správném čtecím rámci a s vhodnými signály pro expresi, včetně vazebného místa pro RNA polymerázu a ribosomálního vazebního místa), že za vhodných podmínek jsou exprimovány.

Pro expresi sekvence kódující peptid mohou být použity různé systémy vektor-hostitel. Tyto zahrnují, ale bez omezení, savčí buňky infikované virem (např. vírem vakcínie, adenovirem, atd.); hmyzí buňky infikované virem (např. bakulovirem); mikroorganismy jako kvasinky obsahující kvasinkové vektory, nebo bakterie transformované bakteriofágovou, plazmidovou nebo kosmidovou DNA. Výhodnou hostitelskou buňkou je bakteria a nejvýhodnější bakterií je E. coli, B subtilis nebo Salmonella.

Signály pro expresi ve vektoru se liší v síle a specifitě. V závislosti na použitém systému hostitel-vektor může být použit kterýkoliv z řady vhodných transkripčních a translačních element.

V konkrétním provedení je exprimován chimémí protein obsahující sekvenci polypeptidů OMP106 nebo OMPlOó-odvozeného polypeptidů a dále pre- a/nebo pro-sekvenci hostitelské buňky. V jiných konkrétních provedeních je exprimován chimémí protein obsahující sekvenci polypeptidů OMP106 nebo OMPlOó-odvozeného polypeptidů a sekvenci peptidu pro afinitní purifikaci. V dalších konkrétních provedeních je exprimován chimémí protein obsahující sekvenci polypeptidů OMP106 nebo OMPlOó-odvozeného polypeptidů a sekvenci užitečného imunogenního peptidu nebo polypeptidů. Ve výhodných provedeních obsahuje exprimovaný OMPlOó-odvozený polypeptid sekvenci, která vytváří v nativním polypeptidů OMP106 buď epitop vnějšího povrchu, nebo vazebnou doménu pro receptor.

Ke konstrukci vektorů exprese, jež obsahují chimémí gen sestávající z vhodných transkripčně/translačních regulačních signálů a kódujících sekvence polypeptidů, může být použita jakákoli, v oboru známá metoda pro inserci fragmentů DNA do vektoru. Tyto metody mohou zahrnovat in vitro techniky rekombinantní DNA a syntetické techniky a metody in vivo rekombinace (genetická rekombinace). Exprese nukleotidové sekvence kódující polypeptid ΘΜΡ106 nebo OMPlOó-odvozený polypeptid může být regulována druhou nukleotidovou sekvencí tak, že vložená sekvence je exprimovaná v hostiteli, transformovaném molekulovou rekombinantní DNA. Exprese vložené sekvence může být například regulována jakýmkoli promotor/enhanderovým elementem známým v oboru. Promotory, které mohou být použity k řízení exprese vložených sekvencí zahrnují, ale bez omezení, SV40 časný promotor (Bemoist aChambon, 1981, Nátuře 290:304-310), promotor obsažený v 3' dlouhé koncové repetici z Rousova sarkomového viru (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), promotor thymidinkinázy herpesviru (Wagner et al., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445). regulační sekvence metallothioneinového genu (Brinster et al., 1982, Nátuře 296:39^42) pro expresi ve zvířecích buňkách; promotory βlaktomasy (Villa-Komaroff et all., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), tac (DeBoer et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci, U.S.A. 80:21-25), XP_L, nebo trc pro expresi

-19CZ 298034 B6 v bakteriálních buňkách (viz též „Useful proteins from recombinant bacteria“ v Scientific Američan, 1980, 242:74-94); promotorová oblast nopalinsynthetasy nebo promotor 35S RNA viru květákové mosaiky (Gardner et al., 1981, Nucl, Acids, Res. 9:2871),a promotoro fotosyntetického enzymu ribolosabisfosfátkarboxylasy (Herrera-Estrella et al., 1984, Nátuře 310:115-120) pro expresi v rostlinných buňkách; promotorové elementy z kvasinek nebo jiných hub, jako jsou Gal4 promotor, ADH (alkoholdehydrogenáza) promotor, PGK (fosfoglycerátkináza) promotor, promotor alkalické fosfatázy.

Vektory exprese, které obsahují kódující sekvence pro polypeptid OMP 106 nebo OMP 106odvozený polypeptid, mohou být identifikovány pomocí tří obecných přístupů: (a) hybridizací nukleových kyselin, (b) přítomností nebo nepřítomností funkce „markerového“ genu, a (c) expresí sekvencí vložených do vektoru. V prvním přistupuje přítomnost cizího genu vloženého do expresního vektoru detekována hybridizací nukleových kyselin s použitím sond, které obsahují sekvence homologní s vloženou sekvencí, jež kóduje polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozený polypeptid. V druhém přístupu může být rekombinantní systém vektor/hostitel identifikován a selektován na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti určitých „markerových“ genových funkcí (např. thymidinkinázová aktivita, resistence vůči antibiotikům, transformační fenotyp, tvorba okluzních tělísek v bakulovirovém systému, atd.), což je způsobeno insercí cizích genů do vektoru. Když je například ve vektoru vložena sekvence kódující polypeptid OMP 106 nebo OMP106-odvozený polypeptid do sekvence markerového genu, mohou být rekombinanty obsahující tento insert identifikovány podle ztráty funkce markerového genu. Ve třetím přístupu mohou být rekombinantní expresní vektory identifikovány pomocí stanovení produktu cizího genu exprimovaného v rekombinantu. Takováto stanovení mohou být založena například na fyzikálních nebo funkčních vlastnostech polypeptidů OMP 106 nebo OMP 106odvozeného polypeptidů v in vitro testech, např. ve vazbě k ligandu nebo receptorů OMP 106, ve vazbě anti-OMP106 protilátek podle vynálezu, nebo ve schopnosti hostitelské buňky hemaglutinovat nebo ve schopnosti buněčného extraktu blokovat hemaglutinaci způsobenou M. catarrhalis.

