TW541314B

TW541314B - Moraxella catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, gene sequence and uses thereof

Info

Publication number: TW541314B
Application number: TW086105809A
Authority: TW
Inventors: Kenneth Tucker; Laura Plosila
Original assignee: Antex Biolog Inc
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2003-07-11
Also published as: EP0900025A4; US20080145916A1; AU723528B2; EE9800373A; HUP9902695A3; WO1997041731A1; CN1222618C; EP0900025B1; US7576179B2; EA002743B1; CN1223549A; EE04684B1; PL330935A1; ZA973809B; BG64832B1; JP2000510696A; HK1021299A1; HUP9902695A2; NO324816B1; US7128910B2

Description

541314 發明説明（1 ) 1. 發明介紹本發明大體而言係關黏膜炎莫拉氏菌之外膜蛋白_ 106(01^-106)多肽。本發明涵蓋一種純化的（：^1>1〇6多肽及衍生自該多肽的多肽（OMP-106衍生多肽）。本發明亦涵盍抗體，包括細胞毒性抗體，其專一結合至〇Mp丨〇6多肽及/或OMP 106衍生多肽。本發明尚涵蓋預防或治療用的組合物，包括疫苗，其含有OMP 1〇6多肽及/或OMP 106衍生多肽。此外本發明還提供在哺乳類體内引發對黏膜炎莫拉氏囷產生兄疫反應的方法。本發明更提供了分離之編碼 OMP 106多肽和OMP 106衍生多肽的核甞酸序列，具有該序列之載體，以及含有該載體的寄主細胞。 2. 發明背景經濟部中央標準局員工消费合作社印製黏膜炎莫拉氏菌（Moraxella catarrhalis)亦以黏膜炎莫拉氏（布蘭罕氏，Branhamella)菌見知，而先前以黏膜炎雙球 ΪΙ或黏膜炎球菌見知，它是一種經常在人體呼吸道發現的革蘭氏陰性菌。黏膜炎莫拉氏菌起初被認爲是一種無害的共生生物，現在則被認知爲動物體上呼吸道與下呼吸遒感染的病原體。在人體，黏膜炎莫拉氏菌會在有慢性肺病的成人身上引發嚴重的下呼吸道感染，在免疫折衝的患者身上造成系統感染，並在嬰兒和兒童身上引起中耳炎和竇炎。請參考Helminen等人於1993年在 <傳染病免疫學> (Infect. Immun.)，第 61 期，2003-2010 頁發表的論文； Catlin，B.W·於1990年在〈臨床微生物回顧> (ciin· -4 - 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 541314 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 )

Microbiol· Rev)，第3期：293-320發表的論文；以及其中引用的參考文獻。 2丄膜蛋白和保護性抗體黏膜炎莫拉氏菌之外表成份已經被研究以暸解其致病過程和發展出有用之治療方式和抗此種感染的預防性處置辨法。外膜蛋白（OMP)在作爲可能之致病因子和可能之疫苗抗原上尤其倍受重視。黏膜炎莫拉氏菌具有大約1 〇至20 種不同的OMPS，而其中有6至8種，也就是OMP A至Η 是主要的種類（Murphy和Loeb，1989年），〈微生物病理學 > (Microbial. Pathogen)，第 6 期：1 59-1 74 頁）。OMP A 至 Η的分子量範圍分別在97至20 kD·。請參考Baftos和 Murphy.，1988 年，〈傳染病雜誌> (H. Infect. Dis.)，第 158 期：761-765頁；Helminen等人，1993年，〈傳染病免疫學 > (Infect· Immun.)，第 61 期：2003-2010 頁；Murphy 等人 ’ 1993 年’〈分子微生物學> (Molecul. Microbiol·)，第10期：87-97頁；和Sarwar等人，1992年，〈傳染病免疫學 > (Infect. Immun.)，第 60 期：804-809 頁。比較 50 株黏膜炎莫拉氏菌之外膜蛋白以硫酸十二酯鈉聚丙晞醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)得到的輪廓圖，其顯示OMP A至Η有近乎均一的樣式（Bartos和Murphy，1988年，<傳染病雜諸 > (J. Infect· Dis)，第 158 期：761-765)。除了 OMP A至Η，還有以種高分子量的OMP以HMW-ΟΜΡ標示，它以SDS-PAGE可得350至720 kD之表面分子 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --^^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 __—_ B7 五、發明説明（3 ) 量，這種OMP也被鑑識爲許多黏膜炎莫拉氏菌菌株所含的另一種主要的表面成份。HMW-OMP經甲酸變性會產生一道120至140 kD之寬帶，顯示其爲一種寡聚物之蛋白質 (Klingman 和 Murphy，1 994 年，〈傳染病免疫學 > (Infect Immun·)，第 62 期：1 1 50-1 1 55 頁）。HMW-OMP 顯然與 Helminen等人所標不的UspA(1994年，<傳染病雜詰> (j Infect. Dis)，第170期：867-872頁）是相同的蛋白質，且被顯示存在許數種黏膜炎莫拉氏菌中。在完整的細菌或細菌衍生之外膜囊泡之中，數種以上鑑認過的OMP提供了曝露在表面的抗原決定部位，而該部位能引發與OMP結合之抗體產生。這些具有引發免疫性的 OMP 包括 OMPE 和 OMPG(Murphy 和 Bartos，，1989 年，〈傳染病免疫學 > (Infect· Immun·)，第 57 期：2938-2941 頁）；OMP C/D(Sarwar等人，1992年，〈傳染病免疫學〉 (Infect· Immun·)，第 60 期：804-809 頁）；CopB，一種 80 kD之OMP·，（Helminen)等人，1993年，〈傳染病免疫學〉 (Infect· Immun·)’ 弟 61 期：（2003-2010 頁）；和 UspA(Helminen 人，1994年，〈傳染病雜誌> (j. Infect Dis.)，第170期： 867-872 頁）。抗體對於CopB和UspA曝露在表面的抗原決定部份之治療潛能已在一項動物與典範中做過評估。該典範涉及直接用經數量控制的黏膜炎莫拉氏菌細胞對BALB/C VAF/ Plus 老鼠的肺進行小丸劑接種。接著檢驗肺部之清除細菌的速率（Unhanand 等人，1992 年，< 傳染病雜誌 >(j.Infect.Dis.) -6 · $氏張尺度適财酬家鮮（CNS ) A4規格（210X297^楚) ' 2 ?----^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 k 541314 A7 B7 五、發明説明（4 ) ，第165期；644-650頁）。黏膜炎莫拉氏菌之不同的臨床分離物顯示其有不同的清除速率，而此速率與顆粒球新份子進入感染邵位的程度有關。以針對c〇pB或UspA表面曝露之抗原決定部位的單源抗體進行被動免疫，會增加肺部黏膜炎莫拉氏菌的清除速率（Helminen等人，1993年，< 傳染病兄疫學 > (Infect. Immun.)，第 61 期·· 2003-2010 頁 ;Helminen等人，1994年，〈傳染病雜誌>，第17〇期： 867-872 頁）〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 衣· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2·2·座,菌/寄主細胞的枯著與血球凝集細菌性病原粘結至寄主細胞表面會促進菌落生成並列發病的發生。參考E.H Beachey，1981年，<傳染病雜 >第143期：325-345頁）。革蘭氏陰性菌典型地會表現出寄主細胞表面之醣蛋白及/或醣脂上的特定結人面外源，集素。這種外源凝集素f與細菌的毛或纖毛在，二細菌粘結亦可經由其與寄主細胞表面之厭水性及/或荷文互作用之非等定結合而發生。黏膜炎莫拉氏菌粘結至呼吸遒細胞的機制至今尚不清。4微生物會黏結至培養的人類口咽上皮細胞（Mbaki) 人，1987年，<Tohuku實驗醫學雜誌> (T〇huku ; & :第153期·· 11卜121頁。Rikitomi等人的一項义九棱出纖毛可能在細菌與此種細胞的黏結上扮演某種角丨因爲當纖毛變性或用抗纖毛之抗體處理會降低有纖毛· 菌株與細胞的黏結（Rikit〇mi等人，1991年，<斯堪地系

訂 • I- M— 541314 A7

經濟部中央標準局Μ工消费合作社印？未維亞傳染病學雜誌> (Scand· j· Infect· Dis.)，第23期· 5 5 9-567頁）。纖毛能調控結合，然而它並不是這種結合的唯一基礎’因爲在受檢之數種菌株之中最具黏結性的菌株是不具纖毛的菌株。在細菌黏著的歸類之中，血球凝集常常取代較爲複雜的黏結檢驗。然而，Rikitomi等人發現黏膜炎莫拉氏菌的菌株（Id·)與人的口咽上皮細胞之黏結和該菌株造成的血球凝集並無相關性。也就是説有三種高度黏結之菌株並不會使人的紅血球凝集。因此，在人的口咽上皮細胞黏結和血球凝集上牵涉不同的結合機制。相對地，一項由Keliens等人發表之最近的研究提出由黏膜炎莫拉氏菌造成的血球凝集與寄主細胞的枯結相關 (Kellens 等人，1995 年，〈傳染 > (Infection)，第 23 期·· 3 7-41頁）。不過，這項研究採用一種基於細菌結合到豬的氣官切片之枯結檢驗。至於褚的氣管纟且織和人的呼吸道、组織是否能就其與黏膜炎莫拉氏菌致病菌株之粘結而被視爲同源，則並不清楚。雖然該枯結性的檢驗有問題，Kellens等人檢驗了 80多種黏腹：炎莫拉氏菌之臨床分離物的血球凝集活性（Kaliens 等人，1995 年，〈傳染 > (Infection)，第 25 期：37-41 頁）。幾乎有四分之三受檢的菌株會使人、兔、天竺鼠、狗或老鼠的紅血球凝集，但是其餘的菌株卻不能。他們對某些能使血球凝集的菌株之凝集活性做進一步的特性鑑定，顯示此活性是鈣離子需求性的，且會被胰蛋白酶消化或高溫 -8- 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝· 訂 541314 A7 B7 經濟部中央標準局Η〈工消费合作社印製五、發明説明（6 處理或添加右旋一葡萄糖胺或右旋一半乳糖胺所抑制。一項由Tucker等人所做的對於能使血球凝集和不能使血球凝集之黏膜炎莫拉氏菌所進行的調查顯示所有菌株都會與醣脂上的神經節丁醣菩醯基鞘氨醇結合，但只有能使血球皱集的菌株才會與醣脂上的球細胞丁醣甞醯基鞘氨醇結合（Tucker等人，1994年，美國微生物學會年會，第Di24 號摘要）。並且，黏膜炎莫拉氏菌的血球凝集活性顯示會被各種包含球細胞丁醣菩醯基鞘氨醇的醣類分子部分之單醣所抑制。這些發現使Tucker等人提出黏膜炎莫拉氏菌是藉由與敏感的紅血球細胞膜中之球細胞丁醣甞醯基鞘氨醇（包括那些人的紅血球細胞膜中的），而使血球凝集。到目前沒有先前的技藝曾鑑識到黏膜炎莫拉氏菌外表負責與寄主細胞黏結或血球凝集的分子。這項應用之此部份或任何其他部份中任何參考文獻的引用或認證不應被解釋爲其意指此類參考文獻對本發明是可得的先前技藝。 3·發明的摘鋒：本發明涵蓋了黏膜炎莫拉氏菌的〇Mp 1〇6多肽和〇Mp · 106何生多肽和製造該多肽的方法。本發明亦涵蓋抗血清和抗體，包括特定於OMP1〇6多肽及/或〇Μρι〇6衍生多肽之具細胞毒性的抗體。本發明尚涵蓋引發免疫反應的，預防或治療的組合物，包括疫苗，其包含-種以上的該多肽。此二卜’纟發明尚涵蓋編碼該多肽之核苷酸序列。本發明更涵盍了引發免疫反應的，預防或治療的組合物。包括疫 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝· 訂 -9- 541314 A7 ---—----- B7 五、發明説明（7 ) 田，其含有一種減弱或去活性之不具血球凝集作用的黏膜炎莫拉氏菌培養株。本發明有許多用途。例如，〇Mpl〇6多肽和〇Μρι〇6衍生多肽可用作偵測因黏膜炎莫拉氏菌感染所引發之抗體的配體（例如用在診斷黏膜炎莫拉氏菌感染）。〇Mp 1〇6多肽和OMP106衍生之多肽亦可用作爲引發特定於黏膜炎莫拉氏菌之抗體的免疫原）。而這種抗體在偵測生物標本中的黏膜炎莫拉氏菌之免疫檢驗上有用。而本發明之具細胞毒性之抗體則有用於對黏膜炎莫拉氏菌感染進行被動免疫。 OMP 106多肽和OMP 106衍生之多肽更可用做爲抗黏膜炎莫拉氏菌感染之疫苗中的活性成份。本發明乃基於一項驚奇的發現：能使血球凝集的黏膜炎莫拉氏菌的菌株及培養株含有一種外膜蛋白〇Mp丨〇6多肽 ’其分子量約爲180 kD至約2 3 0 kD，而不具血球凝集作用的黏膜炎莫拉氏菌的菌株及培養株則不具OMP 1 〇6多肽或是其有在血球凝集上不具活性且無法用銀染的未正確修飾過之OMP 1 06多肽。本發明尚基於一項發現，即從能使血球凝集的黏膜炎莫拉氏菌分離出之OMP 1 06多肽所引發生成的多源抗血清具有抗不同之能使血球凝集黏膜炎莫拉氏菌菌株的胞毒活性，但此種活性卻不能抵抗不使血球凝集之黏膜炎莫拉氏菌菌株。 3.1定義和縮簡窵字抗-OMP 106 =抗-OMP 106多肽之抗體或抗血清 -10- —本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297^釐） ----2---L---•衣II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製訂 541314 A7 B7 五、發明説明（8 ATCC 膜泡（blebs) Gb4 HA 具免疫活性的 kD 黏膜炎莫拉氏菌 (M. Catarrhalis) NHA 0G. OMP 106 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 OMP 106衍生多肽美國典型培養物收集中心自然生成之黏膜炎莫拉氏菌的外膜泡 GalNAc /? l-3Gal ^ l-4Gal^ 1-4Glcl-l醯基鞘氨醇使血球凝集能驅動細胞或體液的免疫反應千道爾呑 Me ; 黏膜炎莫拉氏菌；黏膜炎莫拉氏（布蘭罕氏）菌；黏膜炎布蘭罕氏菌；黏膜炎雙球菌；或黏膜炎球菌。不能使血球凝集。正-辛基-/? -D-吡喃糖甞黏膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白-1 06 ，其具有大約180 kD至大約230 kD之分子量（以SDS-PAGE);可用 OG或肌氨醯基洗濯劑從膜泡或完整的黏膜炎莫拉氏菌細胞抽取到0 OMP 106多肽的片段；野生型〇mf 106多肽或其片段的變異物，包含 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541314 A7 B7 五、發明説明（9 經濟部中央標準局負工消费合作社印t 一個或更多個胺基酸的削去，插入或取代；或是包含一段與完整的OMP 106多肽或其部份之C-端，N-端或中間片段融合之異源多肽的後合型蛋白。 ==外膜蛋白（單數） =外膜蛋白（複數） =磷酸鹽緩衝之鹽液 =聚丙晞醯胺凝膠二任何長度的肽，較好是具有1 〇個或更多胺基酸殘基的肽 =硫酸十二酯鈉硫酸十二酯鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 P免月曰中走我之核菩酸或核酸序列以單一字母符號代表驗基如下： A (腺嘌呤） C (胞嘧淀） G (鳥糞嘌呤） T (胸喊淀） U (尿喊淀） M (A 或 C) R (A 或 G) W (A 或 T/U)

