ES2714008T3 - Tratamiento de biopelícula - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un agente inhibidor de la fumarato reductasa, para su uso en un método para prevenir o tratar la infección por P. gingivalis o la enfermedad periodontal en un sujeto, en donde el método comprende administrar la composición farmacéutica al sujeto y en donde el agente inhibidor previene, inhibe o reduce una biopelícula de P. gingivalis , y se selecciona de decursina, verticipirona, paecilaminol, 5-alquenil-3,3(2H) -furanonas de Streptomyces spp.,nafuredina, ácido mesacónico, rotenona, 4,6- dinitrofenoles 2-sustituidos, N-óxido de mercaptopiridina, L-092,201, fexindazol, megazol, MK-436, L-634,549, misonidazol y bencimidazoles.

Description

DESCRIPCION

Tratamiento de biopelmula

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones y metodos para prevenir o alterar la formacion y/o desarrollo de biopelmulas bacterianas, como las que contienen Porphyromonas gingivalis. En particular, la presente invencion se refiere al uso e inhibicion de polipeptidos que son importantes para el crecimiento como una biopelmula o bajo limitacion de hemo o para modular la formacion y/o desarrollo de biopelmulas. La presente invencion tambien se refiere a una composicion para la modulacion de la formacion y/o desarrollo de biopelmulas, que incluye la regulacion de enzimas bacterianas.

Antecedentes de la invencion

Muchos tratamientos bacterianos estan dirigidos a bacterias en un estado planctonico. Sin embargo, las patologfas bacterianas incluyen bacterias en un estado de biopelmula. Por ejemplo, Porphyromonas gingivalis se considera que es el principal agente causante de enfermedad periodontal cronica. La lesion de tejido asociada a la enfermedad se produce por una respuesta inmunitaria del huesped desregulada a P. gingivalis que crece como parte de una biopelmula bacteriana polimicrobiana sobre la superficie de los dientes. Las biopelroulas bacterianas son ubicuas en la naturaleza y se definen como poblaciones bacterianas encerradas en matriz adherentes entre sf y/o a superficies o interfases (1). Estas celulas bacterianas sesiles que se adhieren a y crecen sobre una superficie como una biopelmula madura pueden sobrevivir en entornos hostiles que pueden incluir la presencia de agentes antimicrobianos, fuerzas de cizallamiento y privacion de nutrientes.

Los Centros para el control y la prevencion de enfermedades estiman que el 65% de las infecciones bacterianas humanas implican biopelroulas. Las biopelroulas frecuentemente complican el tratamiento de infecciones cronicas protegiendo bacterias del sistema inmunitario, disminuyendo la eficacia de antibioticos y dispersando celulas planctonicas a sitios distantes que pueden ayudar en la reinfeccion (2, 3). La placa dental es un ejemplo clasico de una biopelroula bacteriana en la que una alta diversidad de especies forman una biopelroula polimicrobiana heterogenea que crece sobre la superficie de los dientes. La superficie de los dientes es un habitat microbiano unico ya que es la unica superficie que no se muda permanente dura en el cuerpo humano. Esto permite la acrecion de una biopelroula bacteriana sustancial durante un periodo de tiempo prolongado a diferencia de superficies mucosas en las que la eliminacion de celulas epiteliales limita el desarrollo de la biopelroula. Por tanto, los cambios al proteoma de P. gingivalis que se producen entre los estados planctonicos y de biopelroula son importantes para el entendimiento de los presentes inventores de la progresion de enfermedad periodontal cronica.

P. gingivalis se ha clasificado en dos amplios grupos de cepas incluyendo las cepas W50 y W83 que se han descrito como invasivas en modelos de lesion animal mientras que las cepas que incluyen 381 y ATCC 33277 se describen como menos invasivas (4,5). Griffen y col. (6) encontraron que cepas similares a W831W50 estuvieron mas asociadas a enfermedad periodontal humana que otras cepas de P. gingivalis, que incluyen cepas similares a 381, mientras que Cutler y col. (7) demostraron que cepas invasivas de P. gingivalis fueron mas resistentes a fagocitosis que las cepas no invasivas. La comparacion de la cepa W83 de P. gingivalis secuenciada con la cepa ATCC 33277 tipo indico que el 7% de los genes estuvieron ausentes o altamente divergentes en la cepa 33277, que indica que hay diferencias considerables entre las cepas (8). De forma interesante, la cepa W50 de P. gingivalis forma biopelroulas solo escasamente bajo la mayona de las circunstancias en comparacion con la cepa 33277, que facilmente forma biopelroulas (9). Como consecuencia de esto se han realizado relativamente pocos estudios sobre la formacion de biopelroula por W50 de P. gingivalis.

Se han empleado estudios proteomicos cuantitativos para determinar cambios del proteoma de patogenos bacterianos humanos tales como Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Streptococcus mutans del estado planctonico a de biopelroula usando enfoques de electroforesis en gel 2D en los que se calculan relaciones de protemas basandose en la intensidad de la tincion del gel (10-12). Una alternativa es usar tecnicas de marcado con isotopos estables tales como ICAT, iTRAQ o agua pesada (H218O) con cuantificacion por EM (13). La base para el marcado con H218O es que durante la hidrolisis de protemas se ha demostrado que endopeptidasas tales como tripsina demostraron incorporar dos atomos de 18O en los extremos C de los peptidos resultantes (14, 15). Ademas de usarse en la determinacion de las abundancias de protemas relativas (16-19), el marcado con 18O en proteomica tambien se ha usado para la identificacion del extremo C de la protema, identificacion de glucosilacion ligada a N despues de la eliminacion enzimatica del glucano, simplificacion de la interpretacion de datos de EM/EM y mas recientemente para la validacion de sitios de fosforilacion (20-23). El procedimiento de marcado proteolftico con 16O/18O para medir la abundancia de protemas relativa implica digerir una muestra en H216O y la otra muestra en H218O. Los digestos se combinan entonces antes del analisis por EM-CL/EM. Los peptidos que eluyen de la columna de CL pueden cuantificarse midiendo la intensidad de senal relativa de los pares ionicos del peptido en el modo de EM. La incorporacion de dos atomos de 18O en el extremo C de peptidos digeridos por tripsina produce un desplazamiento de la masa de 4 m/z que permite la identificacion de los pares de isotopos.

Debido a la complejidad del proteoma, etapas de prefraccionamiento son ventajosas para aumentar el numero de identificaciones de peptidos y protemas. La mayona de las etapas de prefraccionamiento implican un enfoque de CL 2D al nivel de peptidos despues de la digestion en disolucion (24, 25). Sin embargo, debido a la posible perdida de muestras durante las etapas de deshidratacion iniciales de la disolucion de protema, el prefraccionamiento por SDS-PAGE al nivel de protema seguido del marcado con 16O/18O durante la digestion en gel tambien se ha llevado a cabo satisfactoriamente (26-29). El marcado proteolftico con 16O/18O es una metodologfa altamente espedfica y versatil, pero se han realizado pocos estudios de validacion a gran escala (30). Se llevo a cabo un excelente estudio de validacion por Qian y col. (18) que marcaron dos aftcuotas similares de protemas del suero en una relacion 1:1 y obtuvieron una relacion promedio de 1,02 ± 0,23 de 891 peptidos. Un estudio mas reciente por Lane y col. (26) demostro adicionalmente la factibilidad del procedimiento de 16O/18O usando una estrategia de marcado inverso para determinar la abundancia relativa de las 17 protemas de citocromo P450 entre ratones de control y tratados con inductores de citocromo P450 que se injertaron con tumores humanos.

Resumen de la invencion

La presente invencion uso un sistema por el cual W50 de P. gingivalis se cultiva en cultivo continuo y se desarrolla una biopeftcula madura sobre las superficies verticales en el recipiente del quimiostato durante un periodo de tiempo prolongado. La biopeftcula final es similar a la que se habna observado en condiciones de progresion de la enfermedad, permitiendo asf una comparacion directa entre celulas de biopeftcula y planctonicas. El marcado proteolftico con 16O/18O usando una estrategia de marcado inverso se llevo a cabo despues del prefraccionamiento por SDS-PAGE de la fraccion de la envuelta de celulas de P. gingivalis seguido de acoplamiento a EM CL MALDI TOF/EM fuera de ftnea para la identificacion y cuantificacion. De las 116 protemas identificadas, 81 se encontraron coherentemente en dos estudios en cultivo continuo independientes. Se encontro que 47 protemas con una variedad de funciones aumentaron o disminuyeron coherentemente en abundancia en las celulas de biopeftcula proporcionando posibles dianas para las estrategias de control de biopeftculas. De estas 47 protemas, los presentes inventores han seleccionado 24 protemas que creen que son particularmente utiles como dianas en el tratamiento y/o prevencion de infeccion por P. gingivalis. Estas se enumeran en la Tabla 4 mas adelante. De estas 24 protemas la presente invencion se refiere a fumarato reductasa como un objetivo para el tratamiento o prevencion de infeccion por P. gingivalis o enfermedad periodontal.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un agente inhibidor de la fumarato reductasa, para su uso en un metodo para prevenir o tratar la infeccion por P. gingivalis o enfermedad periodontal en un sujeto, en donde el metodo comprende administrar la composicion farmaceutica al sujeto y en donde el agente inhibidor previene, inhibe o reduce una biopeftcula de P. gingivalis , y se selecciona de decursina, verticipirona, paecilaminol, 5-alquenil-3,3(2H)-furanonas de Streptomyces spp., nafuredina, acido mesaconico, rotenona, 4,6-dinitrofenoles 2-sustituidos, N-oxido de mercaptopiridina, L-092,201, fexindazol, megazol, MK-436, L-634,549, misonidazol y bencimidazoles.

Esta invencion tambien proporciona el uso de un agente inhibidor de la fumarato reductasa, para la fabricacion de un medicamento para su uso en la prevencion o el tratamiento de infeccion por P. gingivalis o enfermedad periodontal en un sujeto, en donde la prevencion o el tratamiento comprende administrar la composicion farmaceutica al sujeto y en donde el agente inhibidor previene, inhibe o reduce una biopeftcula de P. gingivalis , y se selecciona de decursina, verticipirona, paecilaminol, 5-alquenil-3,3(2H)-furanonas de Streptomyces spp., nafuredina, acido mesaconico, rotenona, 4,6-dinitrofenoles 2-sustituidos, N-oxido de mercaptopiridina, L-092,201, fexindazol, megazol, MK-436, L-634,549, misonidazol y bencimidazoles.

La invencion proporciona ademas un kit de partes para su uso en el metodo como se describe en la reivindicacion 1, en donde el kit incluye una composicion farmaceutica de la invencion y un vefftculo farmaceuticamente aceptable.

En el metodo para prevenir o tratar la infeccion por P. gingivalis , el agente inhibidor puede modular la formacion de biopeftculas, particularmente una infeccion por P. gingivalis que es resultado de o esta asociada con la formacion de biopeftculas bacterianas. De manera similar, en el metodo para prevenir o tratar la enfermedad periodontal, el agente inhibidor puede modular la formacion de biopeftculas, particularmente la enfermedad periodontal que es resultado de o esta asociada con la formacion de biopeftculas bacterianas.

Tfpicamente, la composicion tambien incluira un vehftculo farmaceuticamente aceptable. La composicion se administra de tal manera que el antagonista(s) inhibe la infeccion.

Opcionalmente, la composicion puede incluir ademas uno o mas antibioticos que son toxicos para o inhiben el crecimiento de bacterias anaerobias Gram negativas. Potencialmente, puede usarse cualquier antibiotico bacteriostatico o bactericida en una composicion de la invencion. Preferiblemente, los antibioticos adecuados incluyen amoxicilina, doxiciclina o metronidazol.

Las composiciones de la invencion pueden ser para su uso en la cavidad oral. Una composicion oral se puede depositar en los dientes o en las endas o ambos.

Tambien se divulga en la presente una molecula de ARN interferente, la molecula comprendiendo una region de cadena doble de por lo menos 19 pares de bases en cada cadena en la que una de las cadenas de la region de cadena doble es sustancialmente complementaria a una region de un polinucleotido que codifica un polipeptido que modula la formacion de biopelmulas por bacterias. En una realizacion, una de las cadenas es complementaria a una region de polinucleotido que codifica un polipeptido de una secuencia enumerada en la Tabla 4.

El agente inhibidor de la fumarato reductasa de la invencion se selecciona de decursina, verticipirona, paecilaminol, 5-alquenil-3,3(2H) -furanonas de Streptomyces spp., nafuredina, acido mesaconico, rotenona, 4,6-dinitrofenoles 2-sustituido; N-oxido de mercaptopiridina; L-092,201 (Merck Sharpe y Dohme); fexindazol, megazol, MK-436, L-634,549, misonidazol; o bencimidazoles como albendazol, cambendazol, mebendazol, oxfendazol y parebendazol.

El experto en la tecnica reconocera que la seleccion del agente inhibidor dependera del numero de factores clmicos que determinan si el agente inhibidor es apropiado para su uso en un entorno clmico.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Cuantificacion de 16O/18O de relaciones de BSA espedficas. La cuantificacion de cantidades conocidas de BSA se llevo a cabo del mismo modo que para las muestras de biopelmula y planctonicas informadas en los procedimientos experimentales para validar la metodologfa. Cantidades brevemente predeterminadas de BSA se cargaron en carriles adyacentes de un gel NuPAGE seguido de escision de bandas de igual tamano, marcado proteolftico normal o inverso, nanoHPLC y EM MALDI TOF/EM. (A) Espectros de EM del peptido tnptico de BSA, RHPEYAVSVLLR, a relaciones de marcado de 16O:18O conocidas de 1:1 (i), 2:1 (ii), 1:5 (iii) y 10:1 (iv) que muestran la envuelta isotopica doblete caractenstica para el peptido marcado con 16O y 18O (S0, S2 y S4 son la intensidades medidas de los picos isotopicos) (B) Gel de SDS-PAGE de relaciones de BSA conocidas usadas para el procedimiento de cuantificacion.

Figura 2: Espectros de EM y EM/EM directa e inversa tfpicos de muestra de P. gingivalis. (i, ii) Porcion ampliada de espectros de masas que muestran el ion precursor parental [M+H]+ del peptido marcado normal e inverso GNLQALVGR que pertenece a PG2082 y que muestra la diferencia de masa de 4 Da tfpica en una relacion 1:1 (iii, iv) Espectro de masas que muestra el ion precursor parental [M+H]+ del peptido marcado normal e inverso YNANNVDLNR que pertenece a PG0232 y que muestra la diferencia de masa de 4 Da tfpica en una relacion 2:1 (v, vi) Espectro de EM/EM del peptido YNANNVDLNR (+2 180) marcado pesado y YNANNVDLNR sin marcar caracterizado por el desplazamiento de 4 Da de todos los iones Y.