Jakmile je konkrétní rekombinantní DNA identifikována a izolována, lze ji namnožit několika metodami známými v oboru. Poté, co se určí vhodný hostitelský systém a růstové podmínky, je možné rekombinantní expresní vektory dále množit a připravovat naveliko. Jak bylo výše vysvětleno, použitelné expresní vektory zahrnují, ale bez omezení následující vektory nebo jejich deriváty: lidské nebo zvířecí viry jako jsou vakcínie nebo adenovirus; hmyzí viry jako bakulovirus; kvasinkové vektory; bakteriofágové vektory (např. lambda) a plazmidové akosmidové vektory, abychom jmenovali alespoň některé.

Kromě toho, může být zvolen takový kmen hostitelských buněk, který umožňuje regulovat expresi vložených sekvencí, nebo modifikovat a zpracovávat genový produkt specifickým žádoucím způsobem. Exprese řízená určitými promotory může být zvýšena v přítomnosti určitých induktorů; exprese rekombinantního polypeptidů OM106 nebo OMP106-odvozeného polypeptidu může tedy být regulovaná. Navíc, různé hostitelské buňky mají charakteristické a specifické mechanismy pro translační a post-translační zpracování a modifikaci proteinů. Vhodné buněčné linie nebo hostitelské systémy mohou být zvoleny tak, aby zajistily požadovanou modifikaci a zpracování exprimovaného cizího proteinu.

5.9. Činidla

Polypeptidy, peptidy, protilátky a nukleové kyseliny podle vynálezu jsou užitečná činidla pro klinickou nebo lékařskou diagnostiku infekcí způsobených M. catarrhalis a pro vědecký výzkum mechanismů patogenity, virulence a infektivity M. catarrhalis, jakož i výzkum obranných mechanismů hostitele. DNA a RNA podle vynálezu může být například použito jako sond k identifikaci přítomnosti M. catarrhalis v biologických vzorcích pomocí hybridizace nebo PCR amplifikace. DNA a RNA může být též použita k identifikaci jiných bakterií, které by mohly kódovat polypeptid příbuzné OMP 106 z M. catarrhalis.

-20CZ 298034 B6

Polypeptidy a peptidy podle vynálezu mohou být použity pro přípravu polyklonálních a monoklonálních protilátek, které lze použít v afinitní chromatografii pro další purifikaci směsí obsahujících polypeptidy podle vynálezu. Polypeptidy a peptidy mohou být také použity ve standardních imunostanoveních při systematickém prohledávání vzorků na přítomnost protilátek proti M. catarrhalis.

Mělo by být jasné, že poznatky plynoucí z předkládaného vynálezu budou aplikovány na konkrétní problém nebo prostředí v rámci schopností pracovníků s obvyklými dovednostmi v oboru, s přihlédnutím k poznatkům zde obsaženým. Příklady produktů podle vynálezu a způsobů jejich výroby a použití podává následující příklad:

Příklady provedení vynálezu

Příklad: Izolace a charakterizace polypeptidů ΘΜΡ106 a genu, který jej kóduje, z kmene ATCC 49143 nebo jiných kmenů

6.1. Materiály a metody

6.1.1. Hemaglutinační test

Hemaglutinace bakteriemi M. catarrhalis byla stanovována postupem, který popsal Soto-Hemander et al. (J. Clin. Microbiol. 27:903-908) stím, že ve sklíčkovém aglutinačním testu byly použity 5% (objem/objem) erytrocyty namísto 3%. Počáteční hemaglutinační testy byly prováděny s 20 pg bakteriálních buněk (vlhká váha). Jelikož kmen M. catarrhalis ATCC 49143, narostl na miskách krevního agaru při 35 °C, poskytoval silnou hemaglutinační reakci, byl vybrán jako referenční kmen. Sériové řádění buněk kmene ATCC 49143 geometrickou řadou s koeficientem 1:2 vedlo ke snižování hemaglutinačních reakcí. Skórovací indexy od ++++ do + byly přiděleny na základě hemaglutinace pozorované u kmene ATCC 49143 po ředění geometrickou řadou s koeficientem 1:2 tak, že + reakce byla dosažena při použití 1/4 počtu buněk nutných k docílení +++ reakce.

6.1.2. Inhibice hemaglutinace

Buněčná suspenze M. catarrhalis ATCC 49143 byla postupně ředěna v poměru 1:2 a ředění, které poskytlo + hemaglutinační reakci, při použití 7 μΐ Dulbeccova fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku a 7 μΐ 5% (objem/objem) roztoku lidských O⁺ erytrocytů, bylo použito k stanovení inhibice hemaglutinace jednoduchými cukry nebo derivátů cukrů. Aby se zjistilo, zda jednoduché cukry nebo cukerné deriváty mohou inhibovat hemaglutinaci buňkami M. catarrhalis, bylo smícháno 7 μΐ daného cukru v koncentraci 500 mM se 7 μΐ M. catarrhalis a inkubováno 5 minut, aby cukr interagoval s buňkami. Poté bylo přidáno 7 μ 5% (objem/objem) roztoku lidských O⁺ erytrocytů a po 1 minutě byla stanovena hemaglutinace. Schopnost inhibovat hemaglutinaci byla vyzkoušena pro každý cukr a cukerný derivát. Zásobní roztok každého cukru a cukerného derivátu byl postupně ředěn v poměru 1:2 a pro jednotlivá ředění byla stanovena shora popsaná postupem schopnost inhibovat hemaglutinaci. Tímto způsobem byla určena minimální koncentrace cukru nutná pro inhibici hemaglutinace.

