CZ352498A3 - Vnější embránový protein-106 polypeptid, sekvence genu, protilátka a vakcína - Google Patents

Description

Oblast techniky

Ί 5 Předkládaný vynález se obecně týká polypeptidu vnějšího membránového proteinu-106 (OMP106, outer membrane protein) z mikroorganizmu Moraxella catarrhalis. Vynález zahrnuje purifikovaný polypeptid OMP106 a polypeptidy zněj odvozené (OMP106-odvozené polypeptidy). Vynález též zahrnuje protilátky, včetně cytotoxických, které se specificky vážou k polypeptidu

QMP106 a/nebo k OMP1Q6-odvozeným polypeptidům. Vynález dále_

--za h rn u j e—p rofy I a kt i cké n ebotěrape u t i cké p rošt řed ky, včet n ě va kc ί η, které obsahují polypeptid OMP106 a/nebo OMP106-odvozené polypeptidy. Vynález dále poskytuje způsoby navození imunitní odpovědi na M. catarrhalis u savců. Vynález dále poskytuje izolované nukleotidové sekvence kódující polypeptid OMP106 a OMP106odvozené polypeptidy, vektory obsahující uvedené sekvence a hostitelské buňky obsahující uvedené vektory.

2. Dosavadní stav techniky

Moraxella catarrhalis, rovněž známá jako Moraxella

- (Branhamella)catarrhalis -- neboBranhamella catarrhalis ^a a dříve známá jako Neisseria catarrhalis nebo Micrococcus catarrhalis, je gramnegativní baktérie, často se vyskytující v dýchacím traktu lidí. O

M. catarrhalis, původně považované za neškodný symbiotický organizmus, se nyní ví, že je důležitým patogenem způsobujícím u zvířat infekce horních a dolních dýchacích cest. U lidí M. catarrhalis způsobuje vážné infekce dolních cest dýchacích u dospělých • · · · • · ·

s chronickými plicními chorobami, systémové infekce u pacientů s oslabenou imunitou, a zánět středního ucha a zánět dutin u kojenců a dětí. Viz Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Catlin.B.W., 1990, Clin.Microbiol.Rev. 3: 293-320; a odkazy zde citované.

2.1. VNĚJŠÍ MEMBRÁNOVÉ PROTEINY A OCHRANNÉ PROTILÁTKY

K pochopení patogenního procesu při infekcích bakterií io Moraxella catarrhalis a pro vyvinutí užitečných terapeutických postupů a profylaktických opatření proti těmto infekcím, byly studovány složky vnějšího povrchu M. catarrhalis. Zvláštní pozornost byla věnována

-vnějším—membránovým^-proteinOm^OMPyoTJterTneTrrbTarie^-protělK)?

jakožto možným faktorům virulence a potenciálním vakcinačním is antigenům. M. catarrhalis má asi 10 až 20 různých proteinů OMP, přičemž 6 až 8 z nich, proteiny OMP A až H představují převládající typ (Murphy a Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174). Molekulové hmotnosti proteinů OMP A až H se pohybují v rozmezí od 97 do 20 kDa. Viz Bartoš a Murphy, 1988, J Infect.Dis. 158:761-765;

Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Murphy et al., 1993, Molecul. Microbiol. 10:87-97; Sarwar et al., 1992, Infect. Immun. 60:804-809. Srovnání proteinů v preparátech vnějších membrán z 50 kmenů M. catarrhalis pomocí elektroforesy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) ukazuje téměř shodné profily proteinů OMP A až H (Bartoš a Murphy, 1988, J Infect.Dis. 158:761-765).

Vedle proteinů OMP A až H byl v mnoha kmenech M. catarrhalis pozorován jako další významná složka povrchu též OMP o vysoké molekulové hmotnosti, označovaný jako HMW-OMP, mající

3o podle SDS-PAGE zdánlivou velikost 350 až 720 kDa. Po denaturaci kyselinou mravenčí poskytuje HMW-OMP v elektroforese jediný pruh

o velikosti 120 až 140 kDa, takže se patrně jedná o oligomerní protein (Klingman a Murphy, 1994, Infect. Immun. 62:1150-1155). HMW-OMP je zřejmě totožný s proteinem UspA, který takto označil Helminen et al. (1994, J. Infect. Dis. 170:867-872) a který byl prokázán u řady kmenů

M. catarrhalis.

Na povrchu intaktních bakterií nebo vezikulů vytvořených z ? vnější bakteriální membány jsou přístupné epitopy několika výše uvedených proteinů OMP, které mohou vyvolat tvorbu protilátek ťschopných vazby k proteinům OMP. Mezi tyto antigenní proteiny OMP io patří OMP E a OMP G (Murphy a Bartoš, 1989, Infect. Immun.

57:2938-2941); OMP C/D (Sarwar et al., 1992, Infect. Immun. 60:804809); CopB, 80 kDa OMP, (Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010); a UspA (Helminen et al., 1994, J. Infect. Dis. 170:867...................- . -872)......... ............................................................. ......................-............... —

Terapeutický potenciál protilátek proti povrchově přístupným epitopům proteinů CopB a UspA byl studován na zvířecím modelu. Plíce myší kmene Balb/c VAF/Plus byly přímo jednorázově inokulovány regulovaným počtem buněk M. catarrhalis a poté byla sledována rychlost vymizení bakterií v plicích (Unhanand et al., 1992,

J. Infect. Dis. 165:644-650). Různé klinické izoláty M. catarrhalis vykazovaly různé rychlosti vymizení, jež korelovaly s hladinou akumulace granulocytů v místě infekce. Pasivní imunizace & monoklonální protilátkou namířenou proti povrchově přístupnému epitopu CopB nebo UspA zvýšila rychlost vymizení M. catarrhalis ' 25 vplicích (Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010;

Helminen et aJ., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).

- 4 2.2. ADHERENCE BAKTERIE / HOSTITELSKÁ BUŇKA A HEMAGLUTINACE

Adherence bakteriálních patogenů k povrchu hostitelské buňky podporuje kolonizaci a zahajuje patogenezi. Viz Ε H Beachey, 1981, J. Infect. Dis. 143:325-345. Gramnegativní bakterie typicky exprimují povrchové lektiny, které se vážou k specifickým oligosacharidům glykoproteinů a/nebo glykolipidů na povrchu hostitelské buňky. Tyto lektiny jsou často asociovány s pili a fimbriemi. Bakteriální adherence může být též způsobena nespecifickou hydrofobní a/nebo nábojem zprostředkovanou interakcí s povrchem hostitelské buňky.

Mechanizmus adherence M. catarrhalis k buňkám dýchacího traktu není přesně znám. Bakterie se přichytávají na lidské orofar-yngální-epitelové-buňky—v-kultuře-(-Mbaki-et-al-.-₎_1-9B.7,Jr_oh.uku_J... Exp. Med. 153:111-121). V adherenci k těmto buňkám mohou hráfrofi fimbrie, neboť denaturací fimbrií nebo účinkem protilátek namířených proti fimbriím lze snížit adherenci kmenů majících fimbrie (Rikitomi et al., 1991, Scand. J. Infect. Dis. 23:559-567). Vazba zprostředkovaná fimbriemi však nemůže být jediná zodpovědná za tuto adherenci, protože z několika studovaných kmenů se nejvíce vázal kmen bez fimbrií.

Pro klasifikaci bakteriálních adhesinů se často používají hemaglutinační reakce namísto komplikovanějších testů adherence. Rikitomi et al. však nenalezli u kmenů M. catarrhalis žádnou korelaci mezi adherenci k lidským orofaryngálním epitelovým buňkám a hemaglutinací (tamtéž). To jest, tři vysoce adherující kmeny neaglutinovaly lidské erytrocyty. Při adherenci k lidským orofaryngálním epitelovým buňkám a při hemaglutinací se tedy uplatňují rozdílné vazebné mechanizmy.

Naproti tomu Kellens et al. v nedávné studii dokládají, že hemaglutinace bakteriemi M. catarrhalis koreluje s adherenci

- 5 k hostitelským buňkám (Kellens et al., 1995, Infection 23:37-41). Jako testu adherence však byla v této práci použita vazba bakterií k prasečím tracheálním řezům. Není jasné, zda prasečí tracheální tkáň lze považovat za homologní s tkání lidského dýchacího traktu, co se týká adherence patogenních kmenů M. catarrhalis.

Nehledě na problematický adherenční test, Kellens et al.

’ vyšetřili hemaglutinační aktivitu více jak osmdesáti klinických izolátů

M. catarrhalis (Kellens et al., 1995, Infection 23:37-41). Téměř tři čtvrtiny zkoumaných kmenů aglutinovaly lidské, králičí, morčecí, psí io nebo krysí erytrocyty, zatímco zbývající kmeny neaglutinovaly.

Aglutinační aktivita některých hemaglutinujících kmenů byla dále charakterizována a bylo prokázáno, že je závislá na vápenatých iontech a že je inhibována tryptickým štěpením nebo působením —-------vysoké teploty nebo přidáním D-glukosaminu ne!5o~D-galaktosamirnj:

V přehledu hemaglutinujících a nehemaglutinujících kmenů M.

catarrhalis uvádí Tucker et al., že všechny kmeny vážou glykolipid gangliotetraosylceramid, ale pouze hemaglutinující kmeny vážou glykolipid globotetraosylceramid (Tucker et al., 1994, Annal Meeting of Amer. Soc. Microbiol., Abstract No. D124). Kromě toho bylo prokázáno, že hemaglutinační aktivita M. catarrhalis je inhibována různými monosacharidy, které jsou součástí cukerného zbytku globotetraosylceramidu. Tyto nálezy vedly Tuckera et al. k závěru, že > M. catarrhalis hemaglutinuje tím, že se váže ke globotetraosylceramidům v buněčné membráně vhodných erytrocytů, . . 25 včetně lidských červených krvinek. _ Žádné dosavadní výzkumy neidentifikovaly nějakou molekulu na vnějším povrchu M. catarrhalis, jež by byla zodpovědná za adherenci k hostitelské buňce nebo za hemaglutinaci.

Uvedení citace nebo odkazu v této části nebo v kterékoli jiné části této přihlášky nemá být rozuměno tak, že takovýto odkaz znamená dostupnost poznatků před tímto vynálezem.

3. Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká polypeptidu OMP106 z M. catarrhalis a polypeptidu z OMP106 odvozených a způsobů výroby uvedených polypeptidů. Vynález se též týká antisér a protilátek, včetně cytotoxických protilátek, specifických pro polypeptid OMP106 a/nebo OMP106-odvozené polypeptidy. Vynález se dále týká imunogenních, profylaktických nebo terapeutických prostředků, včetně vakcín, obsahujících jeden nebo více uvedených polypeptidů. Vynález se dále týká nukleotidových sekvencí, které kódují uvedené ío polypeptidy. Dále se vynález týká imunogenních, profylaktických nebo terapeutických prostředků, včetně vakcín, které obsahují atenuovaný nebo inaktivovaný nehemaglutinující kultivar M. catarrhalis.

_Předkládaný vynález má mnohá využití. Například, polypeptid

-OMP106 a—OMP106-odvozené polypeptidy mohou být použity jako ligandy k detekci protilátek vytvořených jako odpověď na infekce M. catarrhalis (např. v diagnostice infekcí M. catarrhalis). Polypeptid OMP106 a OMP106-odvozené polypeptidy též mohou být použity jako imunogeny pro vyvolání tvorby protilátek specifických k M. catarrhalis. Takovéto protilátky jsou užitečné pro imunologická stanovení M. catarrhalis v biologických vzorcích. Cytotoxické protilátky podle vynálezu jsou užitečné pro pasivní imunizaci proti infekcím M. catarrhalis. Polypeptid OMP106 a OMP106-odvozené polypeptidy mohou dále být použity jako aktivní součásti vakcín proti infekcím M. catarrhalis.

257 ” Vynález vychází z překvapujícího objevu, že hemaglutinující kmeny a kultivary M. catarrhalis mají vnější membránový protein, OMP106, který má molekulovou hmotnost asi 180 až 230 kDa, a že nehemaglutinující kmeny a kultivary M. catarrhalis buď nemají polypeptid OMP106, nebo mají OMP106 nevhodně modifikovaný tak, že je neaktivní v hemaglutinaci a není barvitelný stříbrem. Vynález dále vychází z objevu, že polyklonální antisérum indukované ····

- 7 polypeptidem OMP106, který byl izolován z hemaglutinujícho kmene

M. catarrhalis, má cytotoxickou aktivitu proti jinému hemaglutinujícímu kmeni M. catarrhalis, nikoli však proti nehemaglutinujícímu kmeni M.

catarrhalis.

3.1. DEFINICE A ZKRATKY

anti-OMP106	= protilátka nebo antisérum proti polypeptidu OMP106
ATCC	= American Type Culture Collection (sbírka kmenů)
měchýřky (blebs)	= přirozeně se vyskytující vezikuly vnější membrány u M. catarrhalis
Gb4	- GalNAcp1-3Gala1-4Galp1-4GI cl -1 Ce ra m id
HA	= hemaglutinující
imunoreaktivní	= schopný vyvolat buněčnou nebo humorální imunitní odpověď
kDa	= kilodaltony
M. catarrhalis	= Mc’, Moraxella catarrhalis Moraxella (Branhamella) catarrhalis’, Branhamella catarrhalis’, Neisseria catarrhalis·, nebo
	“ - Micrococcus catarrhalis - - „„
NHA	= nehemaglutinující
OG	= n-oktyl-p-D-glukopyranosid nebo oktylglukosid
OMP106	= polypeptid vnějšího membránového proteinu-106 z Moraxella catarrhalis mající

podle SDS-PAGE molekulovou hmotnost asi 180 až 230 kDa; extrahovatelný z měchýřků nebo intaktních buněk M. catarrhalis pomocí detergentu OG nebo sarkosylu

OMP106-odvozený = fragment polypeptidu OMP106; varianta polypeptid OMP106 divokého typu nebo její fragment, mající jednu nebo více aminokyselinových delecí, insercí nebo záměn; nebo chimérní protein obsahující heterologní polypeptid fúzovaný k C-koncovému nebo Nkoncovému nebo vnitřnímu segmentu celého polypeptidu OMP106 nebo jeho části

OMP = vnější membránový protein

PBS

PAG polypeptid

SDS

SDS-PAGE = foÁfálenTpIjfřovany fyziologický roztok = polyakrylamidový gel = peptid libovolné délky, s výhodou takový, který má deset nebo více aminokyselinových zbytků = dodecylsulfát sodný = elektroforesa v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného . , Sekvence nukleotidů nebo nukleových kyselin zde uvedených jsou vyjádřeny pomocí níže uvedených jednopísmenových symbolů pro nukleotidové báze;

A (adenin) C (cytosin) G (guanin) T (thymin)

U (uráčil)

M (A nebo C)

R (A nebo G)

W (A nebo T/U)

S (C nebo G)

Y (C nebo T/U)

K (G nebo T/U)

V (A nebo C nebo G; ne T/U)

H (A nebo C nebo T/U; ne G)

D (A nebo G nebo T/U; ne C)

B (C nebo G nebo T/U; ne A)

N (A nebo C nebo G nebo T/U) nebo (neznámý) ~ --P ep t i do vé—apolypepti d o vé—s e kve n ce—zde—uvedené—jsou vyjádřené pomocí jednopísmenových symbolů pro aminokyselinové zbytky:

A (alanin)

R (arginin)

N (asparagin)

2o D (kyselina asparagová)

C (cystein)

Q (glutamin)

E (kyselina glutamová)

G (glycin)

H (histidin) , . .......

I (isoleucin)

L (leucin)

K (lysin)

M (methionin)

F (fenylalanin)

P (prolin) ·· *· ·· ·· ·· ····· • · · · · · « · · _ 1 Π - · · ·· · ·· ······

I ν < · ··«· · · ··· ··· ·· ·· *· *·

S (šeřin)

Τ (threonin)

W (tryptofan)

Υ (tyrosin)

V (valin)

X (neznámý)

Lepšímu pochopení předkládaného vynálezu může napomoci následující podrobný popis, nijak neomezující příklady konkrétních provedení vynálezu a připojené obrázky.

