TW541314B - Moraxella catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, gene sequence and uses thereof - Google Patents
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541314 發明説明(1 ) 1. 發明介紹 本發明大體而言係關黏膜炎莫拉氏菌之外膜蛋白_ 106(01^-106)多肽。本發明涵蓋一種純化的(:^1>1〇6多肽 及衍生自該多肽的多肽(OMP-106衍生多肽)。本發明亦涵 盍抗體,包括細胞毒性抗體,其專一結合至〇Mp丨〇6多肽 及/或OMP 106衍生多肽。本發明尚涵蓋預防或治療用的組 合物,包括疫苗,其含有OMP 1〇6多肽及/或OMP 106衍 生多肽。此外本發明還提供在哺乳類體内引發對黏膜炎莫 拉氏囷產生兄疫反應的方法。本發明更提供了分離之編碼 OMP 106多肽和OMP 106衍生多肽的核甞酸序列,具有該 序列之載體,以及含有該載體的寄主細胞。 2. 發明背景 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)亦以黏膜炎莫拉 氏(布蘭罕氏,Branhamella)菌見知,而先前以黏膜炎雙球 ΪΙ或黏膜炎球菌見知,它是一種經常在人體呼吸道發現的 革蘭氏陰性菌。黏膜炎莫拉氏菌起初被認爲是一種無害的 共生生物,現在則被認知爲動物體上呼吸道與下呼吸遒感 染的病原體。在人體,黏膜炎莫拉氏菌會在有慢性肺病的 成人身上引發嚴重的下呼吸道感染,在免疫折衝的患者身 上造成系統感染,並在嬰兒和兒童身上引起中耳炎和竇炎 。請參考Helminen等人於1993年在 <傳染病免疫學> (Infect. Immun.),第 61 期,2003-2010 頁發表的論文; Catlin,B.W·於1990年在〈臨床微生物回顧> (ciin· -4 - 本紙张尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 541314 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(2 )
Microbiol· Rev),第3期:293-320發表的論文;以及其中 引用的參考文獻。 2丄膜蛋白和保護性抗體 黏膜炎莫拉氏菌之外表成份已經被研究以暸解其致病過 程和發展出有用之治療方式和抗此種感染的預防性處置辨 法。外膜蛋白(OMP)在作爲可能之致病因子和可能之疫苗 抗原上尤其倍受重視。黏膜炎莫拉氏菌具有大約1 〇至20 種不同的OMPS,而其中有6至8種,也就是OMP A至Η 是主要的種類(Murphy和Loeb,1989年),〈微生物病理學 > (Microbial. Pathogen),第 6 期:1 59-1 74 頁)。OMP A 至 Η的分子量範圍分別在97至20 kD·。請參考Baftos和 Murphy.,1988 年,〈傳染病雜誌> (H. Infect. Dis.),第 158 期:761-765頁;Helminen等人,1993年,〈傳染病免疫 學 > (Infect· Immun.),第 61 期:2003-2010 頁;Murphy 等人 ’ 1993 年’〈分子微生物學> (Molecul. Microbiol·), 第10期:87-97頁;和Sarwar等人,1992年,〈傳染病免 疫學 > (Infect. Immun.),第 60 期:804-809 頁。比較 50 株 黏膜炎莫拉氏菌之外膜蛋白以硫酸十二酯鈉聚丙晞醯胺凝 膠電泳(SDS-PAGE)得到的輪廓圖,其顯示OMP A至Η有 近乎均一的樣式(Bartos和Murphy,1988年,<傳染病雜 諸 > (J. Infect· Dis),第 158 期:761-765)。 除了 OMP A至Η,還有以種高分子量的OMP以HMW-ΟΜΡ標示,它以SDS-PAGE可得350至720 kD之表面分子 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) --^^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 __—_ B7 五、發明説明(3 ) 量,這種OMP也被鑑識爲許多黏膜炎莫拉氏菌菌株所含的 另一種主要的表面成份。HMW-OMP經甲酸變性會產生一 道120至140 kD之寬帶,顯示其爲一種寡聚物之蛋白質 (Klingman 和 Murphy,1 994 年,〈傳染病免疫學 > (Infect Immun·),第 62 期:1 1 50-1 1 55 頁)。HMW-OMP 顯然與 Helminen等人所標不的UspA(1994年,<傳染病雜詰> (j Infect. Dis),第170期:867-872頁)是相同的蛋白質,且 被顯示存在許數種黏膜炎莫拉氏菌中。 在完整的細菌或細菌衍生之外膜囊泡之中,數種以上鑑 認過的OMP提供了曝露在表面的抗原決定部位,而該部位 能引發與OMP結合之抗體產生。這些具有引發免疫性的 OMP 包括 OMPE 和 OMPG(Murphy 和 Bartos,,1989 年, 〈傳染病免疫學 > (Infect· Immun·),第 57 期:2938-2941 頁);OMP C/D(Sarwar等人,1992年,〈傳染病免疫學〉 (Infect· Immun·),第 60 期:804-809 頁);CopB,一種 80 kD之OMP·,(Helminen)等人,1993年,〈傳染病免疫學〉 (Infect· Immun·)’ 弟 61 期:(2003-2010 頁);和 UspA(Helminen 人,1994年,〈傳染病雜誌> (j. Infect Dis.),第170期: 867-872 頁)。 抗體對於CopB和UspA曝露在表面的抗原決定部份之治 療潛能已在一項動物與典範中做過評估。該典範涉及直接 用經數量控制的黏膜炎莫拉氏菌細胞對BALB/C VAF/ Plus 老鼠的肺進行小丸劑接種。接著檢驗肺部之清除細菌的速 率(Unhanand 等人,1992 年,< 傳染病雜誌 >(j.Infect.Dis.) -6 · $氏張尺度適财酬家鮮(CNS ) A4規格(210X297^楚) ' 2 ?----^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 k 541314 A7 B7 五、發明説明(4 ) ,第165期;644-650頁)。黏膜炎莫拉氏菌之不同的臨床 分離物顯示其有不同的清除速率,而此速率與顆粒球新份 子進入感染邵位的程度有關。以針對c〇pB或UspA表面曝 露之抗原決定部位的單源抗體進行被動免疫,會增加肺部 黏膜炎莫拉氏菌的清除速率(Helminen等人,1993年,< 傳染病兄疫學 > (Infect. Immun.),第 61 期·· 2003-2010 頁 ;Helminen等人,1994年,〈傳染病雜誌>,第17〇期: 867-872 頁)〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 衣· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2·2·座,菌/寄主細胞的枯著與血球凝集 細菌性病原粘結至寄主細胞表面會促進菌落生成並列 發病的發生。參考E.H Beachey,1981年,<傳染病雜 >第143期:325-345頁)。革蘭氏陰性菌典型地會表現出 寄主細胞表面之醣蛋白及/或醣脂上的特定結人 面外源,集素。這種外源凝集素f與細菌的毛或纖毛在 ,二細菌粘結亦可經由其與寄主細胞表面之厭水性及/或 荷文互作用之非等定結合而發生。 黏膜炎莫拉氏菌粘結至呼吸遒細胞的機制至今尚不清 。4微生物會黏結至培養的人類口咽上皮細胞(Mbaki) 人,1987年,<Tohuku實驗醫學雜誌> (T〇huku ; & :第153期·· 11卜121頁。Rikitomi等人的一項义 九棱出纖毛可能在細菌與此種細胞的黏結上扮演某種角丨 因爲當纖毛變性或用抗纖毛之抗體處理會降低有纖毛· 菌株與細胞的黏結(Rikit〇mi等人,1991年,<斯堪地系
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經濟部中央標準局Μ工消费合作社印?未 維亞傳染病學雜誌> (Scand· j· Infect· Dis.),第23期· 5 5 9-567頁)。纖毛能調控結合,然而它並不是這種結合的 唯一基礎’因爲在受檢之數種菌株之中最具黏結性的菌株 是不具纖毛的菌株。 在細菌黏著的歸類之中,血球凝集常常取代較爲複雜的 黏結檢驗。然而,Rikitomi等人發現黏膜炎莫拉氏菌的菌 株(Id·)與人的口咽上皮細胞之黏結和該菌株造成的血球凝 集並無相關性。也就是説有三種高度黏結之菌株並不會使 人的紅血球凝集。因此,在人的口咽上皮細胞黏結和血球 凝集上牵涉不同的結合機制。 相對地,一項由Keliens等人發表之最近的研究提出由黏 膜炎莫拉氏菌造成的血球凝集與寄主細胞的枯結相關 (Kellens 等人,1995 年,〈傳染 > (Infection),第 23 期·· 3 7-41頁)。不過,這項研究採用一種基於細菌結合到豬的 氣官切片之枯結檢驗。至於褚的氣管纟且織和人的呼吸道、组 織是否能就其與黏膜炎莫拉氏菌致病菌株之粘結而被視爲 同源,則並不清楚。 雖然該枯結性的檢驗有問題,Kellens等人檢驗了 80多 種黏腹:炎莫拉氏菌之臨床分離物的血球凝集活性(Kaliens 等人,1995 年,〈傳染 > (Infection),第 25 期:37-41 頁) 。幾乎有四分之三受檢的菌株會使人、兔、天竺鼠、狗或 老鼠的紅血球凝集,但是其餘的菌株卻不能。他們對某些 能使血球凝集的菌株之凝集活性做進一步的特性鑑定,顯 示此活性是鈣離子需求性的,且會被胰蛋白酶消化或高溫 -8- 本紙张尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝· 訂 541314 A7 B7 經濟部中央標準局Η〈工消费合作社印製 五、發明説明(6 處理或添加右旋一葡萄糖胺或右旋一半乳糖胺所抑制。 一項由Tucker等人所做的對於能使血球凝集和不能使血 球凝集之黏膜炎莫拉氏菌所進行的調查顯示所有菌株都會 與醣脂上的神經節丁醣菩醯基鞘氨醇結合,但只有能使血 球皱集的菌株才會與醣脂上的球細胞丁醣甞醯基鞘氨醇結 合(Tucker等人,1994年,美國微生物學會年會,第Di24 號摘要)。並且,黏膜炎莫拉氏菌的血球凝集活性顯示會被 各種包含球細胞丁醣菩醯基鞘氨醇的醣類分子部分之單醣 所抑制。這些發現使Tucker等人提出黏膜炎莫拉氏菌是藉 由與敏感的紅血球細胞膜中之球細胞丁醣甞醯基鞘氨醇( 包括那些人的紅血球細胞膜中的),而使血球凝集。到目前 沒有先前的技藝曾鑑識到黏膜炎莫拉氏菌外表負責與寄主 細胞黏結或血球凝集的分子。這項應用之此部份或任何其 他部份中任何參考文獻的引用或認證不應被解釋爲其意指 此類參考文獻對本發明是可得的先前技藝。 3·發明的摘鋒: 本發明涵蓋了黏膜炎莫拉氏菌的〇Mp 1〇6多肽和〇Mp · 106何生多肽和製造該多肽的方法。本發明亦涵蓋抗血清 和抗體,包括特定於OMP1〇6多肽及/或〇Μρι〇6衍生多肽 之具細胞毒性的抗體。本發明尚涵蓋引發免疫反應的,預 防或治療的組合物,包括疫苗,其包含-種以上的該多肽 。此二卜’纟發明尚涵蓋編碼該多肽之核苷酸序列。本發明 更涵盍了引發免疫反應的,預防或治療的組合物。包括疫 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝· 訂 -9- 541314 A7 ---—----- B7 五、發明説明(7 ) 田,其含有一種減弱或去活性之不具血球凝集作用的黏膜 炎莫拉氏菌培養株。 本發明有許多用途。例如,〇Mpl〇6多肽和〇Μρι〇6衍 生多肽可用作偵測因黏膜炎莫拉氏菌感染所引發之抗體的 配體(例如用在診斷黏膜炎莫拉氏菌感染)。〇Mp 1〇6多肽 和OMP106衍生之多肽亦可用作爲引發特定於黏膜炎莫拉 氏菌之抗體的免疫原)。而這種抗體在偵測生物標本中的黏 膜炎莫拉氏菌之免疫檢驗上有用。而本發明之具細胞毒性 之抗體則有用於對黏膜炎莫拉氏菌感染進行被動免疫。 OMP 106多肽和OMP 106衍生之多肽更可用做爲抗黏膜炎 莫拉氏菌感染之疫苗中的活性成份。 本發明乃基於一項驚奇的發現:能使血球凝集的黏膜炎 莫拉氏菌的菌株及培養株含有一種外膜蛋白〇Mp丨〇6多肽 ’其分子量約爲180 kD至約2 3 0 kD,而不具血球凝集作 用的黏膜炎莫拉氏菌的菌株及培養株則不具OMP 1 〇6多肽 或是其有在血球凝集上不具活性且無法用銀染的未正確修 飾過之OMP 1 06多肽。本發明尚基於一項發現,即從能使 血球凝集的黏膜炎莫拉氏菌分離出之OMP 1 06多肽所引發 生成的多源抗血清具有抗不同之能使血球凝集黏膜炎莫拉 氏菌菌株的胞毒活性,但此種活性卻不能抵抗不使血球凝 集之黏膜炎莫拉氏菌菌株。 3.1定義和縮簡窵字 抗-OMP 106 =抗-OMP 106多肽之抗體或抗血清 -10- —本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297^釐) ----2---L---•衣II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 訂 541314 A7 B7 五、發明説明(8 ATCC 膜泡(blebs) Gb4 HA 具免疫活性的 kD 黏膜炎莫拉氏菌 (M. Catarrhalis) NHA 0G. OMP 106 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 OMP 106衍生多肽 美國典型培養物收集中心 自然生成之黏膜炎莫拉氏菌的外 膜泡 GalNAc /? l-3Gal ^ l-4Gal^ 1-4Glcl-l醯基鞘氨醇 使血球凝集 能驅動細胞或體液的免疫反應 千道爾呑 Me ; 黏膜炎莫拉氏菌; 黏膜炎莫拉氏(布蘭罕氏)菌; 黏膜炎布蘭罕氏菌; 黏膜炎雙球菌;或 黏膜炎球菌。 不能使血球凝集。 正-辛基-/? -D-吡喃糖甞 黏膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白-1 06 ,其具有大約180 kD至大約230 kD之分子量(以SDS-PAGE);可用 OG或肌氨醯基洗濯劑從膜泡或 完整的黏膜炎莫拉氏菌細胞抽取 到0 OMP 106多肽的片段;野生型〇mf 106多肽或其片段的變異物,包含 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541314 A7 B7 五、發明説明(9 經濟部中央標準局負工消费合作社印t 一個或更多個胺基酸的削去,插 入或取代;或是包含一段與完整 的OMP 106多肽或其部份之C-端 ,N-端或中間片段融合之異源多 肽的後合型蛋白。 ==外膜蛋白(單數) =外膜蛋白(複數) =磷酸鹽緩衝之鹽液 =聚丙晞醯胺凝膠 二任何長度的肽,較好是具有1 〇個 或更多胺基酸殘基的肽 =硫酸十二酯鈉 硫酸十二酯鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 P免月曰中走我之核菩酸或核酸序列以單一字母符號代 表驗基如下: A (腺嘌呤) C (胞嘧淀) G (鳥糞嘌呤) T (胸喊淀) U (尿喊淀) M (A 或 C) R (A 或 G) W (A 或 T/U)