6.1.3. Vazba ligandu a receptoru

Vazba M. catarrhalis ke glykolipidovým receptorem zvířecích buněk byla zkoumána pomocí chromatografické frakcionace glykolipidů hostitelských buněk na tenké vrstvě (TLC) a následným převrstvením chromatogramu značenými buňkami podle postupu, který popsal Magnani et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:14365-14369. Ve stručnosti, glykolipidy získané od firmy Matreya

-21 CZ 298034 B6 lne. (Pleasant Gap, PA) byly rozděleny na deskách pro vysoce účinnou chromatografií na tenké vrstvě (HPTLC) v soustavě chloroform - metanol - voda (5:4:1). Desky byly buď obarveny orcinolem při 100 °C, nebo byly převrstveny ¹²⁵I-značenými měchýřky M. catarrhalis (2 x 10⁶cpm/ml, 2 hodiny), jejichž přípravu popisuje Murphy a Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159174. Desky pak byly 5x promyty, vysušeny a byl jimi exponován rentgenový film.

6.1.4. OG extrakce proteinů OMP

Kmeny M. catarrhalis byly pěstovány v 4-litrových baňkách v jednom litru Mueller-Hintonova média při 35 °C a třepání 200rpm. Vnější membránové proteiny (OMP) byly izolovány z 50 mg buněk (vlhká váha) působením 0,67 ml 1,25% n oktyl-p-D-glukopyranosidu (tj. oktylgukosidu; OG) v PBS (fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku) při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Buňky byly stáčeny 5 minut v mikrocentrifuze a supemantant byl používá jako oktylglukosidový extrakt. Porovnání proteinových profilů těchto extraktů připravených z řady kmenů M. catarrhalis s proteinovými profily měchýřků (tj. vezikulů vnější membrány) získaných diferenční centrifugací, které jsou vysoce obohacené o vnější membránové proteiny (OMP) M. catarrhalis (Murphy a Leob, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174) ukazuje, že oktylglukosidový extrakt obsahuje převážně vnější membránové proteiny M. catarrhalis (Obr. 1). Z toho vyplývá, že extrakce oktylglukosidem představuje rychlejší postup s vyšším výtěžkem vnějších membránových proteinů ve srovnání s přípravou z měchýřků.

6.1.5. Proteolytické štěpení OMP 106 mg buněk kmene ATCC 49143 a 1 ml Dulbeccova fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku bylo při pokojové teplotě 1 hodinu štěpeno následujícími proteázami: TLCK-opracovaným chymotrypsinem (5 mg), proteinázou K (5 mg), TPCK-opracovaným tryprinem nebo proteázou V8 (100 jednotek). Všechny proteázy byly získány od firmy Sigma Chemicals (St. Louis, MO). Ihned po skončení inkubace s proteázou byly buňky jednou promyty v PBS, resuspendovány v 1 ml PBS a byla změřena jejich hemaglutinační aktivita. Proteázou opracované bakteriální buňky byly dále extrahovány oktylgulkosidem, takže po rozdělení vnějších membránových proteinů bylo možné identifikovat specifické proteiny, štěpené proteázami.

6.1.6. Nehemaglutinující kultivary

Hemaglutinující kultury M. catarrhalis jsou normálně pěstovány na třepačce v buňkách, obsahujících Mueller-Hintonovo médium, při 35 až 37 °C, třepání 200 rpm, po dobu 24 až 48 hodin. Buňky odebrané přímo z misky krevního agaru nebo z agarové misky s Mueller-Hintonovým médiem rovněž vykazují hemaglutinující fenotyp. Aby se vyselektoval nehemaglutinující (NHA) kultivar, kmen ATCC 49143 byl postupně pasážován každých 5 dnů ve statické kultuře narostlé v Mueller-Hintonově médiu při 35 °C. Při každé pasáži bylo inokulum odebráno pouze z povrchu kultury. Do druhé pasáže se již vytvořil plovoucí povlak buněk a ten byl použit jako inokulum pro další kultury. Takováto postupná kultivace dala vzniknout NHA kultivarům kmene ATCC 49143 typicky po třech pasážích.