Figura 3: Correlacion de duplicados tecnicos marcados normales/inversos. Comparacion de los diagramas de dispersion transformados por log10 de la relacion de abundancia de peptidos del marcado normal (Bio18, Plank16) e inverso (Plank18, Bio16) para ambos duplicados. Las relaciones de abundancia de los peptidos marcados inversos se han invertido para una comparacion directa. (A) Duplicado biologico 1 (B) Duplicado biologico 2

Figura 4: Distribucion y correlacion de abundancias de protemas de duplicados biologicos. (A) Cambios de veces promedio normalizados para las 81 protemas cuantificables identificadas en ambos duplicados biologicos expresaron una distribucion similar a gaussiana. La relacion de abundancias de cada protema se normalizo adicionalmente a cero (R -1 ) y relaciones inferiores a 1 se invirtieron y calcularon como (1 - (1/R)) (18). Las 81 protemas cuantificables de cada duplicado biologico se clasificaron aumentando las relaciones (Biofilm/Planktonic) y se dividieron igualmente en seis grupos con igual numero de protemas (A-F). Los grupos C y D representan protemas no significativamente reguladas (< 3 DE de 1,0). (B) Distribucion de protemas basandose en clasificaciones. Inserto: tabla de clasificacion para la determinacion de la similitud entre ambos duplicados biologicos. Las protemas se clasificaron en orden descendente siendo 1 la mayor similitud cuando ambos duplicados biologicos se encontraron dentro del mismo grupo y siendo 6 la menor similitud.

Figura 5: Rotura de las 116 protemas identificadas en este estudio basandose en la identificacion en uno o ambos duplicados biologicos y numero de peptidos unicos identificados. Las protemas identificadas de ambos duplicados biologicos (81) se presentan en la Tabla 2. La leyenda muestra el numero de peptidos unicos identificados por protema.

Figura 6: Las rutas catabolicas para la fermentacion de glutamato y aspartato en P. gingivalis. Enzimas identificadas que catalizan cada etapa se representan por su numero de acceso de TIGR como se observa en la Tabla 3. El numero de acceso subrayado indica enzimas que se detectaron en el otro analisis proteomico, pero no en los estudios de ICAT.

Figura 7: Efecto de oxantel sobre el crecimiento de celulas de W50 (A) y ATCC 33277 (B) de P. gingivalis durante 50 h. Las concentraciones usadas fueron de 15,625 a 1000 uM. El control negativo usado fue 4 pl de DMSO. CIM y TGM de P. gingivalis fue como se observo en la Tabla 7 y 8. El resultado muestra la media de dos duplicados biologicos llevados a cabo en diferentes dfas (n=10). (- DMSO, - 15,625 pM, - - 31,25 pM ,------62,5 pM,------125 pM,--------250 pM, - - - 500 pM,----- 1000 pM)

Figura 8: Efecto de morantel sobre el crecimiento de celulas de P. gingivalis durante 50 h. Las concentraciones usadas fueron de 15,625 a 1000 pM. El control negativo usado fue 4 pl de DMSO. CIM y TGM de P. gingivalis fueron como se observa en la Tabla 7. (-DMSO, 19,53 pM, - -39,06 pM,------ 78,13 pM,------- 156,25 pM,------- - - 312,5 pM, - - - 625 pM.---- 1250 pM, - - - 2500 pM,--------5000 pM)

Figura 9: Efecto de tiabendazol sobre el crecimiento de celulas de P. gingivalis durante 50 h. Las concentraciones usadas fueron de 31,25 a 4000 pM. El control negativo usado fue 4 pl de DMSO. CIM y TGM de P. gingivalis fueron como se observa en la Tabla 7. (-DMSO, -31,25 pM, - - 62,5 - 125pM,------ 250 pM, -----------500 pM, ---1000 pM,---------2000 pM, ---4000 pM)

Figura 10: Efectos de oxantel sobre la formacion de biopelmula por la cepa 33277 de P. gingivalis (A) biopelmula de 24 h (B) biopelmula de 48 h. Se llevaron a cabo duplicados biologicos del ensayo y barras de error que representan las desviaciones estandar de ambos duplicados biologicos (n=12).

Figura 11: Imagen de CLSM de ATCC 33277 de control tratado con solo agua y tenido con Backlight. Las imagenes son proyecciones maximas del apilado en z entero obtenido a intervalos de 2 pm. Barra de escala (blanca) = 10 pm.

Figura 12: Imagen de CLSM de ATCC 33277 tratado con oxantel 125 pM y tenido con Backlight. Las imagenes son proyecciones maximas del apilado en z entero obtenido a intervalos de 2 pm. Barra de escala (blanca) = 10 pm

Figura 13: Imagen de CLSM de ATCC 33277 tratado con oxantel 12,5 pM y tenido con Backlight. Las imagenes son proyecciones maximas del apilado en z entero obtenido a intervalos de 2 pm. Barra de escala (blanca) = 10 pm

Figura 14: Unidades formadoras de colonia de P. gingivalis despues del tratamiento con oxantel basado en un ensayo estatico de 24 pocillos.

Descripcion detallada de las realizaciones

Usando una estrategia proteomica los presentes inventores identificaron y cuantificaron satisfactoriamente los cambios en la abundancia de 116 protemas de la envuelta de celulas de P. gingivalis entre los estados de biopelmula y planctonicos, identificandose la mayona de las protemas por exitos de multiples peptidos. Los presentes inventores demostraron expresion potenciada de un grupo grande de protemas de la familia del dominio del extremo C localizadas en la superficie celular que incluyen RgpA, HagA, CPG70 y PG99. Otras protemas que presentaron cambios significativos en la abundancia incluyeron protemas relacionadas con el transporte (HmuY e IhtB), enzimas metabolicas (FrdA y FrdB), protemas inmunogenicas y numerosas protemas con funciones desconocidas hasta ahora.

Los terminos "peptidos, protemas y polipeptidos" se usan indistintamente en la presente. Los polipeptidos de la presente divulgacion pueden incluir polipeptidos recombinantes como polipeptidos de fusion. Los metodos para la produccion de un polipeptido de fusion son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

Como se entendera bien por aquellos expertos en la materia, pueden hacerse alteraciones a las secuencias de aminoacidos correspondientes a los numeros de acceso enumerados en la Tabla 4. Estas alteraciones pueden ser deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoacidos. Los polipeptidos alterados pueden ser tanto que se producen naturalmente (es decir, purificados o aislados de una fuente natural) como sinteticos (por ejemplo, por mutagenesis dirigida a sitio sobre el ADN codificante). Se pretende que tales polipeptidos alterados tengan al menos el 85%, preferentemente al menos el 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de identidad con las secuencias correspondientes a los numeros de acceso enumerados en la Tabla 4. Anticuerpos producidos contra estos polipeptidos alterados tambien se uniran a los polipeptidos que tienen una de las secuencias correspondientes a los numeros de acceso enumerados en la Tabla 4.

Mientras que el concepto de sustitucion conservativa es muy entendido por el experto en la materia, por claridad, sustituciones conservativas son aquellas explicadas a continuacion.

Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Met;

Asp, Glu, Ser;

Asn, Gln;

Ser, Thr;

Lys, Arg, His;

Phe, Tyr, Trp, His; y

Pro, Na -alquilaminoacidos.

La practica de la invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de qmmica, biolog^a molecular, microbiolog^a, ADN recombinante e inmunolog^a muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Tales tecnicas se describen y explican en toda la bibliograffa en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, volumenes 1 y 2, IRL Press (1991), D. M. Glover y B. D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, volumenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996) y F. M. Ausubel y col. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, que incluyen todas las actualizaciones hasta el presente). La divulgacion de estos textos se incorporan en el presente documento por referencia.

Un “polipeptido aislado” como se usa en el presente documento se refiere a un polipeptido que ha sido separado de otras protemas, lfpidos y acidos nucleicos con los que naturalmente se produce o el polipeptido o peptido puede sintetizarse sinteticamente. Preferentemente, el polipeptido tambien se separa de sustancias, por ejemplo, anticuerpos o matriz de gel, por ejemplo, poliacrilamida, que se usan para purificarlo. Preferentemente, el polipeptido constituye al menos el 10%, 20%, 50%, 70% y el 80% de peso seco de la preparacion purificada. Preferentemente, la preparacion contiene una cantidad suficiente de polipeptido para permitir la secuenciacion de protemas (es decir, al menos 1, 10 o 100 mg).

Los polipeptidos aislados descritos en el presente documento pueden purificarse por tecnicas convencionales, tales como cromatograffa en columna (usando diversas matrices que interaccionan con los productos de protema tales como matrices de intercambio ionico, matrices hidrofobas y similares), cromatograffa de afinidad utilizando anticuerpos espedficos para la protema u otros ligandos que se unen a la protema.

Una “secuencia de aminoacidos contigua” como se usa en el presente documento se refiere a un estiramiento continuo de aminoacidos.

Un “polipeptido recombinante” es un polipeptido producido mediante un procedimiento que implica el uso de tecnologfa de ADN recombinante.

En la determinacion de si dos secuencias de aminoacidos se encuentran o no dentro de un lfmite de porcentaje especificado, aquellos expertos en la materia seran conscientes de que es necesario realizar una comparacion lado a lado o multiples alineamientos de secuencias. En tales comparaciones o alineamientos se produciran diferencias en el posicionamiento de residuos no identicos, que dependen del algoritmo usado para realizar el alineamiento. En el presente contexto debe hacerse referencia a un porcentaje de identidad o similitud entre dos o mas secuencias de aminoacidos para referirse al numero de residuos identicos y similares respectivamente, entre dichas secuencias como se ha determinado usando cualquier algoritmo estandar conocido para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, pueden calcularse identidades o similitudes de secuencias de aminoacidos usando el programa GAP y/o alinearse usando el programa PILEUP del Computer Genetics Group, Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, Estados Unidos de America (Devereaux y col. y col., 1984). El programa GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) para maximizar el numero de residuos identicos/similares y para minimizar el numero y longitud de huecos de secuencia en el alineamiento. Alternativamente o ademas, si se comparan mas de dos secuencias de aminoacidos, se usa el programa Clustal W de Thompson y col., (1994).

Un aspecto de la invencion es una composicion farmaceutica que comprende un agente inhibidor de la fumarato reductasa como se define en la reivindicacion 1, para su uso en un metodo para prevenir o tratar a un sujeto para enfermedad periodontal que comprende administrar al sujeto la composicion farmaceutica en donde el agente inhibidor previene, Inhibe o reduce una biopelmula de P. gingivalis.

En un procedimiento se trata un sujeto que incluye tratamiento profilactico para enfermedad periodontal. Las enfermedades periodontales oscilan de una simple inflamacion de enda a enfermedad grave que produce lesion importante al tejido blando y hueso que soportan los dientes. La enfermedad periodontal incluye gingivitis y periodontitis. Bacterias tales como P. gingivalis producen inflamacion de las endas que se llama “gingivitis”. En la gingivitis, las endas se ponen rojas, se hinchan y pueden sangrar facilmente. Si no se trata la gingivitis, puede progresar a “periodontitis” (que significa “inflamacion alrededor de los dientes”). En las periodontitis, las endas se alejan de los dientes y forman “bolsas” que se infectan. El sistema inmunitario del cuerpo combate las bacterias a medida que la placa se propaga y crece debajo de la lmea de la enda. Si no se trata, los huesos, endas y tejido conjuntivo que soportan los dientes se destruyen. Los dientes pueden aflojarse eventualmente y tienen que sacarse.

Puede prepararse una composicion oral de la presente invencion que contiene la composicion farmaceutica anteriormente mencionada y usarse en diversas formas aplicables a la boca tales como dentifrico que incluye pastas de dientes, polvos dentales y dentifricos lfquidos, enjuagues bucales, trociscos, chiches, pastas dentales, cremas de masaje gingival, comprimidos para gargaras, productos lacteos y otros alimentos. Una composicion oral segun la presente invencion pueden ademas incluir adicionalmente componentes muy conocidos dependiendo del tipo y forma de una composicion oral particular.

En ciertas formas preferidas de la invencion, la composicion oral puede ser de caracter sustancialmente lfquido, tal como un enjuague o colutorio bucal. En una preparacion tal, el vehfculo es normalmente una mezcla de agua-alcohol que deseablemente incluye un humectante como se describe mas adelante. Generalmente, la relacion de peso de agua con respecto a alcohol esta en el intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 20:1. La cantidad total de mezcla de agua-alcohol en este tipo de preparacion esta normalmente en el intervalo de aproximadamente el 70 a aproximadamente el 99,9% en peso de la preparacion. El alcohol es normalmente etanol o isopropanol. Se prefiere etanol.

El pH de tales preparaciones lfquidas y otras preparaciones de la invencion esta generalmente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 y normalmente de aproximadamente 5,0 a 7,0. El pH puede controlarse con acido (por ejemplo, acido cftrico o acido benzoico) o base (por ejemplo, hidroxido sodico) o tamponarse (como con citrato, benzoato, carbonato o bicarbonato de sodio, hidrogenofosfato de disodio, dihidrogenofosfato de sodio, etc.).

En otras formas deseables de la presente invencion, la composicion farmaceutica puede ser de caracter sustancialmente solido o pastoso, tal como polvo dental, un comprimido dental o una pasta de dientes (crema dental) o dentffrico en gel. El vehfculo de tales preparaciones oral solidas o pastosas generalmente contiene material de pulido dentalmente aceptable.

En una pasta de dientes, el vehfculo lfquido puede comprender agua y humectante normalmente en una cantidad que oscila de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 80% en peso de la preparacion. Glicerina, propilenglicol, sorbitol y polipropilenglicol ejemplifican humectantes/vetnculos adecuados. Tambien son ventajosas mezclas lfquidas de agua, glicerina y sorbitol. En geles claros en los que el mdice de refraccion es una consideracion importante se emplean preferentemente aproximadamente 2,5 - 30% peso/peso de agua, 0 a aproximadamente 70% peso/peso de glicerina y aproximadamente 20 - 80% peso/peso de sorbitol.

Pasta de dientes, cremas y geles normalmente contienen un espesante o agente gelificante natural o sintetico en proporciones de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 10, preferentemente aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 5% peso/peso. Un espesante adecuado es hectorita sintetica, una arcilla coloidal sintetica compleja de magnesio-silicato de metal alcalino disponible, por ejemplo, como Laponite (por ejemplo CP, SP 2002, D) comercializada por Laporte Industries Limited. Laponite D tiene aproximadamente en peso 58,00% de SiO2, 25,40% de MgO, 3,05% de Na2O, 0,98% de U2O, y algo de agua y metales traza. Su gravedad espedfica real es 2,53 y tiene una densidad a granel aparente de 1,0 g/ml al 8% de humedad.

Otros espesantes adecuados incluyen musgo de Irlanda, carragenina iota, goma tragacanto, almidon, polivinilpirrolidona, hidroxietilpropilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa (por ejemplo, disponible como Natrosol), carboximetilcelulosa de sodio y sflice coloidal tal como Syloid finamente molido (por ejemplo, 244). Tambien pueden incluirse agentes solubilizantes tales como polioles humectantes tales como propilenglicol, dipropilenglicol y hexilenglicol, Cellosolves tales como metil Cellosolve y etil Cellosolve, aceites vegetales y ceras que contienen al menos aproximadamente 12 carbonos en una cadena lineal tal como aceite de oliva, aceite de ricino y petrolato, y esteres tales como acetato de amilo, acetato de etilo y benzoato de bencilo.

Se entendera que, como es convencional, las preparaciones orales se venderan normalmente o se distribuiran de otro modo en envases etiquetados adecuados. Asf, un frasco de colutorio bucal tendra una etiqueta que lo describe, en sustancia, como un colutorio bucal o enjuague bucal y que tiene indicaciones para su uso; y una pasta, crema o gel dental normalmente estara en un tubo colapsible, normalmente aluminio, plomo revestido o plastico, u otro dispensador exprimible, bombeable o presurizado para dosificar el contenido, que tiene una etiqueta que lo describe, en sustancia, como una pasta de dientes, gel o crema dental.

