KR100500000B1 - 모락셀라카타르할리스외측막단백질-16폴리펩티드,이의유전자서열및이의용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 외측 막 단백질-106(OMP106) 폴리펩티드, 이로부터 유도된 폴리펩티드, 이를 인코드하는 뉴클레오티드 서열, OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드에 특이적으로 결합을 하는 항체에 관계한다. 또한 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드로 구성된 백신을 포함하는 면역원성, 예방 및 치료조성물에 대해 상술하고 있다. 본 발명은 또한, 동물에서 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드에 면역 반응을 유도하는 방법을 상술하고 있다.
Description
1. 개요
본 발명은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 외측 막 단백질-106(OMP106)에 관계한다. 본 발명은 순수 OMP106 폴리펩티드와 여기에서 유도된 폴리펩티드(OMP106-유도된 폴리펩티드)를 포함한다. 또한 본 발명은 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드에 특이적으로 결합을 할 수 있는 항체(세포 독성 항체를 포함)를 포함한다. 본 발명은 또한 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 펩티드로 구성된 백신을 포함하는 예방 또는 치료 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 포유류에서 모락셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 반응하는 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 OMP106-폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열, 이 서열을 포함하는 벡터, 이 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
2. 발명의 배경
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)는 모락셀라(브라하멜라) 카타르할리스[Moraxella(Branhamella) catarrhalis] 또는 브라하멜라 카타르할리스(Branhamella catarrhalis)로 알려져 있는데, 또한 예전에는 사람의 호흡기에서 발견되는 그램-음성 박테리아인 나이제리아 카타르할리스(Neisseria catarrhalis) 또는 마이크로코커스 카타르할리스(Micrococcus catarrhalis)로 알려져 있었다. 모락셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)는 원래는 무해한 공생 유기체로 간주하였으나, 현재는 동물의 상하 호흡기관 감염에 중요한 병인균으로 인지하고 있다. 사람에서, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)는 만성 폐질환이 있는 성인과의 심각한 하측 호흡기 감염을 일으키고, 면역절충된 환자에 전신 감염을 일으키고, 유아 및 어린이에게서 중이염 및 정맥두염을 일으킨다(Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Catlin, B. W., 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3:293-320;참고).
2.1. 외측 막 단백질과 보호 항체
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 병인성 감염과정을 연구하고, 이와 같은 감염에 대해 유용한 예방 및 치료수단을 개발하기 위해, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 외측 표면 성분을 연구하였다. 특히 외측막 단백질(OMP)는 독성 인자 및 백신 항원으로 가능성에 대해 상당한 주목을 받고 있다. 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 8개 OMP, 즉 OMP A 부터 H 중에 6개는 약 10개 내지 20개의 상이한 OMP를 가지는데 이것이 유세한 종이다(Murphy and Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174). OMP A 부터 H까지 분자량의 범위는 97kD 부터 20kD정도가 된다(참고; Bartos and Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765; Helminen et al., 1993, Microbiol. 10:87-97; and Sarwar et al., 1992, Infect. Immun. 60:804-809). 50M 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에서 얻은 외측 막을 쇼듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 단백질의 프로파일을 비교하면, OMP A 부터 H 까지 거의 유사한 패턴을 나타낸다(Bartos and Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765).
OMP A부터 H까지의 종류에 추가하여, SDS-PAGE에 의해 측정한 분자량이 350-720kD인 고분자량 OMP(HMW-OMP) 또한 많은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)종에 있는 또 다른 우세한 표면 성분으로 확인되었다. 포름산 변성하에서는 HMW-OMP는 단일 밴드 120-140kD을 나타내는데, 따라서 이는 올리고머 단백질인 것을 알 수 있다(Klingman and Murphy, 1994, Infect. Immun. 62:1150-1155). JMW-OMP는 Helminen(1994, J. Infect. Dis. 170:867-872)이 정의한 UspA와 동일한 단백질인 것으로 보인다.
고유 박테리아 또는 박테리아-유도된 외측 막 소포에서, 상기 확인된 OMP중 몇 가지에는 OMP에 결합을 할 수 있는 항체 생산을 유도하는 표면에 노출된 에피토프를 가진다. 이와 같은 항원성 OMP에는 OMP E 와 OMP G (Murphy and Bartos, 1989, Infect. Immun. 57:2938-2941); OMP C/D (Sarwar et al., 1992, Infect. Immun. 60:804-809); CopB, 80 kD OMP, (Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010); UspA (Helminen et al., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872)를 포함한다.
CopB와 UspA의 표면-노출된 에피토프에 치료능력을 가지는 항체에 대해 동물 모델에서 평가하였다. 모델은 조절된 수의 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)세포와 BALB/c VAF/Plus 쥐의 폐에 환약을 제공하고, 폐에서 박테리아가 제거되는 속도를 검사하였다(Unhanand et al., 1992, J. Infect. Dis. 165:644-650). 여러 가지 다른 임상 분리물에서 유도한 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)은 감염 부위에 입상세포가 회복되는 수준과 연관하여 제거 속도가 다른 것으로 나타났다. CopB와 UspA의 표면-노출된 에피토프에 대한 단클론항체를 이용한 수동 면역화 시키면 폐에서 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)가 제거되는 속도가 증가된다(Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Helminen et al., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).
2.2. 박테라아/숙주 세포 흡착 및 혈구응집반응
숙주세포 표면에 세균성 병인균이 흡착하면 콜리니가 형성되고, 병인화과정이 개시된다(참고; E.H. Beachey, 1981, J. Infect. Dis. 143:325-345). 그램-음성 균은 일반적으로 숙주 세포 표면에 있는 당단백질 또는 당지질의 특이적인 올리고사카라이드에 결합을 할 수 있는 표면 레틴을 발현시킨다. 이와 같은 레틴은 픈히 선모와 연합되어 있다. 세균성 흡착은 숙주 세포 표면과 소수성 또는 전하 상호작용으로 인한 비-특이적인 결합으로 발생한다.
호흡기관의 세포에 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 흡착 메카니즘에 대해서는 잘 모른다. 유기체는 배양된 사람 구강인두 상피 세포에 흡착한다(Mbaki et al., 1987, Tohuku J. Exp. Med. 153:111-121). Rikitomi et al., 의 연구에 따르면, 선모는 이와 같은 세포에 흡착하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알 수 있는데, 그 이유는 선모를 변성시키거나 항-선모항체를 이용하면 선모가 있는 균주에 의한 흡착이 감소되기 때문이다(Rikitomi et al., 1991, Scand. J. Infect. Dis. 23:559-567). 그러나, 선모에 의한 결합이 이와 같은 흡착에 유일한 원인이 아닌데, 이는 몇 가지 검사에 따르면, 대부분 흡착이 강한 균주는 선모가 없는 균주이기 때문이다.
세균성 흡착을 분류하는데, 혈구응집반응이 좀더 복잡한 흡착검사를 하는데 이용된다. 그러나, Rikitomi et al은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 의한 혈구응집반응과 사람 구강인두 상피 세포에 흡착간에는 상관관계가 없다는 것을 발견하였다. 즉, 세 가지 흡착이 매우 강한 균주는 사람 적혈구세포를 응집하지 않는다. 따라서, 사람 구강인두 상피 세포 흡착과 혈구응집반응에는 다른 결합 메커니즘이 관여한다.
대조적으로 Kellens et al.,에 따른 최근 연구에서는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 의한 혈구응집반응은 숙주 세포 흡착과 상관관계가 있다고 한다(Kellens et al., 1995, Infection 23:37-41). 그러나, 이 연구에서는 돼지 기관에 세균성 결합에 대해 흡착연구를 이용하였다. 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 병인성 균주에 의한 흡착에 대한 사람 호흡기와 돼지 기관 조직이 유사한지는 불분명하다.
그럼에도 불구하고, Kellens et al.,은 문제를 가지는 흡착연구에서, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 80개 일부 임상분리체의 혈구응집반응 활성을 검사하였다(Kellens et al., 1995, Infection 23:37-41). 검사한 균주중 ¾ 이 사람, 토기, 기니아 피그, 개 또는 쥐의 적혈구에 응집하는데 나머지 균주는 응집하지 않았다. 혈구응집반응을 하는 균주의 일부에 대한 혈구응집반응 활성에 대해 추가 특징을 조사하였고, 이는 칼슘 이온에 따라 달라지고, 트립신 처리 또는 고온처리 또는 D-클루코사민 또는 D-갈락토사민을 첨가하면 방해를 받았다.
Tucker et al.,가 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 혈구응집반응과 비-혈구응집반응을 검사한 결과, 모든 균주는 당지질 강글리오테트라오실세라미드에 결합을 하나 혈구응집반응을 하는 균주만은 당지질 글로보테트라오실세라미드에 결합을 한 것으로 나타났다(Tucker et al., 1994, Annual Meeting of Amer. Soc. Microbiol., Abstract No. D124). 또한, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 혈구응집반응 활성은 글로보테트라오실세라미드의 탄수화물 잔기로 구성된 다양한 단당류에 의해 방해를 받는 것으로 나타났다. 이와 같은 관찰은 Tucker et al.,의 제시한 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)가 사람의 적혈구 세포를 포함한 가능성이 있는 적혈구세포의 세포막에 있는 글로보테트라오실세라미드에 결합을 하여 혈구응집반응을 한다는 것이다. 현재까지, 숙주 세포 흡착 또는 혈구응집반응을 일으키는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 외측 표면에 있는 분자를 확인한 선행기술은 없었다.
본 출원에서 언급하고 있는 문헌은 이와 같은 문헌을 본 발명의 선행기술로 참고한 것이다.
3. 발명의 요약
본 발명은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) OMP106 폴리펩티드 및 OMP106-유도된 폴리펩티드와 이와 같은 폴리펩티드를 만드는 방법에 관계한다. 본 발명은 또한, OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드에 특이적인 세포독성 항체를 포함한 항혈청 및 항체에 관계한다. 본 발명은 또한, 하나이상의 상기 폴리펩티드를 포함하는 면역학적, 예방학적 또는 치료상 조성물(백신 포함)에 관계한다. 본 발명은 또한, 이와 같은 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한 본 발명은 백신을 포함하는 면역학적, 예방학적 또는 치료 조성물을 포함하는데 이는 감쇠된 또는 비-활성화된 혈구응집반응을 하지 않는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 배양체로 구성된다.
본 발명은 많은 용도를 가진다. 가령, OMP106 폴리펩티드와 OMP106-유도된 폴리펩티드를 리간드로 이용하여 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 감염에 반응을 이끌어내는 항체를 감지한다(가령, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 감염을 진단하는데). OMP106과 OMP106-유도된 폴리펩티드를 면역원으로 이용을 하여 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)-특이적인 항체를 유도할 수 있다. 이와 같은 항체는 면역검사에도 이용하여 생물학적 견본에서 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)를 감지할 수 있다. 본 발명의 세포독성 항체는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 감염에 대한 수동적인 면역화반응에도 이용을 할 수 있다. OMP106 폴리펩티드와 OMP106-유도된 폴리펩티드는 또한 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 감염에 대한 백신의 활성 성분으로도 이용할 수 있다.
본 발명은 혈구응집반응을 하는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)와 이의 배양체가 분자량이 약 180KD 내지 약 230KD인 외측 막 단백질 OMP106을 가지고, 혈구응집반응을 하지 않는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주와 이의 배양체는 OMP106 폴리펩티드를 가지지 않거나 또는 혈구응집반응에 활성이 없는 실버-착색이 되지 않는 부적절하게 변형된 OMP106 폴리펩티드를 가진다는 발견에 기초한 것이다. 본 발명은 또한 혈구응집반응을 하는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주에서 분리된 OMP106 폴리펩티드에 의해 유도된 다클론성 항혈청이 상이한 혈구응집반응을 하는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주에 대해서는 세포독성 활성을 가지나 혈구응집반응을 하지 않는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주에 대해서는 반응을 하지 않는다는 발견에 기초한 것이다.
3.1. 정의 및 약어
항-OMP106 = 항-OMP106 폴리펩티드 항체 또는 항혈청
ATCC = American Type Culture Collection
수포 = 자연계에서 발생하는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 외측 막 수포
Gb4 = GalNAcβ 1-3Galα 1-4Galβ 1-4Glc1-1Ceramide
HA = 혈구응집반응
immuno-reactive = 세포 또는 체액 면역 반응을 일으킬 수 있는
kD = 킬로달톤(분자량의 단위)
M. catarrhalis = Mc;
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis);
모락셀라(브란하멜라)카타르할리스(Moraxella(Branhamella)catarrhlis)
브란하멜라 카타르할리스(Branhamella catarrhalis);
나이제리아 카타르할리스(Neisseria catarrhalis);
마이코로코커스 카타르할리스(Micrococcus catarrhalis)
NHA = 혈구응집반응을 하지 않는
OG = n-옥틸 β-D-글루코피라노시드 또는 옥틸 글루코시드
OMP106 = SDS-PAGE에 의해 측정한 결과 분자량이 약 180 내지 230kD인 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 외측 단백질-106 폴리펩티드; OG 또는 살코실 계면활성제를 이용하여 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 고유 세포 또는 수포에서 추출을 할 수 있음.
