UA68332C2 - Moraxeila catarrhalis outer membrane protein-106 (omp106) polypeptide, peptide fragment and encoding nucleotide sequences, antibodies binding omp106 polypeptide, vaccine and antigenic composition (variants), methods of inducing immune responses to m. catarrhalis in animals (variants), method for treatment and prevention of m. catarrhalis infection (variants) - Google Patents
Moraxeila catarrhalis outer membrane protein-106 (omp106) polypeptide, peptide fragment and encoding nucleotide sequences, antibodies binding omp106 polypeptide, vaccine and antigenic composition (variants), methods of inducing immune responses to m. catarrhalis in animals (variants), method for treatment and prevention of m. catarrhalis infection (variants) Download PDFInfo
- Publication number
- UA68332C2 UA68332C2 UA98126370A UA98126370A UA68332C2 UA 68332 C2 UA68332 C2 UA 68332C2 UA 98126370 A UA98126370 A UA 98126370A UA 98126370 A UA98126370 A UA 98126370A UA 68332 C2 UA68332 C2 UA 68332C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- polypeptide
- omp106
- sequence
- catarrhalis
- variants
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 390
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 371
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 368
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 29
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims description 25
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 title claims description 12
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 title claims description 12
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title abstract description 49
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title abstract description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 title abstract 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 title description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 27
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 105
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 63
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 50
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 49
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 47
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 47
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 41
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 36
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 30
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 22
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 22
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 20
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 16
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 15
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 13
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 13
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 9
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 8
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 6
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 6
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 6
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102100027573 ATP synthase subunit alpha, mitochondrial Human genes 0.000 description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- 101000936262 Homo sapiens ATP synthase subunit alpha, mitochondrial Proteins 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 4
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 4
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 4
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 4
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 4
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 3
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 3
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 208000016063 arterial thoracic outlet syndrome Diseases 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- -1 and 6-8 of them Proteins 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000029586 bacterial cell surface binding Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N (2r,3s,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-octoxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound CCCCCCCCOC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N 0.000 description 1