OMP OMPs PBS PAG 多肽 SDS SDS-OAGE 12- 本紙张尺度相巾關家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) r裝· 訂 541314 Α7 Β7 五、發明説明(1〇 ) S (C 或 G) Y (C 或 T/U) K (G 或 T/U) V(A或C或G ;不是T/U) Η (A或C或T/U ;不是G) D (Α或G或T/U ;不是C) B (C或G或T/U ;不是Α) Ν (Α或C或G或T/U)或是(未知鹼基) 本説明書中定義的肽和多肽序列係以單一字母的符號代 表胺基酸殘基如下: Α (丙胺酸) R (精胺酸) N (天冬醯胺) D (天冬胺酸) C (半胱胺酸) Q (麩醯胺) E (越胺酸) 經濟部中央標準局男工消费合作社印裂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) G (甘胺酸) Η (組織胺酸) I (異丙胺酸) L (白胺酸) Κ (離胺酸) Μ (甲硫胺酸) -13- 本紙张尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X297公釐)
、發明説明(n F (苯丙胺酸) P (脯胺酸) S (絲胺酸) T (蘇胺酸) w (色氨酸) Y (路氨酸) V (纈氨酸) X (未知胺基酸殘基) 本發明可經由參考以下發明之詳細説明、發明之非限制 性的特定具體實例和附圖而得到£完全的瞭解。 圖 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 圖的簡短説明: 1 :黏膜炎莫拉氏菌膜泡或整個黏膜炎莫拉氏菌之辛基 葡萄糖甞(0G)萃取液之外膜蛋白以變性page比較 义輪廓圖。每一行的數字係指ATCC之菌株標示。 用一預染之SDS-PAGE標準試樣(Biorad目綠#161-0305)做爲分子量的標記。該標準試樣包含以下多肽 ,其大約的分子量註記於括弧之中:兔子的肌肉磷 酸化酶B(106 kD);牛血清白蛋白(8〇 kD);難蛋白 之卵清蛋白(49.5kD);牛碳酸酐酶(32.5kD);黃豆 胰蛋白酶抑制(27.5 kD);雞蛋白溶菌酶(18.5 kD) 。凝膠上分子量標記物的位置以箭頭註記在圖的 左側,而將某些標記物的分子量(kD)註記在箭頭的 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨〇><297公釐) 訂 、發明説明(12 上方 圖2 圖 經濟部中央標準局炅工消费含作社印製 圖4 I-標記之外膜膜泡包覆醣脂之薄層色層分析圖 所得的結果。在A-C的長方格中,第i行含有標示 於左(、丨的醣月曰標準物;第2行含有asialo-GMi ;第3 仃含有Gb3 , Gb4和佛尚斯曼抗體(F〇rssman antigen);第4行含有人類紅血球的弗荷(F〇lch)抽出 物。長方格A中的層析圖係以地衣酚染過者,長方 格B的層析圖係以ATCC菌株8n6(一種不會使血球 凝集的菌株)之-標記的膜泡包覆,長方格c的層 析圖則2以ATCC菌株49143(一種使血球凝集的菌 株)之標誌的膜泡包覆者。只有會使血球凝集的 菌株結合至第3行及第4行的Gb4醣脂寬帶上。 •在以圖中指示的蛋白酶消化黏膜炎莫拉氏菌之後, 用銀染外膜蛋白的辛基葡萄糖:y:抽出物所得之蛋白 質輪2圖。圖下方標示有HA的直行係指細胞在消化 义後呈血球凝集之活性。本圖所使用之分子量標記 物如圖1。 τ :從各種黏膜炎莫拉氏菌之ATCC菌株獲得的外膜蛋 白經銀染之蛋白質輪廓圖比較。菌株標示於每一行 的上方。圖下方標有HA的直行係指具有血球凝集活 性的菌株。請注意對具有血球凝集活性的菌株而言 以 125 」--卜----^裝丨| (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ —__-15- 本紙张尺k適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2Η)χ297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 __B7 五、發明説明(13 ) ,其普遍具有的表面分子量要比兔子的肌磷酸化酶 B的分子量(106 kD)來得大的蛋白,但是對不具血球 凝集活性的囷株而言卻不見此種蛋白。這種多肽以 OMP 106標示。所使用之分子量標記物如圖1。 圖5 :得自兩種黏膜炎莫拉氏菌ATCC 49143培養株之外膜 蛋白經銀染的蛋白輪廓圖比較,兩種ATCC 49143 培養株分別爲49143(可使血球凝集的培養株)和 4 9 14 3 - Ν Η A (操法使血球凝集的培養株)。圖下方標有 HA的直行係指該培養物具有血球凝集活性。請注意 在不具血球凝集活性的培養株中看不到OMP 1 〇6多 肽的寬帶(以 <指示者)。本圖所使用的分子量標記物 如圖1。 圖6 :利用裝載至凝膠前培養在25 X:或1 〇〇 °C樣品緩衝液 中之ATCC菌株49 143的OG抽出物,於6 %變性之 聚丙晞酸胺凝膠中進行分子量的估量。凝膠中的蛋 白質係以還原性銀染來辨識。請注意OMp 1 〇6多肽 的寬帶只在1 00 °C培的樣品中可見(以〈指示者)。以 一種範圍寬廣之SDS-PAGE標準試樣(Biorad目綠 #16 1-03 17)作爲分子量的標記物。該標準試樣包含以 下多肽(其大約的分子量註記在括弧中^兔子骨悠肌 的肌凝蛋白(200 kD);大腸桿菌的半乳糖芬酶 (116 kD);兔子的肌磷酸化酶β(97·4 kD);牛的血 ϋϋ* ·ϋϋ —Γ— —ι_ϋ ml m ϋ -ϋ-i·— n (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、^τ -16-
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清白蛋白(66·2 kD)。凝膠中分子量標記物的位置以 箭頭註記在圖的右側,而將該標記物之分子量(kD) 註記在箭頭上方。 % 圖7 :方以Me 5-72爲探針對黏膜炎莫拉氏菌的染色體DHa 以Dra I和Hind III核酸内切限制酶處理的消化進行 南方墨點分析(Southern blot analysis)。將黏膜炎莫 拉氏菌株49143的DNA以Dra I或Himd III消化。 用Me 5-72做爲探針(序列辨識號碼:4)對消化過的 DNA進行南方墨點分析,鬲度嚴苛的沖洗則是以2 X SSC,i % SDS在5(rc沖洗大約2〇分鐘至大約 3〇分鐘。第1行係包含Hind III之消化物;其雜交 之寬帶具有大約8.0KB大小的DNA。第2行包含Dra I之消化物,其雜交之寬帶含有大約4 2kB大小的 DNA 〇 圖8A和8B :用兔子之OMP106抗血清對黏膜炎莫拉氏菌 及其相關菌種之蛋白質抽出物進行西方墨點 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I m V」: !秦·_ — - i =il In I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 分析(Western Blots)(見圖8A),將之與兔子 以OMP 106免疫前的血清活性比對(見圖8B) 。圖8 A和圖8B中各行所含之樣品如下:第 A行,黏膜炎莫拉氏菌;第B行,卵莫拉氏 菌(Moraxella ovis);第C行,腔隙莫拉氏菌 (Moraxella lacunata);第 d 行,莫拉氏菌 -17- 541314 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明(15 ) (Moraxella osloensis);第 E 行,牛莫拉氏菌 (Moraxella bovis);第F行,腦膜炎雙球菌 (Neisseria meningitides);第 G 行,淋病雙球 菌(Neisseria gonorrhoeae)。本圖所使用的分 子量標記物與圖1相同。 圖9A :西方墨點法證明由黏膜炎莫拉氏菌ATCC49143之 OMP 1 06多肤所得之兔子的抗血清能與數種黏膜 炎莫拉氏菌之HA和NHA菌株中具有相似分子量 的多肽交叉反應(ΟMP 1 06多肽的位置以箭頭標出) 。以西方墨點法檢驗了各種黏膜炎莫拉氏菌株的 辛基葡萄糖替抽取物。各菌株之ATCC使用號碼標 示在母一行上端。轉移方式與西方墨點的程序和用 於獲取圖8之墨點圖者方法完全相同。 圖9B :以相應於圖9A所使用之預先免疫的血清對與圖9A 相同的抽取物進行西方墨點分析。 5·發明之詳細説明: 5.1· 使血生屋集和不能使血玻凝隹的培養物 本發明提供了 一種經分離或大體純粹之黏膜炎莫拉氏菌 的〇MP106多肽。OMP106多肽包括埋在或位於黏膜炎莫 拉氏菌之能使血球凝集(HA)之菌株和許多不能使血球凝集 (NHA)之菌株和培養株外膜之外表面上整個蛋白質或其次 IL--^----^-裝------訂------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -18 - 541314 五、發明説明(Μ ) 早兀2 OMP 106直接或間接地對HA菌株或培養株之能使 血球凝集的表現型有貢獻。根據本發明,在任何標準的血 球凝集檢驗之中,如Soto_Hernandez等人在1989年,〈臨 床微生物學雜誌 > (Clin. Micr〇bi〇1),第 27 期:9〇3_9〇; 頁所敎π的方法即是,HA黏膜炎莫拉氏菌會使人或兔子 的紅血球凝集。雖然我們無意要將此限制在任何特定的作 用機制上,但是目前想像此機制爲黏膜炎莫拉氏菌結合至 寄王細胞表面上的醣脂和醣蛋白的紅血球丁碳醣⑴、)分 子邵分上,而使紅血球凝集,並且該血球凝集活性部分由 適當修飾過的OMP 106多肽居間促成,而此多肽具有易被 銀染之特殊性質。相對地,未經修飾或修飾得不正確之〇Mp 1 06多肽既不具居間促成血球凝集的活性又不被銀染。而 且,OMP 106多肽是可從HP *NHA黏膜炎莫拉氏菌膜泡 或冗整的細胞上,以〇G-或肌氨醯基抽取的蛋白質在 SDS-PAGE之中,唯一具有顯見分子量在大約18〇 kD到大 約23 0 kD的多肽。 HA黏膜炎莫拉氏菌細朐胞的血球凝集活性會被紅血球 丁碳醣(GalNAc々l-3Galal-4Galy51-4GlCy31 ; Gb4)和包含 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
Gh的單醣所抑制,這些單醣包括:N_乙醯基_右旋_半乳 糖胺,右旋-半乳糖和葡萄糖及其衍生物,如甲基—α _半乳 糖或甲基->5半乳糖。η Α黏膜炎莫拉氏菌的血球凝集活性 也會受較咼濃度之數種其他的糖所抑制,其包括但不限於 右旋-甘露糖,左旋-岩薄糖,右旋_葡萄糖,和N_乙醯基_ 右旋-葡萄糖胺。 19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 541314 經濟部中央標準局員Μ消费合作社印t A7 B7 五、發明説明(17 ) 血球凝集活性和完整之HA黏膜炎莫拉氏菌細胞的omp 1 06多肽皆會由於完整的黏膜炎莫拉氏菌細胞被各種蛋白 酶消化而降低破壞,這些蛋白酶包括但不限於TLCK(N “ 對-甲基苯續醯基-左旋·離胺酸氯甲基g同[亦以氯_ 3 ·甲基 苯續醒基胺基-7·胺基-左旋-2-庚嗣見知])-處理過的胃蛋 白酶,蛋白酶K和TPCK(N-甲基苯磺醯基-左旋-苯丙胺酸 氟甲基酮)處理過的胰蛋白酶。然而,用蛋白酶V 8消化完 整的HA黏膜炎莫拉氏菌細胞既不影響血球凝集活性也不 影響此種細胞之MOP 1 06多肽的物理完整性。 不具血球凝集活性(NHA)的培養物可經一系列靜止液態 培養(亦即保持在3 5 °C培養而不搖盪)。從Η A黏膜炎莫拉 氏菌的菌株或培養株獲得。例如,將ΗA黏膜炎莫拉氏菌 的囷株或培養株養在穆勒-辛頓肉汁(Mueller Hinton broth) 中’母五天則將接種物從靜止培養液的表面取出,接種到 緊接的靜態培養液中。持通過一系列靜態培養,直到產生 一種NHA培養株。本發明的NHA培養株可用於生產保護 性的疫苗,如抗黏膜炎莫拉氏菌感染的完整細胞疫苗。 相對的’ HA黏膜炎莫拉氏菌菌株或培養株之具血球凝 集活性的表現型,可藉由使菌株或培養株通過搖盪的液體 培養而保持下來。在一項具體實例中,在35 °C至37 °C將 HA黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株養在穆勒一辛頓肉汁 中,以大約200RPM的轉速搖盪,並在每24至48小時轉移 接種。ΗA黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株亦可在固態培 養基上轉移接種而保留下來。例如:將一 HA黏膜炎莫拉 -20- ^紙张尺度適國國家標準(CNS ) A4規格(2i〇x297公釐1 ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) >裝·
、1T 541314 A7