OMP OMPs PBS PAG 多肽 SDS SDS-OAGE 12- 本紙张尺度相巾關家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) r裝· 訂 541314 Α7 Β7 五、發明説明（1〇 ) S (C 或 G) Y (C 或 T/U) K (G 或 T/U) V(A或C或G ;不是T/U) Η (A或C或T/U ;不是G) D (Α或G或T/U ;不是C) B (C或G或T/U ;不是Α) Ν (Α或C或G或T/U)或是（未知鹼基）本説明書中定義的肽和多肽序列係以單一字母的符號代表胺基酸殘基如下： Α (丙胺酸） R (精胺酸） N (天冬醯胺） D (天冬胺酸） C (半胱胺酸） Q (麩醯胺） E (越胺酸）經濟部中央標準局男工消费合作社印裂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) G (甘胺酸） Η (組織胺酸） I (異丙胺酸） L (白胺酸） Κ (離胺酸） Μ (甲硫胺酸） -13- 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）

、發明説明（n F (苯丙胺酸） P (脯胺酸） S (絲胺酸） T (蘇胺酸） w (色氨酸） Y (路氨酸） V (纈氨酸） X (未知胺基酸殘基）本發明可經由參考以下發明之詳細説明、發明之非限制性的特定具體實例和附圖而得到£完全的瞭解。圖 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

經濟部中央標準局員工消費合作社印製圖的簡短説明： 1 :黏膜炎莫拉氏菌膜泡或整個黏膜炎莫拉氏菌之辛基葡萄糖甞（0G)萃取液之外膜蛋白以變性page比較义輪廓圖。每一行的數字係指ATCC之菌株標示。用一預染之SDS-PAGE標準試樣（Biorad目綠#161-0305)做爲分子量的標記。該標準試樣包含以下多肽，其大約的分子量註記於括弧之中：兔子的肌肉磷酸化酶B(106 kD);牛血清白蛋白（8〇 kD);難蛋白之卵清蛋白（49.5kD);牛碳酸酐酶（32.5kD);黃豆胰蛋白酶抑制（27.5 kD);雞蛋白溶菌酶（18.5 kD) 。凝膠上分子量標記物的位置以箭頭註記在圖的左側，而將某些標記物的分子量（kD)註記在箭頭的 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐）訂、發明説明（12 上方圖2 圖經濟部中央標準局炅工消费含作社印製圖4 I-標記之外膜膜泡包覆醣脂之薄層色層分析圖所得的結果。在A-C的長方格中，第i行含有標示於左（、丨的醣月曰標準物；第2行含有asialo-GMi ;第3 仃含有Gb3 ， Gb4和佛尚斯曼抗體（F〇rssman antigen);第4行含有人類紅血球的弗荷（F〇lch)抽出物。長方格A中的層析圖係以地衣酚染過者，長方格B的層析圖係以ATCC菌株8n6(一種不會使血球凝集的菌株）之-標記的膜泡包覆，長方格c的層析圖則2以ATCC菌株49143(一種使血球凝集的菌株）之標誌的膜泡包覆者。只有會使血球凝集的菌株結合至第3行及第4行的Gb4醣脂寬帶上。 •在以圖中指示的蛋白酶消化黏膜炎莫拉氏菌之後，用銀染外膜蛋白的辛基葡萄糖:y：抽出物所得之蛋白質輪2圖。圖下方標示有HA的直行係指細胞在消化义後呈血球凝集之活性。本圖所使用之分子量標記物如圖1。 τ :從各種黏膜炎莫拉氏菌之ATCC菌株獲得的外膜蛋白經銀染之蛋白質輪廓圖比較。菌株標示於每一行的上方。圖下方標有HA的直行係指具有血球凝集活性的菌株。請注意對具有血球凝集活性的菌株而言以 125 」--卜----^裝丨| (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ —__-15- 本紙张尺k適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2Η)χ297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 __B7 五、發明説明（13 ) ，其普遍具有的表面分子量要比兔子的肌磷酸化酶 B的分子量（106 kD)來得大的蛋白，但是對不具血球凝集活性的囷株而言卻不見此種蛋白。這種多肽以 OMP 106標示。所使用之分子量標記物如圖1。圖5 :得自兩種黏膜炎莫拉氏菌ATCC 49143培養株之外膜蛋白經銀染的蛋白輪廓圖比較，兩種ATCC 49143 培養株分別爲49143(可使血球凝集的培養株）和 4 9 14 3 - Ν Η A (操法使血球凝集的培養株）。圖下方標有 HA的直行係指該培養物具有血球凝集活性。請注意在不具血球凝集活性的培養株中看不到OMP 1 〇6多肽的寬帶（以 <指示者）。本圖所使用的分子量標記物如圖1。圖6 :利用裝載至凝膠前培養在25 X：或1 〇〇 °C樣品緩衝液中之ATCC菌株49 143的OG抽出物，於6 %變性之聚丙晞酸胺凝膠中進行分子量的估量。凝膠中的蛋白質係以還原性銀染來辨識。請注意OMp 1 〇6多肽的寬帶只在1 00 °C培的樣品中可見（以〈指示者）。以一種範圍寬廣之SDS-PAGE標準試樣（Biorad目綠 #16 1-03 17)作爲分子量的標記物。該標準試樣包含以下多肽（其大約的分子量註記在括弧中^兔子骨悠肌的肌凝蛋白（200 kD);大腸桿菌的半乳糖芬酶 (116 kD);兔子的肌磷酸化酶β(97·4 kD);牛的血 ϋϋ* ·ϋϋ —Γ— —ι_ϋ ml m ϋ -ϋ-i·— n (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、^τ -16-

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清白蛋白（66·2 kD)。凝膠中分子量標記物的位置以箭頭註記在圖的右側，而將該標記物之分子量（kD) 註記在箭頭上方。 % 圖7 :方以Me 5-72爲探針對黏膜炎莫拉氏菌的染色體DHa 以Dra I和Hind III核酸内切限制酶處理的消化進行南方墨點分析（Southern blot analysis)。將黏膜炎莫拉氏菌株49143的DNA以Dra I或Himd III消化。用Me 5-72做爲探針（序列辨識號碼：4)對消化過的 DNA進行南方墨點分析，鬲度嚴苛的沖洗則是以2 X SSC，i % SDS在5(rc沖洗大約2〇分鐘至大約 3〇分鐘。第1行係包含Hind III之消化物；其雜交之寬帶具有大約8.0KB大小的DNA。第2行包含Dra I之消化物，其雜交之寬帶含有大約4 2kB大小的 DNA 〇圖8A和8B :用兔子之OMP106抗血清對黏膜炎莫拉氏菌及其相關菌種之蛋白質抽出物進行西方墨點經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I m V」: !秦·_ — - i =il In I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 分析（Western Blots)(見圖8A)，將之與兔子以OMP 106免疫前的血清活性比對（見圖8B) 。圖8 A和圖8B中各行所含之樣品如下：第 A行，黏膜炎莫拉氏菌；第B行，卵莫拉氏菌（Moraxella ovis);第C行，腔隙莫拉氏菌 (Moraxella lacunata);第 d 行，莫拉氏菌 -17- 541314 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（15 ) (Moraxella osloensis);第 E 行，牛莫拉氏菌 (Moraxella bovis);第F行，腦膜炎雙球菌 (Neisseria meningitides);第 G 行，淋病雙球菌（Neisseria gonorrhoeae)。本圖所使用的分子量標記物與圖1相同。圖9A :西方墨點法證明由黏膜炎莫拉氏菌ATCC49143之 OMP 1 06多肤所得之兔子的抗血清能與數種黏膜炎莫拉氏菌之HA和NHA菌株中具有相似分子量的多肽交叉反應（ΟMP 1 06多肽的位置以箭頭標出）。以西方墨點法檢驗了各種黏膜炎莫拉氏菌株的辛基葡萄糖替抽取物。各菌株之ATCC使用號碼標示在母一行上端。轉移方式與西方墨點的程序和用於獲取圖8之墨點圖者方法完全相同。圖9B :以相應於圖9A所使用之預先免疫的血清對與圖9A 相同的抽取物進行西方墨點分析。 5·發明之詳細説明： 5.1· 使血生屋集和不能使血玻凝隹的培養物本發明提供了一種經分離或大體純粹之黏膜炎莫拉氏菌的〇MP106多肽。OMP106多肽包括埋在或位於黏膜炎莫拉氏菌之能使血球凝集（HA)之菌株和許多不能使血球凝集 (NHA)之菌株和培養株外膜之外表面上整個蛋白質或其次 IL--^----^-裝------訂------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -18 - 541314 五、發明説明（Μ ) 早兀2 OMP 106直接或間接地對HA菌株或培養株之能使血球凝集的表現型有貢獻。根據本發明，在任何標準的血球凝集檢驗之中，如Soto_Hernandez等人在1989年，〈臨床微生物學雜誌 > (Clin. Micr〇bi〇1)，第 27 期：9〇3_9〇; 頁所敎π的方法即是，HA黏膜炎莫拉氏菌會使人或兔子的紅血球凝集。雖然我們無意要將此限制在任何特定的作用機制上，但是目前想像此機制爲黏膜炎莫拉氏菌結合至寄王細胞表面上的醣脂和醣蛋白的紅血球丁碳醣⑴、）分子邵分上，而使紅血球凝集，並且該血球凝集活性部分由適當修飾過的OMP 106多肽居間促成，而此多肽具有易被銀染之特殊性質。相對地，未經修飾或修飾得不正確之〇Mp 1 06多肽既不具居間促成血球凝集的活性又不被銀染。而且，OMP 106多肽是可從HP *NHA黏膜炎莫拉氏菌膜泡或冗整的細胞上，以〇G-或肌氨醯基抽取的蛋白質在 SDS-PAGE之中，唯一具有顯見分子量在大約18〇 kD到大約23 0 kD的多肽。 HA黏膜炎莫拉氏菌細朐胞的血球凝集活性會被紅血球丁碳醣（GalNAc々l-3Galal-4Galy51-4GlCy31 ; Gb4)和包含經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Gh的單醣所抑制，這些單醣包括：N_乙醯基_右旋_半乳糖胺，右旋-半乳糖和葡萄糖及其衍生物，如甲基—α _半乳糖或甲基->5半乳糖。η Α黏膜炎莫拉氏菌的血球凝集活性也會受較咼濃度之數種其他的糖所抑制，其包括但不限於右旋-甘露糖，左旋-岩薄糖，右旋_葡萄糖，和N_乙醯基_ 右旋-葡萄糖胺。 19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 541314 經濟部中央標準局員Μ消费合作社印t A7 B7 五、發明説明（17 ) 血球凝集活性和完整之HA黏膜炎莫拉氏菌細胞的omp 1 06多肽皆會由於完整的黏膜炎莫拉氏菌細胞被各種蛋白酶消化而降低破壞，這些蛋白酶包括但不限於TLCK(N “ 對-甲基苯續醯基-左旋·離胺酸氯甲基g同[亦以氯_ 3 ·甲基苯續醒基胺基-7·胺基-左旋-2-庚嗣見知])-處理過的胃蛋白酶，蛋白酶K和TPCK(N-甲基苯磺醯基-左旋-苯丙胺酸氟甲基酮）處理過的胰蛋白酶。然而，用蛋白酶V 8消化完整的HA黏膜炎莫拉氏菌細胞既不影響血球凝集活性也不影響此種細胞之MOP 1 06多肽的物理完整性。不具血球凝集活性（NHA)的培養物可經一系列靜止液態培養（亦即保持在3 5 °C培養而不搖盪）。從Η A黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株獲得。例如，將ΗA黏膜炎莫拉氏菌的囷株或培養株養在穆勒-辛頓肉汁（Mueller Hinton broth) 中’母五天則將接種物從靜止培養液的表面取出，接種到緊接的靜態培養液中。持通過一系列靜態培養，直到產生一種NHA培養株。本發明的NHA培養株可用於生產保護性的疫苗，如抗黏膜炎莫拉氏菌感染的完整細胞疫苗。相對的’ HA黏膜炎莫拉氏菌菌株或培養株之具血球凝集活性的表現型，可藉由使菌株或培養株通過搖盪的液體培養而保持下來。在一項具體實例中，在35 °C至37 °C將 HA黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株養在穆勒一辛頓肉汁中，以大約200RPM的轉速搖盪，並在每24至48小時轉移接種。ΗA黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株亦可在固態培養基上轉移接種而保留下來。例如：將一 HA黏膜炎莫拉 -20- ^紙张尺度適國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇x297公釐1 ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) >裝·