Pueden usarse agentes tensioactivos organicos en las composiciones de la presente invencion para lograr elevada accion profilactica, ayudar a alcanzar la dispersion a fondo y completa del agente activo en toda la cavidad bucal, y hacer las presentes composiciones mas cosmeticamente aceptables. El material tensioactivo organico es preferentemente de naturaleza anionica, no ionica o anfolftica y preferentemente no interacciona con el agente activo. Se prefiere emplear como agente tensioactivo un material detersivo que confiere a la composicion propiedades detersivas y espumantes. Ejemplos adecuados de tensioactivos anionicos son sales solubles en agua de monosulfatos de monogliceridos de acidos grasos superiores tales como la sal de sodio del monoglicerido monosulfatado de acidos grasos de aceite de coco hidrogenado, alquilsulfatos superiores tales como laurilsulfato de sodio, alquilarilsulfonatos tales como dodecilbencenosulfonato de sodio, alquilsulfoacetatos superiores, esteres de acidos grasos superiores de 1,2-dihidroxipropanosulfonato, y las acilamidas alifaticas superiores sustancialmente saturadas de compuestos de acido aminocarbox^lico alifatico inferior, tales como aquellos que tienen 12 a 16 carbonos en los radicales acido graso, alquilo o acilo, y similares. Ejemplos de las ultimas amidas mencionadas son N-lauroilsarcosina, y las sales de sodio, potasio y etanolamina de N-lauroil-, N-miristoil- o N-palmitoil-sarcosina que deben estar sustancialmente libres de jabon o material de acido graso superior similar. El uso de estos compuestos de sarcosinato en las composiciones orales de la presente invencion es particularmente ventajoso, ya que estos materiales presentan un efecto marcado prolongado en la inhibicion de la formacion de acido en la cavidad bucal debido a la degradacion de hidratos de carbono, ademas de ejercer alguna reduccion en la solubilidad del esmalte dental en disoluciones acidas. Ejemplos de tensioactivos no ionicos solubles en agua adecuados para su uso son productos de condensacion de oxido de etileno con diversos compuestos que contienen hidrogeno reactivo con ellos que tienen cadenas hidrofobas largas (por ejemplo, cadenas alifaticas de aproximadamente 12 a 20 atomos de carbono), cuyos productos de condensacion (“etoxameros”) contienen restos de polioxietileno hidrofilos, tales como productos de condensacion de poli(oxido de etileno) con acidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, alcoholes polihidroxilados (por ejemplo, monoestearato de sorbitano) y poli(oxido de propileno) (por ejemplo, materiales Pluronic).

El agente tensioactivo esta normalmente presente en una cantidad de aproximadamente el 0,1-5% en peso. Es digno de mencion que el agente tensioactivo pueda ayudar en la disolucion del agente activo de la invencion y asf disminuir la cantidad de humectante solubilizante necesario.

Diversos otros materiales pueden incorporarse en las preparaciones orales de la presente invencion tales como agentes blanqueantes, conservantes, siliconas, compuestos de clorofila y/o material amoniacal tal como urea, fosfato de diamonio y mezclas de los mismos. Estos adyuvantes, si estan presentes, se incorporan en la preparaciones en cantidades que no afectan sustancialmente adversamente las propiedades y caractensticas deseadas.

Tambien puede emplearse cualquier material aromatizante o edulcorante adecuado. Ejemplos de constituyentes aromatizantes adecuados son aceites aromatizantes, por ejemplo, aceite de menta verde, menta piperita, gaulteria, sasafras, clavo, salvia, eucalipto, mejorana, canela, limon y naranja, y salicilato de metilo. Edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, maltosa, sorbitol, xilitol, ciclamato de sodio, perilartina, AMP (aspartilfenilalanina, ester metilico), sacarina y similares. Adecuadamente, aromas y edulcorantes pueden comprender cada uno o juntos de aproximadamente el 0,1% al 5% mas de la preparacion.

Las composiciones de la presente invencion tambien pueden incorporarse en pastillas para chupar, o en chicle u otros productos, por ejemplo, por agitacion en una base de goma caliente o recubriendo la superficie externa de una base de goma, ilustrativos de los cuales son jelutong, latex de caucho, resinas de vinilita, etc., deseablemente con plastificantes o ablandadores convencionales, azucar u otros edulcorantes o tales como glucosa, sorbitol y similares.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un kit de partes para su uso en el metodo como se describe eb la reivindicacion 1, en donde el kit incluye (a) una composicion de agente inhibidor de polipeptidos y (b) un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Deseablemente, el kit incluye adicionalmente instrucciones para su uso para inhibir la formacion de biopelfcula en un paciente en necesidad de tal tratamiento.

Composiciones previstas para uso oral pueden prepararse segun cualquier procedimiento conocido en la tecnica para la fabricacion de composiciones farmaceuticas y tales composiciones pueden contener uno o mas agentes seleccionados del grupo que consiste en edulcorantes, aromatizantes, colorantes y conservantes con el fin de proporcionar preparaciones farmaceuticamente elegantes y agradables al paladar. Los comprimidos contienen el principio activo en mezcla con excipientes farmaceuticamente aceptables no toxicos que son adecuados para la fabricacion de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes tales como carbonato calcico, carbonato sodico, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes granulantes y de disgregacion, por ejemplo, almidon de mafz, o acido algmico: aglutinantes, por ejemplo almidon, gelatina o goma arabiga, y lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, acido estearico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden recubrirse por tecnicas conocidas para retrasar la disgregacion y absorcion en el tubo gastrointestinal y asf proporcionar una accion sostenida durante un periodo mas largo. Por ejemplo, puede emplearse un material de retraso temporal tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Formulaciones para uso oral tambien pueden presentarse como capsulas de gelatina dura en las que el principio activo se mezcla con un diluyente solido inerte, por ejemplo, carbonato calcico, fosfato de calcio o caolm, o como capsulas de gelatina blanda en las que el principio activo se mezcla con agua o un medio de aceite, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina lfquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricacion de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes de suspension, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arabiga; los dispersantes o humectantes pueden ser una fosfatida que se produce naturalmente, por ejemplo, lecitina, o productos de condensacion de un oxido de alquileno con acidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensacion de oxido de etileno con alcoholes alifaticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y antudridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de polietilensorbitano.

Las suspensiones acuosas tambien pueden contener uno o mas conservantes, por ejemplo, benzoatos tales como etilo, o p-hidroxibenzoato de n-propilo, uno o mas colorantes, uno o mas aromatizantes, y uno o mas edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Pueden formularse suspensiones aceitosas suspendiendo los principios activos en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sesamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina lfquida. Las suspensiones aceitosas pueden contener un espesante, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetflico. Edulcorantes tales como aquellos expuestos anteriormente y aromatizantes pueden anadirse para proporcionar preparaciones orales agradables al paladar. Estas composiciones pueden preservarse mediante la adicion de un antioxidante tal como acido ascorbico.

Las comparaciones de abundancias de protema de P. gingivalis entre crecimiento como un estado de biopelmula y planctonico revelaron muchos cambios al proteoma de esta bacteria patogena, en particular la menor abundancia de las enzimas fumarato reductasa esenciales para el catabolismo de glutamato/aspartato. En un estudio separado que implica comparar los cambios del proteoma de P. gingivalis de hemo limitado y en exceso, hubo un desplazamiento observable en los patrones de fermentacion durante la limitacion a hemo que condujo a elevada produccion de acetato y estuvo de acuerdo con los cambios coordinados en abundancia de enzimas en la principal ruta catabolica de P. gingivalis. De particular interes fue la coherente menor abundancia de las enzimas fumarato reductasa durante la limitacion de hemo y el crecimiento de biopelmula. Los presentes inventores demostraron posteriormente la utilidad de tres agentes inhibidores de Frd (oxantel, morantel y tiabendazol) contra la supervivencia de P. gingivalis y concentraciones inhibidoras submmimas (CIsubM) para alterar el desarrollo normal de la biopelmula.

Como se usa en el presente documento, el termino “antagonista” se refiere a un acido nucleico, peptido, anticuerpo, ligandos u otra entidad qmmica que inhibe la actividad biologica del polipeptido de interes. Un experto en la materia estana familiarizado con tecnicas de prueba y seleccion de antagonistas adecuados de una protema espedfica, tales tecnicas incluinan ensayos de union.

En toda esta memoria descriptiva, la palabra “comprenden”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se entenderan que implican la inclusion de un elemento, numero entero o etapa establecido, o grupo de elementos, numeros enteros o etapas, pero no la exclusion de cualquier otro elemento, numero entero o etapa, o grupo de elementos, numeros enteros o etapas.

Con el fin de que la naturaleza de la presente invencion pueda entenderse mas claramente, aspectos preferidos de la invencion se describiran ahora en mas detalle con referencia a las siguientes tablas y ejemplos de composiciones.

Crecimiento y recogida de P. gingivalis para estudios de biopelcula frente a planctonicos

Se cultivo W50 de Porphyromonas gingivalis (ATCC 53978) en cultivo continuo usando un quimiostato BioFlo modelo C-30 (New Brunswick Scientific) con un volumen de trabajo de 400 ml. Tanto el recipiente de cultivo como el deposito de medio se gasifico continuamente con 10% de CO2 y 90% de N2. La temperatura de crecimiento fue 37 °C y el medio de crecimiento de infusion de cerebro-corazon (Oxoid) se mantuvo a pH 7,5. Durante todo el crecimiento, el potencial redox se mantuvo a -300 mV. La tasa de dilucion fue 0,1 h-1, dando un tiempo de generacion medio (TGM) de 6,9 h. Se anadieron HCl de cistema esteril (0,5 g/l) y hemina (5 mg/l). El cultivo alcanzo el estado estacionario aproximadamente 10 dfas despues de la inoculacion y se mantuvo durante otros 30 dfas hasta que se habfa desarrollado una densa capa de biopelmula sobre las superficies verticales del recipiente.

Todas las manipulaciones de celulas bacterianas se llevaron a cabo sobre hielo o a 4 °C. Durante la recogida, las celulas planctonicas se decantaron en un recipiente limpio y la biopelmula se lavo dos veces suavemente con tampon PGA (NaH2PO410,0 mM, KCl 10,0 mM, acido cftrico 2,0 mM, MgCh 1,25 mM, CaCl220,0 mM, ZnCl225,0 mM, MnCh 50,0 mM, CuCl25,0 mM, CoCh 10,0 mM, H3BO35,0 mM, Na2MoO40,1 mM, HCl de cistema 10 mM con el pH ajustado a 7,5 con NaOH 5 M a 37 °C), seguido de recogida de la biopelmula en un tubo de centnfuga de 50 ml.

Celulas planctonicas y de biopelmula se lavaron entonces 3 veces (7000 g) con tampon PGA y ambas muestras se resuspendieron a un volumen final de 30 ml con tampon de lavado (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl25 mM, pH 8,0, inhibidor de proteinasa (Sigma)) y se lisaron por 3 pases a traves de una celda a presion de prensa francesa (SLM, AMINCO) a 138 MPa. Las celulas lisadas se centrifugaron a 2000 g durante 30 min para eliminar cualquier celula sin romper. El sobrenadante se centrifugo adicionalmente a 100000 g durante 1 h para separar las celulas lisadas en sus fracciones solubles e insolubles (envuelta celular). La fraccion de la envuelta celular se lavo adicionalmente 3 veces con tampon de lavado a 100000 g, durante 20 min cada vez para eliminar cualquier contaminacion soluble. Todas las muestras se congelaron y se guardaron entonces a -80 °C.

Crecimiento y recogida de P. gingivalis para estudios de limitacidn y exceso de hemo

Se cultivo W50 de P. gingivalis en cultivo continuo usando un fermentador/biorreactor Bioflo 110 (New Brunswick Scientific) con un volumen de trabajo de 400 ml. El medio de crecimiento fue 37 g/l de medio de infusion de cerebro-corazon (Oxoid) complementado con 5 mg/ml de clorhidrato de cistema esterilizado por filtracion, 5,0 |jg/ml de hemina (exceso de hemo) o 0,1 jg/ml de hemina (de hemo limitada). El crecimiento se inicio inoculando el recipiente de cultivo con un cultivo en lotes de 24 h (100 ml) de P. gingivalis cultivado en el mismo medio (exceso de hemo). Despues de 24 h de crecimiento de cultivo en lotes, la bomba del deposito de medio se encendio y el flujo de medio se ajusto para dar una tasa de dilucion de 0,1 h-1 (tiempo de generacion medio (TGM) de 6,9 h). La temperatura del recipiente se mantuvo a 37 °C y el pH a 7,4 ± 0,1. El cultivo se gasifico continuamente con 5% de CO2 en 95% de N2. Las celulas se recogieron durante el crecimiento en estado estacionario, se lavaron tres veces con tampon de lavado (Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, NaCl 150 mM, MgCh 5 mM) a 5000 g durante 30 min y se rompieron con 3 pases a traves de una celda de presion francesa (SLM, AMINCO) a 138 MPa. Las celulas lisadas se centrifugaron entonces a 2000 g durante 30 min para eliminar las celulas sin romper, seguido de ultracentrifugacion a 100000 g, produciendo una fraccion soluble (sobrenadante) y de membranas. Todas las fracciones se llevaron a cabo sobre hielo.

Preparacion y analisis de biopelcula marcada con 18O proteolftica y fraccion de la envuelta de celulas planctonicas La fraccion de la envuelta de celulas se resuspendio primero en 1 ml de tampon de lavado helado que contema 2% de SDS, luego se llevaron a cabo sonicacion y agitacion con vortex para ayudar en la resuspension del sedimento. La etapa final en la resuspension implico el uso de una aguja de insulina de calibre 29 para ayudar a romper las partmulas. La mezcla se centrifugo entonces a 40000 g para eliminar partmulas insolubles y la concentracion de protema del sobrenadante se determino usando el reactivo BCA (Pierce) segun las instrucciones del fabricante.

Las muestras resuspendidas se sometieron a precipitacion usando 5 volumenes de acetona helada durante la noche a -20 °C que ayudaron adicionalmente a inactivar cualquier actividad proteolftica. Despues de la precipitacion con acetona, ambas muestras se resuspendieron a una concentracion final de 3 mg/ml con Tris 25 mM a pH 8,0 y 1% de SDS ayudado por sonicacion intermitente, agitacion con vortex y el uso de una aguja de insulina de calibre 29. Entonces se llevo a cabo un segundo ensayo de protema BCA para normalizar la cantidad de protema final.

Se llevo a cabo electroforesis en gel sobre un gel NuPAGE segun el protocolo del fabricante usando tampon de electroforesis MOPs (NuPAGE, Invitrogen), excepto que las muestras se hirvieron a 99 °C durante 5 min antes de la carga sobre 10% de gel NuPAGE en 10 pocillos con MOPs como tampon de electroforesis. Las muestras de biopeftcula y planctonicas (30 jg cada una) se cargaron en carriles adyacentes sobre el gel. Entonces se llevo a cabo SDS-PAG^e a 126 V (constante) a 4 °C hasta que el frente de colorante estuvo a aproximadamente 1 cm de la parte inferior del gel. Para el duplicado biologico, el gel usado fue un gel con gradiente del 4-12% de NUPAGE usando MOPs como tampon de electroforesis para dar un patron similar, pero no exacto, de separacion de manera que se venciera la variacion de potencial de una banda de protema que se separa en dos fracciones. La tincion se llevo a cabo durante la noche en azul brillante de Coomassie G-250 (31) seguido de tincion durante la noche en H2O ultrapura.