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 氏菌的菌株或培養株養在含有血液瓊脂或穆勒-辛頓瓊脂 的培養皿上。 5.2. OMP 106 多肽
本發明的OMP 106多肽是HA黏膜炎莫拉氏菌的菌株或 培養株中唯一在SDS.-PAGE上有大約180 kD至大約230 kD 之表面分子量’較好是在大約i 9〇 kD的外膜蛋白。根據本 發明,黏膜炎莫拉氏菌之外膜蛋白是一種出現在黏膜炎莫 拉氏菌的膜泡中,或可用正·辛基-0 -右旋吡喃葡萄糖嘗 (〇 G)或逃氣酿基洗濯劑在室溫下缓衝溶液之中,自黏膜炎 莫拉氏菌的芫整細胞上抽取下來。請參考Murphy和Loeb 在 1989 年 <微生物病現> (Microbial Pathogenesis)第 6 期: 1 59-1 74頁有關黏膜炎莫拉氏菌之膜泡的討論,該膜泡係由 黏膜炎莫拉氏菌之外膜組成之天然生成的膜泡。NHA黏 膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株或不具OMP 106多肽,或者 具有,此與抗Ο Μ P 1 0 6抗體結合(見第5 · 5節)但不與銀染劑 ’(亦即使用銀染劑Silver Stain Plus [Biorad出品,加州 Richmond 市],或用 Gottlieb 和 Chauko,1987 年,〈分析 生物化學> (Anal. Biochem·)第165期:33頁所説明的方法 )反應。相對的,得自HA黏膜炎莫拉氏菌之菌株或培養株 的OMP 106多肽會與抗-OMP 106的抗體結合,並且與銀染 劑反應。 OMP 106多肽可藉其被蛋白酶處理分解而在HA黏膜炎 莫拉氏菌的膜泡或完整細胞中被鑑認出來,而蛋白處理也 -21 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(21〇χ297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 r 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(19 ) 會阻滯或減弱相同HA菌株的血球凝集活性(請參考上面的 5.1.節有關會破壞或不會破壞完整的黏膜炎莫拉氏菌細胞 之蛋白酶的實例)。換句話説,使用令破壞或降低HA菌株 或培養株之血球凝集活性的蛋白酶進行消化,也會改OMP 106多肽在SDS-PAGE中的含量或位置,這是以從菌株或 培養株分離出的OMP 1 06多肽在此種消化分解後和從相同 菌株或培養株分離之OMP 1 06多肽在消化分解前相互比對 發現的。 OMP 1 06多肽亦可以黏膜炎莫拉氏菌之膜泡或其完整細 胞之OG或肌氨醯基抽取物中的多肽被認出,此多肽以變 性之凝膠電泳在含SDS之12 % PAG中,利用Harlow和 Lane的配製方法(<抗體:實驗室手册〉(Antibodies : A Laboratory Manual),冷泉港實驗室出版,紐約,附錄I, 198 8年)測得其具有大於106 kD之表面分子量。在100 °C 加熱處理OG或肌氨醯基抽取物會造成OMP 106多肽在6 % PAG而不含任何還原劑的SDS-PAGE中測得大約180 kD 至大約230 kD的表面分子量,PAGE的方法利用上述 Harlow和Lane説明的配製方法。在一項特定的具體實例中 ,在加熱處理之黏膜炎莫拉氏菌菌株ATCC 49143的OG或 肌氨醯基抽取物中,OMP 106具有大約190 kD的表面分 子量。 在特定的具體實例中,OMP 1 06多肽是從包括但非限於 ATCC 49143,ATCC 25238,ATCC 25240,ATCC 43617 ,ATCC 4361 8 , ATCC 43627 和 ATCC 43628 之任何黏膜 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541314 A7 B7 經濟部中央標準局只工消#'A作社印製 五、發明説明(20 ) 炎莫拉氏菌株製備而得的。較佳之OMP 106多肽來源是此 類菌株的Η A培養株,而更佳的來源是AT C C 4 9 14 3之Η A培養株。 在一項特定的具體實例中,OMP 106多肽包含了胺基酸序列 IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKI V(序列辨號碼:1)或與其大體同源的序列,而較好是在其 胺基端。此外,OMP 106多肽還可包含一段在羧基端與上 面提到之序列相隔的含八個胺基酸的肽,其序列爲 GTVLGGKK(序列辨識號碼:2)或一段大體上與其同源的 序列。此處用到大體上同源之胺基酸序列至少有80 %,較 好是100 %與參考用的胺基酸序到完全相同。 根據本發明的許多方面,本發明之多肽係以其在SDS-PAGE中相對於已知分子量的標記物之移動爲基礎所得之 表面分子量做爲其特徵。雖然任何在本技藝中已知的分子 量標準物均可與SDS-PAGE併用,但是較佳的分子量標記 物至少包括兔子的骨赂肌之肌凝蛋白,大腸桿菌的卢半乳 糖嘗酶和兔子的肌磷酸化酶B。熟習此藝者今暸解到本發 明的多肽可能在不同型式的凝膠系統(例如:不同的缓衝液 ;不同濃度的凝膠、交叉連接劑或SDS)之中有不同的移動 結果。熟習此藝者也會暸解該多肽可能由於和SDS_P AGE 併用之不同的分子量標記物而得到不同的表面分子量。因 此,本發明之多肽的分子量特徵刻意地涵蓋相同的多肽在 任何SDS-PAGE系統中與任何分子量標記物併用的結果, 因爲所使用的SDS-PAGE系統和分子量標記物可能爲該多 -23- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙张尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 541314 Α7 Β7 五、發明説明(21) 肽指出與本説明書所揭示略爲不同的表面分子量。 5.3. OMP106衍生多肽 本發明之OMP 106衍生多肽或爲0MP丨%多肤的片段。 完整的OMP 1 06多肽可能含有一個或更多對其免疫原性質 並非必需的胺基酸殘基。舉例而言,可能只有形成OMp工% 多肽之某一抗原決定部位的胺基酸基對其產生免疫的活性 是必要的。不必要的胺基酸可以用本技藝中詳知的技術移 t去。例如,用酵素如胰蛋白酶、木瓜酵素或相關的蛋白 質分解酶進行有限的蛋白分解消化,或用化學藥劑如溴化 氰進行化學切斷反應,將不要的胺基酸序列除去,接著分 級分離消化物或切斷反應的產物。 本發明之OMP106衍生多肽亦可能是經修飾的〇Mp 1〇6 多肽或其片段(亦即取代、插入、及/或刪除野生型〇Μρ 1〇6 序列上一個或更多胺基酸所得的OMP 1〇6多肽或其片段) 。此種修飾可能促進所得多肽產物之免疫原性質或對此活 f生”、、任何衫響。可能用到的修飾技巧包括美國專利案第 4’526,716所揭示者。 OMP 1〇6多肽還可以是一種嵌合型多肽,其包含一段或 更多&與完整的OMP106多肽或其部份或片段之胺基端或羧 f端融合的異系多肽。組成此種嵌合型多肽之有用的異系 多肽包括但不限於a)能協助〇Mp 1〇6衍生的序列在寄主細 胞中運輸,轉位及/或加工之前_及/或原—序列,…親和性純 化用到的序列,e)任何有用的產生免疫性之序列(例如:編 ____ - 24 - 玉紙ϋ適ϋϋ國家標準(CNS 格(^Τ297^ΪΤ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局爲工消费^作社印製 541314 A7 r------- Β7 五、發明説明(22 ) 碼一種微生物病原表面曝露的蛋白上一個或更多抗原決定 部位的序列)。 較好本發明之OMP 106衍生多肽與0MP 106多肽在免疫 上有X叉的活性,因此能在動物身上引發對黏膜炎莫拉氏 菌的免疫反應。更好的是,本發明之OMP丨06衍生多肽包 含造成黏膜炎莫拉氏菌天然0MP丨〇6多肽上一個或更多外 表抗原決足邵位的序列(亦即如同存在於完整之黏膜炎莫 拉氏菌細胞中之〇M)P 106多肽上曝露在表面的抗原決定 部位)。此種較佳之OMP106衍生多肽可由其專一地結合至 以完整黏膜炎莫拉氏菌細胞產生之抗體(由甲醛或戊二醛 固走之黏膜炎莫拉氏菌細胞所引發之抗體;本説明書中將 此種抗體稱爲Γ抗完整細胞」之抗體)而被認出。例如,將 OMP 1 06多肽或對其進行有限或完全之蛋白酶消化所得之 肽用“準法分級分離,並測試其與抗完整細胞之抗體結合 的能力。具反應性的多肽即包含了較佳之〇Mp丨〇6衍生多 肽。將它們分離出來,再用本技藝中既知的方法決定其胺 基酸序列。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 亦佳的是,本發明之OMP106衍生多肽包含造成天然 OMP 106多肽上一個或更多抗原決定部位的序列,而該序 列能居中調停HA黏膜炎莫拉氏菌細胞造成的血球凝集。 此種較佳的OMP衍生之多肽可以其干擾HA黏膜炎莫拉氏 菌所造成血球凝集之能力而被認出。例用,用標準方法將 OMP 106多肽以有限或徹底的蛋白酶消化或化學切斷反應 所得的多肽分級分離,並測試其干擾黏膜炎莫拉氏菌之血 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS )八4規格(210x297公釐) ------- 541314 A7 一 — B7 五、發明説明(23 ) 球凝集活性的能力。一旦認出並分離出此種較佳之OMP 1 06 本丁生多肽’則利用標準的序列分析法決定其胺基酸序列。 已測定之序列可用於促進此種多肽以化學合成法及/或遺 傳工程的方式進行生產。 這些較佳的OMP 1 06衍生多肽亦可用抗完整細胞之抗體 篩選能表現黏膜炎莫拉氏菌之基因DHA上任意片段或轉 殖之編碼OMP 1 06多肽的核:y:酸序列之細菌圖書館,而被 龜識出來。請參考例如Sambro ok等人之〈分子轉殖,實驗 ▲手册> (Molecular Cloning,A Laboratory Manual),第二 版,冷泉港出版,紐約,第1册,第12章。將具有反應性 的純系鑑識出來,再分離出其插入片段,以序列分析法決 定此較佳之OMP 1 06衍生多肽的胺基酸序列。 經濟部中央標準局負工消费合作杜印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5·4·全^與純化OMP 106多肽和MOP 106衍生的多肽 本發明提供經分離之OMP 106多肽和OMP 106衍生多肽 。此處所使用之「經分離的」一詞意指該產物顯著地不含 其他原本在自然狀況下附帶的生物物質。舉例而言,也就 是説,經分離之OMP 106多肽組成有介於大約70 %和94 %重量百分比的純OMP 1 06多肽。較好的是,本發明之omp 106多肽和OMP 1 06衍生之多肽是經純化的。此處所使用之 「經純化的」一詞意指該產物大體上,不含其他原本在自 然狀況下附帶的生物物質。也説是説經純化的OMp 1 〇6多 肽組成有至少95 %重量百分比之純的OMP 1 06多肽,較好 是至少有98 %,而最好是至少有99 %重量百分比之純omp -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X:297公釐) 經满部中央標準局男工消费合作社印製 541314 A7 一一·——, B7 五、發明説明(24 ) 10 6多肤。
本發明的OMP 1〇6多肽可從蛋白質抽出物中分離,包括 任何黏膜炎莫拉氏菌菌株或培養株之完整細胞的抽出物。 較好該蛋白質抽出物是黏膜炎莫拉氏菌之外膜小泡(亦即 膜泡)或其完整細胞的辛基葡萄糖苷或肌氨醯基抽取物,而 孩菌包括但不限於任何以下菌株:ATCC 49143 ,ATCC 25238,ATCC 25240 , ATCC 43617,ATCC 43618, ATCC 43 627和ATCC 43 628。此種抽取物的較佳來源是此 類菌株的HA培養株。更佳的來源是ATCC 49143的HA培 養株。另一 OMP 106多肽的來源是得自能表現編碼omp ι〇6 多肽或OMP 1 06衍生多肽之經轉殖序列的基因表現系統之 蛋白質製備物(請參考第5、8、節)。 OMP 1 06多肽可利用任何生化技術和熟習本技藝者詳知 的方法從來源物質中分離和純化。在一種方式當中,先用 標準技術取得黏膜炎莫拉氏菌的外膜,用溶離之化合物如 洗濯劑將其外膜蛋白質溶離出來。較佳之溶離用的溶液是 含有大約1.25 % (重量/體積)之辛基葡萄糖答。另一種較佳 之落離用溶液是1.25 %施氨醯基溶浚〇 OMP106多肽存在 於落離出的部份。較好用離心的方式分離和除去抽取物中 的細胞碎片和不溶物。濃縮抽取物中的多肽,在1 〇 〇 t下 培養在含有SDS的拉密賴氏(Laemmli)凝膠樣品緩衝液中 歷5分鐘’然後用電泳法在不含還原劑的6 0/。變性之sds-PAGE中將多肽予以分級分離。請參考Laemmii,ι97〇年 ,〈自然〉,第227期:680-685頁。用以上説明的方法鑑 -27- 本紙张尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) I I I II 訂 I I0U (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541314 A7 B7 五、發明説明(25 ) 認之含OMP 106多肽的寬帶和分級分離物(例如,用銀染找 到出現在HA但不出現在對應之NHA培養株,或ha培養 株以阻滞血球凝集活性之蛋白酶消化後的〇G或肌胺醯基 抽取物中之寬帶)。可直接從含有〇Mp 1〇6多肽的分級分離 物或凝膠切片中分離出來。在一項較佳的具體實例中, OMP106多肽具有190kD之表面分子量,這是從它在變性 之SDS-PAGE中相對於兔子骨骼肌的肌凝蛋白(2〇〇 kD)和 大腸桿菌的/?-半乳糖智:酶(1 1 6 kD)的移動距離或速率之比 對結果測得的。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 另一個純化OMP 106多肽的方法是利用抗_〇Mp 1〇6抗 體進行親和性層析(見第5·5節)。較好是使用單源的抗_〇Mp 106抗體。將該抗體共價地連接到以溴化氰活化的瓊脂糖 或琥轴酸亞胺@旨(八『^-〇01,由則〇11&(1公司出品),或以其 他热習本技藝者知道的方式進行共價連接。