OMP106-유도된 폴리펩티드 = OMP106 폴리펩티드의 단편; 야생형 OMP106폴리펩티드 또는 이의 단편의 변이체로 하나이상의 아미노산 결손, 삽입 또는 치환된 것을 가짐; 또는 OMP106 폴리펩티드의 전체 또는 일부에 N-단부 또는 중간 부분에 또는 C-단부에 융합할 수 있는 이형성 폴리펩티드
OMP = 외측 막 단백질
OMPs = 외측 막 단백질의 복수개념
PBS = 인산 완충된 염
PAG = 폴리아크릴아미드 겔
폴리펩티드 = 적절하게는 10개 이상의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드
SDS = 쇼듐 도데실설페이트
SDS-PAGE = 쇼듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
여기에서 정의하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열은 다음에 기초하여 한문자 코드로 나타낸다;
A = 아데닌
C = 시토신
G = 구아닌
T = 티민
U = 우라실
M = 아데닌 또는 시토신
R = 아데닌 또는 구아닌
W = 아데닌 또는 티민/우라실
S = 시토신 또는 구아닌
Y = 시토신 또는 티민/우라실
K = 구아닌 또는 티민/우라실
V = 아데닌 또는 시토신 또는 구아닌; 티민/우라실은 아님
H = 아데닌 또는 시토신 또는 티민/우라실; 구아닌은 아님
D = 아데닌 또는 구아닌 또는 티민/우라실; 시토신은 아님
B = 시토신 또는 구아닌 또는 티민/우라실; 아데닌은 아님
N = 아데닌 또는 시토신 또는 구아닌 또는 티민/우라실 또는 모름
여기에서 설명하는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열은 다음의 정의에 따라 한문자 코드로 나타냄;
A = 알라닌
R = 아르기닌
N = 아스파라진
D = 아스파르트산
C = 시스테인
Q = 글루타민
E = 글루타민산
G = 글리신
H = 히스티딘
I = 이소루이신
L = 루이신
K = 리신
M = 메티오닌
F = 페닐알라닌
P = 프롤린
S = 세린
T = 트레오닌
W = 트립토판
Y = 티로신
V = 발린
X = 모름
본 발명은 다음의 상세한 설명을 통하여 더욱 이해를 잘 할 수 있을 것이나, 이와 같은 실시예는 본 발명을 설명하기 위함이고 본 발명을 이에 국한시키고자 함은 아니다.
도 1은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 수포 또는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포의 옥틸 글루코시드(OG)의 추출물의 외측막 단백질의 프로파일을 변성 PAGE 비교를 한 것이다. 라인에 있는 수는 ATCC 균주 이름을 나타낸다. 미리 착색한 SDS-PAGE 표준(BioRad catalog # 161-0305)은 분자량의 기준으로 이용한다. 다음은 표준에 포함되는 폴리펩티드를 나타내는데 ()에는 이들의 대략적인 분자량을 나타낸다; 토기 근육 포스포릴라제 B(106KD); 소혈청 알부민(80KD); 암탉 알 흰 단백질 오브알부민(49.5KD); 소 카르보닌 안하이드라제(32.5KD); 콩 트립신 저해제(27.5KD); 암탉 난 백 라이소자임(18.5KD). 분자량 표식의 위치는 겔의 좌측에 하고, 일부 표식은 화살표로 해두었다.
도 2는 125I-라벨된 외측 막 수포와 당지질의 TLC의 결과를 나타낸 것이다. 패널 A-C에서, 라인 1은 좌측에 표시한 것과 같은 당지질을 포함한다; 라인 2는 마시알로-GM1(aislo)을 포함하고; 라인 3은 Gb3, Gb4와 Forssman 항원을 포함한다; 라인 4는 사람 적혈구세포의 Folch 추출물을 포함한다. 패널 A에 나타낸 사이토크롬은 오르시놀로 착생을 하고, 패널 B의 사이토크롬은 125I-라벨한 ATCC 균주 49143(혈구응집반응 착색)와 겹쳐놓는다. 혈구응집반응을 하는 균주만 3과 4라인에 있는 Gb4 당지질에 결합을 한다.
도 3은 도면에 나타낸 프로테아제로 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)를 처리를 한 후에 외측 막 단백질의 옥틸 글루코시드의 실버 착색하여 단백질의 프로파일을 나타낸 것이다. 처리 후에 세포의 혈구응집반응 활성은 라벨된 HA는 도면의 아래에 나타내었다. 이용된 분자량 표식은 도 1의 것과 같다.
도 4는 다양한 ATCC 균주 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에서 수득한 외측 막 단백질의 실버 착색으로 나타낸 단백질의 프로파일을 비교한 것이다. 균주는 라인의 위에 표시를 하였다. 균주의 혈구응집반응의 활성은 도면의 아래에 표시를 하였다. 토끼 근육 포스포릴라제 B(106KD)보다 더 큰 분자량을 가지는 단백질이 혈구응집반응을 하는 균주에 공통이 되나, 혈구응집반응을 하지 않는 균주에는 없다. 이와 같은 폴리펩티드는 OMP106로 지정하였다. 이용된 분자량 표식은 도 1의 것과 같다.
도 5는 두 가지 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) ATCC 49143 배양체; 49143(혈구응집반응을 하는 배양체)와 49143-NHA(혈구응집반응을 하지 않는 배양체)에서 준비한 외측 막 단백질의 실버 착색으로 나타낸 단백질의 프로파일을 비교한 것이다. 배양체의 혈구응집반응 활성은 도면의 아래에 나타내었다. 혈구응집반응을 하지 않는 배양체에서 OMP106 폴리펩티드 밴드가 없는 것은 (＜로 나타내었다). 이용된 분자량 표식은 도 1에서 이용한 것과 같다.
도 6은 ATCC 균주 49143의 OG 추출물을 이용하여 6%변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 측정한 OMP106의 분자량을 나타내는데, 이때 균주는 겔에 얹기전에 25℃ 또는 100℃에서 샘플 완충액에 배양하였다. 겔에 있는 단백질은 환원성 실버 착색으로 볼 수 있다. OMP106 폴리펩티드 밴드(＜로 나타냄)는 100℃에서 배양한 샘플에서만 나타난다. 광범위의 SDS-PAGE 표준(BioRad catalog # 161-0317)을 분자량 표식으로 이용하였다. 다음은 표준에 포함된 폴리펩티드이다[()안에는 분자량을 나타낸다)]; 토끼 골근육 미오신(200KD); 대장균(E.coli) β-갈락토시다제(116KD); 토끼 근육 포스포릴라제 B(97.4KD); 소 혈청 알부민(66.2KD). 겔에 있는 분자량 표식의 위치는 도면의 우측에 평균 분자량을 나타내었다.
도 7은 DraI 와 HindIII 제한효소 엔도뉴클라제를 Mc5-72 프로브를 가진 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 염색체 DNA에 처리한 서던 블랏 분석을 나타낸 것이다. 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 49143의 DNA는 DraI 또는 HindIII로 처리한다. 처리된 DNA의 서던 분석은 프로브를 Mc5-72(서열 4)를 이용하여 실행한다. 엄격한 세척은 20 내지 30분간 50℃에서 2X SSC, 1% SDS를 하는 것이다. 라인 1에는 HindIII 처리물을 포함하고; 하이브리드 밴드는 약 8.0kB 크기를 가진다. 라인 2에는 DraI 처리물을 포함하고; 하이브리드 밴드는 약 4.2kB 크기를 가진다.
도 8a와 8b는 프로브로 OMP106에 대한 토끼 항혈청을 이용하여 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)와 관련된 종의 단백질 추출물의 웨스턴 블랏을 나타낸 것이고(도 8a), 이는 OMP106로 토끼를 면역화시키기전에 혈청의 반응성과 비교를 하였다(도 8b). 라인 8a와 8b에 있는 샘플은 다음과 같다; 라인 A은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)이고; 라인 B은 모락셀라 오비스(Moraxella ovis)이고; 라인 C는 모락셀라 라쿤타(Moraxella lacunata)이고; 라인 D는 모락셀라 오슬로엔시스(Moraxella osloensis)이고; 라인 E는 모락셀라 보비스(Moraxella bovis)이고; 라인 F는 나이제리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)이고; 라인 G는 나이제리아 고노리에(Neisseria gonorrhoeae)이다. 이용된 분자량 표식은 도 1의 것과 같다.
도 9a는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) ATCC 군주 49143의 OMP106 폴리펩티드에 대한 토끼 항혈청이 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 HA와 NHA 균주에서 유사한 분자량을 가지는 폴르펩티드와 상호작용을 한다는 것을 설명하는 웨스턴 블랏이다(OMP106 폴리펩티드의 위치는 화살표로 나타내었다). 웨스턴은 다양한 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주의 옥틸 글루코시드 추출물을 검사를 하였다. ATCC 기탁번호는 라인의 위에 표시를 하였다. 이용된 웨스턴 블랏 과정은 도 8에 나타낸 블랏을 수득하는데 이용된 것과 동일하다.
도 9b는 9a에서 이용된 것에 상응하는 프레-면역 혈청을 이용하여 도 9a와 같은 동일한 추출물의 웨스턴 블랏을 나타낸다.
5.1 혈구응집반응을 하는 배양체와 혈구응집반응을 하지 않는 배양체
본 발명은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 순수한 OMP106 폴리펩티드를 제공한다. OMP106 폴리펩티드는 혈구응집반응을 하는(HA) 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주와 혈구응집반응을 하지 않는 (NHA) 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주의 외측 표면 막에 위치한 전체 단백질 또는 소단위로 구성된다. OMP106은 HA 균주와 배양체의 혈구응집반응 표현형에 직간접적으로 기여한다. 본 발명에 따르면, HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)는 임의 표준 혈구응집반응 검사 가령, Soto-Hernandez et al. 1989, J. Clin. Microbiol. 27:903-908에서 설명을 하는 것과 같은 방법을 이용하여 사람 또는 토끼 적혈구세포를 응집시킨다. 특정 작용 기작에 국한하고자함은 아니지만, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)은 숙주 세포 표면에 있는 당지질과 당단백질의 글로보테트로즈(Gb4)에 결합을 하여 적혈구세포를 응집시키고, 혈구응집반응 활성은 적절하게 변형된 OMP106 폴리펩티드에 의해 중개되는데 이는 실버착색에 민감한 성질을 가진다. 대조적으로, 변형 안된 또는 부적절하게 변형된 OMP106 폴리펩티드는 혈구응집반응을 중개하는데 또는 실버착색을 하는데 활성이 없다. 또한, OMP106 폴리펩티드는 HA 또는 NHA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 수포 또는 고유 세포에서 OG- 또는 사르코실 추출된 것으로 SDS-PAGE에 의하면 분자량이 약 180KD 내지 약 230KD이다.
HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포의 혈구응집반응 활성은 글로보테트로즈(GalNAcβ 1-3Galα 1-4Galβ 1-4Glcβ 1; Gb4)와 D-갈락토즈와 글루코즈 또는 메틸-α -갈락토즈 또는 메틸-β -갈락토즈와 같은 이의 유도체를 포함하는 Gb4로 구성된 단당류에의해 방해를 받는다. HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 혈구응집반응의 활성은 또한 D-만노즈, L-퓨코즈, D-갈락토즈, N-아세틸-D-글루코자민을 포함하나 이에 국한하지 않는 다른 당이 상대적으로 높은 농도로 존재하면 방해를 받는다.
고유 HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) OMP106 폴리펩티드의 혈구응집반응 활성은 다양한 프로테아제로 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)을 처리하면 방해를 받거나 파괴되는데, 이때 프로테아제는 TLCK(Nα-프토실-L-리신 클로로 메틸 케톤[또는 1-클로로-3-토실아미노-7-아미노-L-2-헵타논으로도 공지됨], 프로테아제 K, TPCK(N-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤)-처리된 트립신등이 있으나 이에 국한시키지는 않는다. 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)를 프로테아제 V8 처리할 경우에는 이와 같은 세포의 OMP106 폴리펩티드의 물리적인 일체성 또는 혈구응집반응 활성에 영향을 끼치지 않는다.
혈구응집반응을 하지 않는(HNA) 배양물도 HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 정지(static) 액상 배양물(가령, 교반을 하지 않고 액체 배양물을 35℃에서 유지)에서 연속적으로 계대한 배양체로부터 유도할 수 있다. 가령, HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 배양체는 Mueller Hinton 배지에서 생장을 시키고, 매 5일 마다 접종물은 정지 배양물의 표면에서 취하여 연속적인 정지 배양물에 접종한다. 적절한 접종물은 배양 표면에서 임의 부유 세포이다. 정지 배양물에서 계대는 NHA 배양물이 생성될 때까지 지속한다. 본 발명의 NHA 배양체를 이용하여 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 감염에 대한 전체 세포 백신과 같은 보호성 백신을 생산한다.
대조적으로, HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 배양체의 혈구응집반응 표현형은 교반을 시키는 액체 배양물에 균주 또는 배양체를 계대하여 유지한다. 구체예에서, HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 배양체는 약 200 RPM으로 교반을 하면서 35 내지 37℃에서 Mueller Hinton 배지에서 생장을 시키고, 매 24 내지 48시간마다 계대한다. HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 혈구응집반응의 표현형은 또한 고체 배지에서 계대하여 유지한다. 가령, HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 배양체는 혈액 한천 또는 Mueller Hinton 한천을 포함하는 플레이트에서 생장시킨다.
5.2. OMP106 폴리펩티드
본 발명의 OMP106 폴리펩티드는 분자량이 약 180kD 내지 약 230kD, 적절하게는 약 190kD(SDS-PAGE을 이용하여 측정)을 가지는 HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 배양물의 유일한 외측 막 단백질이다. 본 발명에 따르면, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 외측 막 단백질은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 수포에 있는 폴리펩티드 또는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 수포 또는 실온에서 n-옥틸 β -D-글루코피라노시드(OG) 또는 사르코실 계면활성제에 의해 고유 세포 또는 이의 수포에서 추출할 수 있는 것이다. 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 외측막으로 구성된 자연 발생하는 수포에 대해서는 Murphy and Loeb, 1989, Microbial Pathogenesis 6:159-174을 참고로 한다. NHA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 배양체는 OMP106 폴리펩티드 또는 항-OMP106 폴리펩티드(단[Richmond, CA]의 실버 착색을 이용)에 반응을 하지 않고 또는 Gottlieb and Chauko, 1987, Anal. Biochem. 165:33가 설명하는 공정에도 반응을 하지 않는다. 대조적으로 HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 배양체의 OMP106 폴리펩티드는 항-OMP106 항체에 결합을 하고, 실버착색과도 반응을 한다.
HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 수포 또는 고유 세포에서 동일한 HA 균주의 혈구응집반응을 감쇠 또는 제거할 수 있는 프로테아제로 처리하여 분해에 대해 민감성으로 OMP106 폴리펩티드를 확인할 수 있다(단락5.1에서 고유 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포의 혈구응집반응 활성을 파괴하거나 감소시키지 않는 프로테아제). 환언하면, HA 균주 또는 배양체의 혈구응집반응 활성을 파괴하거나 감소시키는 프로테아제로 처리하면(SDS-PAGE상에서) 균주 또는 배양체에서 분리한 OMP106 폴리펩티드의 위치 또는 양에 변화가 있는데 이는 처리하게전에 동일한 균주 또는 배양체에서 분리한 것과 비교하면 알 수 있다.
OMP106 폴리펩티드는 Harlow와 Lane(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Appendix I, 1998)에서 설명하는 조성물을 이용하여 SDS 12% PAGE에서 겔 전기영동으로 측정한 결과 분자량이 106kD이상인 것을 가지는 고유 세포 또는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 수포의 OG 또는 사르코실 추출물에 있는 것으로 확인할 수 있다. 5분간 100℃에서 OG 또는 사르코실 추출물을 열 처리하면 OMP106 폴리펩티드는 분자량이 약 180kD 내지 약 230kD으로 나타난다(Harlow와 Lane에서 설명을 하는 조성물을 이용하여 임의 환원제를 이용하지 않고 SDS 6%PAGE로 측정을 함). 특정 구체예에서, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 ATCC 49143의 열처리된 OG 또는 사르코실 추출물에 있는 OMP106 폴리펩티드의 분자량은 약 190kd인 것으로 나타났다.
특정 구체예에서, OMP106 폴리펩티드는 ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628중에서 준비할 수 있으나, 이에 국한시키지는 않는다. OMP106 폴리펩티드의 적절한 재료는 이와 같은 균주의 HA 배양체이다. 가장 적절한 재료는 ATCC 49143의 HA 배양체이다.
특정 구체예에서, OMP106 폴리펩티드는 적절하게는 아미노-단부를 가지는데 아미노 단부의 서열은 서열 1이거나 또는 이의 동종인 것이다. OMP106 폴리펩티드는 또한 전술한 서열에 카르복시-말단을 가지는데 이는 아미노산 서열 2 또는 이에 동종인 서열을 가지는 8개 아미노산 서열으로된 펩티드이다. 여기에서 사용할 수 있는 동종 아미노산 서열이란 해당 아미노산 서열의 적어도 80%, 적절하게는 100% 동일한 것을 말한다.
본 발명의 다양한 특징에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는 공지의 분자량 표식을 이용한 SDS-PAGE에서 분석한 폴리펩티드의 이동에 기초한 분자량을 가진다. 본 기술분야에 공지의 임의 분자량 표준은 SDS-PAGE에서 이용할 수 있는데, 적절한 분자량 표식은 토끼 골근육 미오신, 대장균(E.coli) β-갈락토시다제와 토끼 근육 포스포릴라제 B로 구성된다. 당업자는 본 발명의 폴리펩티드가 상이한 겔 시스템(가령, 상이한 완충액, 상이한 겔 농도, 교차결합제 또는 SDS)에서는 다르게 이주 한다는 것을 인지할 것이다. 당업자는 또한 폴리펩티드는 SDS-PAGE에 이용하는 여러 가지 다른 분자량 표식으로 인하여 다른 표면 분자량을 가질 수 있다는 것도 인지할 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 분자량은 분자량 표식과 함께 임의 SDS-PAGE 시스템에서 여기에서 상술하는 폴리펩티드의 표면 분자량이 약간 상이한 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
5.3. OMP106-유도된 폴리펩티드
본 발명의 OMP106-유도된 폴리펩티드는 OMP106-폴리펩티드의 단편이 될 수 있다. 고유 OMP106 폴리펩티드에는 폴리펩티드의 면역원성에 필수적인 것이 아닌 한 개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들면, 면역원성 활성에는 OMP106폴리펩티드의 특정 에피토프를 형성하는 아미노산 잔기가 필수적인 것이 된다. 공지의 기술을 이용하여 비필수 아미노산 서열을 제거할 수 있다. 예를 들면, 원하지 않는 아미노산 서열은 트립신, 파파인, 또는 관련 단백질분해성 효소와 같은 효소를 이용하여 제한 단백질분해를 하거나 시아노젠 브로마이드와 같은 시약을 이용하여 화학적으로 절단한 후에 절단 또는 처리 산물을 분리해낸다.
본 발먕의 OMP106-유도된 폴리펩티드는 변형된 OMP106 폴리펩티드 또는 이의 단편(가령, 야생형 OMP106 서열에 한 개 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결손을 가지는 OMP106 폴리펩티드 또는 단편)이 될 수 있다. 이와 같은 변형으로 인하여 이의 활성에는 영향을 주지 않는 폴리펩티드 생성물의 면역원성을 강화시킬 수 있다. 이용될 수 있는 변형 기술은 미국 특허 4,526,716에 상술하고 있다.
OMP106-유도된 폴리펩티드는 또한 완전한 OMP106 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복시 단부 또는 중간부분 또는 이의 단편 또는 일부분에 융합된 하나이상의 이형성 폴리펩티드로 구성된 키메라 폴리드가 될 수 있다. 이와 같은 키메라 폴리펩티드로 구성된 유용한 이형성 폴리펩티드에는 a)숙주 세포에서 OMP106-유도된 폴리펩티드의 운반, 전치 또는 프로세스를 실행할 수 있는 pre- 또는 pro-서열, b)친화성 정제된 서열, c)임의 유용한 면역원성 서열(가령, 세균성 병인균의 표면-노출된 하나이상의 에피토프를 인코드하는 서열)을 포함하나 이에 국한하지는 않는다.
적절하게는, 본 발명의 OMP106-유도된 폴리펩티드는 OMP106 폴리펩티드와 면역학적으로 교차-반응성이 있어, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 대한 면역반응을 동물에서 유도할 수 있다. 더욱 적절하게는, 본 발명의 OMP106-유도된 폴리펩티드는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 고유 OMP106 폴리펩티드의 한 개이상의 외측 표면 에피토프(가령, 고유 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 존재하는 것과 같은 표면-노출된 에피토프)를 형성하는 서열로 구성된다. 이와 같은 적절한 OMP106-유도된 폴리펩티드는 고유 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 대해 발생한 항체(가령, 포름알데히드 또는 글루타알데히드 고정된 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포에 의해 유도되는 항체; 이와 같은 항체는 여기에서는 "항-완전한 세포" 항체라 함)에 특이적으로 결합을 할 수 있는 이들의 능력으로 확인할 수 있다. 예를 들면, OMP106 폴리펩티드의 제한된 또는 완전한 프로테아제 절단으로 얻은 펩티드 또는 폴리펩티드를 표준 방법을 이용하여 분리하고, 항-완전한 세포 항체에 결합을 할 수 있는 능력에 대해 테스트하였다. 반응성 폴리펩티드는 적절한 OMP106-유도된 폴리펩티드로 구성된다. 공지의 방법에 따라 이를 분리하고 아미노산 서열을 결정한다.
또한 적절한 것은 본 발명의 OMP106-유도된 폴리펩티드는 HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 의해 혈구응집반응을 중개하는 고유 OMP106 폴리펩티드의 한 개이상의 에피토프를 형성하는 서열로 구성된다. 이와 같은 적절한 OMP106-유도된 폴리펩티드는 HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 의한 혈구응집반응을 방해하는 능력으로 확인할 수 있다. 예를 들면, OMP106 폴리펩티드를 제한 또는 완전한 프로테아제 절단 또는 화학적 분해시켜 얻은 폴리펩티드는 표준 방법으로 분리하고, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포에 의한 혈구응집반응을 저해하는 능력에 대해 테스트하였다. 일단 확인되고, 분리되면, 이와 같은 적절한 OMP1060유도된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 표준 서열화 방법을 이용하여 서열을 결정한다. 결정된 서열을 이용하여, 화학적 방법으로 합성 또는 유전자 공학 수단으로 이와 같은 폴리펩티드를 생산할 수 있다.
이와 같은 적절한 OMP106-유도된 폴리펩티드는 또한 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 게놈 DNA의 무작위 단편 또는 OMP106 폴리펩티드를 인코드하는 클론된 뉴클레오티드서열을 발현하는 세균성 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항-전체 세포 항체를 이용하여 확인할 수 있다(참고; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, NY, Vol. 1, Chapter 12). 반응성이 있는 클론을 분리하고, 이들의 삽입체를 분리하고, 서열화시켜 이와 같은 적절한 OMP106-유도된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정한다.
5.4. OMP106 폴리펩티드와 OMP106-유도된 폴리펩티드의 분리 및 정제
본 발명은 분리된 OMP106 폴리펩티드와 OMP106-유도된 폴리펩티드를 제공한다. 여기에서 사용하는 "분리된"이란 자연상태에서 연합된 다른 생물학적 물질이 없는 생성물을 말한다. 예를 들면, 분리된 OMP106 폴리펩티드 조성물은 약 70wt% 내지 94wt% 순수한 OMP106 폴리펩티드를 말한다. 적절하게는, 본 발명의 OMP106 폴리펩티드와 OMP106-유도된 폴리펩티드는 순수한 것이다. 여기에서 사용한 것과 같은 "순수한"은 산물에 자연적으로 연합된 다른 생물학적 물질이 없다는 것을 말한다. 정제된 OMP106 폴리펩티드 조성물로 구성된 것은 적어도 95wt% 순수 OMP106 폴리펩티드, 적절하게는 적어도 98wt% 순수 OMP106 폴리펩티드, 가장 적절하게는 적어도 99wt%의 순수 OMP106 폴리펩티드를 말한다.
본 발명의 OMP106 폴리펩티드는 임의 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 배양체의 전제 세포 추출물을 포함하는 단백질 추출물에서 분리할 수 있다. 적절하게는, 단백질 추출물은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 전체 세포 또는 외측 막 소포의 옥틸 글루코시드 또는 사르코실 추출물인데 이때, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)은 ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 추출물의 적절한 원료는 이와 같은 균주의 HA 배양체이다. 이와 같은 추출물의 더욱 적절한 재료는 ATCC 49143의 HA 배양체이다. 또 다른 OMP106 폴리펩티드 재료로는 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 인코드하는 클론된 서열을 발현하는 유전자 발현 시스템에서 수득한 단백질 물질이다(단락 5.8참조).
OMP106 폴리펩티드는 본 기술분야에 공지된 임의 생물학적 기술 및 방법을 이용하여 재료 물질로부터 분리 및 정제시킬 수 있다. 한가지 방법에서 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 외측 막은 표준 기술을 이용하여 얻고, 외측 막 단백질은 계면활성제와 같은 가용성 조성물을 이용하여 용해시킬 수 있다. 적절한 용해를 시키는 용액은 약 1.25% 옥틸 글루코피라노시드w/v(OG)를 포함하는 것이다. 또 다른 적절한 용해를 시키는 용액은 약 1.25% 사르코실을 포함하는 용액이다. OMP106 폴리펩티드는 용해된 분취물에 있다. 추출물에 있는 세포 찌꺼기와 불용성 물질은 원심분리에 의해 분리하고 적절하게 제거한다. 추출물에 있는 폴리펩티드는 원심분리하고, 5분간 100℃에서 SDS-를 포함하는 Laemmli 겔 샘플 전기영동 완충액에 배양하고, 그 다음 환원제 없이 6% SDS PAGE에서 전기영동을 한다(Laemmli, 1970, Nature 227:680-685). 전술한 것과 같은 OMP106 폴리펩티드(혈구응집반응 활성을 제거하는 프로테아제로 처리한 후에 가령, HA의 OG 또는 사르코실 추출물에는 있으나 이에 상응하는 NHA 배양체에는 없는 실버-착색된 폴리펩티드)는 OMP106 폴리펩티드를 포함하는 겔 절단체에서 직접 분리할 수 있다. 적절한 구체예에서, OMP106 폴리펩티드는 변성 SDS-PAGE에서 토끼 골근육 미오신(200kD)와 대장균(E. coli) β-갈락토시다제(116 kD)의 이동 거리 및 속도와 비교를 할 때 표면 분자량이 190kD을 가진다.
또 다른 OMP106 폴리펩티드를 정제하는 방법은 항-OMP106 폴리펩티드(단락 5.5)를 이용한 친화력 크로마토그래피에 의한 것이다. 적절하게는 단클론 항-OMP106 항체를 이용한다. 항체는 시아노겐 브로마이드 또는 다른 공지의 방법에 의해 숙시니미드 에스테르(Affi-Gel, BioRad, Inc.)에 의해 활성화된 아가로즈에 공유결합된다. 단백질 추출물을 전술한 것과 같이 겔의 상단에 얹는다. 항체에 OMP106 폴리펩티드가 결합을 할 수 있는 충분한 시간동안 표준 반응 조건하 접촉시킨다. 적절하게는 고형 서포트는 크로마토그래피 칼럼에 이용되는 물질이다. OMP106 폴리펩티드를 항체로부터 떼어내고 그 다음 분리된 또는 적절하게는 정제된 형의 OMP106 폴리펩티드를 회수한다.