- YBLJYSTXRAWBBH-PZRMXXKTSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-6-(hydroxymethyl)-2-methyloxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound C[C@]1(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YBLJYSTXRAWBBH-PZRMXXKTSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 1,4-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=C(N)C=C1 CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTWSDDKGKIGSJE-UHFFFAOYSA-N 5-(4-aminophenyl)cyclohexa-2,4-diene-1,1,2-triamine;tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1C(N)(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 WTWSDDKGKIGSJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000218642 Abies Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710133359 Agglutinin receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000408923 Appia Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037833 Bacterial Adhesins Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical group [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000693916 Gallus gallus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910000288 alkali metal carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008041 alkali metal carbonates Chemical class 0.000 description 1
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- SNCZNSNPXMPCGN-UHFFFAOYSA-N butanediamide Chemical class NC(=O)CCC(N)=O SNCZNSNPXMPCGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108010008385 glycolipid receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000013376 serial cultivation Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
- C07K14/212—Moraxellaceae, e.g. Acinetobacter, Moraxella, Oligella, Psychrobacter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Опис винаходу 1. Область техники, к которой относится изобретение 2 Данное изобретение относится в общем к полипептиду белка-106 наружной мембраньі (ОМР106) МогахеїІа сагагттаїйї». Данное изобретение включаєт очищенньій полипептид ОМР106 и производньсе от него полипептидь! (производнье от ОМРІ06 полипептидь). Данное изобретение включаєт также антитела, в том числе, цитотоксические антитела, которне специфически связьвают полипептид ОМРІОб и/или производнье от
ОМРІ106 полипептидь. Кроме того, данное изобретение включаєт профилактические или терапевтические 70 композиции, в том числе, вакциньі, которне содержат полипептид ОМРІ106 и/или производнье от ОМР106 полипептидьі. Дополнительно данное изобретение обеспечивает способьі индукции иммунньїх ответньх реакций на М. саїйагттайз в млекопитающих. Далее, данное изобретение обеспечиваєт вьіделеннье нуклеотиднье последовательности, кодирующие полипептид ОМР106 и производнье от ОМР106 полипептидьїі, векторьі, имеющие зти последовательности, и клетки-хозяева, содержащие зти векторь. 12 2. Уровень техники
Могахеїа саїйагтнайв, также известная как МогахеМйа (Вгаппатег|а) сайагттпайв или Вгаппатегйа сайатрайв и оранее о известная как Меїіззегіа сайатнайв или Місго соссив сайагтнаїййв5, является грамотрицательной бактерией, часто обнаруживаеємой в дьїхательньїх путях людей. МогахеїІа саїйагтпаїів, которую сначала считали безопасньм комменсальньм организмом, теперь признают как важньій патоген в инфекциях верхних и нижних дьїхательньїх путей животньїх. У людей М. саїйагтаїййв вьізьіваєт серьезнье инфекции нижних дьїхательньїх путей у пациентов с ослабленной иммунной системой и воспаление среднего уха и синусит у младенцев и детей. См. Неїтіпеп еї аїЇ., 1993, Іптесі. Птип. 61:2003-2010; Сайіп, В.МУ., 1990, Сііп. Місгобіо!. Кеу. 3:293-320; и цитированньє в них ссьІлки. 2.1. Белки наружной мембрань и защитнье антитела с 29 Компонентьї наружной поверхности Могахеїйа сайагтнаїїв исследовались в попьітке ввіяснения патогенного Ге) процесса инфекций М. сайагтнаїїз и разработки применимьїх терапевтических способов и профилактических мер против таких инфекций. Белки наружной мембрань! (ОМР), в частности, привлекли большое внимание как возможнье факторьі вирулентности и как потенциальнье вакцинньюе антигень». М. сайагтнйаїв имеет приблизительно 10-20 различньїх ОМР, причем 6-8 из них, ОМР А - Н, являются преобладающими типами сч (Мигрпу апа І серб, 1989, МісгіріаІ Раїподеп. 6:159-174). Молекулярнье массь! ОМР А - Н находятся в диапазоне со от 97 до 2О0кДа, соответственно. См. Вагпоз апа Мигрпу, 1988, .Іптесі.Оів.158:761-765; Неїтіпеп еї аї., 1993,ІпТесі. Іттип. 61:2003-2010; Мигрпу еї аї., 1993, Моїіеси|.Місгобіої. 10:87-97; и Запгмаг еї аї., 1992, Ше
Інтесі. Іттип. 60:804-809. Сравнения белковьїх профилей при помощи злектрофореза в полиакриламидном еле о с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ) препаратов наружной мембрань из 50 штаммов М. саїйагтнаї»з показали почти гомогеннье распределения ОМР А - Н (Вагіоз апа Мигрпу, 1988, 9.Іптесі. Оів. 158:761-765). ее,
Кроме ОМР А - Н, вьісокомолекулярнье ОМР, названнье НМУУ-ОМР, имеющие среднюю мол. массу 350-720кДа, согласно ПААГ-ДСН, бьли идентифицированьі также в качестве другого существенного поверхностного компонента, присутствующего во многих штаммах М. саїйагтйаїйв. НМУУ-ОМР дают при « денатурации муравьиной кислотой одну полосу 120-140кДа и, следовательно, представляют собой, З 50 по-видимому, олигомерньй белок (Кіпдтап апа Мигрпу, 1994, Іпїесі. Іттип. 62:1150-1155).. НММУУ-ОМР, с по-видимому, является тем же белком, которьій бьл назван ОзрА Неїтіпеп еї аї., (1994, .Іптесі.Оів.
Із» 170:867-872) и, как бьіло показано, присутствует в ряде штаммов М. сайагтнаїв.