Los dos carriles de gel se dividieron en 10 bandas de gel de tamanos iguales usando una plantilla hecha a medida y cada seccion se corto en cubos de aproximadamente 1 mm3. El destenido se llevo a cabo 3 veces en una disolucion de NH4HCO350 mM/ACN (1:1). Despues del destenido, los cubos de gel se deshidrataron con 100% de ACN, seguido de rehidratacion/reduccion con una disolucion de ditiotreitol 10 mM en tampon ABC (NH4HCO350 mM) a 56 °C durante 30 min. La disolucion en exceso se elimino antes de anadir yodoacetamida 55 mM en tampon ABC durante 60 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Despues de la reaccion de alquilacion, los cubos de gel se lavaron 3 veces en tampon ABC, seguido de deshidratacion dos veces en 100% de ACN durante 10 min. Los cubos de gel se secaron adicionalmente bajo centrifugacion usando Speedvac durante 90 min. La digestion se llevo a cabo en 60 j l de disolucion por seccion de gel que contema 2 jg de tripsina modificada de calidad para secuencia (Promega) y tampon ABC de A concentracion preparado en tanto H216O como H218O (H218O, >97% de pureza, Marshall Isotopes) durante 20 h a 37 °C. Despues de la digestion, los peptidos se extrajeron dos veces del gel usando una disolucion de 50% de ACN/0,1% de TFA en su agua respectiva (H216O/H218O) y 0,1% de TFA con la ayuda de sonicacion durante 5 min cada vez. El extracto reunido se hirvio a 99 °C durante 5 min para inactivar la tripsina, seguido de liofilizacion durante 48 h.

Los peptidos liofilizados se resuspendieron en una disolucion de 5% de ACN/0,1% de TFA en su agua respectiva (H216O/H218O) justo antes del analisis usando analisis de nanoHPLC y EM MALDI TOF/EM. La disolucion de peptido (20 jl) se cargo entonces sobre un sistema Ultimate Nano LC (LC Packings) usando un autoinyector FAMOS (LC Packings) en modo de recogida de j l avanzado. Las muestras se cargaron primero sobre una columna trampa (300 jm de diametro interno x 5 mm) a 200 jl/min durante 5 min. La separacion se logro usando una columna de fase inversa (LC Packings, C18 PepMap100, 75 jm de d.i. x 15 cm, 3 jm, 100A) con una velocidad de flujo de 300 nl/min, y se eluyo en 0,1% de acido formico con un gradiente de ACN de 0-5 min (0%), 5-10 min (0­ 16%), 10-90 min (16-80%), 90-100 min (80-0%).

Los eluyentes se aplicaron en manchas lineales sobre placas AnchorChip (Bruker Daltonics) previamente moteadas usando el robot Proteineer Fc (Bruker Daltonics) a intervalos de 30 s. Antes del moteado, cada posicion de mancha se moteo previamente con 0,2 j l de H2O ultrapura para reducir la concentracion del acetonitrilo durante el procedimiento de cristalizacion con la matriz. La placa se lavo con fosfato de amonio 10 mM y 0,1% de TFA y se seco al aire antes del analisis automatizado usando MALDI-TOF/TOF (Ultraflex con mejora LIFT II, Bruker Daltonics). El analisis por EM del digesto se llevo inicialmente a cabo en modo reflectron midiendo de 800 a 3500 Da usando un voltaje de aceleracion de 25 kV. Todos los espectros de EM se produjeron a partir de 8 conjuntos de 30 disparos de laser, necesitando cada conjunto tener una senal con respecto a ruido, S/R >6, resolucion >3000 para incluirse. La calibracion del instrumento se realizo externamente con iones [M+H]+ de los patrones internos previamente moteados (angiotensina II, angiotensina I, neurotensina, Renina_sustrato y ACTH_Clip) para cada grupo de cuatro muestras. El modo LIFT para MALDI-TOF/TOF se llevo a cabo en un modo completamente automatizado usando el software Flexcontrol y WarpLC (Bruker Daltonics). En la etapa de TOF1, todos los iones se aceleraron a 8 kV y posteriormente se elevo a 19 kV en la celda LIFT y todos los espectros de EM/EM se produjeron a partir de la acumulacion de 550 disparos de laser consecutivos.

La seleccion de precursores parentales se llevo a cabo usando el software WarpLC (ver 1.0) con el flujo de trabajo de SILE (experimento de marcado de isotopos estables) de CL-MALDI. Solo se selecciono el pico mas abundante de cada par pesado o ligero separado 4 Da, siempre que su S/R fuera >50. Los compuestos separados menos de seis fracciones de CL-MALDI se consideraron iguales y por tanto solo se seleccionaron una vez.

Se generaron listas de picos usando Flexanalysis 2.4 Compilacion 11 (Bruker Daltonics) con el algoritmo de busqueda de picos Apex con S/R > 6. El barrido de EM se suavizo una vez con el algoritmo de Savitzky Golay usando una anchura de 0,2 m/z y la resta de la lmea base se logro usando el algoritmo de Median con planicidad de 0,8.

La identificacion de protemas se logro usando el motor de busqueda MASCOT (MASCOT version 2.1.02, Matrix Science) sobre datos de EM/EM buscados por comparacion con la base de datos de P. gingivalis obtenida de la pagina web de The Institute for Genomic Research (TIGR) (www.tigr.org). Los parametros de busqueda de MASCOT fueron: estado de carga 1+, tripsina como proteasa, se permitio la ausencia de una escision y una tolerancia de 250 ppm para EM y 0,8 m/z para picos de EM/EM. La modificacion fija se fijo para carbamidometilo de cistema y la modificacion variable fue residuos de lisina y arginina marcados con 18O del extremo C.

Se empleo una estrategia de base de datos inversa como se ha descrito previamente (32) para determinar la puntuacion de MASCOT de peptido mmimo requerida para omitir positivos falsos para la identificacion de un unico peptido. Brevemente, la base de datos consiste en tanto la secuencia de cada protema de P. gingivalis predicha en su orientacion normal como las mismas protemas con su secuencia invertida (3880 secuencias). El conjunto de datos de EM/EM completo se busco entonces por comparacion con la base de datos combinada para determinar la menor puntuacion de Mascot para dar el 0% de positivos falsos. Se definio un positivo falso como coincidencia positiva con la secuencia invertida (rojo en negrita y por encima de la puntuacion umbral de peptidos). Se determino que una tasa de positivos falsos para peptidos diana individuales era del 0,5% con puntuaciones de iones de peptidos Mascot de >umbral y <25. Cuando la puntuacion de iones de peptidos Mascot >30, no hubo coincidencia con la base de datos inversa. Con el fin de aumentar la confianza de identificacion para el peptido diana individual, los presentes inventores usaron una puntuacion de iones de peptido Mascot minima de >50 que da una probabilidad de dos ordenes de magnitud menor de identificacion incorrecta que si se usara una puntuacion de 30, segun el algoritmo de puntuacion de Mascot.

Los peptidos coincidentes se evaluaron usando los siguientes criterios, i) al menos 2 unicos peptidos con una puntuacion basada en probabilidad correspondiente a un valor de p <0,05 se consideraron positivamente identificados (coincidencias rojas en negrita requeridas) en los que la puntuacion es -log X 10log(P) y P es la probabilidad de que la coincidencia observada sea un evento al azar (33), ii) si solo se uso un unico peptido en la identificacion de una protema espedfica (la identificacion de tanto peptido marcado pesado como ligero se considera uno), la puntuacion de iones de peptidos MASCOT debe ser superior a 50 o ese peptido se identifica en mas de uno de los cuatro experimentos independientes (2 duplicados biologicos y 2 duplicados tecnicos).

Debido a la incorporacion mixta de uno o dos atomos de 18O en los peptidos, la contribucion de la abundancia natural del isotopo de 18O y la pureza de H218O (a=0,97), las relaciones de los peptidos R se corrigieron matematicamente usando la ecuacion:

Io, I1 y I2 se calcularon segun las siguientes ecuaciones (27)

En las que So, S2 y S4 son las intensidades medidas del pico monoisotopico para el peptido sin marca de 18O, el pico con 2 Da superior al pico monoisotopico y el pico con 4 Da superior al pico monoisotopico respectivamente (Fig 1 A). Jo, J2 y J4 son las intensidades relativas teoricas correspondientes de la envuelta isotopica del peptido calculadas a partir de isotopos de EM (http://prospector.ucsf.edu). Sin embargo, cuando la intensidad de los segundos picos isotopicos (S1 y S5) fue mas intensa que los primeros picos isotopicos (So y S4), la relacion se calculo simplemente como S1 dividido entre S5. Esto fue cierto especialmente para peptidos grandes superiores a 2000 m/z en los que la contribucion del quinto pico isotopico del peptido marcado con 16O al pico S4 se vuelve significativa. El calculo de la incorporacion de 16O18O mixta se determino por la diferencia en S2 experimental y S2 teorica (J2) como un porcentaje de S4 experimental.

Las relaciones de abundancia de protemas se determinaron promediando todos los peptidos identificados de la misma protema, incluso cuando la misma protema se identificara en mas de una seccion de gel. Los datos de cada duplicado “normal” se combinaron con las relaciones invertidas de su duplicado “inverso” respectivo proporcionando una relacion promedio y error estandar para cada protema en cada duplicado biologico. La normalizacion de ambos duplicados biologicos se llevo a cabo entonces similarmente a la previamente informada (34, 35). Brevemente, la relacion promediada para cada duplicado biologico se multiplico por un factor de manera que la media geometrica de las relaciones fuera igual a uno.

Preparacion y analisis de celulas de hemo limitado y en exceso marcadas con ICAT

El marcado y la separacion de protemas se basaron en el enfoque de EM geLC/EM (Li y col., 2003) usando el reactivo ICAT escindible (Applied Biosystems). En el documento PCT/AU2007/000890 se ha tomado otro enfoque proteomico que se incorpora en el presente documento por referencia. La protema se precipito primero usando TCA (16%) y se solubilizo con urea 6 M, EDTA 5 mM, 0,05% de SDS y Tris-HCl 50 mM a pH 8,3. La concentracion de protema se determino usando el reactivo de protema BCA y se ajusto a 1 mg/ml. 100 |jg de protema de cada condicion de crecimiento se redujeron individualmente usando 2 j l de clorhidrato de Tris(2-carboxi-etil)fosfina 50 mM durante 1 h a 37 °C. La protema reducida de la condicion de crecimiento de limitacion de hemo se alquilo entonces con el reactivo ICATpesado y la protema de la condicion de crecimiento de hemo en exceso con el reactivo ICATligero. Las dos muestras se combinaron luego y se sometieron a SDS-PAGE sobre un gel precolado Novex al 10% de NuPAGE (Invitrogen). El gel se tino durante 5 min usando SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen), seguido de destenido con agua. El carril de gel se escindio entonces en 20 secciones desde la parte superior del gel hasta el frente de colorante.

Las secciones escindidas se trocearon adicionalmente en cubos de 1 mm3 y se digirieron en gel durante la noche y se extrajeron dos veces segun el procedimiento anterior. El sobrenadante reunido se seco a vacm reducido a aproximadamente 50 j l seguido de mezcla con 500 j l de tampon de carga de afinidad antes de cargar sobre la columna de afinidad segun instruccion del fabricante (Applied Biosystems). Los peptidos eluidos se secaron y la marca de biotina se escindio con TFA puro a 37 °C durante 2 h, seguido de secado a vacm reducido. Las muestras secas se suspendieron en 35 j l de 5% de acetonitrilo en 0,1% de TFA.

Se llevo a cabo EM usando un espectrometro de masas de trampa de iones Esquire HCT (Bruker Daltonics) acoplado a un sistema UltiMate Nano LC (LC Packings - Dionex). La separacion se logro usando una columna de fase inversa de LC Packings (C18 PepMap100, 75 jm de d.i. x 15 cm, 3 jm, 100A), y se eluyo en 0,1% de acido formico con el siguiente gradiente de acetonitrilo: 0-5 min (0%), 5-10 min (0-10%), 10-100 min (10-50%), 100-120 min (50-80%), 120-130 min (80-100%).

La salida de CL se conecto directamente con la fuente de nanopulverizacion. Las adquisiciones de EM se realizaron bajo un control de carga ionica de 100000 en el intervalo de m/z de 300-1500 con tiempo de acumulacion maximo de 100 ms. Si se usa GPF se usaron tres intervalos de m/z adicionales (300-800, 700-1200 y 1100-1500) para seleccionar iones precursores y cada intervalo de m/z se llevo a cabo por duplicado para aumentar el numero de peptidos identificados. La adquisicion de EM/EM se obtuvo durante un intervalo de masas de 100-3000 m/z y se realizo en hasta 10 precursores para el analisis de proteomas completo inicial y 3 para analisis de ICAT para los iones multiplemente cargados mas intensos con un tiempo de exclusion activa de 2 min.

Se generaron listas de picos usando DataAnalysis 3.2 (Bruker Daltonics) usando el algoritmo de busqueda de picos Apex con un umbral de deteccion de compuestos de 10000 y umbral de senal con respecto a ruido de 5. Se fijo una limitacion de carga global de 2 y 3 para datos exportados. La identificacion de protemas se logro usando el motor de busqueda MASCOT (MASCOT version 2.1.02, Matrix Science sobre datos de EM/EM buscados por comparacion con la base de datos de P. gingivalis obtenida de la pagina web de The Institute for Genomic Research (TIGR) (www.tigr.org). Los peptidos coincidentes se evaluaron adicionalmente usando los siguientes criterios, i) peptidos con una puntuacion de Mowse basada en probabilidad correspondiente a un valor de p de como maximo 0,05 se consideraron positivamente identificados, en los que la puntuacion es -log X 10(log(P)) y P es la probabilidad de que la coincidencia observada sea un evento al azar ii) si solo se uso un unico peptido en la identificacion de una protema espedfica y la puntuacion de MASCOT fue inferior a 30, se realizo verificacion manual de los espectros. Para aumentar la confianza en la identificacion de protemas marcadas con ICAT, especialmente para aquellas con peptidos diana individuales, se aplicaron filtros adicionales del siguiente modo: i) los peptidos pesados y ligeros de un par de ICAT deben haber presentado picos de elucion proximos como se ha determinado a partir de sus cromatogramas de iones extrafdos ii) para protemas con un peptido unico individual, este peptido debe haberse identificado mas de una vez (por ejemplo, en diferentes fracciones de SDS-PAGE o en tanto las formas de ICAT ligeras como pesadas iii) si un peptido individual no cumplio los criterios de (ii), la puntuacion de MASCOT debe haber sido >25, el valor de esperanza <0,01 y el espectro de EM/EM debe haber presentado una serie contigua de iones tipo 'b' o 'y' considerandose los iones intensos. Las determinaciones de positivos falsos fueron como se ha descrito anteriormente.

La relacion de peptidos isotopicamente marcados con 13C pesado con respecto a 12C ligero se determino usando un comando de DataAnalysis (Bruker Daltonics) y se verifico manualmente basandose en la medicion de la intensidad de picos monoisotopicos (intensidad de senal y area del pico) en un unico espectro de EM. El recuento de iones mmimo de iones parentales usados para la cuantificacion fue 2000 aunque >96% de tanto iones precursores pesados como ligeros fue >10000. En el caso de espectros escasamente resueltos, la relacion se determino a partir del area de los cromatogramas de iones extrafdos reconstruidos (CIE) de los iones parentales. Los promedios se calcularon para multiples peptidos derivados de un unica protema parental y se eliminaron valores atfpicos usando la prueba de Grubb con a =0,05.