본 발명의 OMP106-유도된 폴리펩티드는 분리 또는 정제된 OMP106 폴리펩티드의 화학적 또는 효소적 절단 또는 분해에 의해 생성될 수 있다. OMP106-유도된 폴리펩티드는 OMP106 폴리펩티드의 공지의 아미노산 서열에 기초하여 화학적으로 합성할 수 있는데, 키메라 폴리펩티드의 경우에는 당 기술분야에 공지의 기술을 이용하여 이형 폴리펩티드의 아미노산 서열을 합성한다(Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY).
OMP106-유도된 폴리펩티드는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 인코드하는 서열로 구성된 재조합 뉴클레오티드 구성을 발현시키는 유전자 발현 시스템으로 만들 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 공지의 방법에 따라 합성하고, 클론시키고, 발현시킨다(Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY, Chapter 9).
여기에서 상술하는 기술 및 발견에 따라 표준 단백질 정제 기술에 의해 본 발명의 OMP106-유도된 폴리펩티드를 분리하고, 정제할 수 있다. 특히, 적절한 본 발명의 OMP106-폴리펩티드, 고유 OMP106 폴리펩티드의 외측-표면 에피토프를 형성하는 것을 OMP106-폴리펩티드의 분리 및 정제에 대한 전술한 과정에 따라 분리 및 정제시킬 수 있는데 가령, 항-OMP106 폴리펩티드를 이용한다.
원하는 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 전기영동, 원심분리. 겔 여과. 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC 등을 포함), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법을 포함하나 이에 국한시키지 않는 기술을 이용하여 표준 단백질 또는 펩티드를 정제할 수 있다.
이들의 물리적인 또는 화학적인 특징에 따라 문자를 분리하기 위해 고안된 과정에 이와 같은 하나이상의 기술을 이용한다. 이들의 특징은 단백질의 소수성, 전하, 결합 능력, 분자량 등을 포함한다. 각 기술에 의해 수득된 다양한 물질은 OMP106 수용체 또는 이의 리간드에 결합하는 능력 또는 항-OMP106 항체에 결합하는 능력 또는 HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포에 의해 혈구응집반응을 간섭하는 능력("테스트 항체")에 대해 검사한다. 이와 같은 활성을 나타내는 이들 부분은 연속과정에서 그 다음 기술로 처리할 수 있고, 이 새로운 분취물은 다시 테스트한다. 전술한 "테스트" 활성만을 가지는 분취물이 수득될 때까지 이 공정을 반복하고 이는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 크로마토그레피를 한다.
5.5. OMP106 면역원과 항-OMP106 항체
본 발명은 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드에 특이적으로 결합을 할 수 있는 항체를 제공한다. 이와 같은 항체를 생산하기 위해, 분리된 또는 적절하게는 정제된 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 면역원으로 이용한다.
구체예에서, SDS-PAGE를 이용하여 HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포 또는 수포의 외측막 OG 또는 사르코실 추출물에 있는 다른 외측 막 단백질에서 분리하고, OMP106 폴리펩티드를 포함하는 겔 절단물은 면역원으로 이용하여 토끼에 주사하여 다클론성 OMP106 폴리펩티드를 포함하는 항혈청을 생산한다. 동일한 면역원을 이용하여 쥐에 면역 주사하여 단클론성 항-OMP106 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산한다. 특히 적절한 구체예에서, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628 균주중 어느 것에서 분리한 정제된 OMP106을 포함하는 PAG 슬라이스를 면역원으로 이용할 수 있다. 적절한 구체예에서, 이와 같은 균주의 HA 배양체에서 얻은 분리 또는 정제된 OMP106을 포함하는 PAG 슬라이스는 면역원으로 이용을 할 수 있다.
다른 구체예에서, OMP106 폴리펩티드의 펩티드 단편은 면역원으로 이용할 수 있다. 적절하게는 정제된 OMP106 폴리펩티드의 펩티드 단편을 이용할 수 있다. 펩티드는 프로테아제 절단, 분리 또는 정제된 OMP106 폴리펩티드의 절단 또는 화학적 합성에 의해 생산하고 이 다음 분리 또는 정제할 수 있다. 특정 구체예에서, 유용한 펩티드 단편에는 서열 1을 가지는 펩티드 또는 길이가 6개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 이의 단편을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 또 다른 구체예에서, 펩티드 단편은 서열 2를 가지는 것이다.
유용한 면역원은 이와 같은 펩티드 또는 담체 분자 적절하게는 담체 단백질에 결합된 펩티드로 구성된다. 담체 단백질은 면역학에 사용되는 통상적인 것이 되는데, 예를 들면, 소 혈청 알부민(BSA), 병아리 알부민, 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH) 및 이와 유사한 것을 포함하나 이에 국한하는 것은 아니다. 합텐 단백질 공액물질의 경우는 Hartlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, or a standard immunology textbook such as Roitt, I. et al., IMMUNOLOGY, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1985) or Klein, J., IMMUNOLOGY, Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, MA, (1990)을 참고로 한다.
또 다른 구체예에서, 고유 OMP106 폴리펩티드의 하나이상의 표면 에피토프에 특이적으로 결합을 할 수 있는 항체를 생산하기 위해서는 고유 HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포 또는 수포를 면역원으로 이용한다. 세포 또는 수포는 면역화를 시키기 전에 포름알데히드 또는 글루타알데히드와 같은 물질에 고정시킨다(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, Chapter 15). 적절하게는 이와 같은 항-전체 세포 항체를 단클론항체로 이용한다. 원하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 스크리닝 리간드로써 정제된 OMP106 폴리펩티드를 이용하여 확인할 수 있다. ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628의 임의 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)를 이와 같은 항체를 생산하는데 면역원으로 이용하나 이에 국한시키는 것은 아니다. 적절하게는 이와 같은 균주의 HA 수포 또는 세포를 면역원으로 이용한다. 더욱 적절하게는 균주 ATCC 49143의 HA 배양체의 세포 또는 수포를 이와 같은 항체를 만드는데 면역원으로 이용한다.
전체 세포 또는 수포에 의해 생산되는 다클론성 항체에는 다른 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 외측 막 단백질에 결합을 하는 항체("비-항-OMP106 항체")를 포함하고 따라서 이들 외측 막 단백질과 교차반응을 하는 다른 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 외측 막 단백질을 포함하는 샘플인지를 파악하는데 이용하기에는 다소 번거롭다. 이와 같은 환경하에서는, 주어진 샘플 또는 밴드의 항-전체 세포 항체에 의한 결합은 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드에 특이적으로 결합을 하는 항체(가령, 항-OMP106)에 의해 또는 경쟁물질로써 항-OMP106 항체, OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 이용한 경쟁 테스트에 의해 동일한 샘플 또는 밴드의 결합과 일치하는 것으로 증명된다(예를 들면, 반응 혼합물에 항-OMP106 항체, OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 첨가하면, 항-전체 세포 항체에 의한 샘플 결합을 감소시키거나 또는 제거하게 됨). 또는 "비-항-OMP106 항체"를 포함하는 다클론성 항체는 표준 방법에 의해 이와 같은 항체를 제거한다. 예를 들면, 비-항-OMP106 항체는 NHA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 배양체 또는 OMP106 폴리펩티드를 가지지 않는 것으로 알려진 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주(가령, ATCC 8176, 더욱 적절하게는 ATCC 49143의 NHA 배양체)의 세포로 침전시키거나 또는 이와 같은 세포 또는 세포의 외측 막 단백질로 구성된 칼럼에 흡착시켜 제거한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체를 유도하는데 유용한 면역원은 전술한 개별 면역원중 두 개 이상의 혼합물로 구성된다.
다클론성 항체를 포함하는 항혈청 또는 단클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 얻기 위해. 여기에서 언급한 면역원으로 포유류 적절하게는 사람, 토끼, 쥐, 생쥐, 양, 염소, 소 또는 말에 면역화반응을 시키는 것은 당분야에 공지의 과정에 따라 실행한다.
여기에 언급하는 기술에 따라 단클론 항체를 만들 수 있다. 이와 같은 기술은 예를 들면 미국 특허 No. 4,271,145와 No. 4,196,265., 에 상술되어 있다. 간략하면, 면역원으로 동물에 면역반응을 시킨다. 면역화된 동물의 지라세포와 골수세포를 융합하여 하이브리도마를 만든다. 면역원에 결합을 하는 항체를 만드는 지에 대해 융합 산물은 스크리닝한다. 양성 하이브리도마 클론을 분리하고, 이들 클론으로부터 단클론 항체를 회수한다.
다클론성 항체 및 단클론성 항체를 생산하는 면역화과정은 당분야에 공지되어 있다. 면역원을 피하, 정맥, 복막, 경피, 근육, 점막 또는 이들의 복합 경로를 포함하는 다수 경로중 임의 경로를 통하여 주사한다. 면역원은 본 기술에 공지의 방법 및 물질을 이용하여 용해된 형태 또는 물리적인 담체에 부착된 응집형 또는 어쥬번트와 혼합된 형으로 주사된다. 당 기술분야에 공지의 칼럼 크로마토그래피 방법을 이용하여 항혈청 및 항체를 정제한다.
본 발명에 따르면, HA 또는 NHA형의 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 OMP106 폴리펩티드는 면역 교차반응성이 있다. 따라서, 한 개의 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 OMP106 폴리펩티드에 대해 발생된 항체는 다른 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 및 배양체의 OMP106 폴리펩티드 및 OMP106-유도된 폴리펩티드에 특이적으로 결합을 한다. 예를 들면, 균주 ATCC 49143의 OMP106 폴리펩티드에 의해 유도된 다클론 항-OMP106 항체는 동종의 OMP106 폴리펩티드(가령, 균주 ATCC 49143의 OMP106 폴리펩티드)에 특이적으로 결합을 할 뿐만아니라 ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240, ATCC 25238을 포함하나 이에 국한시키지 않는 다른 균주의 OMP106 폴리펩티드 및 OMP106-유도된 폴리펩티드에도 특이적으로 결합을 한다.
항-OMP106 항체를 포함하는 본 발명의 항체를 이용하여 OMP106 폴리펩티드 및 OMP106-유도된 폴리펩티드의 분리 및 정제를 할 수 있다. 항체를 프로브로 이용을 하여 OMP106 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코드하는 삽입체를 가지는 발현 라이브러리에 클론을 확인할 수 있다. 항체는 면역검사(가령, ELISA, RIA, Westerns)에 이용하여 생물학적 견본에 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)를 특이적으로 감지 및 정량할 수 있다. 본 발명의 항-OMP106 항체는 OMP106 폴리펩티드에 특이적으로 결합을 하나 관련된 다른 병인균 가령, 모락셀라 오비스(Moraxella ovis), 모락셀라 라쿠나타(Moraxella lacunata). 모락셀라 오슬렌시스(Moraxella osloensis), 모락셀라 보비스(Moraxella bovis), 나이제리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 나이제리아 고노리에(Neisseria gonorrhoeae)의 단백질에는 결합을 하지 않는다.
본 발명의 항체, 특히 세포독성이 있는 항체를 수동 면역화반응에 이용하여 사람을 포함하는 동물에서 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 감염을 예방하거나 감쇠시킨다. (여기에서 이용하는 것과 같이, 세포 독성 항체는 항체에 의해 결합된 세균를 상보적으로 죽이거나 opsinization 시키는 것을 강화하는 것이다). 본 발명의 면역원에 대해 발생한 다클론성 또는 단클론성 항체의 효과적인 농도를 숙주에 투여하여 이와 같은 효과를 얻는다. 투여할 항체의 정확한 농도는 각 특이적인 항체 물질에 따라 다양하나 당 분야에 숙지의 지식을 가진 자가 표준 방법을 이용하여 결정을 할 수 있다. 다양한 기술을 이용하여 항체를 투여할 수 있는데 예를 들면 백신으로 수송할 수 있지만(단락 5.6) 이에 국한시키지는 않는다.
본 발명의 항체의 예방학적 그리고 치료학적 효과는 실험 동물에서 표준 약리학적 과정으로 결정한다. 동물 연구에서 얻은 자료를 이용하여 사람에게 이용할 수 있는 약량 범위를 정한다.
5.6. 백신
본 발명은 또한 사람을 포함하는 동물, 특히 설치류, 영장류 및 사람에서 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 감염에 대한 치료 및 예방 백신을 제공한다. 백신의 적절한 용도는 사람이다. 당분야에 공지의 기술을 이용하여 백신을 만들 수 있는데, 예를 들면, 백신은 면역원형태의 항원, 제약학적 수용 가능한 담체, 가능한 적절한 어쥬번트 및 다른 백신에서 볼 수 있는 통상적인 다른 물질로 구성된다. 백신에 이용될 수 있는 면역원의 면역학적 효과량은 여기에서 상술하는 수단으로 결정을 한다.
본 발명의 백신은 제약학적 수용 가능한 담체에 단락 5.5에 상술된 면역원의 면역학적 효과량으로 구성된다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 백신은 본 발명의 비활성화된 또는 감쇠된 HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 배양체 또는 NHA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 배양체의 면역학적 효과량으로 구성된다. 화학물 처리(가령, 포르말린), 열 처리 및 방사등의 공지의 방법을 이용하여 비활성화된 또는 감쇠된 HA 또는 NHA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 배양체를 얻을 수 있다.
여기에서 이용되는 "면역학적 효과량"이란 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 감염을 방지하거나 기존의 심각한 또는 부차적인 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 감염을 감쇠시킬 수 있는 면역 반응을 유도할 수 있을 정도의 충분한 양을 말한다. 정확한 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지나 면역 반응의 발생을 검사하기 위한 당업자가 공지의 방법을 이용하여 이를 결정할 수 있다.