В интактной бактерий или полученньїх из бактерий везикулах наружньх мембран некоторье из идентифицированньїх вьіше ОМР представляют поверхностно зкспонированнье зпитопьі, которне индуцируют образование антител, которье связьівают зти ОМР, Зти антигеннье ОМР включают ОМР Е и ОМР о (Мигрпу
Ме апа Вагоз, 1989, Іптесї Іттип. 57:2938-2941)) ОМР С/О (Загмаг еї аї., 1992, Іпїесі. Іттип. 60:804-809);
Ге | СорВ, ОМР 8ОкДа, Неїтіпеп еї аїЇ., 1993, Іпїесї Іттип. 61:2003-2010; и ОврА (Неїтіпеп еї аї., (1994,
УЛиїтесі. Сів. 170:867-872). о Терапевтический потенциал антител к поверхностно зкспонированньїм (доступньім) зпитопам СорВ и ОзрА
Ге) 20 оценивали в модели животного. Модель включала непосредственное болюсное инокулирование легких ВАЇ В/с
МАР/Ріиз мьшей контролируемь!м количеством клеток М. сайагттайв и последующее исследование скорости із легочного клиренса зтих бактерий (ппапа еї аї., 1992, У.Іпїесі. Оів. 165:644-650). Различнье клинические изолять! М. саїйагтнаїйв обнаруживали различнье скорости клиренса, которье коррелировали с уровнем рекрутмента гранулоцитов в сайт инфекции. Пассивная иммунизация моноклональньми антителами против 29 поверхностно зкспонированного зпитопа СорВ или ОврА увеличивала скорость легочного клиренса М. сайагтнаїїв
ГФ) (Неїтіпетп еї а/!., 1993, Іптесі. Іттип. 61:2003-2010; (НеїІтіпеп еї аї!., (1994, У.Іптесі. Оів. 170:867-872). 2.2. Адгезия бактерий/клеток-хозяев и гемагглютинация о Прикрепление (адгезия) бактериальньїх патогенов к поверхности клеток-хозяев усиливает колонизацию и инициирует патогенез. См. Е.Н. Веаспеу, 1981, у.Іптесі. Сів. 143:325-345. Обьічно грамотрицательнье бактерий 60 зкспрессируют поверхностнье лектиньі, которье связьиваются со специфическими олигосахаридами гликопротеинов и/или гликолипидов на поверхности клеток-хозяев. Такие лектиньі часто связань! со жгутиками или фимбриями. Бактериальное прикрепление (адгезия) может также опроисходить в результате неспецифического связьувания, имеющего в основе гидрофобное и/или связанное с зарядами взаймодействие с поверхностью клетки-хозяина. бо Механизм адгезии М. сайагтнаїїз к клеткам дьїхательньїх путей остается слабо вьіясненньім. Зтот организм прикрепляется к культивируемьм человеческим зпителиальньм клеткам ротоглотки (МБбакі еї аї!., 1987, ТопиКи
У. Ехр. Меа. 153:111-121). Исследование Кікіюті еї аІ. предполагает, что фимбрии могут играть роль в адгезии к таким клеткам, так как денатурация фимбрий или обработка антителами против фимбрий снижала адгезию имеющих фимбрии штаммов (Кікіюті еї аІ., 1991, Зсапа. 9.Іптесі. Оів. 23:559-567). Однако, опосредованное фимбриями связьівание не может бьіть единственной основой зтой адгезии, так как в наибольшей степени прикрепляющимся штаммом, среди испьітанньїх штаммов, бьіл штамм, не имеющий фимбрий.
Реакции гемагглютинации часто заменяют более сложньсе тесть! адгезиий при классификации бактериальньх адгезинов. Однако, Кікіюті еї а. не нашли корреляции между адгезией к человеческим зпителиальньїм клеткам 7/0 ротоглотки и гемаглютинацией при использований штаммов М. саїйагтнаїз (Ід.). А именно, три штамма с вьісокой адгезией не аглютинировали человеческие зритроцить. Таким образом, в адгезий человеческих зпителиальньмх клеток ротоглотки и гемагглютинации участвуют различнье механизмь! связьввания.
В противоположность зтому, недавнее исследование КеїЇепз еї аІ. предполагает, что гемагглютинация посредством М. саїйагтнпаїйз коррелирует с адгезией клетки-хозяина (КеїЇепз еї аїЇ., 1995, Іптесіоп 23:37-41). 7/5 Однако, зто исследование использовало тест адгезии, основанньй на бактериальном связьваний с отрезками трахеи свиньи. Неизвестно, может ли ткань трахей свиньи рассматриваться как гомологичная с тканью дьїхательньїх путей человека в отношений адгезии патогенньїх штаммов М. садатпаїів.
