JP4401437B2 - モラクセラ・カタラーリス外膜タンパク質―１０６ポリペプチド、遺伝子配列およびそれらの用途 - Google Patents

Description

１．緒言
本発明は、一般に、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）の外膜タンパク質−106（OMP106）ポリペプチドに関する。本発明は、精製されたOMP106ポリペプチドおよびそれに由来するポリペプチド（OMP106由来ポリペプチド）を含む。本発明はまた、OMP106ポリペプチドおよび／またはOMP106由来ポリペプチドに特異的に結合する抗体（細胞傷害性抗体など）を含む。本発明はさらに、OMP106ポリペプチドおよび／またはOMP106由来ポリペプチドを含んでなる予防用または治療用組成物（ワクチンなど）を含む。本発明はまた、哺乳動物においてモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。本発明はさらに、OMP106ポリペプチドおよびOMP由来ポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド配列、該配列を有するベクター、および該ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
２．発明の背景
モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）は、モラクセラ（ブランハメラ）・カタラーリス（Moraxella（Branhamella）catarrhalis）またはブランハメラ・カタラーリス（Branhamella catarrhalis）としても公知であり、かつてはナイセリア・カタラーリス（Neisseria catarrhalis）またはミクロコッカス・カタラーリス（Micrococcus catarrhalis）として公知であった、ヒトの気道中にしばしば見出されるグラム陰性菌である。モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）は、当初は無害な片利共性生物と考えられていたが、現在では動物の上気道炎および下気道炎における重要な病原体であると認識されている。ヒトにおいてモラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）は、慢性肺疾患を有する成人における重篤な下気道炎、免疫低下患者における全身感染、および乳児および子供における中耳炎および副鼻腔炎を引き起こす。Helminenら，1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Catlin, B.W., 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3:293-320およびそれらに引用されている文献を参照されたい。
２．１．外膜タンパク質および防御抗体
モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）感染症の発病過程を理解し、そのような感染症に対する有用な治療用および予防用手段を開発する試みにおいて、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の外部表面成分の研究が行われている。特に、その外膜タンパク質（OMP）は、考えうるビルレンス因子および潜在的なワクチン抗原として、かなり注目されている。モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）は、約10〜20個の異なるOMPを有し、これらのうちの6〜8個のOMP（OMP A〜H）が優勢な種である（MurphyおよびLoeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174）。OMP A〜Hの分子量は、それぞれ、97〜20kDの範囲にある。BartosおよびMurphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765; Helminenら，1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Murphyら，1993, Molecul. Microbiol. 10:87-97; およびSarwarら，1992, Infect. Immun. 60:804-809を参照されたい。50株のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）からの外膜調製物のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）のタンパク質プロフィールの比較は、OMP A〜Hのほぼ均一なパターンを示している（BartosおよびMurphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765）。
OMP A〜Hに加え、SDS-PAGEにより350〜720kDの見掛け分子量を有するHMW-OMPと称される高分子量OMPも、多数のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株に存在するもう１つの優勢な表面成分として同定されている。HMW-OMPは、ギ酸による変性に際して、120〜140kDの単一のバンドを生じるため、オリゴマータンパク質であると思われる（KlingmanおよびMurphy, 1994, Infect. Immun. 62:1150-1155）。HMW-OMPは、Helminenら（1994, J. Infect. Dis. 170:867-872）によりUspAと称されており多数のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株に存在することが示されているタンパク質と同じタンパク質であると思われる。
無傷の細菌中または細菌由来の外膜小胞中において前記OMPのいくつかは、該OMPに結合する抗体の産生を惹起する表面露出エピトープを呈示する。これらの抗原性OMPには、OMP EおよびOMP G（MurphyおよびBartos, 1989, Infect. Immun. 57:2938-2941）、OMP C/D（Sarwarら，1992,Infect. Immun. 60:804-809）、CopB、80kDのOMP（Helminenら，1993, Infect. Immun. 61:2003-2010）、およびUspA（Helminenら，1994, J. Infect. Dis. 170:867-872）が含まれる。
CopBおよびUspAの表面露出エピトープに対する抗体の潜在的治療能力が、動物モデルにおいて評価されている。該モデルは、制御された数のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞をBALB/cVAF/Plusマウスの肺に直接的にボーラス接種し、次いで該細菌の肺クリアランス率を検査することを含むものであった（Unhanandら，1992, J. Infect. Dis. 165:644-650）。感染部位への顆粒球のリクルートメントのレベルと相関するクリアランス率は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の臨床分離株によって異なることが示された。CopBまたはUspAのいずれかの表面露出エピトープに対するモノクローナル抗体による受動免疫は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の肺クリアランス率を増加させた（Helminenら，1993, J. Infect. Immun. 61:2003-2010; Helminenら，1994, J. Infect. Dis. 170:867-872）。
２．２．細菌／宿主細胞の付着および赤血球凝集
宿主細胞表面に対する細菌病原体の付着は、定着（colonization）を促進し、病理発生を開始させる。E.H. Beachey, 1981, J. Infect. Dis. 143:325-345を参照されたい。グラム陰性菌は、典型的には、宿主細胞表面上の糖タンパク質および／または糖脂質の特定のオリゴ糖に結合する表面レクチンを発現する。そのようなレクチンは、しばしば、線毛（piliまたはfimbriae）と結合する。また、細菌の付着は、宿主細胞表面との疎水性および／または荷電相互作用から生じる非特異的結合により生じることもある。
気道の細胞に対するモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の付着のメカニズムは、まだ十分には理解されていない。該生物は、培養されたヒト口腔咽頭上皮細胞に付着する（Mbakiら，1987, Tohuku J. Exp. Med. 153:111-121）。Rikitomiらの研究は、抗線毛抗体による線毛の変性または処理が線毛化（fimbriated）株による付着を減少させたため、線毛が、そのような細胞に対する付着において何らかの役割を果たしている可能性があることを示唆している（Rikitomiら，1991, Scand. J. Infect. Dis. 23:559-567）。しかしながら、調査したいくつかの株の中で最も高度に付着する株は非線毛化株であったため、フィムブリエに媒介される結合が、この付着の唯一の原理であるとは考えられない。
細菌付着因子の分類においては、赤血球凝集反応が、より複雑な付着アッセイの代わりに用いられることが多い。しかしながら、Rikitomiらは、ヒト口腔咽頭上皮細胞に対する付着とモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）による赤血球凝集との間に何ら相関性を見出さなかった（前掲誌）。すなわち、３個の高度に付着する株は、ヒト赤血球を凝集させなかった。したがって、異なる結合メカニズムが、ヒト口腔咽頭上皮細胞に対する付着および赤血球凝集反応に関与している。
これに対して、Kellensらによる最近の研究は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）による赤血球凝集が、宿主細胞に対する付着と相関することを示唆している（Kellensら，1995, Infection 23:37-41）。しかしながら、この研究では、ブタ気管切片に対する細菌の結合に基づく付着アッセイを用いている。モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の病原株による付着に関して、ブタ気管組織をヒト気道組織と相同と考えることができるか否かは明らかでない。
この付着アッセイには問題が多いが、Kellensらは、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の八十数個の臨床分離株の赤血球凝集活性を調べている（Kellensら，1995, Infection 23:37-41）。調べた株の約４分の３は、ヒト、ウサギ、モルモット、イヌまたはラット赤血球を凝集させたが、残りの株は凝集させなかった。該赤血球凝集株のいくつかに関する凝集活性がさらに特徴づけられ、それがカルシウムイオン依存性であり、トリプシンによる消化または高温処理またはＤ−グルコサミンまたはＤ−ガラクトサミンの添加により抑制されることが示された。
Tuckerらによる赤血球凝集性および非赤血球凝集性モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株の研究は、糖脂質ガングリオテトラオシルセラミドにはすべての株が結合するが、糖脂質グロボテトラオシルセラミドには赤血球凝集株しか結合しないことを示している（Tuckerら，1994, Annual Meeting of Amer. Soc. Microbiol., Abstract No. D124）。さらに、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の赤血球凝集活性は、グロボテトラオシルセラミドの炭水化物部分を含む種々の単糖により抑制されることが示されている。これらの観察は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）がヒト赤血球などの感受性赤血球の細胞膜中のグロボテトラオシルセラミドに対する結合により赤血球凝集を引き起こすことを、Tuckerらに示唆させることにつながった。現在のところ、先行技術においては、宿主細胞に対する付着または赤血球凝集を引き起こすモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の外表面上の分子は同定されていない。
この節または本出願中の他のいずれかの節におけるいずれかの参照文献の引用または列挙は、そのような参照文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを示すものであるとみなしてはならない。
３．発明の概要
本発明は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）のOMP106ポリペプチドおよびOMP106由来ポリペプチド、ならびに該ポリペプチドの製造法を含む。本発明はまた、OMP106ポリペプチドおよび／またはOMP106由来ポリペプチドに特異的な抗血清および抗体（細胞傷害性抗体など）を含む。本発明はさらに、該ポリペプチドの１以上を含んでなる予防用または治療用の免疫原性組成物（ワクチンなど）を含む。本発明はまた、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はさらに、弱毒化または不活化非赤血球凝集性モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）品種を含んでなる予防用または治療用の免疫原性組成物（ワクチンなど）を含む。
本発明は、多数の有用性を有する。例えば、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）感染に応答して惹起される抗体を検出するための（例えば、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）感染の診断における）リガンドとして、OMP106ポリペプチドおよびOMP106由来ポリペプチドを使用することができる。また、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）特異的抗体を誘導するための免疫原としても、OMP106ポリペプチドおよびOMP106由来ポリペプチドを使用することができる。そのような抗体は、生物学的試料中のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）を検出するためのイムノアッセイにおいて有用である。本発明の細胞傷害性抗体は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）感染に対する受動免疫において有用である。さらに、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）感染に対するワクチン中の有効成分として、OMP106ポリペプチドおよびOMP106由来ポリペプチドを使用することができる。
本発明は、赤血球凝集性モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株および品種が、分子量約180kD〜約230kDの外膜タンパク質であるOMP106ポリペプチドを有し、非赤血球凝集性モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株および品種が、OMP106ポリペプチドを有さないか、または赤血球凝集に不活性で銀染色不能な不適当に修飾されたOMP106ポリペプチドを有するという驚くべき知見に基づく。本発明はさらに、赤血球凝集性モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株から単離されたOMP106ポリペプチドにより誘導されるポリクローナル抗血清が、別の赤血球凝集性モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株に対しては細胞傷害性活性を有するが、非赤血球凝集性モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株に対しては細胞傷害性活性を有さないという知見に基づく。
３．１．定義および略語
抗OMP106＝抗OMP106ポリペプチド抗体または抗血清
ATCC＝American Type Culture Collection
ブレブ（blebs）＝モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の天然に生じる外膜小胞
Gb₄＝GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc1-1セラミド
HA＝赤血球凝集性
免疫反応性＝細胞性免疫応答または体液性免疫応答を引き起こす能力を有する
kD＝キロダルトン
モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）＝Mc、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、モラクセラ（ブランハメラ）・カタラーリス（Moraxella（Branhamella）catarrhalis）、ブランハメラ・カタラーリス（Branhamella catarrhalis）、ナイセリア・カタラーリス（Neisseria catarrhalis）またはミクロコッカス・カタラーリス（Micrococcus catarrhalis）
NHA＝非赤血球凝集性
OG＝ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドまたはオクチルグルコシド
OMP106＝SDS-PAGEにより約180kD〜230kDの分子量を有し、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）のブレブまたは無傷細胞からOGまたはサルコシル界面活性剤により抽出可能な、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）の外膜タンパク質−106ポリペプチド
OMP106由来ポリペプチド＝OMP106ポリペプチドの断片；アミノ酸の欠失、挿入または置換の１以上を含有する野生型OMP106ポリペプチドの変異体またはその断片：またはOMP106ポリペプチドの全部または一部のＣ末端またはＮ末端または内部セグメントに融合した異種ポリペプチドを含むキメラタンパク質
OMP＝外膜タンパク質
OMPs＝外膜タンパク質類
PBS＝リン酸緩衝食塩水
PAG＝ポリアクリルアミドゲル
ポリペプチド＝任意の長さのペプチド、好ましくは、10個以上のアミノ酸残基を有するペプチド
SDS＝ドデシル硫酸ナトリウム
SDS-PAGE＝ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
本発明で定義されるヌクレオチドまたは核酸配列は、塩基に関する以下の１文字の記号で表される。
Ａ（アデニン）
Ｃ（シトシン）
Ｇ（グアニン）
Ｔ（チミン）
Ｕ（ウラシル）
Ｍ（ＡまたはＣ）
Ｒ（ＡまたはＧ）
Ｗ（ＡまたはT/U）
Ｓ（ＣまたはＧ）
Ｙ（ＣまたはT/U）
Ｋ（ＧまたはT/U）
Ｖ（ＡまたはＣまたはＧであり、T/Uではない）
Ｈ（ＡまたはＣまたはT/Uであり、Ｇではない）
Ｄ（ＡまたはＧまたはT/Uであり、Ｃではない）
Ｂ（ＣまたはＧまたはT/Uであり、Ａではない）
Ｎ（ＡまたはＣまたはＧまたはT/U）または（不明）
本発明で定義されるペプチドおよびポリペプチド配列は、アミノ酸残基に関する以下の１文字の記号で表される。
Ａ（アラニン）