유용한 폴리펩티드 면역원에는 분리된 OMP106 폴리펩티드 및 OMP106-유도된 폴리펩티드를 포함한다. 적절한 면역원에는 정제된 OMP106 폴리펩티드 및 OMP106-유도된 폴리펩티드 또는 OMP106의 펩티드를 포함한다. 복합 면역원 및 담체는 수용액, 유액 또는 현탁액의 형태가 될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드 면역원의 양은 약량당 0.1 내지 500㎍이 된다. 담체는 당분야에 공지의 것으로 안정화제, 희석제, 완충액을 포함한다. 적절한 안정화제에는 솔비톨, 락토즈, 만니톨, 전분, 당, 덱스트란 및 포도당과 같은 탄수화물; 알부민 또는 카제인과 같은 단백질을 포함한다. 적절한 희석제에는 염, Hanks 균형 염, 링거액을 포함한다. 적절한 완충액에는 알칼리 금속 인산염, 알칼리 금속 탄산염, 알칼리 토금속 탄산염등을 포함한다. 또한 백신에는 면역 반응을 개선 또는 강화시키기 위한 한 개 이상의 어쥬번트를 포함한다. 적절한 어쥬번트에는 펩티드; 알루미늄 하이드록시드; 알루미늄 포스페이트; 알루미늄 옥시드; Marcol 52와 같은 미네랄 오일 또는 식물성 오일 및 하나이상의 유화제로 구성된 조성물 또는 리졸레시틴, 다가양이온, 다가음이온과 같은 표면 활성물질; BCG와 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 유용한 사람 어쥬번트등을 포함한다. 백신에는 또한 다른 면역원을 포함할 수도 있다. 이와 같은 혼합 백신은 한번 투여로 몇 가지 면역원에 대해 면역성을 가질 수 있는 장점이 있다. 다른 면역원으로는 공지의 DPT 백신에 이용된 것들이 있다.
본 발명의 백신은 여기에서 상술하는 것과 같은 공지의 기술을 이용하여 준비할 수 있다. 일반적으로 면역원은 담체와 혼합하여 용액, 현탁액 또는 유화액으로 만든다. 전술한 첨가제중 한 개 이상을 담체에 혼합하거나 연속적으로 첨가할 수 있다. 백신 조제물은 저장을 목적으로 냉동 건조시킬 수 있다. 그럴 경우, 적절한 액체 담체를 첨가하여 액체 백신으로 재구성할 수 있다.
백신은 설치류 및 영장류를 포함하는 포유류 또는 사람에게 투여된다. 백신은 1회 또는 여러 약량으로 투여될 수 있다. 백신은 공지의 투여 경로를 통하여 투여된다. 여기에서 상술하는 백신 조제물을 투여하는데에는 많은 방법을 이용한다. 이와 같은 방법에는 경구, 경피, 근육, 복막, 정맥, 피하, 비강 경로를 이용할 수 있으나 이에 국한시키지는 않는다. 적절한 경로는 근육 또는 피하주사이다.
또한 본 발명은 포유류에서 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 의한 질병을 감쇠시키거나 또는 이의 감염으로부터 포유류를 보호하기 위해, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 방법은 본 발명의 면역원 효과량을 숙주에 투여하여 적절하게는 숙주에 본 발명의 백신을 투여하는 것으로 구성된다.
5.7. OMP106 폴리펩티드 및 OMP106-유도된 폴리펩티드를 인코드하는 핵산
본 발명은 또한 OMP106 폴리펩티드 및 OMP106-유도된 폴리펩티드를 인코드하는 핵산, DNA, RNA를 제공한다. 한 편으로는, 공지의 방법을 이용하여 본 발명의 핵산을 합성하는 것이다. 특히, OMP106 폴리펩티드 및 OMP106-유도된 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열 또는 일부 아미노산 서열을 Edman 분해 기술과 같은 공지의 기술을 이용하여 결정을 할 수 있다.(참고; Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., pp. 34-49). 수득된 아미노산 서열을 이용하여 통상적인 화학적인 방법 또는 올리고뉴클레오티드를 겹치는 폴리메라제 사슬 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 인코드하는 DNA를 합성을 한다.
또 다른 측면에서는 아미노산 서열을 이용하여 올리고뉴클레오티드 혼합물을 합성하는데 이는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 게놈 라이브러리에서 OMP106 폴리펩티드 코딩 서열을 스크리닝하는데 이용된다. 이와 같은 라이브러리는 임의 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 세포에서 DNA를 분리하여 만들 수 있다. 적절하게는, 게놈 라이브러리와 PCR 증폭반응을 위해 OMP106 폴리펩티드 코딩 서열의 재료로써 이용된 DNA는 ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628을 포함하는 임의 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포에서 준비한 것이나 이에 국한시키지는 않는다.
게놈 라이브러리를 만드는데, DNA 단편을 만들고, 이의 일부는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) OMP106 폴리펩티드의 전체 또는 일부분을 인코드한다. DNA는 다양한 제한효소를 이용하여 특정 부위를 절단한다. 또는 DNA를 분절화시키기위해 망간 존재 하에 DNase를 이용하거나 또는 초음파와 같은 것을 이용하여 물리적으로 DNA를 절단할 수 있다. 그 다음 DNA는 표준 방법에 따라 크기별로 분류를 하는데, 이때 이용되는 방법에는 아가로즈 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 칼럼 크로마토그래피 및 슈크로즈 농도차 원심분리등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 그 다음 DNA 단편은 적절한 벡터에 삽입을 하는데, 이때 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파아지 람다 또는 T4, 및 이스트 인공 염색체(YAC)등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다(참고; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Zd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II). 게놈 라이브러리는 라벨된 프로브에 핵산을 하이브리드시켜 스크리닝할 수 있다(Benton and Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961).
공지의 적절한 방법을 이용하여 OMP106 폴리펩티드의 임의 펩티드 아미노산 서열에 상응하는 라벨된 축중 올리고뉴클레오티드 서열로 게놈 라이브러리를 스크리닝한다. 특정 구체예에서, 스크리닝 프로브는 서열 1를 가지는 펩티드 또는 이의 단편에 상응하는 축중 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 구체예에서, 스크리닝 프로브는 서열 2를 가지는 펩티드에 상응하는 축중 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 추가 구체예에서, 서열 3과 서열 7의 올리고뉴클레오티드는 각각 서열 2의 OMP106 펩티드에 상응하는 것으로 이를 프로브로 이용한다. 또 다른 구체예에서, 서열 4 또는 이의 단편 또는 서열의 임의 상보체 또는 이의 단편을 프로브로 이용할 수 있다. 이용된 프로브는 적절하게는 15개 뉴클레오티드 또는 그 이상이 될 수 있다.
OMP106 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코드하는 삽입체 DNA가 있는 라이브러리에 있는 클론은 하나 이상의 축중 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드할 수 있다. 게놈 라이브러리에 이와 같은 올리고뉴클레오티드를 하이브리드하는 것은 공지의 방법을 이용하여 실행한다. 예를 들면, 전술한 두 가지 올리고뉴클레오티드를 하이브리드시키는 것은 50℃에서 2X SSC, 1.0% SDS에서 실행하고 동일한 조건에서 세척을 한다. 특정 구체예에서, OMP106 폴리펩티드 전부 또는 일부를 인코드하는 ATCC 49143 DNA는 길이가 약 8,000bp인 HindIII 제한효소 단편이거나 또는 길이가 약 42,00bp인 DRAI 제한효소 단편이 된다.
또 다른 측면에서, OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드 전부 또는 일부를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 클론은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 발현 라이브러리를 스크리닝하여 수득할 수 있다. 예를 들면, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) DNA를 분리하고, 무작위 단편을 준비하여 발현 벡터(가령, 박테리오파아지, 플라스미드, 파아지미드 또는 코스미드)에 결찰을 시켜 벡터에 삽입된 서열이 벡터가 도입된 숙주세포내에서 발현될 수 있도록 한다. 그 다음 다양한 스크리닝 방법을 이용하여 발현된 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 선별한다. 한 구체예에서, 다양한 본 발명의 항-OMP106 항체를 이용하여 본 기술의 공지 방법에 따라 원하는 클론을 확인한다(참고;Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, COld Spring Harbor, NY, Appendix IV). 라이브러리의 클론 또는 플락을 항체와 접촉시켜 이에 결합된 클론을 확인하는 것이다.
구체예에서, OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 인코드하는 DNA를 포함하는 콜로니 또는 플락은 Olsvick et al., 29th ICAAC, Houston, Tex, 1989에 따른 방법으로 DYNA 비드를 이용하여 감지할 수 있다. 항-OMP106 항체는 토실화된 DYNA Beads M280과 교차반응을 하고, 이와 같은 항체를 포함하는 비드는 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 발현시키는 콜로니 또는 플락에 흡착시키는데 이용한다. OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 발현시키는 콜로니 또는 플락은 비드에 결합된 것으로 확인을 할 수 있다.
또는, 항-OMP106 항체는 비특이적으로 이용하여 실리카 또는 CeliteTM와 같은 적절한 서포트에 고정시킬 수 있다. 이와 같은 물질을 이용하여, 전술한 문단에 설명한 것과 같이 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 발현시키는 세균성 콜로니를 흡수한다.
또 다른 측면에서 PCR 증폭을 이용하여 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 게놈 DNA의 전부 또는 일부 OMP106 폴리펩티드를 인코드하는 실제 순수한 DNA를 만들 수 있다. 공지의 OMP106 폴리펩티드에 상응하는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 축중 물질을 프라이머로 이용을 할 수 있다. 특정 구체예에서, 서열 1의 펩티드를 인코드하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 축중 뉴클레오티드 또는 이의 일부를 5' 프라이머로 이용할 수 있다. 예를 들면, 5' 프라이머는 서열 4의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 일부분일 수 있다. 서열 2를 인코드하는 서열의 역상보체인 뉴클레오티드 서열 또는 이의 축중체를 3' 프라이머로 이용할 수 있다. 예를 들면, 서열 6 또는 서열 8의 축중 뉴클레오티드 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드, 이의 축중체를 전술한 다양한 5' 프라이머와 결합된 3' 프라이머로 이용할 수 있다.
PCR은 Perkin-Elmer Cetus thermal cycler 과 Tag 중합효소(Gene AmpTM)를 이용하여 실행할 수 있다. PCR 반응에 이용을 하기 위해 몇 가지 다른 축중 프라이머를 합성하는데 선택할 수 있다. 또한, 축중 프라이머와 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) DNA에 있는 이에 상응하는 서열간에 뉴클레오티드 서열의 유사성 정도를 허용하기 위해 PCR 반응에 프라이밍하는데 이용되는 하이브리드 조건의 엄격성을 다양하게 할 수 있다. OMP106 폴리펩티드를 인코드하는 단편 서열을 성공적으로 증폭시킨 후에, 단편은 분자로 클론시키고 서열화시키고, 프로브로 이용하여 완전한 게놈 클론을 분리한다. 이는 역으로 유전자의 완전한 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있도록 하고, 이의 발현을 분석하고, 여기에서 설명을 하는 것과 같이 기능을 분석하기 위한 이의 단백질 생성물의 생산을 할 수 있게 한다.
일단, 한 개의 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 배양체로부터 OMP106을 인코드하는 코딩 서열을 분리한 후에, 다른 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 배양체로부터 OMP106 폴리펩티드 코딩 서열을 분리하게 위한 동일한 방법을 이용할 수 있다. 당업자는 본 발명의 OMP106 폴리펩티드(또는 이의 단편)를 인코드하는 DNA 또는 RNA를 이용하여, 당 분야에 일반적인 기술을 이용하여 하이브리드 반응의 조건을 중간 정도의 엄격성에서 높은 엄격성까지의 조건하에 이와 하이브리드할 수 있는 다른 DNA 또는 RNA 서열을 얻을 수 있다. 높은 엄격성을 가진 하이브리드 조건하에 한 개의 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 배양체에서 얻은 OMP106 서열과 하이브리드하는 것으로 다른 균주 또는 배양체의 이에 상응하는 서열을 확인할 수 있다. 높은 엄격성 조건은 프로브 길이와 염기 조성에 따라 달라진다. 이와 같은 조건을 결정하는 공식은 당분야에 공지되어 있다(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, Chapter II). 여기에서 이용한 것과 같이, 길이가 300개 염기이상인 프로브에 적용하는 매우 엄격한 조건은 적어도 1시간동안 68℃에서 0.1X SSC/0.1% SDS로 최종 세척을 하는 것이다(Ausubel, et al., Eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York, at page 2.10.3). 특정 구체예에서, 서열 4를 가지는 프로브 또는 이의 상보체를 가지는 프로브를 이용한 하이브리드반응에서 엄격한 세척은 적어도 20분내지 30분간 50℃에서 2X SSC, 1% SDS 세척을 하는 것이다.
당업자는 본 기술분야에 공지인 방법을 이용하여 OMP106 폴리펩티드 코딩 서열의 완전한 클론을 확인할 수 있다. 분리된 클론에 포함된 OMP106 폴리펩티드 코딩 서열의 크기는 클론된 삽입체를 서열화하고, 오픈 리딩 프레임(ORFs)에 인코드된 폴리드의 유추된 크기와 비교하여 또는 정제된 OMP106 폴리펩티드의 공지 아미노산 서열과 유추한 아미노산 서열을 비교하여 확인할 수 있다. OMP106 폴리펩티드 코딩 서열의 부분적인 클론을 분리하면, 하이브리드 프로브로써 부분적인 클론의 삽입체를 이용하여 분리할 수 있다. 또는, 이들 삽입체를 절단하여 부분 클론을 겹쳐놓아 완전한 OMP106 폴리펩티드 코딩 서열을 재구성할 수 있다.