Несмотря на проблематичньй тест адгезии, КеїЇепз еї аІ. исследовали активность гемагглютинации более восьмидесяти клинических изолятов М. саїйагтнаїїв (КеПепе еї аїЇ.,, 1995, Іпїесйоп 23:37-41). Почти три го четверти испьітанньїх штаммов агглютинировали зритроцить! человека, кролика, морской свинки, собаки или крьісьі, тогда как остальнье штаммь! не вьізьівали агглютинации. Активность агглютинации для некоторьх из гемагглютинирующих штаммов характеризовались дополнительно, и бьло обнаружено, что она зависит от ионов кальция и ингибируется расщеплением трипсином или вьсоко температурной обработкой или добавлением ЮО-глюкозамина или О-галактозамина. с
Обследование гемаггллютинирующих и негемагг'лютинирующих штаммов М.саїйагтнаїїв ТисКег еї аЇ. показало, о что все штаммь!ї связьівают гликолипид ганглиотетраозилцерамид, но только гемаг-лютинирующие штаммь! связьувают гликолипид глоботетраозилцерамид (ТискКег еї а!., 1994, Аппиа!| Меейпд ої Атегісап бос. Місго-біо|.,
Арзігасі Мо. 0124). Кроме того, бьіло показано, что гемагглютинирующая активность М.сайагтнаїїв ингибируется различньми моносахаридами, которье содержат углеводную часть молекуль! глоботетраозилцерамида. Зто сі зо наблюдение позволило ТисКег еї а). предположить, что М.саїйагттпаїйз производит гемаглютинацию путем связьшвания с глоботетраозилцерамидами в клеточньїх мембранах чувствительньїх зритроцитов, в том числе, і, зритроцитов человека. До настоящего времени не бьіла идентифицирована молекула на наружной поверхности (се
М.савагтнаїйз, которая ответственна либо за адгезию клетки-хозяина, либо за гемагглютинацию.
Цитирование или идентификация любой ссьілки в зтом разделе или в любом другом разделе зтой заявки не со з5 должна рассматриваться как указание на то, что такая ссьілка доступна в качестве прототипа данного со изобретения. 3. Сущность изобретения
Данное изобретение включает полипептид ОМР106 М.саїйагтнаїїз и производньіе от ОМР106 полипептидь и способь! получения зтих полипептидов. Данное изобретение включает также антисьіворотки и антитела, в том « числе цитотоксические антитела, специфические для полипептида ОМРІ106 и/или производньїх от ОМР10О6 з с полипептидов. Далее, данное изобретение включает иммуногенньюе, профилактические или терапевтические композиции, в том числе вакциньі, содержащие один или несколько указанньїх полипептидов. Дополнительно ;» данное изобретение включаєт нуклеотиднье последовательности, кодирующие зти полипептидьі. Далее, данное изобретение включает иммуногеннье, профилактические или терапевтические композиции, в том числе вакцинь), содержащие аттенуированньй или инактизированньй негемагглютинирующий культивар М.саїйагтпаїів.
Ге» Данное изобретение имеет много применений. Например, полипептид ОМР106 и производнье от ОМР106 полипептидь! могут бьіть использовань! в качестве лигандов для обнаружения антител, индуцированньх в ответ со на инфекции М.саїагтнайз (например, в диагностике инфекций М.саїйагтнпа|йв) Полипептид ОМРІ1Об и 2) производнье от ОМРІОЄ полипептидь могут бьть также использованьй в качестве иммуногенов для 5р Мндуцирования М.саїагтнаїї5-специфических анти-тел. Такие антитела применимь! в иммуно анализ ах для о детектирования М.саїагтнпайв в биологических образцах. Цитотоксичнье антитела данного изобретения
Ге применимь! в пассивньїх иммунизациях против инфекций М.саїйагтнаїїв. Кроме того, полипептид ОМР106 и производнье от ОМР106 полипептидь! могут бьіть использовань! в качестве активньїх ингредиентов в вакцинах против инфекций М.сагагтнаїів. 5Б Данное изобретение основано на неожиданном обнаружении, что гемаглютинирующие штаммь и культиварь! М.саїйагнаїїв имеют белок наружной мембраньі, полипептид ОМР106, которьій имеет молекулярную
Ф) массу примерно от 180-до 230кДа, и что негемагглюотинирующие штаммь! и культиварь! М.саїйагтнаїїв не имеют ка полипептида ОМР106 или имеют неподходящим образом модифицированньй полипептид ОМР106, которьй неактивен в гемагглютинации и не окрашивается серебром. Далее, данное изобретение основано на открьїтийи, бо что поликлональная антиськворотка, индуцируемая полипептидом ОМРІОб, вьіделенньім из гемагглютинирующего штамма М.саїагтнарйв, имеет цитотоксическую активность против отличающегося гемагглютинирующего штамма М.сайагтнаїїв, но не против негемагглютинирующего штамма М.сайагтпнаїв. 3.1. Определения и аббревиатурь
Анти-ОМР106б-антитело или антисьіворотка против полипептида ОМР10О6 65 АТОСС-Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп пузьірьки (бБіерз)-природно-встречающиеся везикуль! наружньїх мембран М.саїйагтнаїйв оЬь,-СаіМасв1-3баід1-4ба1ІВв1-4аїсВв1-1-церамид
НА:-гемагглютинация иммунореактивньій-способньій провоцировать клеточньїй или гуморальньйй иммунньй ответ кДа-килодальтон
М.сайагтна|йв-Мс; Могахейа сайатнаїїв, МогахеМйа (Вгаппатег| Іа) сайагттпаїйв; Вгапнагпеїйа саїйатнаїів;
Меїззегіа сагатнаїйв или Місгососсиз сагагтнаїїв
МНА:негемагглютинирующие
Об-н-октил-В-О-глюкопиранозид или октилглюкозид 70 ОМРІ06б-полипептид белка-106 наружной мембрань! Могахеїйа сайагтнаїїх, имеющий молекулярную массу приблизительно 18О0кДа-23О0кДа, согласно злектрофорезу в ПААГ-ДСН; зкстрагируемьй из везикул или интактньїх клеток М.садатнаїйв при помощи ОС или содержащего саркозил детергента производньій от ОМР106 полипептид-фрагмент полипептида ОМР106; вариант полипептида ОМР106 дикого типа или его фрагмент, содержащий одну или несколько делеций, инсерций (вставок) или замен аминокислот; /5 мли химерньй белок, содержащий гетерологичньій полипептид, слитьій с С-концевьм, М-концевьм или внутренним сегментом целого или части полипептида ОМР1О6
ОМР-белок наружной мембрань! белки ОМР--белки наружной мембрань!