4. Stručný popis obrázků

Obr. 1: Srovnání elektroforetických profilů vnějších membránových proteinů z měchýřků M. catarrhalis nebo oktylglukosidových (OG) extraktů celých buněk M. catarrhalis v denaturující PAGE. Čísla nad jednotlivými dráhami odkazují na označení kmenů ve sbírce ATCC. Jako markérů molekulových hmotností byla použita směs předbarvených SDS-PAGE standardů (BioRad, katalogové # 1610305). Standardy obsahovaly následující polypeptidy (přibližná molekulová hmotnost je uvedena v závorkách): fosforylasa B králičího svalu (106 kDa); hovězí sérum albumin (80 kDa); ovalbumin slepičího bílku (49,5 kDa); hovězí anhydrasa kyseliny uhličité (32,5 kDa); sojový inhibitor trypsinu (27,5 kDa); lysozym slepičího vaječného bílku (18,5kDa). Pozice odpovídající na gelu markérům molekulových hmotností jsou označeny šipkami na levé straně obrázku, přičemž pro některé markéry je nad šipkou uvedena molekulová hmotnost v kDa.

Obr. 2: Chromatogramy glykolipidu na tenké vrstvě po převrstvení ¹²⁵l-značenými měchýřky vnější membrány. V panelech A - C, dráha 1

9 fefe ί·1» fefe ·· ·· fet · « · « · a « • · « · · · · · · _ 11 . a ·>·· a · ··· a·· ¹¹ · · aa·· · · fe·· fefefe ·· ·· 99 *· obsahuje standardy glykolipidů, označené vlevo; dráha 2 obsahuje asialo-GM!; dráha 3 obsahuje Gb3, Gb4 a Forssmanův antigen; dráha 4 obsahuje Folchův extract lidských erytrocytů. Chromatogram ukázaný v panelu A byl obarven orcinolem, chromatogram ukázaný v panelu B byl převrstven ¹²⁵l-značenými měchýřky kmene ATCC 8176 (nehemaglutinující kmen), a chromatogram ukázaný v panelu C byl převrstven ¹²⁵l-značenými měchýřky kmene ATCC 49143 (hemaglutinující kmen). Pouze hemaglutinující kmen se vázal ke glykolipidovému pruhu Gb4 ve třetí a čtvrté dráze.

Obr. 3: Stříbrem obarvené elektroforetické profily proteinů oktylglukosidových extraktů vnější membrány po digesci buněk M. catarrhalis proteasami uvedenými v obrázku. Hemaglutinační aktivita buněk po digesci je—uvedena pod obrázkem v řádce_označené HA.

Markéry molekulových hmotností jsou jako v Obr. 1.

Obr. 4: Srovnání stříbrem obarvených proteinových profilů po elektroforetickém rozdělení proteinů vnější membrány různých kmenů M. catarrhalis ze sbírky ATCC. Označení kmenů je uvedeno nad jednotlivými dráhami. Hemaglutinační aktivita kmenů je uvedena v řádce označené HA pod obrázkem. Všimněte si proteinu se zdánlivou molekulovou hmotností větší než přísluší fosforylase B králičího svalu (106 kDa), který je společný pro hemaglutinující kmeny, ale je nepřítomen v nehemaglutinujících kmenech. Tento poiypeptid byl označen OMP106. Markéry molekulových hmotností jsou jako v Obr. 1.

Obr. 5: Srovnání stříbrem obarvených proteinových profilů po elektroforetickém rozdělení proteinů vnější membrány dvou kultivarů M. catarrhalis ATCC 49143: 49143 (hemaglutinující kutivar) a 49143• ·

- 12 • · ·

NHA (nehemaglutinující kultivar). Hemaglutinační aktivity kutivarů jsou uvedeny pod obrázkem v řádce označené HA. Všimněte si nepřítomnosti polypeptidu OMP106 (označeno symbolem <) u nehemaglutinujícího kultivaru. Markéry molekulových hmotností jsou jako v Obr. 1.

Obr. 6: Odhad molekulové hmotnosti OMP106 v 6% denaturujícím , polyakrylamidovém gelu s použitím OG extraktu kmene ATCC 49143.

Před aplikací na gel byl extrakt inkubován ve vzorkovém pufru buď io při 25°C nebo 100°C. Proteiny byly v gelu vizualizovány pomocí reduktivního barvení stříbrem. Pruh odpovídající polypeptidu OMP106 (označený symbolem <) je vidět pouze ve vzorku, jenž byl inkubován __při 1OO^oC. Jako markér molekulových hmotností byl použit standard—(BioRad, katalogové č.---161—

0317). Standard obsahoval následující polypeptidy (přibližné molekulové hmotnosti jsou uvedeny v závorkách): myosin králičího kosterního svalu (200 kDa); E coli β-galaktosidasa (116 kDa); fosforylasa B králičího svalu (97,4 kDa); hovězí sérum albumin (66,2 kDa). Pozice markérů molekulových hmotností v gelu jsou vyznačeny šipkami na pravé straně obrázku, hodnota molekulové hmotnosti v kDa je uvedena nad šipkami.

Obr. 7: Southernova analýza chromosomální DNA M. catarrhalis, ¹ štěpené restrikčními endonukleasami Dral a Hindll, s použitím sondy

Mc5-72. DNA z M. catarrhalis, kmene 49143, byla štěpena enzymy

Dral nebo Hindll. Southernova analýza štěpené DNA byla provedena s použitím sondy Mc5-72 (SEQ ID NO:4). Filtr byl promyt za vysoce stringentních podmínek, tj. roztokem 2x SSC, 1% SDS při 50°C, po dobu asi 20 až 30 minut. Dráha 1 obsahuje digest enzymem Hindlll;

- 13 hybridizující pruh má přibližnou velikost 8,0 kB. Dráha 2 obsahuje digest enzymem Dral; hybridizující pruh má přibližnou velikost 4,2 kB.

• · · » · · · · · • · »» ··

Obr. 8A a 8B: Srovnání westernových přenosů proteinových 5 extraktů M. catarrhalis a příbuzných druhů s použitím králičího antiséra proti OMP106 jako sondy (Obr. 8A), a králičího séra před imunizací proteinem OMP106 (Obr. 8B). Vzorky v jednotlivých dráhách na obrázku 8A a 8B jsou: dráha A, M. catarrhalis·, dráha B,

Moraxella ovis-, dráha C, Moraxella lacunata', dráha D, Moraxella io osloensis', dráha E, Moraxella bovis', dráha F, Neisseria meningitidis', dráha G, Neisseria gonorrhoeae. Markéry molekulových hmotností jsou jako v Obr.1.

Obr. 9A: Westernový přenos dokládající, že králičí antisérum proti polypeptidů OMP106 z M. catarrhalis kmene ATCC 49143 křížově reaguje s polypeptidem o podobné molekulové hmotnosti v řadě HA a NHA kmenů M. catarrhalis (poloha polypeptidů OMP106 je označena šipkou). Analýze westernovým přenosem byly podrobeny oktylglukosidové extrakty různých kmenů M. catarrhalis. Čísla přiřazená kmenům v ATCC sbírce jsou uvedena nad jednotlivými dráhami. Westernový přenos a další postup byly provedeny stejně jako v analýze uvedené v obr. 8.

Obr. 9B: Westernový přenos stejných extraktů jako v obr.9A s použitím neimunního séra, příslušejícího k séru použitému v obr.9A.

5. PODROBNÝ POPIS VYNÁLEZU

5.1. HEMAGLUTINUJÍCÍ A NEHEMAGLUTINUJÍCÍ KULTIVARY ·· · · ·*

- 14 • · ·

Vynález poskytuje izolovaný nebo v podstatě čistý polypeptid OMP106 z M. catarrhalis. Polypeptid OMP106 zahrnuje celý protein nebo podjednotku proteinu, který je zanořen nebo se nachází na vnějším povrchu vnější membrány hemaglutinujících (HA) kmenů a mnoha nehemaglutinujících (NHA) kmenů a kultivarů M. catarrhalis. OMP106 přímo nebo nepřímo přispívá k hemaglutinujícímu fenotypu HA kmenů a kultivarů. Podle vynálezu HA buňky M. catarrhalis aglutinují lidské nebo králičí erytrocyty v jakémkoli standardním hemaglutinačním testu, jako je i test uvedený v Sotoio Hernandez et al., 1989, J. Clin. Microbiol. 27:903-908. Současná představa, i když se nemíní omezovat na žádný konkrétní mechanismus, předpokládá, že M. catarrhalis aglutinuje erytrocyty tím, že se váže ke globotetrosovým (Gb₄) zbytkům glykolipidových

-a-glykOprOteinových-reeeptorů—na—pov-r-chu-hostitelské buňky, a že_ hemaglutinační aktivita je částečně zprostředkovaná vhodně modifikovaným polypeptidem OMP106, který se specificky vyznačuje tím, že je barvitelný stříbrem. Naproti tomu, nemodifikovaný nebo nevhodně modifikovaný polypeptid OMP106 není aktivní ve zprostředkování hemaglutinace, ani není barvitelný stříbrem. Kromě

2o toho je polypeptid OMP106 jediný polypeptid, mající v SDS-PAGE zdánlivou molekulovou hmotnost kolem 180 až 230 kDa, který je extrahovatelný oktylglukosidem nebo sarkosylem z měchýřků nebo intaktních buněk HA nebo NHA M. catarrhalis.

Hemaglutinační aktivita buněk HA M. catarrhalis je inhibována globotetrosou (GalNAcp1-3Gala1-4Galp1-4Glcp1; Gb₄) a monosacharidy, které jsou v Gb₄ obsaženy, včetně N-acetyl-Dgalaktosaminu, D-galaktosy a glukosy, a jejich derivátů, jako jsou metyl-a-galaktosa nebo metyl-p-galaktosa. Hemaglutinační aktivita buněk HA M. catarrhalis je rovněž inhibována relativně vyššími koncentracemi řady dalších cukrů zahrnujících, aie bez omezení, Dmannosu, L-fukosu, D-glukosu a N-acetyl-D-glukosamin.

• · · ···· ·· · · • · ·· · · · ·

Hemaglutinační aktivita a polypeptid OMP106 intaktních buněk HA M. catarrhalis jsou sníženy nebo zničeny digescí intaktních buněk M. catarrhalis různými proteasami zahrnujícími, ale bez omezení, TLCK - opracovaný chymotrypsin (TLCK = Na-tosyl-L-lysyl5 chlormetylketon, též známý jako 1-chloro-3-tosylamino-L-2-heptanon), proteinasu K a TPCK - ošetřený trypsin (TPCK = N-tosyl-L, fenylalanyl-chlormetylketon). Digesce intaktních buněk HA M.

catarrhalis proteasou V8 však hemaglutinační aktivitu ani fyzickou

I ' integritu polypeptidů OMP106 neovlivňuje.

I 10 Nehemaglutinující (NHA) kultivar může být odvozen z HA kmene

I nebo kultivaru M. catarrhalis postupným pasážováním ve statických

I tekutých kulturách (tj. v tekutých kulturách udržovaných při 35°C bez

I třepání). Například, kmen nebo kultivar HA M. catarrhalis je pěstován

I----v Mueller-Hintonově médiu a každých pětdnuje z povrchu~sťatické~

I 15 kultury odebráno inokulum, kterým je zaočkována následující statická

I kultura. Výhodným inokulem je jakýkoli plovoucí shluk buněk na

I povrchu kultury. Pasážování statické kultury probíhá dokud není

I získán NHA kultivar. NHA kultivar podle vynálezu může být použit

I k výrobě ochranných vakcín, jako jsou celobuněčné vakcíny, proti infekcím M. catarrhalis.

I Naproti tomu, hemaglutinující fenotyp HA M. catarrhalis kmene

I nebo kultivaru může být udržován pasážováním kmene nebo kultivaru v tekutých kulturách střepáním. v třepaných tekutých kulturách.

I V takovém provedení je kmen nebo kultivar HA M. catarrhalis

I - - - -25 pěstován v Mueller- Hintonově médiu při _s 35 - 37°C, třepání asi 200

I ot/min a pasážování každých 24 až 48 hodin. Hemaglutinující

I fenotyp HA M. catarrhalis kmene nebo kultivaru může být rovněž udržován pasážováním na tuhém médiu. Například kmen nebo kultivar

I HA M. catarrhalis je pěstován na miskách obsahujících krevní agar

I 30 nebo Mueller-Hintonův agar.

• ·

- 16 5.2. POLYPEPTID QMP106

Polypeptid OMP106 podle vynálezu je jediný protein vnější membrány HA kmene nebo kultivaru M. catarrhalis, který má v SDSPAGE zdánlivou molekulovou hmotnost asi 180 kDa až 230 kDa, s výhodou asi 190 kDa. Podle vynálezu je vnější membránový protein M. catarrhalis polypeptid, který je přítomen v měchýřcích M. catarrhalis, nebo který může být z měchýřků nebo intaktních buněk M. catarrhalis extrahován při pokojové teplotě pufrovaným roztokem detergentů n-oktyl-p-D-glukopyranosidu (OG) nebo sarkosylu. Viz ío Murphy a Loeb, 1989, Microbial Pathogenesis 6:159-174, kde jsou diskutovány měchýřky M. catarrhalis, což jsou přirozeně se vyskytující vezikuly sestávající z vnější membrány M. catarrhalis. NHA M. catarrhalis kmeny nebo kultivary buď nemají polypeptid OMP106, nebo

-mají—QMPJO6^polypeptid ve formě, která váze anti^rOMP1O6~protilátky is (viz část 5.5., níže), ale nereaguje se stříbrným barvivém (tj. při použití Silver Stain Pius firmy BioRad [Richmond, CA] nebo podle postupu uvedeným v Gottlieb a Chauko, 1987, Anal. Biochem. 165:33). Naproti tomu, polypeptid OMP106 z HA M. catarrhalis kmenů nebo kutivarů váže anti-OMP106 protilátky a reaguje se stříbrným barvivém.

Polypeptid OMP106 může být v měchýřcích nebo intaktních buňkách HA M. catarrhalis identifikován pomocí své citlivosti na proteolytické štěpení, které současně vede ke zrušení nebo snížení hemaglutinační aktivity tohoto HA kmene (viz výše, v části

5.1 příklady proteas, které ničí nebo neničí hemaglutinační aktivitu intaktních buněk M. catarrhalis). Jinými slovy, digesce proteasou, která zničí nebo sníží hemaglutinační aktivitu daného HA kmene nebo kultivaru, současně změní, viděno v SDS-PAGE, relativní zastoupení nebo migraci polypeptidů OMP106 izolovaného z tohoto kmene nebo kultivaru po takovéto digesci, ve srovnání s polypeptidem izolovaným z téhož kmene nebo kultivaru před digesci.

• · · • · · · ·· 0 ·

Polypetid OMP106 může být rovněž identifikován v OG nebo sarkosylovém extraktu z měchýřků nebo intaktních buněk M. catarrhalis jako polypeptid, který má zdánlivou molekulovou hmotnost větší než 106 kDa při stanovení pomocí elektroforézy v denaturujícím

12% PAG v přítomnosti SDS, podle návodu popsaného v manuálu

Harlow a Lané (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Appendix I, 1988).

Tepelné působení na OG nebo sarkosylový extrakt po dobu 5 minut při 100°C může způsobit, že polypeptid OMP106 bude mít při SDSio PAGE v 6% PAG a nepřítomnosti redukčních činidel, podle návodu popsaného v Harlow a Lané (tamtéž), zdánlivou molekulovou hmotnost kolem 180 kDa až 230 kDa. V konkrétním provedení má polypeptid OMP106 v tepelně zpracovaném OG nebo sarkosylovém

-extraktu—Λ4—ea/arrha//s^-AT-CC-krnene^4-9_1 A3._zdánlivou molekulovou_ hmotnost kolem 190 kDa.