La localizacion celular de protemas de P. gingivalis se predijo usando CELLO (http://cello.life.nctu.edu.tw (36)). Las predicciones extracelulares, de la membrana externa, de la membrana interna y periplasmicas se consideraron que eran de la fraccion de la envuelta.

Las concentraciones de acidos grasos de cadena corta (SCFA) en sobrenadantes de cultivo libres de celulas (sin inocular, hemo en exceso de y hemo limitado) se determinaron por cromatograffa de gases capilar basandose en el procedimiento de derivatizacion de Richardson y col. (37).

El coeficiente de correlacion (r) entre ambos duplicados biologicos se evaluo usando la funcion del coeficiente de correlacion de Pearson de Microsoft Excel. El coeficiente de la varianza (CV) se calculo por la desviacion estandar de las relaciones de abundancia de peptidos dividido entre la media, expresada como porcentaje.

Extraccion de acidos nucleicos para analisis transcriptomico

Se extrajo ARN de muestras de 5 ml de celulas de P. gingivalis recogidas directamente del quimiostato. A cada muestra se anadieron 0,2 volumenes de reactivo de estabilizacion de ARN (5% v/v de fenol en etanol absoluto). Las celulas se sedimentaron por centrifugacion (9000 g, 5 min, 25 °C), inmediatamente se congelaron en nitrogeno lfquido y se guardaron a -70 °C para el posterior procesamiento. Las celulas congeladas se suspendieron en 1 ml de reactivo TRlzol (Invitrogen) por 1 x 1010 celulas y luego se rompieron usando perlas de vidrio Lysing Matrix B (MP Biomedicals) y el homogeneizador Precellys 24 (Bertin Technologies, Francia). Las perlas de vidrio se eliminaron por centrifugacion y la fraccion de ARN se purifico segun el protocolo del fabricante de TRIzol (Invitrogen), excepto que se anadio etanol (a una concentracion final del 35%) en vez de isopropanol en la etapa de precipitacion de ARN y las muestras se transfirieron entonces a las columnas de centrifugacion del kit de aislamiento de ARN Illustra RNAspin Mini (GE Healthcare). El ARN se purifico segun las instrucciones del fabricante de la etapa de union mas adelante, que incluye tratamiento de ADNsa en columna para eliminar cualquier ADN residual. La integridad del ARN se determino usando la estacion de electroforesis automatizada Experion (Bio-Rad).

Se extrajo ADN genomico de celulas de P. gingivalis que se cultivaron en cultivo continuo usando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) segun las instrucciones del fabricante.

Diseno de micromatrices, hibridacion y analisis

Se imprimieron portaobjetos de micromatrices por Australian Genome Research Facility y consistieron en 1977 sondas de oligonucleotidos 60-meros disenados a medida para las regiones codificantes de protema predichas del genoma de W83 de P. gingivalis que incluyen regiones codificantes de protema adicionales predichas por el proyecto Oralgen de Los Alamos National Laboratory. Se incluyeron sondas de control del conjunto de muestras de micromatrices (MSP) para ayudar en la normalizacion dependiente de la intensidad. El complemento completo de sondas se imprimio 3 veces por portaobjetos de micromatriz sobre portaobjetos recubiertos con UltraGAPS de Corning.

Los portaobjetos se hibridaron usando tanto muestras con hemo en exceso como de hemo limitadas marcadas con Cy3, se combinaron con una referencia de ADN genomico universal marcada con Cy5 (GE Lifesciences). Se sintetizo ADNc a partir de 10 |jg de ARN total usando el sistema SuperScript plus indirect cDNA labelling (Invitrogen), con 5 jg de hexameros al azar (Invitrogen) para el cebado de la reaccion de smtesis de ADNc. El ADNc se marco con Cy3 usando el paquete de colorante reactivo despues del marcado Amersham CyDye (GE Lifesciences) y se purifico usando el modulo de purificacion del sistema de marcado Invitrogen. Se sintetizo ADNc genomico marcado con Cy5-dUTP de un modo similar a partir de 400 ng de ADN, usando el sistema BioPrime Plus Array CGH Indirect Genomic Labelling (Invitrogen).

Antes de la hibridacion, los portaobjetos de micromatrices se sumergieron durante 1 h en disolucion de bloqueo (35% de formamida, 1% de BSA, 0,1% de SDS, 5X SSPE [1 X SSPE es NaCl 150 mM, NaH2PO410 mM, EDTA 1 mM]) a 42 °C. Despues de bloquear los portaobjetos se lavaron brevemente en H2O, seguido de 99% de etanol y luego se secaron por centrifugacion. Los ADNc marcados se resuspendieron en 55 j l de tampon de hibridacion (35% de formamida, 5X SSPE, 0,1% de SDS, 0,1 mg ml-1 de ADN de esperma de salmon) desnaturalizado a 95 °C durante 5 min, luego se aplicaron a portaobjetos y se cubrieron con LifterSlips (Erie Scientific). La hibridacion se realizo a 42 °C durante 16 h. Tras la hibridacion, los portaobjetos se lavaron sucesivamente en 0,1% de SDS mas 2X SSC [1X SSC es NaCl 150 mM, citrato de sodio 15 mM] (5 min a 42 °C, todos los lavados posteriores se realizaron a temperatura ambiente), 0,1% de SDS mas 0,1X SSC (10 min), 0,1X SSC (4 lavados, 1 min cada uno), y luego sumergiendo rapidamente en 0,01X SSC, luego 99% de etanol y usando centrifugacion para secar los portaobjetos.

Los portaobjetos se barrieron usando un escaner de micromatrices GenePix 4000B y las imagenes se analizaron usando el software GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices). Se usaron tres portaobjetos para cada tratamiento (limitacion de hemo o exceso de hemo) que representan tres duplicados biologicos.

El analisis de imagenes se realizo usando el software GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices), y se usaron valores de referencia “morf” como los calculos estimados de referencia en el posterior analisis. Para identificar genes diferencialmente expresados, el paquete de software LIMMA se uso con un corte de P <0,005. Dentro de la matriz se realizo la normalizacion ajustando una curva de Loess global a traves de los puntos de control de MSP y aplicando la curva a todos los otros puntos. Se uso el metodo de Benjamini Hochberg para controlar la tasa de descubrimientos falsos para corregir multiples pruebas.

Las predicciones de genes se basaron en la anotacion del genoma de W83 de P. gingivalis a partir del The Institute for Genomic Research (TIGR, www.tigr.org). La prediccion de operones se llevo a cabo a partir de la pagina web Microbesonline (http://microbesonline.org)

Respuesta de P. gingivalis a limitacion de hemo como se ha determinado usando analisis de micromatrices de ADN Un analisis de micromatrices de ADN del efecto del crecimiento limitado por hemo sobre la expresion genica global de P. gingivalis se llevo a cabo bajo condiciones de crecimiento identicas a las empleadas para el analisis proteomico. El analisis de los datos de tres duplicados biologicos identificaron un total de 160 genes que mostraron regulacion diferencial estadfsticamente significativa entre exceso de hemo y limitacion de hemo, mostrando la mayona de estos genes elevados niveles de expresion en condiciones de limitacion de hemo y siendo solo 8 genes regulados por disminucion. Se predijo que muchos de los genes regulados por incremento estaban en operones y la mayona de estos mostraron cambios similares en niveles de transcritos (Tabla 3 y 5). Hubo un amplio acuerdo entre los datos transcriptomicos proteomicos con una correlacion significativa entre los dos conjuntos de datos en los que se observo regulacion diferencial tras la limitacion de hemo [correlacion de Spearman 0,6364, p < 0,05]. Sin embargo, para algunas de las protemas que muestran diferencias en abundancia del analisis proteomico, el analisis transcriptomico de los genes correspondientes no detecto ninguna diferencia estadfsticamente significativas en la abundancia del ARNm. Los analisis de micromatrices tendieron a identificar solo aquellos genes que codificaban protemas que teman grandes cambios en abundancia como se ha determinado por el analisis proteomico (Tablas 3 y 5). Si se encontro que protema y transcrito del mismo gen estaban significativamente regulados por limitacion de hemo, la mayona mostro la misma direccion de regulacion. Las excepciones fueron dos productos genicos, PG0026, una protema de la familia putativa CTD de la proteinasa de la superficie celular y PG2132, una fimbrilina (FimA). Estas protemas disminuyeron en abundancia en el analisis proteomico bajo limitacion de hemo, pero se predijo que se regulaban por incremento por el analisis transcriptomico. Ambas de estas protemas estan localizadas en la superficie celular y es bastante posible que sean tanto liberadas de la superficie celular como modificadas postraduccionalmente lo que podna descartarlas de ser identificadas como reguladas por incremento en el analisis proteomico.

Susceptibilidad de P. gingivalis a agentes inhibidores de Frd

El efecto de agentes inhibidores de Frd sobre P. gingivalis se llevo a cabo en cultivos lfquidos. Brevemente, W50 se cultivo en 200 ml de medio BHI hasta DO de 0,6 (~2,9 x 108 ufc/ml). Las celulas se resuspendieron entonces en medio de crecimiento fresco a una concentracion final de 2,5 x 107 ufc/ml. Se disolvieron pamonato de oxantel, citrato de morantel y tiabendazol (Sigma) en DMSO para lograr concentraciones madre de 250 mM. Entonces se mezclaron 4 pl de la disolucion de prueba con 196 pl de suspension de celulas y se transfirieron a placas de fondo plano de 96 pocillos, seguido de incubacion a 37 °C en condiciones anaerobias y se monitorizaron cada hora durante un periodo de 50 h midiendo la densidad optica del cultivo a 620 nm usando un lector de microplacas iEMS (Labsystems OY Research Technologies Division). Los tiempos de generacion media de P. gingivalis en presencia de diferentes agentes inhibidores se calcularon dividiendo el tiempo de duplicacion [(logi0Nt -logi0N0) /logi02] entre el tiempo (Nt - N0) en la que Nt y N0 son poblacion de celulas en el tiempo t y tiempo cero, respectivamente.

Efectos de agentes inhibidores de Frd sobre biopelcula de P. gingivalis

La formacion de biopelmula de P. gingivalis durante 48 h en un modo estatico de 96 pocillos se determino como se ha descrito previamente. Brevemente, celulas ATCC 33277 de P. gingivalis se resuspendieron a una densidad de celulas final de 2,5 x 107 antes de mezclar con las sustancias de prueba, seguido de transferencia a placas de fondo plano de 96 pocillos, y se incubaron anaerobicamente a 37 °C. La evaluacion de la masa de biopelmula se llevo a cabo a 24 h y 48 h lavando las celulas dos veces con 250 pl de agua ultrapura para eliminar celulas adheridas sueltas, seguido de secado a 37 °C durante 3 h. La biopelmula seca se tino entonces en una disolucion de 0,1% de cristal violeta durante 15 min y se lavo 2 veces con 250 pl de agua ultrapura. La tincion con cristal violeta se disolvio entonces de la biopelmula usando una disolucion de 80% de etanol y 20% de acetona durante 2 min mediante pipeteado repetido antes de transferir a una nueva placa de 96 pocillos para la medicion de la densidad optica a 620 nm.

Cultivo de biopelcula en celdas de flujo y analisis por CSLM

El cultivo de biopelmula de ATCC 33277 de P. gingivalis en celdas de flujo fue similar al previamente descrito con varias modificaciones. Se fijo un sistema de celda de flujo de 3 canales (Stovall Life Science, EE.UU.) en una camara anaerobia (estacion de trabajo anaerobia MK3; Don Whitley Scientific Ltd.) y se modifico con tubos de bomba de silicona (Gilson, Francia) y llaves de paso para la inoculacion, prueba y tincion de las biopelmulas bacterianas. Todas las partes se ensamblaron y se bombeo 0,5% de hipoclorito de sodio en el sistema y se dejo durante la noche para esterilizar el sistema. Luego se uso agua esteril (200 ml) para lavar el sistema antes de la adicion del medio de crecimiento. El sistema se inoculo con 1 ml de P. gingivalis exponencialmente creciente diluido a 0,1 de DO600. El sistema se incubo durante 1 h antes de flujo constante (0,2 ml/min) de 5* BHI diluido (Oxoid) complementado con 0,1 g/l de cistema, 1 mg/l de hemina y 1 mg/l de vitamina K. Despues de 18 h se inyecto 1 ml de 125 pM o 12,5 pM de Oxantel o agua esteril en cada canal del sistema y se incubo durante 30 min. El flujo de medio continuo durante otros 10 min para eliminar por lavado cualquier celula sin unir debido a la prueba. Luego se uso tincion con BackLight (Molecular Probes) para tenir la biopelmula in situ (vease mas adelante).

Se llevo a cabo microscopfa de barrido laser confocal (CLSM) de las biopelmulas bacterianas en un microscopio confocal Meta 510 con una platina invertida (Zeiss). Se obtuvieron imagenes de secciones optodigitales horizontales (xy), cada una de 2 pm de espesor sobre el espesor completo de la biopelmula (z), usando 63* objetivo a 512 x 512 pixel (0,28 pm por pixel), con cada marco a 143,86 pm (x) x 143,86 pm (y). Para determinar la reproducibilidad a traves de la biopelmula se obtuvieron 5 imagenes en posiciones al azar de cada uno de dos duplicados biologicos a longitudes de onda de 488 nm y 568 nm para cada canal. Todas las imagenes obtenidas se analizaron usando el software COMSTAT. Las microcolonias se definieron como agrupacion de celulas con >500 recuentos de pfxeles.

Viabilidad de celulas dispersadas por tratamiento con oxantel

Para probar la viabilidad de celulas dispersadas por tratamiento con oxantel se realizo un ensayo de biopelmula estatico como se ha descrito anteriormente, pero con ligeras modificaciones. Brevemente, P. gingivalis (ATCC 33277) se dejo formar biopelmula en microplacas de 24 pocillos despues de 18 h de incubacion. Las celulas planctonicas de libre flotacion se eliminaron primero y la biopelmula se lavo una vez con PBS. Se anadio 1 ml de 125 uM o 12,5 uM de oxantel o agua esteril (control positivo) a cada pocillo y se incubo durante 30 min. El numero de celulas de P. gingivalis dispersas que todav^a son viables se determino por analisis en cultivo sobre placas de agar de sangre de caballo despues de dilucion seriada en BHI.

Analisis estad^stico

El coeficiente de correlacion (r) entre ambos duplicados biologicos se evaluo usando la funcion del coeficiente de correlacion de Pearson de Microsoft Excel. El coeficiente de la varianza (CV) se calculo por la desviacion estandar de las relaciones de abundancia de peptidos divididas entre la media, expresada como un porcentaje.

Cultivo continuo y formacion de biopelcula

Se cultivo W50 de P. gingivalis en cultivo continuo durante un periodo de 40 dfas durante el cual la densidad celular del cultivo permanecio constante despues de los 10 primeros dfas con una DO650 de 2,69 ± 0,21 y 2,80 ± 0,52 para los duplicados biologicos 1 y 2 respectivamente. Esto es equivalente a una densidad celular de ~3 mg de peso seco celular/ml. Durante este periodo de tiempo se desarrollo una biopelfcula de celulas de P. gingivalis sobre la pared de vidrio vertical del recipiente del fermentador. Esta biopelfcula tuvo ~2 mm de espesor en el momento de la recogida.