Ｒ（アルギニン）
Ｎ（アスパラギン）
Ｄ（アスパラギン酸）
Ｃ（シトシン）
Ｑ（グルタミン）
Ｅ（グルタミン酸）
Ｇ（グリシン）
Ｈ（ヒスチジン）
Ｉ（イソロイシン）
Ｌ（ロイシン）
Ｋ（リシン）
Ｍ（メチオニン）
Ｆ（フェニルアラニン）
Ｐ（プロリン）
Ｓ（セリン）
Ｔ（トレオニン）
Ｗ（トリプトファン）
Ｙ（チロシン）
Ｖ（バリン）
Ｘ（不明）
以下の発明の詳細な説明、本発明の特定の実施態様の非限定的な実施例、および添付図面を参照することにより、本発明に対する理解はより完全なものとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１：モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ブレブまたは全モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞のオクチルグルコシド（OG）抽出物の外膜タンパク質プロフィールの変性PAGEによる比較。レーン上の数字は、ATCC株の名称を意味する。予め染色されたSDS-PAGE基準（BioRadカタログ#161-0305）を、分子量マーカーとして使用した。該基準は、括弧内に示すおよその分子量を有する以下のポリペプチドよりなるものであった：ウサギ筋ホスホリラーゼＢ（106kD）、ウシ血清アルブミン（80kD）、ニワトリ卵白オボアルブミン（49.5kD）、ウシカルボニックアンヒドラーゼ（32.5kD）、ダイズトリプシンインヒビター（27.5kD）、ニワトリ卵白リゾチーム（18.5kD）。ゲル内の分子量マーカーの位置は矢印により図の左側に示されており、該マーカーのいくつかの分子量（kD）が該矢印の上に付されている。
図２：¹²⁵Iで標識された外膜ブレブを有する糖脂質の重層薄層クロマトグラムからの結果。パネルＡ〜Ｃのレーン１は、左側に示されている糖脂質基準を含有する。レーン２はアシアロ−GM₁を含有し、レーン３はGb₃、Gb₄およびフォルスマン抗原を含有し、レーン４は、ヒト赤血球のフォルチ抽出物を含有する。パネルＡに示すクロマトグラムは、オルシノールで染色されており、パネルＢに示すクロマトグラムは、ATCC 8176株（非赤血球凝集性株）の¹²⁵I標識ブレブで重層されており、パネルＣに示すクロマトグラムは、ATCC 49143株（赤血球凝集性株）の¹²⁵I標識ブレブで重層されている。赤血球凝集性株だけが、第３および第４レーン中のGb₄糖脂質バンドに結合した
図３：図中に示されているプロテアーゼでモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞を消化した後、外膜タンパク質のオクチルグルコシド抽出物を銀染色することによるタンパク質プロフィール。該消化後の該細胞の赤血球凝集活性を、図の下のHAと表示している列に示す。使用した分子量マーカーは、図１のとおりである。
図４：モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の種々のATCC株からの外膜タンパク質の銀染色によるタンパク質プロフィールの比較。株の名称をレーンの上に示す。該株の赤血球凝集活性を、図の下のHAと表示した列に示す。ウサギ筋ホスホリラーゼＢの見掛け分子量（106kD）を超える見掛け分子量を有するタンパク質は、赤血球凝集性株には共通しているが、非赤血球凝集性株には存在しないことに注目されたい。このポリペプチドは、OMP106と称される。使用した分子量マーカーは、図１のとおりである。
図５：モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ATCC49143の２個の品種[49143（赤血球凝集性品種）および49143-NHA（非赤血球凝集性品種）]の外膜タンパク質の銀染色によるタンパク質プロフィールの比較。該品種の赤血球凝集活性を、図の下のHAと表示した列に示す。該非赤血球凝集性品種にはOMP106ポリペプチドのバンド（<で示されている）が存在しないことに注目されたい。使用した分子量マーカーは、図１のとおりである。
図６：ゲルに適用する前に25℃または100℃でサンプル緩衝液中でインキュベートしたATCC 49143株のOG抽出物を使用する、6％変性ポリアクリルアミドゲルにおけるOMP106の分子量の推定。該ゲル中のタンパク質は、還元銀染色により可視化した。OMP106ポリペプチドのバンド（<で示されている）が、100℃でインキュベートしたサンプルでしか認められないことに注目されたい。広領域SDS-PAGE基準（BioRadカタログ#161-0317）を、分子量マーカーとして使用した。該基準は、以下のポリペプチド（およその分子量を括弧内に示す）よりなるものであった：ウサギ骨格筋ミオシン（200kD）、大腸菌（E. coli）β−ガラクトシダーゼ（116kD）、ウサギ筋ホスホリラーゼＢ（97.4kD）、ウシ血清アルブミン（66.2kD）。該ゲル中の分子量マーカーの位置を、矢印により図の右側に示し、該マーカーの分子量（kD）を該矢印の上に示す。
図７：Mc5-72で釣りあげたモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）染色体ＤＮＡのDraIおよびHindIII制限エンドヌクレアーゼ消化物のサザンブロット分析。モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）49143株のＤＮＡをDraIまたはHindIIIで消化した。消化されたＤＮＡのサザン分析を、プローブとしてMc5-72（配列番号４）を使用して行なった。高いストリンジェンシーの洗浄は、2×SSC、1％SDS（50℃で約20〜約30分）であった。レーン１はHindIII消化物を含有し、ハイブリダイズしているバンドは約8.0kBのサイズを有する。レーン２はDraI消化物を含有し、ハイブリダイズしているバンドは約4.2kBのサイズを有する。
図8Aおよび8B：OMP106に対するウサギ抗血清をプローブとして使用する、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）および関連種のタンパク質抽出物のウエスタンブロット（図8A）（該ウサギをOMP106で免疫する前の該血清の反応性（図8B）と比較されている）。図8Aおよび8Bのレーン中のサンプルは、以下のとおりである：レーンＡ、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）；レーンＢ、モラクセラ・オビス（Moraxella ovis）；レーンＣ、モラクセラ・ラクナータ（Moraxella lacunata）；レーンＤ、モラクセラ・オスロエンシス（Moraxella osloensis）；レーンＥ、モラクセラ・ボビス（Moraxella bovis）；レーンＦ、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）；レーンＧ、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）。使用した分子量マーカーは、図１のとおりである。
図9A：モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ATCC 49143からのOMP106ポリペプチドに対するウサギ抗血清が、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の多数のHAおよびNHA株中の同様の分子量のポリペプチドと交差反応することを示すウエスタンブロット（OMP106ポリペプチドの位置を、矢印で示す）。該ウエスタン分析では、種々のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株のオクチルグルコシド抽出物を調べた。該株のATCC受託番号を、レーンの上に示す。用いたトランスファーおよびウエスタンブロットの方法は、図８に示すブロットを得るために用いた方法と同じであった。
図9B：図9Aで使用したものに対応する免疫前血清を使用する、図9Aと同じ抽出物のウエスタンブロット。
５．発明の詳細な説明
５．１．赤血球凝集性品種および非赤血球凝集性品種
本発明は、単離された又は実質的に純粋な、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）のOMP106ポリペプチドを提供する。該OMP106ポリペプチドは、赤血球凝集性（HA）株および多数の非赤血球凝集性（NHA）株およびモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）品種の外膜中に包埋された又は該外膜の外表面上に局在する、全タンパク質または該タンパク質のサブユニットを含む。OMP106は、該HA株および品種の赤血球凝集表現型に直接的または間接的に関与する。本発明によれば、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞は、標準的な任意の赤血球凝集アッセイ（例えば、Soto-Hernandezら，1989, J. Clin. Microbiol. 27:903-908に教示されているもの）において、ヒトまたはウサギの赤血球を凝集させる。いずれかの特定の作用メカニズムに限定されることを意図するものではないが、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）は、宿主細胞表面上の糖脂質および糖タンパク質受容体のグロボテトロース（Gb₄）部分に結合することにより赤血球を凝集させ、該赤血球凝集活性は、１つには、銀染色に感受性であるという特有の性質を有する、適当に修飾されたOMP106ポリペプチドにより媒介されると現在考えられている。これに対して、未修飾または不適当に修飾されたOMP106ポリペプチドは、赤血球凝集の媒介において活性でなく、銀染色も不可能である。さらに、OMP106ポリペプチドは、HAまたはNHAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ブレブまたは無傷細胞からOGまたはサルコシルで抽出可能な、SDS-PAGEにおいて約180kD〜約230kDの見掛け分子量を有する唯一のポリペプチドである。
HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞の赤血球凝集活性は、グロボテトロース（GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1；Gb₄）と、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトースおよびグルコースならびにそれらの誘導体（例えば、メチル−α−ガラクトースまたはメチル−β−ガラクトース）などの、Gb₄を構成する単糖とにより阻害される。また、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞の赤血球凝集活性は、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｄ−グルコースおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンなどの（これらに限定されるものではない）比較的により高濃度の多数の他の糖により阻害される。
無傷HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞の赤血球凝集活性およびOMP106ポリペプチドは共に、TLCK（Ｎα−ｐトシル−Ｌ−リシン クロロメチルケトン［１−クロロ−３−トシルアミノ−７−アミノ−Ｌ−２−ヘプタノンとしても公知である]）で処理されたキモトリプシン、プロテイナーゼＫおよびTPCK（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニン クロロメチルケトン）で処理されたトリプシンなどの（これらに限定されるものではない）種々のプロテアーゼによる無傷モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞の消化により減少するか又は損なわれる。しかしながら、プロテアーゼV8での無傷HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞の消化は、赤血球凝集活性にも、そのような細胞のOMP106ポリペプチドの物理的完全性にも影響を及ぼさない。
非赤血球凝集性（NHA）品種は、静置液体培養（すなわち、振とう無しで35℃で維持する液体培養）内での連続継代により、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種から誘導することができる。例えば、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種を、Mueller Hintonブロス内で増殖させ、５日毎に該静置培養の表面から接種物を採取して、後続の静置培養に接種する。好ましい接種物は、該培養の表面における細胞の任意の浮遊マットである。NHA品種が産生されるまで、静置培養内での継代を維持する。モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）感染症に対する防御ワクチン（例えば、全細胞ワクチン）を製造するために、本発明のNHA品種を使用することができる。
これに対して、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種の赤血球凝集表現型は、振とう液体培養内で該株または品種を継代することにより維持することができる。１つの実施態様では、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種を、約200RPMで振とうしながら、Mueller Hintonブロス中、35〜37℃で増殖させ、24〜48時間毎に継代する。また、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種の赤血球凝集表現型は、固形培地上で継代することにより維持することができる。例えば、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種を、血液寒天またはMueller Hinton寒天を含有するプレート上で増殖させる。
５．２．OMP106ポリペプチド
本発明のOMP106ポリペプチドは、SDS-PAGEにおいて約180kD〜約230kD、好ましくは約190kDの見掛け分子量を有するHAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種の唯一の外膜タンパク質である。本発明によれば、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の外膜タンパク質は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ブレブ中に存在するか、又は緩衝溶液中のｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（OG）またはサルコシル界面活性剤により室温でモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ブレブまたは無傷細胞から抽出されうるポリペプチドである。モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の外膜よりなる天然に生じる小胞であるモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ブレブを検討するには、MurphyおよびLoeb, 1989, Microbial Pathogenesis 6:159-174を参照されたい。NHAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種は、OMP106ポリペプチドを有しないか、または抗OMP106抗体に結合するが（後記第5.5節を参照されたい）銀染色剤と反応しない（すなわち、BioRad[Richmond, CA]のSilver Stain PlusまたはGottliebおよびChauko, 1987, Anal. Biochem. 165:33に記載されている方法を用いた場合）形態のOMP106ポリペプチドを有する。これに対して、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種からのOMP106ポリペプチドは、抗OMP106抗体に結合し、銀染色剤と反応する。
OMP106ポリペプチドは、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ブレブまたは無傷細胞中で同定することができ、これは、同じHA株の赤血球凝集活性を損なうか又は弱めるプロテアーゼ処理による分解に対するその感受性により行なうことができる（無傷モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞の赤血球凝集活性を損なうか又は損なわないプロテアーゼの具体例に関しては、前記第5.1節を参照されたい）。すなわち、HA株または品種の赤血球凝集活性を損なうか又は減少させるプロテアーゼでの消化はまた、該消化前に同じ株または品種から単離されたOMP106ポリペプチドの存在量または位置と比べて、そのような消化の後に該株または品種から単離されたOMP106ポリペプチドの存在量または位置をSDS-PAGEにおいて変化させるであろう。
また、OMP106ポリペプチドは、HarlowおよびLane（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Appendix I, 1988）に記載されている組成を用いるSDSを含有する12％PAG中の変性ゲル電気泳動による測定で106kD以上の見掛け分子量を有する、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ブレブまたは無傷細胞のOGまたはサルコシル抽出物中のポリペプチドとして同定することができる。OGまたはサルコシル抽出物を100℃で５分間熱処理すると、OMP106ポリペプチドは、HarlowおよびLane（前掲）に記載されている組成を使用し、還元剤を全く使用しない6％PAG中のSDS-PAGEによる測定で約180kD〜約230kDの見掛け分子量を有するに至ることがある。ある特定の実施態様では、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ATCC 49143株の熱処理されたOGまたはサルコシル抽出物中のOMP106ポリペプチドは、約190kDの見掛け分子量を有する。
特定の実施態様では、OMP106ポリペプチドは、ATCC 49143、ATCC 25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627およびATCC 43628などのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株のいずれかから調製されたものであるが、これらに限定されるものではない。OMP106ポリペプチドの好ましい起源は、そのような株のHA品種である。より好ましい起源は、ATCC 49143のHA品種である。
ある特定の実施態様では、OMP106ポリペプチドは、好ましくはアミノ末端に、アミノ酸配列：
IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV（配列番号１）またはそれと実質的に相同な配列を含む。OMP106ポリペプチドは、さらに、アミノ酸配列GTVLGGKK（配列番号２）またはそれと実質的に相同な配列を有するオクタペプチドを、前記配列のカルボキシル末端に含むことが可能である。本発明で用いる実質的に相同なアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも80％、好ましくは100％同一である。