將蛋白質抽出 物裝載到以上説明的凝膠上頭。讓反應物接觸一段在標準 的反應條件下足使OMP 1 06多肽連結至抗體的時間。較好 該固態支持物是用於層析管柱的材質。然後將〇Mp丨〇6多 肽從抗體上移除下來,而使OMP 1 〇6多肽以分離的或較好 是純化的形式回收。 本發明的OMP衍生多肽可用化學及/或酵素切割或分解 分離出來或純化過的OMP 1 06多肽而產生。亦可利用本技 藝中詳知的方法,以既知的OMP 1 06多肽之胺基酸序列爲 基礎’而在嵌合型多肽的情形下,以既知的異種多肽之胺 基酸序列爲基礎,對OMP106衍生多肽進行化學合成。可 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 541314 五、發明説明(26 ) 參考例如·· Creighton,1 存 S n 1983年,〈蛋白質:結構與分子 原理〉,W.H. Freeman公司(紐約)出版。 OMP106何生多肽亦可在一個基因表現系統中生產,該 系統能表現包含編碼OMP_106衍生多肤序列的重組核答酸 達構體。編碼本發明之多肽的核替酸序列可以是合成的及/ 或轉殖的,而根據熟習本技藝者詳知的技術把它們表現出 來。例如,請參考Sambrook等人於1989年<分子轉殖,實 驗室手册> (MolecuIar CIonrig,A Lab〇m〇ry ―),第 1 _3册,冷泉港實驗室出版,紐约,第9章。 本發明(0MP106衍生多肤可以利用標準蛋白質純化技 術予以分級分離和純化,並依照本説明書中説明的發現和 技術予以修飾和應用。尤其,根據本發明之較佳的〇Mp _ 106多肽,亦即那些形成天然〇Mp 1〇6多肽之外表抗原決 定部位的衍生多肽,可以根據以上所揭示用於分離和純化 0MP 106多肽的親和性方法(例如,用抗〇Μρ_ι〇6抗體進 行親和性純化)加以分離和純化。 經濟部中央標隼局爲工消f含作社印製 若有需要,可利用標準的蛋白質或肽的純化技術進一步 純化本發明的多肽,這些純化技術包括但不限於電泳,離 心,凝膠過濾法、沉澱法、透析法、層析法(包括離子交換 層析法、親和性層析法、免疫吸附親和性層析法,逆相高 解析液相層析法,和凝膠滲透高解析液相層析法),等電$ 聚法和其變化和組合的方法。 這些技術的一種或更多種可連續用於依分子之物理或化 學特性所設計的分離程序之中。而這些分子特性包括疋 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 541314 經濟部中央標準局贤工消费含作社印製 A7 B7 五、發明説明(27 ) 白質的厭水性、電荷,結合能力和分子量。對每一種技術 得到的各種分級分離物質與OMP 1 06受體或配體結合的能 力,與抗OMP 1 06抗體結的能力,或干擾由黏膜炎莫拉氏 菌造成之血球凝集的能力進行測試(「測試」活性)。將顯 示此諸活性的分級分離物進行測試。重覆此過程,直到只 有一個具上述「測試」活性的分離部份留下來,而該分離 部份以聚丙烯醯胺凝膠電泳或層析法處理則產生單一寬帶 或實物。 5.5. OMP 106免疫原和抗-OMP 106抗體 本發明提供特定與OMP 106多肽或OMP 106衍生多肽結 合的抗體。爲了生產此種抗體,所以使用分離的或較好是 純化的OMP 106多肽或OMP106衍生多肽製備物作免疫原。 在一項具體實例中,用SDS-PAGE將OMP 106多肽與其 他出現在HA黏膜炎莫拉氏菌細胞或膜泡的外膜蛋白分離( 見以上第5.2節),並且利用包含OMP 106多肽的凝膠切作 做爲免疫原注射到兔子身上以產生含有多株OMP 1 06抗體 的抗血清。用同樣的免疫原對老鼠進行免疫處理以產生能 生產單源抗-OMP 1 06抗體的融合瘤系。在特別的具體實例 中,使用含有來自 ATCC 49143 ,ATCC 25238,ATCC 25240,ATCC 43617,ATCC 43627,和 ATCC 43628 中 任一菌株之經分離或純化的OMP 106之PAGE切片做爲免 疫原。在較佳的具體實例中,所使用的PAG切片含有得自 此類菌株之HA培養株的分離或純化之OMP 1 06。在一項 -30- ~本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) I. —L--i----良------丁------l· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消费含作社印製 541314 A7 B7 五、發明説明(28 ) 更佳的具體實例中,用以做爲免疫原的PAG切片含有得自 菌株ATCC 49143之HA培養株之經分離或純化的OMP 10 6 ° 在一項具體實例中,使用OMP 106多肽之肽片段做爲免 疫原。較好是使用純化之OMP 1 06多肽的肽片段。該肽可 由蛋白酶消化或化學切斷經分離或純化的OMP 1 06多肽, 或是由化學合成製得,然後予以分離或純化。此種經分離 或純化的肽可直接做爲免疫原。在特別的具體實例中,有 用的肽片段包括但不限於具有IGISEADGGKGGANARGDK SIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(序列辨識號碼:1)之序 列或具有6個以上胺基酸長度之該序列任何部份的肽片段 。 在另一項具體實例中,該肽片段具有GTVLGGKK之序 列(序列辨識號碼:2)。 有用的免疫原亦可包括結合至載體分子之此類肽或肽片 段,較好是結合至載體蛋白質上者。載體蛋白質可以是任 何在免疫學上常用者,其包括但不限於,牛血清白蛋白 (BSA),難的白蛋白,鎖孔虫戚的血藍質(KLH)及類似者。 關於半抗原蛋白結合物的討論,請參考例如:Hartlow等 人,〈抗體,實驗室手册 >,冷泉港實驗室出版,紐約冷泉 港,1988年,或標準的免疫學敎本如Roitt,I.等人的< 免疫學〉,C.V. Mosby公司出版,密蘇里州聖路易市(1985 年)或 Klein,J_ 的〈免疫學〉,Blackwell Scientific Publications公司出版,麻州劍橋市(1 990年)。 尚有另一個具體實例,目的在於製造能特定與一個或更 -31 - 本紙张尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 541314 A7 B7 五、發明説明(29 ) 多天然OMP 1 06多肽之外表抗原決定部份結合的抗體,其 中利用完整的HA黏膜炎莫拉氏細胞或由該細胞製備的膜 泡做爲免疫原。在免疫作用之前,可用如甲醛或戊二醛將 該細胞或膜泡固定。請參考Harlow和Lane的〈抗體,實驗 室手册,冷泉港實驗室出版,紐約冷泉港,1 988年,第1 5 章。較好此種抗全細胞的抗體是單株抗體。用純化的OMP 1 06多肽做篩選之配體可鑑識出生產所想要之單株抗體的 融合瘤系。任何黏膜炎莫拉氏菌的菌株包括但不限於ATCC 49143,ATCC 25238,ATCC 25240,ATCC 43617, ATCC 4361 8,ATCC43627,和 ATCC 43 628 之細胞或膜泡 被用作爲引發這些抗體產生的免疫原。較好是使用此諸菌 株之HA培養株的細胞或膜泡做爲免疫原。更好是使用菌 株ATCC 49143之HA培養株的細胞或膜泡做爲引發這些抗 體產生的免疫原。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由全細胞或膜泡之免疫處理所產生的多株抗體包括會與 其他黏膜炎莫拉氏菌外膜蛋白(「非抗-OMP 106之抗體」) 結合的抗體,因此在已知或懷疑樣品含有其他黏膜炎莫拉 氏菌外膜蛋白或是與這些其他外膜蛋白交叉反應的物質之 情況下,較不便於使用此種抗體。在這樣的情況下,任何 樣品或寬帶與抗-全細胞之抗體結合者務必要藉同種樣品 或寬帶與專一結合至OMP 106多肽的抗體(例如,抗 OMP-106)及/或專一結合至OMP106衍生多肽的抗體同時 發生結合作用來證實,或者用抗-OMP 106抗體,OMP 106 多肽或OMP 1 06衍生多肽做爲競爭物以競爭性試驗來證明 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 541314 A7 B7 五、發明説明(30 ) (亦即將抗-OMP 106之抗體,〇Mp 1〇6多肽或〇Μρι〇6衍 生多肽到反應混合物中,而使樣品與抗_全細胞抗體的結合 降低或受阻滯)。或者,可用標準的方法將含有「非抗 OMP-1 06」之抗m的多源抗血清中的該種抗體清除掉。例 如’以NHA黏膜炎莫拉氏菌培養株或已知不具οΜρ ι〇6 夕肽的黏膜炎莫拉氏菌菌株(例如:ATCC 8176 ,較好是 ATCC 49143的NHA培養株)與非抗〇Mp 1〇6之抗體進行沉 嬴作用而將之除去;或者藉著使非抗〇Mp ! 〇6之抗體吸附 至包含此種細胞或其外膜蛋白的管柱上而將之除去。 在進-步的具體實例中,能引發本發明之抗體的有用的 免疫原包含以上提過之個別免疫原中任何二種或更多種的 混合物。 、用本説明書中説明的免疫原對哺乳動物進行免疫處理, 較好是對人、i、家鼠、鼬鼠、綿羊、山羊、牛或馬施行 者、可用以下熟習此藝者詳知的方法來進行”乂求獲得含 有多株抗體的抗血清或能分泌單株抗體的融合瘤系。 經 濟 部 t k. 標 準 局 員 工 消 費 合 作 社 至於單株抗體可用標準技術㈣備,其敎示包含於本説 明書中。舉例而s ’此種技術揭示於美國專利案第(me 和4,196,265號之中。簡言之,將動物以免疫原施行免疫。 而將:兄疫(動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合而製得融合 :去對融合產物進行筛楝以得到能產生與免疫原結合之抗 ::。將具有正反應之融合瘤之純系分離出來,而從這政 純系回收單株抗體。 生產多株和單株抗體之免疫方法己詳知於本技藝之中。 製 33- 經濟部中央標準局負工消费>作社印製 541314 A7 B7 五、發明説明(31 ) 該免疫原可用許多途徑之任一者進行注射,包括:皮下、 靜脈内、腹膜内、皮内、肌内、粘膜的注射方式,或這些 方式的組合。該免疫原可利用本技藝中詳知方法或材料以 可溶形式、集結形式、連接至一種物理載體、或與一種佐 劑混合的形式注射。抗血清和抗體可用熟習此藝者已詳知 的管柱層析法予以純化。 根據本發明,黏膜炎莫拉氏菌株HA或NHA的OMP 106 多肽之具有免疫交叉反應性的。因此,以一種黏膜炎莫拉 氏菌菌株或培養株之OMP 106引生之抗體會特定地與其他 黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株之OMP 106多肽和 OMP106衍生多肽結合。例如,由菌株ATCC 49143之OMP 106多肽引生之多株抗-OMP 106抗體會特定地與不單是同 源的OMP 106多肽(亦即菌株ATCC 49143的OMP 106多肽 )結合,也會與其他黏膜炎莫拉氏菌株的OMP 106多肽及/ 或OMP-106衍生多肽結合,而言些菌株包括卻不限於ATCC 43628 , ATCC 43627 , ATCC 43618 , ATCC43617 , ATCC 25240 ,和 ATCC 25238。 本發明之抗體包括但不限於抗-OMP 106抗體,可用於協 助OMP 106多肽和OMP 106衍生多肽的分離與純化。該抗 體亦可做爲探針以鑑識具有編碼OMP 106多肽或其片段之 插入序列的表現圖書館中的純系。該抗體亦可用於免疫檢 驗(例如:ELISA,RIA,西方墨點法)以特定地偵測及/或定 量生物標本中的黏膜炎莫拉氏菌。本發明之抗-OMP 106抗 體能特定與OMP 106多肽結合,但不與來自相關細菌性病 -34- 本紙张尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) I L--"----Φ-裝------訂------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541314 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 腔隙莫拉氏菌、奥斯陸莫拉氏菌 牛莫拉氏菌、腦膜炎雙球菌、淋病 。因此抗-OMP 1〇6抗體可用於診斷黏 〇 ,尤其是那些具有胞毒性的,亦可用 莫拉氏菌對動物(包括人類)造成感染 用胞毒抗體一詞是指能促進產生與抗 作用及/或補體致死的抗體)。可將本 抗免疫原方式培養之多株或單株抗體 發明説明(32 原如:卵莫拉氏菌 (Moraxella osloensis) 雙球菌的蛋白質結合 膜炎莫拉氏菌的感染 根據本發明之抗體 於防止或減弱黏膜炎 之被動免疫上。(此處 體結合之細菌之調理 發明中有效濃度之以 。她於寄王體内以達到此效果。施用之確切的抗體濃度會 依每-特定抗體製備物而有所改變,㈣用一般熟習本技 藝者已詳知的標準技術予以測定。抗體之施用可採許多技 術來達成,這些技藝包括但不限於第5 “"所説明用以 遞送疫苗的技術。 本根據本發明〈柷體的預防和治療效能可用標準的藥物 程序在實驗動物身上測足。從動物研究得到的數據可用於 調配用在人體之劑量範圍。 5.6.疫苗 本發明亦提供抗黏膜炎莫拉氏菌對動物之感染的治療和 預防用疫苗,這些動物包括哺乳類,而更特定^審齒類 、靈長類和人類。較佳之疫苗用途是用在人類。該疫苗可 用熟習此藝者已知的技術製備,並且包含例如呈免疫原形 式的抗原、藥物上可接受之載體’可能還包含有適當的佐 IL--^----裝------訂------® U (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -35- 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 541314 A7 __B7 五、發明説明(33 ) 助劑和其他傳統上在疫苗之中發現的物質。在疫苗中使用 之免疫學上有效量的免疫原係鑒於本説明書的敎示以本技 藝中已知的方法測定。 根據本發明的疫苗包含免疫學上有效量之第5 · 5 ·節所揭 不的任何免疫原,在一種藥物上可接受的載體之中。 根據另一個具體實例,本發明的疫苗包含了免疫學上有 效量之本發明之去活化或減毒的HA黏膜炎莫拉氏菌培養 株或NHA莫拉氏菌培養株。去活化或減毒之Ha黏膜炎莫 拉氏菌培養株或NHA黏膜炎莫拉氏菌培養株乃利用任何 本技藝中已知的方法獲得,這些方法包括但不限於化學處 理法(例如:福嗎啉),熱處理法和輻射法。 