6.1.7. Izolace polypeptidu ΘΜΡ106

Polypeptid OMP 106 z extraktu vnější membrány M. catarrhalis ATCC 49143 je detekován (např. barvením stříbrem nebo anti-OMP106 protilátkami) při elektroforéze v denaturujícím gelu pouze v případě, že extrakt byl inkubován 5 minut při 100 °C. Aby se určilo, zda přítomnost pruhu OMP 106 po inkubaci při 100 °C je způsobena agregací proteinů nižší molekulové hmotnosti během varu, nebo zda povaření vzorku umožňuje normálně agregovanému proteinu vstup do gelu, byla provedena analýza nepovařeného oktylgukosidového extraktu vnější membrány buněk ATCC 49143 v nativním polyakrylamidovém gelu. Jednotlivé části gelu, včetně oblasti přímo pod jamkou pro nanesení vzorku, byly vyříznuty a povařeny. Výsledné vzorky pak byly rozděleny na denaturujícím polyakrylamidovém gelu a obarveny stříbrem (Silve Stain Plus,

-22CZ 298034 B6 katalog, č. 161-0449, BioRad Laboratories, Richmond, CA). Pro N-koncové sekvenování byl oktylglukosidový extrakt vnější membrány buněk ATCC 49143 smíchán s PAGE vzorkovým pufrem obsahujícím SDS a inkubován 5 minut na vroucí vodní lázni. Proteiny pak byly rozděleny na 12% PAG s SDS a přeneseny elektroforegicky na PVDF membránu. Oblast membrány obsahující pruh proteinu OMP 106 byla vystřižena a použita pro aminokoncovou sekvenaci. V žádné z elektroforetických procedur pro izolaci polypeptidu OMP 16 nebyla ve vzorkových nebo gelových pufrem použita redukční činidla.

6.1.8. Anti-OMP106 antisérum

Pro přípravu antiséra proti OMP 106 byly proteiny z HA kultivaru ATCC 49143 rozděleny v denaturujícím SDS polyakrylamidovém gelu postupem dříve popsaným (Laemmli, 1970, Nátuře, 227:680—685), a pruh obsahující OMP106 byl vyříznut z gelu. Vyříznutý plátek gelu byl macerován a injikován do králíka, aby se vytvořilo antisérum proti polypeptidu OMP106. Antisérum bylo použito k inhibici hemaglutinace tak, aby bylo popsáno výše v části 6.1.2. stím, že namísto cukru bylo použito antisérum. Antisérum bylo rovněž vyzkoušeno na komplementemzprostředkovanou cytotoxickou aktivitu proti buňkám M. catarrhalis, jak je popsáno v části 7.

6.1.9. Westernové přenosy s anti-OMP106 antisérem

Buňky M. catarrhalis ATCC 49143, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240, ATCC 25238 a ATCC 8176; M. ovis ATCC 33078; M. lacunata ATCC 17967; M. bovis ATCC 10900; M. osloensis ATCC 10973; Neisseria gonorrhoeae (klinický izolát); a N. meningitidis ATCC 13077 byly pěstovány na miskách čokoládového agaru po 48 hodin při 35 °C v 5% CO₂. Pomocí polystyrénové inokulační klíčky byly z povrchu agaru seškrábnuty kolonie a buňky byly poté solubilizovány tak, že 30 pg buněk bylo suspendováno v 150 μΐ vzorkového PAGE pufru (360 mM Tris pufr [pH 8,8] obsahující 4% SDS a 20% glycerol) a suspenze byla inkubována 5 minut při 100 °C. Solubilizované buňky byly rozděleny na 12% polyakrylamidových gelech podle Leammliho a takto separované proteiny byly elektroforeticky (1,5 h při 100 V) přeneseny na PVDF membrány, jak bylo již dříve popsáno (Thebaíne et al. 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:4350^1354) stou výjimkou, že do pufru, v němž probíhal přenos, byl přidán 0,05% SDS k usnadnění pohybu proteinů z gelu. PDVF membrány byly pak vysyceny v 25 ml Dulbeccova fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku obsahujícího 0,5% kasein sodný, 0,5% hovězí sérum albumin a 1% kozí sérum. Všechny následující inkubace byly prováděny s použitím tohoto sytícího pufru.

PVDF membrány byly inkubovány 1 hodinu při pokojové teplotě s 25 ml 1:500 ředěného neimunního králičího séra nebo séra z králíka imunizovaného polypeptidem OMP106 (jak bylo popsáno výše). PVDF membrány pak byly dvakrát omyty promývacím pufrem (20 mM Tris pufr [pH 7,5] obsahující 150 mM chlorid sodný a 0,05% Tween-20). PVDF membrány byly dále inkubovány 30 minut při pokojové teplotě s 25 ml kozích protilátek (ředění 1:5000) proti králičímu IgG, značených peroxidasou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Penn., Katalog, č. 111-035-003). Membrány byly 4-krát omyty promývacím pufrem a pak vyvolány 3,3'diaminobenzidintetrachloridem (4 minuty) a peroxidem močoviny (4 minuty), tak, jak byla činidla dodána firmou Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, katalog, č. D-4418).

6.1.10. Anti-OMP106 imunofluorescenční barvení buněčného povrchu

Buňky M. catarrhalis ATCC 49143 byly pěstovány přes noc na třepačce při 35 °C v MuellerHintonově médiu. Buňky byly stočeny na centrifuze a pak resuspendovány ve stejném objemu fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (Dulbeccova modifikace bez vápníku nebo hořčíku, PBS/MC). Na každé z 5 čistých mikroskopických sklíček bylo napipetováno 20 μΐ buněčné suspenze, ponecháno 10 sekund ustát, poté byla pomocí mikropipety odstraněna přebytečná tekutina a sklíčka byla ponechána schnout na vzduchu 1 hodinu. Sklíčka pak byla tepelně fixována nad odkrytým plamenem, dokud nebyla teplá na dotek. Sklíčka byla nejprve inkubována 10

-23 CZ 298034 B6 minut s 40 μΐ anti-OMP106 antiséra nebo neimunního séra ze stejného zvířete, v obou případech ředěného 1:40 v PBS/MC, nebo pouze s PBS/CM, a poté 5-krát pláchnuta v PBS/CM. Pak byla sklíčka inkubována s 40 μΐ kozích protilátek proti králičímu IgG (5pg/ml v PBS/MC), značených fluoresceinisothiokyanátem (Kirkegaard and Perry Laboratories, lne., Gaithersburg, MD, katalog č. 02-15-06). Sklíčka byla inkubována 10 minut ve tmě a pak opláchnuta 5-krát v PBS/MC. Každé sklíčko bylo uchováváno pokryté PBS/MC pod krycím sklíčkem a bylo přihlíženo ve fluorescenčním mikroskopu s 489 nm filtrem. U každého vzorku byl v pěti volných polích vyhodnocen rozsah vybarvení.