V konkrétních provedeních je polypeptid OMP106 připraven z kteréhokoli z kmenů M. catarrhalis zahrnujících, ale bez omezení,

ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618,

ATCC 43627 a ATCC 43628. Výhodným zdrojem polypeptidu OMP106 je HA kultivar takovýchto kmenů. Ještě výhodnějším zdrojem je HA kultivar kmene ATCC 49143.

V konkrétním provedení polypeptid OMP106 obsahuje, s výhodou na amino-konci, aminokyselinovou sekvenci

IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID

NO: 1) nebo sekvenci s ní podstatně homologní. Polypetid OMP106 může navíc obsahovat, od výše uvedené sekvence směrem ke karboxylu, oktapeptid mající aminokyselinovou sekvenci GTVLGGKK (SEQ ID NO:2) nebo sekvenci jí podstatně homologní. Jak se zde užívá, podstatně homologní aminokyselinová sekvence je alespoň z

80%, s výhodou ze 100%, identická s uváděnou aminokyselinovou sekvencí.

- 18 Polypeptidy podle vynálezu se z různých aspektů vynálezu vyznačují svými zdánlivými molekulovými hmotnostmi, jež vyplývají z pohyblivosti polypeptidů při SDS-PAGE v porovnání s pohyblivostí známých markérů molekulové hmotnosti. I když v SDS-PAGE lze použít jakýchkoli standardů molekulové hmotnosti známých v oboru, výhodné markéry molekulové hmotnosti zahrnují alespoň myosin králičího kosterního svalu, E coli β-galaktosidasu a fosforylasu B králičího svalu. Pracovníci zběhlí v oboru si jsou vědomi toho, že polypeptidy podle vynálezu mohou mít rozdílnou pohyblivost v různých typech gelových systémů (např. různé pufry; různé koncentrace gelu, síťovadla nebo SDS). Znalci v oboru jsou si rovněž vědomi toho, že polypeptidy mohou mít jiné zdánlivé molekulové hmotnosti, použijí-li se v SDS-PAGE jiné markéry molekulové hmotnosti. Proto je charakterizace—molekulové—hmotnosti polypeptidů podle vynálezu_ míněna tak, aby postihla tytéž polypeptidy v jakémkoli systému SDSPAGE a s jakýmikoli markéry molekulových hmotností, jež by mohly poskytovat poněkud odlišnější zdánlivé molekulové hmotnosti polypeptidů oproti těm, jaké jsou zde uváděny.

5.3. OMP106-ODVQZENÉ POLYPEPTIDY

OMP106-odvozený polypeptid podle vynálezu může být fragment polypeptidu OMP106. Intaktní polypeptid OMP106 může obsahovat jeden nebo více aminokyselinových zbytků, které nejsou nezbytné pro jeho imunogenitu. Může například platit, že pro imunogenní aktivitu polypeptidu OMP106 jsou nezbytné pouze aminokyselinové zbytky tvořící jeden konkrétní epitop. Nepotřebné aminokyselinové sekvence mohou být odstraněny technikami dobře známými v oboru. Nechtěné aminokyseliny mohou být například odstraněny omezeným proteolytickým působením enzymy jako jsou trypsin, papain nebo příbuzné proteolytické enzymy, nebo chemickým • · • ·

Φ

- 19 štěpením činidly jako je bromkyan a následnou frakcionací produktů enzymové digesce nebo chemického štěpení.

OMP106-odvozený polypeptid podle vynálezu může též být modifikovaný polypeptid OMP106 nebo jeho fragment (tj. polypeptid

OMP106 nebo jeho fragment, mající jednu nebo více aminokyselinových substitucí, insercí a/nebo delecí oproti sekvenci OMP106 divokého typu). Takovéto modifikace mohou imunogenitu výsledného polypeptidového produktu zesilovat nebo nemusí mít na tuto aktivitu žádný účinek. Modifikační techniky, které mohou být to použity zahrnují i ty, jež byly zveřejněny v US Patentu No. 4,526,716.

OMP106-odvozený polypeptid může dále být chimérní polypeptid obsahující jeden nebo více heterologních polypeptidů fúzovaných k amino-konci nebo karboxy-konci nebo vnitřní části úplného POlypeptidu-©MP-106Hiebo4eho-částj-nebo4ebo-Jiagnientu_J~

Užitečné heterologní polypeptidy obsažené v takovémto chimérním polypeptidu zahrnují, ale bez omezení, a) pre- a/nebo prosekvence, jež usnadňují transport, translokaci a/nebo zpracování OMP106-odvozeného polypeptidu v hostitelské buňce, b) sekvence pro afinitní purifikaci, a c) libovolné užitečné imunogenní sekvence (např. sekvence kódující jeden nebo více epitopů povrchově přístupného proteinu nějakého mikrobiálního patogenu).

Je výhodné, když OMP106-odvozené polypeptidy podle vynálezu mají s polypeptidem OMP106 zkříženou imunologickou reaktivitu, takže mohou vyvolat ve zvířeti imunitní odpověď proti M. catarrhalis.

Ještě výhodnější je, když OMP106-odvozené polypeptidy podle vynálezu obsahují sekvence, které vytvářejí jeden nebo více epitopů vnějšího povrchu nativního polypetidu OMP106 M. catarrhalis (tj. povrchově přístupné epitopy polypeptidu OMP106, jak se nachází v intaktních buňkách M. catarrhalis). Takovéto výhodné OMP10630 odvozené polypeptidy mohou být identifikovány podle schopnosti specificky vázat protilátky získané proti intaktním buňkám M.

• · · · • ·

- 20 ·· · · catarrhalis (např. protilátky vyvolané proti buňkám M. catarrhalis fixovaným formaldehydem nebo glutaraldehydem; takové protilátky jsou zde označovány jako „anti -celobuněčné“ protilátky). Například, polypeptidy nebo peptidy pocházející z omezeného nebo úplného proteolytického štěpení polypeptidu OMP106 jsou frakcionovány standardními postupy a zkoušeny na schopnost vázat „anti celobuněčné“ protilátky. Reaktivní polypeptidy představují výhodné OMP106-odvozené polypeptidy. Tyto jsou izolovány a jejich aminokyselinové sekvence určeny pomocí postupů známých v oboru.

Rovněž výhodné je, kdyžOMP106-odvozené polypeptidy podle vynálezu obsahují sekvence, tvořící jeden nebo více epitopů nativního polypeptidu ΘΜΡ106, které zprostředkovávají hemaglutinaci buňkami HA M. catarrhalis. Takovéto výhodné

OMP106-odvozené polypeptidy mohou být—identifikovány—podle schopnosti bránit hemaglutinaci způsobené buňkami HA M. catarrhalis. Například, polypeptidy pocházející z omezeného nebo úplného proteolytického nebo chemického štěpení polypeptidu OMP106 jsou frakcionovány standardními postupy a zkoušeny na schopnost bránit hemaglutinaci způsobené buňkami M. catarrhalis.

Po identifikaci a izolaci takovýchto výhodných OMP106-odvozených polypeptidů jsou určeny jejich aminokyselinové sekvence s použitím standardních sekvenačních technik. Stanovená sekvence může umožnit výrobu takovýchto polypetidů metodami chemické syntézy a/nebo genového inženýrství.

Tyto výhodně' OMP106-odvozené polypeptidy mohou být též identifikovány tak, že se pomocí anti-celobuněčných protilátek systematicky testují bakteriální knihovny exprimující náhodné fragmenty genomové DNA M. catarrhalis, nebo klonované nukleotidové sekvence kódující polypeptid OMP106. Viz např.

Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manuál, 2.vydání, Cold Spring Harbor Press, NY, Sv.1, Kapitola 12. Z pozitivních klonů

- 21 jsou izolovány inzerty a ty jsou sekvenovány, aby se určily aminokyselinové sekvence takovýchto výhodných OMP106odvozených polypeptidů.

5.4. IZOLACE A PURIFIKACE POLYPEPTIDU QMP106 A

OMP1Q6-ODVOZENÝCH POLYPEPTIDŮ

Vynález poskytuje izolované polypeptidy 0MP106 a OMP106-odvozené polypeptidy. Termín „izolovaný“, jak se zde používá, znamená, že produkt je v podstatě zbaven jiných io biologických materiálů, se kterými se přirozeně společně vyskytuje. To například znamená, že prostředek s izolovaným polypeptidem OMP106 představuje asi 70% až 94% (váhově) čistý polypeptid O Μ Ρ1Ό6T~Jě~výhodňe~když~jsou polypěpťidý~~O Μ Ρ1Ό6~a~O Μ P TO6^ odvozené polypeptidy podle vynálezu purifikované. Termín 15 „purifikovaný“, jak se zde používá, znamená, že produkt je v podstatě zbaven jiného biologického materiálu, s nímž se přirozeně společně vyskytuje. To znamená, že prostředek s purifikovaným polypeptidem OMP106 je váhově alespoň 95% čistý polypeptid

OMP106, s výhodou alespoň 98% čistý polypeptid OMP106 20 a nejvýhodněji alespoň 99% čistý polypeptid OMP106.

Polypeptid OMP106 podle vynálezu může být izolován z proteinového extraktu, včetně extraktu z celých buněk, jakéhokoli kmene nebo kultivaru M. catarrhalis. Proteinový extrakt je s výhodou Q.ktyjg. [úkos i dpv ý ne bo sarkosylovy extrakt . vez i kul ů vněj_š i m e m b rá ny (tj. měchýřků) nebo celých buněk M. catarrhalis, zahrnujících, ale bez omezení, kterýkoli z kmenů ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628. Výhodným zdrojem takovýchto extraktů jsou HA kultivary těchto kmenů. Ještě výhodnějším zdrojem takovýchto extraktů je HA kultivar kmene ATCC

49143. Jiným zdrojem polypeptidu OMP106 jsou proteinové produkty systémů genové exprese, které exprimují klonované sekvence, jež

- 22 • · kódují polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozené polypeptidy (viz část 5.8., níže).

Polypeptid OMP106 může být izolován a purifikován z výchozího materiálu s použitím kterékoli biochemické techniky nebo přístupu, které jsou dobře známy pracovníkům zběhlým v oboru. Podle jednoho přístupu se získá standardními technikami vnější mebrána M. catarrhalis a proteiny vnější membrány jsou solubilizovány s použitím solubilizující sloučeniny, jako je detergent. Výhodný solubilizující roztok obsahuje asi 1,25% (hmotnost/objem) io oktylglukopyranosid (OG). Jiný výhodný solubilizující roztok obsahuje asi 1,25% sarkosyl. Polypeptid OMP106 se nachází v solubilizované frakci. Buněčné zbytky a nerozpustný materiál v extraktu jsou s výhodou odděleny a odstraněny centrifugací. Polypeptidy v extraktu

-jsou zahuštěny, inkubovány 5 min při 100°C v Laemmliho vzorkovém pufru s obsahem SDS, a poté frakcionovány elektroforézou v 6% denaturujícím polyakrylamidovém gelu (PAG), v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS), bez redukčního činidla. Viz Laemmli, 1970, Nátuře 227:680-685. Polypeptid OMP106, identifikovaný v pruhu nebo frakci jak bylo popsáno výše (např. stříbrem obarvený polypeptidový pruh, který je přítomen v OG nebo sarkosylovém extraktu HA kultivaru, ale nikoli v odpovídajícím NHA kultivaru nebo HA kultivaru po štěpení proteasou, které zrušilo hemaglutinační aktivitu) může pak být izolován přímo z této, polypeptid OMP106 obsahující, frakce nebo plátku gelu. Ve výhodném provedení má „ 25. po ly p epti d O Μ P10 6 zd á η I i vo u m o Ie k u Iovo u hmotnost 190 k Da, jak plyne ze srovnání jeho elektroforetické pohyblivosti v denaturující SDS-PAGE s pohyblivostí myosinu králičího kosterního svalu (200 kDa) a E.coli β-galaktosidasy (116 kDa).

Jiný způsob purifikace polypeptidu OMP106 spočívá v afinitní 30 chromatografií s použitím anti-OMP106 protilátek (viz část 5.5). Výhodné je použití monoklonálních anti-OMP106 protilátek. Protilátky

- 23 4 · jsou kovalentně navázány na agarosový gel, aktivovaný bromkyanem nebo estery sukcinamidu (Affi-Gel, BioRad, lne.) nebo jinými metodami, známými v oboru. Proteinový extrakt je nanesen na výše popsaný gel a ponechán v kontaktu po dobu a za standardních reakčních podmínek, které postačují na vazbu polypeptidu OMP106 k protilátce. Gelová matrice je s výhodou umístěna v chromatografické koloně. Polypeptid OMP106 je poté uvolněn z protilátky, čímž se získá v izolované nebo, s výhodou, purifikované formě.

io OMP106-odvozený polypeptid podle vynálezu může být získán chemickým a/nebo enzymatickým štěpením nebo degradací izolovaného nebo purifikovaného polypeptidu OMP106. OMP106odvozený polypeptid může být též chemicky syntetizován, metodami v oboru—dobře známými,-na základě známé aminokyselinové sekvence polypeptidu OMP106 a v případě chimérního polypeptidu též známé sekvence heterologního polypeptidu. Viz např. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, WH. Freeman and Co., NY.

OMP106-odvozený polypeptid může být též produkován v systému genové exprese, v němž je exprimován rekombinantní nukleotidový konstrukt, obsahující sekvence kódující OMP106odvozené polypeptidy. Nukleotidové sekvence kódující polypeptidy podle vynálezu mohou být syntetizovány a/nebo klonovány a exprimovány pomocí technik dobře známých v oboru. Viz např.

Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, svazky 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY, kapitola 9.

OMP106-odvozené polypeptidy podle vynálezu mohou být frakcionovány a purifikovány standardními technikami užívanými při purifikaci proteinů, modifikovanými a použitými v souladu s objevy a nálezy zde popsanými. Konkrétně, výhodné OMP106-odvozené polypeptidy podle vynálezu, které tvoří epitop na vnějším povrchu

- 24 • fe fefe · fefefefe

nativního polypeptidu OMP106 mohou být izolovány a purifikovány pomocí afinitních postupů, uvedených výše pro izolaci a purifikaci polypeptidu OMP106 (např. afinitní purifikace s použitím anti-OMP106 protilátek).

Je-li to žádoucí, polypeptidy podle vynálezu mohou být dále purifikovány pomocí standardních technik pro purifikaci proteinů a peptidů, které zahrnují, ale bez omezení, elektroforézu, centrifugací, gelovou filtraci, srážení, dialýzu, chromatografií (včetně ionexové chromatografie, afinitní . chromatografie, imunoadsorbční afinitní chromatografie, vysokovýkonné kapalinové chromatografie (HPLC) s reverzní fází, a gelové permeační HPLC), izolelektrickou fokusaci, a jejich variace a kombinace.

-Jedna-nebo-více-těGhto-technik_může-b-ýt_použita_v_ná_v_azno.S-ti_ po sobě, v postupu navrženém pro separaci molekul na základě jejich is fyzikálních nebo chemických vlastností. Tyto vlastnosti zahrnují hydrofobicitu, náboj, vazebné schopnosti a molekulovou hmotnost proteinu. Různé frakce získané po aplikaci každé z těchto technik jsou testovány na schopnost vázat OMP106 receptor nebo ligand, schopnost vázat anti-OMP106 protilátky, nebo schopnost bránit hemaglutinaci buňkami HA M. catarrhalis („testovací“ aktivity).

Frakce vykazující takovou aktivitu jsou pak podrobeny další separační technice v návazné proceduře a nové frakce jsou opět testovány.

Postup je opakován, až zůstane jediná frakce, která má výše popsané „testovací“ aktivity a přitom poskytuje jediný pruh při elektroforéze v’polyakrylamidovém geíu’nebo jediný vrchol při chromatografii.

5.5 QMP106 IMUNOGENY A ANTI-QMP106 PROTILÁTKY

Předkládaný vynález poskytuje protilátky, které specificky vážou poiypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozené polypeptidy.