二本説明書使用之「免疫學上有效量」一詞意指足以引發 月匕防止黏膜炎莫拉氏菌感染或減弱任何預存或緊接之黏膜 炎莫拉氏菌感染之免疫反應的量。確切的濃度要視將被施 用之特定免疫原而定,但是可藉習於此藝者詳知的標準技 術檢驗免疫反應的發展情形來測定。 有用的多肽免疫原包括經分離的OMP 1〇6多肽和 OMP106衍生多肽。較佳之免疫原包括純化的〇Μρ 多 ,和OMP 106之衍生多肽或肽。組合的免疫原和載體可以 是水溶液,乳化物或懸浮液。一般而言,多肽免疫原的量 介於每劑0.1和500微克之間。而载體是習於此藝者已知的 ,它包括了穩定劑、稀釋劑和緩衝溶液。適當=穩定劑包 括醣類,如,山梨糖醇、乳糖、甘露糖醇、澱粉、蔗糖、 糊精和葡萄糖,以及蛋白質,如,白蛋白或路蛋白。適當 IL ^ 裝 訂------U (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -36- 541314 經濟部中央標隼局爲工消费含作社印製 A7 L、發明説明(34 的稀釋劑包括鹽液、漢克斯氏平衡鹽液(Ha* Baia_d Salts)和林哲氏溶液(Ringers s〇luU〇n)。適當的缓衝液包括 驗金屬鱗酸鹽、驗金屬碳酸鹽、或驗土金屬的碳酸鹽緩衝 夜。孩疫苗亦可包含一種或更多纟助劑以增強或促進免疫 反應。適當的佐助劑包括但不限於肽;氫氧化鋁;磷酸鋁 、;氧化鋁;一種包含礦物油如Marc〇152,或植物油和一種 以上(乳化劑,或界面活性劑如溶血卵磷脂、聚陽離子、 聚陰離子的組合物;以及相當有用的人體佐助劑如bcg和 小棒桿菌(g^iiebacterium卿vum)的組合物。該疫苗亦可 包含其他免疫原。比如難尾酒疫苗具有單一次施用即可獲 侍對抗數種病原之免疫性的好處。其他免疫原的實例係用 於已知DPT疫苗之免疫原。 本發明的疫苗係以熟習此藝者既知的技巧製備的,其敎 不包含於本説明書中。一般而言是將一種免疫原與載體混 合形成溶液,懸浮液或乳化物。以上所討論之添加物中的 一種或多種可能包含在載體之中,或緊接著添入。該疫苗 製備物可能經過乾燥,例如··藉由冷凍乾燥以便保存。若 是經過乾燥,則緊接著可藉由添加一種適當的液體載劑而 重組成爲液體疫苗。 泫疫苗係施用於人或其他哺乳類動物,包括嚆齒類和靈 長類。它們可以一劑或多劑的方式施用。該疫苗可用已知 的施用途徑施用。許多方法可被用於引進此處説明的疫苗 調配物。這些方法包括但不限於,口腔、皮内、肌内、腹 膜内、靜脈内、皮下、和鼻内的途徑。較佳的途徑是肌内 37- 本紙张尺度適用中國國家標準(CNS )八4規格(2l〇X297公釐 I .----#-¾衣II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 541314 五、發明説明(35 ) 或皮下注射。 、本發明亦提供一種在哺乳類體内引發對黏膜炎莫拉氏菌 之免疫反應的方法,以保護哺乳類抵抗由黏膜炎莫拉氏菌 弓I起的感染和或減弱其造成的疾病。該方法包括對寄主施 用免疫學上有效量之本發明的免疫原,較好是對寄主施用 本發明之疫苗。 5·7·邊碼ΘΜΡ 106多肽和OMP 106衍生多脱之核酸 本發明亦#疋供編碼ΟΜΡ 1 06多肽和ΟΜΡ 1 〇ό衍生多肽之 核酸DNA和RNA。就一方面來看,本發明的核酸可用本 技藝中已知的方法進行合成。特定而言,〇Μρ 1〇6多肽或 ΟΜΡ 1 06衍生多肽的郅份或整個胺基酸序列可用熟習此藝 者詳知的技巧加以測定,比如經由埃德曼氏(Edman)分解技 術(請參考例如:Greighton,1983年,〈蛋白質:結構和 分子原理〉,W.H. Freeman公司出版,紐約,第3心49頁) 。所得到的胺基酸序列乃做爲合成編碼〇Mp丨〇6多肽或 ΟΜΡ 1 06衍生多肽之DNA合成的指引,合成Dna可利用 經漪部中央標準局負工消费含作社印製 傳統的化學方法或用聚合酶鏈反應(PCR)將重疊的寡核替酸 放大。 在另一方面,該胺基酸可用做合成寡核甞酸混合物的指 引,而該混合物可用於篩選黏膜炎莫拉氏菌之基因組圖書 館中編碼OMP 106多肽的序列。這樣的基因組圖書館可藉 分離自任何黏膜炎莫拉氏菌株細胞的DNa製得。較好的是 對基因組圖書館和PCR放大作用二者而言,做爲〇Mpl〇6 -38- 本紙张尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 541314 經濟部中央標準局βς工消費含作社印¾ A7 B7 反、發明説明(36 ) 多肽之編碼序列來源的DNA是從任何黏膜炎莫拉氏菌株 的細胞製備的,這些菌株包括但不限於 ATCC 2523S,ATCC 2524〇,ATCC 43617, atcc;;6;8 ’ ATCC 43627 和 ATCC 43628。 在基因組圖書館的製備當中產生了 DNA片段,它們之中 有某些是編碼部分或整個黏膜炎莫拉氏菌〇Μρι〇6多肽的 DNA片段。該DNA可用各種限制酶在特定的位置上進行切 斷反應。或者,可在錳存在下用DNase將該DNA切成片段 ,或者該DNA可以物理方式剪斷,例如用超音波法。然後 用標準技術依片段大小將DNA片段分開,這些技術包括但 不限於瓊脂和聚丙烯醯胺凝膠電泳法。管柱層析法和薦糖 梯度離心法。然後將DNA片段插入適當的載體,這些載體 包括但不限於質體,粘接質體,爛它一唑菌體或丁4唑菌體 ,以及酵母菌的人造染色體(TAC)(請參考例如,Sambr〇〇k 等人,1989年,〈分子轉殖,實驗室手册〉,第二版,冷泉 港貫驗室出版,紐約冷泉港;Gl〇ve]r,D M·(編審,1985 年’ <dna 轉殖;實用方法> (DNA Cloning : A Pratical Approach), MRL公司出版,英國牛津市,第一册和第二 册。該基因組圖書館可利用使核酸雜交至經標記之探針的 方式進行師選(Bent on和Davis,1977年,〈科學〉,第196 期· 180 頁·’ Grunstein 和 H〇gness,1975 年,〈美國科學 院進展報導>(?1*0(:,^^1.入〇&(1.8(^,1;8八.),第72期:3961 頁)。 該基因組圖書館可用本技藝中詳知的最佳方法以對應於 -39- 暴紙张尺度適用中國國家標準(CNS } A4規格(2ΐ〇χ:297公釐} — ) ------IT------l· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541314 A7 B7 五、發明説明(37 ) 任何OMP 1 06多肽之肽片段的胺基酸序列之經標記的簡併 寡核甞酸來做篩選。在特別的具體實例中,該用於篩選的 探針是一段與具有 IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQ ALGSQSIAIGDNKIV(序列辨識號編:1)之序列或其部份 相對應之簡併的寡核甞酸序列。在另一項具體實例中,該 用於篩選的探針可能是與具有GTVLGGKK(序列辨識號碼 :2)之序列的肽相對應之間併的寡核甞酸。在還有一項具 體實例中,寡核甞酸序列GGNACNGTNCTNGGNGGNAARA AR(序列辨識號碼:3)和 GGNACNGTNTTRGGNGGNAARA AR(序列辨識號碼:7)均對應於OMP106的肽GTVLGGKK (序列辨識號碼:2),兩者均用做爲探針。還有一項具體實 例中,序列 GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATG CGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGC AA(序列辨識號碼:4)或其任何片段,或該序列之任何互 補序列或其片段可用做探針。任何使用的探針較好長度是 在1 5個核铝酸以上。 經濟部中央標隼局贤工消t含作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在具有編碼OMP 106多肽或其片段之插入DNA圖書館 中的純系會雜交至一個或更多簡併的寡核钻酸探針上,將 此種寡核甞酸探針與基因組圖書館雜交,乃利用本技藝中 已知的方法實行。例如:以兩種以上提到之寡核替酸探針 進行雜交可在2X SSC,1.0 % SDS中而在50 °C下實行, 並用相同的條件進行沖洗。在一項特別的具體實例中,編 碼整段OMP 106多肽的ATCC 49143 DNA序列是長度約爲 8,000 b.p.的Hind III限制片段或長度約爲4,200 bp的 -40- 適用中國國家標準(CNS ) A4規格(21〇X297公釐) 541314 A7 B7 五、發明説明(38 ) DRAI限制片段。 從另一方面來看,編碼部份或整個OMP 106多肽或OMP 1 06衍生多肽之核甞酸純系可藉由篩選黏膜炎莫拉氏菌之 表現圖書館而獲得。例如,將黏膜炎莫拉氏菌的DNA分離 出來,並將隨意之片段製備出來,而且接到一個表現載體 上(例如:噬菌體,質體、噬菌體之質體或粘接質體),而 使得該載體上的插入序列能藉由戴體送入之寄主細胞予以 表現。然後可用各種篩選用的檢驗選出被表現出來的OMP 106多肽或OMP 106衍生多肽。在一項具體實例中,本發 明之各種抗OMP 106之抗體(見第5·5·節)可用在本技藝之 已知方法中鑑識所想要的純系。請參考,例如:Harlow和 Lane, 1988年,〈抗體··實驗室手册〉,冷泉港實驗室出 版,紐約冷泉港,附錄4。使從該圖書館得到的純系與溶 菌斑和抗體相接觸以鑑識那些會與抗體結合的純系。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在一項具體實例中,含有編碼OMP· 106多肽或OMP 106 衍生多肽的DNA之純系或溶菌斑可用DYNA BEADS(商品 名)根據Olsvick等人,第29屆ICAAC,德州休士頓市, 19 89年之論文予以偵測,該篇論文以參考文獻併入本説明 書中,使抗-OMP 106的抗體交叉連接至經甲基苯磺醯化的 DYNA Beads M280上,然後用這些含有抗體的小珠去吸附 能表現OMP 106多肽或OMP 106衍生多肽之純系或溶菌斑 。能表現OMP 106多肽或OPM 106衍生多肽之純系或溶菌 斑係以任何能與該小珠結合者做爲鑑識依據。 或者,可將抗-OMP 1 06的抗體非特定地固定在適當的支 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 541314 A7 B7 五、發明説明(39 ) 持物,如矽膠或CeliteTM樹脂上。此物質可接著用在吸附 如前段説明之能表現OMP 106多肽或OMP 106衍生多肽的 細菌純系。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在另一方面,可利用PCR放大的方式從黏膜炎莫拉氏菌 的基因組DNA生產相當純粹之編碼部分或整個OMP 1 06 多肽的DNA 。經簡併或其他處置之對應於已知OMP 106-多肽序列的寡核甞酸引子可以做爲引子。在特別的具體實 例中,編碼肽序列 IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQA LGSQSIAIGDNKIV(序列辨識號碼:1)或其任何部份之經 簡併或其他處理之寡核棼酸可做爲5’-引子。例如,5’引子 可以是核芬酸序列 GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAG CCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACA TTGCGCAA(序列辨識號碼:4)或其任何部份。編碼GTVLG GKK(序列辨識號碼:2)之序列的逆向互補序列經簡併或 其他處理者,可做爲3’-引子。例如,經簡併或其他處理還 具有簡併核甞酸序列YTTYTTNCCNCCNAGNACNGTNCC (序歹坪識號石馬:6)或 YTTYTTNCCNCCYAANACNGTNCC (序列辨識號碼:8)可做爲與各種上面討論過之5’-引子結 合的3’-引子。 PCR可利用例如.Perkin-Elmer Cetus熱循環器和Tag聚 聚合酶(Gene. AmpTM)來進行。吾人可選擇合成數種不同的 簡併引子用於PCR反應。吾人亦可改變用於引導PCR反應 之雜交條件的嚴苛性,以容許簡併的引子和黏膜炎莫拉氏 菌DNA中的對應序列之間有較高或較低程度的核甞酸序 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2l〇X297公釐) 541314 、發明説明(4〇 ) 列之相似性。在成功地放大編碼OMP丨〇6多肽之序列的片 ί又以後’可將該片段以分子轉殖方式處理並予序列分析, 並用其做爲探針以分離出一個完整的基因組純系。如此一 來便成如本説明書中説明的方式測定的完整核甞酸序列, 分析其表現,和生產其蛋白質以供功能分析。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 11‘ ^ -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 、一旦ΟΜΡ 1〇6多肽的編碼序列從黏膜炎莫拉氏菌的菌株 j培養株分離出來,則可利用同樣的方法其他莫拉氏菌的 菌株或培養株將OMP1〇6多肽的編碼序列分離出來。習於 此藝者會知道編碼0MP 106多肽(或其片段)的DNA或rna 序列可用以獲得其他DNA或rna序列,而這些dna或rna 序列能在中度到高度苛性的條件下用本技藝中已知的一般 技巧與本發明的序列雜交。在高度嚴格條件下與得自一種 黏膜炎莫拉氏菌的〇MP 106序列雜交將能辨識其對應之得 自其他菌株和培養株的序列。高度嚴格條件會因探針的長 度和鹼基成份而有所改變,用以測定此種條件的配方已詳 知於本技藝。凊參考Sombro ok等人,1989年,〈分子轉殖 ,實驗室手册 >,冷泉港實驗室出版,紐約冷泉港,第i i 章。此處所用之施用在大於300個鹼基長度的苛性雜交條 件包括最後在68 °C之1 X Ssc/0_ 1 % SDS中沖洗至少一小 時(Ausubel等人編校,1989年,<分子生物學之現代方法〉 (Current ProtocolsinMolecularBi〇1〇gy),第一册,Greene Publishing Associates·公司和 John Wiiey & s〇ns 公司出版 ,紐約,第2、10、3頁)。在特別的具體實例中,在使用 序列辨識號碼:4的序列或其互補序列進行雜交之中所用 43- 541314 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(41 ) 鬲度苛性沖洗條件是2 X SSC,1。/〇 SDS在50 °C沖洗大約 20分鐘至大約30分鐘。 為¥此藝者將能利用本技藝中已知的方法辨識出 1 06多肽之編碼序列的完全純系。包含於分離出來之純系 中的OMP 106多肽的編碼序列長度可藉由分析轉殖的插二 序列並將由該開放讀碼區(open reading frames,〇RFS)編碼 之推演的多肽主^和OMP 106多肽比較,及/或將推演的胺 基酸座I與已知經純化之OMP 106多肽的胺基酸序列比較 而探知。當OMP 106多肽的編碼序列之部分純系被分離出 來時,則可利用該部份純系的插入序列作爲雜交探針將完 整的純系分離出來。或者,重疊的部份純系可經由連接其 插入序列而重建出完整的0MP 106多肽之編碼序列。 完整的純系可以是任何具有0RFs ,而該〇RFs具有與 OMP 106多肽吻合的推定胺基酸序列之純系,或者當QMP 1〇6多肽之胺基酸序列無法獲得時,則爲與〇Μρ 1〇6多肽 的肽片段且具有與OMP 106多肽對應之分子量的胺基酸序 列吻合者。還有,完整的純系可由其插入序列的能力予以 辨識,當插入片段被放在一個表現載體中則會產生一種與 專一結合至OMP 106多肽之胺基端的抗體,和與專一結合 至OMP 106多肽之羧基端的抗體相結合的多肽。 編碼OMP 1 06衍生多肽的核酸序列可用本技藝中詳知的 方法生產。一方面,編碼OMP 106衍生多肽可鑒於本説明 書所揭示的敎示而以重組DNA法從OMP 1 〇6多肽之編碼序 列衍生得到。例如,0MP 106多肽之編碼序列可以是不會 -44-