6.2. Výsledky

6.2.1. Hemaglutinační aktivita

Aglutinační aktivita M. catarrhalis vzhledem k erytrocytům je druhově specifická, přičemž nejsilnější aktivita je pozorovaná u lidských erytrocytů. Králičí erytrocyty jsou M. catarrhalis rovněž aglutinovány, ale méně dramaticky než lidské buňky. Erytrocyty z myši, koně nebo ovce nebyly aglutinován (viz Tabulka 1).

Tabulka 1: Hemaglutinace erytrocytů z různých druhů při použití M.
catarrhalis	ATCC 49143
Zdroi ervtrocvtů	Skóre hemaalutinace³
lidské	++++
králičí	++
myší	-
koňské	-
ovčí	-

^a ++++ = nejsilnější aglutinace, - značí nulovou aglutinaci

6.2.2. Receptory a ligandy OMP106

Hemaglutinační aktivita M. catarrhalis je způsobená vazbou ke globotetrose (Gb₄). Měchýřky z hemaglutinujících kmenů se vážou ke glykolipidu, který obsahuje Gb₄, zatímco nehemaglutinující kmeny se ke stejnému glykolipidu nevážou (viz Obr. 2). Hemaglutinační aktivita M. catarrhalis je inhibována monosacharidovými složkami Gb₄ nebo deriváty takovýchto monosacharidů, přičemž nejúčinnějšími inhibitory jsou N-acetylgalaktosamin a galaktóza (zejména alfa anomer galaktózy) (viz Tabulka 2).

-24CZ 298034 B6

Tabulka 2: Minimální koncentrace cukrů potřebná pro inhibicí hemaglutinace (MIC) vyvolané M. catarrhalis

Cukr	MIC (n
D-glukosa	> 167
D-mannosa	83
D-galaktosa	41
L-fukosa	83
N-acetyl-D-glukosamin	> 167
N-acetyl-D-galaktosamin	41
metyl-a-glukosa	> 167
metyl-a-mannosa	167
metyl-a-galaktosa	10
metyl-p-galaktosa	83

* Minimální koncentrace cukru potřebná k inhibicí hemaglutinační reakce o skóre 1+, vyvolané M. catarrhalis ATCC 49143 u 5% promytvch lidských 0+ ervtrocvtů.

N-acetyl-galaktosamin i alfa-galaktóza jsou součástí Gb₄ tetrasacharidu. Korelace mezi hemaglutinací a vazbou kGb₄ spolu se zjištěním, že hemaglutinace je inhibována monosacharidy, které jsou součástí Gb₄ receptorů, naznačuje, že buňky M. catarrhalis se vážou na tetrasacharid Gb₄. Tento tetrasacharid je přitom na lidských arytrocytech a tkáních a mohl by zprostředkovávat připojení buněk M. catarrhalis k eukaryotickým membránám.

6.2.3. Identifikace polypeptidu OMP 106

Analýza hemaglutinace buňkami M. catarrhalis, jež byly podrobeny proteolytickému štěpení prokázala, že proteolytické působení chymotrypsinu a proteinázy K ničí hemaglutinační aktivitu a že působení trypsinu částečně ničí hemaglutinační aktivitu, což naznačuje, že hemaglutinační aktivita je zprostředkována proteiny. Elektroforetická analýza proteinů OMP z proteázově štěpených buněk M. catarrhalis ukázala degradaci mnohých proteinů v každém vzorku, takže nebylo možné usoudit, který protein je přímo nebo nepřímo zodpovědný za hemaglutinační aktivitu (viz Obr. 3).

Jelikož pokus s proteolytickým štěpením naznačil, že za hemalutinační aktivitu je přímo nebo nepřímo zodpovědný polypeptid, porovnali jsme v SDS-PAGE profily OMP proteinů z hemaglutinujících a nehemaglutinujících kmenů (Obr. 4). Z rozdílů mezi těmito profily je vidět, že hemaglutinující kmeny byly dva charakteristické polypeptidy, jeden se zdánlivou molekulovou hmotností 27 kDa (označený OMP27) a druhý polypeptid, který jako jediný měl zdánlivou molekulovou hmotnost větší než 106 kDa (označený OMP 106). Nápadná je nepřítomnost prahu tohoto OMP 106 polypeptidu v preparátech OMP proteinů získaných z buněk, které po štěpení různými proteázami měly sníženou nebo eliminovanou hemaglutinační aktivitu, zatímco pruh OMP27 byl přítomen v preparátu OMP z buněk opracovaných proteinázou K, které neměly žádnou hemaglutinační aktivitu. Navíc, pruh polypeptidu OMP 106 nebyly degradovaný u buněk štěpených proteinázou V8, které nemělo žádný účinek na hemaglutinační aktivitu těchto buněk.