РВБ5-забуференньій фосфатом солевой раствор
РАС-полиакриламидньй гель полипептид-пептид любой длиньї, предпочтительно имеющий десять или более аминокислотньїх остатков
ОЗ (ДСН)-додецилсульфат натрия
ЗОЗ-РАСЕ (ПААГ-ДСН)-:злектрофорез в додецилсульфатполиакриламидном геле
Нуклеотидньюе последовательности или последовательности нуклеиновьх кислот, определеннье здесь, с представленьії однобуквенньіми символами для оснований, такими как:
А (аденин) і)
С (цитозин)
Со (гуанин)
Т (тимин) с зо У (урацил)
М (А или С) о
К (А или 5) с
МІ (А или Т/)) 8 (С или С) со
М (С или Т/)) «о
К(С или Т/У)
М (А или С или 0; не Т/))
Н(А или С или ТЛ; не 5)
Р (А или С или Т/Ш/ не С) «
В (С или б или Т/); не А) з с М (А или С или С или Т/У) или (неизвестное)
Пептиднье или полипептиднье последовательности, определеннье здесь, представлень однобуквенньіми ;» символами для аминокислотньх остатков, такими как:
А (аланин)
К (аргинин)
Ге» М (аспарагин)
Ор (аспарагиновая кислота) со С (цистейин)
Га О (глутамин)
Е (глутаминовая кислота) о о (глицин)
Ге Н (гистидин)
І (изолейцин)
Ї (лейцин)
К (лизин)
М (метионин)
Ф) Е (фенилаланин) ка Р (пролин)
З (серин) во Т (треонин)
М (триптофан)
ХУ (тирозин)
М (валин)
Х (неизвестная аминокислота) 65 Данное изобретение может бьть более полно понятьмм со ссьлкой на следующее далее подробное описание данного изобретения, неограничивающие примерь!ї характерньїх вариантов данного изобретения и прилагаемье рисунки. 4. Краткое описание рисунков
Фиг.1: Сравнение при помощи РАСЕ (злектрофореза в полиак-риламидном геле) профилей белков наружной мембрань! везикул М.саїйагпаїйв или октилглюкозидньїх (00) зкстрактов цельїх клеток М.сайагтнаїїв. Цифрь! над дорожками относятся к АТСС-обозначениям штаммов. Предварительно окрашенньій стандарт ЗОЗ-РАСЕ (Віокай сайаіод 5161-0305) использовали в качестве маркеров молекулярньїх масс. Стандарт состоял из следующих полипептидов с их приблизительньми молекулярньми массами, указанньми в скобках: фосфорилазьі В мьішц кролика (10бкДа); бьчьего сьівороточного альбумина (8О0кДа); овальбумина белка 7/0 Куриного яйца (49,5кДа); бьічьей карбоангидразь! (32,5кДа); ингибитора трипсина сои (27,5кДа); лизоцима белка куриного яйца (18,5кДа). Положения маркеров молекулярньїх масс в геле показань! на левой стороне рисунка стрелками с молекулярньіми массами (кДа) некоторьїх маркеров над зтими стрелками.