K výrobě takovýchto protilátek se jako imunogen používají izolované * ·

- 25 nebo, výhodněji, purifikované preparáty polypeptidu OMP106 nebo

OMP106-odvozených polypeptidů.

V konkrétním provedení je polypeptid OMP106 separován od ostatních proteinů vnější membrány, přítomných v OG nebo sarkosylovém extraktu vnější membrány buněk nebo měchýřků HA M. catarrhalis, pomocí SDS-PAGE (viz část 5.2. výše) a gelový plátek obsahující polypeptid OMP106 je použit jako imunogen a injikován do králíka, za účelem získání antiséra obsahujícího polyklonální antiOMP106 protilátky. Stejný imunogen může být použit na imunizaci io myší k vytvoření hybridomových linií, které produkují monoklonální anti-OMP106 protilátky. V konkrétních provedeních je jako imunogen použit PAG plátek obsahující izolovaný nebo purifikovaný polypeptid OMP106 z kteréhokoli z kmenů ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC

-^2524Or^TCe-43617T^TeC-43618—ATCC 43627-a~ATCe-4-3628^-Ve15 výhodných provedeních je použit PAG plátek obsahující izolovaný nebo purifikovaný OMP106 z HA kultivaru těchto kmenů. Ve výhodnějším provedení je jako imunogen použit PAG plátek obsahující izolovaný nebo purifikovaný OMP106 z HA kultivaru kmene ATCC 49143.

V jiných provedeních jsou jako imunogen použity peptidové fragmenty polypeptidu OMP106. S výhodou se použijí peptidové fragmenty purifikovaného polypeptidu OMP106. Peptidy mohou být získány štěpením proteasou, chemickým štěpením izolovaného nebo purifikovaného polypeptidu OMP106 nebo chemickou syntézou a poté mohou¹ být ’izolovány nebo purifikovány. Takovéto izolované nebo purifikované peptidy mohou být přímo použity jako imunogeny. V konkrétních provedeních užitečné peptidové fragmenty zahrnují, ale bez omezení, peptidy mající sekvenci

IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID

3o NO:1) nebo jakoukoli její část, která je 6 nebo více aminokyselin ·

- 26 dlouhá. V jiném provedení má peptidový fragment sekvenci

GTVLGGKK (SEQ ID N0:2).

Užitečné imunogeny mohou též obsahovat tyto peptidy nebo peptidové fragmenty konjugované s nosičovými molekulami, výhodně s nosičovým proteinem. Nosičové proteiny mohou být kterékoli z běžně užívaných v imunologii, které zahrnují, ale bez omezení, hovězí sérum albumin (BSA), kuřecí albumin, hemocyanin mořského měkýše (KHL, keyhole limpet, tj. šášeň lodní) a podobně. Pro diskusi konjugátů hapten-protein viz např. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory io Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, nebo standardní učebnici imunologie, jako je Roitt, I. et al., IMMUNQLQGY, C. V. Mosby Co., St. Louis, MO (1985) nebo Klein, J., IMMUNOLOGY, Blackwell Scientific Publications, lne., Cambridge, MA

-(1990).-----15 V ještě jiném provedení jsou pro produkci protilátek, jež specificky vážou jeden nebo více epitopů vnějšího povrchu nativního polypeptidu OMP106, použity jako imunogen intaktní buňky HA M. catarrhalis nebo měchýřky z nich připravené. Buňky nebo měchýřky mohou být před imunizací fixovány činidly jako jsou formaldehyd nebo glutaraldehyd. Viz Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, kapitola 15. Je výhodné, když takovéto anti-celobuněčné protilátky jsou monoklonální. Hybridomové linie produkující požadované monoklonální protilátky mohou být identifikovány pomocí 'purifikovaného polypeptidu OMP106 jako testovacího ligandu. Jako imunogen k indukci těchto protilátek lze použít buňky nebo měchýřky kteréhokoli z M. catarrhalis kmenů zahrnujících, ale bez omezení, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628. S výhodou se jako imunogen použijí buňky nebo měchýřky z HA kultivaru těchto kmenů. Ještě výhodnější

- 27 ·· ··*« ·· ·· • * · · · · • · · · · ·

imunogen na indukci těchto protilátek jsou buňky nebo měchýřky HA kultivaru kmene ATCC 49143.

Polyklonální protilátky, vzniklé imunizací celými buňkami nebo měchýřky, obsahují protilátky, které vážou další proteiny vnější membrány M. catarrhalis („ne-anti-OMP106 protilátky“), a jejich použití je tudíž méně pohodlné u vzorků, o kterých je známo nebo u kterých je podezření, že obsahují jiné proteiny vnější membrány M. catarrhalis nebo obsahují materiály, které mají s těmito jinými proteiny vnější membrány zkříženou reaktivitu. Za těchto okolností je v daném ío vzorku nebo elektroforetickém pruhu nutné každou vazbu anticelobuněčných protilátek potvrdit v témže vzorku nebo pruhu současnou vazbou protilátky, jež specificky váže polypeptid OMP106 (např. anti-OMP106) a/nebo OMP106-odvozený polypeptid, anebo

--kompetičními testy s použitím anti-OMP106 protilátek a polypeptidu _

OMP106 nebo OMP106-odvozeného polypeptidu jako kompetitoru (tzn. přídavek anti-OMP106 protilátek, polypeptidu OMP106 nebo OMP106-odvozeného polypeptidu k reakční směsi, sníží nebo zruší vazbu anti-celobuněčných protilátek ke vzorku). Jinou možností je takováto polyklonální antiséra, jež obsahují „ne-anti-OMP106“ protilátky, vyčistit standardními postupy a metodami. Ne-anti-OMP106 protilátky mohou být například odstraněny vysrážením buňkami NHA kultivarů M. catarrhalis nebo buňkami kmenů M. catarrhalis, o nichž je známo, že nemají polypeptid OMP106 (např. ATCC 8176, výhodněji NHA kultivar kmene ATCC 49143); nebo adsorpcí ke a.......„25 . kolonkám, které obsahují takovéto buňky nebo které obsahují proteiny vnější membrány takovýchto buněk.

V dalších provedeních sestávají užitečné imunogeny na indukci protilátek podle vynálezu ze směsi dvou nebo více shora zmíněných jednotlivých imunogenů.

Imunizace savců, s výhodou lidí, králíků, krys, myší, ovcí, koz, krav nebo koní, imunogeny zde popsanými, se provádí postupy dobře • · ·· frfr fr frfr « • frfr ·

- 28 známými v oboru, za účelem získání antisér obsahujících polyklonální protilátky, nebo za účelem získání hybridomových linií secernujících monoklonální protilátky.

Monoklonální protilátky mohou být připraveny standardními technikami, při zohlednění poznatků zde uvedených. Takové techniky jsou zveřejněny například v U.S. Patentu No. 4,271,145 a U.S. Patentu No. 4,196,265. Stručně: zvíře je imunizováno imunogenem a fúzí buněk sleziny imunizovaného zvířete s myelomovými buňkami se připraví hybridomy. Mezi hybridomy se systematickým testováním to vyhledají ty, které vytvářejí protilátky, jež se vážou k imunogenu. Tyto pozitivní hybridomové klony se izolují a z nich se pak získávají monoklonální protilátky.

-Imunizační-schémata-pro-tv-oxbu_poJ-yklonáJníchi monoklonálních protilátek jsou v oboru dobře známá. K injekci imunogenu může být použito celé řady cest, včetně podkožní, nitrožilní, intraperitoneální, nitrokožní, nitrosvalové, slizniční nebo jejich kombinací. Imunogen může být injikovaný ve formě rozpustné nebo agregované, připojený k fyzickému nosiči nebo smíchaný s adjuvans, přičemž použité způsoby a materiály jsou dobře známé v oboru. Antiséra a protilátky mohou být purifikovány pomocí metod sloupcové chromatografie, dobře známých pracovníkům v oboru.

Podle předkládaného vynálezu mají polypeptidy OMP106 z kmenů M. catarrhalis, HA nebo NHA, zkříženou imunoreaktivitu. Protilátky namířené proti polypeptidů OMP106 jednoho kmene nebo kultivaru M. catarrhalis tedy specificky vážou polypeptid ÓMP1Ó6 a OMP106-odvozené polypeptidy jiných kmenů a kultivarů M. catarrhalis. Například, polyklonální anti-OMP106 protilátky indukované polypeptidem OMP106 z kmene ATCC 49143 se specificky vážou nejen k homolognímu polypeptidů OMP106 (tzn. polypeptidů

OMP106 kmene ATCC 49143), ale též k polypeptidů OMP106 a/nebo OMP106-odvozeným polypeptidům jiných kmenů M. catarrhalis • · ··* ·

-29999 999 ·· ··

I · * ► · 9

99» 9 9 zahrnujících, ale bez omezení, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240 a ATCC 25238.

Protilátky podle vynálezu včetně, ale bez omezení, anti-OMP106 protilátek, mohou být použity k usnadnění izolace a purifikace polypeptidu OMP106 a OMP106-odvozených polypeptidů. Protilátky mohou být též použity jako sondy při identifikaci klonů v expresních knihovnách, jež nesou inserty kódující polypeptid OMP106 nebo jeho fragmenty. Protilátky mohou být rovněž použity v imunostanoveních (např. ELISA, RIA, westerny) ke specifické detekci a/nebo kvantifikaci M. catarrhalis v biologických vzorcích. Anti-OMP106 protilátky podle vynálezu specificky vážou polypeptid OMP106 a nevážou proteiny příbuzných bakteriálních patogenů, jako jsou Moraxella ovis, Moraxella lacunata, Moraxella osloensis, Moraxella bovis, Neisseria meningitidis,—A/e/ssef/a~gottOffdoeae^Antrp’MPT06~protilátky—tedy mohou být použity pro diagnostiku infekcí M. catarrhalis.

Protilátky podle vynálezu, zejména cytotoxické protilátky, mohou být též použity pro pasivní imunizaci s cílem zabránit nebo zmírnit infekce M. catarrhalis u zvířat, včetně lidí. (Cytotoxická protilátka, jak se zde užívá, je taková protilátka, která po navázání na bakterii zvyšuje její opsonizaci a/nebo její zabití komplementem). K dosažení takovýchto účinků je nutné hostiteli podat účinnou koncentraci polyklonálních nebo monoklonálních protilátek namířených proti imunogenům podle vynálezu. Přesná koncentrace podávaných protilátek se u jednotlivých preparátů protilátek bude lišit, může však být určena pomocí standardních technik,„dobře známých a běžných v oboru. Podávání protilátek lze uskutečnit řadou technik zahrnujících, ale bez omezení, techniky popsané v části 5.6. pro podávání vakcín.

Profylaktická a terapeutická účinnost protilátek podle vynálezu může být určena na experimentálních zvířatech standardními farmaceutickými postupy. Údaje získané z testů na zvířatech mohou být použity pro stanovení rozsahu dávkování pro lidi.

• · •V ··*· ··

- 30 • 4 · ··<

• « »4 »·

5.6. VAKCÍNY

Předkládaný vynález rovněž poskytuje terapeutické a profylaktické vakcíny proti infekcím M. catarrhalis u zvířat, včetně savců a obzvláště hlodavců, primátů a lidí. Výhodné je použití vakcín u lidí. Vakcíny lze připravit technikami známými v oboru, přičemž budou obsahovat napříkla antigen ve formě imunogenu, farmaceuticky přijatelný nosič, případně vhodné adjuvans a případně další látky obvykle přítomné ve vakcínách. Imunologicky účinné množství io imunogenu ve vakcíně je stanoveno způsobem známým v oboru při zohlednění poznatků zde uvedených.

Vakcíny podle vynálezu obsahují imunologicky účinné množství kteréhOkoii-z-imunogenů—zveřejněných—v_části 5,5., ve farmaceuticky přijatelném nosiči. ~

V jiném provedení, vakcíny podle vynálezu obsahují imunologicky účinné množství inaktivovaného nebo oslabeného HA kultivaru M. catarrhalis nebo NHA kultivaru M. catarrhalis podle vynálezu. Inaktivovaný nebo oslabený HA kultivar M. catarrhalis nebo NHA kultivar M. catarrhalis lze získat kteroukoli z metod známých v oboru, které zahrnují, ale bez omezení, působení chemické (např. formalinem), tepelné nebo ozáření.

Termín „imunologicky účinné množství“ se zde užívá ve smyslu množství postačujícího k indukci imunitní odpovědí, která zabrání infekcím M. catarrhalis, nebo zmírní vážnost již existujících nebo pozdějších infekcí M. catarrhalis. Přesná koncentrace bude záviset na konkrétním aplikovaném imunogenu, může však být určena standardními, v oboru dobře známými technikami užívanými při testování vzniku imunitní odpovědi.

Užitečné polypeptidové imunogeny zahrnují izolovaný polypeptid

3o OMP106 a OMP106-odvozené polypeptidy. Výhodné imunogeny ·· 99»·

- 31 9 • 4 · • · · • « 9 • · · · ·· ·♦

4· • 9 · · • · 9 9 ·»· 999

9 • 9 ·9 zahrnují purifikovaný polypeptid OMP106 a purifikované OMP106odvozené polypeptidy nebo peptidy. Imunogen smíchaný s nosičem může mít podobu vodného roztoku, emulze nebo suspenze. Obecně se bude množství polypeptidového imunogenu pohybovat mezi 0,1 a

500 mikrogramy na jednu dávku. Nosiče, známé v oboru, zahrnují stabilizátory, ředící roztoky a pufry. Mezi vhodné stabilizátory patří cukry jako sorbitol, laktosa, manitol, škrob, sacharosa, dextran a glukosa, a proteiny jako albumin nebo kasein. Vhodné ředící roztoky zahrnují fyziologický roztok, Hanksův izotonický roztok a Ringerův io roztok. Vhodné pufry zahrnují fosforečnan alkalického kovu, uhličitan alkalického kovu nebo uhličitan kovu alkalických zemin. Vakcína může rovněž obsahovat jedno nebo více adjuvans na zlepšení nebo zvýšení imunologické odpovědi. Vhodná adjuvans zahrnují, ale bez omezení, peptidy; hyčloxid^-trliTTitý;^-fosforečnanhlínit-ýf—oxid—hlinit-ý;—připravek.

obsahující minerální olej jako Marcol 52, nebo rostlinný olej a jedno nebo více emulgujících činidel, nebo povrchově aktivní látky jako lysolecithin, polykationty, polyanionty; a potenciálně užitečná lidská adjuvans jako BCG a Corynobacterium parvum. Vakcína může též obsahovat další imunogeny. Takováto kombinovaná vakcína je výhodná v tom, že jednou imunizací lze dosáhnout imunity proti několika patogenům. Příkladem těchto dalších imunogenů jsou například složky známých DPT (tj. záškrt, černý kašel, tetanus) vakcín.

Vakcíny podle vynálezu jsou připravovány technikami známými v oboru, s přihlédnutím k poznatkům zde obsaženým. Obecně, imunogen je smíchán s nosičem za vzniku roztoku, suspenze nebo emulze. Jedna nebo více přísad, diskutovaných výše, může být již v nosiči nebo mohou být přidány dodatečně. Preparáty vakcín mohou být pro skladovací účely vysušeny, například lyofilizací. V takovém případě mohou být následně rekonstituovány do tekuté vakcíny přídavkem vhodného tekutého nosiče.

- 32 • · * · · • 0 ·

• ·

0 · 0 l

··

Vakcíny se podávají lidem nebo jiným savcům, včetně hlodavců a primátů. Mohou být aplikovány v jedné nebo více dávkách. Vakcíny mohou být podávány známými cestami. K podání vakcínových prostředků zde popsaných může být použito mnoho způsobů. Tyto způsoby zahrnují, ale bez omezení, cestu orální, intradermální, niírosvaíovou, iníraperitoneální, nitrožilní, podkožní a intranazáiní. Výhodné způsoby jsou nitrosvalové nebo podkožní injekce.