완전한 클론은 OMP106 폴리펩티드의 아미노산 서열과 일치하는 유추된 아미노산 서열이 있는 ORFs를 가지는 것이거나 OMP106 폴리펩티드의 완전한 아미노산 서열을 이용할 수 없는 경우에는 OMP106 폴리펩티드에 상응하는 분자량을 가지는 OMP106 폴리펩티드의 펩티드 단편을 이용한다. 또한, 완전한 클론은 발현 벡터에 있을 때, OMP106 폴리펩티드의 아미노 단부에 특이적인 항체와 OMP106 폴리펩티드의 카르복시-단부에 특이적인 항체에 결합을 하는 폴리펩티드를 생산하는 이 삽입체의 능력으로 확인을 할 수 있다.
당 분야에 공지의 방법을 이용하여 OMP106-유도된 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열을 만들 수 있다. 한 측면에서, OMP106-유도된 폴리펩티드를 인코드하는 서열은 여기에서 상술하는 재조합 DNA 방법에 의해 OMP106 폴리펩티드 코딩 서열로부터 유도할 수 있다. 예를 들면, OMP106 폴리펩티드의 코딩 서열은 OMP106 폴리펩티드의 면역원성에 영향을 주지 않는 아미노산 치환을 만들도록 변형시키거나 또는 OMP106 폴리펩티드의 면역원성을 개선시키도록 아미노산 서열을 치환시킬 수 있도록 할 수 있다. 다양한 방법을 이용할 수 있는데, 올리고뉴클레오티드 직접적인 부위 특이적인 돌연변이를 포함한 다양한 방법을 이용하는데 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 방법 및 다른 방법은 당 분야에 공지의 것으로써 Botstein and Shortle, 1985, Science 229:1193-1210에 기술된 것과 같이, 치환, 삽입, 결손 및 전치와 같은 단일 또는 다중 돌연변이를 만드는데 이용할 수 있다.
또한, 제한 효소 또는 엑소뉴클레아제 처리를 이용하여 OMP106 폴리펩티드 코딩 서열의 OMP106를 절단할 수 있다. 이형성 코딩 서열을 결찰 또는 PCR 방법을 이용하여 OMP106 폴리펩티드 코딩 서열에 추가할 수 있다. 또한, OMP106-유도된 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 인코드하는 DNA는 화학적으로 또는 공지의 또는 유추된 OMP106 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초한 PCR 방법을 이용하여 합성을 할 수 있고 원하는 경우 그 서열에 변화를 줄 수 있다.
적절한 클로닝 벡터에 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드 코딩 서열을 포함하는 확인 및 분리된 DNA를 삽입한다. 당 분야에 많은 공지된 벡터-숙주 시스템을 이용할 수 있다. 가능한 벡터에는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하나 이에 국한시키지는 않는데, 단 벡터 시스템은 이용할 숙주 세포와 적응성이 있어야 한다. 이와 같은 벡터에는 람다 유도체와 같은 박테리오파아지 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 클로닝 벡터에 삽입은 상보적으로 결찰할 수 있는 단부(cohesive termini)를 가지는 클로닝 벡터에 DNA 단편을 결찰시키면 된다. 그러나, DNA를 분절하는데 이용할 상보적인 제한 효소 부위가 클로닝 벡터에 없는 경우에 DNA 분자의 단부를 효소를 이용하여 변형을 시킬 수 있다. 또는 DNA 단부에 뉴클레오티드 서열(링커)를 결찰을 시켜 원하는 부위를 만들 수 있고; 이와 같은 결찰된 링커는 제한효소 엔도뉴클라아제 인지 서열을 인코드하는 특정 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 또 다른 방법에서, 절단된 DNA는 동종의 다중 반복 꼬리를 이용하여 변형시킬 수 있다. 재조합 분자를 형질도입, 형질감염, 감염, 전기천공등을 통하여 숙주세포로 도입시켜 원하는 유전자 서열을 다수 복제할 수 있다.
또 다른 방법에서, "shot gun" 방법을 이용하여 적절한 클로닝 벡터에 삽입한 후에 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드 코딩 서열을 포함하는 원하는 DNA를 확인하고 분리할 수 있다. 클로닝 벡터에 삽입시키기전에 예를 들면, 크기별 분취를 통하여 원하는 서열을 모을 수 있다.
특정 구체예에서, OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드 코딩 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자로 숙주세포에 형질도입된 것은 이와 같은 코딩 서열을 다수 복제할 수 있다. 따라서, 형질변환체를 생장시키고, 형질변환체로부터 재조합 DNA 분자를 분리하여 다량의 코딩 서열을 얻을 수 있는데, 필요에 따라서는 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 코딩 서열을 회수할 수 있다.
5.8. OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드의 재조합에 의한 생산
유전공학을 이용하여, 본 발명의 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 이경우에, 폴리펩티드를 코드하는 DNA로 형질변환된 숙주세포를 적절하게 이용하여 이를 생산할 수 있다. 본 발명의 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 적절한 발현 벡터(가령, 삽입된 폴리펩티드-코딩 서열의 전사 및 해독을 하는데 필요한 필수 요소를 가지는 벡터)내로 삽입할 수 있다. OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 적절한 조건하에 발현될 수 있도록 벡터내에 삽입된다(가령, 적절한 방향 및 정확한 리딩 프레임을 가지고, RNA 중합효소 결합 서열 및 리보좀 결합 서열이 있는 등의 조건).
폴리펩티드-코딩 서열을 발현시키기 위해서는 다양한 숙주-벡터 시스템을 이용할 수 있다. 여기에는 바이러스(벡시나아 바이러스[vaccinia virus], 아데노바이러스[adenovirus]등)에 감염된 포유류 세포계; 바이러스(베큘로바이러스[baculovirus])에 감염된 곤충 세포계; 이스트 벡터를 포함하는 이스트 또는 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA에 의해 형질변환된 미생물을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 적절하게는 숙주세포는 박테리아이고, 가장 적절한 박테리아는 대장균(E. coli), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 또는 살모넬라(Salmonella)이다.
벡터의 발현 성분은 이들의 강도 및 특이성이 다양하다. 이용되는 숙주-벡터에 따라, 적절한 전사 및 해독 원소들을 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드 서열과 숙주 세포의 pre/pro 서열로 구성된 키메라 단백질이 발현된다. 또 다른 구체예에서, OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드 서열과 유용한 면역원성 펩티드 또는 폴리펩티드로 구성된 키메라 단백질이 발현된다. 적절한 구체예에서, 발현된 OMP106-유도된 폴리펩티드에는 고유 OMP106 폴리펩티드의 외측 표면 에피토프 또는 수용체-결합 도메인을 만드는 서열을 포함한다.
벡터내로 DNA 단편을 삽입하기 위한 당 분야에 공지의 기술을 이용하여 적절한 전사 및 해독 조절 시그날과 폴리펩티드 코딩 서열로 구성된 키메라 유전자를 포함하는 발현 벡터를 만들 수 있다. 이와 같은 방법에는 in vitro 재조합 DNA 및 합성 기술과 in vivo 재조합(유전자 재조합) 방법을 포함한다. OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드를 인코드하는 핵산서열의 발현은 제2핵산 서열로 조절하여 삽입된 서열이 재조합 DNA 분자로 형질변환된 숙주에서 발현되도록 한다. 예를 들면, 삽입된 서열의 발현은 당 분야에 공지의 프로모터/인헨서 서열에 의해 제어를 받는다. 삽입된 서열의 발현을 조절하는데 이용될 수 있는 프로모터는 동물 세포에서 발현을 시키기 위해서는 SV40 초가 프로모터 부분(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 로스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)의 3' 단부 긴 반복부위에 포함된 프로모터(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), 허피스 티미딘 카이나제 프로모터(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), 메탈티오닌 유전자의 조절 서열(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42)를 포함하나 이에 국한시키지 않고; 세균 세포에 발현을 시키기 위해서는 β-락탐메이즈의 프로모터(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25), λPL, 또는 trc를 포함하나 이에 국한시키지는 않고(참고;"Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94); 식물 세포에서 발현을 시키기 위해서는 노팔린 합성효소 프로모터 부위 또는 양배추 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871) 및 광합성 효소 리불로즈 이인산 카르복실라제의 프로모터(Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120)를 포함하나 이에 국한시키지 않고; Ga14 프로모터, ADC(알코올 탈수소효소) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 카아나제) 프로모터, 알칼리 포스파타제 프로모터와 같은 이스트 또는 다른 곰팡이의 프로모터를 이용할 수 있으나 이에 국한시키지는 않는다.
OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드 코딜 서열을 포함하는 발현 벡터는 세 가지 일반적인 방법으로 확인을 할 수 있는데; (a) 핵산 하이브리드 반응; (b) "표식" 유전자 기능의 유무; (c) 삽입된 서열의 발현. 첫 번째 방법에서, 발현 벡터에 삽입된 외부 유전자가 존재하는 지는 삽입된 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드 코딩 서열에 동종인 서열로 구성된 프로브를 이용하여 핵산 하이브리드 반응을 이용하여 감지할 수 있다. 두 번째 방법에서 벡터에 외부 유전자가 삽입됨으로 인하여 특정 "표식"유전자 기능(가령, 티미딘 카이나제 활성, 항생제에 저항성, 형질변환 표현형, 베큘로바이러스에 합체 형성 등)의 유무에 기초하여 재조합 벡터/숙주 시스템을 확인할 수 있다. 예를 들면, 벡터의 표식 유전자에 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드 코딩 서열이 삽입되면, 삽입체를 포함하는 재조합체는 표식 유전자 기능이 없는 것으로 확인할 수 있다. 세 번째 방법에서, 재조합체에 의해 발현된 외부 유전자 산물을 검사함으로써 재조합 발현 벡터를 확인할 수 있다. 이와 같은 검사는 예를 들면, in vitro 검사 시스템에서 OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드의 물리적 또는 기능적인 성질에 기초하는데 예를 들면, OMP106 리간드 또는 수용체에 결합 또는 본 발명의 항-OMP106 항체와 결합 또는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 의한 혈구응집반응을 간섭하는 세포 추출물의 능력등에 따라 확인할 수 있다.
일단, 특정 재조합 DNA 분자를 확인하고 분리하였으면, 당 분야에 공지인 몇 가지 방법을 이용하여 이를 증식시킨다. 적절한 숙주 시스템 및 생장 조건을 확립한 후에, 재조합 발현 벡터를 증식시키고 정량적으로 준비한다. 전술한 것과 같이, 이용되는 발현 벡터에는 다음을 포함하는데; 벡시니아 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 사람 또는 동물 바이러스; 베큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스; 박테리오파아지 벡터(람다) 및 플라스미드 및 코스미드 벡터등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
또한, 숙주 세포 균주는 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물의 발현을 조절하고 변형 및 프로세스하는 것에 따라 선택을 할 수 있다. 특정 프로모터의 발현은 특정 유도물질 존재 하에 평가하는데; 따라서, OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드의 발현을 조절할 수 있다. 또한, 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독후 처리과정 및 변형을 위한 특정 메카니즘을 가진다. 적절한 세포 주 또는 숙주 세스템은 발현될 외부 단백질의 원하는 변형 및 프로세싱을 할 수 있는 것에 따라 선택을 한다.
5.9. 시약
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 감염의 의학적인 진단 및 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 병인성, 독성, 감염성 그리고 숙주의 방어 기작 성질을 연구하는 과학적인 조사에 본 발명의 폴리펩티드, 펩티드, 항체 및 핵산을 시약으로 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 DNA 및 RNA를 프로브로 이용하여 PRC 증폭 또는 하이브리드 반응등으로 생물학적 시료에 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)가 있는 지를 확인한다. 또한 RNA 및 DNA를 이용하여 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) OMP106에 관련된 폴리펩티드를 인코드하는 다른 세균을 확인할 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드를 이용하여, 다클론성 및 단클론성 항체를 준비하고, 친화성 크로마토그래피에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 정제할 수 있다. 또한 폴리펩티드 및 펩티드를 표준 면역검사법에 이용하여 샘플에 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 대한 항체가 존재하는지를 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 기술을 특정 문제 또는 환경에 적용하는 문제는 당업자의 능력 범위내에서 결정할 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명의 산물의 예시와 이를 준비하고 이용하는 것은 다음의 실시예에 나타내었다.
6. 실시예 : ATCC 49143 또는 다른 균주로부터 OMP106 폴리펩티드와 이를 인코드하는 유전자의 분리 및 특징
6.1.재료 및 방법
6.1.1. 혈구응집반응 검사
Soto-Hernandez et al(J. Clin. Microbiol. 27:903-908)에 따른 방법을 이용하여 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 의한 혈구응집반응을 테스트하였는데, 단 3%대신에 5% v/v 적혈구세포를 슬라이드 혈구응집반응에 이용하였다. 20㎍ 세균세포(중량)를 이용하여 초기 혈구응집반응 검사를 실시하였다. 35℃에서 혈액 한천 플레이트에 생장한 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) ATCC 49143 균주는 강한 혈구응집반응을 제공하기 때문에 기준 균주로 선택을 하였다. ATCC 균주 49143을 연속하여 1:2 희석비로 희석하면 혈구응집반응이 감소되었다. 1:2로 희석한 후에 ATCC 균주 49143에서 관측된 혈구응집반응을 ++++에서 +까지로 기록하였는데 +반응은 +++반응을 얻는데 요구되는 세포 수의 ¼ 수준이 되는 반응이다.