-25CZ 298034 B6

6.2.4. OMP profil NHA kultivarů

Sériovou kultivaci HA kultivaru ATCC 49143 ve statické kultuře při 35 °C vznikl NHA kultivar (označený 49143-NHA) v třetí pasáži kultury. Tato ztráta hemaglutinační aktivity byla reprodukovatelná. Analýza elektroforetických profilů proteinů OMP v oktylgukosidových extraktech vnější membrány z HA a NHA kultivarů ukázala, že v extraktu 49143-NHA chybí proužek polypeptidů OMP106 (Obr. 5). Toto naznačuje, že polypeptid OMP106 je hemagluininem M. catarrhalis (tj., polypeptid OMP 106 váže Gb₄ receptor neboje podjednotkou homopolymemího proteinu, který váže Gb₄ receptor) anebo tvoří část hemaglutininu M. catarrhalis, (tj. polypeptid OMP 106 je podjednotkou heteropolymemích proteinu, který váže GB₄ receptor).

6.2.5. OMP106 a hemaglutinace

Polyklonální antisérum namířené proti polypeptidů OMP 106 z kmene ATCC 49143, neutralizovalo hemaglutinaci způsobenou kmenem ATCC 49143, jakož i heterologním kmenem ATCC 43627. Tento výsledek dále podporuje závěr, že hemaglutinující aktivita M. catarrhalis obsahuje polypeptid OMP106 a že polypeptid OMP106 je jako antigen konzervován mezi kmeny. To je vidět i na Obr. 9A, který ukazuje, že protilátky v polyklonálním antiséru vážou polypeptid OMP 106 z heterologních kmenů M. catarrhalis.

6.2.6. Umístění OMP106 na vnějším povrchu

Králičí anti-OMP106 antisérum bylo použito v nepřímém imunofluorescenčním barvení, aby se zjistilo, zdaje OMP106 přístupný na vnějším povrchu buněk M. catarrhalis. Buňky M. catarrhalis se anti-OMP106 antisérem barvily intenzivněji a rovnoměrněji než buňky, které byly inkubovány sneimunním sérem nebo s PBS/MC. Z toho vyplývá, že intaktní polypeptid OMP 106 na buňkách M. catarrhalis reaguje santi-OMP106 protilátkami. Tento výsledek naznačuje, že polypeptid OMP106 je přístupný na vnějším povrchu buněk M. catarrhalis. Toto zjištění je v souladu s představou, že polypeptid OMP 106 se účastní hemaglutinace a naznačuje navíc, že polypeptid OMP106 by mohl být užitečný jako vakcína.

6.2.7. Vlastnosti polypeptidů OMP 106

Polypeptid OMP 106 existuje v nativním vrstvu jako velký proteinový komplex a při extrakci oktylglukosidem tvoří agregáty. Tento závěr má podporu ve zjištění, že extrakce buněk M. catarrhalis oktylglukosidem solubilizuje polypeptid OMP 106, ale extrahovaný polypeptid OMP 106 nevznikne do denaturujícího polyakrylamidového gelu, pokud není extrakt nejprve inkubován při 100 °C (Obr. 6). Nezdá se ale, že by proužek polypeptidů OMP 106 vznikl z polypeptidů o nižší molekulové hmotnosti agregací nebo polymerízací při zahřívání, neboť polypeptid OMP106 vnikli tepelně denaturovaném vzorku je zachycen v jamce pro nanášení vzorku a vstupuje do dělicího gelu jen tehdy, byl-li vzorek nejprve inkubován při 100 °C. Této biochemické vlastnosti lze velmi výhodně použít při identifikaci polypeptidů OMP 106 v různých gelech.

Po inkubaci oktylgukosidových extraktů M. catarrhalis s SDS při 100 °C a rozdělení proteinů elektroforézou v denaturujícím polyakrylamidovém gelu, jsme stanovili zdánlivou molekulovou hmotnost polypeptidů OMP106 pro různé kmeny M. catarrhalis, konkrétně ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628, v rozmezí asi od 180 kDa do 230 kDa (obr. 9A). zatímco polypeptid ΘΜΡ106 z kmene ATCC 49143 má zdánlivou molekulovou hmotnost okolo 190 kDa (obr. 6).

Polypeptid OMP 106 z kmene ATCC 49143 byl extrahován z gelu a podroben N-koncové sekvenaci. Zjištěná sekvence N-konce polypeptidů OMP106 z vnější membrány M. catarrhalis ATCC 49143 je IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID NO: 1).

-26CZ 298034 B6

Dále byl po štěpení OMP 106 endoproteinázou Lys-C (Femandez et al., 1994, Anal. Bochem. 218: 121-117) izolován vnitřní peptid a jeho sekvence určena jako GTVLGGKK (SEQ ID NO: 2).

Připravili jsme tři oligonukleotidové sondy. Dvě sondy odpovídající vnitřnímu peptidu GTVLGGKK, z nichž jedna má sekvenci GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (SEQ ID NO: 3) a druhá sekvenci GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (SEQ ID NO: 7). Další sonda, Mc, 5-72, kódující vnitřní fragment (SEQ ID NO: 5) amino-koncové sekvence polypeptidu OMP106 (SEQ ID NO: 1) má sekvenci GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA (SEQ ID NO: 4). Při Southemově hybridizaci k úplnému Hindlll nebo Dral digestu DNA M. catarrhalis poskytla sonda Mc 5-72 u obou digestů jediný pruh (Obr. 7). Hybridizující pruh v Hindlll digestu má přibližnou velikost 8,0 kb; hybridizující pru v Drul digestu má přibližnou velikost 4,2 kb (Obr. 7).