Validacion del procedimiento de cuantificacion de 16O/18O usando BSA

Para determinar la precision y reproducibilidad del procedimiento de cuantificacion de 16O/18O, cantidades conocidas de BSA se cargaron sobre carriles de gel adyacentes para dar relaciones de 1:1, 1:2, 1:5 y 10:1 (Fig 1B). Las bandas se sometieron a digestion tnptica en gel en presencia de tanto H216O como H218O, se mezclaron y luego se analizaron por EM CL MALDI-EM/EM. Un conjunto tfpico de espectros para un unico peptido tnptico de BSA a traves de las cuatro relaciones muestra la incorporacion preferencial de dos atomos de 18O, que se observa mas claramente por la predominancia del pico de 4 Da en la relacion de BSA 10:1, y por el doblete casi simetrico en el espectro de 1:1, simplificando tanto la cuantificacion como la identificacion (Fig 1A). La incorporacion promedio de un unico atomo de 18O se estimo que fue <7% basandose en el marcado 1:1 (tabla adicional). Las relaciones promedio calculadas para todos los peptidos de BSA identificados fueron 0,98 ± 0,12, 2,22 ± 0,26, 4,90 ± 0,75 y 10,74 ± 2,04 para relaciones de 1:1 (triplicado), 2:1 (y 1:2), 1:5 y 10:1, respectivamente, que indica buen intervalo dinamico, alta precision de ± 2-11% y un bajo CV que oscila del 11,75% al 18,95% (Tabla 1). La precision reproducible de la mezcla 1:1 (realizada por triplicado) implica que el sesgo del marcado era muy bajo. Esto se confirmo adicionalmente comparando BSA marcada normal e inversa a una relacion 2:1 usando solo peptidos que se identificaron en ambos experimentos. Se determino que la relacion normal era 2,11 ± 0,33, mientras que la inversa era 2,30 ± 0,20 (Tabla 1).

Diseno experimental para el analisis cuantitativo de muestras de biopelcula y planctonicas

El diseno de este estudio implico el uso de dos duplicados biologicos, es decir, dos cultivos continuos independientes, cada uno fraccionado en una muestra de biopelfcula obtenida de las paredes del recipiente, y una muestra planctonica obtenida del contenido de fluido del recipiente. Se realizaron dos duplicados tecnicos por cada duplicado biologico, y aunque los presentes inventores establecieron que no hubo sesgo de marcado significativo con BSA, los presentes inventores eligieron utilizar la estrategia de marcado inverso ya que habfa una falta de estudios de validacion del marcado con 16O/18O que se habfan realizado en muestras biologicas complejas (30). Por tanto, en total hubo cuatro experimentos, consistiendo cada uno en 10 ejecuciones de EM CL-MALDI/EM que se originaron a partir de 2*10 segmentos de gel.

La Figura 2 muestra espectros de EM y EM/EM tfpicos de dos peptidos marcados normales e inversos de las muestras de biopelfcula/planctonicas que ilustran el patron de marcado inverso tfpico. Al igual que con los datos de BSA, podna observarse que habfa un alto nivel de incorporacion de 18O doble siendo la incorporacion mixta promedio calculada <15% para todos los peptidos, confirmando que el procedimiento de marcado proteolftico de 16O/18O tambien fue eficaz con muestras complejas (datos no mostrados). La predominancia de peptidos doblemente marcados se confirmo adicionalmente por los relativamente pocos exitos de Mascot para las especies de 2 Da. Los espectros de EM/EM de los peptidos marcados pesados revelaron adicionalmente los desplazamiento de 4 Da esperados en los iones Y (Fig 2).

Correlacion entre duplicados tecnicos

Para comparar duplicados tecnicos de los datos biologicos, la abundancia transformada por log-i0 de relaciones de protema de cada par de experimentos marcados normales e inversos se representaron los unos frente a los otros (Fig 3). La regresion lineal de estas representaciones indico que cada par estaba altamente correlacionado con valores de R2 de 0,92 y 0,82 para el duplicado biologico 1 y 2, respectivamente. La pendiente de cada ajuste lineal tambien fue similar al valor esperado de 1,0 a 0,97 y 0,93 para el duplicado biologico 1 y 2, respectivamente, que indica que no hay sesgo de marcado entre los duplicados tecnicos (Fig 3). La abundancia de relaciones de protema de los duplicados tecnicos se promedio dando una unica relacion para cada duplicado biologico.

Correlacion de duplicados biologicos

Antes de comparar los datos promedio para los dos duplicados biologicos, las relaciones de abundancia de protemas de cada duplicado biologico se normalizaron dando una relacion media promedio de 1,0. Una representacion de las relaciones de abundancia de protemas normalizadas de ambos duplicados biologicos presenta una distribucion similar a gaussiana estrechamente centrada en cero (Fig 4A) similar a la descrita por otros (40, 41). Hubo una significativa correlacion positiva entre los dos duplicados biologicos (coeficiente de correlacion de Pearson r = 0,701, p < 0,0001) que indica que el crecimiento de los cultivos de biopelmula/planctonicos y todo el procesamiento aguas abajo de las muestras podna reproducirse a un nivel satisfactorio. Para determinar que protemas se regularon coherentemente en los dos duplicados biologicos se construyo un simple diagrama de clasificacion en el que las protemas se dividieron en 6 grupos (A-F) segun su relacion de abundancia y luego se clasificaron 1-6 segun la correlacion basada en grupos, teniendo aquellos clasificados con 1 la mayor similitud cuando una protema de ambos duplicados biologicos se encontraba dentro del mismo grupo (Fig 4B). Usando el diagrama de clasificacion, los presentes inventores pudieron determinar que 34 de las 81 (42%) protemas identificadas de ambos duplicados se clasificaron con el numero uno, considerablemente superior al valor esperado para una correlacion al azar que sena del 17% (o 1/6). La mayona de las restantes protemas se clasificaron con el numero dos y, por tanto, en total, 70 protemas (86,4%) se consideraron que estaban similarmente reguladas entre los dos experimentos (se clasificaron 1 o 2; Tabla 2).

Basandose en la desviacion estandar medida (± 0,26) del experimento de marcado de BSA a 2:1 (Tabla 1), los cambios en la abundancia de protemas se consideraron biologicamente significativos cuando se diferenciaron 1,0 por >3 desviaciones estandar (tanto >1,78 o <0,56) (18, 42). Usando este criterio, la abundancia de 47 de las 81 protemas identificadas en ambos duplicados cambio significativamente (basandose en las relaciones promedio), y de estas, 42 se clasificaron tanto como 1 como 2 (Tabla 2). De las 42 protemas clasificadas con 1 y 2, 24 tuvieron abundancia significativamente elevada y 18 tuvieron abundancia disminuida.

Enzimas de rutas metabolicas que muestran regulacion coordinada

Veinte protemas que participaron en el catabolismo de glutamato/aspartato se identificaron en el estudio de limitacion de hemo frente a exceso de hemo usando estrategias de marcado con ICAT (Tabla 3). De aquellas se identificaron enzimas que catalizan seis de las ocho etapas que participaron directamente en el catabolismo de glutamato a butirato y se encontro que habfa aumentado 1,8 a 4 veces bajo limitacion de hemo (Fig. 6, Tabla 3). Aunque las otras dos enzimas catalfticas (PG0690, 4-hidroxibutirato CoA-transferasa y PG1066, butiratoacetoacetato CoA-transferasa) no se detectaron usando ICAT, se encontro que estaban presentes en un estudio cualitativo separado a intensidades de iones altas comparables a aquellas protemas informadas en la Tabla 3 y pertenecen a operones que se mostro que se regulaban por incremento. Por otra parte, se mezclo el efecto de la limitacion de hemo sobre las abundancias de las enzimas de la ruta catabolica del aspartato, siendo invariables las enzimas que catalizan la rotura de aspartato a oxaloacetato en la ruta de degradacion oxidativa y mostrando las enzimas que participan en la conversion de piruvato a acetato un aumento de 2 a 4,4 veces.

La abundancia de dos enzimas fumarato reductasa que contienen hierro, FrdA (PG1615) y FrdB (PG1614), que juntas catalizan la conversion de fumarato a succinato mediante la ruta reductora de aspartato, se redujo significativamente en celulas cultivadas en limitacion de hemo (Figura 6, Tabla 3). Estas dos protemas, que estan codificadas en un operon (Baughn y col., 2003), muestran cambios similares en abundancia en respuesta a limitacion de hemo (UE de FrdA = 0,35; L/E de FrdB = 0,25).

Analisis de productos finales de acidos organicos

Las cantidades de acetato, butirato y propionato en el medio agotado de cultivo de P. gingivalis cultivado bajo limitacion de hemo fueron 13,09 ± 1,82, 7,77 ± 0,40 y 0,71 ± 0,05 mmol/g de peso seco celular, respectivamente. Los niveles de acetato, butirato y propionato en el medio agotado de cultivo de P. gingivalis cultivado en exceso de hemo fueron 6,00 ± 0,36, 6,51 ± 0,04 y 0,66 ± 0,07 mmol/g de peso seco celular, respectivamente.

Efectos de agentes inhibidores de Frd sobre el crecimiento de P. gingivalis

El efecto de diferentes concentraciones de los tres antihelmmticos oxantel, morantel y tiabendazol sobre el crecimiento de W50 de P. gingivalis durante 50 h se mostro en las Figuras 7, 8 y 9. El efecto de DMSO sobre el crecimiento fue insignificativo como se observa en el TGM de P. gingivalis con estudios informados previos y W50 solo (43,44). El efecto mas profundo de estos tres agentes inhibidores sobre el crecimiento de P. gingivalis es oxantel (Fig. 7). De las curvas de crecimiento, es evidente que hay inhibicion positiva de oxantel sobre el crecimiento de P. gingivalis a concentraciones superiores a 15 pM. Se determino que las concentraciones inhibidoras mmimas (CIM) de oxantel como se ha descrito previamente (45) fueron 112 pM. Tambien hubo una correlacion significativa de concentracion creciente de oxantel con mayor TGM como se observa para CIsubM de oxantel (Fig 7A). El efecto bactericida de morantel fue comparablemente menor que el de oxantel con CIM de - 3 mM, pero todavfa muestra efectos inhibidores significativos a CIsubM (Fig 8). El tiabendazol parece no tener efectos inhibidores muy significativos sobre el crecimiento de P. gingivalis y aparentemente requiere mas de 1 mM para ligeros efectos inhibidores sobre el crecimiento (Fig 9). En conclusion, se estimo que los efectos inhibidores de los diferentes agentes inhibidores de Frd estaban en el orden de oxantel » morantel > tiabendazol.

Efectos de concentraciones inhibidoras subm^nimas de oxantel sobre la formacion de biopelcula

El oxantel, que tiene los efectos mas profundos sobre el crecimiento de P. gingivalis, se uso para estudiar sus efectos sobre la formacion de biopeftcula. En la prueba de biopeftcula, la cepa ATCC 33277 de P. gingivalis se uso en lugar de W50, ya que la ultima forma biopeftculas solo escasamente bajo la mayona de las circunstancias. Como el efecto inhibidor del crecimiento de oxantel sobre la cepa ATCC 33277 es similar a W50 en ensayos planctonicos a 125 pM (Fig 7B), representa por tanto un buen modelo para estudiar los efectos de oxantel sobre la formacion de biopeftcula. Oxantel a concentraciones inhibidoras submmimas (CIsubM) de tan solo 0,1 pM redujo significativamente la masa de biopeftcula a 24 h (Fig. 10A), aunque concentraciones de 3,9 pM o superiores fueron necesarias para tener un efecto inhibidor sobre la masa de biopeftcula a 48 h (Fig. 10B).

Efecto de oxantel sobre la dispersion de biopelcula

Para estudiar mas estrechamente los efectos de CIsubM de oxantel, sobre biopeftculas de P. gingivalis se uso un sistema de cultivo en celda de flujo. Hubo una reduccion significativa en la profundidad y tamano de la biopeftcula de microcolonias cuando la biopeftcula madura se trato con oxantel (P < 0,01), mientras que no hubo diferencia significativa en el numero de microcolonias entre las muestras de control y tratadas (Figs. 11-13, Tabla 6).

Se liberaron celulas de P. gingivalis de la biopeftcula que siguio viable especialmente para la biopeftcula tratada con oxantel 12,5 pM (Fig. 14). Las celulas de control no tratadas parecieron mas resistentes a la dispersion con respecto a celulas tratadas con oxantel. El numero de celulas recuperadas de la biopeftcula tambien esta de acuerdo con el observado bajo el CLSM (Figs. 11-13) con significativamente mayor numero de celulas en la muestra de control.

Los resultados anteriores ilustran los cambios en la abundancia de protemas que se producen cuando celulas de P. gingivalis planctonicas se adhieren a una superficie solida y se cultivan como parte de una biopeftcula de monoespecie madura. Es el primer estudio comparativo de biopeftcula bacteriana frente a crecimiento planctonico en utilizar tanto el enfoque de Em de geLC del grupo de Gygi (46) como el procedimiento de marcado proteolftico con 16O/18O para determinar cambios en abundancias de protemas ya que todos los estudios publicados hasta la fecha han utilizado procedimientos basados en electroforesis en gel 2D (10-12). Un enfoque de marcado inverso con 16O/18O de dos duplicados tecnicos y dos duplicados biologicos se empleo satisfactoriamente para cuantificar y validar los cambios en abundancia de protema.

Cultivo continuo de P. gingivalis

En este estudio, W50 de P. gingivalis se cultivo en cultivo continuo a diferencia de la metodologfa mas tradicional de cultivo en lotes. El cultivo en lotes introduce un gran intervalo y grado de variacion en analisis bacterianos debido a variables entre los lotes tales como: tamano y viabilidad del inoculo, etapa de crecimiento exacto de la bacteria cuando se recoge, niveles de nutrientes disponibles en el medio y potencial redox del medio, entre otros factores. En cultivo continuo, la bacteria se cultiva durante muchas generaciones bajo condiciones estrictamente controladas que incluyen tasa de crecimiento, densidad celular, concentraciones de nutrientes, temperatura, pH y potencial redox (44, 47, 48). Un estudio previo ha demostrado un alto nivel de reproducibilidad de analisis transcriptomicos de Saccharomyces cerevisiae continuamente cultivados en quimiostatos en diferentes laboratorios (49). Ademas, en el estudio de los presentes inventores, el crecimiento de tanto celulas de biopeftcula como planctonicas se llevo a cabo en un unico recipiente de fermentacion, reduciendo la variabilidad con respecto a cultivos separados. Los coherentes cambios en las abundancias de protema de la envuelta de celulas P. gingivalis entre duplicados biologicos del 86,4% de las protemas identificadas (clasificadas 1 y 2) observadas en este estudio ilustran la aplicabilidad del sistema de cultivo continuo y la estrategia de marcado proteolftico con 16O/18O para el analisis del efecto del crecimiento de biopeftcula sobre el proteoma de P. gingivalis.