、1T 541314 A7

經濟部中央標準局員工消費合作社印製氏菌的菌株或培養株養在含有血液瓊脂或穆勒-辛頓瓊脂的培養皿上。 5.2. OMP 106 多肽

本發明的OMP 106多肽是HA黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株中唯一在SDS.-PAGE上有大約180 kD至大約230 kD 之表面分子量’較好是在大約i 9〇 kD的外膜蛋白。根據本發明，黏膜炎莫拉氏菌之外膜蛋白是一種出現在黏膜炎莫拉氏菌的膜泡中，或可用正·辛基-0 -右旋吡喃葡萄糖嘗 (〇 G)或逃氣酿基洗濯劑在室溫下缓衝溶液之中，自黏膜炎莫拉氏菌的芫整細胞上抽取下來。請參考Murphy和Loeb 在 1989 年 <微生物病現> (Microbial Pathogenesis)第 6 期： 1 59-1 74頁有關黏膜炎莫拉氏菌之膜泡的討論，該膜泡係由黏膜炎莫拉氏菌之外膜組成之天然生成的膜泡。NHA黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株或不具OMP 106多肽，或者具有，此與抗Ο Μ P 1 0 6抗體結合（見第5 · 5節）但不與銀染劑 ’（亦即使用銀染劑Silver Stain Plus [Biorad出品，加州 Richmond 市]，或用 Gottlieb 和 Chauko，1987 年，〈分析生物化學> (Anal. Biochem·)第165期：33頁所説明的方法 )反應。相對的，得自HA黏膜炎莫拉氏菌之菌株或培養株的OMP 106多肽會與抗-OMP 106的抗體結合，並且與銀染劑反應。 OMP 106多肽可藉其被蛋白酶處理分解而在HA黏膜炎莫拉氏菌的膜泡或完整細胞中被鑑認出來，而蛋白處理也 -21 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 r 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（19 ) 會阻滯或減弱相同HA菌株的血球凝集活性（請參考上面的 5.1.節有關會破壞或不會破壞完整的黏膜炎莫拉氏菌細胞之蛋白酶的實例）。換句話説，使用令破壞或降低HA菌株或培養株之血球凝集活性的蛋白酶進行消化，也會改OMP 106多肽在SDS-PAGE中的含量或位置，這是以從菌株或培養株分離出的OMP 1 06多肽在此種消化分解後和從相同菌株或培養株分離之OMP 1 06多肽在消化分解前相互比對發現的。 OMP 1 06多肽亦可以黏膜炎莫拉氏菌之膜泡或其完整細胞之OG或肌氨醯基抽取物中的多肽被認出，此多肽以變性之凝膠電泳在含SDS之12 % PAG中，利用Harlow和 Lane的配製方法（<抗體：實驗室手册〉(Antibodies ： A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版，紐約，附錄I， 198 8年）測得其具有大於106 kD之表面分子量。在100 °C 加熱處理OG或肌氨醯基抽取物會造成OMP 106多肽在6 % PAG而不含任何還原劑的SDS-PAGE中測得大約180 kD 至大約230 kD的表面分子量，PAGE的方法利用上述 Harlow和Lane説明的配製方法。在一項特定的具體實例中，在加熱處理之黏膜炎莫拉氏菌菌株ATCC 49143的OG或肌氨醯基抽取物中，OMP 106具有大約190 kD的表面分子量。在特定的具體實例中，OMP 1 06多肽是從包括但非限於 ATCC 49143，ATCC 25238，ATCC 25240，ATCC 43617 ，ATCC 4361 8 ， ATCC 43627 和 ATCC 43628 之任何黏膜 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541314 A7 B7 經濟部中央標準局只工消#'A作社印製五、發明説明（20 ) 炎莫拉氏菌株製備而得的。較佳之OMP 106多肽來源是此類菌株的Η A培養株，而更佳的來源是AT C C 4 9 14 3之Η A培養株。在一項特定的具體實例中，OMP 106多肽包含了胺基酸序列 IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKI V(序列辨號碼：1)或與其大體同源的序列，而較好是在其胺基端。此外，OMP 106多肽還可包含一段在羧基端與上面提到之序列相隔的含八個胺基酸的肽，其序列爲 GTVLGGKK(序列辨識號碼：2)或一段大體上與其同源的序列。此處用到大體上同源之胺基酸序列至少有80 %，較好是100 %與參考用的胺基酸序到完全相同。根據本發明的許多方面，本發明之多肽係以其在SDS-PAGE中相對於已知分子量的標記物之移動爲基礎所得之表面分子量做爲其特徵。雖然任何在本技藝中已知的分子量標準物均可與SDS-PAGE併用，但是較佳的分子量標記物至少包括兔子的骨赂肌之肌凝蛋白，大腸桿菌的卢半乳糖嘗酶和兔子的肌磷酸化酶B。熟習此藝者今暸解到本發明的多肽可能在不同型式的凝膠系統（例如：不同的缓衝液 ;不同濃度的凝膠、交叉連接劑或SDS)之中有不同的移動結果。熟習此藝者也會暸解該多肽可能由於和SDS_P AGE 併用之不同的分子量標記物而得到不同的表面分子量。因此，本發明之多肽的分子量特徵刻意地涵蓋相同的多肽在任何SDS-PAGE系統中與任何分子量標記物併用的結果，因爲所使用的SDS-PAGE系統和分子量標記物可能爲該多 -23- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 541314 Α7 Β7 五、發明説明（21) 肽指出與本説明書所揭示略爲不同的表面分子量。 5.3. OMP106衍生多肽本發明之OMP 106衍生多肽或爲0MP丨％多肤的片段。完整的OMP 1 06多肽可能含有一個或更多對其免疫原性質並非必需的胺基酸殘基。舉例而言，可能只有形成OMp工％多肽之某一抗原決定部位的胺基酸基對其產生免疫的活性是必要的。不必要的胺基酸可以用本技藝中詳知的技術移 t去。例如，用酵素如胰蛋白酶、木瓜酵素或相關的蛋白質分解酶進行有限的蛋白分解消化，或用化學藥劑如溴化氰進行化學切斷反應，將不要的胺基酸序列除去，接著分級分離消化物或切斷反應的產物。本發明之OMP106衍生多肽亦可能是經修飾的〇Mp 1〇6 多肽或其片段（亦即取代、插入、及/或刪除野生型〇Μρ 1〇6 序列上一個或更多胺基酸所得的OMP 1〇6多肽或其片段）。此種修飾可能促進所得多肽產物之免疫原性質或對此活 f生”、、任何衫響。可能用到的修飾技巧包括美國專利案第 4’526,716所揭示者。 OMP 1〇6多肽還可以是一種嵌合型多肽，其包含一段或更多&與完整的OMP106多肽或其部份或片段之胺基端或羧 f端融合的異系多肽。組成此種嵌合型多肽之有用的異系多肽包括但不限於a)能協助〇Mp 1〇6衍生的序列在寄主細胞中運輸，轉位及/或加工之前_及/或原—序列，…親和性純化用到的序列，e)任何有用的產生免疫性之序列（例如：編 ____ - 24 - 玉紙ϋ適ϋϋ國家標準(CNS 格(^Τ297^ΪΤ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局爲工消费^作社印製 541314 A7 r------- Β7 五、發明説明（22 ) 碼一種微生物病原表面曝露的蛋白上一個或更多抗原決定部位的序列）。較好本發明之OMP 106衍生多肽與0MP 106多肽在免疫上有X叉的活性，因此能在動物身上引發對黏膜炎莫拉氏菌的免疫反應。更好的是，本發明之OMP丨06衍生多肽包含造成黏膜炎莫拉氏菌天然0MP丨〇6多肽上一個或更多外表抗原決足邵位的序列（亦即如同存在於完整之黏膜炎莫拉氏菌細胞中之〇M)P 106多肽上曝露在表面的抗原決定部位）。此種較佳之OMP106衍生多肽可由其專一地結合至以完整黏膜炎莫拉氏菌細胞產生之抗體（由甲醛或戊二醛固走之黏膜炎莫拉氏菌細胞所引發之抗體；本説明書中將此種抗體稱爲Γ抗完整細胞」之抗體）而被認出。例如，將 OMP 1 06多肽或對其進行有限或完全之蛋白酶消化所得之肽用“準法分級分離，並測試其與抗完整細胞之抗體結合的能力。具反應性的多肽即包含了較佳之〇Mp丨〇6衍生多肽。將它們分離出來，再用本技藝中既知的方法決定其胺基酸序列。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 亦佳的是，本發明之OMP106衍生多肽包含造成天然 OMP 106多肽上一個或更多抗原決定部位的序列，而該序列能居中調停HA黏膜炎莫拉氏菌細胞造成的血球凝集。此種較佳的OMP衍生之多肽可以其干擾HA黏膜炎莫拉氏菌所造成血球凝集之能力而被認出。例用，用標準方法將 OMP 106多肽以有限或徹底的蛋白酶消化或化學切斷反應所得的多肽分級分離，並測試其干擾黏膜炎莫拉氏菌之血 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210x297公釐） ------- 541314 A7 一 — B7 五、發明説明（23 ) 球凝集活性的能力。一旦認出並分離出此種較佳之OMP 1 06 本丁生多肽’則利用標準的序列分析法決定其胺基酸序列。已測定之序列可用於促進此種多肽以化學合成法及/或遺傳工程的方式進行生產。這些較佳的OMP 1 06衍生多肽亦可用抗完整細胞之抗體篩選能表現黏膜炎莫拉氏菌之基因DHA上任意片段或轉殖之編碼OMP 1 06多肽的核：y：酸序列之細菌圖書館，而被龜識出來。請參考例如Sambro ok等人之〈分子轉殖，實驗 ▲手册> (Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港出版，紐約，第1册，第12章。將具有反應性的純系鑑識出來，再分離出其插入片段，以序列分析法決定此較佳之OMP 1 06衍生多肽的胺基酸序列。經濟部中央標準局負工消费合作杜印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5·4·全^與純化OMP 106多肽和MOP 106衍生的多肽本發明提供經分離之OMP 106多肽和OMP 106衍生多肽。此處所使用之「經分離的」一詞意指該產物顯著地不含其他原本在自然狀況下附帶的生物物質。舉例而言，也就是説，經分離之OMP 106多肽組成有介於大約70 %和94 %重量百分比的純OMP 1 06多肽。較好的是，本發明之omp 106多肽和OMP 1 06衍生之多肽是經純化的。此處所使用之「經純化的」一詞意指該產物大體上，不含其他原本在自然狀況下附帶的生物物質。也説是説經純化的OMp 1 〇6多肽組成有至少95 %重量百分比之純的OMP 1 06多肽，較好是至少有98 %，而最好是至少有99 %重量百分比之純omp -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐）經满部中央標準局男工消费合作社印製 541314 A7 一一·——, B7 五、發明説明（24 ) 10 6多肤。