Фиг.2: Результать! разделения на тонкослойньїх хроматограммах гликолипидов с 125І-меченьми везикулами наружньїх мембран. В Панелях А-С, дорожка 1 содержит гликолипиднье стандарть, указаннье слева; дорожка 2 75 содержит асиало-ЗМ;; дорожка З содержит Об3з, ОБ; и антиген Форссмана; и дорожка 4 содержит зкстракт по
Фолчу зритроцитов человека. Хроматограмма, показанная в Панели А, окрашена орсином, хроматограмма, показанная в Панели В, покрьта сверху 125|-меченьми везикулами штамма АТСС 8176 (негемагглютинирующего штамма), а хроматограмма, показанная в Панели С, покрьіта сверху 71292І-меченьми везикулами штамма АТСС 49143 (гемагглютинирующего штамма). Только гемаглютинирующий штамм связьівался с полосой гликолипида СБ. на третьей и четвертой дорожках.
Фиг.3: Белковье профили при окрашиваниий серебром октилглю-козидньїх зкстрактов белков наружньх мембран после расщепления клеток М.саїйїагтнайв протеазами, указанньми на рисунке. Активность гемагглютинации клеток после расщепления показана ниже рисунка в ряду, обозначенном НА. Использованнье маркерь! молекулярньїх масс соответствовали маркерам на Фиг.1. с
Фиг.4: Сравнение белковьїх профилей при окрашиваний серебром белков наружньїх мембран из различньх о штаммов АТСС М.саїйагтнаїїв. Обозначения штаммов указаньї над дорожками. Активность гемагглютинации штаммов указана в ряду НА ниже рисунка. Обратите внимание, что белок, имеющий среднюю молекулярную массу, большую, чем молекулярная масса фосфорилазьі В мьішц кролика (10бкДа), является общим для гемагглютинирующих штаммов, но отсутствует в негемагг'лютинирующих штаммах. Зтот полипептид назван СМ ОМРІ1І06. Использованнье маркерь! молекулярньїх масс соответствовали маркерам на Фиг.1. со
Фиг.5: Сравнение белковьіх профилей при окрашиваниий серебром белков наружньх мембран из двух культиваров М.саїатнайв АТСС 49143:49143 (гемаглютинирующего культивара) и 49143-МНА «(о (негемагг'лютинирующего культивара). Активности гемагглютинации зтих культиваров указаньі ниже рисунка в со ряду НА. Обратите внимание на отсутствие полосьї полипептида ОМРІО06 (указанной «у в негемагглютинирующем культиваре. Использованнье маркерьї молекулярньїх масс соответствовали маркерам (Се) на Фиг.1.
Фигб: Оценка молекулярной массь ОМРІОб в бо денатурирующем полиакриламидном геле с использованием Об-зкстрактов штамма АТСС 49143, которне инкубировали в буфере для нанесения проб при « 25"Сб или при 100"С перед нанесением на гель. Белки в геле визуализировали восстановительньм окрашиванием серебром. Обратите внимание, что полоса полипептида ОМР106 (указанная «) видна только в т с пробе, инкубированной при 100"С. В качестве маркеров молекулярньїх масс использовали стандарт широкого ч диапазона для 5О5Б-РАСЕ (ВіоКай сайаюд 5161-0317). Стандарт состоял из следующих полипептидов » (приблизительно молекулярнье массь! указаньй в скобках); миозина скелетньхх мьішц кролика (200кДа);
В-галактозидазь Е.соїї (116бкДа); фосфорилазь! В мьішць кролика (97,4кДа); бьічьего сьівороточного альбумина (66,2кДа). Положения маркеров молекулярньїх масс в геле указаньї на правой стороне рисунка стрелками с (22) молекулярньїми массами (кДа) маркеров над зтими стрелками. о Фиг.7: Блот-анализ по Саузерну гидролизатов рестриктаз ЮОга!І и НіпайШ хромосомной ДНК М.саїйагтнаїіз, зондированньїх Мес5-72. ДНК штамма М.саїйагтнаїїв 49143 расщепляли ОгаІ или Ніпай!й. Анализ по Саузерну о расщепленной ДНК проводили с использованием Ме5-72 (ЗЕО ІЮО М 4) в качестве зонда. Промьівка вьісокой с 50 строгости бьла 2х55С, 196 ДСН при 50"С в течение приблизительно 20-30 минут. Дорожка 1 содержит гидролизат Ніпаїїї; гибридизующаяся полоса имеет приблизительньй размер 8,0 т.п.н. Дорожка 2 содержит кі» гидролизат Ога!: гибридизующаяся полоса имеет приблизительньй размер 4.2т.п.н.