6.1.2. 혈구응집반응의 저해
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) ATCC 49143 세포 현탁액을 1:2로 희석하고, 간단한 당과 당 유도체에 의해 혈구응집반응의 저해를 검사하는데 7㎕ Dulbecco 인산완충염과 7㎕ 5%(v/v) 사람 O+ 적혈구세포를 이용하였을 때, +혈구응집반응이 나타났다. 간단한 당 및 단 유도체가 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 의한 혈구응집반응을 방해하는지를 알아보기 위해, 500mM에서 주어진 당 7㎕을 7㎕ 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포와 혼합하여 5분간 배양하여 당이 세포와 상호작용을 할 수 있도록 하였다. 그 다음, 5%(v/v) 사람 O+ 적혈구세포 7㎕를 첨가하고, 1분후에 혈구응집반응을 기록하였다. 혈구응집반응을 저해하는 능력에 대해 각 당과 당 유도체를 테스트하였다. 그 다음 각 당과 당 유도체의 원액을 연속하여 1:2로 희석하고 이들 희석액을 전술한 과정에 따라 혈구응집반응을 저해하는 능력에 대해 테스트하였다. 이와 같은 방식으로 혈구응집반응을 방해하는데 요구되는 탄수화물의 최저 농도를 결정할 수 있다.
6.1.3. 리간드와 수용체 결합
숙주 세포 당지질의 TLC 분류 및 크로마토그램의 라벨된 세포를 올려놓아 동물의 세포 당지질 수용체에 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 결합을 테스트하였다(Magnani et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:14365-14369). 간략하면, Natreya Inc.(Pleasant Gap, PA)에서 수득한 당지질은 클로로포름, 메탄올, 물(5:4:1)에서 HPTLC(High Performance Thin Layer Chromatograph)에 용해시킨다. 플레이트는 100℃에서 오르시놀에 착색시키거나 또는 2시간동안 2 X 106 cpm/㎖에서 125I-라벨된 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 수포와 겹쳐놓는다(Murphy and Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174).
6.1.4. OMP의 OG 추출
4ℓ 플라스크에 Mueller Hinton 배지 1ℓ에 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주를 25℃, 200rpm에서 생장시킨다. 실온에서 30분간 인산 완충염(PBS)에서 1.25% n-옥틸β -D-글루코피라노시드(가령, 옥틸 글루코시드; OG) 0.67㎖로 50㎎ 세포(젖은 상태의 중량)를 처리하여 외측 막 단백질(OMP) 준비물을 분리하였다. 5분간 세포는 마이크로원심분리에 의해 펠렛화시키고, 상청액으로 옥틸 글루코시드 추출물로 이용하였다. 분별 원심분리에 의해 분리된 수포의 단백질 프로파일(가령, 외측 막 수포)[이때, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)으로터 외측 막 단백질(OMP)이 매우 많음]과 다수의 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주로부터 이와 같은 추출물의 단백질 프로파일을 비교하면, 옥틸 글리코시드 추출물에는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 외측 막 단백질이 상당히 포함되어 있다(도 1 참고)는 것을 알 수 있다(Murphy and Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174). 이는 옥틸 글리코시드 추출을 이용하면 수포에서 준비한 외측 막 단백질과 비교하였을 때, 더 신속하게 더 많은 양의 외측 막 단백질을 준비할 수 있다는 것을 알 수 있다.
6.1.5. OMP106의 단백질 분해
다음의 프로테아제를 이용하여 실온에서 1시간동안 1㎖ Dulbecco's 인산 완충염에 ATCC 49143 균주의 세포 50㎎을 처리한다; TLCK-처리된 키모트립신(5㎎); 프로테네이즈 K(5㎎), TLCK-처리된 트립신(5㎎) 또는 프로테아제 V8(100Units). 이용된 모든 프로테아제는 Sigma Chemicals(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 프로테아제 처리후에 바로, 세포는 PBS로 일단 세척을 하고, 1㎖ PBS에 현탁시켜, 혈구응집반응 활성을 테스트한다. 또한, 프로테아제-처리된 세균 세포는 옥틸 글리코시드로 추출하여, 외측 막 단백질을 용해시켜 프로테아제에 의해 절단될 수도 있는 특정 단백질을 확인한다.
6.1.6. 혈구응집반응을 하지 않는 배양체
정상적으로는, 혈구응집반응을 하는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 배양체는 35 내지 37℃, 200rpm, 24 내지 48시간동안 Mueller Hinton 배지를 포함하는 교반 플라스크에서 생장시킨다. 혈액 한천 플레이트 또는 Mueller Hinton 배지에서 취한 세포는 혈구응집반응을 하는 표현형을 발현한다. 혈구응집반응을 하지 않는 배양체를 선별하기 위해서는 ATCC 49143 균주를 35℃에서 Mueller Hinton 배지에서 생장시킨 정지 배양체에 매일 5일간 연속적으로 계대하였다. 각 계대에서 배양 배지의 표면에 있는 접종물을 취한다. 두 번째 계대를 하여, 세포 부유물을 발생시키고, 이 세포 매트를 이용하여 연속 배양을 위한 접종물로 이용한다. 이와 같은 방식으로 연속 배양을 하여 3대 계대후에 전형적인 ATCC 49143 NHA 배양체를 만들 수 있다.
6.1.7. OMP106 폴리펩티드의 분리
추출물을 5분단 100℃에서 배양시킨 후에 겔을 변성시켜, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) ATCC 49143의 외측 막 추출물에서 OMP106 폴리펩티드를 감지한다(실버 착색 또는 항-OMP106 항체). 100℃에 배양 후에 OMP106 밴드가 존재하는 것이 가열 동안에 적은 분자량의 단백질이 응집하여 생성된 것인지를 결정을 하기 위해, 또는 가열로 인하여 정상적으로 응집된 단백질이 겔로 들어가는지를 결정을 하기 위해, ATCC 49143의 가열 안한 옥틸 글리코시드 외측 막 단백질 추출물을 고유 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다. 샘플 바로 아래의 특정 겔 부분을 잘라내어 가열한다. 그 다음 생성된 샘플은 변성 폴리아크릴아미드 겔에 용해시키고, 실버 착색을 한다(Silver Stain Plus, Catalog number 161-0449, BioRad Laboratories, Rochmond, CA). N-단부를 서열화시키기 위해, ATCC 49143의 옥틸 글리코시드 외측 막 추출물은 SDS를 포함하는 PAGE 샘플 완충액과 혼합하고, 끓은 물에 5분간 둔다. 그 다음 단백질은 SDS를 포함하는 12%PAGE에 용해시키고, 전기블랏팅으로 PVDF 막으로 옮긴다. OMP106 밴드를 포함하는 막 부분은 아미노 단부를 서열화시키기 위해 절단해낸다. OMP106 폴리펩티드를 분리하는데 이용된 PAGE 과정에서 샘플 또는 겔 완충액에 환원제를 이용하지는 않았다.
6.1.8. 항-OMP106 항혈청
전술한 것과 같이(Lammeli, 1970, Nature 227:680-685), 변성 SDS 폴리아크릴아미드 겔에 ATCC 49143의 HA 배양체로부터 수득한 OMP106 폴리펩티드를 용해시켜 OMP106에 대한 항혈정을 준비하고, 겔에서 OMP106 폴리펩티드를 포함하는 부분을 잘라낸다. 잘라낸 밴드는 부드럽게하여, 토끼에 주사하여 OMP106 폴리펩티드에 대한 항혈청을 만든다. 항혈청을 이용하여 6.1.2에서 설명하는 혈구응집반응을 방해하는데 이때 탄수화물대신에 항혈청을 이용하는 것이다. 항혈청은 단락 7에서 설명하는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 대한 상보체-중개된 세포독성 활성에 대해 조사한다.
6.1.9. 항-OMP106 항혈청으로 웨스턴 블랏
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) ATCC 49143, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240, ATCC 25238, ATCC 8176; 모락셀라 오비스(Moraxella ovis) ATCC 33078; 모락셀라 라쿤타(Moraxella lacunata) ATCC 17967; 모락셀라 보비스( Moraxella bovis) ATCC 10900; 모락셀라 오슬로엔시스(Moraxella osloensis) ATCC 10973; 나이제리아 고노리에(Neisseria gonorrhoeae) 임상분리체; 나이제리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) ATCC 13077을 5% CO2에서 35℃, 48시간동안 초콜렛 한천 플레이트에 생장시킨다. 폴리스티렌 접종 루프를 이용하여 한천 표면으로부터 콜로니를 긁어내어 세포를 제거한다. 그 다음 세포는 PAGE 샘플 완충액(360mM 트리스 완충액[pH 8.8], 4% SDS, 20% 글리세롤을 포함) 150㎕에 세포 30㎍을 현탁시켜 용해시킨다. 용해된 세포는 Laemmli의 방법에 따라 12% 폴리아크릴아미드 겔에 용해시키고, 분리된 단백질은 전술한 것과 같이(Thebaine et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354), 1.5시간동안 100V에서 PVDF 막으로 전기천공방식으로 이동시킨다. 단, 이때 0.05% SDS를 이동 완충액에 첨가하여 겔로부터 단백질이 이동할 수 있도록 한다. 그 다음 PVDF 막은 25㎖ Dulbecco's 인산 완충염(0.5% 카제인 나트륨, 0.5% th 혈청 알부민, 1% 염소 혈청을 포함)으로 선처리한다. 모든 연속적인 배양에서는 이 선처리 완충액을 이용하여 실시한다.
PVDF 막은 실온에서 1시간동안 OMP106 폴리펩티드로 면역화시킨 토끼(상기 설명을 참고)의 혈청 또는 선면역 토끼 혈청의 1:500 희석물 25㎖으로 배양한다. 그 다음 PVDF 막은 세척 완충액(150mM 염화나트륨, 0.05% 트윈-20을 포함하는 20mM 트리스 완충액[pH 7.5])으로 2회 세척을 한다. PVDF 막은 1:500 희석된 퍼옥시다제-라벨된 염소 항-토끼 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove Penn. Catalog number 111-035-003)로 실온에서 30분간 배양한다. 그 다음 PVDF 막은 세척 완충액으로 4회 세척을 하고, Sigma Chemical Co(St. Louis, Mo. catalog number D-4418)에서 공급하는 과산화요소와 3.3' 다아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드로 각 4분간 현상을 한다.
6.1.10. 세포 표면의 항-OMP106 면역형광 착색
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) ATCC 49143는 교반하는 수조에 Mueller Hinton 배지상에서 35℃ 하룻밤동안 생장시킨다. 세포는 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 그 다음 칼슘 또는 마그네슘이 포함 안된 Dulbecco 변형된 인산완충염(PBS/MC) 동량으로 재현탁시킨다. 세포 현택액 20㎕를 5개의 깨끗한 현미경 슬라이드에 각 얹고, 10초간 세팅후에, 과량의 유체는 마이크로피펫으로 제거하고, 슬라이드는 1시간동안 대기 건조시킨다. 그 다음 슬라이드는 유리를 손으로 만질 경우에 따스하다는 느낌이 있을 때까지 개방 불꽃으로 열 고정한다. 슬라이드는 우선 PBS/MC, PBS/MC에 희석한 동일 동물의 항-OMP106 항혈청 또는 선면역 혈청 1:40 희석한 40㎕로 10분간 처리하고 그 다음 PBS/MC로 5회 세척한다. 슬라이드는 토끼 IgG에 대한 형광 이소시아네이트-라벨된 염소 항체 5㎍/ (PBS/MC)㎖ 40㎕fh 처리한다(Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc, Gaithersburg, MD catalog number 02-15-06). 슬라이드는 암상태에서 10분간 두고, PBS/MC로 5회 세척을 한다. 각 슬라이드는 덮개 슬라이드로 덮어 보관을 하고, 489㎚ 필터로 고정된 형광현미경으로 관찰한다. 각 샘플에서 착색 정도를 평가하기 위해 5-field view로 검사를 한다.
6.2.1. 결과
6.2.1. 혈구응집반응 활성
적혈구 세포에 대한 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 혈구응집반응 활성은 사람 적혈구세포에서 가장 강력한 활성을 가지는 종-특이적인 활성이다. 토끼 적혈구 세포 또한, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 의해 혈구응집반응을 하나 사람 세포보다는 그 활성이 상당히 적다. 쥐, 말 또는 양의 적혈수세포에서는 응집이 일어나지 않는다(표 1 참고).
[표 1]
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) ATCC 49143을 이용한 대양한 종에서의 적혈구 세포의 혈구응집반응 강도
6.2.2. OMP106 수용체와 리간드
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 혈구응집반응 활성은 글로보테트로즈(Gb4)에 결합하는 것 때문이다. 혈구응집반응을 하는 균주의 수포는 Gb4를 가지는 당지질에 결합을 하나, 혈구응집반응을 하지 않는 균주는 동일한 당지질에 결합을 하지 않는다.(표 2 참고). 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 혈구응집반응 활성은 Gb4의 단당류 구성체 또는 이와 같은 단당류의 유도체에 의해 방해를 받는데 가장 강력한 방해는 N-아세틸 갈락토사민과 갈락토즈(특히 갈락토즈의 α 아노머)가 가장 강한 저해물질이다.
[표 2]
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)에 의한 혈구응집반응을 저해하는데 필요한 당의 최소 농도
N-아세틸 갈락토사민과 알파-갈락토즈는 모두 Gb4 테트라사카로즈의 일부분이다. Gb4 에 대한 결합과 혈구응집반응 사이에 상관관계와 혈구응집반응이 Gb4 수용체로 구성된 단당류에 의해 방해를 받는 지에 대한 관측으로 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포가 테트라사카로즈 Gb4에 결합을 한다는 것을 나타낸다. 이와 같은 테트라사카로즈가 사람 적혈구세포와 조직에 있으며, 적혈구 막에 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)가 흡착하는 것을 중개한다는 것을 알 수 있다.