Vynález rovněž poskytuje způsob navození imunitní odpovědi vůči M. catarrhalis u savce, s cílem ochránit savce před infekcí a/nebo io zmírnit onemocnění způsobené M. catarrhalis. Způsob zahrnuje podání imunologicky účinného množství imunogenů podle vynálezu hostiteli a, s výhodou, v podání vakcín podle vynálezu hostiteli.

5.7. NUKLEOVÉ KYSELINY KÓDUJÍCÍ—POLYPEPTID

QMP106 AOMP1Q6-ODVOZENÉ PEPTIDY.

Předkládaný vynález rovněž poskytuje nukleové kyseliny, DNA a RNA, kódující polypeptid ΘΜΡ106 a OMP106-odvozené polypeptidy. V jednom aspektu mohou být nukleové kyseliny podle vynálezu syntetizovány metodami známými v oboru. Konkrétně, stanoví se část nebo úplná aminokyselinová sekvence polypeptidu OMP106 nebo OMP106-odvozeného polypeptidu pomocí technik dobře známých v oboru, např. Edmanovým odbouráním (viz např. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W H Freeman & Co., N Y., str.34-49). Získaná aminokyselinová sekvence slouží jako vodítko pro syntézu DNA kódující polypeptid OMP106 nebo OMP106odvozený peptid, přičemž se použijí konvenční chemické přístupy nebo amplifikace překrývajících se oligonukleotidů pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR).

V jiném aspektu může aminokyselinová sekvence posloužit jako vodítko pro syntézu oligonukletidových směsí, kterými se v

genomových knihovnách M. catarrhalis systematicky vyhledávají hybridizací sekvence kódující polypeptid OMP106. Takovéto knihovny mohou být připraveny izolací DNA z buněk kteréhokoli kmene M. catarrhalis. DNA použitá jako zdroj kódující sekvence polypeptidu

OMP106 pro genomové knihovny i pro PCR amplifikaci je s výhodou připravena z buněk kteréhokoli kmene M. catarrhalis včetně, ale bez omezení, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628.

Při přípravě genomových knihoven se DNA naštěpí na io fragmenty, z nichž některé kódují části nebo celý polypeptid OMP106 M. catarrhalis. DNA může být štěpena na specifických místech pomocí různých restrikčních enzymů. Jinak lze DNA fragmentovat použitím DNasy v přítomnosti manganu anebo mechanicky rozbít, například

-ultrazvukem.—Fragmenty DNA pak mohou byt separovány—podle velikosti standardními technikami, které zahrnují, ale bez omezení, elektroforesu v agarose a polyakrylamidovém gelu, sloupcovou chromatografií a centrifugací v sacharosovém gradientu. DNA fragmenty pak mohou být vloženy do vhodných vektorů, které zahrnují, ale bez omezení, plasmidy, kosmidy, bakteriofágy lambda nebo T4 a kvasinkové umělé chromosomy (YAC, yeast artificial chromosome). (Viz například: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover.D.M. (ed), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press,Ltd., Oxford, U K. Vol. I, l|.) Genomová knihovna, může být systematicky prohledána značenou sondou na základě hybridizace nukleových kyselin (Benton a Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein a Hogness, 1975, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72:3961).

Genomové knihovny mohou být systematicky analyzovány směsí značených oligonukleotidů, využívající degenerace genetického kódu, a odpovídající aminokyselinové sekvenci kteréhokoli peptidu ·* 99 9 9 9 9999 » 1 9·« 9999 ί e 9 j » · · ......

- 34 - J. *.»··..· ..

obsaženého v polypeptidu 0MP106, s použitím optimálních přístupů dobře známých v oboru. V konkrétních provedeních představuje hybridizační sondu degenerovaný oligonukleotid odpovídající peptidu o sekvenci s IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID NO:1) nebo její části. V jiném provedení sonda může být degenerovaný oligonukleotid odpovídající peptidu o sekvenci GTVLGGKK (SEQ ID NO:2). V dalším provedení se jako sondy použijí oligonukleotidy GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (SEQ ID NO:3) io a GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (SEQ ID NO:7), které oba odpovídají ΘΜΡ106 peptidu GTVLGGKK (SEQ ID NO:2). V dalších provedeních se jako sondy použije sekvence

GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAA ATCCTVTTGCTATTGGTGACATTOOGCAA—(-SĚQ—ID—NQ:4.)_nebo jakékoli její fragmenty, nebo jakýkoli komplement této sekvence nebo jejich fragmentů. Každá použitá sonda je s výhodou 15 nebo více nukleotidů dlouhá.

Klony s insertem DNA kódujícím polypeptid OMP106 nebo jeho fragmenty budou v knihovnách hybridizovat s jednou nebo více

2o degenerovaných oligonukleotidových sond. Hybridizace takovýchto oligonukleotidových sond ke genomovým knihovnám se provádí metodami známými v oboru. Hybridizace se dvěma výše uvedenými oligonukleotidovými sondami může například probíhat v roztoku 2X SSC, 1% SDS při 50°C a následné promytí může být za stejných podmínek. V konkrétním provedení s DNA ATCC 49143 je sekvence kódující celý nebo část polypeptidu OMP106 obsažena v 8000 bp dlouhém Hindlll restrikčním fragmentu, nebo v 4200 bp dlouhém Dral restrikčním fragmentu.

V dalším aspektu mohou být klony nukleotidových sekvencí kódujících část nebo celý polypeptid OMP106 nebo OMP106odvozené polypeptidy získány systematickým testováním expresních

- 35 *

«· ·· knihoven M. catarrhalis. Například, DNA M. catarrhalis je izolována a jsou z ní připraveny náhodné fragmenty, které jsou Iigovány do vektoru pro expresi (např. bakteriofág, plasmid, phagemid nebo kosmid) takovým způsobem, že vektor je schopen exprese v hostitelské buňce, do které je vnesen. Expresí vytvořený polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozené polypeptidy mohou být identifikovány pomocí různých testovacích postupů. V jednom provedení mohou být k identifikaci hledaných klonů použity různé anti-OMP106 protilátky podle vynálezu (viz část 5.5) s použitím metod známých v oboru. Viz například Harlow a Lané, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Dodatek IV. Kolonie nebo plaky v knihovně se přivedou do kontaktu s protilátkami tak, aby byly identifikovány klony s vazebnou schopností?_______

V konkrétním provedení lze detekovat kolonie nebo plaky obsahující DNA, jež kóduje polypeptid OMP106 nebo OMP106odvozené polypeptidy, pomocí DYNA Beads jak popsal Olsvick et al., 29^th ICAAC, Houston, Tex., 1989 a jak je zde uvedeno odkazem. AntiOMP106 protilátky jsou přisíťovány k tosylovaným kuličkám DYNA Beads M280 a tyto kuličky s navázanou protilátkou jsou pak použity k adsorbci na kolonie nebo plaky exprimující polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozený polypeptid. Kolonie nebo plaky, které exprimují polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozený polypeptid se poznají podle toho, že vážou kuličky.

Jinou možností je nespecifická imobilizace anti-OMP106 protilátek na vhodném nosiči, jako je křemelina nebo pryskyřice Celíte™. Tento materiál pak může být použit k adsorbci na bakteriální kolonie exprimující polypetid OMP106 nebo OMP106-odvozený polypeptid, jak bylo popsáno v předešlém odstavci.

V jiném aspektu může být použita PCR amplifikace na to, aby se z genomové DNA M. catarrhalis namnožila v podstatě čistá DNA,

- 36 kódující celý polypeptid OMP106 nebo jeho část. Jako primery lze použít oligonukleotidy, degenerované nebo ne, které odpovídají známým sekvencím polypeptidů OMP106. V konkrétních provedeních může být jako 5' primer použit oligonukleotid, degenerovaný nebo ne, který kóduje peptid IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSiAiGDNKIV (SEQ ID NO:1) nebo kteroukoli jeho část. Například, 5' primer může mít nukleotidovou sekvenci GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTAT TGGTGACATTGCGCAA (SEQ ID NO:4) nebo kteroukoli její část. Nukleotidové sekvence, degenerované nebo ne, které jsou reversními komplementy sekvence kódující GTVLGGKK (SEQ ID NO:2) mohou být použity jako 3' primer. Například, oligonukleotid, degenerovaný nebo ne, který má degenerovanou nukleotidovou sekvenci

YTTYTTNCCNCCNAGNAQNGTNGG-(SEQ-l-D_NOJ5)__nebo

YTTYTTNCCNCCYAANACNGTNCC (SEQ IDXoIeTAůžAbýt^použit jako 3' primer v kombinaci s různými 5' primery diskutovanými výše.

PCR může být provedena například s použitím termálního cykleru firmy Perkin-Elmer Cetus a enzymu Taq polymerasy (Gene Amp™). Pro použití v PCR reakci lze syntetizovat několik různých degenerovaných primerů. Je též možné obměňovat stringentnost hybridizačních podmínek pro startování PCR reakcí, aby byl zohledněn vyšší nebo nižší stupeň podobnosti nukleotidových sekvencí degenerovaných primerů a odpovídajících sekvencí v DNA M. catarrhalis. Po úspěšné amplifikaci segmentu DNA kódujícího polypeptid OMP106 může být tento segment molekulárně klonován a sekvenován, a využit jako sonda k izolaci úplného genomového klonu. To pak umožní stanovení úplné nukleotidové sekvence genu, analýzu jeho exprese a výrobu proteinového produktu genu pro funkční analýzu, jak je popsáno níže.

Jakmile je izolována kódující sekvence polypeptidů OMP106 z jednoho kmene nebo kultivaru M. catarrhalis, je pak možné využít .t ·

9 9

- 37 0' • é«

0« • 0 ··

0 0 0 • 0 0 0 stejného postupu k izolaci kódující sekvence polypeptidu OMP106 z dalších kmenů a kultivarů M. catarrhalis. Osoby znalé oboru vědí, že s použitím obecných technik známých v oboru, může být DNA nebo RNA sekvence, kódující polypeptid OMP106 (nebo jeho fragmenty) podle vynálezu, využita pro získání jiných DNA nebo RNA sekvencí, které s ní hybridizují za mírně až vysoce stringentních podmínek. Hybridizace se sekvencí OMP106 z jednoho kmene nebo kultivaru M. catarrhalis za vysoce stringentních podmínek povede k identifikaci odpovídající sekvence v jiných kmenech a kultivarech. Podmínky io vysoké stringentnosti se liší podle délky sondy a podle složení nukleotidových baží. Vzorec pro stanovení takovýchto podmínek je dobře znám v oboru. Viz Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, kapitola 11. Podmínky hybridizace při vysoké strinqetnosti. iak se zde používá, zahrnují u sond delších než 300 baží závěrečné promytí v 0,1X~SSC7~ 0,1% SDS při 68°C po dobu alespoň 1 hodiny (Ausbel, et al., Eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.l, Greene Publishing Associates,lne. A John Wiley & Sons, lne., New York, strana 2.10.3). V konkrétních provedeních hybridizace se sondou, která má sekvenci

SEQ ID NO:4 nebo sekvenci jí komplementární, znamená promytí při vysoké stringetnosti promytí v roztoku 2X SSC, 1% SDS při 50°C po dobu 20 až 30 minut.

Pracovník znalý oboru bude schopen pomocí postupů dobře známých v oboru identifikovat klony obsahující úplnou kódující sekvenci polypeptidu OMP106. Rozsah sekvence kódující polypeptid OMP106, obsažené v izolovaném klonu, může být zjištěn' sekvenováním příslušného klonovaného insertu a srovnáním dedukované velikosti polypeptidu kódovaného otevřenými čtecími rámci (ORFs, open reading frames) s velikostí polypeptidu OMP106 a/nebo srovnáním dedukované aminokyselinové sekvence se známou aminokyselinovou sekvencí purifikovaného polypeptidu OMP106. Pokud byl izolován parciální klon, který kóduje část • ·

25“

sekvence polypeptidů OMP106, může být jeho insert použit jako hybridizační sonda pro izolaci úplných klonů. Jinou možností, jak rekonstruovat úplnou kódující sekvenci polypeptidů OMP106, je pospojovat navzájem inserty překrývajících se parciálních klonů.

Úplnými klony mohou být ty, jejichž otevřený čtecí rámec (ORF) s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí odpovídá polypeptidů OMP106 nebo, tam kde úplná aminokyselinová sekvence polypeptidů OMP106 není k dispozici, odpovídá peptidovému fragmentu polypeptidů OMP106, a má molekulovou hmotnost odpovídající molekulové hmotnosti polypeptidů OMP106. Dále, úplné klony mohou být identifikovány tak, že jejich inserty mají schopnost, po vložení do expresního vektoru, produkovat polypeptid, který váže protilátky specifické pro amino-konec polypeptidů OMP106 a protilátky specifické pro karboxy-konec_po_lypeptidu GMPTOB; Sekvence nukleových kyselin, kódující OMP-106 odvozené polypeptidy mohou být připraveny metodami dobře známými v oboru. V jednom aspektu mohou být sekvence kódující OMP106-odvozené polypeptidy odvozeny ze sekvencí kódujících polypeptid OMP106 metodami rekombinantní DNA s přihlédnutím k poznatkům zde uvedeným. Kódující sekvence polypeptidů OMP106 může být například pozměněna zavedením aminokyselinových substitucí, které neovlivní imunogenicitu polypeptidů OMP106 nebo které zlepší jeho imunogenicitu. Mohou být použity různé metody, zahrnující, ale bez omezení, oligonukleotidově cílenou místně specifickou mutagenezu. Tyto a další, v oboru známé techniky mohou být použity k vytvoření jednoduchých nebo vícečetných mutací, jako jsou výměny, inserce, delece a transpozice, jak je popsáno v Botstein a Shortle, 1985, Science 229:1193-1210.

Sekvence DNA kódující polypeptid OMP106 mohou být dále zkracovány štěpením restrikčními enzymy nebo exonukleasovým štěpením. K sekvenci kódující polypeptid OMP106 může být ligací

- 39 « to

Sb

nebo PCR amplifikací přidána heterologní kódující sekvence. Kromě toho, může být DNA kódující celý nebo část OMP-odvozeného polypeptidu syntetizována chemicky nebo pomocí PCR amplifikace, a to na základě známé nebo dedukované aminokyselinové sekvence polypeptidu OMP106 a jakýchkoli požadovaných změn této sekvence.

Identifikovaná a izolovaná DNA, obsahující kódující sekvenci pro polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozený polypeptid, může být vložena do vhodného klonovacího vektoru. Může být použita řada v oboru známých systémů vektor-hostitel. Možné vektory zahrnují, ale bez omezení, plasmidy nebo upravené viry, avšak vektorový systém musí být kompatibilní s použitým buněčným hostitelem. Takovéto vektory zahrnují, ale bez omezení, bakteriofágy jako jsou deriváty fága lambda, nebo plasmidy jako jsou pBR322 nebo deriváty plasmidu

-^pUCrHTiseTce-do-kjonovací+iO-vektoTu-může-být-pTovedena-napříWad15 ligací DNA fragmentu do klonovacího vektoru, který má komplementární kohezní konce. Pokud nejsou v klonovacím vektoru přítomná restrikční místa, kterých bylo použito k fragmentaci DNA, konce DNA molekul mohou být enzymaticky modifikovány. Jinou možností je vytvořit libovolné žádoucí místo ligací olignukleotidových úseků (linkerů) na konce DNA; tyto ligované linkery mohou obsahovat specifické chemicky syntetizované oligonukleotidy, které kódují rozpoznávací místa restrikčních endonukleas. Další metodou modifikace štěpené DNA může být připojení homopolymerních úseků na konce molekul DNA. Rekombinantní molekuly mohou být vneseny do hostitelských buněk pomocí transformace, transfekce, infekce, elektroporace atd., čímž lze získat mnoho kopií dané genové sekvence.