本發明的OMP 1〇6多肽可從蛋白質抽出物中分離，包括任何黏膜炎莫拉氏菌菌株或培養株之完整細胞的抽出物。較好該蛋白質抽出物是黏膜炎莫拉氏菌之外膜小泡（亦即膜泡）或其完整細胞的辛基葡萄糖苷或肌氨醯基抽取物，而孩菌包括但不限於任何以下菌株：ATCC 49143 ，ATCC 25238，ATCC 25240 , ATCC 43617，ATCC 43618， ATCC 43 627和ATCC 43 628。此種抽取物的較佳來源是此類菌株的HA培養株。更佳的來源是ATCC 49143的HA培養株。另一 OMP 106多肽的來源是得自能表現編碼omp ι〇6 多肽或OMP 1 06衍生多肽之經轉殖序列的基因表現系統之蛋白質製備物（請參考第5、8、節）。 OMP 1 06多肽可利用任何生化技術和熟習本技藝者詳知的方法從來源物質中分離和純化。在一種方式當中，先用標準技術取得黏膜炎莫拉氏菌的外膜，用溶離之化合物如洗濯劑將其外膜蛋白質溶離出來。較佳之溶離用的溶液是含有大約1.25 % (重量/體積）之辛基葡萄糖答。另一種較佳之落離用溶液是1.25 %施氨醯基溶浚〇 OMP106多肽存在於落離出的部份。較好用離心的方式分離和除去抽取物中的細胞碎片和不溶物。濃縮抽取物中的多肽，在1 〇〇 t下培養在含有SDS的拉密賴氏（Laemmli)凝膠樣品緩衝液中歷5分鐘’然後用電泳法在不含還原劑的6 0/。變性之sds-PAGE中將多肽予以分級分離。請參考Laemmii，ι97〇年，〈自然〉，第227期：680-685頁。用以上説明的方法鑑 -27- 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I I I II 訂 I I0U (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541314 A7 B7 五、發明説明（25 ) 認之含OMP 106多肽的寬帶和分級分離物（例如，用銀染找到出現在HA但不出現在對應之NHA培養株，或ha培養株以阻滞血球凝集活性之蛋白酶消化後的〇G或肌胺醯基抽取物中之寬帶）。可直接從含有〇Mp 1〇6多肽的分級分離物或凝膠切片中分離出來。在一項較佳的具體實例中， OMP106多肽具有190kD之表面分子量，這是從它在變性之SDS-PAGE中相對於兔子骨骼肌的肌凝蛋白（2〇〇 kD)和大腸桿菌的/?-半乳糖智:酶（1 1 6 kD)的移動距離或速率之比對結果測得的。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 另一個純化OMP 106多肽的方法是利用抗_〇Mp 1〇6抗體進行親和性層析（見第5·5節）。較好是使用單源的抗_〇Mp 106抗體。將該抗體共價地連接到以溴化氰活化的瓊脂糖或琥轴酸亞胺@旨（八『^-〇01，由則〇11&(1公司出品），或以其他热習本技藝者知道的方式進行共價連接。將蛋白質抽出物裝載到以上説明的凝膠上頭。讓反應物接觸一段在標準的反應條件下足使OMP 1 06多肽連結至抗體的時間。較好該固態支持物是用於層析管柱的材質。然後將〇Mp丨〇6多肽從抗體上移除下來，而使OMP 1 〇6多肽以分離的或較好是純化的形式回收。本發明的OMP衍生多肽可用化學及/或酵素切割或分解分離出來或純化過的OMP 1 06多肽而產生。亦可利用本技藝中詳知的方法，以既知的OMP 1 06多肽之胺基酸序列爲基礎’而在嵌合型多肽的情形下，以既知的異種多肽之胺基酸序列爲基礎，對OMP106衍生多肽進行化學合成。可 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 541314 五、發明説明（26 ) 參考例如·· Creighton，1 存 S n 1983年，〈蛋白質：結構與分子原理〉，W.H. Freeman公司（紐約）出版。 OMP106何生多肽亦可在一個基因表現系統中生產，該系統能表現包含編碼OMP_106衍生多肤序列的重組核答酸達構體。編碼本發明之多肽的核替酸序列可以是合成的及/ 或轉殖的，而根據熟習本技藝者詳知的技術把它們表現出來。例如，請參考Sambrook等人於1989年<分子轉殖，實驗室手册> (MolecuIar CIonrig，A Lab〇m〇ry ―)，第 1 _3册，冷泉港實驗室出版，紐约，第9章。本發明（0MP106衍生多肤可以利用標準蛋白質純化技術予以分級分離和純化，並依照本説明書中説明的發現和技術予以修飾和應用。尤其，根據本發明之較佳的〇Mp _ 106多肽，亦即那些形成天然〇Mp 1〇6多肽之外表抗原決定部位的衍生多肽，可以根據以上所揭示用於分離和純化 0MP 106多肽的親和性方法（例如，用抗〇Μρ_ι〇6抗體進行親和性純化）加以分離和純化。經濟部中央標隼局爲工消f含作社印製若有需要，可利用標準的蛋白質或肽的純化技術進一步純化本發明的多肽，這些純化技術包括但不限於電泳，離心，凝膠過濾法、沉澱法、透析法、層析法（包括離子交換層析法、親和性層析法、免疫吸附親和性層析法，逆相高解析液相層析法，和凝膠滲透高解析液相層析法），等電$ 聚法和其變化和組合的方法。這些技術的一種或更多種可連續用於依分子之物理或化學特性所設計的分離程序之中。而這些分子特性包括疋 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 541314 經濟部中央標準局贤工消费含作社印製 A7 B7 五、發明説明（27 ) 白質的厭水性、電荷，結合能力和分子量。對每一種技術得到的各種分級分離物質與OMP 1 06受體或配體結合的能力，與抗OMP 1 06抗體結的能力，或干擾由黏膜炎莫拉氏菌造成之血球凝集的能力進行測試（「測試」活性）。將顯示此諸活性的分級分離物進行測試。重覆此過程，直到只有一個具上述「測試」活性的分離部份留下來，而該分離部份以聚丙烯醯胺凝膠電泳或層析法處理則產生單一寬帶或實物。 5.5. OMP 106免疫原和抗-OMP 106抗體本發明提供特定與OMP 106多肽或OMP 106衍生多肽結合的抗體。爲了生產此種抗體，所以使用分離的或較好是純化的OMP 106多肽或OMP106衍生多肽製備物作免疫原。在一項具體實例中，用SDS-PAGE將OMP 106多肽與其他出現在HA黏膜炎莫拉氏菌細胞或膜泡的外膜蛋白分離（見以上第5.2節），並且利用包含OMP 106多肽的凝膠切作做爲免疫原注射到兔子身上以產生含有多株OMP 1 06抗體的抗血清。用同樣的免疫原對老鼠進行免疫處理以產生能生產單源抗-OMP 1 06抗體的融合瘤系。在特別的具體實例中，使用含有來自 ATCC 49143 ，ATCC 25238，ATCC 25240，ATCC 43617，ATCC 43627，和 ATCC 43628 中任一菌株之經分離或純化的OMP 106之PAGE切片做爲免疫原。在較佳的具體實例中，所使用的PAG切片含有得自此類菌株之HA培養株的分離或純化之OMP 1 06。在一項 -30- ~本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I. —L--i----良------丁------l· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消费含作社印製 541314 A7 B7 五、發明説明（28 ) 更佳的具體實例中，用以做爲免疫原的PAG切片含有得自菌株ATCC 49143之HA培養株之經分離或純化的OMP 10 6 ° 在一項具體實例中，使用OMP 106多肽之肽片段做爲免疫原。較好是使用純化之OMP 1 06多肽的肽片段。該肽可由蛋白酶消化或化學切斷經分離或純化的OMP 1 06多肽，或是由化學合成製得，然後予以分離或純化。此種經分離或純化的肽可直接做爲免疫原。在特別的具體實例中，有用的肽片段包括但不限於具有IGISEADGGKGGANARGDK SIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(序列辨識號碼：1)之序列或具有6個以上胺基酸長度之該序列任何部份的肽片段。在另一項具體實例中，該肽片段具有GTVLGGKK之序列（序列辨識號碼：2)。有用的免疫原亦可包括結合至載體分子之此類肽或肽片段，較好是結合至載體蛋白質上者。載體蛋白質可以是任何在免疫學上常用者，其包括但不限於，牛血清白蛋白 (BSA)，難的白蛋白，鎖孔虫戚的血藍質（KLH)及類似者。關於半抗原蛋白結合物的討論，請參考例如：Hartlow等人，〈抗體，實驗室手册 >，冷泉港實驗室出版，紐約冷泉港，1988年，或標準的免疫學敎本如Roitt，I.等人的< 免疫學〉，C.V. Mosby公司出版，密蘇里州聖路易市（1985 年）或 Klein，J_ 的〈免疫學〉，Blackwell Scientific Publications公司出版，麻州劍橋市（1 990年）。尚有另一個具體實例，目的在於製造能特定與一個或更 -31 - 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 541314 A7 B7 五、發明説明（29 ) 多天然OMP 1 06多肽之外表抗原決定部份結合的抗體，其中利用完整的HA黏膜炎莫拉氏細胞或由該細胞製備的膜泡做爲免疫原。在免疫作用之前，可用如甲醛或戊二醛將該細胞或膜泡固定。請參考Harlow和Lane的〈抗體，實驗室手册，冷泉港實驗室出版，紐約冷泉港，1 988年，第1 5 章。較好此種抗全細胞的抗體是單株抗體。用純化的OMP 1 06多肽做篩選之配體可鑑識出生產所想要之單株抗體的融合瘤系。任何黏膜炎莫拉氏菌的菌株包括但不限於ATCC 49143，ATCC 25238，ATCC 25240，ATCC 43617， ATCC 4361 8，ATCC43627，和 ATCC 43 628 之細胞或膜泡被用作爲引發這些抗體產生的免疫原。較好是使用此諸菌株之HA培養株的細胞或膜泡做爲免疫原。更好是使用菌株ATCC 49143之HA培養株的細胞或膜泡做爲引發這些抗體產生的免疫原。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由全細胞或膜泡之免疫處理所產生的多株抗體包括會與其他黏膜炎莫拉氏菌外膜蛋白（「非抗-OMP 106之抗體」）結合的抗體，因此在已知或懷疑樣品含有其他黏膜炎莫拉氏菌外膜蛋白或是與這些其他外膜蛋白交叉反應的物質之情況下，較不便於使用此種抗體。在這樣的情況下，任何樣品或寬帶與抗-全細胞之抗體結合者務必要藉同種樣品或寬帶與專一結合至OMP 106多肽的抗體（例如，抗 OMP-106)及/或專一結合至OMP106衍生多肽的抗體同時發生結合作用來證實，或者用抗-OMP 106抗體，OMP 106 多肽或OMP 1 06衍生多肽做爲競爭物以競爭性試驗來證明 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 541314 A7 B7 五、發明説明（30 ) (亦即將抗-OMP 106之抗體，〇Mp 1〇6多肽或〇Μρι〇6衍生多肽到反應混合物中，而使樣品與抗_全細胞抗體的結合降低或受阻滯）。或者，可用標準的方法將含有「非抗 OMP-1 06」之抗m的多源抗血清中的該種抗體清除掉。例如’以NHA黏膜炎莫拉氏菌培養株或已知不具οΜρ ι〇6 夕肽的黏膜炎莫拉氏菌菌株（例如：ATCC 8176 ，較好是 ATCC 49143的NHA培養株）與非抗〇Mp 1〇6之抗體進行沉嬴作用而將之除去；或者藉著使非抗〇Mp ! 〇6之抗體吸附至包含此種細胞或其外膜蛋白的管柱上而將之除去。在進-步的具體實例中，能引發本發明之抗體的有用的免疫原包含以上提過之個別免疫原中任何二種或更多種的混合物。、用本説明書中説明的免疫原對哺乳動物進行免疫處理，較好是對人、i、家鼠、鼬鼠、綿羊、山羊、牛或馬施行者、可用以下熟習此藝者詳知的方法來進行”乂求獲得含有多株抗體的抗血清或能分泌單株抗體的融合瘤系。經濟部 t k. 標準局員工消費合作社至於單株抗體可用標準技術㈣備，其敎示包含於本説明書中。舉例而s ’此種技術揭示於美國專利案第（me 和4，196,265號之中。簡言之，將動物以免疫原施行免疫。而將：兄疫（動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合而製得融合 :去對融合產物進行筛楝以得到能產生與免疫原結合之抗 ::。將具有正反應之融合瘤之純系分離出來，而從這政純系回收單株抗體。生產多株和單株抗體之免疫方法己詳知於本技藝之中。製 33- 經濟部中央標準局負工消费>作社印製 541314 A7 B7 五、發明説明（31 ) 該免疫原可用許多途徑之任一者進行注射，包括：皮下、靜脈内、腹膜内、皮内、肌内、粘膜的注射方式，或這些方式的組合。該免疫原可利用本技藝中詳知方法或材料以可溶形式、集結形式、連接至一種物理載體、或與一種佐劑混合的形式注射。抗血清和抗體可用熟習此藝者已詳知的管柱層析法予以純化。根據本發明，黏膜炎莫拉氏菌株HA或NHA的OMP 106 多肽之具有免疫交叉反應性的。因此，以一種黏膜炎莫拉氏菌菌株或培養株之OMP 106引生之抗體會特定地與其他黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株之OMP 106多肽和 OMP106衍生多肽結合。例如，由菌株ATCC 49143之OMP 106多肽引生之多株抗-OMP 106抗體會特定地與不單是同源的OMP 106多肽（亦即菌株ATCC 49143的OMP 106多肽 )結合，也會與其他黏膜炎莫拉氏菌株的OMP 106多肽及/ 或OMP-106衍生多肽結合，而言些菌株包括卻不限於ATCC 43628 ， ATCC 43627 ， ATCC 43618 ， ATCC43617 ， ATCC 25240 ，和 ATCC 25238。本發明之抗體包括但不限於抗-OMP 106抗體，可用於協助OMP 106多肽和OMP 106衍生多肽的分離與純化。該抗體亦可做爲探針以鑑識具有編碼OMP 106多肽或其片段之插入序列的表現圖書館中的純系。該抗體亦可用於免疫檢驗（例如：ELISA，RIA，西方墨點法）以特定地偵測及/或定量生物標本中的黏膜炎莫拉氏菌。本發明之抗-OMP 106抗體能特定與OMP 106多肽結合，但不與來自相關細菌性病 -34- 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I L--"----Φ-裝------訂------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541314 經濟部中央標準局負工消费合作社印製腔隙莫拉氏菌、奥斯陸莫拉氏菌牛莫拉氏菌、腦膜炎雙球菌、淋病。因此抗-OMP 1〇6抗體可用於診斷黏〇，尤其是那些具有胞毒性的，亦可用莫拉氏菌對動物（包括人類）造成感染用胞毒抗體一詞是指能促進產生與抗作用及/或補體致死的抗體）。可將本抗免疫原方式培養之多株或單株抗體發明説明（32 原如：卵莫拉氏菌 (Moraxella osloensis) 雙球菌的蛋白質結合膜炎莫拉氏菌的感染根據本發明之抗體於防止或減弱黏膜炎之被動免疫上。（此處體結合之細菌之調理發明中有效濃度之以。她於寄王體内以達到此效果。施用之確切的抗體濃度會依每-特定抗體製備物而有所改變，㈣用一般熟習本技藝者已詳知的標準技術予以測定。抗體之施用可採許多技術來達成，這些技藝包括但不限於第5 “"所説明用以遞送疫苗的技術。本根據本發明〈柷體的預防和治療效能可用標準的藥物程序在實驗動物身上測足。從動物研究得到的數據可用於調配用在人體之劑量範圍。 5.6.疫苗本發明亦提供抗黏膜炎莫拉氏菌對動物之感染的治療和預防用疫苗，這些動物包括哺乳類，而更特定^審齒類、靈長類和人類。較佳之疫苗用途是用在人類。該疫苗可用熟習此藝者已知的技術製備，並且包含例如呈免疫原形式的抗原、藥物上可接受之載體’可能還包含有適當的佐 IL--^----裝------訂------® U (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -35- 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 541314 A7 __B7 五、發明説明（33 ) 助劑和其他傳統上在疫苗之中發現的物質。在疫苗中使用之免疫學上有效量的免疫原係鑒於本説明書的敎示以本技藝中已知的方法測定。