6.2.3. OMP106 폴리펩티드의 확인
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포의 단백질 분해, 및 분해된 세포에 의한 혈구응집반응의 연속적인 분석으로 키모트립신과 프로테네이즈 K와 같이 단백질 분해 처리를 하면, 혈구응집반응의 활성이 파괴되고 그리고 트립신으로 처리를 하면 혈구응집반응의 활성이 부분적으로 파괴되는데 이는 혈구응집반응 활성이 단백질에 의해 중개된다는 것을 나타낸다. 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포의 단백질분해효소 처리된 OMP106 단백질 프로파일분석을 통하여 각 샘플에 다수의 단백질이 분해되었음을 나타내고, 따라서 프로파일은 단백질이 혈구응집반응 활성이 직접 또는 간접적으로 기여하는 열쇠를 제공하는 것이다(도 3).
프로테아제로 처리하면 폴리펩티드가 혈구응집반응 활성에 직접 또는 간접적으로 관여를 하기 때문에, SDS-PAGE를 이용하여 혈구응집반응을 하는 균주의 프로파일과 혈구응집반응을 하지 않는 균주의 프로파일을 비교한다(도 4). 이들 프로파일간에 차이를 분석하면 혈구응집반응 균주는 두 가지 독특한 폴리펩티드를 가지는데 한 개는 표면 분자량이 27kD(OMP27로 지정)이고, 다른 한 개는 표면 분자량이 106kD(OMP106로 지정)을 가지는 단백질이다. 분명한 것은 OMP106 폴리펩티드는 다양한 프로테아제 처리된 혈구응집반응 활성이 감소된 또는 활성이 없는 세포의 OMP106 준비물에는 없고, 반면에 OMP27 밴드는 혈구응집반응 활성이 없는 프로테나제 K 처리된 OMP 준비물에는 존재한다. 또한, OMP106 폴리펩티드는 프로테나제 V8 처리에 의해서는 영향을 받지 않는데 이는 처리된 세포의 혈구응집반응 활성이 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다.
6.2.4. NHA 배양체의 OMP 프로파일
35℃에서 정지 배양물에 있는 NHA 배양체 ATCC 49143를 연속적으로 배양하면 배양물의 3대 계대에 의해 NHA(49143-NHA로 지정)가 생산된다. 이의 혈구응집반응 활성의 손실은 반복적이다. HA와 NHA 배양체의 OG 외측 막 추출물의 OMP 프로파일에서는 49143-NHA 추출물에서 OMP106 폴리펩티드 밴드가 유실되었음을 나타낸다(도 5). 이는 OMP106 폴리펩티드가 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 헤마글루티닌(가령, OMP106 폴리펩티드는 Gb4 수용체에 결합되거나 또는 Gb4 수용체에 결합을 하는 동종고분자 단백질의 서브유닛) 또는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 헤마글루티닌의 일부를 형성한다(이는 OMP106 폴리펩티드가 Gb4 수용체에 결합을 하는 이종고분자 단백질의 서브유닛이다)
6.2.5. OMP106와 헤마글루티닌
ATCC 49143 OMP106 폴리펩티드에 대해 발생된 다클론 항혈청은 ATCC 49143와 ATCC 43627의 헤마글루티닌을 중화시킨다. 또한 이는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 혈구응집반응 활성이 OMP106 폴리펩티드로 구성된다는 것과 OMP106 폴리펩티드가 이들 균주간에 항원성으로 보존된다는 결론을 뒷받침한다. 도 9a를 참고로 하는데 다클론성 항혈청에 있는 항체는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주의 OMP106 폴리펩티드에 결합을 한다는 것을 보여준다.
6.2.6. OMP106의 외측 표면 위치
토끼 항-OMP106 항혈청을 간접 면역형광 착색에 이용하여, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주의 외측 표면에 OMP106 폴리펩티드가 노출되어 있는지를 결정을 한다. 항-OMP106 항혈청으로 처리한 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포는 프레이뮨 혈청 또는 PBS/MC으로 처리한 세포보다 더 강하게 균질하게 착색한다. 이는 고유 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주에서 OMP106 폴리펩티드가 항-OMP106 항체와 반응한다는 것을 나타낸다. 이 결과는 OMP106 폴리펩티드가 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)의 외측 표면에 노출된다는 것을 나타낸다. 이와 같은 발견은 OMP106 폴리펩티드가 혈구응집반응에 주요 역할을 한다는 것과 일치하고 또한 OMP106 폴리펩티드가 백신으로 유용하다는 것을 나타낸다.
6.2.7. OMP106 폴리펩티드의 수용체
OMP106 폴리펩티드는 고유상태에서 큰 단백질 복합체로 존재를 하거나 옥틸 글루코즈로 추출하였을 때 응집된다. 옥틸 글루코즈로 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 세포를 추출하면 OMP106 폴리펩티드를 용해시키나 추출된 OMP106 폴리펩티드는 추출물을 우선 100℃에 배양하지 않는 한 변성 PAGEs에 들어가지 않는다는 것으로 이를 뒷받침한다(도 6). 또한, OMP106 폴리펩티드 밴드는 가열시에 중합되거나 응집된 분자량이 적은 폴리펩티드에서는 나타나지 않는데, 그 이유는 열변성 안된 샘플에 있는 OMP106-폴리펩티드는 샘플 웰에 갇혀있고 샘플을 100℃에 우선 배양한다면 용해 겔에 들어가지 때문이다. 이와 같은 생화학적 성질은 다양한 겔에서 OMP106 폴리펩티드를 확인하는데 유용하다.
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)를 옥틸 글루코즈 추출하고, 추출물을 100℃에서 SDS로 배양하고, 변성 폴리아크릴아미드 겔에 용해시켜 다양한 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 가령, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628로부터 수득한 OMP106 폴리펩티드의 표면 분자량 평가하였는데 분자량의 범위가 약 180kD부터 약 230kD(도 9a)이고, 반면에 ATCC 균주 49143의 OMP106 폴리펩티드는 표면 분자량이 약 190kD인 것으로 나타났다(도 6).
ATCC 49143의 OMP106 폴리펩티드를 겔 절단물에서 추출하고 이의 N-단부의 서열을 결정하였다. 서열에서는 ATCC 49143의 OMP106 폴리펩티드의 N단부 서열은 서열 1로 나타났다. 또한, Lys-C 처리하여 OMP106 폴리펩티드의 내부 서열(Fernandez et al., 1994, Anal Biochem 218:112-117)을 확인하였다(서열 2).
세 가지 올리고뉴클레오티드 프로브를 만든다. 두 개의 프로브는 내부 펩티드(서열 2)에 상응하고; 한 개는 서열 3을 가지고; 다른 한 개는 서열 7을 가진다. 또 다른 프로브는 Mc 5-72로 OMP106의 아미노 단부 서열(서열 1)의 내부 단부를 인코드하는 것으로 서열 4를 가진다. 각 경우에 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) DNA의 완전한 HindIII 또는 DraI 절단물에 대해 Mc 5-72 프로브를 하이브리드하면, 서든 블랏 분석에서 단일 밴드를 만든다(도 7). HindIII 절단체에 있는 하이브리드 밴드는 약 크기가 8.0kb 이고, DraI 절단체에 있는 하이브리드 밴드 약 크기가 4.2kb이다(도 7).
6.2.8. OMP106 폴리펩티드의 보존
모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 다수 균주와 관련 종에서 외측 막 단백질 추출물의 웨스턴 블랏 분석에서는 항-OMP106 항체가 많은 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주, HA와 NHA 균주 또는 배양체에서 약 180kD 내지 약 230kD의 폴리펩티드에 결합을 한다는 것을 알 수 있다(도 9a). 항-OMP106 항체는 관련 세균의 단백질 추출물에 있는 임의 폴리펩티드에 결합을 하지 않는다(도 8a). 이와 같은 결과는 다음과 같이 설명한다; 1) 항-OMP106 폴리펩티드는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주를 확인하고 관련 세균 종으로부터 이를 구별할 수 있게 한다. 2) OMP106 폴리펩티드를 이용하면 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 확인을 위한 진단분야에 이용할 수 있는 항체를 만들 수 있다. 3) 한 균주(ATCC 49143)의 OMP106 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 다른 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주에서 이에 상응하는 OMP106 폴리펩티드를 확인 및 분리할 수 있다. 흥미롭게는, 웨스턴 블랏 결과로 많은 NHA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주가 이의 외측 막의 OG 추출물에 OMP106 폴리펩티드를 가진다는 것을 알 수 있다. 이와 같은 발견과 PAGE 후에 180kD 내지 230kD 범위에서 밴드가 나타나지 않으면 NHA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주의 OG 외측막 추출물의 OMP106를 실버 착생을 한 결과에서는 OMP106 폴리펩티드가 대부분의 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 또는 이의 배양체에서 발현되나 OMP106 폴리펩티드는 적절한 방식으로 변형된다는 것을 알 수 있다. 이는 혈구응집반응(가령, 포유류 세포 표면에 있는 수용체에 결합을 하는 것) 또는 실버 착색에서 반응을 하기 위해서이다. 분명한 것은 HA 균주와 배양체만이 OMP106 폴리펩티드를 변형시킬 수 있어 이는 포유류 세포 표면에 있는 혈구응집반응 수용체에 세균이 결합할 수 있도록 하는 것이다.
7. 실시예; OMP106 백신의 효과; 항-OMP106 항혈청의 세포 독성 활성
OMP106 폴리펩티드의 백신 활성을 평가하기 위해 상보체-중개된 항-OMP106 항체의 세포 독성 활성을 검사한다. ATCC 49143의 HA 배양체의 OMP106 폴리펩티드에 대한 항혈청을 6.1.8에 상술된 방식으로 준비한다. "혈청 살균 테스트"(Immune Responses to Neiserria meningitis, in Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3rd ed., pg 347-349)의 방법에 따라 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주의 상보체 중개된 치사에 항-OMP106 혈청과 프레-이뮨 혈청의 활성을 검사하였는데 단, 나이제리라 메닝지티스(Neiserria meningitis) 세포 대신에 HA와 NHA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주를 이용하였다.
결과에 따르면 이종 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) ATCC 43627의 HA 배양체는 항-OMP106 항혈청 중개되어 세포를 죽이나 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) ATCC 43627의 NHA 배양체 또는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) ATCC 8176의 NHA 배양체에서는 독성 활성이 없다. 표3에서는 ATCC 43627 HA 배양체에 대한 프레-이뮨 혈청과 항-OMP106 항혈청의 상보체-중개된 세포독성 활성을 요약한 것이다.
[표 3]
프레-이뮨 혈청과 항-OMP106 항혈청의 상보체 중개된 세포독성 활성
표 3에서 나타낸 것과 같이, 항-OMP106 항혈청은 프레-이뮨 혈청보다 8배 더 큰 세포 독성 활성을 가진다. 이와 같은 발견은 OMP106 폴리펩티드가 HA 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주 및 배양체의 백신으로 유용하다는 것을 나타낸다.
본 발명은 비록 구체예로 설명을 하고 있으나 본 발명의 범위내에서 다양한 변화가 가능함을 인지할 것이다. 또한, 여기에서 설명하는 것에 추가하여 다양한 변화도 전술한 설명 범위에 속한다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 변화도 본 발명의 범위에 속한다.
명세서에 언급한 문헌을 여기에 첨부한다.
Claims (23)
- 모락셀라 카타르할리스의 외측 막 단백질이고 토끼 골근육 미오신과 대장균 β-갈락토시디아제를 각각 200kD와 116.25kD 분자량 표준으로 활용한 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과에 따르면, 180kD~230kD 분자량을 보유하고 Seq ID No.1 또는 2, 또는 Seq ID No.1 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 인지되는 Seq ID No. 1에 80%이상 상동한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 OMP 106 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 서열 및 SEQ ID NO:2 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 OMP106 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 분자량이 190kD인 것을 특징으로 하는 OMP106 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주의 외측 막 폴리펩티드는 ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628, ATCC 49143에서 선택된 것을 특징으로 하는 OMP106 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 균주는 ATCC 49143인 것을 특징으로 하는 OMP106 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis)는 혈구응집반응 배양체인 것을 특징으로 하는 OMP106 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 실버 착색 반응을 하는 것을 특징으로 하는 OMP106 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 서열과 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 OMP106 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 서열 및 SEQ ID NO:2 서열과 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 OMP106 폴리펩티드.
- 제 1항 내지 9항중 어느 항에 따른 OMP106 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
- 제 10항에 있어서, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhlis) 치사를 중개하는 세포독성 항체인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
- 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 OMP106 폴리펩티드의 펩티드에 있어서, OMP106 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩티드 단편.
- 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 OMP106 폴리펩티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 OMP106 폴리펩티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 항원 조성물.
- 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 OMP106 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA.
- SEQ ID NO:1의 펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA.
- OMP106 폴리펩티드 또는 OMP106-유도 폴리펩티드를 인코드하는 분리된 DNA에 있어서, DNA는 스트린젼트(strigent) 조건하에서 SEQ ID NO:4 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA.
- 제 16항에 있어서, SEQ ID NO:4 서열 또는 이의 상보적 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리 DNA.
- 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 있어서, 모락셀라 카타르할리스(M. cartarrhlis) 감염의 치료 또는 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는 OMP106 폴리펩티드.
- 제 10항에 있어서, 모락셀라 카타르할리스(M. catarrhlis) 감염의 치료 또는 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
- 제 12항에 있어서, 모락셀라 카타르할리스(M. catarrhlis) 감염의 치료 또는 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는 펩티드 단편.
- 제 15항 또는 16항에 있어서, 모락셀라 카타르할리스(M. catarrhlis) 감염의 확인 또는 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 DNA.
- 제 17 항에 따른 분리된 DNA에 의해 인코드된 분리된 OMP106 폴리펩티드, 또는 OMP106-유도된 폴리펩티드.
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