Jinou alternativou je identifikace a izolace žádoucí DNA, jež obsahuje kódující sekvenci pro polypeptid OMP106 nebo OMP10630 odvozený polypeptid, až po inserci DNA do vhodného klonovacího vektoru při použití tzv. „shot gun“ postupu. Před inserci do klonovacího

vektoru lze obohatit směs fragmentů DNA o žádoucí sekvenci, například frakcionací podle velikosti.

V konkrétních provedeních umožňuje transformace hostitelských buněk molekulami rekombinantní DNA, které obsahují sekvenci kódující polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozený polypeptid, vytvoření mnohonásobného počtu kopií takovéto kódující sekvence. Kódující sekvence tedy může být získána ve velkých množstvích kultivací transformantů, izolací molekul rekombinantní DNA z transformantů a, je-li to potřebné, opětovným vynětím insertu s kódující sekvencí z izolované rekombinantní DNA.

5.8. REKOMBINANTNÍ VÝROBA POLYPEPTIDU OMP106

-A~OMP1O6^TODVOZENÝCH~PQDYPEPT1DŮ~ Polypeptid OMP106 a OMP106-odvozené polypeptidy podle vynálezu mohou být vyrobeny technikami genového inženýrství. V takovém případě jsou produkovány vhodnou hostitelskou buňkou, jež byla transformována DNA, která kóduje polypeptid. Nukleotidová sekvence kódující polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozené polypeptidy podle vynálezu může být vložena do vhodného expresního vektoru, tj. do vektoru, který obsahuje nezbytné elementy pro transkripci a translaci vložené sekvence kódující polypeptid. Nukleotidové sekvence kódující polypeptid OMP106 nebo OMP106odvozené polypeptidy jsou vloženy do vektorů takovým způsobem (např. ve správné orientaci a správném čtecím rámci a s vhodnými signály pro expresi, včetně vazebného místa pro RNA polymerasu a ribosomálního vazebného místa), že za vhodných podmínek jsou exprimovány.

Pro expresi sekvence kódující polypeptid mohou být použity různé systémy vektor-hostitel. Tyto zahrnují, ale bez omezení, savčí buňky infikované virem (např. virem vakcínie, adenovirem atd.); hmyzí

- 41 * * «· «· • * • »'

Λ • · · · ·

··· buňky infikované virem (např. bakulovirem); mikroorganismy jako kvasinky obsahující kvasinkové vektory, nebo bakterie transformované bakteriofágovou, plasmidovou nebo kosmidovou DNA. Výhodnou hostitelskou buňkou je bakterie a nejvýhodnější bakterií je E coli,

B subtilis nebo Salmonella.

Signály pro expresi ve vektorech se liší v síle a specifitě.

V závislosti na použitém systému hostitel-vektor může být použit kterýkoli z řady vhodných transkripčních a translačních elementů.

V konkrétním provedení je exprimován chimérní protein obsahující io sekvenci polypeptidu OMP106 nebo OMP106-odvozeného polypeptidu a dále pre- a/nebo pro- sekvenci hostitelské buňky.

V jiných konkrétních provedeních je exprimován chimérní protein obsahující sekvenci polypeptidu OMP106 nebo OMP106-odvozeného

-polypeptidu—a sekvenci—peptidu—pro—afinitní—purifikaci.—V dalších15 konkrétních provedeních je exprimován chimérní protein obsahující sekvenci polypeptidu OMP106 nebo OMP106-odvozeného polypeptidu a sekvenci užitečného imunogenního peptidu nebo polypeptidu. Ve výhodných provedeních obsahuje exprimovaný OMP106-odvozený polypeptid sekvenci, která vytváří v nativním polypeptidu OMP106 buď

2o epitop vnějšího povrchu, nebo vazebnou doménu pro receptor.

Ke konstrukci vektorů exprese, jež obsahují chimérní gen sestávající z vhodných transkripčně/translačních regulačních signálů a kódující sekvence polypeptidu, může být použita jakákoli, v oboru známá metoda pro inserci fragmentů DNA do vektoru. Tyto metody mohou zahrnovat in vitro techniky rekombinantní DNA a syntetické techniky a metody in vivo rekombinace (genetická rekombinace).

Exprese nukleotidové sekvence kódující polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozený polypeptid může být regulována druhou nukíeotidovou sekvencí tak, že vložená sekvence je exprimovaná

3o v hostiteli, transformovaném molekulou rekombinantní DNA. Exprese vložené sekvence může být například regulována jakýmkoli • ·

- 42 promotor/enhancerovým elementem známým v oboru. Promotory, které mohou být použity k řízení exprese vložených sekvencí zahrnují, ale bez omezení, SV40 časný promotor (Bernoist a Chambon, 1981, Nátuře 290:304-310), promotor obsažený v 3' dlouhé koncové repetici z Rousova sarkomového viru (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787797), promotor íhymidinkinasy herpesviru (Wagner et al., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), regulační sekvence metallothioneinového genu (Brinster et al., 1982, Nátuře 296:39-42) pro expresi ve zvířecích buňkách; promotory β-laktamasy (Villaio Komaroff et al., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), tac (DeBoer et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25), λΡι_, nebo trc pro expresi v bakteriálních buňkách (viz též „Useful proteins from recombinant bacteria“ v Scientific American, 1980, 242:74-94);

-promotorová^oblast^nopalinsynthetasy nebo promotor 35S RNA viru květákové mosaiky (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), a promotor fotosyntetického enzymu ribulosabisfosfátkarboxylasy (Herrera-Estrella et al., 1984, Nátuře 310:115-120) pro expresi v rostlinných buňkách; promotorové elementy z kvasinek nebo jiných hub, jako jsou Gal4 promotor, ADH (alkoholdehydrogenasa) promotor,

PGK (fosfoglycerátkinasa) promotor, promotor alkalické fosfatasy.

Vektory exprese, které obsahují kódující sekvence pro polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozený polypeptid, mohou být identifikovány pomocí tří obecných přístupů: (a) hybridizací nukleových kyselin, (b) přítomností nebo nepřítomností funkce „markerového“ = 25 genu, a (c) expresí sekvencí vložených do vektoru. V prvním přístupu je přítomnost cizího genu vloženého do expresního vektoru detekována hybridizací nukleových kyselin s použitím sond, které obsahují sekvence homologní s vloženou sekvencí, jež kóduje polypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozený polypeptid. V druhém přístupu může být rekombinantní systém vektor/hostitel identifikován a selektován na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti určitých

··· »»

- 43 „markerových“ genových funkcí (např. thymidinkinasová aktivita, resistence vůči antibiotikům, transformační fenotyp, tvorba okluzních tělísek v bakulovirovém systému, atd), což je způsobeno insercí cizích genů do vektoru. Když je například ve vektoru vložena sekvence kódující poiypeptid OMP106 nebo OMP106-odvozený poiypeptid do sekvence markerového genu, mohou být rekombinanty obsahující tento insert identifikovány podle ztráty funkce markerového genu. Ve třetím přístupu mohou být rekombinantní expresní vektory identifikovány pomocí stanovení produktu cizího genu exprimovaného v rekombinantu. Takováto stanovení mohou být založena například na fyzikálních nebo funkčních vlastnostech polypeptidu OMP106 nebo OMP106-odvozeného polypeptidu vin vitro testech, např. ve vazbě k iigandu nebo receptoru OMP106, ve vazbě anti-OMP106 protilátek podle vynálezu^nebO~ve-schopnosti-hostitelské-buňk-V-hemagLutinovat nebo ve schopnosti buněčného extraktu blokovat hemaglutinaci způsobenou M. catarrhalis.

Jakmile je konkrétní rekombinantní DNA identifikována a izolována, lze ji namnožit několika metodami známými v oboru. Poté, co se určí vhodný hostitelský systém a růstové podmínky, je možné rekombinantní expresní vektory dále množit a připravovat naveliko. Jak bylo výše vysvětleno, použitelné expresní vektory zahrnují, ale bez omezení, následující vektory nebo jejich deriváty: lidské nebo zvířecí viry jako jsou vakcínie nebo adenovirus; hmyzí viry jako bakulovirus; kvasinkové vektory; bakteriofágové vektory (např. lambda) a plasmidové a kosmidové vektory, abychom jmenovali alespoň některé.

Kromě toho, může být zvolen takový kmen hostitelských buněk, který umožňuje regulovat expresi vložených sekvencí, nebo modifikovat a zpracovávat genový produkt specifickým žádoucím způsobem. Exprese řízená určitými promotory může být zvýšena v přítomnosti určitých induktorů; exprese rekombinantního polypeptidu

- 44 ΟΜΡ106 nebo OMP106-odvozeného polypeptidu může tedy být regulovaná. Navíc, různé hostitelské buňky mají charakteristické a specifické mechanismy pro translační a post-translační zpracování a modifikaci proteinů. Vhodné buněnčné linie nebo hostitelské systémy mohou být zvoleny tak, aby zajistily požadovanou modifikaci a zpracování exprimovaného cizího proteinu.

5.9. ČINIDLA

Polypeptidy, peptidy, protilátky a nukleové kyseliny podle vynálezu jsou užitečná činidla pro klinickou nebo lékařskou diagnostiku infekcí způsobených M. catarrhalis a pro vědecký výzkum mechanismů patogenity, virulence a infektivity M. catarrhalis, jakož j výzkum—obranných—mechanismů_hostitele· DNA a RNA podle vynálezu může být například použito jako sond k identifikaci přítomnosti M. catarrhalis v biologických vzorcích pomocí hybridizace nebo PCR amplifikace. DNA a RNA může být též použita k identifikaci jiných bakterií, které by mohly kódovat polypeptid příbuzný OMP106 z M. catarrhalis.

Polypeptidy a peptidy podle vynálezu mohou být použity pro přípravu polyklonálních a monoklonálních protilátek, které lze použít v afinitní chromatografií pro další purifikaci směsí obsahujících polypeptidy podle vynálezu. Polypeptidy a peptidy mohou být také použity ve standardních imunostanoveních při systematickém prohledávání vzorků na přítomnost protilátek proti M. catarrhalis.

Mělo by být jasné, že poznatky plynoucí z předkládaného vynálezu budou aplikovány na konkrétní problém nebo prostředí v rámci schopností pracovníků s obvyklými dovednostmi v oboru, s přihlédnutím k poznatkům zde obsaženým. Příklady produktů podle vynálezu a způsobů jejich výroby a použití podává následující příklad. 6. Příklady provedení vynálezu

PŘÍKLAD: IZOLACE A CHARAKTERIZACE POLYPEPTIDŮ OMP106

A GENU, KTERÝ JEJ KÓDUJE, Z KMENE ATCC 49143

NEBO JINÝCH KMENŮ 6.1. MATERIÁLY A METODY

6.1.1. HEMAGLUTINAČNÍ TEST

Hemaglutinace bakteriemi M. catarrhalis byla stanovována postupem, který popsal Soto-Hernandez et al. (J. Clin. Microbiol. 27:903-908) s tím, že ve sklíčkovém aglutinačním testu byly použity 5% (objem/objem) erytrocyty namísto 3%. Počáteční hemaglutinační testy byly prováděny s 20pg bakteriálních buněk (vlhká váha). Jelikož kmen M. catarrhalis ATCC 49143, narostlý na miskách krevního agaru při 35°C, poskytoval silnou hemaglutinační reakci, byl vybrán j a ko referenční^-kmemy-S^ériové—ředě ní—buněk— kmen e ATCC 49143 geometrickou řadou s koeficientem 1:2 vedlo ke snižování hemaglutinačních reakcí. Skórovací indexy od ++++ do + byly přiděleny na základě hemaglutinace pozorované u kmene ATCC 49143 po ředění geometrickou řadou s koeficientem 1:2 tak, že + reakce byla dosažena při použití 1/4 počtu buněk nutných k docílení +++ reakce.

6.1.2. INHIBICE HEMAGLUTINACE

Buněčná suspenze M. catarrhalis ATCC 49143 byla postupně ředěna v poměru 1:2 a ředění, které poskytlo + hemaglutinační reakci, při použití 7μΙ Dulbeccova fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku a 7μΙ 5% (objem/objem) roztoku lidských O⁺ erytrocytů, bylo použito k stanovení inhibice hemaglutinace jednoduchými cukry nebo deriváty cukrů. Aby se zjistilo, zda jednoduché cukry nebo cukerné deriváty mohou inhibovat hemaglutinaci buňkami M. catarrhalis, bylo smícháno 7 μί daného cukru v koncentraci 500 mM se 7 μΙ buněk M. catarrhalis a inkubováno

minut, aby cukr mohl interagovat s buňkami. Poté bylo přidáno 7μΙ 5% (objem/objem) roztoku lidských O⁺ erytrocytů a po 1 minutě byla stanovena hemaglutinace. Schopnost inhibovat hemaglutinaci byla vyzkoušena pro každý cukr a cukerný derivát. Zásobní roztok každého cukru a cukerného derivátu byl postupně ředěn v poměru 1:2 a pro jednotlivá ředění byla stanovena shora popsaným postupem schopnost inhibovat hemaglutinaci. Tímto způsobem byla určena minimální koncentrace cukru nutná pro inhibici hemaglutinace.

6.1.3. VAZBA LIGANDU A RECEPTORU

Vazba M. catarrhalis ke glykolipidovým receptorům zvířecích buněk byla zkoumána pomocí chromatografické frakcionace glykolipidů—hostitelských—buněk—na—tenké—vrstvě_-(TLC) a následným převrstvením chromatogramu značenými buňkami podle postupu, který popsal Magnani et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:14365-14369. Ve stručnosti, glykolipidy získané od firmy Matreya lne. (Pleasant Gap, PA) byly rozděleny na deskách pro vysoce účinnou chromatografií na tenké vrstvě (HPTLC) v soustavě chloroform - metanol - voda (5:4:1). Desky byly buď obarveny orcinolem při 100°C, nebo byly převrstveny ¹²⁵l-značenými měchýřky M. catarrhalis (2 x 10⁶ cpm/ml, 2 hodiny), jejichž přípravu popisuje Murphy a Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174. Desky pak byly 5x promyty, vysušeny a byl jimi exponován rentgenový film.

6.1.4. OG EXTRAKCE PROTEINŮ OMP

Kmeny M. catarrhalis byly pěstovány v 4-litrových baňkách v jednom litru Mueller-Hintonova média při 35°C a třepání 200rpm. Vnější membránové proteiny (OMP) byly izolovány z 50 mg buněk (vlhká váha) působením 0,67 ml 1,25% n oktyl-p-D-glukopyranosidu (tj. oktylglukosidu; OG) v PBS (fosfátem pufrovaném fyziologickém “ *t Z - · ♦ ·· ·· · 9 <·· ··· ·» ·· ·· ** roztoku) při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Buňky byly stáčeny 5 minut v mikrocentrifuze a supernantant dál používán jako oktylglukosidový extrakt. Porovnání proteinových profilů těchto extraktů připravených z řady kmenů M. catarrhalis s proteinovými profily měchýřků (tj. vezikulů vnější membrány) získaných diferenční cenírifugací, které jsou vysoce obohacené o vnější mebránové proteiny (OMP) M. catarrhalis (Murphy a Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174) ukazuje, že oktylglukosidový extrakt obsahuje převážně vnější membránové proteiny M. catarrhalis (Obr. 1). Z toho ío vyplývá, že extrakce oktylglukosidem představuje rychlejší postup s vyšším výtěžkem vnějších membránových proteinů ve srovnání s přípravou z měchýřků.

-671T57PROTECLYTÍCKÉ—ŠTĚPENÍ—CMP406___

50 mg buněk kmene ATCC 49143 v 1 ml Dulbeccova fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku bylo při pokojové teplotě 1 hodinu štěpeno následujícími proteasami: TLCK-opracovaným chymotrypsinem (5 mg), proteinasou K (5 mg), TPCK-opracovaným trypsinem nebo proteasou V8 (100 jednotek). Všechny proteasy byly

2o získány od firmy Sigma Chemicals (St. Louis, MO). Ihned po skončení inkubace s proteasou byly buňky jednou promyty v PBS, resuspendovány v 1 ml PBS a byla změřena jejich hemaglutinační aktivita. Proteasou opracované bakteriální buňky byly dále extrahovány oktylglukosidem, takže po rozdělení vnějších membránových proteinů bylo možné identifikovat specifické proteiny,.... štěpené proteasami.