根據本發明的疫苗包含免疫學上有效量之第5 · 5 ·節所揭不的任何免疫原，在一種藥物上可接受的載體之中。根據另一個具體實例，本發明的疫苗包含了免疫學上有效量之本發明之去活化或減毒的HA黏膜炎莫拉氏菌培養株或NHA莫拉氏菌培養株。去活化或減毒之Ha黏膜炎莫拉氏菌培養株或NHA黏膜炎莫拉氏菌培養株乃利用任何本技藝中已知的方法獲得，這些方法包括但不限於化學處理法（例如：福嗎啉），熱處理法和輻射法。二本説明書使用之「免疫學上有效量」一詞意指足以引發月匕防止黏膜炎莫拉氏菌感染或減弱任何預存或緊接之黏膜炎莫拉氏菌感染之免疫反應的量。確切的濃度要視將被施用之特定免疫原而定，但是可藉習於此藝者詳知的標準技術檢驗免疫反應的發展情形來測定。有用的多肽免疫原包括經分離的OMP 1〇6多肽和 OMP106衍生多肽。較佳之免疫原包括純化的〇Μρ 多，和OMP 106之衍生多肽或肽。組合的免疫原和載體可以是水溶液，乳化物或懸浮液。一般而言，多肽免疫原的量介於每劑0.1和500微克之間。而载體是習於此藝者已知的，它包括了穩定劑、稀釋劑和緩衝溶液。適當=穩定劑包括醣類，如，山梨糖醇、乳糖、甘露糖醇、澱粉、蔗糖、糊精和葡萄糖，以及蛋白質，如，白蛋白或路蛋白。適當 IL ^ 裝訂------U (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -36- 541314 經濟部中央標隼局爲工消费含作社印製 A7 L、發明説明（34 的稀釋劑包括鹽液、漢克斯氏平衡鹽液（Ha* Baia_d Salts)和林哲氏溶液（Ringers s〇luU〇n)。適當的缓衝液包括驗金屬鱗酸鹽、驗金屬碳酸鹽、或驗土金屬的碳酸鹽緩衝夜。孩疫苗亦可包含一種或更多纟助劑以增強或促進免疫反應。適當的佐助劑包括但不限於肽；氫氧化鋁；磷酸鋁、；氧化鋁；一種包含礦物油如Marc〇152，或植物油和一種以上（乳化劑，或界面活性劑如溶血卵磷脂、聚陽離子、聚陰離子的組合物；以及相當有用的人體佐助劑如bcg和小棒桿菌(g^iiebacterium卿vum)的組合物。該疫苗亦可包含其他免疫原。比如難尾酒疫苗具有單一次施用即可獲侍對抗數種病原之免疫性的好處。其他免疫原的實例係用於已知DPT疫苗之免疫原。本發明的疫苗係以熟習此藝者既知的技巧製備的，其敎不包含於本説明書中。一般而言是將一種免疫原與載體混合形成溶液，懸浮液或乳化物。以上所討論之添加物中的一種或多種可能包含在載體之中，或緊接著添入。該疫苗製備物可能經過乾燥，例如··藉由冷凍乾燥以便保存。若是經過乾燥，則緊接著可藉由添加一種適當的液體載劑而重組成爲液體疫苗。泫疫苗係施用於人或其他哺乳類動物，包括嚆齒類和靈長類。它們可以一劑或多劑的方式施用。該疫苗可用已知的施用途徑施用。許多方法可被用於引進此處説明的疫苗調配物。這些方法包括但不限於，口腔、皮内、肌内、腹膜内、靜脈内、皮下、和鼻内的途徑。較佳的途徑是肌内 37- 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（2l〇X297公釐 I .----#-¾衣II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 541314 五、發明説明（35 ) 或皮下注射。、本發明亦提供一種在哺乳類體内引發對黏膜炎莫拉氏菌之免疫反應的方法，以保護哺乳類抵抗由黏膜炎莫拉氏菌弓I起的感染和或減弱其造成的疾病。該方法包括對寄主施用免疫學上有效量之本發明的免疫原，較好是對寄主施用本發明之疫苗。 5·7·邊碼ΘΜΡ 106多肽和OMP 106衍生多脱之核酸本發明亦#疋供編碼ΟΜΡ 1 06多肽和ΟΜΡ 1 〇ό衍生多肽之核酸DNA和RNA。就一方面來看，本發明的核酸可用本技藝中已知的方法進行合成。特定而言，〇Μρ 1〇6多肽或 ΟΜΡ 1 06衍生多肽的郅份或整個胺基酸序列可用熟習此藝者詳知的技巧加以測定，比如經由埃德曼氏（Edman)分解技術（請參考例如：Greighton，1983年，〈蛋白質：結構和分子原理〉，W.H. Freeman公司出版，紐約，第3心49頁）。所得到的胺基酸序列乃做爲合成編碼〇Mp丨〇6多肽或 ΟΜΡ 1 06衍生多肽之DNA合成的指引，合成Dna可利用經漪部中央標準局負工消费含作社印製傳統的化學方法或用聚合酶鏈反應（PCR)將重疊的寡核替酸放大。在另一方面，該胺基酸可用做合成寡核甞酸混合物的指引，而該混合物可用於篩選黏膜炎莫拉氏菌之基因組圖書館中編碼OMP 106多肽的序列。這樣的基因組圖書館可藉分離自任何黏膜炎莫拉氏菌株細胞的DNa製得。較好的是對基因組圖書館和PCR放大作用二者而言，做爲〇Mpl〇6 -38- 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 541314 經濟部中央標準局βς工消費含作社印¾ A7 B7 反、發明説明（36 ) 多肽之編碼序列來源的DNA是從任何黏膜炎莫拉氏菌株的細胞製備的，這些菌株包括但不限於 ATCC 2523S，ATCC 2524〇,ATCC 43617, atcc；；6；8 ’ ATCC 43627 和 ATCC 43628。在基因組圖書館的製備當中產生了 DNA片段，它們之中有某些是編碼部分或整個黏膜炎莫拉氏菌〇Μρι〇6多肽的 DNA片段。該DNA可用各種限制酶在特定的位置上進行切斷反應。或者，可在錳存在下用DNase將該DNA切成片段，或者該DNA可以物理方式剪斷，例如用超音波法。然後用標準技術依片段大小將DNA片段分開，這些技術包括但不限於瓊脂和聚丙烯醯胺凝膠電泳法。管柱層析法和薦糖梯度離心法。然後將DNA片段插入適當的載體，這些載體包括但不限於質體，粘接質體，爛它一唑菌體或丁4唑菌體，以及酵母菌的人造染色體（TAC)(請參考例如，Sambr〇〇k 等人，1989年，〈分子轉殖，實驗室手册〉，第二版，冷泉港貫驗室出版，紐約冷泉港；Gl〇ve]r，D M·(編審，1985 年’ <dna 轉殖；實用方法> (DNA Cloning : A Pratical Approach)， MRL公司出版，英國牛津市，第一册和第二册。該基因組圖書館可利用使核酸雜交至經標記之探針的方式進行師選（Bent on和Davis，1977年，〈科學〉，第196 期· 180 頁·’ Grunstein 和 H〇gness，1975 年，〈美國科學院進展報導>(?1*0(：，^^1.入〇&(1.8(^，1；8八.），第72期：3961 頁）。該基因組圖書館可用本技藝中詳知的最佳方法以對應於 -39- 暴紙张尺度適用中國國家標準（CNS } A4規格（2ΐ〇χ：297公釐} — ) ------IT------l· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541314 A7 B7 五、發明説明（37 ) 任何OMP 1 06多肽之肽片段的胺基酸序列之經標記的簡併寡核甞酸來做篩選。在特別的具體實例中，該用於篩選的探針是一段與具有 IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQ ALGSQSIAIGDNKIV(序列辨識號編：1)之序列或其部份相對應之簡併的寡核甞酸序列。在另一項具體實例中，該用於篩選的探針可能是與具有GTVLGGKK(序列辨識號碼 :2)之序列的肽相對應之間併的寡核甞酸。在還有一項具體實例中，寡核甞酸序列GGNACNGTNCTNGGNGGNAARA AR(序列辨識號碼：3)和 GGNACNGTNTTRGGNGGNAARA AR(序列辨識號碼：7)均對應於OMP106的肽GTVLGGKK (序列辨識號碼：2)，兩者均用做爲探針。還有一項具體實例中，序列 GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATG CGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGC AA(序列辨識號碼：4)或其任何片段，或該序列之任何互補序列或其片段可用做探針。任何使用的探針較好長度是在1 5個核铝酸以上。經濟部中央標隼局贤工消t含作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在具有編碼OMP 106多肽或其片段之插入DNA圖書館中的純系會雜交至一個或更多簡併的寡核钻酸探針上，將此種寡核甞酸探針與基因組圖書館雜交，乃利用本技藝中已知的方法實行。例如：以兩種以上提到之寡核替酸探針進行雜交可在2X SSC，1.0 % SDS中而在50 °C下實行，並用相同的條件進行沖洗。在一項特別的具體實例中，編碼整段OMP 106多肽的ATCC 49143 DNA序列是長度約爲 8,000 b.p.的Hind III限制片段或長度約爲4,200 bp的 -40- 適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 541314 A7 B7 五、發明説明（38 ) DRAI限制片段。從另一方面來看，編碼部份或整個OMP 106多肽或OMP 1 06衍生多肽之核甞酸純系可藉由篩選黏膜炎莫拉氏菌之表現圖書館而獲得。例如，將黏膜炎莫拉氏菌的DNA分離出來，並將隨意之片段製備出來，而且接到一個表現載體上（例如：噬菌體，質體、噬菌體之質體或粘接質體），而使得該載體上的插入序列能藉由戴體送入之寄主細胞予以表現。然後可用各種篩選用的檢驗選出被表現出來的OMP 106多肽或OMP 106衍生多肽。在一項具體實例中，本發明之各種抗OMP 106之抗體（見第5·5·節）可用在本技藝之已知方法中鑑識所想要的純系。請參考，例如：Harlow和 Lane， 1988年，〈抗體··實驗室手册〉，冷泉港實驗室出版，紐約冷泉港，附錄4。使從該圖書館得到的純系與溶菌斑和抗體相接觸以鑑識那些會與抗體結合的純系。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在一項具體實例中，含有編碼OMP· 106多肽或OMP 106 衍生多肽的DNA之純系或溶菌斑可用DYNA BEADS(商品名）根據Olsvick等人，第29屆ICAAC，德州休士頓市， 19 89年之論文予以偵測，該篇論文以參考文獻併入本説明書中，使抗-OMP 106的抗體交叉連接至經甲基苯磺醯化的 DYNA Beads M280上，然後用這些含有抗體的小珠去吸附能表現OMP 106多肽或OMP 106衍生多肽之純系或溶菌斑。能表現OMP 106多肽或OPM 106衍生多肽之純系或溶菌斑係以任何能與該小珠結合者做爲鑑識依據。或者，可將抗-OMP 1 06的抗體非特定地固定在適當的支 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 541314 A7 B7 五、發明説明（39 ) 持物，如矽膠或CeliteTM樹脂上。此物質可接著用在吸附如前段説明之能表現OMP 106多肽或OMP 106衍生多肽的細菌純系。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在另一方面，可利用PCR放大的方式從黏膜炎莫拉氏菌的基因組DNA生產相當純粹之編碼部分或整個OMP 1 06 多肽的DNA 。經簡併或其他處置之對應於已知OMP 106-多肽序列的寡核甞酸引子可以做爲引子。在特別的具體實例中，編碼肽序列 IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQA LGSQSIAIGDNKIV(序列辨識號碼：1)或其任何部份之經簡併或其他處理之寡核棼酸可做爲5’-引子。例如，5’引子可以是核芬酸序列 GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAG CCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACA TTGCGCAA(序列辨識號碼：4)或其任何部份。編碼GTVLG GKK(序列辨識號碼：2)之序列的逆向互補序列經簡併或其他處理者，可做爲3’-引子。例如，經簡併或其他處理還具有簡併核甞酸序列YTTYTTNCCNCCNAGNACNGTNCC (序歹坪識號石馬：6)或 YTTYTTNCCNCCYAANACNGTNCC (序列辨識號碼：8)可做爲與各種上面討論過之5’-引子結合的3’-引子。 PCR可利用例如.Perkin-Elmer Cetus熱循環器和Tag聚聚合酶（Gene. AmpTM)來進行。吾人可選擇合成數種不同的簡併引子用於PCR反應。吾人亦可改變用於引導PCR反應之雜交條件的嚴苛性，以容許簡併的引子和黏膜炎莫拉氏菌DNA中的對應序列之間有較高或較低程度的核甞酸序 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(2l〇X297公釐) 541314 、發明説明（4〇 ) 列之相似性。在成功地放大編碼OMP丨〇6多肽之序列的片 ί又以後’可將該片段以分子轉殖方式處理並予序列分析，並用其做爲探針以分離出一個完整的基因組純系。如此一來便成如本説明書中説明的方式測定的完整核甞酸序列，分析其表現，和生產其蛋白質以供功能分析。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 11‘ ^ -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂、一旦ΟΜΡ 1〇6多肽的編碼序列從黏膜炎莫拉氏菌的菌株 j培養株分離出來，則可利用同樣的方法其他莫拉氏菌的菌株或培養株將OMP1〇6多肽的編碼序列分離出來。習於此藝者會知道編碼0MP 106多肽（或其片段）的DNA或rna 序列可用以獲得其他DNA或rna序列，而這些dna或rna 序列能在中度到高度苛性的條件下用本技藝中已知的一般技巧與本發明的序列雜交。在高度嚴格條件下與得自一種黏膜炎莫拉氏菌的〇MP 106序列雜交將能辨識其對應之得自其他菌株和培養株的序列。高度嚴格條件會因探針的長度和鹼基成份而有所改變，用以測定此種條件的配方已詳知於本技藝。凊參考Sombro ok等人，1989年，〈分子轉殖，實驗室手册 >，冷泉港實驗室出版，紐約冷泉港，第i i 章。此處所用之施用在大於300個鹼基長度的苛性雜交條件包括最後在68 °C之1 X Ssc/0_ 1 % SDS中沖洗至少一小時（Ausubel等人編校，1989年，<分子生物學之現代方法〉 (Current ProtocolsinMolecularBi〇1〇gy)，第一册，Greene Publishing Associates·公司和 John Wiiey & s〇ns 公司出版，紐約，第2、10、3頁）。在特別的具體實例中，在使用序列辨識號碼：4的序列或其互補序列進行雜交之中所用 43- 541314 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（41 ) 鬲度苛性沖洗條件是2 X SSC，1。/〇 SDS在50 °C沖洗大約 20分鐘至大約30分鐘。為¥此藝者將能利用本技藝中已知的方法辨識出 1 06多肽之編碼序列的完全純系。包含於分離出來之純系中的OMP 106多肽的編碼序列長度可藉由分析轉殖的插二序列並將由該開放讀碼區（open reading frames，〇RFS)編碼之推演的多肽主^和OMP 106多肽比較，及/或將推演的胺基酸座I與已知經純化之OMP 106多肽的胺基酸序列比較而探知。當OMP 106多肽的編碼序列之部分純系被分離出來時，則可利用該部份純系的插入序列作爲雜交探針將完整的純系分離出來。或者，重疊的部份純系可經由連接其插入序列而重建出完整的0MP 106多肽之編碼序列。完整的純系可以是任何具有0RFs ，而該〇RFs具有與 OMP 106多肽吻合的推定胺基酸序列之純系，或者當QMP 1〇6多肽之胺基酸序列無法獲得時，則爲與〇Μρ 1〇6多肽的肽片段且具有與OMP 106多肽對應之分子量的胺基酸序列吻合者。還有，完整的純系可由其插入序列的能力予以辨識，當插入片段被放在一個表現載體中則會產生一種與專一結合至OMP 106多肽之胺基端的抗體，和與專一結合至OMP 106多肽之羧基端的抗體相結合的多肽。編碼OMP 1 06衍生多肽的核酸序列可用本技藝中詳知的方法生產。一方面，編碼OMP 106衍生多肽可鑒於本説明書所揭示的敎示而以重組DNA法從OMP 1 〇6多肽之編碼序列衍生得到。例如，0MP 106多肽之編碼序列可以是不會 -44-