Фиг.8А и 88: Вестерн-блоть! белковьїх зкстрактов М.саїагпайв и родственньїх видов с использованием кроличьей антисьіворотки к ОМР106 в качестве зонда (Фиг.8А) сравнивали с реактивностью зтой сьіворотки перед иммунизацией кролика ОМР106 (Фиг.88). Пробьї в дорожках Фиг.8А и 88 являются следующими: дорожка
Ге! А, М.сайагтнпа|йв; дорожка В, Могахеїйа омів; дорожка С, Могахеїйа Іасипаїа; дорожка О, МогахейПа озіоепвів; дорожка Е, МогахеМйа ромів: дорожка ГЕ: Меїіззегіа тепіпойідіз; дорожка С, Меїівззегіа допотпоеаєеє. ко Использованнье маркерь! молекулярньїх масс соответствовали маркерам на Фиг.1.
Фиг.9А. Вестерн-блот, показьівающий, что кроличья антисьшворотка к полипептиду ОМР106 из штамма 60 М.саїагтаїйз 49143 перекрестно реагирует с полипептидом той же молекулярной массьі в ряде НА- и МНА штаммов М.саїагнаїй» (положение полипептида ОМР106 указано стрелкой). В зтом Вестерн-блоте исследовали октилглюкозиднье зкстракть! различньїх штаммов М.сайагтнаїїв. Номера доступа в АТСС зтих штаммов указань над дорожками. Использованнье процедурьі переноса и Вестерн-блоттинга бьли идентичньі! процедурам, использованньїм для получения блотов, показанньїхх на Фиг.8. 65 Фиг.98. Вестерн-блот тех же самьїх зкстрактов, что и в Фиг.9А, с использованием пре-иммунной сьіворотки, соответствующей сьіворотке, использованной в Фиг.9А.
5. Сведения подтверждающие возможность осуществления изобретения 5.1. Гемагглютинирующий и негемагглзотинирующий культиварь
Данное изобретение обеспечиваєет вьіделенньій или по существу чистьій полипептид ОМР106 М.сагагтнаїів.
Полипептид ОМРІ10О6 содержит весь белок или субьединицу белка, погруженнье в наружную мембрану или расположеннье на наружной поверхности наружной мембраньі! гемагглютинирующих (НА) штаммов и многих негемагглютини-рующих (МНА) штаммов и культиваров М.саїйагтнаїїв. ОМРІ106 прямо или опосредованно способствует созданию фенотипа сгемаглютинации НА штаммов и культиваров. Согласно данному изобретению, НА клетки М.сайагтнаїїз агг'лютинируют зритроцить! человека или кролика в любом стандартном /о тесте гемагллютинации, таком как описанньій Зоїо-Негтпападе? еї аї. 1989, 9. Сііп. Місгобріо!ї. 27:903-908. Хотя и без намерения ограничения каким-либо конкретньім механизмом действия, в настоящее время рассматривается вопрос о том, что М.сайагтнаїїв агглютинирует зритроцить! путем связьтвания с глобо-тетрозной (СБ 4) частью гликолипидньїх и гликопротейновьіх рецепторов на поверхностях клеток-хозяев и что активность гемаггллютинации опосредована отчасти подходящим образом модифицированньм полипептидом ОМР106, 7/5 Которьйй обладает специфическим свойством чувствительности к окрашиванию серебром. В противоположность зтому, немодифицированньій или неподходящим образом модифицированньій полипептид ОМР106 является неактивньім в гемагглютинации и не окрашиваєтся серебром. Кроме того, полипептид ОМР106 является единственньмм полипептидом, имеющим среднюю молекулярную массу приблизительно 180кДа - 230кДа при злектрофорезе в ПААГ-ДСН (ЗО5-РАСЕ), которьій может зкстрагироваться ОС или саркозилом из НА или МНА 2о везикул или интактньх клеток М.сагаггпаїв.