6.1.6. NEHEMAGLUTINUJÍCÍ KULTIVARY

Hemaglutinující kultury M. catarrhalis jsou normálně pěstovány na třepačce v baňkách, obsahujících Mueller-Hintonovo médium, při «· ····

- 48 35 až 37°C, třepání 200 rpm, po dobu 24 až 48 hodin. Buňky odebrané přímo z misky krevního agaru nebo z agarové misky s MuellerHintonovým médiem rovněž vykazují hemaglutinující fenotyp. Aby se vyselektoval nehemaglutinující (NHA) kultivar, kmen ATCC 49143 byl postupně pasážován každých 5 dnů ve statické kultuře narostlé v Mueller-Hiníonově médiu při 35°C. Při každé pasáži bylo inokulum odebráno pouze z povrchu kultury. Do druhé pasáže se již vytvořil plovoucí povlak buněk a ten byl použit jako inokulum pro další kultury. Takováto postupná kultivace dala vzniknout NHA kultivarům kmene io ATCC 49143 typicky po třech pasážích.

6.1.7. IZOLACE POLYPEPTIDU QMP106 .

Polypepttd^_OMP1O6-z-extrak-tu-vnější-membrány—M.—catantialls_ ATCC 49143 je detekován (např. barvením stříbrem nebo anti15 OMP106 protilátkami) při elektroforéze v denaturujícím gelu pouze v případě, že extrakt byl inkubován 5 minut při 100°C. Aby se určilo, zda přítomnost pruhu OMP106 po inkubaci při 100°C je způsobena agregací proteinů nižší molekulové hmotnosti během varu, nebo zda povaření vzorku umožňuje normálně agregovanému proteinu vstup do

2o gelu, byla provedena analýza nepovařeného oktylglukosidového extraktu vnější membány buněk ATCC 49143 v nativním polyakrylamidovém gelu. Jednotlivé části gelu, včetně oblasti přímo pod jamkou pro nanesení vzorku, byly vyříznuty a povařeny. Výsledné vzorky pak byly rozděleny na denaturujícím polyakrylamidovém gelu a obarveny stříbrem (Šilver Štain Plus, katalog, č. 161-0449, BioRad Laboratories, Richmond, CA). Pro N-koncové sekvenování byl oktylglukosidový extrakt vnější membány buněk ATCC 49143 smíchán s PAGE vzorkovým pufrem obsahujícím SDS a inkubován 5 minut na vroucí vodní lázni. Proteiny pak byly rozděleny na 12% PAG s SDS a přeneseny elektroforeticky na PVDF membránu. Oblast membrány obsahující pruh proteinu OMP106 byla vystřižena a použita pro aminokoncovou sekvenaci. V žádné z elektroforetických procedur pro izolaci polypeptidu OMP16 nebyla ve vzorkových nebo gelových pufrech použita redukční činidla.

- 49 ·♦ 00

0 0

0 0 • 00 00 0

4 • · 0 0

6.1.8. ANTI-OMP106 ANTISÉRUM

Pro přípravu antiséra proti OMP106 byly proteiny z HA kultivaru ATCC 49143 rozděleny v denaturujícím SDS polyakrylamidovém gelu postupem dříve popsaným (Laemmli, 1970, Nátuře 227:680-685) a pruh obsahující OMP106 byl vyříznut z gelu. Vyříznutý plátek gelu byl macerován a injikován do králíka, aby se vytvořilo antisérum proti polypeptidu OMP106. Antisérum bylo použito k inhibici hemaglutinace tak, jak bylo popsáno výše v části 6.1.2. s tím, že namísto—euk-r-u—bylo—použito_antisérum. Antisérum bylo rovněž vyzkoušeno na komplementem-zprostředkovanou cytotoxickou aktivitu proti buňkám M. catarrhalis, jak je popsáno v části 7.

6.1.9. WESTERNOVÉ PŘENOSY S ANTI-QMP106

ANTISÉREM

Buňky M. catarrhalis ATCC 49143, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240, ATCC 25238 a ATCC 8176; M. ovis ATCC 33078; M. lacunata ATCC 17967; M. bovis ATCC 10900; M. osloensis řkTOQ 10973; Neisseria gonorrhoeae (klinický izolát); a N. Meningitidis ATCC 13077 byly pěstovány na miskách čokoládového agaru po 48 hodin při 35°C v 5% CO2. Pomocí polystyrénové inokulační kličky byly z povrchu agaru seškrábnuty kolonie a buňky byly poté solubilizovány tak, že 30 pg buněk bylo suspendováno v 150 μΙ vzorkového PAGE pufru (360 mM Tris pufr [pH 8,8] obsahující 4% SDS a 20% glycerol) a suspenze byla inkubována 5 minut při 100°C. Solubilizované buňky byly rozděleny na 12% polyakrylamidových gelech podle Laemmliho a takto separované

- 50 « * · · · ·

proteiny byly elektroforeticky (1,5 hod při 100 V) přeneseny na PVDF membrány, jak bylo již dříve popsáno (Thebaine et al. 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:4350-4354) s tou výjimkou, že do pufru, v němž probíhal přenos, byl přidán 0,05% SDS k usnadnění pohybu proteinů z gelu. PDVF membrány byly pak vysyceny v 25 ml Duibeccova fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku obsahujícího 0,5% kasein sodný, 0,5% hovězí sérum albumin a 1% kozí sérum. Všechny následující inkubace byly prováděny s použitím tohoto sytícího pufru.

PVDF membrány byly inkubovány 1 hodinu při pokojové teplotě s 25 ml 1:500 ředěného neimunního králičího séra nebo séra z králíka imunizovaného polypeptidem OMP106 (jak bylo popsáno výše). PVDF membrány pak byly dvakrát omyty promývacím pufrem (20 mM Tris pufr—[pH-7-_r&]_ob_sah_ujLcí 150 mM chlorid sodný a 0,05% Tween-20). PVDF membrány byly dále inkubovány 30 minut při pokojové teplotě s 25 ml kozích protilátek (ředění 1:5000) proti králičímu IgG, značených peroxidasou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Penn., katalog, č. 111-035-003). Membrány byly 4-krát omyty promývacím pufrem a pak vyvolány

3,3'diaminobenzidintetrachloridem (4 minuty) a peroxidem močoviny (4 minuty), tak jak byla činidla dodána firmou Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, katalog.č. D-4418).

6.1.10. ANTI-QMP106 IMUNQFLUORESCENČNÍ BARVENÍ BUNĚČNÉHO POVRCHU - .....

Buňky M. catarrhalis ATCC 49143 byly pěstovány přes noc na třepačce při 35°C v Mueíler-Hintonově médiu. Buňky byly stočeny na centrifuze a pak resuspendovány ve stejném objemu fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (Duibeccova modifikace bez vápníku nebo hořčíku, PBS/MC). Na každé z 5 čistých mikroskopických sklíček bylo napipeptováno 20 μΙ buněčné suspenze, ponecháno 10 sekund • 9 ·9·9

••9 999

9

9 9 9

ustát, poté byla pomocí mikropipety odstraněna přebytečná tekutina a sklíčka byla ponechána schnout na vzduchu 1 hodinu. Sklíčka pak byla tepelně fixována nad odkrytým plamenem, dokud nebyla teplá na dotek. Sklíčka byla nejprve inkubována 10 minut s 40μΙ anti-OMP106 antiséra nebo neimunního séra ze stejného zvířete, v obou případech ředěného 1:40 v PBS/MC, nebo pouze s PBS/CM, a poté 5-krát

- opláchnuta v PBS/CM. Pak byla sklíčka inkubována s 40 μΙ kozích protilátek proti králičímu IgG (δμρΛηΙ v PBS/MC), značených fluoresceinisothiokyanátem (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., io Gaithersburg, MD, katalog.č. 02-15-06). Sklíčka byla inkubována 10 minut ve tmě a pak opláchnuta 5-krát v PBS/MC. Každé sklíčko bylo uchováváno pokryté PBS/MC pod krycím sklíčkem a bylo prohlíženo ve fluorescenčním mikroskopu s 489 nm filtrem. U každého vzorku byl

--vpěti zorných polích vyhodnocen rozsah~vvbarvenh--15

6.2. VÝSLEDKY

6.2.1. HEMAGLUTINAČNÍ AKTIVITA

Aglutinační aktivita M. catarrhalis vzhledem k erytrocytům je druhově specifická, přičemž nejsilnější aktivita je pozorovaná u lidských erytrocytů. Králičí erytrocyty jsou M. catarrhalis rovněž aglutinovány, ale méně dramaticky než lidské buňky. Erytrocyty i„ z myši, koně nebo ovce nebyly aglutinovány (viz Tabulka 1).

Tabulka 1: Hemaglutinace erytrocytů z různých druhů při použití M.
catarrhalis	ATCC 49143
Zdroi erytrocytů	Skóre hemaqlutinace3
lidské	++++
králičí	++
myší	-
koňské	-
ovčí	-

^a ++++ = nejsilnější aglutinace, - značí nulovou aglutinaci • to

- 52 totototo to· ·· • · ···« • * *··* • · ,· ««to «toto

6.2.2. RECEPTORY A LIGANDY QMP106

Hemaglutinační aktivita M. catarrhalis je způsobená vazbou ke globotetrose (Gb₄). Měchýřky z hemaglutinujících kmenů se vážou ke glykolipidu, který obsahuje Gb₄, zatímco nehemaglutinující kmeny se ke stejnému glykolipidu nevážou (viz Obr. 2). Hemaglutinační aktivita M. catarrhalis je inhibována monosacharidovými složkami Gb₄ nebo deriváty takovýchto monosacharidů, přičemž nejúčinnějšími inhibitory jsou N-acetylgalaktosamin a galaktosa (zejména alfa anomer ío galaktosy) (viz Tabulka 2).

Tabulka 2: Minimální koncentrace cukrů potřebná pro inhibici hemagluťmace-(MIG-)A/yvolané-/VL-cařarr/7a/řs

15	Cukr	MIC (mM)
	D-glukosa	> 167
	D-mannosa	83
	D-galaktosa	41
	L-fukosa	83
20	N-acetyl-D-glukosamin	> 167
	N-acetyl-D-galaktosamin	41
	metyl-a-glukosa	> 167
	metyl-a-mannosa	167
	metyl-a-galaktosa	10
25	metýl-p-galaktosa - —	.· 83 ..........

* Minimální koncentrace cukru potřebná k inhibici hemaglutinační reakce o skóre 1+, vyvolané M. catarrhalis ATCC 49143 u 5% promytych lidských 0+ erytrocytů.

3o N-acetyl-galaktosamin i alfa-galaktosa jsou součástí Gb₄ tetrasacharidu. Korelace mezi hemaglutinaci a vazbou k Gb₄ spolu se zjištěním, že hemaglutinace je inhibována monosacharidy, které jsou součástí Gb₄ receptoru, naznačuje, že buňky M. catarrhalis se vážou na tetrasacharid Gb₄. Tento tetrasacharid je přítomen na lidských erytrocytech a tkáních a mohl by zprostředkovávat připojení buněk M.

catarrhalis k eukaryotickým membránám.

- 53 • fr frfr • frfr · * · · « • frfr · · · • * frfr

6.2.3. IDENTIFIKACE POLYPEPTIDU QMP106

Analýza hemaglutinace buňkami M. catarrhalis, jež byly podrobeny proteolytickému štěpení prokázala, že proteolytické působení chymotrypsinu a proteinasy K ničí hemaglutinační aktivitu a io že působení trypsinu částečně ničí hemaglutinační aktivitu, což naznačuje, že hemaglutinační aktivita je zprostředkována proteiny. Elektroferetická analýza proteinů OMP z proteasově štěpených buněk

-fl47~cařarrha//s—uk-áz-ata—degradaci-mnohvch-proteinů v každém vzorku,_ takže nebylo možné usoudit, který protein jěnpřímo“nebo“ nepřímo15 zodpovědný za hemaglutinační aktivitu (viz Obr. 3).

Jelikož pokus s proteolytickým štěpením naznačil, že za hemaglutinační aktivitu je přímo nebo nepřímo zodpovědný polypeptid, porovnali jsme v SDS-PAGE profily OMP proteinů z hemaglutinujících a nehemaglutinujících kmenů (Obr. 4). Z rozdílů mezi těmito profily je vidět, že hemaglutinující kmeny mají dva charakteristické polypeptidy, jeden se zdánlivou molekulovou hmotností 27 kDa (označený OMP27) a druhý polypeptid, který jako jediný měl zdánlivou molekulovou hmotnost větší než 106 kDa (označený OMP106). Nápadná je nepřítomnost pruhu tohoto OMP106 polypeptidu v preparátech OMP proteinů získaných z buněk, které po štěpení různými proteasami měly sníženou nebo eliminovanou hemaglutinační aktivitu, zatímco pruh OMP27 byl přítomen v preparátu OMP z buněk opracovaných proteinasou K, které neměly žádnou hemaglutinační aktivitu. Navíc, pruh polypeptidu OMP106 nebyl

3o degradovaný u buněk štěpených proteinasou V8, které nemělo žádný účinek na hemaglutinační aktivitu těchto buněk.

6.2.4. OMP PROFIL NHA KULTIVARŮ

Sériovou kultivací HA kultivaru ATCC 49143 ve statické kultuře při 35°C vznikl NHA kultivar (označený 49143-NHA) v třetí pasáži kultury. Tato ztráta hemaglutinační aktivity byla reprodukovatelná.

Analýza elektroforetických profilů proteinů OMP v oktylglukosidových extraktech vnější membrány z HA a NHA kultivarů ukázala, že v extraktu 49143-NHA chybí proužek polypeptidu OMP106 (Obr. 5). Toto naznačuje, že polypeptid OMP106 je hemaglutininem M. catarrhalis (tj., polypeptid OMP106 váže Gb₄ receptor nebo je io podjednotkou homopolymerního proteinu, který váže Gb₄ receptor) anebo tvoří část hemaglutininu M. catarrhalis (tj., polypeptid OMP106 je podjednotkou heteropolymerního proteinu, který váže Gb₄ receptor).

6.2.5. QMP106 A HEMAGLUTINACE

Polyklonální antisérum namířené proti polypeptidu OMP106 z kmene ATCC 49143 neutralizovalo hemaglutinaci způsobenou kmenem ATCC 49143, jakož i heterologním kmenem ATCC 43627. Tento výsledek dále podporuje závěr, že hemaglutinující aktivita M. catarrhalis obsahuje polypeptid OMP106 a že polypeptid OMP106 je jako antigen konzervován mezi kmeny. To je vidět i na Obr. 9A, který ukazuje, že protilátky v polyklonálním antiséru vážou polypeptid OMP106 z heterologních kmenů M. catarrhalis.

Q.2.Q. UMÍSTĚNÍ OMP106 TC VNĚJŠÍM^ POVRCHU

Králičí anti-OMP106 antisérum bylo použito v nepřímém imunofluorescenčním barvení, aby se zjistilo, zda je OMP106 přístupný na vnějším povrchu buněk M. catarrhalis. Buňky M. catarrhalis se anti-OMP106 antisérem barvily intenzivněji a rovnoměrněji než buňky, které byly inkubovány s neimunním sérem nebo s PBS/MC. Z toho vyplývá, že intaktní polypeptid OMP106 na ·· ···· ···· · · · · · · ·

CC · · ··· ·«··

- QO - · ··«· · · ··· ··» • 0 0··· 0 β

00· ··· ·· 0· ·· ·· buňkách Μ. catarrhalis reaguje s anti-OMP106 protilátkami. Tento výsledek naznačuje, že polypeptid OMP106 je přístupný na vnějším povrchu buněk M. catarrhalis. Toto zjištění je v souladu s představou, že polypeptid OMP106 se účastní hemaglutinace a naznačuje navíc, že polypeptid OMP106 by mohl být užitečný jako vakcína.