Hi- ϋϋ I JTI« ml ι_ιϋ ϋϋ 1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -I#

541314 A7 五、發明説明（42 影響OMP 106多肽之免疫原性質或者能增進其免疫原性質之經修改製造的胺基酸取代序列。各種方法都可被使用，其包括但不限於針對特定寡核甞酸位置的突變。這些和其他本技藝中已知的技術可用於製造單一或多元的突變，諸如置換、插入、刪除、和轉位，如Botstein和Shortle ’ 1985 年 <科學 >，第 229 期：1193-121〇頁。裝遂有，OMP 1 〇6多肽編碼序列DMA可用限制酶或核酸外切酶加以截修。異源之編碼序列可用連接法或pcR放大法添加到0MP 106多肽的編碼序列上。而且，編碼整個或部分0MP 106衍生多肽的DNA可基於已知或推演之〇Mp 1〇6多肽的胺基酸序列和任何所想要對序列做的改變用 PCR放大法合成或以化學法合成。經鑑認並分離之含有OMP106多肽或OMP1〇6衍生多肽之編碼序列的DNA可被插人—個適#的轉殖用載體中。有許多本技藝中已知的載體一寄主系統可以使用。可用的載體包括但不限於質體或經修飾的病毒，但是該載體系統必須要所使用的寄主細胞相容。這樣的載體包括但不限於唑固體如爛它吐菌體（lambda)的衍生物，或質體如卿322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製或pUC質體的衍生物。你丨如# 物例如，將DNA插入轉殖用載體的過 ==接該職片段到具有互補之枯合端的轉殖；虹來達成。然而’若是用以將DNA切段之互補限位不出現在轉殖用的載體中丨刀做酵素性的修飾。或者，要了猎耆知核芬序列（連接序列黏接到DNA未端上而產生任何、斤歹" 仃所要的切位；這些經黏接的本紙張國國家標準（CNS) -45- 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（43 ) 連接序列可能包括特^之化學合成的寡㈣酸，其編碼限制核酸内切酶的辨認序列。在另—可行的方法之中，可用同聚物接尾的方式修飾被切開的DNA。重組分子可經由轉移型、轉移感染、感染、電穿洞法等方法送入寄主細胞中，因此可產生許多複製的基因序列。在另一万法之中，所要之含有0MP l06多肽或〇Mp 衍生多肽編碼序列的DNA可在用「發射槍（811加gun)」的方式插入適當的轉殖用載體後被辨識和分離出來。對所要之序列進行濃縮（例如用大小分級分離法）可在插入體之前進行。 ^ 在特定的具體實例中，以含有OMP 106多肽有0Mp 1〇6 行生多肽之編碼序列的重組DNA分子使寄主細胞轉型能產生此種編碼序列的多重複製物。因此，該編碼序列由培養轉型細胞，從轉型細胞分離出重組的DNA，以及若有必要時，將插入的編碼序列從分離的重組DNA上取出而獲得。 5·8. 式.生_J^〇MP 100 多肽和本發明之OMP 106多肽和OMP 106衍生多肽可經由遗傳工程技術生產。在這種情形之中，它們是由以編碼該多月太之DNA予以轉型的適當主細胞所生產。編碼本發明之 1〇6多肽或OMP-106衍生多肽之核甞酸序列可插入適各的載體之中，亦即含有轉錄和轉譯該插入之多肽編碼序列所需元素的載體。編碼OMP 106多肽或OMP 1〇6衍生多月太之 46 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（2丨0><297公釐） —— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) LT . 訂 541314 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（44 ) 核#酸序列以其能在適當條 r 田條件下被表現出來的方式插入載 :(例如，以正確的位向和正確的讀碼區，並且具有適當的序歹j I括#又RNA聚合酶的結合序列和核糖體的結合序列）。有許多寄主-載體系統可用於表現該多肽之編碼序列。這些系統包括但不限於以病毒（例如：牛症病毒，腺病毒等） ^染的哺乳類細胞系統；以病毒（例如：巴氏病毒）感染的 :蟲細m微生物如包含料菌載體之酵母菌或以嗟菌DNA、質體DNA，或粘接質體DNA轉型的細菌。較好邊寄主細胞是細菌細胞，而最好該細菌是大腸桿菌、枯草桿菌或沙門氏菌。載體的表現元素在其強度與特定性上會有變化。視所使用的寄主-載體系統而定，許多適當之轉綠和轉譯元素之中的任一個均可被使用。在一項特定具體實例中，一種包含 OMP 1〇6多肽或0MP 1〇6衍生多肽序列及一種寄主細胞之如及/或原一序列的嵌合型蛋白被表現出來。在其他特定的具體實例中，一種包含〇Mp 1〇6多肽或omp 106衍生多月太序列和一種親和性純化之肽的嵌合型蛋白被表現出來。還有一些特定的具體實例中，一種包含OMP 1〇6多肽或 OMP 1〇6衍生多肽序列和一種有用之免疫原多肽或肽的嵌合型蛋白被表現出來。在較佳的具體實例中，表達出來的 0MP 106衍生多肽含有一段形成天然OMP 106多肽之外表抗原決定部位或受體結合區位的序列。任何在本技藝中已知用於將DNA片段插入載體的方法 -47 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 卜· ▼裝- 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 -----—— _ 五、發明説明（45 ) ~ ~" I用於建構含有一種嵌合型基因的載體，而該嵌合型基因含有適當的轉綠/轉譯控制信號和多肽編碼序列。這些方法 u匕括把外重組DNA和合成技術，以及體内重組物（基因重組）。編碼OMP 106多肽或0MP 1〇6衍生多肽之核酸序列的表現可由第二種核酸序列來調控，使得插入的序列能在以重組DNA分子加以轉型的寄主中表現。例如，插入序列的表現可由任何本技藝中已知的起動子/促進子多以控制。可用於控制插入序列之表現的起動子，包括但不限於用在動物細胞中表現的SV 40早期起動子區（Bern〇ist和 Chambon·，1981 年，<自然>，第 290 期：3〇4_31〇頁），包含在勞斯（Rous内肉瘤病毒之3’末端長段重覆序列中的起動子（Yamamoto等人，1980年，<細胞〉，第22期：787_ 797頁），疱疹胸苷激酶起動子（Wagner等人，1981年，< 美國科學院進展報導>(PNAS)第78期：i44i_i445頁），金屬硫新質基因的控制序列（Brinster等人，1 982年，〈自然〉 ’第296期：39-42頁）；用在細菌細胞中表現的卢·内醯胺酶的動子（Villa-Kamaroff等人，1978年，〈美國科學院進展報導 >(PNAS)第 75 期，3727-373 1 頁），tac(DeB〇er 等人，1983年，〈美國科學院進展報導〉，第go期，21-25頁），APl，或trc(亦請參考<科學的美國人〉；198〇年，第242 期：74-94頁中的「得自重組細菌之有用的蛋白質」用在移植細胞中表現的nopaline合成酶起動子區或椰花菜鑲後病毒35 S RNA起動子（Gardner等人，1981年，〈核酸研究〉，第9期：2871頁）和光合酵素二磷酸核酮糖羧化酶 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐) ""~' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 541314 A7 ---------B7 五、發明説明（46 ) (Herrera-Estrella 等人，1984 年，<自然>，第 31〇期： 1 15-120頁）；來自酵母菌或其他眞菌的起動子元素如， GaU起動子，ADC(酒精去氫酶）起動子，pGK(磷酸甘油激酶）起動子，鹼性磷酸水解酶起動子。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 含有OMP106多肽或〇MP1〇6衍生多肽之編碼序列的表現載體可用三種一般方式鑑認：（a)核酸雜交法有無「標圮物」基因功能存在，和〇)插入序列之表現。在第一種方法之中，插入表現載體之外來基因可用探針以核酸雜交法偵測其存在，而該探針包含與插入之〇Mp 1〇6多肽或〇Mp 106衍生多肽的編碼序列同源的序列。第三種方法之中，重組載體/寄主系統可基於某種「標記物」基因功能的存在與否（例如，胸苷激酶的活性對抗生素之抗性，轉型之表現型，在巴氏病毒中的吸凝體（〇cclusi〇n b〇dy)之形成等等）予以鑑識和挑選。而這些基因功能則由於插入外來基因到載體上所造成。例如，若將OMP 1〇6多肽或omp 1〇6 衍生多肽的編碼序列插入載體之標記物基因序列的範圍内 ’則含有該插入序列之重組載體可藉由標記物基因功能之不存在而被鑑認出來。在第三種方法之中，重組的表現載體可經由檢驗重組載體所表現的外來基因產物而被鑑識出來。例如，此種檢驗可基於OMP1〇6多肽或OMP1〇6衍生多肽在體外檢驗系統中的物理或官能性質，例如：結合至 OMP 1 06的配體或受體，或與本發明之抗_〇Mp 1 〇6抗體結合，或寄主細胞的血球凝集能力，或細胞抽取物干擾由黏膜炎莫拉氏菌所造成之血球凝集能力。 _____-49- 本紙張尺度適用中關家標準（CNS ) M規格（2獻297公羡 M1314

、發明説明（π 經濟部中央標準局員工消費合作社印製一旦鑑識或分離出某種特別的重組DNA分子，則可用本技藝中的數種方法予以增殖。—旦建立了適合的寄主系統生長條件，則可大I繁殖和製備重組的表現載體。如以 ~釋k的了使用的表現載體包括但不限於以下載體或生物·人的或動物的病毒如牛痘病毒或腺病毒；昆蟲 =二如巴氏病毒；酵母菌載體；噬菌體的載體（例如：爛它噬菌體載體），和質體及粘接質體的DNA載體，而並只有少數具名者。 ^ 此外，寄至細胞株可以選擇能轉變插入序列之表現，或修以特定之想要的方式修改和對基因產物加工者。從某些起動子發生的表現可在某些引發物出現的情況下被提高；因此，以遺傳工程修改的〇Μρι〇6多肽或〇Μρι〇6衍生多肽的表現是可控制的。還有，不同的寄主細胞對於轉譯和轉譯後的蛋白質加工和修飾有其特徵和特定的機制。吾人可選擇適當的細胞系或寄主系統以確保表現之外來蛋白質上有所要的修飾和加工。、 5.9.試劑本發明的多肽、肽、抗體和核酸對臨床或醫學上診斷點膜炎莫拉氏菌感染和對科學上研究莫拉氏菌的致病性、毒性和感染性，以及對於寄主的防禦機制之研究而言，是= 用的試劑。例如，本發明的DNA和RNA可做爲以雜交或 PCR放大法鑑認生物標本中黏膜炎莫拉氏菌之存在的探^ 。該DNA和RNA亦可用於鑑認其他或許編碼一種與黏犷 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i. 訂 -50- 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（48 ) 炎莫拉氏菌OMP 106相關之蛋白質的細菌。本發明的多肽和肽可用於製備多株和單株浐舰抗體可用於進一步以親和層析法純化含有本:而這些組合物。該多肽和肽亦可用於標準的免°疫檢驗=多肽的中抗黏膜炎莫拉氏菌的抗體存在與否。 ’師選樣品吾人需瞭解要利用本發明的敎示於特定的問需要依照本發明所含的敎示在具有本技蓺 ’衣境必处*桥芬f固nb、1 , 斗牧云 < 一般技巧者的犯力所及範圍内万可。以下的實施例中顯示及其製備和使用方法的實例。 6_宜~施例：分離和鑑定 11143或其他菌株之编碼卫因的特徵 6.1材料及方法 6.1.1.血球凝集檢驗以Soto-Hernandez等人説明的方法（<臨床微生物學雜誌 >，第27期：903-908頁），試驗黏膜炎莫拉氏菌引致的血球各疋集’除了在抹片血球凝集試驗中以5 〇/0取代3 〇/。（體積比）的紅血球。最初的血球凝集檢驗是以2〇毫克的細菌細胞（澄重）達成的。因爲在3 5 °C生長在血液瓊脂皿上的菌株 ATCC 49143會產生強的血球凝集反應，所以被選做爲參考菌株。以1 : 2的稀釋率連續稀釋菌株ATCC 49143則會造成減低之血球凝集反應。+ + + +到+的計分是基於連續以1 :2稀釋以後，由ATCC 49143菌株觀察到的血球凝集現象 ’因此，產生一個+的反應要用到達成一個+ + +反應所需之 51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) I裝 I I 訂 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（49 ) 細胞數目的1/4 6_1.2·也球凝集之抽制將黏膜炎莫拉氏菌ATCC 49143細胞懸浮液以1 ·· 2的比例連續稀釋，而用產生一個+血球凝集反應的稀釋液在使用 7微升和俾可（Duibecc〇)磷酸鹽缓衝之鹽液和7微升$ %( 體積比）的人類〇 +紅血球的條件下檢驗血球凝集受簡單的糖和糖衍生物抑制的情形。爲了要測定簡單的糖或糖衍生物是否會抑制黏膜炎莫拉氏菌造成的血球凝集，所以將7 微升500mM之某種糖液和7微升的黏膜炎莫拉氏菌細胞混合，並且培養5分鐘以使該糖與細胞交互作用。然後添加7 极升5 4 (^ #貝比）的人類〇紅血球，而在}分鐘後對血球凝集現象計分。試驗每種糖和糖衍生物抑制血球凝集的能力。然後將每種糖和糖衍生物的貯存液連續以丨：2稀釋，並以上述方法用這些稀釋液檢驗其抑制血球凝集的能力。以這樣的方式可以測得抑制血球凝集所需的醣類之最小濃度。 6.1.3.與配體和受體的結合依照Magnani等人，1982年，<生物化學雜誌>(J Br〇1 Chem.)第257期：14365-14369頁説明的方式利用薄層色析法（TLC)分級分離寄主細胞的醣脂和覆在該層析圖上之經標記的細胞，以檢驗黏膜炎莫拉氏菌與動物細胞醣脂受體的結合。P曰1吕之’將待自Matreya公司（賓州歡樂峽市） - 52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---*--^----^裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -I# 541314 A7

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訂

：)4丄3丄4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（si ) 法。 6.1.5. 將得自ATCC 49143菌枝> 古土么k ^ 50笔克細胞懸浮於1毫升杜俾可（祕ecc〇)磷酸鹽緩衝鹽液的細胞懸浮液酶^室溫下消幻小時：TLCK•處理過的胃蛋白酶（5毫克）蛋白酶Κ(5笔克），TPCK_處理過的胰蛋白酶〇 =蛋白酶，100單位）。所有這些蛋白酶均得自咖 hemlcals公司(密蘇里州聖路易市）。蛋白酶處理後，緊接著將細胞在PBS中沖洗一次，並縣淬. 上忍，于在1笔升PBS中，然 =試驗其血球凝集活性。此外，科基㈣料對蛋白酶處理過的細菌細胞進行抽取，使外膜蛋白能被分解出來以便鑑認被蛋白酶消化之特定蛋白質。 Λ1·6·玉能使血球凝集的培I梓一般而言，將能使血球凝集之黏膜炎莫拉氏菌的培養物在35至37 °c，200 rmp下養在含有穆勒-辛頓肉汁的振盪反應瓶中24至48小時。從血液瓊脂盤或含有穆勒_辛頓培養基的盤中取出的細胞也表現出能使血球凝集的表現型。爲了要挑出不能使血球凝集（NHA)的培養株，以使ATCC 49143菌株以每5天的時間連續轉徙接種到穆勒辛頓肉汁的#止培養物中，在3 5 C培養。每一次轉徒接種都只從肉汁培養物的表面吸取接種物。在第二次轉徒接種前就產生了一團浮在表面的細胞，而這團細胞就被用來做爲緊接下來培養的接種物。以此種方式做連續培養能典型地在三次 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝·