本発明の種々の態様では、本発明のポリペプチドは、既知分子量マーカーの泳動に対するSDS-PAGE中の該ポリペプチドの泳動に基づくそれらの見掛け分子量により特性づけられる。当該技術分野で公知の任意の分子量基準をSDS-PAGEで使用することができるが、好ましい分子量マーカーは、少なくとも、ウサギ骨格筋ミオシン、大腸菌（E. coli）β−ガラクトシダーゼおよびウサギ筋ホスホリラーゼＢを含む。当業者であれば、本発明のポリペプチドは、ゲル系の型の相違（例えば、緩衝液の相違、ゲル、架橋剤またはSDSの濃度の相違）に応じて異なって泳動しうることを理解するであろう。また、当業者であれば、該ポリペプチドは、SDS-PAGEで使用する分子量マーカーに応じて異なる見掛け分子量を有する可能性があることを理解するであろう。したがって、本発明のポリペプチドの分子量の特性づけは、該ポリペプチドに関して本明細書に開示されている見掛け分子量と僅かに異なる見掛け分子量を示しうる任意の分子量マーカーによる任意のSDS-PAGE系上の同一ポリペプチドを包含（cover）するように行われると意図される。
５．３．OMP106由来ポリペプチド
本発明のOMP106由来ポリペプチドは、OMP106ポリペプチドの断片であってもよい。完全長OMP106ポリペプチドは、その免疫原性に必要でない１以上のアミノ酸残基を含有しているかもしれない。これは、例えば、OMP106ポリペプチドの或る特定のエピトープを形成するアミノ酸残基だけが免疫原性活性に必要である場合に言えるかもしれない。不必要なアミノ酸配列は、当該技術分野でよく知られている技術により除去することができる。例えば、トリプシン、パパインまたは関連タンパク質分解酵素などの酵素を使用する限定的なタンパク質分解消化、または臭化シアンなどの物質を使用する化学的切断を行ない、ついでその消化産物または切断産物を分画することにより、不要なアミノ酸配列を除去することができる。
また、本発明のOMP106由来ポリペプチドは、修飾されたOMP106ポリペプチドまたはその断片（すなわち、野生型OMP106配列の１以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を有するOMP106ポリペプチドまたは断片）であってもよい。そのような修飾は、得られたポリペプチド産物の免疫原性を増強したり、あるいはそのような活性に何ら影響を及ぼさないものであってもよい。使用しうる修飾技術としては、米国特許第4,526,716号に開示されている技術を挙げることができる。
さらに、OMP由来ポリペプチドは、完全なOMP106ポリペプチドまたはその一部もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシル末端または内部に融合した１以上の異種ポリペプチドを含むキメラポリペプチドであってもよい。そのようなキメラポリペプチドを含む有用な異種ポリペプチドとしては、a）宿主細胞中でのOMP106由来ポリペプチドの輸送、トランスロケーションおよび／またはプロセシングを促進するプレおよび／またはプロ配列、b）アフィニティー精製配列、およびc）有用な任意の免疫原性配列（例えば、微生物病原体の表面露出タンパク質のエピトープの１以上をコードする配列）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
好ましくは、本発明のOMP106由来ポリペプチドは、OMP106ポリペプチドと免疫学的に交差反応性であり、したがってモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）に対する免疫応答を動物中に惹起する能力を有する。より好ましくは、本発明のOMP106由来ポリペプチドは、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の天然OMP106ポリペプチドの外表面エピトープ（すなわち、無傷モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞中に存在するOMP106ポリペプチドの表面露出エピトープ）の１以上を形成する配列を含む。そのような好ましいOMP106由来ポリペプチドは、無傷モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞に対して産生された抗体（例えば、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドで固定されたモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞により惹起された抗体；そのような抗体を本明細書中では「抗全細胞」抗体と称することにする）に対するその特異的結合能により同定することができる。例えば、OMP106ポリペプチドの限定的または完全なプロテアーゼ消化からのポリペプチドまたはペプチドを、標準的な方法を用いて分画し、抗全細胞抗体に対するそれらの結合能に関して試験する。反応性ポリペプチドは、好ましいOMP106由来ポリペプチドを含む。当該技術分野で公知の方法により、それらを単離し、それらのアミノ酸配列を決定する。
また、好ましくは、本発明のOMP106由来ポリペプチドは、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞による赤血球凝集を媒介する天然OMP106ポリペプチドのエピトープの１以上を形成する配列を含む。そのような好ましいOMP106由来ポリペプチドは、それがHAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞による赤血球凝集を妨害する能力により同定することができる。例えば、OMP106ポリペプチドの限定的もしくは完全なプロテアーゼ消化または化学的切断からのポリペプチドを、標準的な方法を用いて分画し、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞による赤血球凝集を妨害する能力に関して試験する。同定および単離を行なったら、そのような好ましいOMP106由来ポリペプチドのアミノ酸配列を、標準的な配列決定方法を用いて決定する。その決定された配列を使用すれば、そのようなポリペプチドを合成化学および／または遺伝子工学的手段により製造することが可能となる。
また、抗全細胞抗体を使用して、OMP106ポリペプチドをコードするモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ゲノムＤＮＡのランダムな断片またはクローン化ヌクレオチド配列を発現する細菌ライブラリーをスクリーニングすることにより、これらの好ましいOMP106由来ポリペプチドを同定することができる。例えば、Sambrookら，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版，Cold Spring Harbor Press, NY, Vol. 1, 第12章を参照されたい。該反応性クローンを同定し、それらのインサートを単離し、配列決定して、そのような好ましいOMP106由来ポリペプチドのアミノ酸配列を決定する。
５．４．OMP106ポリペプチドおよびOMP106由来ポリペプチドの単離および精製
本発明は、単離されたOMP106ポリペプチドおよびOMP106由来ポリペプチドを提供する。本発明で用いる「単離（された）」なる語は、該産物が、それと天然で結合している他の生物学的物質を有意に含有しないことを意味する。すなわち、例えば、単離されたOMP106ポリペプチド組成物は、約70重量％〜94重量％純粋なOMP106ポリペプチドである。好ましくは、本発明のOMP106ポリペプチドおよびOMP106由来ポリペプチドは、精製されている。本発明で用いる「精製（された）」なる語は、該産物が、それと天然で結合している他の生物学的物質を実質的に含有しないことを意味する。すなわち、精製されたOMP106ポリペプチド組成物を含むとは、少なくとも95重量％純粋なOMP106ポリペプチド、好ましくは、少なくとも98重量％純粋なOMP106ポリペプチド、最も好ましくは、少なくとも99重量％純粋なOMP106ポリペプチドを意味する。
本発明のOMP106ポリペプチドは、任意のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種の全細胞抽出物を含むタンパク質抽出物から単離することができる。好ましくは、該タンパク質抽出物は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）（ATCC 49143、ATCC 25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627およびATCC 43628株のいずれかを含むが、これらに限定されるものではない）の外膜小胞（すなわち、ブレブ）または全細胞のオクチルグルコシドまたはサルコシル抽出物である。そのような抽出物の好ましい起源は、そのような株のHA品種である。そのような抽出物のより好ましい起源は、ATCC 49143のHA品種である。OMP106ポリペプチドのもう１つの起源は、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドをコードするクローン化配列を発現する遺伝子発現系からのタンパク質調製物である（後記第5.8節を参照されたい）。
OMP106ポリペプチドは、当業者によく知られている任意の生化学的技術およびアプローチを用いて、それらの起源物質から単離し精製することができる。１つのアプローチでは、標準的な技術によりモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）外膜を得、界面活性剤などの可溶化化合物を使用して外膜タンパク質を可溶化する。好ましい可溶化溶液は、約1.25％（w/v）のオクチルグルコピラノシド（OG）を含有する可溶化溶液である。もう１つの好ましい可溶化溶液は、約1.25％のサルコシルを含有する可溶化溶液である。OMP106ポリペプチドは、可溶化画分中に存在する。該抽出物中の細胞破片および不溶性物質を、好ましくは遠心分離により、分離し、除去する。該抽出物中のポリペプチドを濃縮し、SDS含有Laemmliゲルサンプル緩衝液中、100℃で５分間インキュベートし、ついで還元剤を含まない６％変性ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル（PAG）中の電気泳動により分画する。Laemmli, 1970, Nature 227:680-685を参照されたい。ついで、前記のとおりにOMP106ポリペプチドと同定されたバンドまたは画分（例えば、HAのOGまたはサルコシル抽出物中には存在するが、対応するNHA品種のOGまたはサルコシル抽出物中にも、赤血球凝集活性を損なうプロテアーゼで消化した後のHA品種のOGまたはサルコシル抽出物中にも存在しない、銀染色されたポリペプチドバンド）を、OMP106ポリペプチドを含有する画分またはゲル切片から直接単離することができる。好ましい実施態様では、OMP106ポリペプチドは、変性SDS-PAGE中のその泳動距離または速度をウサギ骨格筋ミオシン（200kD）および大腸菌（E. coli）β−ガラクトシダーゼ（116kD）と比較することにより測定した場合に、190kDの見掛け分子量を有する。
OMP106ポリペプチドを精製するもう１つの方法は、抗OMP106抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによるものである（第5.5節を参照されたい）。好ましくは、モノクローナル抗OMP106抗体を使用する。該抗体は、臭化シアンまたはスクシンアミドエステルにより、あるいは当業者に公知の他の方法により活性化されたアガロースゲル（Affi-Gel, BioRad, Inc.）に共有結合させる。該タンパク質抽出物を、前記のとおりにゲル上にのせる。該接触は、OMP106ポリペプチドが該抗体に結合するのに十分な時間および標準的な反応条件下で行なう。好ましくは、該固体支持体は、クロマトグラフィーカラム中で使用する物質である。ついでOMP106ポリペプチドを該抗体から取り出し、それにより、単離された、または好ましくは精製された形態のOMP106ポリペプチドの回収が可能となる。
本発明のOMP106由来ポリペプチドは、単離または精製されたOMP106ポリペプチドの化学的および／または酵素的切断あるいは分解により製造することができる。また、OMP106由来ポリペプチドは、OMP106ポリペプチドの公知アミノ酸配列に基づき、また、キメラポリペプチドの場合には、異種ポリペプチドの公知アミノ酸配列に基づき、当該技術分野でよく知られている方法により化学的に合成することができる。例えば、Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NYを参照されたい。
また、OMP106由来ポリペプチドは、OMP106由来ポリペプチドをコードする配列を含む組換えヌクレオチド構築物を発現する遺伝子発現系において製造することができる。本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当業者によく知られている技術に従い合成し、および／または、クローニングし、発現させることができる。例えば、Sambrookら，1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY, 第９章を参照されたい。
本発明のOMP106由来ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を適用することにより分画し、精製し、本明細書に記載の知見および教示に従い修飾し、適用することができる。特に、本発明の好ましいOMP106ポリペプチド、すなわち、天然OMP106ポリペプチドの外表面エピトープを形成するOMP106ポリペプチドは、OMP106ポリペプチドの単離および精製に関して前記したアフィニティー法（例えば、抗OMP106抗体を使用するアフィニティー精製）に従い単離し、精製することができる。
所望により、本発明のポリペプチドを、電気泳動、遠心分離、ゲル濾過、沈殿、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸着アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、ゲル浸透高速液体クロマトグラフィーなど）、等電点焦点化法ならびにそれらの変法および組合わせを含む（これらに限定されるものではない）標準的なタンパク質またはペプチド精製技術を用いてさらに精製することができる。
分子をその物理的または化学的特性に応じて分離するように設計された方法において、これらの技術の１以上を連続的に使用することができる。これらの特性には、該タンパク質の疎水性、電荷、結合能および分子量が含まれる。それぞれの技術を適用した後で得られた物質の種々の画分を、OMP106受容体もしくはリガンドに対するそれらの結合能、抗OMP106抗体に対するそれらの結合能、またはそれらがHAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞による赤血球凝集を阻害する能力（「試験」活性）に関して試験する。ついで、そのような活性を示す画分を、連続的な方法の後続の技術に付し、新たな画分を再び試験する。前記の「試験」活性を有する唯一の画分が残り、その画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動またはクロマトグラフィーに付した場合に、その画分が単一のバンドまたは構成要素だけを産生するようになるまで、この方法を繰返す。
５．５．OMP106免疫原および抗OMP106抗体
本発明は、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。そのような抗体の製造には、単離された、好ましくは精製された、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドの調製物を、免疫原として使用する。
１つの実施態様では、HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞またはブレブの外膜のOGまたはサルコシル抽出物中に存在する他の外膜タンパク質から、OMP106ポリペプチドをSDS-PAGE（前記第5.2節を参照されたい）により分離し、OMP106ポリペプチドを含有するゲル切片を免疫原として使用しウサギに注射して、ポリクローナルOMP106抗体を含有する抗血清を産生させる。モノクローナル抗OMP106抗体を産生するハイブリドーマ系の作製のためにマウスを免疫するために、同じ免疫原を使用することができる。特定の実施態様では、ATCC 49143、ATCC 25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627およびATCC 43628株のいずれかから単離または精製されたOMP106を含有するPAG切片を免疫原として使用する。好ましい実施態様では、そのような株のHA品種から単離または精製されたOMP106を含有するPAG切片を使用する。より好ましい実施態様では、ATCC 49143株のHA品種から単離または精製されたOMP106を含有するPAG切片を免疫原として使用する。
他の実施態様では、OMP106ポリペプチドのペプチド断片を免疫原として使用する。好ましくは、精製されたOMP106ポリペプチドのペプチド断片を使用する。該ペプチドは、単離または精製されたOMP106ポリペプチドのプロテアーゼ消化、化学的切断、あるいは化学合成により製造することができ、ついで単離または精製することができる。そのような単離または精製されたペプチドを免疫原として直接使用することができる。特定の実施態様では、有用なペプチド断片には、配列IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV（配列番号１）または６以上のアミノ酸長のその任意の部分を有するペプチド断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。もう１つの実施態様では、該ペプチド断片は、配列GTVLGGKK（配列番号２）を有する。
また、有用な免疫原は、担体分子、好ましくは担体タンパク質に結合した該ペプチドまたはペプチド断片を含むことが可能である。担体タンパク質は、免疫学において一般に使用される任意の担体タンパク質であることが可能であり、ウシ血清アルブミン（BSA）、ニワトリアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。ハプテンタンパク質結合体を検討するには、例えば、Hartlowら，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988、またはRoitt, I. ら，IMMUNOLOGY, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO（1985）またはKlein, J., IMMUNOLOGY, Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, MA, （1990）などの標準的な免疫学のテキストを参照されたい。