6.2.7. VLASTNOSTI POLYPEPTIDU QMP106

Polypeptid OMP106 existuje v nativním stavu jako velký proteinový komplex a při extrakci oktylglukosidem tvoří agregáty. Tento závěr má podporu ve zjištění, že extrakce buněk M. catarrhalis oktylglukosidem solubilizuje polypeptid OMP106, ale extrahovaný ~polypepťícl~OMP1O6 nevnikne do~denaturujíčího polyakrylarnidovehcr gelu, pokud není extrakt nejprve inkubován při 100°C (Obr. 6). Nezdá se ale, že by proužek polypeptidu OMP106 vznikal z polypeptidů o nižší molekulové hmotnosti agregací nebo polymerizací při zahřívání, neboť polypeptid OMP106 v nikoli tepelně denaturovaném vzorku je zachycen v jamce pro nanášení vzorku a vstupuje do dělícího gelu jen tehdy, byl-li vzorek nejprve inkubován při 100°C. Této biochemické vlastnosti lze velmi výhodně použít při identifikaci polypeptidu OMP106 v různých gelech.

Po inkubaci oktylglukosidových extraktů M. catarrhalis s SDS při 100°C a rozdělení proteinů elektroforézou v denaturujícím polyakrylamidovém gelu, jsme stanovili zdánlivou molekulovou hmotnost polypeptidu OMP106 pro různé kmeny M. catarrhalis, konkrétně ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628, v rozmezí asi od 180 kDa do 230 kDa (Obr. 9A), kdežto polypeptid OMP106 z kmene ATCC 49143 má zdánlivou molekulovou hmotnost okolo 190 kDa (Obr, 6).

9999

- 56 99 99 ·· 9 9 9 9 9 • · * · 9 9 9 9 • · · · 9 · ··· 999 • 9 9 9 9 9 t

Polypeptid OMP106 z kmene ATCC 49143 byl extrahován z gelu a podroben N-koncové sekvenaci. Zjištěná sekvence N-konce polypeptidu OMP106 z vnější membrány M. catarrhalis ATCC 49143 je IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ

ID NO:1). Dále byl po štěpení OMP106 endoproteinasou Lys-C (Fernandez et ai., 1994, Anal. Biochem. 218:112-117) izolován vnitřní peptid a jeho sekvence určena jako GTVLGGKK (SEQ ID NO:2).

Připravili jsme tři oligonukleotidové sondy. Dvě sondy odpovídají vnitřnímu peptidu GTVLGGKK, z nichž jedna má sekvenci io GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (SEQ ID NO:3) a druhá sekvenci GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (SEQ ID NO:7). Další sonda, Mc 5-72, kódující vnitřní fragment (SEQ ID NO:5) aminokoncové sekvence polypeptidu QMP106 (SEQ ID NO:1) má sekvenci

-GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAA

ATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA (SEQ ID NO:4). Při

Southernově hybridizaci k úplnému HindlII nebo Dral digestu DNA M. catarrhalis poskytla sonda Mc 5-72 u obou digestů jediný pruh (Obr. 7). Hybridizující pruh v HindlII digestu má přibližnou velikost 8,0 kb; hybridizující pruh v Dral digestu má přibližnou velikost 4,2 kb (Obr. 7).

6.2.8. KONZERVACE POLYPEPTIDU QMP106

Analýza extraktů vnějších membránových proteinů řady kmenů M. catarrhalis a příbuzných bakteriálních druhů westernovým přenosem ukázala, že anti-OMP106 protilátky se vážou u mnoha kmenů M. catarrhalis k polypeptidu o velikosti okolo 180 kDa až 230 kDa, a to jak u HA tak NHA kmenů nebo kultivarů (Obr. 9A). Anti-OMP106 protilátky se nevázaly k žádnému polypeptidu v proteinových extraktech z příbuzných bakterií (Obr.8A). Tyto výsledky dokazují následující: 1) Anti-OMP106 protilátky mohou být použity ke specifické identifikaci a odlišení M. catarrhalis od příbuzných bakteriálních druhů. 2) Polypeptid OMP106 může být • · • · použit k přípravě protilátek, jež mají diagnostické uplatnění pro identifikaci M. catarrhalis. 3) Protilátky proti polypeptidu OMP106 jednoho kmene (např. OMP106 kmene ATCC 49143) mohou být použity na identifikaci a izolaci odpovídajícího polypeptidu OMP106 u jiných kmenů M. catarrhalis. Výsledky westernové analýzy kupodivu ukázaly, že mnohé NHA kmeny M. catarrhalis mají v OG extraktech svých vnějších membrán polypeptid OMP106. Toto zjištění a skutečnost, že v PAGE oktylglukosidových extraktů vnějších membrán NHA kmenů M. catarrhalis není po barvení stříbrem viditelný io pruh v oblasti 180 kDa až 230 kDa naznačuje, že polypeptid OMP106 je exprimován většinou kmenů nebo kultrivarů M. catarrhalis, ale k tomu, aby byl aktivní v hemaglutinaci (tj., aby se vázal k receptoru na povrchu savčí buňky) nebo byl barvitelný stříbrem, musí být _polypeptid QMP106 určitým způsobem modifikovaný. Zdá se. že pouze

HA kmeny a kultivary jsou schopné příslušně modifikovat polypeptid OMP106 tak, aby mohl zprostředkovávat vazbu bakterií k hemaglutininovému receptoru na povrchu savčích buněk.

7. PŘÍKLAD: ÚČINNOST OMP106 VAKCÍNY: CYTOTOXICKÁ

AKTIVITA ANTI-0MP106 ANTISÉRA

Aby se určil vakcinační potenciál polypeptidu OMP106, byla u anti-OMP106 protilátek studována cytotoxická aktivita zprostředkovaná komplementem. Proti polypeptidu OMP106 z HA kultivaru ATCC 49143 bylo připraveno antisérum, jak bylo popsáno výše v části 6.1.8. Aktivita neimunního séra a anti-OMP106 antiséra v zabíjení buněk M. catarrhalis komplementem byla studována pomocí „Sérového Bactericidního Testu“, podle Zollingera et al. (Immune Responses to Neiserria meningitis, v Manual of Clinical Laboratory Immunology. 3^rd ed., str. 347-349) stou výjimkou, že místo buněk

3o Neiserria meningitis byly použity buňky HA a NHA kmenů nebo kultivarů M. catarrhalis.

Výsledky ukazují, že zabíjení komplementem bylo zprostředkováno anti-OMP106 antisérem u buněk HA kultivaru heterologního M. catarrhalis ATCC 43627, ale nikoli u buněk NHA kultivaru M. catarrhalis ATCC 43627 nebo NHA M. catarrhalis ATCC 5 8176. Tabulka 3 shrnuje cytotoxické aktivity neimunního séra a antiOMP106 antiséra proti HA kultivaru ATCC 43627 zprostředkované komplementem.

Tabulka 3:	Cytotoxická aktivita neimunního séra a anti-OMP106 antiséra zprostředkovaná komplementem
Cytotoxický titr* 1
Experiment 1 Experiment 2	Neimunní Anti-OMP106 16 128 8 64

___Titr představuje nejvyšší ředění,_při_němž může_sérum_ zprostředkovat zabíjení buněk HA kultivaru ATCC 43627 komplementem (např. hodnota 16 znamená, že sérum bylo 16krát zředěno), čím vyšší je číslo, tím vyšší je cytotoxická aktivita nebo titr.

Jak je vidět z Tabulky 3, anti-OMP106 antisérum má 8-krát větší cytotoxickou aktivitu než neimunní sérum. Tento výsledek ukazuje, že polypeptid OMP106 je užitečný jako vakcína proti HA kmenům a kultivarům M. catarrhalis.

I když je vynález podrobně popsán pokud jde o jeho konkrétní provedení, rozumí se, že funkčně ekvivalentní odchylky spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Různé další modifikace vynálezu, vedle těch, které jsou zde ukázány a popsány, budou osobám zběhlým v oboru zřejmé z předešlého popisu a doprovodných obrázků. Takovéto modifikace budou spadat do rozsahu připojených nároků.

Jsou zde citovány různé publikace a jejich zveřejnění jsou zahrnuta odkazem jako celek.

•4 4444 ·· 44

- 59 SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: TUCKER, KENNETH 5 PLOSILA, LAURA (* (íí) NÁZEV VYNÁLEZU: VNĚJŠÍ MEMBRÁNOVÝ PROTEIN-106 Z

MORAXELLA CATARRHALIS, POLYPEPTID, SEKVENCE GENU · A JEJICH POUŽITÍ (iii) POČET SEKVENCÍ: 8 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: PENNIE & EDMONDS (B) ULICE: 1155 Avenue of the Americas ~ (CTMĚBTOTNěvirÝořR (D) STÁT: New York (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ (ZIP): 10036-2711 (v) POČÍTAČOVÝ FORMÁT:

(A) TYP MÉDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) ÚDAJE O PŘEDLOŽENÉ PŘIHLÁŠCE (A) číslo přihlášky: us (B) DATUM PODÁNÍ:

(C) KLASIFIKACE:

(viii) INFORMACE O ZASTOUPENÍ:

(A) JMÉNO: Baldwin, Geraldine F.

(B) ČÍSLO REGISTRACE: 31,232 (C) REFERENČNÍ ČÍSLO: 7969-045 · · 0 • 0 · • »

- 60 - :

0

(ix) INFORMACE O SPOJENI:

(A) TELEFON: (212) 790-9090 (B) TELEFAX: (212) 869-8864 (C) TELEX: 66141 PENNIE (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Ile Gly Ile Ser Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg 15 10 15

Gly Asp Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gin Ala Leu Gly Ser 20 25 30

Gin Ser Ile Ala Ile Gly Asp Asn Lys Ile Val 25 3 5 40 • ’ (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2: ™ — (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin 30 (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE: neznámá • · ···· · · · · • · · · ·

(ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Gly Thr Val Leu Gly Gly Lys Lys

5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: neznámý

--(D) TOPOLOGIE: neznámá15 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „sonda“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

GGNACNGTNC TNGGNGGNAA RAAR 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 72 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová ₌......_ (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLlČ: CDS (B) POLOHA: 1..72 • · • ·

- 62 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

GAA GCG GAC GGG GGG AAA GGC GGA GCC AAT GCG CGC GGT GAT 42 Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp

1 5 10

AAA TCC ATT GCT ATT GGT GAC ATT GCG CAA 72

Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gin

20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 aminokyselin

15_(B)UrYR:_aminoky.seJinová_ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp Lys Ser 15 10 15

Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gin 25 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: 30 (A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá ·*··

- 63 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „sonda“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

YTTYTTNCCN CCNAGNACNG TNCC 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

Ί5---(A)“POPISr/desc =gsonda“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

GGNACNGTNT TRGGNGGNAA RAAR 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá 25 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „sonda“ (v) TYP FRAGMENTU: N-koncový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

YTTYTTNCCN CCYAANACNG TNCC 24

Zastupuje:

- 64 tt · · ···· ·· ·· * · « · · · « • · · · · · « • · · * ··· · · « • · · · · 1 ·· ·· ·· ··

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný nebo v podstatě čistý polypeptid OMP106, který je vnějším membránovým polypeptidem Moraxella catarrhalis a jehož molekulová hmotnost činí přibližně 180 až 230 kDa při stanovení 5 elektroforézou v SDS polyakrylamidovém gelu s použitím myosinu králičího kosterního svalu 200 kDa a β-galaktosidasy E. coli 116,25 kDa jako stanadardů molekulových hmotností.

   2. Polypeptid OMP106 podle nároku 1, který má molekulovou io hmotnost přibližně 190 kDa.

   3. Polypeptid OMPT06 podle n á roku 1, který je vnějším membránovým polypeptidem kmene Moraxella catarrhalis, vybraného ze skupiny ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618,

   ATCC 43627, ATCC 43628 a ATCC 49143.

   4. Polypeptid OMP106 podle nároku 3, kde kmen Moraxella catarrhalis je ATCC 49143.

   5. Polypeptid OMP106 podle nároku 3, kde Moraxella catarrhalis je hemaglutinující kultivar.

   6. Polypeptid OMP106 podle nároku 1, který reaguje se stříbrným barvivém.

   7. Polypeptid OMP106 podle nároku 1, který specificky váže protilátku, jež se specificky váže k sekvenci SEQ ID NO:1 nebo jejímu fragmentu.

   - 65 5 8. Polypeptid OMP106 podle nároku 1, který specificky váže protilátku, jež se specificky váže k sekvenci SEQ ID NO:2.

   9. Izolovaný nebo v podstatě čistý polypeptid OPM106, který obsahuje sekvenci podstatně homologní se sekvencí SEQ ID NO:1.

   10. Polypeptid OMP106 podle nároku 9, který navíc obsahuje _sekvenci SEQ ID NQ:2 ._

   11. Polypeptid OMP106 podle nároku 9, který obsahuje 15 sekvenci SEQ ID NO:1.

   12. Polypeptid OMP106 podle nároku 11, který navíc obsahuje sekvenci SEQ ID NO:2.

   13. Izolovaná protilátka, která specificky váže polypeptid

   OMP106 podle nároku 1, nebo jeho fragment.

   14. Izolovaná protilátka, která specificky váže polypeptid

   OMP106 podle nároku 9, nebo jeho fragment.

   15. Izolovaná protilátka, která specificky váže polypeptid

   OMP106 podle nároku 11, nebo jeho fragment.

   ·· * ·

   - 66 16. Izolovaná protilátka podle nároků 13 a 14, která je cytotoxickou protilátkou, která umožňuje zabíjení buněk Moraxella catarrhalis komplementem.

   17. Peptidový fragment polypeptidů OMP106 podle nároku 1, který se specificky váže k protilátce, jež specificky váže zmíněný polypeptid OMP106.

   io 18. Peptidový fragment polypeptidů OMP106 podle nároku 9, který se specificky váže k protilátce, jež specificky váže zmíněný polypeptid OMP106.

   19. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid 15 OMP106 podle kteréhokoli z nároků 1, 2, 5 nebo 9.

   20. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje peptidový fragment podle nároku 17 nebo 18.

   21. Antigenní prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid OMP106 podle kteréhokoli z nároků 1, 2, 5 nebo 9.

   22. Antigenní prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje peptidový fragment podle nároku 17 nebo 18.

   23. V podstatě čistá DNA, obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid OMP106 podle nároku 1 nebo 9.

   24. V podstatě čistá DNA, obsahující nukleotidovou sekvenci kódující peptid o sekvenci SEQ ID NO:1.

   - 67 25. V podstatě čistá DNA kódující polypeptid OMP106, která 5 obsahuje nukleotidovou sekvenci, jež hybridizuje za vysoce stringentních podmínek se sekvencí SEQ ID NO:4 nebo se sekvencí komplementární k SEQ ID NO:4.

   26. DNA podle nároku 24, která obsahuje sekvenci SEQ ID NO:4 ío nebo sekvenci komplementární k SEQ ID NO:4.

   _27, Způsob navození imunitní odpovědi ve zvířeti, zahrnující ířňuňiižači~zvířětě~učlnTíým~mnOŤstvím—polypeptidti—ΟΜΡ-4Ό6—podtekteréhokoli z nároků 1, 2, 5 nebo 9.

   28. Způsob navození imunitní odpovědi ve zvířeti, zahrnující imunizaci zvířete účinným množstvím peptidového fragmentu podle nároku 17 nebo 18.

   29. Způsob produkce nehemaglutinujícího kultivaru M.

   catarrhalis z HA kmene nebo kultivaru M. catarrhalis, vyznačující se tím, že zahrnuje postupné pasážování HA kmene nebo kultivaru M. catarrhalis ve statických tekutých kulturách. =25

   Zastupuje:

   V10

   8176 23246 25238 £ j? ží >u >í. S ϋ 3 o £ o

   49143