Eficiencia del marcado con 18O

El procedimiento proteomico basico empleado en este estudio fue el procedimiento de EM de geLC (46, 50) debido a la alta resolucion y solubilidad de protemas de membrana que proporciona el procedimiento de SDS-PAGE. Este procedimiento se combino con una unica reaccion de marcado con 18O durante el procedimiento de digestion en gel similar al descrito por otros (26-29). Un marcado eficiente debe producir la incorporacion de dos atomos de 18O en el extremo C de cada peptido y debe ser resistente al retro-intercambio con 16O. Se encontro que este era el caso en el estudio de los presentes inventores con BSA cuando el nivel de incorporacion de un unico atomo de 18O se estimo que era de <7% y se encontro que las relaciones medias obtenidas para diversos experimentos con BSA no favoredan significativamente 16O (Tabla 1), sugiriendo que el retro-intercambio con agua normal no era una problema. Tambien se obtuvieron resultados similares para las muestras biologicas. Una etapa crucial para el eficaz marcado con 18O fue la necesidad de la eliminacion completa del H216O natural, seguido de la resolubilizacion de la protema en H218O antes de la digestion tnptica empleando un procedimiento de “una sola digestion”. Aunque varios estudios han usado una procedimiento “de digestion doble” (51, 52), el procedimiento de una sola digestion tiene la ventaja de dar una mayor eficiencia de marcado con 18°, ya que en el procedimiento de digestion doble algunos peptidos tnpticos fueron incapaces de intercambiar cualquiera de sus atomos de 16O del extremo C con un atomo de 18O despues de la digestion inicial (53). Los presentes inventores utilizaron adicionalmente un procedimiento de digestion en gel en el que la protema es retenida en la matriz de gel durante la etapa de deshidratacion inicial usando disolventes organicos como en cualquier protocolo de digestion en gel convencional. La eliminacion completa de cualquier traza de H216O natural se logro mediante la liofilizacion por centrifugacion a vacm mientras que la protema todavfa estuvo dentro de la matriz de gel para prevenir las posteriores perdidas adsorptivas durante la etapa de liofilizacion inicial. La rehidratacion y la digestion en gel se llevaron a cabo en H218O que contema un gran exceso de tripsina, que tambien se reconstituyo en H218O. Durante el procedimiento de digestion, los peptidos tnpticos liberados del gel despues de la incorporacion del primer atomo de 18O pueden experimentar el procedimiento de intercambio del segundo oxfgeno del carbonilo mediado por la tripsina en exceso. Esto debe promover la sustitucion del segundo oxfgeno del carbonilo, ya que los peptidos liberados tendnan mayor solubilidad que las protemas, produciendo asf un mayor nivel de peptidos tnpticos doblemente marcados con 18O (Figs 1 y 2; (54)). Con el fin de prevenir el retro-intercambio con agua normal, la tripsina se desactivo hirviendo, que se habfa mostrado previamente que era eficaz (51,54). Ademas, la mezcla desactivada secada solo se resuspendio y mezclo inmediatamente antes de la inyeccion sobre una NanoLC para minimizar el intercambio espontaneo, aunque este intercambio espontaneo se ha mostrado que es muy bajo (15,40).

Marcado inverso

En el caso del marcado y cuantificacion de isotopos estables usando EM, los errores se introducen probablemente durante el procedimiento de marcado e ionizacion. Estos errores incluyen la potencial afinidad diferente de la marca y el posible efecto de supresion de los peptidos marcados pesados o ligeros durante el procedimiento de MALDI (13, 55). Duplicados tecnicos tradicionales que implican repetir el mismo marcado podnan producir un sesgo hacia una marca particular o error al azar elevado de peptidos espedficos debido a picos contaminantes. Los duplicados tecnicos marcados normales e inversos de los presentes inventores demostraron un alto grado de correlacion con gradientes de representaciones de dispersion de 0,97 (R2 = 0,92) y 0,93 (R2 = 0,82) para los duplicados biologicos 1 y 2, respectivamente (Fig 3), que es proximo a la relacion esperada de 1,0 para sesgo no marcado. Estos gradientes tambien indican que el procedimiento fue reproducible con respecto a la estimacion de protemas, carga de gel, escision del gel y digestion en gel. La falta de sesgo sugiere que podnan ser innecesarias rutinas de normalizacion como intercambio de colorante o normalizacion de datos de LOWESS usados rutinariamente en experimentos de micromatriz (35). Sin embargo, las muestras que son considerablemente mas complejas que las envueltas de la celula bacteriana usadas en este estudio pueden todavfa requerir validacion del marcado inverso como cuando se considera la influencia de peptidos contaminantes menores en el calculo de las relaciones 18O/16O y la necesidad de verificar peptidos con cambios extremos. El diseno de marcas inversas, ademas de proporcionar un calculo estimado y medios para corregir errores sistemicos, tuvo el beneficio adicional de permitir que se identificaran facilmente tanto los peptidos marcados pesados como ligeros, ya que el procedimiento de adquisicion de EM/EM solo selecciono el peptido mas intenso en cada par pesado/ligero con respecto al fragmento. De esta forma se reduce la posibilidad de asignacion incorrecta. A nuestro conocimiento, este es el primer informe de marcado con 16O/18O inverso en una muestra biologica compleja distinta de la reciente cuantificacion de las diecisiete protemas de citocromo P450 (26,30).

Cultivo de biopelculas frente a planctonico

Hemos demostrado una fuerte correlacion positiva entre los duplicados biologicos (r = 0,701, p < 0,0001) que indican que hubo reproducibilidad en la formacion y desarrollo de biopelmulas. Esto tambien se observo por el hallazgo de que se observo que 70 de las 81 protemas cuantificables presentaban relaciones similares en ambos duplicados biologicos (Tabla 2, clasificados 1 o 2). Mas de tres cuartos de las protemas de P. gingivalis identificadas en este estudio se identificaron por >2 peptidos unicos, aumentando adicionalmente la confianza de la identificacion y cuantificacion de este procedimiento de marcado. De las 81 protemas coherentemente identificadas de ambos duplicados biologicos, 47 cambiaron significativamente en abundancia del estado planctonico al de biopelmula. El cambio en la abundancia de un porcentaje del proteoma detectado, especialmente en la envuelta de la celula, esta de acuerdo con otros estudios de bacterias formadoras de biopelmulas tales como Pseudomonas aeruginosa, en las que mas del 50% del proteoma detectado se mostro que presentaba cambios significativos en la abundancia entre fases de crecimiento planctonicas y de biopelmula madura. (12). Los presentes inventores observaron adicionalmente un amplio intervalo de respuestas en el proteoma de la envuelta de la celula de P. gingivalis al crecimiento como una biopelmula. Varias protemas que demostraron previamente que se alteraban en abundancia en respuesta a cultivo de biopelmula tambien se encontro que habfan cambiado en abundancia en el estudio de los presentes inventores. Sorprendentemente se observaron algunas protemas que haWan cambiado en abundancia hasta cinco veces (Tabla 2), sugiriendo algunos desplazamientos importantes en el proteoma en respuesta al cultivo de biopelmulas.

Metabolismo

La principal fuente de energfa para P. gingivalis se deriva de la fermentacion de aminoacidos que se obtienen en forma de peptido por la hidrolisis proteolftica de protemas huesped (47, 80, 81). Las principales rutas catabolicas de P. gingivalis son la fermentacion de glutamato y aspartato en la que el glutamato se metaboliza a butirato, propionato y amoniaco, y el aspartato se metaboliza a butirato, propionato, acetato y amoniaco (Fig. 6). Informes previos han mostrado que P. gingivalis utiliza preferencialmente aspartato/asparagina, glutamato/glutamina, treonina, serina, leucina y valina del medio de cultivo (47, 81, 82).

Dos protemas de P. gingivalis que participan en el catabolismo de glutamato, PG1076 (UE = 1,8) y PG1078 (UE = 2,0), aumentaron significativamente en abundancia durante la limitacion de hemo. Estas protemas estan codificadas por genes dispuestos en un gran operon predicho de 15 genes. En la direccion 5' de estos genes estan dos genes que codifican una protema hipotetica y una protema hipotetica conservada cuya abundancia tambien aumento durante la limitacion de hemo (PG1067, UE = 2,4 y PG1068, UE = 1,7, respectivamente). El analisis de este gran operon revelo adicionalmente la presencia de una region de union consenso Fur putativa caractenstica de muchos genes regulados por hierro (83), que sugiere que la expresion podna controlarse por la disponibilidad de hierro. Aunque los presentes inventores esperaron que el cambio en veces de todas las protemas codificadas en un operon fuera el mismo, esto no es necesariamente el caso en todos los casos, ya que el nivel de transcrito algunas veces no se correlaciona con los niveles de protema (84). Esto podna ser debido a modificaciones postraduccionales o estabilidad del transcrito, permitiendo que se produzca una regulacion sustancial de eventos celulares al nivel de protema sin cambio aparente de la abundancia de ARNm.

La conversion de fumarato a succinato mediante la ruta de aspartato esta catalizada por un complejo heterotnmero de succinato-quinona oxidorreductasa (SQOR) que consiste en dos enzimas citoplasmicas FrdA (1615) y FrdB (1614) y una FrdC transmembrana (1616). La abundancia de las dos enzimas fumarato reductasa citoplasmicas, FrdA (PG1615) y FrdB (PG1614), se redujo significativamente en celulas cultivadas en limitacion de hemo (3 y 4 veces, respectivamente) y crecimiento de biopelmula (17 y 5,9 veces, respectivamente). Estas dos protemas, que estan codificadas en un operon (85), muestran cambios similares en abundancia en respuesta a limitacion de hemo (UE de FrdA = 0,35; UE de FrdB = 0,25) y crecimiento de biopelmula (B/P de FrdA = 0,o6; B/P de FrdB = 0,17). Estudios previos en Bacteroides fragilis han sugerido que se requiere hemo para la smtesis del complejo de Frd dependiente de citocromo-b (86). Por tanto, no es sorprendente ver niveles mas bajos de Frd durante las condiciones de crecimiento de limitacion de hemo en P. gingivalis considerando que es incapaz de sintetizar PPIX de novo. Estudios de crecimiento de tanto B. fragilis como P. gingivalis han mostrado que requieren heno para el crecimiento y que este requisito puede sustituirse parcialmente con succinato exogeno (87, 88). Esta observacion se confirmo usando mutantes deficientes en Frd de B. fragilis cuyo crecimiento no se estimulo por hemo, pero se estimulo mediante la adicion de succinato (85). Estudios de rendimiento del crecimiento molar mostraron adicionalmente que los mutantes deficientes en Frd de B. fragilis tienen un rendimiento de ATP similar al de una cepa natural restringida a hemo. Durante el crecimiento optimo, el succinato se convierte en succinil-CoA tanto para la entrada en rutas productoras de energfa como para la biosmtesis de aminoacidos esenciales (lisina y metionina). Estos estudios demuestran la importancia de la conversion de aspartato a succinato para el crecimiento equilibrado. Bajo condiciones de exceso de hemo, una parte del aspartato catabolizado por P. gingivalis se reduce inicialmente mediante las enzimas fumarato reductasa (FrdA y FrdB) a succinato y luego se cataboliza mediante la ruta de glutamato para producir butirato (Fig. 6). La disminucion de 3-4 veces en la abundancia de estas enzimas fumarato reductasa durante la limitacion de hemo indica que menos del aspartato entrana en la ruta catabolica del glutamato y como consecuencia de esto la mayona del aspartato catabolizado se convertina mediante la ruta oxidativa en acetato (Fig. 6). Para probar esta hipotesis, los presentes inventores llevaron a cabo analisis de acidos organicos sobre los medios de cultivo agotados de P. gingivalis cultivado en cultivo continuo. Esto mostro que habfa un nivel dos veces mayor de acetato producido bajo limitacion de hemo (13,09 ± 1,82 mmol/g de peso seco celular) en comparacion con el nivel producido bajo exceso de hemo (6,00 ± 0,36 mmol/g de peso seco celular), mientras los niveles de los otros productos finales principales, butirato y propionato, fueron similares bajo ambas condiciones de crecimiento. Esto esta de acuerdo con la hipotesis de los presentes inventores de un desplazamiento en la ruta usada para la fermentacion de aspartato. El aumento en la abundancia de las enzimas que catalizan la conversion de piruvato a acetato (acetato cinasa PG1081, fosfotransacetilasa PG1082 y piruvato ferredoxina PG0548) tambien esta de acuerdo con el aumento de las cantidades de acetato encontradas en el medio de cultivo agotado (Tabla 2; Fig. 6).

Estos resultados motivaron asf a los presentes inventores a investigar de dos formas para controlar la bacteria mediante la inhibicion de esta delicada ruta reguladora metabolica.

Efectos de agentes inhibidores de fumarato reductasa sobre el crecimiento

Los presentes inventores han mostrado una reduccion de 17,0 y 5,9 veces en la abundancia del complejo de Frd (FrdA y FrdB, respectivamente) durante el crecimiento de biopelmula de P. gingivalis que es incluso mayor que las reducciones de 3 y 4 veces en FrdA y FrdB durante el crecimiento con limitacion de hemo. La coherente menor abundancia del complejo de Frd se correlaciona con la disminucion del crecimiento de la bacteria asociada a la limitacion de hemo durante tanto condiciones de crecimiento de biopelmula como de hemo limitado . Smith y col. (89) han demostrado previamente que las actividades de Frd de Campylobacter spp son mayores en cultivos que crecen exponencialmente, pero disminuyeron a medida que entraron en la fase estacionaria. Por tanto, sugiere que la actividad de Frd limita la tasa de crecimiento que destaca que sea una nueva diana terapeutica atractiva. La respiracion de fumarato es el tipo mas generalizado de respiracion anaerobia y es el unico producto intermedio metabolico conocido por servir de aceptor de electrones dando ~0,5 ATP/electron para formar succinato como producto final (90). Shah y William (91) informaron que P. gingivalis produjo succinato a partir de aspartato y Takahashi y col. (81) propusieron que el succinato producido se convirtio en succinil-CoA que luego se convirtio en butirato o propionato.

Se demostro que los antihelmmticos normalmente usados para curar infeccion helmmtica en animales y seres humanos teman efectos inhibidores y bactericidas contra Helicobacter pylori y Campylobacter jejuni (89, 94). Se ha mostrado que uno de estos farmacos, oxantel, es un inhibidor de la enzima fumarato reductasa en H. pylori y C. jejuni supuestamente sobre las subunidades hidrofilas del complejo Frd mediante mecanismos desconocidos (94­ 96).

De forma interesante no todas las bacterias anaerobias poseen Frd y algunas bacterias que poseen Frd tienen rutas bioqmmicas alternativas para la supervivencia cuando Frd se inhibe (97, 98). Por tanto, el descubrimiento de que la viabilidad de P. gingivalis esta gravemente afectada en presencia de agentes inhibidores de Frd (Fig. 7-10) sugiere que la enzima es absolutamente esencial para el crecimiento y la contribucion del ATP de la ruta aspartato podna desempenar una funcion crucial en la supervivencia de P. gingivalis. Como el complejo de Frd esta ausente en seres humanos y otros animales (92, 93), el agente que inhibe Frd proporciona una diana contra enfermedades producidas por patogenos, especialmente aquellos que tienen un requisito esencial para Frd.

Efectos de agentes inhibidores de fumarato reductasa sobre la formacion de biopelcula

Lo siguiente ilustra el efecto de agentes inhibidores de Frd sobre la capacidad de P. gingivalis para formar biopelmulas. La reduccion de la masa de biopelmula a concentraciones de oxantel CIsubM es muy interesante, ya que sugiere que hay una cantidad minima de Frd o energfa requerida para la optima formacion de biopelmula.