さらにもう１つの実施態様では、天然OMP106ポリペプチドの外表面エピトープの１以上に特異的に結合する抗体を製造するために、無傷HAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞またはそれから調製したブレブを免疫原として使用する。免疫前に、該細胞またはブレブをホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどの物質で固定することができる。HarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1988, 第15章を参照されたい。そのような抗全細胞抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。精製されたOMP106ポリペプチドをスクリーニングリガンドとして使用することにより、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ系を同定することができる。これらの抗体を誘導するためには、任意のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株（ATCC 49143、ATCC 25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627およびATCC 43628を含むが、これらに限定されるものではない）の細胞またはブレブを免疫原として使用する。好ましくは、そのような株のHA品種の細胞またはブレブを免疫原として使用する。より好ましくは、これらの抗体を誘導するための免疫原として、ATCC 49143株のHA品種の細胞またはブレブを使用する。
全細胞またはブレブでの免疫により産生されたポリクローナル抗体は、他のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）外膜タンパク質に結合する抗体（「非抗OMP106抗体」）を含有するため、該サンプルが、他のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）外膜タンパク質または他のこれらの外膜タンパク質と交差反応する物質を含有することが既知であるか又はその疑いがある場合には、該ポリクローナル抗体の使用はより厄介なものとなる。そのような場合には、ある与えられたサンプルまたはバンドの抗全細胞抗体によるいずれかの結合を、OMP106ポリペプチドおよび／またはOMP106由来ポリペプチドに特異的に結合する抗体（例えば、抗OMP106）による同じサンプルまたはバンドの同時結合により、あるいは抗OMP106抗体、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチド（競合体として）を使用する競合試験により確認しなければならない。（すなわち、抗OMP106抗体、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドを該反応混合物に加えると、抗全細胞抗体に対するサンプルの結合が低下するか又は損なわれる）。あるいは、標準的なアプローチおよび方法により、「非抗OMP106」抗体を含有するそのようなポリクローナル抗血清から、そのような抗体を除去することができる。例えば、OMP106ポリペプチドを有することが知られていないNHAモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）品種またはモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株（例えば、ATCC 8176、より好ましくは、ATCC 49143のNHA品種）細胞での沈殿により、あるいはそのような細胞またはそのような細胞の外膜タンパク質を含むカラムに対する吸収により、非抗OMP106抗体を除去することができる。
さらにもう１つの実施態様では、本発明の抗体を惹起するために有用な免疫原は、前記の個々の免疫原のいずれかの２以上の混合物を含む。
本明細書中に前記した免疫原での哺乳動物（好ましくは、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはウマ）の免疫は、ポリクローナル抗体を含有する抗血清またはモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ系を得るための当業者によく知られている以下の方法に従い行なう。
モノクローナル抗体は、本明細書中に含まれる教示で示される標準的な技術により製造することができる。そのような教示は、例えば、米国特許第4,271,145号および米国特許第4,196,265号に開示されている。簡単に説明すると、動物を該免疫原で免疫する。該免疫化動物からの脾細胞を骨髄腫細胞と融合することにより、ハイブリドーマを製造する。該融合産物を、該免疫原に結合する抗体を産生する融合産物に関してスクリーニングする。陽性ハイブリドーマクローンを単離し、それらのクローンから該モノクローナル抗体を回収する。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を産生させるための免疫方法は、当該技術分野でよく知られている。皮下、静脈内、腹腔内、皮内、筋肉内、粘膜またはこれらの組合せを含む多数の経路のいずれかにより、該免疫原を注射することができる。当該技術分野でよく知られている方法および物質を用いて、該免疫原を可溶性形態、凝集物形態で注射したり、物理的担体に結合させたり、あるいはアジュバントと混合することができる。当業者によく知られているカラムクロマトグラフィー法を用いて、該抗血清および抗体を精製することができる。
本発明では、HAまたはNHAのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株のOMP106ポリペプチドは免疫交差反応性である。したがって、１つのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種のOMP106ポリペプチドに対して産生された抗体は、他のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株および品種のOMP106ポリペプチドおよびOMP106由来ポリペプチドに特異的に結合する。例えば、ATCC 49143株のOMP106ポリペプチドにより誘導されたポリクローナル抗OMP106抗体は、同種OMP106ポリペプチド（すなわち、ATCC 49143株のOMP106ポリペプチド）だけでなく、他のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株（ATCC 43628、ATCC 43627、ATCC 43618、ATCC 43617、ATCC 25240およびATCC 25238を含むが、これらに限定されるものではない）のOMP106ポリペプチドおよび／またはOMP106由来ポリペプチドにも特異的に結合する。
本発明の抗体（抗OMP106抗体を含むが、これに限定されるものではない）を使用して、OMP106ポリペプチドおよびOMP106由来ポリペプチドの単離および精製を容易なものとすることができる。また、該抗体は、OMP106ポリペプチドまたはその断片をコードする挿入断片を有する発現ライブラリー中のクローンを同定するためのプローブとして使用することができる。また、生物学的試料中のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）を特異的に検出しおよび／または定量するために、イムノアッセイ（例えば、ELISA、RIA、ウエスタン）において該抗体を使用することができる。本発明の抗OMP106抗体は、OMP106ポリペプチドに特異的に結合し、モラクセラ・オビス（Moraxella ovis）、モラクセラ・ラクナータ（Moraxella lacunata）、モラクセラ・オスロエンシス（Moraxella osloensis）、モラクセラ・ボビス（Moraxella bovis）、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）などの関連細菌病原体からのタンパク質には結合しない。したがって、抗OMP106抗体を使用して、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）感染症を診断することができる。
また、本発明の抗体は、特に、細胞傷害性の抗体を受身免疫で使用して、ヒトを含む動物のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）感染症を予防または軽減することができる（本発明で用いる細胞傷害抗体は、該抗体に結合した細菌のオプソニン作用および／または補体殺傷を増強する抗体である）。本発明の免疫原に対して産生したポリクローナルまたはモノクローナル抗体の有効濃度を宿主に投与して、そのような効果を得ることができる。投与する抗体の厳密な濃度は、それぞれの特異的抗体調製物によって異なるが、当業者によく知られている標準的な技術を用いて決定することができる。種々の技術（ワクチンの運搬に関する第5.6節に記載の技術を含むが、それに限定されるものではない）を用いて、該抗体の投与を行なうことができる。
本発明の抗体の予防および治療効果は、実験動物における標準的な薬学的手法により判定することができる。ヒトに使用する用量範囲の決定において、動物研究から得たデータを利用することができる。
５．６．ワクチン
本発明はまた、動物（哺乳動物、特に齧歯類、霊長類およびヒトを含む）のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）感染症症に対する、治療用および予防用ワクチンを提供する。ワクチンの好適な使用は、ヒトにおいてである。ワクチンは当業者に公知の方法で調製され、例えば免疫原の形の抗原、薬剤学的に許容される担体、おそらく適切なアジュバント、およびおそらくワクチンに常套的に存在する他の物質を含むであろう。ワクチンで使用される免疫原の免疫学的有効量は、本明細書の教示を考慮して当該分野で公知の手段により決定される。
本発明のワクチンは、薬剤学的に許容される担体中のセクション５．５．に開示の任意の免疫原の免疫学的有効量を含む。
別の例によれば、本発明のワクチンは、本発明の不活性化または弱毒化されたＨＡモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）品種またはＮＨＡモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）品種の免疫学的有効量を含む。不活性化または弱毒化されたＨＡモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）品種またはＮＨＡモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）品種は、当該分野で公知の方法（化学処理（ホルマリンなど）、熱処理および放射線照射を含むが、これらに限定されない）を使用して得られる。
「免疫学的有効量」という用語は、本明細書においてモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）感染症を防止するか、またはすでに存在するかまたはその後のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）感染症の重症度を弱めることができる免疫応答を誘導するのに充分な量を意味する。正確な濃度は、投与される特定の免疫原に依存するが、免疫応答の出現を測定するための当業者に公知の標準的方法により決定される。
有用なポリペプチド免疫原は、単離されたＯＭＰ１０６ポリペプチドやＯＭＰ１０６由来ペプチドを含む。好適な免疫原は、精製されたＯＭＰ１０６ポリペプチドおよびＯＭＰ１０６の誘導ポリペプチドまたはペプチドを含む。組合せ免疫原と担体は、水溶液、乳濁液または懸濁液であってよい。一般に、ポリペプチド免疫原の量は、１回投与当たり０．１〜５００μgであろう。担体は当業者に公知であり、安定剤、希釈剤、および緩衝液を含む。適切な安定剤には、炭水化物（例えば、ソルビトール、乳糖、マニトール、デンプン、ショ糖、デキストラン、およびグルコース）、およびタンパク質（例えば、アルブミンまたはカゼイン）がある。適切な希釈剤には、生理食塩水、ハンクス塩、リンゲル液がある。適切な緩衝液には、アルカリ金属リン酸塩、アルカリ金属炭酸塩、またはアルカリ土類金属炭酸塩がある。ワクチンはまた、免疫応答を改善または増強するための１つまたはそれ以上のアジュバントを含有してもよい。適切なアジュバントには、ペプチド；水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；酸化アルミニウム；鉱物油（例えば、Marcol 52）、または植物油、および１つまたはそれ以上の乳化剤、または界面活性剤（例えば、リソレシチン、ポリカチオン、ポリアニオン）から構成される組成物；および有用な可能性のあるヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧおよびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum））があるが、これらに限定されない。ワクチンはまた、他の免疫原を含有してもよい。このようなカクテルワクチンは、１回の投与でいくつかの病原体に対する免疫が得られるという利点を有する。他の免疫原の例は、公知のＤＰＴワクチンで使用されるものである。
本明細書に記載の教示により、本発明のワクチンは当該分野で公知の技術により調製される。一般に免疫原は担体と混合されて、溶液、懸濁液、または乳濁液を形成する。前記添加物の１つまたはそれ以上を担体内に入れてもよく、または逐次添加してもよい。ワクチン調製物は、例えば保存目的のために凍結乾燥してもよい。この場合適切な液体担体を添加して、液体ワクチンに復元してもよい。
このワクチンは、ヒトまたは他の哺乳動物（齧歯類および霊長類を含む）に投与される。これは、１回またはそれ以上の回数投与される。ワクチンは、公知の投与経路で投与される。本明細書に記載のワクチン製剤を導入するために、多くの方法が使用される。これらの方法は、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、および鼻内経路を含むが、これらに限定されない。好適な経路は、筋肉内または皮下注入である。
本発明はまた、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の感染に対して哺乳動物を防御および／またはその疾患を弱めるために、哺乳動物においてモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。この方法は、本発明の免疫原の免疫学的有効量を宿主に投与、好ましくは本発明のワクチンを宿主に投与することを含む。
５．７．OMP106ポリペプチドおよびOMP106由来ポリペプチドをコードする核酸
本発明はまた、OMP106ポリペプチドおよびOMP106由来ポリペプチドをコードする核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡを提供する。１つの面において、本発明の核酸は、当該分野で公知の方法を使用して合成されうる。具体的には、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドの完全なアミノ酸配列の一部を、当業者に公知の技術（例えば、エドマン分解法（例えば、Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., pp. 34-49））を使用して決定してもよい。得られるアミノ酸配列は、通常の化学的アプローチまたは重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用して、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドをコードするＤＮＡの合成のための指針として使用される。
別の面において、アミノ酸配列は、オリゴヌクレオチド混合物の合成のための指針として使用でき、これはまた、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ゲノムライブラリー中のOMP106ポリペプチドコード配列についてスクリーニングするために使用することができる。このようなライブラリーは、任意のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株の細胞からＤＮＡを単離することにより調製されうる。好ましくは、ゲノムライブラリーおよびＰＣＲ増幅の両方のための、OMP106ポリペプチドコード配列の供給源として使用されるＤＮＡは、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株（ATCC49143、ATCC25238、ATCC25240、ATCC43617、ATCC43618、ATCC43627、およびATCC43628を含むが、これらに限定されない）の細胞から調製される。
ゲノムライブラリーの調製において、ＤＮＡ断片が作成され、その一部は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）OMP106ポリペプチドの一部またはすべてをコードするであろう。該ＤＮＡは、種々の制限酵素を使用して特定の部位で切断されてもよい。あるいは、マンガンの存在下でDNaseを使用してＤＮＡを断片化するか、または超音波処理によりＤＮＡを物理的に剪断することができる。次にＤＮＡ断片は、標準的方法（例えば、アガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーおよびショ糖勾配遠心分離があるが、これらに限定されない）により、サイズに従って分離することができる。次にＤＮＡ断片を適切なベクター（プラスミド、コスミド、バクテリオファージラムダまたはＴ₄、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）があるが、これらに限定されない）に挿入することができる。（例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. （ed.）, 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II.）。ゲノムライブラリーは、標識プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングされうる（Benton and Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961）。
ゲノムライブラリーは、当該分野で公知の最適なアプローチを使用して、OMP106ポリペプチドの任意のペプチドのアミノ酸配列に対応する、標識縮重オリゴヌクレオチドでスクリーニングされうる。具体例では、スクリーニングプローブは、IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV（配列番号１）を有するペプチドまたはその一部に対応する縮重オリゴヌクレオチドである。さらに別の例において、スクリーニングプローブは、配列GTVLGGKK（配列番号２）を有するペプチドに対応する縮重オリゴヌクレオチドでもよい。別の例において、オリゴヌクレオチドGGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR（配列番号３）およびGGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR（配列番号７）（それぞれ、OMP106ペプチドGTVLGGKK（配列番号２）に対応する）が、プローブとして使用される。さらなる例において、配列GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA（配列番号４）もしくはその任意の断片、またはこの配列もしくはその断片の相補体が、プローブとして使用されうる。使用されるプローブは好ましくは、15ヌクレオチドまたはそれより長い。