▼、1T ίφ • 111 1 i -54- 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（52 轉徒接種後產生ATCC 49143的NHA培養株。 6·1·7· OMP 106 多妝得自黏膜炎莫拉氏菌ATCC 49143外膜抽取液的 106多肽在抽取液於10(rc培養5分鐘後就能在變性凝膠上被偵測到（例如，用銀染或用抗-〇Mp抗體）。爲了要測定在 100 c培養後出現的0MP 106寬帶是否爲低分子量蛋白在滞騰期間集結的結果，或者是否料會使常態下集結的蛋白質進入凝膠，所以將未經沸騰處理之ATCC 49143的辛基葡萄糖苷外膜抽取液在天然聚丙烯醯胺凝膠上做分析。將包含緊連在樣品槽下的特定凝膠區切下並使加熱沸騰。然後使產生的樣品在變性的聚丙烯醯胺凝膠上做解析，並且用銀染劑染色（Silver Stain Plus商品，Biorad Lab〇rat〇ries 公司，目綠號碼 161-0449，於加州 Richmond 市）。爲了做N-端的序列分析，故將ATCC 49143的辛基葡萄糖苷外膜抽取液和含有SDS的PAGE樣品緩衝液混合，並且在沸騰的水浴中培養5分鐘。然後在含sds的12 〇/。 PAG上做解析，並且用電吸墨法將之轉移到一片pvDF膜 ^。然後把含有OMP106寬帶的膜區切下，以便進行胺基邮的序列分析。沒有任何用於分離OMP丨〇6多肽的PagE 程序在其樣品或凝膠的緩衝液中用還原劑。 6·1·8·拉- ΟΜΡ 106的抗血清抗-ΟΜΡ 106抗體的製備係將得自atcc 49143之ΗΑ培 --—·--hi---裝------訂----- Φ—, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 55- 541314 A7 B7 五、發明説明（53 OMP 1 06多肽以前述方式在變性之硫酸十二酯鈉聚胺&是膠上做解析（Lammeli，1970年，〈自然>，第 :680-685頁）’並且將含有〇MP1 〇6多肽的寬帶從切下來。將切下來的寬帶浸軟後注射到兔子體内，生抗-OMP-106的抗血清。以第6」.2節説明的方式血清抑制血球凝集，但是以抗血清取代第6· 1.2節中如第7節中説明的，同樣對此抗血清做補體調節之炎莫扭氏菌之胞毒活性的檢驗。 6·1.9·里把-OMP 106抗血清進行西方零、點法將以下菌株在5 % C〇2，35 °C下之巧克力瓊脂培養皿中培養48小時：黏膜炎莫拉氏菌ATCC 49143，ATCC 43628 ’ ATCC 43627 ’ ATCC 43618，ATCC 43617，ATCC 25240 ’ ATCC 25238，ATCC 8170 ;卵莫拉氏菌 ATCC 3 3 078;腔隙莫拉氏菌ATCC 17967;牛莫拉氏菌ATCC 10900 經濟部中央標準局員工消費合作社印製養株的丙晞醯 227期凝膠上使其產用此抗的醣。抗黏膜 I Hi- m I— m n I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T ，奥斯陸莫拉氏菌ATCC 10973 ;淋病雙球菌（臨床分離物） ;和腦膜炎莫拉氏菌ATCC 13077。將細菌細胞用聚苯乙烯接種環以刮取方式將菌落從瓊脂表面移出。然後將細胞 30微克懸浮在15〇微升的PaGE樣品緩衝液（36〇mM Tris 緩衝液[pH 8·8]，含有4 %硫十二酯鈉和20 %甘油）之中，並使该懸浮液在1 〇〇。(：培養5分鐘以使其溶解。將溶解的細胞依Laemmli氏的方法在12 %聚丙烯醯胺凝膠上做解析，並將分開的蛋白質以電轉移法在1〇〇伏特下如前述方式轉私至PVDF膜上歷5分鐘（Thebaine等人，1979年，〈美 -56 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 ------B7 五、發明説明（54 ) 國科學院進展報告>(PNAS)，除了添加〇·05 %酸十二酯鈉以協助蛋白質從凝膠上移動。然後PVDF膜用25亳升 Dulbecco氏的磷酸鹽緩衝鹽液預處理，該鹽液含有〇.5 〇/。酪蛋白鈉，0.5 %牛血清白蛋白和1%山羊血清。所有接下來的培養都用此預處理緩衝液實行之。將PDVF膜與Μ毫升1 : 500倍稀釋之已做免疫前處理之兔血清或從以OMP 106多肽（如先前説明者）做免疫處理的兔子身上採得的血清在室溫下培養丨小時。然後用沖洗緩衝液（20mM Tris緩衝液[ρΗ 7·5]，並含有15〇mM氯化鈉及〇·〇5 % Tween-20)沖洗PVDF膜。將PDVF膜與25亳升1 • 5000倍稀釋之過氧化物酶標記的山羊之抗兔血清

IgG.(JackS0n ImmunoResearch Lab〇rat〇ries 出品，該公司位於賓州West Grove目錄編號1U_035_〇〇3)在室溫下培養3〇分鐘。然後用冲洗用緩衝液將PVDF膜沖洗四次，並以3 31 二胺基聯苯胺四氫氯酸鹽和Sigma化學公司供應之過氧化脲個別沖洗4分鐘（Sigma化學公司位於密蘇里州聖路易市 ’過氧化脲之目錄編號爲D-44 1 8)。 6· · 0里jgj-lQJViP 106免疫螢光染細胞表面在35 C的振盪式水浴中將黏膜炎莫拉氏菌49 143養在穆勒-辛頓肉汁中至隔液。然後將細胞用離心法沉澱成小塊，再懸浮於等體積之不含鈣或鎂之經修飾的Dulbecc〇氏磷酸鹽緩衝液（PBS/MC)中。將該細胞懸浮液裝載於五片乾淨的顯微叙片上。裝置1 〇秒鐘後，用微滴管將過量的液體除去 I — 1 裝訂 Aw L. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -57- 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（55 ，然後將此玻片風乾丨小時。再將此波片以大焰加熱固定，直到玻片觸起來是溫熱的。一開始先用40微升以 PBS/MC做1 ·· 40倍稀釋的抗-OMP106抗血清或免疫前得自相同動物的血清，或是PBS/mc將玻片處理10分鐘，然後用PBS/MC沖洗5次。然後用4〇毫升5微克/毫升濃度之經螢光素異氰酸鹽標記的山羊之抗兔子的抗體 IgG_(Kirkegaard and Perry Laboratories 出品，位於瑪里蘭州的Gaithersburg市，目錄編號〇2_15_〇6)溶於pbs/Mc溶液處理該玻片。每一玻片都以PBS/MC覆蓋，上面再覆以蓋玻片的方式保存，並且用安裝之489毫微米波長的濾鏡之螢光顯微鏡做觀察。對每一樣品而言，將五種視野的結果以目視檢驗之，以評估其受染的程度。 6.2.結果 ό·2·1.血球凝集活性黏膜炎莫拉氏菌對紅血球的凝集活性是具物種特定性的，而在人的紅血球上可觀察到最強的活性。兔子的紅血球也會被黏膜炎莫拉氏菌凝集，但是不像人體細胞那麼顯著。老鼠、馬或羊的血紅素則不會被凝集（見表丨）。 ........................................................................-..................................... || | ___________ ___________ 表1用黏膜炎莫拉氏菌ATCC 49143試驗其對各種生物物種之紅血球造成血球凝集的活性

-58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） m m I n^i «.HI I m n mu ml、lXTJIn ml m I m m (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 541314 A7 B7 五、發明説明（56 ) 兔馬羊 a ++++ 最強的血球凝集反應，-表示沒有血球凝集反應 6.2.2. OMP 106受體輿配體黏膜炎莫拉氏菌的血球凝集活性是由於和紅血球丁碳糖 (Gtu)。得自能使血球凝集之菌株的膜泡會與具有Gb4之醣月曰結合’但疋不具血球凝集活性的菌株卻不會與同樣的糖酉旨結合（見圖2)。黏膜炎莫扭氏菌的血球凝集活性受到的單醣成份或此種單酷的衍生物所抑制，其中尤其有效的抑制劑爲N-乙醯基半乳糖胺和半乳糖（尤其是半乳糖的反構體）（見表2) 濃度。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝·

、1T -Φ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ........... _____ mnn——[TT|||[||議Π|, .. .mmi丨 I 丨丨丨丨 _i«u」„^_M>w>wwwwww>H|MWWM 表2 :抑制由黏膜炎引起之血球凝集（MIC)所需的最低糖糖 1VT Τ ΓΎ m λ/ί、右旋-葡萄糖 ——^—_ ivi 1 L 1 III IV! J >167 右旋-甘露糖 83 右旋-半乳糖 41 左旋-岩蕩糖 83 Ν-乙醯基-右旋葡萄糖胺 >167 Ν_乙醯基-右旋半乳糖胺 41 -59-

10 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 B7 五、發明説明（57 ) 甲基-β -葡萄糖甲基-β -甘露糖甲基-半乳糖甲基-/?-半乳撼 ^___ ρ制由黏腱炎莫拉氏菌ATCC 49143引起5 %經沖洗之人的0紅血球之1 +血球凝集反應所需的最 -^低糖濃度。 N- ^醯基半乳糖胺和π _半乳糖均爲Gh四醣的一部份。血球凝集和與（3%結合的相關性，及其與血球凝集會受包含Gh文體之單醣抑制的發現建議了黏膜炎莫拉氏菌細胞黏結至四醣Gh的可能。這種四醣存在於人的紅血球和組織，並且能居間促成黏膜炎莫拉氏菌黏接至紅血球的膜上。 6.2.3. m^QMP 106 多肽以虫白水解方式消化黏膜炎莫拉氏菌，接著對消化過的細胞I血球凝集作用加以分析，證明用胃蛋白酶和蛋白酶 K做蛋白酶處理會破壞血球凝集的活性，而用胰蛋白酶則部份破壞血球凝集活性，這顯示該血球凝集活性是受蛋白質居間促成的。分析經蛋白酶消化之黏膜炎莫拉氏菌二胞的OMP蛋白輪廓圖顯示在每一樣品中有多重的蛋白質= 分解了，因此該輪廓圖無法提供哪一種蛋白質是負責或产接造成血球凝集活性的線索（見圖3)。因爲蛋白酶處理指出有一種多肽直接或間接負責血球 -60

(請先閱讀背面之注意事訂----- j m 1- -- ......