La inhibicion parcial de Frd por concentraciones CIsubM de agentes inhibidores de Frd podna traducirse como senales similares tal como en un entorno pobre en nutrientes. Por ejemplo, la formacion de biopelmula regulada por carbono esta bien documentada en varias bacterias que incluyen Pseudomonas aeruginosa y E. coli y, por tanto, mediada por reguladores transcripcionales tales como RpoS, Crc y CsrA en durante la limitacion de nutrientes (99-101). En E. coli, el gen csrA codifica una protema reguladora global, CsrA (regulador del almacenamiento de carbono) que reprime ciertas rutas metabolicas tales como smtesis de glucogeno y gluconeogenesis (101,102). La rotura de csrA en E. coli produjo formacion potenciada de biopelmula (101, 103) y, de forma interesante, la activacion del homologo de CsrA en Salmonella enterica serovar Typhimurium produjo la elevada invasion de celulas epiteliales debido a los efectos de CsrA sobre otras dianas (104, 105). Es, por tanto, muy tentador especular que es menos probable que P. gingivalis de hemo limitado forme biopelmulas debido a los menores niveles de ATP como resultado de la actividad de Frd reducida, ya que tales protemas de invasion de celulas huesped que incluyen internalinas estan reguladas por incremento para promover la fuga a celulas epiteliales hasta el final de la privacion de nutrientes.

Hay una mayor abundancia de la enzima glucolttica gliceraldehndo 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) durante el estado de biopelmula en comparacion con el planctonico que esta de acuerdo con resultados previos obtenidos para Listeria monocytogenes y Pseudomonas aeruginosa (12, 106). Aunque GAPDH se clasifica como una enzima de union a NAD tetramera que participa en la glucolisis y gluconeogenesis, ha habido numerosos informes de esta protema que es multifuncional y cuando se expresa en la superficie celular de bacterias Grampositivas, parecio participar en la union de plasmina, plasminogeno y transferrina (107,108). De forma interesante, se ha mostrado que la coagregacion entre Streptococcus oralis y 33277 de P. gingivalis esta mediada por la interaccion de fimbrias de P. gingivalis y GAPDH de S. oralis (109). Sin embargo, queda por responder la funcion exacta, si la tiene, de GAPDH en sustrato que se une en P. gingivalis.

Formacion de biopelcula

Hubo una abundancia significativamente mayor de la protema del estres universal (UspA) en las celulas planctonicas con respecto a las celulas de biopelmula. Se encontro que la produccion de Usp en diversas bacterias se estimulaba por una gran variedad de condiciones, tales como entrada en la fase estacionaria, inanicion de ciertos nutrientes, oxidantes y otros estimulantes (110, 111). La elevada abundancia en celulas de la fase planctonica esta de acuerdo con el hecho de que P. gingivalis ha evolucionado para crecer como parte de una biopelmula y que es mas probable que las fases planctonicas sean mas estresantes. Se cree que la expresion de UspA en P. gingivalis esta relacionada con la formacion de biopelmula, ya que la inactivacion de uspA produjo la atenuacion de la formacion de biopelmula temprana por celulas planctonicas (112). En este estudio, la biopelmula se ha establecido y alcanzado la maduracion, por tanto parece tener menos necesidad de UspA con respecto a celulas planctonicas flotantes libres.

Se observo que un homologo de la protema de la familia internalina InIJ (PG0350) era mayor en abundancia durante el estado de biopelmula. Se ha mostrado que PG0350 es importante para la formacion de biopelmula en P. gingivalis 33277 y que la inactivacion genica produjo formacion de biopelmula reducida (39). Mayores niveles de PG0350 en la biopelmula podnan sugerir que esta protema podna ser requerida no solo para la formacion de biopelmula inicial, sino que actua de adhesina que une P. gingivalis entre sf o sustratos extracelulares dentro de la biopelmula.

Protenas con funciones desconocidas

El mayor grupo de protemas identificadas en este estudio fue 41 protemas con funciones desconocidas que incluyen cuatro protemas que se identificaron por primera vez en este estudio (Tabla 2). De las 41 protemas identificadas, se predijo que 37 eran de la envuelta de la celula y dentro de este grupo 17 protemas mostraron cambios significativos entre las celulas de biopelmula y planctonicas. La mayona de estas protemas tienen homologfa con protemas de GenBank con nombres definidos, pero funciones no bien definidas. Son de particular interes varias protemas que se encontro que aumentaban coherentemente sustancialmente en abundancia en el estado de biopelmula, concretamente PG0181, PG0613, PG1304, PG2167 y PG2168.

Los resultados anteriores representan una validacion a gran escala del procedimiento de marcado proteolftico con 16O/18O como se aplica a una mezcla compleja, y son los primeros en usar este enfoque para la comparacion de estados de crecimiento de biopelmula bacteriana y planctonica. Se encontro que un numero sustancial de protemas con una variedad de funciones aumentaron o disminuyeron coherentemente en abundancia en las celulas de biopelmula, que indica como las celulas se adaptan a las condiciones de la biopelmula y tambien proporcionan posibles dianas para las estrategias de control de las biopelmulas.

EJEMPLOS

Para ayudar a ilustrar composiciones que encarnan un aspecto de la invencion dirigido al tratamiento, se proporcionan las siguiente formulaciones de muestra.

Lo siguiente es un ejemplo de una formulacion de pasta de dientes.

Componente_____________________________% peso/peso

Fosfato de dicalcio dihidratado 50,0

Glicerol 20,0

Carboximetilcelulosa de sodio 1,0

Laurilsulfato de sodio 1,5

Lauroilsarcosinato de sodio 0,5

Aroma 1,0

Sacarina sodica 0,1

Gluconato de clorhexidina 0,01

Dextranasa 0,01

Inhibidor de biopelmula (pamoato de oxantel) 0,2

Agua resto

Lo siguiente es un ejemplo de una formulacion de pasta de dientes.

Componente_____________________________ % peso/peso

Fosfato de dicalcio dihidratado 50,0

Sorbitol 10,0

Glicerol 10,0

Carboximetilcelulosa de sodio 1,0

Laurilsulfato de sodio 1,5

Lauroilsarcosinato de sodio 0,5

Aroma 1,0

Sacarina sodica 0,1

Monofluorofosfato de sodio 0,3

Gluconato de clorhexidina 0,01

Dextranasa 0,01

Inhibidor de biopelmula (pamoato de oxantel) 0,2

Agua resto

Lo siguiente es un ejemplo de una formulacion de pasta de dientes.

Componente_______________________________ % peso/peso Fosfato de dicalcio dihidratado 50,0 Sorbitol 10,0 Glicerol 10,0 Carboximetilcelulosa de sodio 1,0 Lauroildietanolamida 1,0 Monolaurato de sacarosa 2,0 Aroma 1,0 Sacarina sodica 0,1 Monofluorofosfato de sodio 0,3 Gluconato de clorhexidina 0,01 Dextranasa 0,01 Inhibidor de biopelfcula (pamoato de oxantel) 0,1 Agua resto

Lo siguiente es un ejemplo de una formulacion de pasta de dientes.

Componente______________________________ % peso/peso Sorbitol 22,0 Musgo de Irlanda 1,0 Hidroxido sodico (50%) 1,0 Gantrez 19,0 Agua (desionizada) 2,69 Monofluorofosfato de sodio 0,76 Sacarina sodica 0,3 Pirofosfato 2,0 Alumina hidratada 48,0 Aceite aromatizante 0,95 Inhibidor de biopelfcula (pamoato de oxantel) 0,3 Laurilsulfato de sodio 2,00

Lo siguiente es un ejemplo de una formulacion de pasta de dientes Ifquida.

Componente______________________________% peso/peso Poliacrilato de sodio 50,0 Sorbitol 10,0 Glicerol 20,0 Aroma 1,0 Sacarina sodica 0,1 Monofluorofosfato de sodio 0,3 Gluconato de clorhexidina 0,01 Etanol 3,0 Inhibidor de biopelfcula (pamoato de oxantel) 0,2 Acido linolico 0,05 Agua resto

Lo siguiente es un ejemplo de una formulacion de enjuague bucal.

Componente_______________________________% peso/peso Etanol 20,0 Aroma 1,0 Sacarina sodica 0,1 Monofluorofosfato de sodio 0,3 Gluconato de clorhexidina 0,01 Lauroildietanolamida 0,3 Inhibidor de biopelfcula (pamoato de oxantel) 0,2 Agua resto

Lo siguiente es un ejemplo de una formulacion de enjuague bucal.

Lo siguiente es un ejemplo de una formulacion de pastilla para chupar.

Lo siguiente es un ejemplo de una formulacion en crema de masaje gingival.

C % /

Lo siguiente es un ejemplo de una formulacion en gel periodontal.

Lo siguiente es un ejemplo de una formulacion de chicle.

continuacion

Tabla 4. Los 24 polipeptidos de P. gingivalis seleccionados como dianas para la inhibicion de la formacion de bio eliculas.

continuacion

Tabla 6: Efecto anadir Oxantel a peKcula de 16 h P.gingivalis como se determina usando COMSTAT en un sistema l l fl 2 nl

T l 7. Ef xn l mrn l i n zl r l r imi n P inivli W n h

Tabl . Ef ^ xn l r l r imi n P. inivli AT 277 r n 50 h

Referencias

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La invencion tambien proporciona las siguientes realizaciones numeradas:

1. Una composicion util en la prevencion, inhibicion o tratamiento de infeccion por P. gingivalis, la composicion comprendiendo un agente inhibidor de la fumarato reductasa, para su uso en un metodo para prevenir o tratar la infeccion por P. gingivalis o enfermedad periodontal en un sujeto, en donde el metodo comprende administrar la composicion farmaceutica al sujeto y en donde el agente inhibidor previene, inhibe o reduce un biopelfcula de P. gingivalis, y se selecciona de decursina, verticipirona, paecilaminol, 5-alquenil-3,3(2H)-furanonas de Streptomyces spp. , nafuredina, acido mesaconico, rotenona, 4,6-dinitrofenoles 2-sustituidos, N-oxido de mercaptopiridina, L-092,201, fexindazol, megazol, MK-436, L-634,549, misonidazol y benzimidazoles.

2. Una composicion util en la prevencion, inhibicion o tratamiento de infeccion por P. gingivalis, la composicion comprendiendo un agente inhibidor de la fumarato reductasa en donde el agente inhibidor se selecciona de decursina, verticipirona, paecilaminol, 5-alquenil-3,3(2H)-furanonas de Streptomyces spp., nafuredina, acido mesaconico, rotenona, 4,6-dinitrofenoles 2-sustituidos, N-oxido de mercaptopiridina, L-092,201, fexindazol, megazol, MK-436, L-634,549, misanozol y benzimidazoles, la composicion comprendiendo ademas un antibiotico.

3. Una composicion util en la prevencion o el tratamiento de enfermedad periodontal o el tratamiento de infeccion por P. gingivalis que comprende un agente inhibidor de la fumarato reductasa en donde el agente inhibidor se selecciona de decursina, verticipirona, paecilaminol, 5-alquenil-3,3(2H)-furanonas de Streptomyces spp., nafuredina, acido mesaconico, rotenona, 4,6-dinitrofenoles 2-sustituidos, N-oxido de mercaptopiridina, L-092,201, fexindazol, megazol, MK-436, L-634,549, misanozol, y benzocidazoles y un antibiotico .

4. Una composicion util en la prevencion o el tratamiento de enfermedad periodontal, la composicion comprendiendo un agente inhibidor de la fumarato reductasa en donde el agente inhibidor se selecciona de decursina, verticipirona, paecilaminol, 5-alquenil-3, (2H)-furanonas de Streptomyces spp. ., nafuredina, acido mesaconico, rotenona, 4,6-dinitrofenoles 2-sustituidos, N-oxido de mercaptopiridina, L-092,201, fexindazol, megazol, MK-436, L-634,549, misonidazol y bencimidazoles para reducir o inhibir la formacion y/o el desarrollo de biopelfculas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composicion farmaceutica que comprende un agente inhibidor de la fumarato reductasa, para su uso en un metodo para prevenir o tratar la infeccion por P. gingivalis o la enfermedad periodontal en un sujeto, en donde el metodo comprende administrar la composicion farmaceutica al sujeto y en donde el agente inhibidor previene, inhibe o reduce una biopelfcula de P. gingivalis, y se selecciona de decursina, verticipirona, paecilaminol, 5-alquenil-3,3(2H) -furanonas de Streptomyces spp.,nafuredina, acido mesaconico, rotenona, 4,6-dinitrofenoles 2-sustituidos, N-oxido de mercaptopiridina, L-092,201, fexindazol, megazol, MK-436, L-634,549, misonidazol y bencimidazoles.

2. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el agente inhibidor de la fumarato reductasa inhibe una fumarato reductasa que corresponde al numero de acceso AAQ66642.1.

3. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el agente inhibidor de la fumarato reductasa inhibe una fumarato reductasa que corresponde al numero de acceso AAQ66643.1.

4. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composicion farmaceutica incluye ademas uno o mas antibioticos que son toxicos para o inhiben el crecimiento de bacterias anaerobias Gram negativas.

5. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composicion farmaceutica incluye ademas un agente tensioactivo organico.

6. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composicion farmaceutica esta contenida en una composicion oral que se prepara y usa en dentffrico que incluye pastas de dientes, polvos dentffricos y dentffricos lfquidos, enjuagues bucales, trociscos, gomas de mascar, pastas dentales, cremas de masaje gingival, comprimidos para gargaras, productos lacteos u otros productos alimenticios.

7. La composicion farmaceutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el pH de la composicion farmaceutica esta en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 o de aproximadamente 5,0 a 7,0.

8. El uso de un agente inhibidor de la fumarato reductasa, para la fabricacion de un medicamento para su uso en la prevencion o el tratamiento de infeccion por P. gingivalis o enfermedad periodontal en un sujeto, en el que prevenir o tratar comprende administrar la composicion farmaceutica al sujeto y en el que el agente inhibidor previene, inhibe o reduce una biopelfcula de P. gingivalis, y se selecciona de decursina, verticipirona, paecilaminol, 5-alquenil-3,3(2H) -furanonas de Streptomyces spp., nafuredina, acido mesaconico, rotenona, 4,6-dinitrofenoles 2-sustituidos, N-oxido de mercaptopiridina, L-092,201, fexindazol, megazol, MK-436, L-634,549, misonidazol y bencimidazoles.

9. El uso de un agente inhibidor de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde el agente inhibidor de la fumarato reductasa inhibe una fumarato reductasa que corresponde al numero de acceso AAQ66642.1.

10. El uso de un agente inhibidor de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde el agente inhibidor de la fumarato reductasa inhibe una fumarato reductasa que corresponde al numero de acceso AAQ66643.1.

11. El uso de un agente inhibidor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la composicion farmaceutica incluye ademas uno o mas antibioticos que son toxicos para o inhiben el crecimiento de bacterias anaerobias Gram negativas.

12. El uso de un agente inhibidor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la composicion farmaceutica incluye ademas un agente tensioactivo organico.

13. El uso de un agente inhibidor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que la composicion farmaceutica esta contenida en una composicion oral que se prepara y se usa en dentffrico incluyendo pastas de dientes, polvos dentffricos y dentffricos lfquidos, enjuagues bucales, trociscos, gomas de mascar, pastas dentales, cremas de masaje gingival, comprimidos para gargaras, productos lacteos u otros productos alimenticios.

14. El uso de un agente inhibidor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que el pH de la composicion farmaceutica esta en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 o de aproximadamente 5,0 a 7,0.

15. Un kit de piezas para su uso en el metodo como se describe en la reivindicacion 1, en el que el kit incluye (a) una composicion farmaceutica como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y (b) un vehfculo farmaceuticamente aceptable.