OMP106ポリペプチドまたはその断片をコードする挿入体ＤＮＡを有するライブラリー中のクローンは、１以上の縮重オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするであろう。ゲノムライブラリーに対するこのようなオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の方法を使用して行われる。例えば、２つの上記のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションは、50℃で2×SSC、1.0％SDSで行われ、同じ条件下で洗浄される。具体例では、OMP106ポリペプチドのすべてまたは一部をコードするATCC49143ＤＮＡ配列は、約8,000塩基対の長さのHindIII制限断片、または約4,200塩基対の長さのDRAI制限断片である。
さらに別の面において、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドの一部またはすべてをコードするヌクレオチド配列のクローンはまた、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）発現ライブラリーをスクリーニングして得られる。例えば、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ＤＮＡは単離され、ランダム断片が調製され、発現ベクター（例えばバクテリオファージ、プラスミド、ファージミドまたはコスミド）に連結され、その結果ベクター中の挿入された配列は宿主細胞により発現されることが可能で、次にここにベクターが導入される。次に種々のスクリーニングアッセイを使用して、発現されたOMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドについて選択する。ある例では、当該分野で公知の方法を使用して所望のクローンを同定するのに、本発明の種々の抗OMP106抗体（第5.5節を参照）が使用できる。例えば、Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, NY. Appendix IVを参照。このライブラリーからのクローンまたはプラークを抗体と接触させて、結合するクローンを同定する。
ある例では、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するコロニーまたはプラークは、Olsvick et al., 29th ICAAC, Houston, Tex. 1989（引用により本明細書中に組み込まれる）に従って、DYNAビーズを使用して検出することができた。抗OMP106抗体は、トシル化されたDYNAビーズM280に架橋され、これらの抗体含有ビーズは次に、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドを発現するコロニーまたはプラークに吸着するために、使用されるであろう。OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドを発現するコロニーまたはプラークは、ビーズに結合するものとして同定される。
あるいは、抗OMP106抗体は、適当な支持体（例えば、シリカまたはセライト（商標）樹脂）に非特異に固定化される。次にこの物質は、前段落で説明したようにOMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドを発現する細菌コロニーに吸着するために使用される。
別の面では、ＰＣＲ増幅を使用して、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ゲノムＤＮＡからのOMP106ポリペプチドの一部またはすべてをコードする実質的に純粋なＤＮＡを産生する。既知のOMP106ポリペプチド配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマー（縮重であってもなくても）は、プライマーとして使用できる。具体例では、ペプチドIGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV（配列番号１）をコードするオリゴヌクレオチド（縮重であってもなくても）またはその任意の部分は、５’プライマーとして使用されうる。例えば、５’プライマーは、ヌクレオチド配列GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA（配列番号４）またはその任意の部分である。GTVLGGKK（配列番号２）をコードする配列の逆相補体であるヌクレオチド配列（縮重であってもなくても）は、３’プライマーとして使用されうる。例えば、縮重ヌクレオチド配列YTTYTTNCCNCCNAGNACNGTNCC（配列番号６）またはYTTYTTNCCNCCYAANACNGTNCC（配列番号８）を有するオリゴヌクレオチド（縮重であってもなくても）は、上記の種々の５’プライマーとともに３’プライマーとして使用されうる。
ＰＣＲは、例えばPerkin-Elmer CetusサーマルサイクラーとＴａｑポリメラーゼ（Gene Amp（商標））を使用して行うことができる。ＰＣＲ反応で使用するために、いくつかの異なる縮重プライマーを合成することを選択できる。またＰＣＲ反応をプライムするために使用されるハイブリダイゼーション条件の厳密性（stringency）を変更して、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ＤＮＡ中の、縮重プライマーと対応する配列との間のヌクレオチド配列の類似性の程度を大きくまたは小さくすることができる。OMP106ポリペプチドをコードする配列のセグメントがうまく増幅された後、このセグメントを分子的にクローン化し配列決定し、完全なゲノムクローンを単離するためのプローブとして使用することができる。次にこれは、既に記載したように、遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の解析、および機能的解析のためのそのタンパク質生成物の産生を可能にする。
１つのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または栽培種（cultivar）から、OMP106ポリペプチドコード配列がいったん単離されると、他のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株および栽培種から、OMP106ポリペプチドコード配列を単離するために、同じアプローチを使用することができる。本発明のOMP106ポリペプチド（またはその断片）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を使用して、当該分野で公知の一般的技術を使用して、中程度から高ストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズする他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を得ることができることは、当業者は理解できるであろう。高ストリンジェントな条件下での１つのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または栽培種からのOMP106配列とのハイブリダイゼーションにより、他の菌株および栽培種からの対応する配列が同定されるであろう。高ストリンジェントな条件は、プローブの長さと塩基組成により変わる。そのような条件を決定するための公式は、当該分野で公知である。Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, Chapter 11を参照。本明細書において、300塩基対より長いプローブに適用される高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、0.1×SSC／0.1％SDSで68℃で少なくとも１時間、最終洗浄を行う（Ausubel, et al., Eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Greene Pbulishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. New York, page 2.10.3）。具体例では、配列番号４またはその相補体の配列を有するプローブを使用するハイブリダイゼーションにおける高ストリンジェントな洗浄は、2×SSC、1％SDS、50℃で約20〜約30分である。
当業者は、当該分野で公知のアプローチを使用して、OMP106ポリペプチドコード配列の完全なクローンを同定することができるであろう。単離されたクローン中に含有されるOMP106ポリペプチドコード配列の程度は、クローン化された挿入体を配列決定し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）によりコードされるポリペプチドの推定サイズを、OMP106ポリペプチドのサイズと比較することにより、および／または推定アミノ酸配列を、精製されたOMP106ポリペプチドの既知のアミノ酸配列と比較することにより、確認される。OMP106ポリペプチドコード配列の部分クローンが単離されれば、部分的クローンの挿入体をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、完全なクローンが単離されるであろう。あるいは、完全なOMP106ポリペプチドコード配列は、これらの挿入体を一緒にスプライスして重複部分クローンから再構成することができる。
完全なクローンは、OMP106ポリペプチドの配列に一致する推定アミノ酸配列を有するＯＲＦを有する任意のものであるか、または、OMP106ポリペプチドの完全なアミノ酸配列が利用できない時は、OMP106ポリペプチドのペプチド断片の配列およびOMP106ポリペプチドの配列に一致する分子量を有するものである。さらに、OMP106ポリペプチドのアミノ末端に特異的な抗体またはOMP106ポリペプチドのカルボキシ末端に特異的な抗体に結合するポリペプチドを産生するために、発現ベクター中に置かれた時、完全なクローンはこれらの挿入体の能力により同定される。
OMP106由来ポリペプチドをコードする核酸配列は、当該分野で公知の方法により産生される。１つの面において、OMP106由来ポリペプチドをコードする配列は、本明細書中に開示された技術を考慮して、組換えＤＮＡ法によりOMP106ポリペプチドコードから得られる。例えば、OMP106ポリペプチドのコード配列は改変されて、OMP106ポリペプチドの免疫原性に影響を与えないアミノ酸置換、または免疫原を改良するアミノ酸置換を作成する。種々（オリゴヌクレオチド指向性（oligonucleotide directed）部位特異的突然変異誘発を含むが、これらに限定されない）の方法が使用される。Botstein and Shortle, 1985, Science 229:1193-1210に記載のような、置換、挿入、欠失、および転位のような単一のまたは複数突然変異を作成するために、これらのおよび当該分野で公知の他の技術が使用されうる。
さらに、OMP106ポリペプチドコード配列のＤＮＡは、制限酵素またはエキソヌクレアーゼ消化により末端が切り取られうる。連結またはＰＣＲ増幅により、OMP106ポリペプチドコード配列に異種コード配列が付加される。さらに、OMP106由来ポリペプチドのすべてまたは一部をコードするＤＮＡは、OMP106ポリペプチドの既知のまたは推定アミノ酸配列およびこの配列に対する所望の変更に基づき、化学的にまたはＰＣＲ増幅を使用して合成されうる。
OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドコード配列を含有する、同定され単離されたＤＮＡは、適当なクローニングベクター中に挿入されうる。当該分野で公知の多数のベクター−宿主系が使用できる。可能なベクターには、プラスミドまたは修飾ウイルスがある（しかし、これらに限定されない）が、ベクター系は使用される宿主細胞と適合性がなければならない。そのようなベクターには、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体のようなプラスミドがあるが、これらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的な粘性末端を有するクローニングベクターにＤＮＡ断片を連結することにより行われる。しかし、ＤＮＡを断片化するために使用される相補的な制限部位がクローニングベクター中に存在しない時、ＤＮＡ分子の端は酵素的に修飾してもよい。あるいは、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することにより、任意の所望部位を産生してもよい；これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含有してもよい。別の方法では、切断されたＤＮＡは、ホモポリマーテイリングにより修飾されてよい。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどを介して宿主細胞中に導入することができ、その結果、遺伝子配列の多くのコピーが作成される。
別の方法では、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドコード配列を含有する所望のＤＮＡは、「ショットガン」アプローチで適当なクローニングベクター中に挿入後、同定され単離される。例えばサイズ断片化による所望の配列の富化（enrichment）は、クローニングベクターへの挿入前に行うことができる。
具体例では、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドコード配列を含有する組換えＤＮＡ分子を有する宿主細胞の形質転換は、そのようなコード配列の多くのコピーの作成を可能にする。すなわち、形質転換体を増殖させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要な場合は、単離された組換えＤＮＡから挿入されたコード配列を回収することにより、コード配列が多量に得られる。
５．８．OMP106ポリペプチドとOMP106由来ポリペプチドの組換え産生
本発明のOMP106ポリペプチドとOMP106由来ポリペプチドは、遺伝子工学技術により産生される。この場合、これらは、このポリペプチドをコードするＤＮＡにより形質転換されている適当な宿主細胞により産生される。本発明のOMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適当な発現ベクター（すなわち、挿入されたポリペプチドコード配列の転写と翻訳に必要な要素を含有するベクター）中に挿入することができる。OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切な条件（例えば、正しい配向と正しいリーディングフレームで、適当な発現配列（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列およびリボゾーム結合配列）を有する）下で発現されるような方法でベクター中に挿入される。
ポリペプチド−コード配列を発現するために、種々の宿主細胞−ベクター系が使用できる。これらには、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染された哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母、またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細菌のような微生物があるが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は細菌であり、最も好ましくは、大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis）またはサルモネラ菌（Salmonella）である。
ベクターの発現要素は、その強度と特異性が異なる。使用される宿主細胞−ベクター系に依存して、多くの適当な転写および翻訳要素の任意のものが使用される。具体例では、OMP106ポリペプチドもしくはOMP106由来ポリペプチド配列ならびに宿主細胞のプレおよび／またはプロ配列を含むキメラタンパク質が発現される。他の具体例では、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチド配列とアフィニティ精製ペプチドを含むキメラタンパク質が発現される。さらなる具体例では、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチド配列を含むキメラタンパク質および有用な免疫原性ペプチドまたはポリペプチドが発現される。好適な例において、発現されたOMP106由来ポリペプチドは、未変性のOMP106ポリペプチドの外表面エピトープまたは受容体結合ドメインを形成する配列を含有する。
適当な転写／翻訳制御シグナルおよびポリペプチドコード配列からなるキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築するために、ベクターにＤＮＡ断片を挿入するための当該分野で公知の任意の方法が使用される。これらの方法には、インビトロの組換えＤＮＡおよび合成法およびインビボ組換え体（遺伝子組換え）がある。OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、挿入された配列が組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現されるように、第２の核酸配列により調節される。例えば、挿入された配列の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサー要素により制御されうる。挿入された配列の発現を制御するために使用されるプロモーターには、動物細胞での発現のためのＳＶ４０初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復配列中に含有されるプロモーター（Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペス・チミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42）；細菌細胞中での発現のためのβ−ラクタマーゼのプロモーター（Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731）、tac（DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25）、λP_L、またはtrc（Scientific American, 1980, 242:74-94中の「組換え細菌からの有用なタンパク質」（Useful proteins from recombinant bacteria）も参照）；移植細胞発現のためのノパリン・シンセターゼプロモーター領域またはカリフラワーモザイクウイルス35Ｓ ＲＮＡプロモーター（Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871）、および、光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ（Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120）；Gal4プロモーター、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母または真菌からのプロモーター要素があるが、これらに限定されない。
OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドコード配列を含有する発現ベクターは、３つの一般的アプローチにより同定することができる：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の有無、および（ｃ）挿入された配列の発現。第１のアプローチでは、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を、挿入されたOMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドコード配列に相同的な配列を含むプローブを使用して、核酸ハイブリダイゼーションにより検出する。第２のアプローチでは、ベクターへの外来遺伝子の挿入により引き起こされるいくつかの「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成）の有無に基づき、組換えベクター／宿主系が同定され選択される。例えば、OMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されると、挿入体を含有する組み換え体はマーカー遺伝子機能の欠如により同定することができる。第３のアプローチでは、組み換え体により発現される外来遺伝子産物をアッセイすることにより、組換え発現ベクターを同定することができる。このようなアッセイは、例えばOMP106リガンドまたは受容体への結合、本発明の抗OMP106抗体との結合、または血球凝集する宿主細胞の能力またはモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）による血球凝集を妨害する細胞抽出物の能力のような、インビトロアッセイ系でのOMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドの物理的または機能的性質に基づく。
特定の組換えＤＮＡ分子がいったん同定され単離されると、当該分野で公知のいくつかの方法を使用してこれを増やすことができる。適当な宿主系と増殖条件が確立されると、組換え発現ベクターが多量に増殖され調製される。前述したように、使用される発現ベクターには、以下のベクターまたはその誘導体があるが、これらに限定されない（少し列記すると、ヒトまたは動物ウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）；昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターがある）。
さらに挿入された配列の発現をモジュレートする宿主細胞株、または所望の特定の方法で遺伝子生成物を修飾し含有する宿主細胞株が選択される。特定のプロモーターからの発現は、特定のインデューサーの存在下で上昇させることができる；すなわち、遺伝子工学的に作成したOMP106ポリペプチドまたはOMP106由来ポリペプチドの発現は、制御されうる。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞株または宿主系は、所望の修飾および発現される外来タンパク質のプロセシングを確実にするために選択することができる。
５．９．試薬
本発明のポリペプチド、ペプチド、抗体および核酸は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）感染症の臨床的または医学的診断およびモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の病原性、毒性、および感染性、ならびに宿主防御機構に関する科学的研究のための試薬として有用である。例えば、本発明のＤＮＡおよびＲＮＡは、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅により生物学的試料中のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の存在を同定するためのプローブとして使用することができる。このＤＮＡおよびＲＮＡはまた、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）OMP106に関連するポリペプチドをコードする可能性のある他の細菌を同定するのに使用することができる。
本発明のポリペプチドおよびペプチドは、本発明のポリペプチドを含有する組成物をアフィニティクロマトグラフィーによりさらに精製するために使用することができるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製するのに使用される。このポリペプチドおよびペプチドはまた、試料中のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）に対する抗体の存在をスクリーニングするための標準的免疫測定法で使用することができる。
特定の問題または環境への本発明の技術の応用は、本明細書中に記載の技術を考慮すれば当業者の能力の範囲内にあることは理解すべきである。本発明の生成物およびその調製法および使用法の例は、以下の実施例に記載する。
６．実施例：OMP106ポリペプチド、および、これをコードする、ATCC49143または他の菌株由来遺伝子の単離と特徴づけ
６．１．材料と方法
６．１．１血球凝集アッセイ
モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）による血球凝集は、スライド凝集アッセイで３％v/vの赤血球の代わりに５％を使用した以外は、Soto-Hernandezら（J. Clin. Microbiol. 27:903-908）の方法により試験した。最初の血球凝集アッセイは、２０μgの細菌細胞（湿重量）を使用して行なった。血液寒天プレートで３５℃で増殖させたモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ATCC49143株は、強い血球凝集反応を示したため、参照菌株として選択した。ATCC49143株の１：２連続希釈により、血球凝集反応が低下した。＋＋＋＋〜＋のスコアは、連続１：２希釈後のATCC49143株により観察される血球凝集に基づき、＋反応は、＋＋＋反応を達成するのに必要な細胞の数の１／４を使用して得られた。
６．１．２．血球凝集の阻害
モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ATCC49143細胞懸濁液を連続的に１：２希釈した。この希釈物は、単純糖または糖誘導体による血球凝集の阻害をアッセイするために、７μlのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水および７μlの５％（v/v）ヒトＯ⁺赤血球を使用した時に、＋血球凝集反応を示した。単純糖または糖誘導体がモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）による血球凝集を阻害することができるかどうかを測定するために、５００mMで所与の糖７μlを７μlのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞と混合し、５分インキュベートして、糖を細胞と反応させた。次に７μlの５％（v/v）ヒトＯ⁺赤血球を加え、１分後血球凝集のスコアを付けた。各糖と糖誘導体を、血球凝集阻害の能力について測定した。次に各糖と糖誘導体のストックを連続的に１：２希釈し、これらの希釈物を、前記方法を使用して血球凝集を阻害する能力についてアッセイした。この方法で、血球凝集を阻害するのに必要な炭水化物の最小濃度を測定した。
６．１．３．リガンドおよび受容体結合
動物細胞糖脂質受容体へのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）結合を、宿主細胞糖脂質の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）画分とクロマトグラムの標識細胞オーバーレイを使用して、Magnaniら，1982, J. Biol. Chem. 257:14365-14369が記載した方法に従って、試験した。簡単に説明すると、Matreya Inc. （ペンシルバニア州、Pleasant Gap）から得られた糖脂質を、クロロホルム、メタノール、水（５：４：１）中の高速薄層クロマトグラフプレート（ＨＰＴＬＣ）上で分離した。プレートを１００℃でオルシノールで染色するか、または既に記載されている（Murphy and Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174）ように調製した¹²⁵Ｉ−標識モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ブレッブ（bleb）を２×１０⁶cpm／mlで２時間重層した。次にプレートを５回洗浄し、乾燥し、Ｘ線フィルムに露光した。
６．１．４．OMPSのＯＧ抽出
モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の菌株をそれぞれ、４リットルフラスコ中の１リットルのミューラーヒントン流体培養基（Mueller Hinton broth）中で３５℃で２００rpmで増殖させた。５０mgの細胞（湿重量）を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．６７mlの１．２５％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（すなわち、オクチルグルコシド；ＯＧ）で、室温で３０分処理して、外膜タンパク質（ＯＭＰ）調製物を単離した。細胞を微量遠心分離機中で５分遠心分離してペレットにし、上清をオクチルグルコシド抽出物として使用した。多くのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の菌株からのこれらの抽出物のタンパク質プロフィールを、分画遠心分離で単離したブレッブ（すなわち、外膜液胞）（これは、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の外膜タンパク質が高度に富化されている（Murphy and Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174））のタンパク質プロフィールと比較すると、オクチルグルコシド抽出物は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の外膜タンパク質を主に含むことを示す（図１）。これは、ブレッブから調製した外膜タンパク質に比較して、オクチルグルコシド抽出が、外膜タンパク質のより高収率のより迅速な方法を提供することを示す。
６．１．５．OMP106のタンパク質分解性消化
ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水１ml中のATCC49143株由来の細胞５０mgを、以下のプロテアーゼで室温で１時間消化した：ＴＬＣＫ−処理キモトリプシン（５mg）、プロテイナーゼＫ（５mg）、ＴＰＣＫ−処理トリプシン（５mg）、またはプロテアーゼＶ８（１００単位）。すべてのプロテアーゼは、Sigma Chemicals（ミズーリ州、セントルイス）から得た。プロテアーゼ処理の直後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ １mlに再懸濁し、その血球凝集活性を試験した。さらにプロテアーゼ処理した細菌細胞を、オクチルグルコシドで抽出して、プロテアーゼにより消化された特定のタンパク質を同定するために外膜タンパク質を分離した。
６．１．６．非血球凝集性品種
通常、血球凝集性モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）培養物は、ミューラーヒントン流体培養基を含有するシェーカーフラスコ中で３５〜３７℃で２００rpmで２４〜４８時間増殖させる。血液寒天プレートまたはミューラーヒントン培地の寒天プレートから直接取った細胞も、血球凝集性表現型を発現する。非血球凝集性（ＮＨＡ）品種について選択するために、ATCC49143株を、ミューラーヒントン流体培養基で３５℃で静置培養して、５日毎に連続的に継代した。各継代について、接種物は流体培養基培養物の表面からのみ取った。２回目の継代までに、細胞の浮遊マットが成長し、細胞のこのマットを、後続する培養の接種物として使用した。こうした連続培養により、典型的には３回の継代後にATCC49143株のＮＨＡ品種が産生された。
６．１．７．OMP106ポリペプチドの単離
モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ATCC49143の外膜抽出物からのOMP106ポリペプチドは、抽出物が１００℃で５分間インキュベートされた後にのみ、（例えば、銀染色または抗OMP106抗体により）変性ゲル中で検出される。１００℃でインキュベート後のOMP106バンドの出現は、沸騰中に凝集している低分子量タンパク質の結果によるのか、または沸騰により普通に凝集したタンパク質がゲルに入ることによるのかどうかを決定するために、ATCC49143株の沸騰させないオクチルグルコシド外膜抽出物を、未変性のポリアクリルアミドゲルで解析した。試料のウェルのすぐ下の領域を含むゲルの特異的領域を切り出し、沸騰させた。次に得られた試料を変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、銀染色で染色した（Silver Stain Plus、カタログ番号１６１−０４４９、BioRad Laboratories、カリフォルニア州リッチモンド）。Ｎ−末端配列決定のために、ATCC49143株のオクチルグルコシド外膜抽出物を、ＳＤＳを含むＰＡＧＥ試料緩衝液と混合し、沸騰水浴中で５分間インキュベートした。次にタンパク質をＳＤＳを有する１２％ＰＡＧ上で分離し、電気ブロッティングによりＰＶＤＦ膜に移した。OMP106バンドを含有する膜の領域を、アミノ末端配列決定のために切り出した。OMP106ポリペプチドを単離するために用いたＰＡＧＥ法のいずれも、試料中またはゲル緩衝液中で還元剤を使用しなかった。
６．１．８．抗OMP106抗血清
ATCC49143のＨＡ品種由来のOMP106ポリペプチドを、既に記載されている（Lammeli, 1970, Nature 227:680-685）ように、変性ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで分離し、OMP106を含有するバンドをゲルから切り出して、OMP106に対する抗血清を調製した。切り出したバンドを液体に浸して、ウサギに注射して、OMP106ポリペプチドに対する抗血清を作成した。抗血清は、前記６．１．２節に記載のように血球凝集を阻害するために使用したが、炭水化物の代わりに抗血清を使用した。抗血清はまた、７節に記載のようにモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）に対する補体介在細胞障害活性について試験した。
６．１．９．抗OMP106抗血清によるウェスタンブロット
モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ATCC49143、ATCC43628、ATCC43627、ATCC43618、ATCC43617、ATCC25240、ATCC25238、およびATCC8176；モラクセラ・オビス（M. ovis）ATCC33078；モラクセラ・ラクナタ（M. lacunata）ATCC17967；モラクセラ・ボビス（M. bovis）ATCC10900；モラクセラ・オスロエンシス（M. osloensis）ATCC10973；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）（臨床単離株）；および髄膜炎菌（N. meningitidis）ATCC13077を、チョコレート寒天プレートで３５℃で５％ＣＯ₂で４８時間増殖させた。ポリスチレン接種ループを使用して寒天表面からコロニーを掻き取って細胞を取った。次に３０μgの細胞を１５０μlのＰＡＧＥ試料緩衝液（３６０mMトリス緩衝液［ｐＨ８．８］、４％ドデシル硫酸ナトリウムと２０％グリセロールを含有）中に懸濁し、懸濁液を１００℃で５分間インキュベートして、細胞を可溶化した。可溶化した細胞を、Laemmliに従って１２％ポリアクリルアミドゲルで分離し、分離したタンパク質を、既に記載されている（Thebaineら1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354）ように、１００Ｖで１．５時間ＰＶＤＦ膜に電気泳動的に移した（ただし、ゲルからのタンパク質の移動を促進するために、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウムを移動緩衝液に添加した）。次にＰＶＤＦ膜を、０．５％カゼインナトリウム、０．５％ウシ血清アルブミンおよび１％ヤギ血清を含有するダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水２５mlで前処理した。すべての以後のインキュベーションは、この前処理緩衝液を使用して行なった。
ＰＶＤＦ膜を、免疫前ウサギ血清またはOMP106ポリペプチドで免疫したウサギ（前述）の血清の１：５００希釈液２５mlで室温で１時間インキュベートした。次にＰＶＤＦ膜を、洗浄緩衝液（１５０mM塩化ナトリウムと０．０５％ツイーン−２０を含有する２０mMトリス緩衝液［ｐＨ７．５］）で２回洗浄した。ＰＶＤＦ膜を、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove Penn.カタログ番号１１１−０３５−００３）の１：５０００希釈液２５mlで室温で３０分間インキュベートした。次にＰＶＤＦ膜を洗浄緩衝液で４回洗浄し、Sigma Chemical Co. （ミズーリ州、セントルイス、カタログ番号Ｄ−４４１８）により供給された3,3’ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドおよび尿素ペルオキシダーゼで、各４分間発色させた。
６．１．１０．細胞表面の抗OMP106免疫蛍光染色
モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ATCC49143を、振盪水浴中のミューラーヒントン流体培養基で３５℃で一晩増殖させた。遠心分離して細胞をペレットにし、次にカルシウムまたはマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水のダルベッコ修飾培地（ＰＢＳ／ＭＣ）の等量に再懸濁した。２０μlの細胞懸濁液を、５つのきれいな顕微鏡スライドの各々に添加した。１０秒間置いた後、過剰の液体をマイクロピペッターで除去し、スライドを１時間風乾させた。次にガラスを触ると熱くなるまで、スライドを裸の火で加熱固定した。まずスライドを、抗OMP106抗血清またはＰＢＳ／ＭＣで希釈した同じ動物の免疫前血清の１：４０希釈物、またはＰＢＳ／ＭＣ ４０μlで処理し、次にＰＢＳ／ＭＣで５回洗浄した。スライドを、ウサギＩｇＧに対するフルオレセインイソチオシアネート標識ヤギ抗体（Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.,メリーランド州ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、カタログ番号０２−１５−０６）の５μg/ml ＰＢＳ／ＭＣ ４０μlで処理した。スライドを暗所で１０分間インキュベートし、ＰＢＳ／ＭＣで５回洗浄した。各スライドをカバースライド下でＰＢＳ／ＭＣでカバーして保存し、４８９nmフィルターの付いた蛍光顕微鏡で観察した。各試料について１回の観察について５視野を調べて、染色の程度を評価した。
６．２．結果
６．２．１．血球凝集活性
赤血球についてモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の凝集活性は、種特異的であり、最も強い活性はヒト赤血球で観察された。ウサギの赤血球はまたモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）により凝集したが、ヒト細胞ほど劇的ではなかった。マウス、ウマおよび羊由来の赤血球は凝集しなかった（表１を参照）。