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541314 A7 五、發明説明(42 影響OMP 106多肽之免疫原性質或者能增進其免疫原性質 之經修改製造的胺基酸取代序列。各種方法都可被使用, 其包括但不限於針對特定寡核甞酸位置的突變。這些和其 他本技藝中已知的技術可用於製造單一或多元的突變,諸 如置換、插入、刪除、和轉位,如Botstein和Shortle ’ 1985 年 <科學 >,第 229 期:1193-121〇 頁。 裝 遂有,OMP 1 〇6多肽編碼序列DMA可用限制酶或核酸 外切酶加以截修。異源之編碼序列可用連接法或pcR放大 法添加到0MP 106多肽的編碼序列上。而且,編碼整個或 部分0MP 106衍生多肽的DNA可基於已知或推演之〇Mp 1〇6多肽的胺基酸序列和任何所想要對序列做的改變用 PCR放大法合成或以化學法合成。 經鑑認並分離之含有OMP106多肽或OMP1〇6衍生多肽 之編碼序列的DNA可被插人—個適#的轉殖用載體中。有 許多本技藝中已知的載體一寄主系統可以使用。可用的載 體包括但不限於質體或經修飾的病毒,但是該載體系統必 須要所使用的寄主細胞相容。這樣的載體包括但不限於唑 固體如爛它吐菌體(lambda)的衍生物,或質體如卿322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 或pUC質體的衍生物。你丨如# 物例如,將DNA插入轉殖用載體的過 ==接該職片段到具有互補之枯合端的轉殖; 虹來達成。然而’若是用以將DNA切段之互補限 位不出現在轉殖用的載體中丨 刀 做酵素性的修飾。或者, 要 了猎耆知核芬序列(連接序列 黏接到DNA未端上而產生任何 、 斤歹" 仃所要的切位;這些經黏接的 本紙張國國家標準(CNS) -45- 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(43 ) 連接序列可能包括特^之化學合成的寡㈣酸,其編碼限 制核酸内切酶的辨認序列。在另—可行的方法之中,可用 同聚物接尾的方式修飾被切開的DNA。重組分子可經由轉 移型、轉移感染、感染、電穿洞法等方法送入寄主細胞中 ,因此可產生許多複製的基因序列。 在另一万法之中,所要之含有0MP l06多肽或〇Mp 衍生多肽編碼序列的DNA可在用「發射槍(811加gun)」的 方式插入適當的轉殖用載體後被辨識和分離出來。對所要 之序列進行濃縮(例如用大小分級分離法)可在插入 體之前進行。 ^ 在特定的具體實例中,以含有OMP 106多肽有0Mp 1〇6 行生多肽之編碼序列的重組DNA分子使寄主細胞轉型能 產生此種編碼序列的多重複製物。因此,該編碼序列 由培養轉型細胞,從轉型細胞分離出重組的DNA,以及若 有必要時,將插入的編碼序列從分離的重組DNA上取出而 獲得。 5·8. 式.生_J^〇MP 100 多肽和 本發明之OMP 106多肽和OMP 106衍生多肽可經由遗傳 工程技術生產。在這種情形之中,它們是由以編碼該多月太 之DNA予以轉型的適當主細胞所生產。編碼本發明之 1〇6多肽或OMP-106衍生多肽之核甞酸序列可插入適各的 載體之中,亦即含有轉錄和轉譯該插入之多肽編碼序列所 需元素的載體。編碼OMP 106多肽或OMP 1〇6衍生多月太之 46 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) M規格(2丨0><297公釐) —— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) LT . 訂 541314 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(44 ) 核#酸序列以其能在適當條 r 田條件下被表現出來的方式插入載 :(例如,以正確的位向和正確的讀碼區,並且具有適當的 序歹j I括#又RNA聚合酶的結合序列和核糖體的結 合序列)。 有許多寄主-載體系統可用於表現該多肽之編碼序列。這 些系統包括但不限於以病毒(例如:牛症病毒,腺病毒等) ^染的哺乳類細胞系統;以病毒(例如:巴氏病毒)感染的 :蟲細m微生物如包含料菌載體之酵母菌或以嗟 菌DNA、質體DNA,或粘接質體DNA轉型的細菌。較 好邊寄主細胞是細菌細胞,而最好該細菌是大腸桿菌、枯 草桿菌或沙門氏菌。 載體的表現元素在其強度與特定性上會有變化。視所使 用的寄主-載體系統而定,許多適當之轉綠和轉譯元素之中 的任一個均可被使用。在一項特定具體實例中,一種包含 OMP 1〇6多肽或0MP 1〇6衍生多肽序列及一種寄主細胞之 如及/或原一序列的嵌合型蛋白被表現出來。在其他特定 的具體實例中,一種包含〇Mp 1〇6多肽或omp 106衍生多 月太序列和一種親和性純化之肽的嵌合型蛋白被表現出來。 還有一些特定的具體實例中,一種包含OMP 1〇6多肽或 OMP 1〇6衍生多肽序列和一種有用之免疫原多肽或肽的嵌 合型蛋白被表現出來。在較佳的具體實例中,表達出來的 0MP 106衍生多肽含有一段形成天然OMP 106多肽之外表 抗原決定部位或受體結合區位的序列。 任何在本技藝中已知用於將DNA片段插入載體的方法 -47 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(21〇χ297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 卜· ▼裝- 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 -----—— _ 五、發明説明(45 ) ~ ~" I用於建構含有一種嵌合型基因的載體,而該嵌合型基因 含有適當的轉綠/轉譯控制信號和多肽編碼序列。這些方法 u匕括把外重組DNA和合成技術,以及體内重組物(基因 重組)。編碼OMP 106多肽或0MP 1〇6衍生多肽之核酸序 列的表現可由第二種核酸序列來調控,使得插入的序列能 在以重組DNA分子加以轉型的寄主中表現。例如,插入序 列的表現可由任何本技藝中已知的起動子/促進子多以控 制。可用於控制插入序列之表現的起動子,包括但不限於 用在動物細胞中表現的SV 40早期起動子區(Bern〇ist和 Chambon·,1981 年,<自然>,第 290 期:3〇4_31〇 頁),包 含在勞斯(Rous内肉瘤病毒之3’末端長段重覆序列中的起 動子(Yamamoto等人,1980年,<細胞〉,第22期:787_ 797頁),疱疹胸苷激酶起動子(Wagner等人,1981年,< 美國科學院進展報導>(PNAS)第78期:i44i_i445頁),金 屬硫新質基因的控制序列(Brinster等人,1 982年,〈自然〉 ’第296期:39-42頁);用在細菌細胞中表現的卢·内醯胺 酶的動子(Villa-Kamaroff等人,1978年,〈美國科學院進 展報導 >(PNAS)第 75 期,3727-373 1 頁),tac(DeB〇er 等人 ,1983年,〈美國科學院進展報導〉,第go期,21-25頁) ,APl,或trc(亦請參考<科學的美國人〉;198〇年,第242 期:74-94頁中的「得自重組細菌之有用的蛋白質」用 在移植細胞中表現的nopaline合成酶起動子區或椰花菜鑲 後病毒35 S RNA起動子(Gardner等人,1981年,〈核酸研 究〉,第9期:2871頁)和光合酵素二磷酸核酮糖羧化酶 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨〇><297公釐) ""~' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 541314 A7 ---------B7 五、發明説明(46 ) (Herrera-Estrella 等人,1984 年,<自然>,第 31〇 期: 1 15-120頁);來自酵母菌或其他眞菌的起動子元素如, GaU起動子,ADC(酒精去氫酶)起動子,pGK(磷酸甘油激 酶)起動子,鹼性磷酸水解酶起動子。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 含有OMP106多肽或〇MP1〇6衍生多肽之編碼序列的表 現載體可用三種一般方式鑑認:(a)核酸雜交法有無「標 圮物」基因功能存在,和〇)插入序列之表現。在第一種方 法之中,插入表現載體之外來基因可用探針以核酸雜交法 偵測其存在,而該探針包含與插入之〇Mp 1〇6多肽或〇Mp 106衍生多肽的編碼序列同源的序列。第三種方法之中, 重組載體/寄主系統可基於某種「標記物」基因功能的存 在與否(例如,胸苷激酶的活性對抗生素之抗性,轉型之 表現型,在巴氏病毒中的吸凝體(〇cclusi〇n b〇dy)之形成等 等)予以鑑識和挑選。而這些基因功能則由於插入外來基 因到載體上所造成。例如,若將OMP 1〇6多肽或omp 1〇6 衍生多肽的編碼序列插入載體之標記物基因序列的範圍内 ’則含有該插入序列之重組載體可藉由標記物基因功能之 不存在而被鑑認出來。在第三種方法之中,重組的表現載 體可經由檢驗重組載體所表現的外來基因產物而被鑑識出 來。例如,此種檢驗可基於OMP1〇6多肽或OMP1〇6衍生 多肽在體外檢驗系統中的物理或官能性質,例如:結合至 OMP 1 06的配體或受體,或與本發明之抗_〇Mp 1 〇6抗體結 合,或寄主細胞的血球凝集能力,或細胞抽取物干擾由黏 膜炎莫拉氏菌所造成之血球凝集能力。 _____-49- 本紙張尺度適用中關家標準(CNS ) M規格(2獻297公羡 M1314
、發明説明(π 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 一旦鑑識或分離出某種特別的重組DNA分子,則可用本 技藝中的數種方法予以增殖。—旦建立了適合的寄主系統 生長條件,則可大I繁殖和製備重組的表現載體。如以 ~釋k的了使用的表現載體包括但不限於以下載體或 生物·人的或動物的病毒如牛痘病毒或腺病毒;昆蟲 =二如巴氏病毒;酵母菌載體;噬菌體的載體(例如:爛它 噬菌體載體),和質體及粘接質體的DNA載體,而並只有 少數具名者。 ^ 此外,寄至細胞株可以選擇能轉變插入序列之表現,或 修以特定之想要的方式修改和對基因產物加工者。從某些 起動子發生的表現可在某些引發物出現的情況下被提高; 因此,以遺傳工程修改的〇Μρι〇6多肽或〇Μρι〇6衍生多 肽的表現是可控制的。還有,不同的寄主細胞對於轉譯和 轉譯後的蛋白質加工和修飾有其特徵和特定的機制。吾人 可選擇適當的細胞系或寄主系統以確保表現之外來蛋白質 上有所要的修飾和加工。 、 5.9.試劑 本發明的多肽、肽、抗體和核酸對臨床或醫學上診斷點 膜炎莫拉氏菌感染和對科學上研究莫拉氏菌的致病性、毒 性和感染性,以及對於寄主的防禦機制之研究而言,是= 用的試劑。例如,本發明的DNA和RNA可做爲以雜交或 PCR放大法鑑認生物標本中黏膜炎莫拉氏菌之存在的探^ 。該DNA和RNA亦可用於鑑認其他或許編碼一種與黏犷 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i. 訂 -50- 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(48 ) 炎莫拉氏菌OMP 106相關之蛋白質的細菌。 本發明的多肽和肽可用於製備多株和單株浐舰 抗體可用於進一步以親和層析法純化含有本:而這些 組合物。該多肽和肽亦可用於標準的免°疫檢驗=多肽的 中抗黏膜炎莫拉氏菌的抗體存在與否。 ’師選樣品 吾人需瞭解要利用本發明的敎示於特定的問 需要依照本發明所含的敎示在具有本技蓺 ’衣境必 处*桥芬f固nb、1 , 斗牧云 < 一般技巧者的 犯力所及範圍内万可。以下的實施例中顯示 及其製備和使用方法的實例。 6_宜~施例:分離和鑑定 11143或其他菌株之编碼卫因的特徵 6.1材料及方法 6.1.1.血球凝集檢驗 以Soto-Hernandez等人説明的方法(<臨床微生物學雜誌 >,第27期:903-908頁),試驗黏膜炎莫拉氏菌引致的血 球各疋集’除了在抹片血球凝集試驗中以5 〇/0取代3 〇/。(體積 比)的紅血球。最初的血球凝集檢驗是以2〇毫克的細菌細 胞(澄重)達成的。因爲在3 5 °C生長在血液瓊脂皿上的菌株 ATCC 49143會產生強的血球凝集反應,所以被選做爲參考 菌株。以1 : 2的稀釋率連續稀釋菌株ATCC 49143則會造 成減低之血球凝集反應。+ + + +到+的計分是基於連續以1 :2稀釋以後,由ATCC 49143菌株觀察到的血球凝集現象 ’因此,產生一個+的反應要用到達成一個+ + +反應所需之 51 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) I裝 I I 訂 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(49 ) 細胞數目的1/4 6_1.2·也球凝集之抽制 將黏膜炎莫拉氏菌ATCC 49143細胞懸浮液以1 ·· 2的比 例連續稀釋,而用產生一個+血球凝集反應的稀釋液在使用 7微升和俾可(Duibecc〇)磷酸鹽缓衝之鹽液和7微升$ %( 體積比)的人類〇 +紅血球的條件下檢驗血球凝集受簡單的 糖和糖衍生物抑制的情形。爲了要測定簡單的糖或糖衍生 物是否會抑制黏膜炎莫拉氏菌造成的血球凝集,所以將7 微升500mM之某種糖液和7微升的黏膜炎莫拉氏菌細胞混 合,並且培養5分鐘以使該糖與細胞交互作用。然後添加7 极升5 4 (^ #貝比)的人類〇紅血球,而在}分鐘後對血球凝 集現象計分。試驗每種糖和糖衍生物抑制血球凝集的能力 。然後將每種糖和糖衍生物的貯存液連續以丨:2稀釋, 並以上述方法用這些稀釋液檢驗其抑制血球凝集的能力。 以這樣的方式可以測得抑制血球凝集所需的醣類之最小濃 度。 6.1.3.與配體和受體的結合 依照Magnani等人,1982年,<生物化學雜誌>(J Br〇1 Chem.)第257期:14365-14369頁説明的方式利用薄層色 析法(TLC)分級分離寄主細胞的醣脂和覆在該層析圖上之 經標記的細胞,以檢驗黏膜炎莫拉氏菌與動物細胞醣脂受 體的結合。P曰1吕之’將待自Matreya公司(賓州歡樂峽市) - 52- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) ---*--^----^裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -I# 541314 A7