本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐）

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集的活性，所以我們用SDS_PAGE來比較得自能使血球凝集的菌株之OMP輪廓圖和不能使血球凝集之菌株之〇Mp 輪廓圖（見圖4)。分析這些輪廓圖之間的差異指出該能使血球合是集囷株有兩種獨特的多肤，一種具有27 KD的表面分子量（以OMP 27表示），而另一種是唯一具有大於1〇6 KD 表面分子量的蛋白質（以〇MP丨〇6表示）。値得注意的是， OMP 1 06多肽的寬帶不存在各種經蛋白酶處理而使血球凝集活性降低或消失的細胞之OMP 1 〇6製備物中，但是〇Mp 27的寬帶卻存在於經蛋白酶κ處理而不具血球凝集活性之細胞的ΟΜΡ製備物中。此外，ΟΜΡ1〇6多肽的寬帶不會被蛋白酶V8消化而分解，而這種消化不會影響到經處理之細胞的血來凝集活性。 I ·ρι— ϋϋ _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕 —衣經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6_2·4· ΝΗΑ培養株的OMP輪廓圖在35°C靜態培養中對ATCC 49143的NHA培養株做連續培養能在第三次培養物的轉徒接種前產生NHA培養株（以 49 143 -NHA表示）。這種血球凝集活性的喪失是可重覆發生的。對HA和NHA培養株的OG外膜抽取液之omp輪廓圖進行分析顯示OMP 106多肽的寬帶在49 143-NHA抽取物中消失了（圖5)。這顯示OMP 106多肽就是黏膜炎莫拉氏菌的血球凝集素（亦即OMP 106多肽與Gb4受體結合，或者它是與Gb4受體結合之同聚物蛋白質的一個次單元體），或者它形成黏膜炎莫拉氏菌之血球凝集素的一部份（亦即OMP 1 〇6多肽是與Gh受體結合之異聚物蛋白質的次單元體）。 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 541314 A7 B7 五、發明説明fe9 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6.2.5. OMP 106和血球凝集作用由ATCC 49143 OMP 106多肽爲抗原產生之多株抗血清能中ATCC 49143引起的血球凝集，而且也能中和由異源之ATCC 43 627所引起的血球凝集。這更支持了以下結論，那就是黏膜炎莫拉氏菌的血球凝集活性包含OMP 1 06多肽，而OMP 1 06多肽的抗原性在菌株間被保留下來。請參考圖9 A，其顯示多株抗血清中的抗體會與異源之黏膜炎莫拉氏菌株的OMP 106多肽結合。 6.2.6. OMP 106在外表的位置用兔子的抗一 OMP 106抗血清做間接的免疫螢光染色以測定OMP 106多肽是否曝露在黏膜炎莫拉氏菌細胞的外表。以抗一 OMP 1 06抗血清處理的黏膜炎莫拉氏菌細胞要比用免疫前的血清或PBS/MC處理的細胞染得深且均句。這指出完整之黏膜炎莫拉氏菌的OMP 106多肽會與抗一 OMP 1 06抗體反應。而這結果指出OMP 1 06多肽是曝露在黏膜炎莫拉氏菌的表面上。這項發現和OMP 1 06多肽扮演血球凝集的角色一致，並且還指出OMP 106在做爲疫苗上有用。 6.2.7. OMP 106多肽的性質 OMP 1 06多肽以大型的蛋白質複合體，爲其天然狀態存在或當它以辛基葡萄糖菩抽取時呈結集的形式。這項結論由以下發現所支持，那就是用辛基葡萄糖棼對黏膜炎莫拉 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ,»^1- 1 - -- - - (請先閱讀背面之注意事- 1· ，項再填· 裝-- .寫本頁) 、?! 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 B7 五、發明説明（60 ) 氏菌進行抽取會把OMP 106多肽溶出，但抽出的OMP 106 多肽並不會進入變性PAG中，除非該抽取物泡在1 00 °C培養過（圖6)。而且，OMP 106多肽並未顯示其能從低分子量的多肽在加熱時因聚合或集結而形成，因爲在未經加熱的變性樣品中OMP 1 06多肽會被凝在樣品槽中，而只有在樣品先培養在1 〇〇 °c的條件下才能進入解析用凝膠。這項生化性質對於鑑認各種凝膠中的OMP 1 06多肽很有用。利用黏膜炎莫拉氏菌的辛基葡萄糖甞抽取物，然後將該抽取物硫酸十二酯鈉在1 00 °C培養，再將蛋白質於變性聚丙晞醯胺凝膠上做解析，我們估測出得自各種黏膜炎莫拉氏菌菌株之OMP 106多肽的表面分子量，尤其是ATCC 25238，ATCC 25240，ATCC 43617 ， ATCC 43618 ， ATCC 43 627和ATCC 43 62 8的OMP 106多肽，其範圍在大約180 kD至大約230 kD(圖9A)，然而ATCC 49143菌株的 OMP 106多肽顯示其具有大約190 kD的表面分子量（圖 6) 〇吾人將ATCC 49143菌株的OMP 106多肽從凝膠切片抽出，並對其N-端做序列分析。序列分析顯示得自 ATCC 49143之外膜之OMP 106多肽的Ν·端爲IGISEADGGKGGA NARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(序歹ij 辨識號碼 :1)。此外，還分離出一段由Lys-C消化分解（Fernandez 等人，1994年，〈分析生物化學〉，第218號：112-117頁）產生之OMP 106多肽的中間肽段，其序列經測定爲 GTVLGGKK(序列辨識號碼：2)〇 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^衣. 訂 541314 A7 B7 五、發明説明（61 ) 我們製造出三種寡核甞酸探針。兩種探針相對於該中間肽段GTVLGGKK，其中一者具有以下序列GGNACNGTNCT NGGNGGNAARAAR(序列辨識號：3)，另一者具以下序列 :GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR(序列辨識號碼：7) 。另外一種探針Me 5-72編碼OMP 106序列之N-端（序列辨識號碼：1)的中間片段（序列辨識號碼），其序列爲GAAGC GGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATA AATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA(序歹"坪識號碼 :4)。將Me 5-72探針雜交至黏膜炎莫拉氏菌DNA的Hind III或Dra I完全消化物，每一種消化物都在南方墨點分析中產生單一的一條寬帶（圖7)。在Hind III消化物中的雜交寬帶具有大約8.0 Kb的大小，而在Dra I消化物中的雜交寬帶則具有大約4.2 Kb的大小（圖7)。 6.2.8. OMP 106多肽保守性經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對數種黏膜炎莫拉氏菌菌株及有關的菌種之外膜蛋白抽取物做西方墨點分析顯示抗-OMP 1 06抗體會和許多黏膜炎莫拉氏菌的菌株中，包括HA和NHA菌株或培養株之大約180KS至大約230 kD的多肽結合（見圖9A)。抗-OMP 106 的抗體不會與任何存在於相關細菌之蛋白質抽取物中的多肽結合（圖8A)。這些結果證明以下事實： 1)抗-OMP 1〇6抗體可用於特定地鑑認並將黏膜炎莫拉氏菌從相關的菌種之中區辨出來。2) OMP 106多肽可用於產生能做爲診斷之應用以鑑認黏膜炎莫拉氏菌之抗體。3) ___ -64- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 541314 A7 B7 五、發明説明（62 ) 抗一種菌株之OMP 106多肽的抗體（例如：抗ATCC 49143 之OMP 106的抗體）可用於鑑認和分離其他黏膜炎莫拉氏菌的菌株中相對應的Ο Μ P 1 0 6多肤。有趣的是，西方墨點的結果顯示有許多ΝΗΑ黏膜炎莫拉氏菌的菌株有ΟΜΡ 106 多肽存在於其外膜的OG抽取液中。這項發現以及下述事實，即在PAGE之後得自ΗΝΑ黏膜炎莫拉氏菌菌株之OG 外膜抽取液的OMP做銀染並未在180 KD至230 KD的範圍透露一道寬帶，這顯示OMP 106多肽會由大多黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株表現出來，但是爲了要在血球凝集作用上具有活性（亦即能結合至哺乳類細胞表面受體上）或可被銀染，該OMP 106多肽勢必要以某種方式做適當地修飾。顯然地，只有HA菌株和培養株能正確地修飾OMP 1 06 多肽，使其能居間促成細菌結合至哺乳類細胞表面的血球凝集素之受體。 7.實施例：OMP 106疫苗的效能：抗-OMP 106抗血清之胞毒活性經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 檢驗抗-OMP 1 06抗體之補體中介性胞毒活性，以測定 OMP 1 06多肽的疫苗潛能。以第6.1 ·8節所説明的方法製備抗ATCC 49143 HA培養株之OMP 106多肽的抗血清。用 Eollinger等人所説明之「血清殺菌試驗」來檢驗免疫前的血清和抗_〇MP 106之抗血清在中介補體殺滅黏膜炎莫拉氏菌上的活性（「對於腦膜炎雙球菌之免疫反應」，反於< 臨床實驗室免疫學手册〉，第三版，347-349頁），除了以 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 541314 A7 B7 五、發明説明（63 ) ΗA和NHA黏膜炎莫拉氏菌菌株或培養株細胞取代腦膜炎雙球菌的細胞。結果顯示抗·〇ΜΡ 106的抗血清可中介補體殺滅異種之黏膜膜拉氏菌ATCC 43627的ΗΑ培養株，但卻不會殺滅黏膜炎莫拉氏菌ATCC 43627的ΝΗΑ培養株或ΝΗΑ黏膜炎莫拉氏菌ATCC 8176。表3摘錄了免疫前血清和抗-ΟΜΡ 106 抗血清在對抗ATCC 43627之ΗΑ培養株上的補體中介胞毒活性。表3 免疫前的血清和抗-OMP 106抗血清之補體中介胞毒 ϋϋ· ·ϋϋ —ϋ 4^ϋ— m ϋ— —ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 活性胞毒效價 1 免疫前抗 ΟΜΡ 106 貫驗1 16 128 實驗2 8 64 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1.該效價是指血清能中介補體殺減ATCC 43627之HA培養株之最高稀釋倍數（例如，16代表將該血清稀釋16倍 )，其數値愈大，則胞毒活性或效價愈高。如表3中所示，抗-OMP 106抗血清具有比免疫前的血清大上8倍的胞毒活性。這項發現指出OMP 106多肽有用於做爲對抗ΗA黏膜炎莫拉氏菌的菌株和培養株之疫苗。雖然本發明以參考其特定具體實例的方式做詳細的説明，但是讀者必需暸解在功能上有同等性的改變亦包括在本 -66 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 541314 A7 B7 五、發明説明（64 ) 發明的範疇之中。其實，對於熟習本技藝者而言，從先前的説明和附帶的圖示中均能對本説明書已顯示及説明修飾之外的各種關於本發明的修飾感到顯而易知。此等修飾含括在附錄之申請專利範圍的範疇之中。本説明書引用了許多論文，其所揭示的内容乃完整地以參考文獻的方式併入本説明書中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -ϋϋ m· mmMammmmmmm Mammmmmmmmmr ιϋ_ϋ 1 y m_l im ιϋϋ_· US. 、v'口 Φ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 541314 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（65 ) 序列表 (1) 一般訊息：

⑴申請人：TUCKER，KENNETH PLOSILA, LAURA (ii) 發明標題：黏膜炎莫拉氏菌外膜蛋白_106多肽，基因序列及其用途 (iii) 序列數目：8 (iv) 聯絡地址：

(A) 收件人：PENNIE 和 EDMONDS (B) 街道：11 55 Avenue of the Americas (C) 城市：紐約市 (D) 州名：紐約州 (E) 國名··美國 (F) 郵遞區號：10036-271 1 (v) 電腦可讀形式： (A) 媒介型式：磁片 (B) 電腦：IBM可相容的個人電腦

(C) 操作系統：PC-DOS / MS-DOS (D) 軟體：patentln Release #1.0，Version#1.30 (vi) 目前申請數據：

(A) 申請號碼：US (B) 歸檔日期： (C) 分類： (viii)法律事務所訊息： _ -68- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ΐ〇χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝·

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 ____ B7 五、發明説明（66 ) (A) 姓名：Baldwin, Geraldine F. (B) 註册號碼：31,232 (C) 參考號碼：7969-045 (ix)電信資料： (A) 電話：（212)790-9090 (B) 傳眞：（212)869-8864

(C) 電傳：66141 PENNIE (2)序列辨識號碼：1的訊息 (i) 序列特徵： (A)長度：43個氨基酸 .(B)型式：氨基酸 (C) 股數： (D) 拓樸結構：未知 (ii) 分子型式：肽 (xi)序列描述：序列辨識號碼：1 : lie Gly lie Ser Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Als Asn Ala Arg 1 5 10 15

Gly Asp Lys Ser lie Ala lie Gly Asp lie Ala Gin Ala Leu Gly Ser 20 25 30 Gin Ser lie Ala lie Gly Asp Asn Lys lie Val 3 5 40 (2)序列辨識號碼：2的訊息 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 11^ H 1-1 Μϋ— ϋϋ —ϋ I I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（67 ) (i) 序列特徵： (A) 長度：8個氨基酸 (B) 型式：氨基酸 (C) 股數： (D) 拓樸結構：未知 (ii) 分子型式：肽 (v)片段型式：内部 (xi)序列描述：序列辨識號碼：2 : Gly Thr Val Leu Gly Gly Lys Lys 1 5 (2)序列辨識號碼：3的訊息 (i) 序列特徵： (A) 長度：24個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股數：未知 (D) 拓樸結構：未知 (ii) 分子型式：其他核酸 (A)説明：/desc = n 探針•’ (xi)序列描述：序列辨識號碼：3 : GGNACNGTNC TNGGNGGNAA RAAR 24 (2)序列辨識號碼：4的訊息 ⑴序列特徵： -70- (請先閱讀背面之注意事 I項再填· 裝-- :寫本頁) 訂 i# 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 541314 A7 B7 五、發明説明（68 ) (A) 長度：72個驗基對 (B) 型式：核酸 (C) 股數、單股 (D) 拓樸結構：未知 (ii)分子型式：DNA(基因組的） (A)説明：/desc = ”探針” (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：CDS (B) 位置：1..72 (xi)序列描述：序列辨識號碼·· 4 ·· Siu Sa Aso Gi? 〇ΐΞ GCG CGC ^ TCC 1 u-./ ^/S Gly ^ly Ala Asn Ala Arg Glv Aso Lys Ser 5 10 15 48 (請先閱讀背面之注意事 l#mi i ATI _ 1· •項再填· 裝-- :寫本頁)

、1T ATT GCT ATT GGT GAC ATT GCG CAA He Ala lie Gly Asd He Ala Gin 20 ’ 72 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (2)序列辨識號碼：5的訊息 ⑴序列特徵： (A) 長度：24個氨基酸， (B) 型式：氨基酸 (D)拓樸結構：直鏈狀 (Π)分子迤式：蛋白質 (xi)序列描述：序列辨識號碼：5 : Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp Lys Ser 1 5 10 15 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準（pNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 541314 A7 B7 五、發明説明（69 ) lie Ala lie Gly Asp lie Ala Gin 20 (2)序列辨識號碼：6的訊息 (i) 序列特徵： (A) 長度：24個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股數：未知 (D) 拓樸結構：未知 (ii) 分子型式：DNA(基因組的） (A)説明：/desc = ’·探針’’ (xi)序列描述：序列辨識號碼：6 : YTTYTTNCCN CCNAGNACNG TNCC 24 (2)序列辨識號碼：7的訊息 ⑴序列特徵： (A) 長度：24個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股數：未知 (D) 拓樸結構：未知 (ii)分子型式：其他核酸 (A)説明：/ d e s c ="探針π (xi)序列描述：序列辨識號碼：7 : GGNACNGTNT TRGGNGGNAA RAAR 24 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、?τ 541314 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（70 ) (2)序列辨識號碼：8的訊息 (i)序列特徵： (A) 長度：24個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股數：未知 (D) 拓樸結構：未知 (Π)分子型式：其他核酸 (A)説明：/desc = n探針’’ (v)片段型式：N端 (xi)序列描述：序列辨識號碼：8 : YTTYTTNCCN CCYAANACNG TNCC 24 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、言 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

Claims

541314 第086105809號專利申請案中文申請專利範圍替換本(92年

A B c D

1. 一種分離之OMP106多肽，其為黏膜炎莫拉氏菌 (Moraxella catarrhalis)的外膜多肽，且利用SDS聚丙婦醯胺凝膠電泳而以分子量分別是200 kD和116.25 kD 的兔骨骼肌之肌凝蛋白和大腸桿菌的Θ -半乳糖誓酶做為分子量的標準，測得該多肽之分子量為大約1 80 kD 至大約230 kD，且其包含下示之序列 IGISEADGGIKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV 或 IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV，以及 GTVLGGKK. 2. 根據申請專利範圍第1項的〇?^106多肽，其具有|大約190 kD的分子量。 3. 根據申請專利範圍第1項的OMP 106多肽，其為選自以下集合之黏膜炎莫拉氏菌株的外膜多肽，該菌株集合包含·· ATCC 25238，ATCC 25240，ATCC 43617，ATCC 436 18，ATCC 43627，ATCC 43628 和 ATCC 49143。 4. 根據申請專利範圍第3項的OMP 106多肽，其中該黏膜炎莫拉氏菌株為ATCC 49 143。 5. 根據申請專利範圍第3項的OMP 106多肽，其中該黏膜炎莫拉氏菌是能使血球凝集的培養株。 6. 根據申請專利範圍第1項的 OMP 106多肽，其能與銀染反應。 7. —種經分離之多株抗體，其可專一結合至根據申請專利範圍第1、2或5項中任一項之OMP 106多肽。 8. 根據申請專利範圍第7項之經分離之抗體，其為可中介本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 x 297公釐) 541314 A8 B8 C8 申請專利範圍黏膜炎莫拉氏菌之補體致死的胞毒抗體。 9 一種疫苗，其包含根據申請專利範圍第1，2或5項中 • 任一項之OMP 106多肽。 10· —種抗原性組合物，其包含根據申請專利範圍第1 , 2 或5項中任一項之OMP 106多肽。 U·根據申請專利範圍第1、2或5項中任一項的omp 1〇6 多肽，其在動物體内有效地產生免疫反應。 —種從HA黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株生產不具血球凝集活性之黏膜炎莫拉氏菌的方法，其包括使HA黏膜炎莫拉氏菌的菌株或培養株連續地轉徒接種到靜止液體培養物中，該培養物保持在3 5 °C不搖盪，於約每5 天便將接種物轉徒接種到新的靜止培養物，且該轉徒將持續’直至獲得不具血球凝集活性之培養株為止。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)