6.2.8. Konzervace polypeptidu OMP106

Analýza extraktů vnějších membránových proteinů řady kmenů M. catarrhalis a příbuzných bakteriálních druhů westernovým přenosem ukázala, že anti-OMP106 protilátky se vážou u mnoha kmenů M. catarrhalis k polypeptidu o velikosti okolo 180 kDa až 230 kDa, a to jak uHA, tak NHA kmenů nebo kultivarů (obr. 9A). Anti-OMP106 protilátky se nevázaly k žádnému polypeptidu v proteinových extraktech z příbuzných bakterií (Obr. 8A). Tyto výsledky dokazují následující: 1) Anti-OMP106 protilátky mohou být použity ke specifické identifikaci a odlišení M. catarrhalis od příbuzných bakteriálních druhů. 2) Polypeptid OMP 106 může být použit k přípravě protilátek, jež mají diagnostické uplatnění pro identifikaci M catarrhalis. 3) Protilátky proti polypeptidu OMP 106 jednoho kmene (např. OMP 106 kmene ATCC 49143) mohou být použity na identifikaci a izolaci odpovídajícího polypeptidu OMP 106 u jiných kmenů M. catarrhalis. Výsledky westernové analýzy kupodivu ukázaly, že mnohé NHA kmeny M. catarrhalis mají v OG extraktech svých vnějších membrán polypeptid OMP106. Toto zjištění a skutečnost, že v PAGE oktylglukosidových extraktů vnějších membrán NHA kmenů M. catarrhalis není po barvení stříbrem viditelný pruh v oblasti 180 kDa až 230 kDa naznačuje, že polypeptid OMP 106 je exprimován většinou kmenů nebo kultivarů M. catarrhalis, ale k tomu, aby byl aktivní v hemaglutinaci (tj., aby se vázal k receptoru na povrchu savčí buňky) nebo byl barvitelný stříbrem, musí být polypeptid OMP 106 určitý způsobem modifikovaný. Zdá se, že pouze HA kmeny a kultivary jsou schopné příslušně modifikovat polypeptid OMP 106 tak, aby mohl zprostředkovávat vazbu bakterií k hemaglutininovému receptoru na povrchu savčích buněk.

7. Příklad: Účinnost OMP 106 vakcíny: cytotoxická aktivita anti- OMP 106 antiséra

Aby se určil vakcinační potenciál polypeptidu OMP 106, byla u anti-OMP106 protilátek studována cytotoxická aktivita zprostředkovaná komplementem. Proti polypeptidu OMP 106 z HA kultivaru ATCC 49143 bylo připraveno antisérum, jak bylo popsáno výše v části 6.1.8. Aktivita neimunního séra a anti—OMP 106 antiséra v zabíjení buněk M. catarrhalis komplementem byla studována pomocí „Sérového Bactericidního Testu“, podle Zollingera et al. (Immune Responses to neiserria meningitis, v Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3^rd ed., str. 347-349) s tou výjimkou, že místo buněk Neisserria maningitis byly použity buňky HA a NHA kmenů nebo kultivarů M. catarrhalis.

Výsledky ukazují, že nabízejí komplementem bylo zprostředkováno anti-OMP106 antisérem u buněk HA kultivaru heterologního M. catarrhalis ATCC 43627, ale nikoli u buněk NHA kultivaru M. catarrhalis ATCC 43627 nebo NHA M. catarrhalis ATCC 8176. Tabulka 3 shrnuje cytotoxické aktivity neimunního séra a anti-OMP106 antiséra proti HA kultivaru ATCC 43627 zprostředkované komplementem.

-27CZ 298034 B6

Tabulka 3: Cytotoxická aktivita neimunního séra aanti-OMP106 antiséra zprostředkovaná komplementem

Cytotoxický titr¹

	Neimunní	Anti-OMP106
Experiment 1	16	128
Experiment 2	8	64

Titr představuje nejvyšší ředění, při němž může sérum zprostředkovat zabíjení buněk HA kultivaru ATCC 43627 komplementem (např. hodnota 16 znamená, že sérum bylo 16krát zředěno), čím vyšší je číslo, tím vyšší je cytotoxická aktivita nebo titr.

Jak je vidět z Tabulky 3, anti-OMP106 antisérum má 8-krát větší cytotoxickou aktivitu než neimunní sérum. Tento výsledek ukazuje, že polypeptid OMP 106 je užitečný jako vakcína proti HA kmenům a kultivarům M. catarrhalis.

I když je vynález podrobně popsán pokud jde o jeho konkrétní provedení, rozumí se, že funkčně ekvivalentní odchylky spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Různé další modifikace vynálezu, vedle těch, které jsou zde ukázána a popsány, budou osobám zběhlým v oboru zřejmé z předešlého popisu a doprovodných obrázků. Takovéto modifikace budou spadat do rozsahu připojených nároků.

Jsou zde citovány různé publikace ajejich zveřejnění jsou zahrnuta odkazem jako celek.