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訂
:)4丄3丄4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(si ) 法。 6.1.5. 將得自ATCC 49143菌枝> 古土么k ^ 50笔克細胞懸浮於1毫升杜 俾可(祕ecc〇)磷酸鹽緩衝鹽液的細胞懸浮液 酶^室溫下消幻小時:TLCK•處理過的胃蛋白酶(5毫克) 蛋白酶Κ(5笔克),TPCK_處理過的胰蛋白酶〇 =蛋白酶,100單位)。所有這些蛋白酶均得自咖 hemlcals公司(密蘇里州聖路易市)。蛋白酶處理後,緊接 著將細胞在PBS中沖洗一次,並縣淬. 上忍,于在1笔升PBS中,然 =試驗其血球凝集活性。此外,科基㈣料對蛋白酶 處理過的細菌細胞進行抽取,使外膜蛋白能被分解出來以 便鑑認被蛋白酶消化之特定蛋白質。 Λ1·6·玉能使血球凝集的培I梓 一般而言,將能使血球凝集之黏膜炎莫拉氏菌的培養物 在35至37 °c,200 rmp下養在含有穆勒-辛頓肉汁的振盪 反應瓶中24至48小時。從血液瓊脂盤或含有穆勒_辛頓培 養基的盤中取出的細胞也表現出能使血球凝集的表現型。 爲了要挑出不能使血球凝集(NHA)的培養株,以使ATCC 49143菌株以每5天的時間連續轉徙接種到穆勒辛頓肉汁 的#止培養物中,在3 5 C培養。每一次轉徒接種都只從肉 汁培養物的表面吸取接種物。在第二次轉徒接種前就產生 了 一團浮在表面的細胞,而這團細胞就被用來做爲緊接下 來培養的接種物。以此種方式做連續培養能典型地在三次 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝·
▼、1T ίφ • 111 1 i -54- 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(52 轉徒接種後產生ATCC 49143的NHA培養株。 6·1·7· OMP 106 多妝 得自黏膜炎莫拉氏菌ATCC 49143外膜抽取液的 106多肽在抽取液於10(rc培養5分鐘後就能在變性凝膠上 被偵測到(例如,用銀染或用抗-〇Mp抗體)。爲了要測定在 100 c培養後出現的0MP 106寬帶是否爲低分子量蛋白在 滞騰期間集結的結果,或者是否料會使常態下集結的蛋 白質進入凝膠,所以將未經沸騰處理之ATCC 49143的辛 基葡萄糖苷外膜抽取液在天然聚丙烯醯胺凝膠上做分析。 將包含緊連在樣品槽下的特定凝膠區切下並使加熱沸騰。 然後使產生的樣品在變性的聚丙烯醯胺凝膠上做解析,並 且用銀染劑染色(Silver Stain Plus商品,Biorad Lab〇rat〇ries 公司,目綠號碼 161-0449,於加州 Richmond 市)。爲了做N-端的序列分析,故將ATCC 49143的辛基葡 萄糖苷外膜抽取液和含有SDS的PAGE樣品緩衝液混合, 並且在沸騰的水浴中培養5分鐘。然後在含sds的12 〇/。 PAG上做解析,並且用電吸墨法將之轉移到一片pvDF膜 ^。然後把含有OMP106寬帶的膜區切下,以便進行胺基 邮的序列分析。沒有任何用於分離OMP丨〇6多肽的PagE 程序在其樣品或凝膠的緩衝液中用還原劑。 6·1·8·拉- ΟΜΡ 106的抗血清 抗-ΟΜΡ 106抗體的製備係將得自atcc 49143之ΗΑ培 --—·--hi---裝------訂----- Φ—, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 55- 541314 A7 B7 五、發明説明(53 OMP 1 06多肽以前述方式在變性之硫酸十二酯鈉聚 胺&是膠上做解析(Lammeli,1970年,〈自然>,第 :680-685頁)’並且將含有〇MP1 〇6多肽的寬帶從 切下來。將切下來的寬帶浸軟後注射到兔子體内, 生抗-OMP-106的抗血清。以第6」.2節説明的方式 血清抑制血球凝集,但是以抗血清取代第6· 1.2節中 如第7節中説明的,同樣對此抗血清做補體調節之 炎莫扭氏菌之胞毒活性的檢驗。 6·1.9·里把-OMP 106抗血清進行西方零、點法 將以下菌株在5 % C〇2,35 °C下之巧克力瓊脂培養皿中 培養48小時:黏膜炎莫拉氏菌ATCC 49143,ATCC 43628 ’ ATCC 43627 ’ ATCC 43618,ATCC 43617,ATCC 25240 ’ ATCC 25238,ATCC 8170 ;卵莫拉氏菌 ATCC 3 3 078;腔隙莫拉氏菌ATCC 17967;牛莫拉氏菌ATCC 10900 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 養株的 丙晞醯 227期 凝膠上 使其產 用此抗 的醣。 抗黏膜 I Hi- m I— m n I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T ,奥斯陸莫拉氏菌ATCC 10973 ;淋病雙球菌(臨床分離物) ;和腦膜炎莫拉氏菌ATCC 13077。將細菌細胞用聚苯乙 烯接種環以刮取方式將菌落從瓊脂表面移出。然後將細胞 30微克懸浮在15〇微升的PaGE樣品緩衝液(36〇mM Tris 緩衝液[pH 8·8],含有4 %硫十二酯鈉和20 %甘油)之中, 並使该懸浮液在1 〇〇。(:培養5分鐘以使其溶解。將溶解的 細胞依Laemmli氏的方法在12 %聚丙烯醯胺凝膠上做解析 ,並將分開的蛋白質以電轉移法在1〇〇伏特下如前述方式 轉私至PVDF膜上歷5分鐘(Thebaine等人,1979年,〈美 -56 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 ------B7 五、發明説明(54 ) 國科學院進展報告>(PNAS),除了添加〇·05 %酸十二酯鈉 以協助蛋白質從凝膠上移動。然後PVDF膜用25亳升 Dulbecco氏的磷酸鹽緩衝鹽液預處理,該鹽液含有〇.5 〇/。 酪蛋白鈉,0.5 %牛血清白蛋白和1%山羊血清。所有接下 來的培養都用此預處理緩衝液實行之。 將PDVF膜與Μ毫升1 : 500倍稀釋之已做免疫前處理 之兔血清或從以OMP 106多肽(如先前説明者)做免疫處理 的兔子身上採得的血清在室溫下培養丨小時。然後用沖洗 緩衝液(20mM Tris緩衝液[ρΗ 7·5],並含有15〇mM氯化鈉 及〇·〇5 % Tween-20)沖洗PVDF膜。將PDVF膜與25亳升1 • 5000倍稀釋之過氧化物酶標記的山羊之抗兔血清
IgG.(JackS0n ImmunoResearch Lab〇rat〇ries 出品,該公司位 於賓州West Grove目錄編號1U_035_〇〇3)在室溫下培養3〇 分鐘。然後用冲洗用緩衝液將PVDF膜沖洗四次,並以3 31 二胺基聯苯胺四氫氯酸鹽和Sigma化學公司供應之過氧化 脲個別沖洗4分鐘(Sigma化學公司位於密蘇里州聖路易市 ’過氧化脲之目錄編號爲D-44 1 8)。 6· · 0里jgj-lQJViP 106免疫螢光染細胞表面 在35 C的振盪式水浴中將黏膜炎莫拉氏菌49 143養在穆 勒-辛頓肉汁中至隔液。然後將細胞用離心法沉澱成小塊, 再懸浮於等體積之不含鈣或鎂之經修飾的Dulbecc〇氏磷酸 鹽緩衝液(PBS/MC)中。將該細胞懸浮液裝載於五片乾淨的 顯微叙片上。裝置1 〇秒鐘後,用微滴管將過量的液體除去 I — 1 裝 訂 Aw L. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -57- 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(55 ,然後將此玻片風乾丨小時。再將此波片以大焰加熱固定 ,直到玻片觸起來是溫熱的。一開始先用40微升以 PBS/MC做1 ·· 40倍稀釋的抗-OMP106抗血清或免疫前得 自相同動物的血清,或是PBS/mc將玻片處理10分鐘,然 後用PBS/MC沖洗5次。然後用4〇毫升5微克/毫升濃度之 經螢光素異氰酸鹽標記的山羊之抗兔子的抗體 IgG_(Kirkegaard and Perry Laboratories 出品,位於瑪里蘭 州的Gaithersburg市,目錄編號〇2_15_〇6)溶於pbs/Mc溶 液處理該玻片。每一玻片都以PBS/MC覆蓋,上面再覆以 蓋玻片的方式保存,並且用安裝之489毫微米波長的濾鏡 之螢光顯微鏡做觀察。對每一樣品而言,將五種視野的結 果以目視檢驗之,以評估其受染的程度。 6.2.結果 ό·2·1.血球凝集活性 黏膜炎莫拉氏菌對紅血球的凝集活性是具物種特定性的 ,而在人的紅血球上可觀察到最強的活性。兔子的紅血球 也會被黏膜炎莫拉氏菌凝集,但是不像人體細胞那麼顯著 。老鼠、馬或羊的血紅素則不會被凝集(見表丨)。 ........................................................................-..................................... || | ___________ ___________ 表1用黏膜炎莫拉氏菌ATCC 49143試驗其對各種生物物 種之紅血球造成血球凝集的活性
-58- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) m m I n^i «.HI I m n mu ml、lXTJIn ml m I m m (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 541314 A7 B7 五、發明説明(56 ) 兔 馬 羊 a ++++ 最強的血球凝集反應,-表示沒有血球凝集反應 6.2.2. OMP 106受體輿配體 黏膜炎莫拉氏菌的血球凝集活性是由於和紅血球丁碳糖 (Gtu)。得自能使血球凝集之菌株的膜泡會與具有Gb4之醣 月曰結合’但疋不具血球凝集活性的菌株卻不會與同樣的糖 酉旨結合(見圖2)。黏膜炎莫扭氏菌的血球凝集活性受到 的單醣成份或此種單酷的衍生物所抑制,其中尤其有效的 抑制劑爲N-乙醯基半乳糖胺和半乳糖(尤其是半乳糖的 反構體)(見表2) 濃度。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝·
、1T -Φ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ........... _____ mnn——[TT|||[||議Π|, .. .mmi丨 I 丨丨 丨丨 _i«u」„^_M>w>wwwwww>H|MWWM 表2 :抑制由黏膜炎引起之血球凝集(MIC)所需的最低糖 糖 1VT Τ ΓΎ m λ/ί、 右旋-葡萄糖 ——^—_ ivi 1 L 1 III IV! J >167 右旋-甘露糖 83 右旋-半乳糖 41 左旋-岩蕩糖 83 Ν-乙醯基-右旋葡萄糖胺 >167 Ν_乙醯基-右旋半乳糖胺 41 -59-
10 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 B7 五、發明説明(57 ) 甲基-β -葡萄糖 甲基-β -甘露糖 甲基-半乳糖 甲基-/?-半乳撼 ^___ ρ制由黏腱炎莫拉氏菌ATCC 49143引起5 %經沖洗 之人的0紅血球之1 +血球凝集反應所需的最 -^低糖濃度。 N- ^醯基半乳糖胺和π _半乳糖均爲Gh四醣的一部份。 血球凝集和與(3%結合的相關性,及其與血球凝集會受包 含Gh文體之單醣抑制的發現建議了黏膜炎莫拉氏菌細胞 黏結至四醣Gh的可能。這種四醣存在於人的紅血球和組 織,並且能居間促成黏膜炎莫拉氏菌黏接至紅血球的膜上。 6.2.3. m^QMP 106 多肽 以虫白水解方式消化黏膜炎莫拉氏菌,接著對消化過的 細胞I血球凝集作用加以分析,證明用胃蛋白酶和蛋白酶 K做蛋白酶處理會破壞血球凝集的活性,而用胰蛋白酶則 部份破壞血球凝集活性,這顯示該血球凝集活性是受蛋白 質居間促成的。分析經蛋白酶消化之黏膜炎莫拉氏菌二胞 的OMP蛋白輪廓圖顯示在每一樣品中有多重的蛋白質= 分解了,因此該輪廓圖無法提供哪一種蛋白質是負責或产 接造成血球凝集活性的線索(見圖3)。 因爲蛋白酶處理指出有一種多肽直接或間接負責血球 -60
(請先閱讀背面之注意事 訂----- j m 1- -- ......