６．２．２．OMP106受容体およびリガンド
モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）血球凝集活性は、グロボテトロース（globotetrose）（Ｇｂ₄）への結合に起因する。血球凝集性菌株のブレッブは、Ｇｂ₄を有する糖脂質に結合するが、非血球凝集菌株は、同じ糖脂質に結合しない（図２を参照）。モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）血球凝集活性は、Ｇｂ₄の単糖構成成分またはそのような単糖の誘導体により阻害され、最も強いインヒビターは、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびガラクトースである（特に、ガラクトースのアルファアノマー）（表２を参照）。

Ｎ−アセチルガラクトサミンとアルファ−ガラクトースの両方とも、Ｇｂ₄四糖の一部である。血球凝集とＧｂ₄への結合との相関、およびＧｂ₄受容体を含む単糖により血球凝集が阻害されるという観察結果は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞が四糖Ｇｂ₄に結合することを示唆する。この四糖は、ヒトの赤血球と組織に存在し、赤血球膜へのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）付着を仲介し得る。
６．２．３．OMP106ポリペプチドの同定
モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞のタンパク質分解性消化、および消化した細胞による血球凝集の後続の解析は、キモトリプシンとプロテイナーゼＫによるプロテアーゼ処理が血球凝集活性を破壊し、トリプシンによる処理は血球凝集活性を部分的に破壊することを証明し、これは血球凝集活性はタンパク質に媒介されることを示している。プロテアーゼに消化されたモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞のＯＭＰタンパク質プロフィールの解析は、複数のタンパク質が各試料で分解されたことを証明し、従ってこのプロフィールはどのタンパク質が血球凝集活性に直接または間接に寄与しているかについてのヒントを与えなかったことを示している（図３を参照）。
プロテアーゼ処理は、ポリペプチドが血球凝集活性に直接または間接に関与していることを示したため、我々はＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、血球凝集性菌株のＯＭＰプロフィールを非血球凝集性菌株のＯＭＰプロフィールと比較した（図４）。これらのプロフィールの差の解析は、血球凝集性菌株は２つの固有のポリペプチドを有し、その１つは見かけの分子量が２７kD（ＯＭＰ２７と呼ぶ）で他の１つは見かけの分子量が１０６kDを越える唯一のタンパク質（OMP106と呼ぶ）であることを示した。注目すべきことは、種々のプロテアーゼで処理した血球凝集活性が低下しているかまたは活性がない細胞のＯＭＰ調製物にはOMP106ポリペプチドバンドがなく、プロテアーゼＫで処理した血球凝集活性のない細胞のＯＭＰ調製物ではＯＭＰ２７が存在したことである。さらに、OMP106ポリペプチドバンドはプロテイナーゼＶ８消化により分解されず、これは処理した細胞の血球凝集活性に影響を与えなかった。
６．２．４．ＮＨＡ品種のＯＭＰプロフィール
ATCC49143のＮＨＡ品種の３５℃の静置培養での連続培養は、培養物の３回目の継代でＮＨＡ品種（４９１４３−ＮＨＡと呼ぶ）を産生した。この血球凝集活性の欠如は再現性があった。ＨＡおよびＮＨＡ品種のＯＧ外膜抽出物のＯＭＰプロフィールの解析は、４９１４３−ＮＨＡ抽出物からOMP106ポリペプチドバンドが消失していることを示した（図５）。これは、OMP106ポリペプチドが、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）血球凝集素（すなわち、OMP106ポリペプチドは、Ｇｂ₄受容体に結合するか、またはＧｂ₄受容体に結合するホモポリマー性タンパク質のサブユニットである）であるか、またはモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）血球凝集素の一部を構成する（すなわち、OMP106ポリペプチドは、ＧＢ₄受容体に結合するヘテロポリマー性タンパク質のサブユニットである）ことを示唆した。
６．２．５．OMP106と血球凝集
ATCC49143 OMP106ポリペプチドに対するポリクローナル抗血清は、ATCC49143ならびにATCC43627による血球凝集を中和した。これは、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）血球凝集活性はOMP106ポリペプチドを含み、OMP106ポリペプチドは菌株間で抗原性的に保存されているという結論をさらに支持する。異種モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株のOMP106ポリペプチドに結合する、ポリクローナル抗血清中の抗体を示す、図９Ａも参照されたい。
６．２．６．OMP106の外表面局在
モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞の外表面でOMP106ポリペプチドが露出しているかどうかを測定するために、間接免疫蛍光染色においてウサギ抗OMP106抗血清を使用した。抗OMP106抗血清で処理したモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞は、免疫前血清またはＰＢＳ／ＭＣで処理した細胞より強くかつ均一に染色された。これは、完全なモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞中では、OMP106ポリペプチドは抗OMP106抗血清と反応性であることを示した。この結果は、OMP106ポリペプチドがモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の外表面に露出していることを示す。この知見は、OMP106ポリペプチドが血球凝集においてある役割を有することに一致し、さらにOMP106ポリペプチドがワクチンとして有用であろうということを示す。
６．２．７．OMP106ポリペプチドの性質
OMP106ポリペプチドは未変性の状態では大きなタンパク質複合体として存在するか、またはオクチルグルコシドで抽出すると凝集物として存在する。この結論は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）細胞をオクチルグルコシドで抽出するとOMP106ポリペプチドが可溶化されるが、抽出されたOMP106ポリペプチドは、抽出物をまず１００℃でインキュベートしない限りは、変性ＰＡＧ中に入らない（図６）という知見により支持される。さらに、非加熱変性試料中のOMP106ポリペプチドは試料ウェル中に捕捉され、試料がまず１００℃でインキュベートされた場合のみ分離ゲルに入るため、OMP106ポリペプチドバンドは、加熱により重合または凝集する低分子量ポリペプチドからは生成しないようである。この生化学的特性は、種々のゲルにおいてOMP106ポリペプチドを同定するのに非常に有用である。
モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）のオクチルグルコシド抽出物を使用して、次に抽出物をドデシル硫酸ナトリウムで１００℃でインキュベートして、そのタンパク質を変性ポリアクリルアミドゲルで分離して、我々は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の種々の菌株のOMP106ポリペプチド（特に、ATCC25238、ATCC25240、ATCC43617、ATCC43618、ATCC43627、およびATCC43628のもの）の見かけの分子量は、約１８０kD〜約２３０kDの範囲であると推定し（図９Ａを参照）、一方ATCC49143株のOMP106ポリペプチドは見かけの分子量が約１９０kDであると推定した（図６）。
ATCC49143株のOMP106ポリペプチドをゲルスライスから抽出し、そのＮ−末端配列を決定した。この配列決定は、ATCC49143の外膜由来のOMP106ポリペプチドのＮ−末端は、IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV（配列番号１）であることを示した。さらに、Ｌｙｓ−Ｃ消化により産生されるOMP106の内部ペプチド（Fernandezら，1994, Anal Biochem 218:112-117）が単離され、その配列はGTVLGGKK（配列番号２）であると決定された。
我々は、３つのオリゴヌクレオチドプローブを作成した。２つのプローブは内部ペプチドGTVLGGKKに一致し、その１つは以下の配列GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR（配列番号３）を、そしてもう１つはGGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR（配列番号７）を有する。OMP106のアミノ末端配列（配列番号１）の内部断片（配列番号５）をコードする他のプローブ（Ｍｃ５−７２）は、以下の配列GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA（配列番号４）を有する。各例でモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ＤＮＡの完全なＨｉｎｄIIIまたはＤｒａＩ消化物に対するＭｃ５−７２プローブのハイブリダイゼーションは、サザンブロット解析で単一のバンドを示した（図７）。ＨｉｎｄIII消化物中のハイブリダイズするバンドは、約８．０kbのサイズを有し、ＤｒａＩ消化物中のハイブリダイズするバンドは、約４．２kbのサイズを有する（図７）。
６．２．８．OMP106ポリペプチドの保存
いくつかのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株と関連する細菌種の外膜タンパク質抽出物のウェスタンプロット解析は、抗OMP106抗体が、多くのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株（ＨＡとＮＨＡ株の両方、または品種）の約１８０Kd〜約２３０kDのポリペプチドに結合することを示した（図９Ａ）。抗OMP106抗体は、関連する細菌のタンパク質抽出物中のいずれのポリペプチドにも結合しなかった（図８Ａ）。これらの結果は、以下のことを証明する：１）抗OMP106抗体は、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）を、特異的に同定し、関連する細菌種から区別するために使用される。２）OMP106ポリペプチドは、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の同定のための診断的用途を有する抗体を作成するために使用される。３）１つの菌株のOMP106ポリペプチド（例えば、ATCC49143のOMP106）に対する抗体は、他のモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株の対応するOMP106ポリペプチドを同定し単離するために使用される。興味深いことに、ウェスタンブロットの結果は、多くのＮＨＡモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株が、その外膜のＯＧ抽出物中にOMP106ポリペプチドを有することを示す。この知見、およびＰＡＧＥ後のＮＨＡモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株のＯＧ外膜抽出物からのＯＭＰの銀染色は１８０kD〜２３０kDの範囲にバンドを示さないという事実は、OMP106ポリペプチドが多くのモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株または品種により発現されることを示すが、血球凝集で活性がある（すなわち、哺乳動物細胞表面上の受容体に結合する）かまたは銀染色が可能であるためには、OMP106ポリペプチドは何らかの方法で適切に修飾される必要があることを示す。ＨＡ株と品種のみがOMP106ポリペプチドを適切に修飾できるようであり、従って哺乳動物細胞表面上の血球凝集素受容体への細菌の結合を媒介することができる。
７．実施例：OMP106ワクチンの効果：抗OMP106抗血清の細胞障害活性
OMP106ポリペプチドのワクチンとしての可能性を測定するために、抗OMP106抗体の補体介在細胞障害活性を調べた。ATCC49143のＨＡ品種のOMP106ポリペプチドに対する抗血清は、前記６．１．８節で記載したように調製した。モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）の補体死滅を媒介する免疫前血清と抗OMP106抗血清の活性を、Zollingerらの記載した「血清殺菌試験」（Serum Bactericidal Test）を使用して調べた（Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3rd et., pg 347-349中のImmune Responses to Neiserria meningitis）が、髄膜炎菌（Neiserria meningitis）細胞の代わりにＨＡおよびＮＨＡモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株もしくは品種の細胞を使用した。
結果は、抗OMP106抗血清は、異種モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ATCC43627のＨＡ品種の補体死滅を媒介するが、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ATCC43627またはＮＨＡモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ATCC8176のＮＨＡ品種についてはそうではないことを示す。表３は、ATCC43627のＨＡ品種に対する免疫前血清と抗OMP106抗血清の補体介在細胞障害活性を要約する。