Seznam sekvencí (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: TUCKER, KENNETH PLOSILA, LAURA (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: VNĚJŠÍ MEMBRÁNOVÝ PROTEIN-106 ZMORAXELLA CATARRHALIS, POLYPEPTID, SEKVENCE GENU A JEJICH POUŽITÍ (iii) POČET SEKVENCÍ: 8 (iv) ADRESE PRO KORESPONCENCI:

(A) ADRESÁT: PENNIE & EDMONDS (B) ULICE: 1155 Avenue of the Americas (C) MĚSTO: New York (D) STÁT: New York (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ (ZIP): 100036-2711 (v) POČÍTAČOVÝ FORMÁT:

(A) TYP MÉDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Pateintln Release # 1.0, Version # 1.30

-28CZ 298034 B6 (vi) ÚDAJE O PŘEDLOŽENÉ PŘIHLÁŠCE (A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US (B) DATUM PODÁNÍ:

(C) KLASIFIKACE:

(viii) INFORMACE O ZASTOUPENÍ:

(A) JMÉNO: Baldwin, Geraldine F.

(B) ČÍSLO REGISTRACE: 31,232 (C) REFERENČNÍ ČÍSLO: 7969-045 (ix) INFORMACE O SPOJENÍ:

(A) TELEFON: (212) 790-9090 (B) TELEFAX: (212) 869-8864 (C) TELEX: 66141 PENNIE (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

fle Gly Ile Ser Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg 15 1015

Gly Asp Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gin Ala Leu Gly Ser

2530

Gin Ser Ile Ala Ile Gly Asp Asn Lys Ile Val

3540 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní

-29CZ 298034 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Gly Thr Val Leu Gly Gly Lys Lys

5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „sonda“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

GGNACNGTNC TNGGNGGNAA RAAR 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 72 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..72 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

GAA GCG GAC GGG GGG AAA GGC GGA GCC AAT GCG CGC GGT GAT 42

Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp

510

AAA TCC ATT GCT ATT GGT GAC ATT GCG CAA72

Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gin

1520 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová

-30CZ 298034 B6 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp Lys Ser

5 10 15

Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gin (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc= „sonda“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

YTTYTTNCCN CCNAGNACNG TNCC 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „sonda“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

GGNACNGTNT TGGGNGGNAA RAAR 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá

-31 CZ 298034 B6 (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „sonda“ (v) TYP FRAGMENTU: N-koncový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

YTTYTTNCCN CCYAANACNG TNC 24

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný polypeptid OMP106, který je vnějším membránovým polypeptidem Moraxella catarrhalis a jehož molekulová hmotnost činí přibližně 180 až přibližně 230 kDa při stanovení elektroforézou v SDS polyakrylamidovém gelu s použitím myosinu králičího kosterního svalu 200 kDa a β-galaktosidázy E. coli 116,25 kDa jako standardů molekulových hmotností, a který obsahuje sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2.
2. Polypeptid OMP 106 podle nároku 1, který obsahuje sekvence SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2.
3. Polypeptid OMP 106 podle nároku 1 nebo 2, který má molekulovou hmotnost přibližně 190 kDa.
4. Polypeptid OMP 106 podle některého z nároků 1 až 3, který je vnějším membránovým polypeptidem kmene Moraxella cararrhalis, vybraného ze skupiny ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628 a ATCC 49143.
5. Polypeptid OMP106 podle některého z nároků 1 až 4, kde kmen Moraxella catarrhalis je ATCC 49143.
6. Polypeptid OMP 106 podle některého z nároků 1 až 5, kde Moraxella catarrhalis je hemaglutinující kultivar.
7. Polypeptid OMP 106 podle některého z nároků 1 až 65, který reaguje při barvení stříbrem.
8. Polypeptid OMP 106 podle některého z nároků 1 až 7, který specificky váže protilátku, jenž se specificky váže k sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo jakékoli její části o délce 6 nebo více aminokyselin.
9. Polypeptid OMP 106 podle některého z nároků 1 až 8, který specificky váže protilátku, jež se specificky váže k sekvenci SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2.
10. Izolovaná protilátka, která se specificky váže na polypeptid OMP 106 podle některého z nároků 1 až 9 nebo jakoukoli jeho část o délce 6 nebo více aminokyselin ze SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2.
11. Izolovaná protilátka podle nároku 10, která je cytotoxickou protilátkou, která umožňuje zabíjení buněk Moraxella catarrhalis komplementem.
12. Peptidový fragment polypeptidu OMP 106 podle některého z nároků 1 až 9, který se specificky váže k protilátce, jež specificky váže zmíněný polypeptid OMP 106.

-32CZ 298034 B6
13. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid OMP106 podle některého z nároků 1 až 9.
14. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje peptidový fragment podle nároku 12.
15. Směs antigenů, vy z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje polypeptid OMP106 podle kteréhokoli z nároků 1 až 9.
16. Směsantigenů, vyznačující se t í m , že obsahuje peptidový fragment podle nároku 12.
17. Izolovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid OMP 106 podle některého z nároků 1 až 9.
18. Izolovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující peptid podle SEQ ID NO: 1.
19. Izolovaná DNA kódující polypeptid OMP 106, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, jež hybridizuje za vysoce stringentních podmínek se sekvencí SEQ ID NO: 4 nebo se sekvencí komplementární k SEQ ID NO: 4.
20. DNA podle nároku 18, obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 4 nebo sekvenci komplementární k SEQ ID NO: 4.
21. Použití polypeptidu podle některého z nároků 1 až 9 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci infekce M. catarrhalis.
22. Použití izolované protilátky podle některého z nároků 10 až 11 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci infekce M. catarrhalis.
23. Použití peptidového fragmentu podle nároku 12 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci infekce M. catarrhalis.
24. Použití DNA podle některého z nároků 17 až 18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci infekce M. catarrhalis.