本紙張又度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X297公釐)
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集的活性,所以我們用SDS_PAGE來比較得自能使血球凝 集的菌株之OMP輪廓圖和不能使血球凝集之菌株之〇Mp 輪廓圖(見圖4)。分析這些輪廓圖之間的差異指出該能使血 球合是集囷株有兩種獨特的多肤,一種具有27 KD的表面分 子量(以OMP 27表示),而另一種是唯一具有大於1〇6 KD 表面分子量的蛋白質(以〇MP丨〇6表示)。値得注意的是, OMP 1 06多肽的寬帶不存在各種經蛋白酶處理而使血球凝 集活性降低或消失的細胞之OMP 1 〇6製備物中,但是〇Mp 27的寬帶卻存在於經蛋白酶κ處理而不具血球凝集活性之 細胞的ΟΜΡ製備物中。此外,ΟΜΡ1〇6多肽的寬帶不會被 蛋白酶V8消化而分解,而這種消化不會影響到經處理之細 胞的血來凝集活性。 I ·ρι— ϋϋ _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕 —衣 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6_2·4· ΝΗΑ培養株的OMP輪廓圖 在35°C靜態培養中對ATCC 49143的NHA培養株做連續 培養能在第三次培養物的轉徒接種前產生NHA培養株(以 49 143 -NHA表示)。這種血球凝集活性的喪失是可重覆發生 的。對HA和NHA培養株的OG外膜抽取液之omp輪廓圖 進行分析顯示OMP 106多肽的寬帶在49 143-NHA抽取物中 消失了(圖5)。這顯示OMP 106多肽就是黏膜炎莫拉氏菌的 血球凝集素(亦即OMP 106多肽與Gb4受體結合,或者它是 與Gb4受體結合之同聚物蛋白質的一個次單元體),或者它 形成黏膜炎莫拉氏菌之血球凝集素的一部份(亦即OMP 1 〇6多肽是與Gh受體結合之異聚物蛋白質的次單元體)。 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 541314 A7 B7 五、發明説明fe9 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6.2.5. OMP 106和血球凝集作用 由ATCC 49143 OMP 106多肽爲抗原產生之多株抗血清 能中ATCC 49143引起的血球凝集,而且也能中和由異源 之ATCC 43 627所引起的血球凝集。這更支持了以下結論 ,那就是黏膜炎莫拉氏菌的血球凝集活性包含OMP 1 06多 肽,而OMP 1 06多肽的抗原性在菌株間被保留下來。請參 考圖9 A,其顯示多株抗血清中的抗體會與異源之黏膜炎莫 拉氏菌株的OMP 106多肽結合。 6.2.6. OMP 106在外表的位置 用兔子的抗一 OMP 106抗血清做間接的免疫螢光染色以 測定OMP 106多肽是否曝露在黏膜炎莫拉氏菌細胞的外表 。以抗一 OMP 1 06抗血清處理的黏膜炎莫拉氏菌細胞要比 用免疫前的血清或PBS/MC處理的細胞染得深且均句。這 指出完整之黏膜炎莫拉氏菌的OMP 106多肽會與抗一 OMP 1 06抗體反應。而這結果指出OMP 1 06多肽是曝露在黏膜 炎莫拉氏菌的表面上。這項發現和OMP 1 06多肽扮演血球 凝集的角色一致,並且還指出OMP 106在做爲疫苗上有用。 6.2.7. OMP 106多肽的性質 OMP 1 06多肽以大型的蛋白質複合體,爲其天然狀態存 在或當它以辛基葡萄糖菩抽取時呈結集的形式。這項結論 由以下發現所支持,那就是用辛基葡萄糖棼對黏膜炎莫拉 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) ,»^1- 1 - -- - - (請先閱讀背面之注意事- 1· ,項再填· 裝-- .寫本頁) 、?! 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 B7 五、發明説明(60 ) 氏菌進行抽取會把OMP 106多肽溶出,但抽出的OMP 106 多肽並不會進入變性PAG中,除非該抽取物泡在1 00 °C培 養過(圖6)。而且,OMP 106多肽並未顯示其能從低分子量 的多肽在加熱時因聚合或集結而形成,因爲在未經加熱的 變性樣品中OMP 1 06多肽會被凝在樣品槽中,而只有在樣 品先培養在1 〇〇 °c的條件下才能進入解析用凝膠。這項生 化性質對於鑑認各種凝膠中的OMP 1 06多肽很有用。 利用黏膜炎莫拉氏菌的辛基葡萄糖甞抽取物,然後將該 抽取物硫酸十二酯鈉在1 00 °C培養,再將蛋白質於變性聚 丙晞醯胺凝膠上做解析,我們估測出得自各種黏膜炎莫拉 氏菌菌株之OMP 106多肽的表面分子量,尤其是ATCC 25238,ATCC 25240,ATCC 43617 , ATCC 43618 , ATCC 43 627和ATCC 43 62 8的OMP 106多肽,其範圍在大 約180 kD至大約230 kD(圖9A),然而ATCC 49143菌株的 OMP 106多肽顯示其具有大約190 kD的表面分子量(圖 6) 〇 吾人將ATCC 49143菌株的OMP 106多肽從凝膠切片抽 出,並對其N-端做序列分析。序列分析顯示得自 ATCC 49143之外膜之OMP 106多肽的Ν·端爲IGISEADGGKGGA NARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(序歹ij 辨識號碼 :1)。此外,還分離出一段由Lys-C消化分解(Fernandez 等人,1994年,〈分析生物化學〉,第218號:112-117頁) 產生之OMP 106多肽的中間肽段,其序列經測定爲 GTVLGGKK(序列辨識號碼:2)〇 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^衣. 訂 541314 A7 B7 五、發明説明(61 ) 我們製造出三種寡核甞酸探針。兩種探針相對於該中間 肽段GTVLGGKK,其中一者具有以下序列GGNACNGTNCT NGGNGGNAARAAR(序列辨識號:3),另一者具以下序列 :GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR(序列辨識號碼:7) 。另外一種探針Me 5-72編碼OMP 106序列之N-端(序列辨 識號碼:1)的中間片段(序列辨識號碼),其序列爲GAAGC GGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATA AATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA(序歹"坪識號碼 :4)。將Me 5-72探針雜交至黏膜炎莫拉氏菌DNA的Hind III或Dra I完全消化物,每一種消化物都在南方墨點分析 中產生單一的一條寬帶(圖7)。在Hind III消化物中的雜交 寬帶具有大約8.0 Kb的大小,而在Dra I消化物中的雜交 寬帶則具有大約4.2 Kb的大小(圖7)。 6.2.8. OMP 106多肽保守性 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對數種黏膜炎莫拉氏菌菌株及有關的菌種之外膜蛋白抽 取物做西方墨點分析顯示抗-OMP 1 06抗體會和許多黏膜 炎莫拉氏菌的菌株中,包括HA和NHA菌株或培養株之大 約180KS至大約230 kD的多肽結合(見圖9A)。抗-OMP 106 的抗體不會與任何存在於相關細菌之蛋白質抽取物中的多 肽結合(圖8A)。這些結果證明以下事實: 1)抗-OMP 1〇6抗體可用於特定地鑑認並將黏膜炎莫拉氏 菌從相關的菌種之中區辨出來。2) OMP 106多肽可用於產 生能做爲診斷之應用以鑑認黏膜炎莫拉氏菌之抗體。3) ___ -64- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 541314 A7 B7 五、發明説明(62 ) 抗一種菌株之OMP 106多肽的抗體(例如:抗ATCC 49143 之OMP 106的抗體)可用於鑑認和分離其他黏膜炎莫拉氏 菌的菌株中相對應的Ο Μ P 1 0 6多肤。有趣的是,西方墨點 的結果顯示有許多ΝΗΑ黏膜炎莫拉氏菌的菌株有ΟΜΡ 106 多肽存在於其外膜的OG抽取液中。這項發現以及下述事 實,即在PAGE之後得自ΗΝΑ黏膜炎莫拉氏菌菌株之OG 外膜抽取液的OMP做銀染並未在180 KD至230 KD的範圍 透露一道寬帶,這顯示OMP 106多肽會由大多黏膜炎莫拉 氏菌的菌株或培養株表現出來,但是爲了要在血球凝集作 用上具有活性(亦即能結合至哺乳類細胞表面受體上)或可 被銀染,該OMP 106多肽勢必要以某種方式做適當地修飾 。顯然地,只有HA菌株和培養株能正確地修飾OMP 1 06 多肽,使其能居間促成細菌結合至哺乳類細胞表面的血球 凝集素之受體。 7.實施例:OMP 106疫苗的效能:抗-OMP 106抗血清之 胞毒活性 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 檢驗抗-OMP 1 06抗體之補體中介性胞毒活性,以測定 OMP 1 06多肽的疫苗潛能。以第6.1 ·8節所説明的方法製備 抗ATCC 49143 HA培養株之OMP 106多肽的抗血清。用 Eollinger等人所説明之「血清殺菌試驗」來檢驗免疫前的 血清和抗_〇MP 106之抗血清在中介補體殺滅黏膜炎莫拉 氏菌上的活性(「對於腦膜炎雙球菌之免疫反應」,反於< 臨床實驗室免疫學手册〉,第三版,347-349頁),除了以 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 541314 A7 B7 五、發明説明(63 ) ΗA和NHA黏膜炎莫拉氏菌菌株或培養株細胞取代腦膜炎 雙球菌的細胞。 結果顯示抗·〇ΜΡ 106的抗血清可中介補體殺滅異種之 黏膜膜拉氏菌ATCC 43627的ΗΑ培養株,但卻不會殺滅黏 膜炎莫拉氏菌ATCC 43627的ΝΗΑ培養株或ΝΗΑ黏膜炎莫 拉氏菌ATCC 8176。表3摘錄了免疫前血清和抗-ΟΜΡ 106 抗血清在對抗ATCC 43627之ΗΑ培養株上的補體中介胞毒 活性。 表3 免疫前的血清和抗-OMP 106抗血清之補體中介胞毒 ϋϋ· ·ϋϋ —ϋ 4^ϋ— m ϋ— —ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 活性 胞毒效價 1 免疫前 抗 ΟΜΡ 106 貫驗1 16 128 實驗2 8 64 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1.該效價是指血清能中介補體殺減ATCC 43627之HA培 養株之最高稀釋倍數(例如,16代表將該血清稀釋16倍 ),其數値愈大,則胞毒活性或效價愈高。 如表3中所示,抗-OMP 106抗血清具有比免疫前的血清 大上8倍的胞毒活性。這項發現指出OMP 106多肽有用於 做爲對抗ΗA黏膜炎莫拉氏菌的菌株和培養株之疫苗。 雖然本發明以參考其特定具體實例的方式做詳細的説明 ,但是讀者必需暸解在功能上有同等性的改變亦包括在本 -66 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 541314 A7 B7 五、發明説明(64 ) 發明的範疇之中。其實,對於熟習本技藝者而言,從先前 的説明和附帶的圖示中均能對本説明書已顯示及説明修飾 之外的各種關於本發明的修飾感到顯而易知。此等修飾含 括在附錄之申請專利範圍的範疇之中。 本説明書引用了許多論文,其所揭示的内容乃完整地以 參考文獻的方式併入本説明書中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -ϋϋ m· mmMammmmmmm Mammmmmmmmmr ιϋ_ϋ 1 y m_l im ιϋϋ_· US. 、v'口 Φ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 541314 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(65 ) 序列表 (1) 一般訊息:
⑴申請人:TUCKER,KENNETH PLOSILA, LAURA (ii) 發明標題:黏膜炎莫拉氏菌外膜蛋白_106多肽, 基因序列及其用途 (iii) 序列數目:8 (iv) 聯絡地址:
(A) 收件人:PENNIE 和 EDMONDS (B) 街道:11 55 Avenue of the Americas (C) 城市:紐約市 (D) 州名:紐約州 (E) 國名··美國 (F) 郵遞區號:10036-271 1 (v) 電腦可讀形式: (A) 媒介型式:磁片 (B) 電腦:IBM可相容的個人電腦
(C) 操作系統:PC-DOS / MS-DOS (D) 軟體:patentln Release #1.0,Version#1.30 (vi) 目前申請數據:
(A) 申請號碼:US (B) 歸檔日期: (C) 分類: (viii)法律事務所訊息: _ -68- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2ΐ〇χ297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝·
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 ____ B7 五、發明説明(66 ) (A) 姓名:Baldwin, Geraldine F. (B) 註册號碼:31,232 (C) 參考號碼:7969-045 (ix)電信資料: (A) 電話:(212)790-9090 (B) 傳眞:(212)869-8864
(C) 電傳:66141 PENNIE (2)序列辨識號碼:1的訊息 (i) 序列特徵: (A)長度:43個氨基酸 .(B)型式:氨基酸 (C) 股數: (D) 拓樸結構:未知 (ii) 分子型式:肽 (xi)序列描述:序列辨識號碼:1 : lie Gly lie Ser Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Als Asn Ala Arg 1 5 10 15
Gly Asp Lys Ser lie Ala lie Gly Asp lie Ala Gin Ala Leu Gly Ser 20 25 30 Gin Ser lie Ala lie Gly Asp Asn Lys lie Val 3 5 40 (2)序列辨識號碼:2的訊息 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 11^ H 1-1 Μϋ— ϋϋ —ϋ I I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(67 ) (i) 序列特徵: (A) 長度:8個氨基酸 (B) 型式:氨基酸 (C) 股數: (D) 拓樸結構:未知 (ii) 分子型式:肽 (v)片段型式:内部 (xi)序列描述:序列辨識號碼:2 : Gly Thr Val Leu Gly Gly Lys Lys 1 5 (2)序列辨識號碼:3的訊息 (i) 序列特徵: (A) 長度:24個鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股數:未知 (D) 拓樸結構:未知 (ii) 分子型式:其他核酸 (A)説明:/desc = n 探針•’ (xi)序列描述:序列辨識號碼:3 : GGNACNGTNC TNGGNGGNAA RAAR 24 (2)序列辨識號碼:4的訊息 ⑴序列特徵: -70- (請先閱讀背面之注意事 I項再填· 裝-- :寫本頁) 訂 i# 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 541314 A7 B7 五、發明説明(68 ) (A) 長度:72個驗基對 (B) 型式:核酸 (C) 股數、單股 (D) 拓樸結構:未知 (ii)分子型式:DNA(基因組的) (A)説明:/desc = ”探針” (ix)特徵: (A) 名稱/關鍵:CDS (B) 位置:1..72 (xi)序列描述:序列辨識號碼·· 4 ·· Siu Sa Aso Gi? 〇ΐΞ GCG CGC ^ TCC 1 u-./ ^/S Gly ^ly Ala Asn Ala Arg Glv Aso Lys Ser 5 10 15 48 (請先閱讀背面之注意事 l#mi i ATI _ 1· •項再填· 裝-- :寫本頁)
、1T ATT GCT ATT GGT GAC ATT GCG CAA He Ala lie Gly Asd He Ala Gin 20 ’ 72 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (2)序列辨識號碼:5的訊息 ⑴序列特徵: (A) 長度:24個氨基酸, (B) 型式:氨基酸 (D)拓樸結構:直鏈狀 (Π)分子迤式:蛋白質 (xi)序列描述:序列辨識號碼:5 : Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp Lys Ser 1 5 10 15 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準(pNS ) A4規格(210X297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 B7 五、發明説明(69 ) lie Ala lie Gly Asp lie Ala Gin 20 (2)序列辨識號碼:6的訊息 (i) 序列特徵: (A) 長度:24個鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股數:未知 (D) 拓樸結構:未知 (ii) 分子型式:DNA(基因組的) (A)説明:/desc = ’·探針’’ (xi)序列描述:序列辨識號碼:6 : YTTYTTNCCN CCNAGNACNG TNCC 24 (2)序列辨識號碼:7的訊息 ⑴序列特徵: (A) 長度:24個鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股數:未知 (D) 拓樸結構:未知 (ii)分子型式:其他核酸 (A)説明:/ d e s c ="探針π (xi)序列描述:序列辨識號碼:7 : GGNACNGTNT TRGGNGGNAA RAAR 24 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、?τ 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(70 ) (2)序列辨識號碼:8的訊息 (i)序列特徵: (A) 長度:24個鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股數:未知 (D) 拓樸結構:未知 (Π)分子型式:其他核酸 (A)説明:/desc = n探針’’ (v)片段型式:N端 (xi)序列描述:序列辨識號碼:8 : YTTYTTNCCN CCYAANACNG TNCC 24 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、言 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐)
Claims (1)
- 541314 第086105809號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(92年A B c D1. 一種分離之OMP106多肽,其為黏膜炎莫拉氏菌 (Moraxella catarrhalis)的外膜多肽,且利用SDS聚丙婦 醯胺凝膠電泳而以分子量分別是200 kD和116.25 kD 的兔骨骼肌之肌凝蛋白和大腸桿菌的Θ -半乳糖誓酶做 為分子量的標準,測得該多肽之分子量為大約1 80 kD 至大約230 kD,且其包含下示之序列 IGISEADGGIKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV 或 IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV,以及 GTVLGGKK. 2. 根據申請專利範圍第1項的〇?^106多肽,其具有|大 約190 kD的分子量。 3. 根據申請專利範圍第1項的OMP 106多肽,其為選自 以下集合之黏膜炎莫拉氏菌株的外膜多肽,該菌株集合 包含·· ATCC 25238,ATCC 25240,ATCC 43617,ATCC 436 18,ATCC 43627,ATCC 43628 和 ATCC 49143。 4. 根據申請專利範圍第3項的OMP 106多肽,其中該黏 膜炎莫拉氏菌株為ATCC 49 143。 5. 根據申請專利範圍第3項的OMP 106多肽,其中該黏 膜炎莫拉氏菌是能使血球凝集的培養株。 6. 根據申請專利範圍第1項的 OMP 106多肽,其能與銀 染反應。 7. —種經分離之多株抗體,其可專一結合至根據申請專利 範圍第1、2或5項中任一項之OMP 106多肽。 8. 根據申請專利範圍第7項之經分離之抗體,其為可中介 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 x 297公釐) 541314 A8 B8 C8 申請專利範圍 黏膜炎莫拉氏菌之補體致死的胞毒抗體。 9 一種疫苗,其包含根據申請專利範圍第1,2或5項中 • 任一項之OMP 106多肽。 10· —種抗原性組合物,其包含根據申請專利範圍第1 , 2 或5項中任一項之OMP 106多肽。 U·根據申請專利範圍第1、2或5項中任一項的omp 1〇6 多肽,其在動物體内有效地產生免疫反應。 —種從HA黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株生產不具血 球凝集活性之黏膜炎莫拉氏菌的方法,其包括使HA黏 膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株連續地轉徒接種到靜止 液體培養物中,該培養物保持在3 5 °C不搖盪,於約每5 天便將接種物轉徒接種到新的靜止培養物,且該轉徒將 持續’直至獲得不具血球凝集活性之培養株為止。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
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