表３に示すように、抗OMP106抗血清は免疫前血清より８倍大きい細胞障害活性を示す。この知見は、OMP106ポリペプチドが、ＨＡモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）株および品種に対するワクチンとして有用であることを示す。
本発明を具体例に関して詳述したが、機能的に等価の変更は本発明の範囲内にあることは理解されるであろう。前記説明および添付図面から、当業者は、本明細書に記載のもの以外に本発明の種々の改変が明らかになるであろう。そのような改変は、本発明の請求の範囲の範囲内に入ると考えられる。
本明細書に引用された種々の文献は、その開示全体を参考のため本明細書に援用する。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：４３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド

配列番号：２
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部

配列番号：３
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
説明：／ｄｅｓｃ＝「プローブ」

配列番号：４
配列の長さ：７２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
配列の特徴：
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．７２

配列番号：５
配列の長さ：２４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質

配列番号：６
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
説明：／ｄｅｓｃ＝「プローブ」

配列番号：７
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
説明：／ｄｅｓｃ＝「プローブ」

配列番号：８
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
説明：／ｄｅｓｃ＝「プローブ」
フラグメント型：Ｎ−末端

Claims (11)

1. モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）の外膜ポリペプチド-106（OMP106ポリペプチド）であり、ウサギ骨格筋ミオシンおよび大腸菌（E. coli）β−ガラクトシダーゼをそれぞれ200kDおよび116.25kDの分子量基準として使用するSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定で約190kDの分子量を有し、かつ、それぞれアミノ末端および内部に位置する配列番号１および２で示されるアミノ酸配列を含んでなる、単離されたOMP106ポリペプチド。
2. モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）株がATCC 49143である、請求項１に記載のOMP106ポリペプチド。
3. モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）株が赤血球凝集性品種である、請求項１または２に記載のOMP106ポリペプチド。
4. 銀染色剤と反応する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のOMP106ポリペプチド。
5. 配列番号１の配列に特異的に結合する抗体に特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のOMP106ポリペプチド。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のOMP106ポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体。
7. モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）の補体介在細胞障害活性を媒介する細胞傷害性抗体である、請求項６に記載の単離された抗体。
8. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のOMP106ポリペプチドを含んでなるワクチン。
9. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のOMP106ポリペプチドを含んでなる抗原組成物。
10. モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）による感染の治療または予防に使用する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
11. モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）による感染の治療または予防に使用する、請求項６に記載の単離された抗体。

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