Гемагглютинирующая активность НА клеток М.саїйатнаїїв ингибируется глоботетрозой (Са1Масв1-3батАІ-4ба181-4ба1сВ1; 05р)) и моносахаридами, которье осодержат (р), в том числе,
М-ацетил-О-галактозамином, ЮО-галактозой и глюкозой и их производньїми, такими как метил-а-галактоза или метил-В-галактоза. Гемагглютинирующая активность НА клеток М.сайагтнаїїз ингибируется также относительно сч 2г5 более вьісокими концентрациями ряда других сахаров, в том числе (но не только) О-маннозь, І-фукозь,
О-глюкозьї и М-ацетил-О-глюкозамина. і)
Гемагглютинирующая активность и полипептид ОМР106 интактньїх НА клеток М.садагтнаїїз уменьшаются или разрушаются при расщеплений интактньїх клеток М.сайагтпаїїв различньми, протеазами, в том числе (но не только) обработанньм сек (Ма-п-тозил-Ї -лизин-хлорметилкетоном (также известньі!м как сч
Зо 1-хлор-З-тозиламино-7-амино-І--2-гептаноні) трипсином. Однако, расщепление протеазой М8 интактньїх НА клеток М.сайагтпайв не влияєт ни на гемаглютинирующую активность, ни на физическую целостность і, полипептида ОМР106 таких клеток. с
Неагглютинирующий (МНА) культивар может бьіть произведен из НА штамма или культивара М.саїйагтнаїїв серийньім пассажем в статических жидких культурах (те. жидких культурах, поддерживаемьх при 35"С без со встряхивания). Например, НА штамм или культивар М.саїйагтнаїїз виращивают в бульоне Мюллера-Хинтона и «о каждье 5 дней берут инокулят (посевной материал) с поверхности статической культурь! для инокулирования последующей статической культурьі. Предпочтительньім инокулятом является любой плавающий "ковер" клеток на поверхности культурьі. Серийньй пассаж в статических культурах поддерживают, пока не образуется МНА культивар. МНА культивар данного изобретения может бьїть использован для получения защитньїх вакцин, « таких как цельно-клеточньсе вакцинь, против инфекций М.саїйагтнаїв. з с В противоположность зтому, гемагглютивирующий фенотип НА штамма или культивара М.саїйагтнаїїз может бьіть сохранен пассажем зтого штамма или культивара во встряхиваемьх жидких культурах. В одном варианте ;» НА штамм или культивар М.саїйатнаїїз вниращивают в бульоне Мюллера-Хинтона при 35-377С со встряхиванием при приблизительно 200об/мин, и пассируют каждье 24-48 часов. Гемагглютинирующий фенотип НА штамма
Мли культивара М.саїагпаїїв может бьїть такке сохранен пассажем на твердьїх средах. Например, НА штамм б или культивар виіращивают на чашке, содержащей кровяной агар или агар Мюллера-Хинтона. 5.2. Полипептид ОМР106 со Полипептид ОМРІ106 данного изобретения является единственньім белком наружной мембраньі НА штамма 2) или культивара М.саїйагтпаїїв, которьій имеет среднюю молекулярную массу в 50О5-РАСЕ приблизительно 5о 18ОкДа - 23ОкДа, предпочтительно примерно 190кДа. Согласно данному изобретению, белок наружной о мембрань! М.саїйагтнпайв представляеєет собой полипептид, которьій присутствует в пузьірьках (везикулах)
Ге М.саїйїагттайв или которьій может бьть зкстрагирован из везикул или интактньїх клеток М.сайагтнаїз н-октил-В-ЮО-глюкопиранозидом (00) или содержит саркозил детергентом в буферном растворе при комнатной температуре. См. Мигрпу апа І сер, 1989, Місгоріа! Раїподепезіз 6:159-174, в отношений обсуждения везикул 5Б М.саїатнаїйв, которне являются природно-встречающимися везикулами, состоящими из наружной мембрань
М.саїйагтнаїйв. МНА штаммь! или культиварьї М.саїйагттайз либо не имеют полипептида ОМР106, либо имеют
Ф) полипептид ОМРІТОб в форме, которая связьвает антитела против ОМР106 (см. раздел 5.5, іпіта), но не ка взаймодействует с содержащим серебро красителем (а именно, при использований красителя Зіїмег Зіаіп Різ
Віокай (|Кісптопа, СА) или процедурь, описанной (зоШіер апа Спацко, 1987, Апаї. Віоспет. 165:33). В бо противоположность зтому, полипептид ОМР106 из НА штаммов или культиваров связьвает антитела против
ОМРІ06 и реагирует с содержащим серебро красителем.
Полипептид ОМРІТОб6 может бьть идентифицирован в НА везикулах или штаммах М.саїйагтнаїїв по его чувствительности к деградации при обработке протеазой, которая также уничтожает или аттенуирует гемагглютинирующую активность того же НА штамма (См. Раздел 5.1. виіше в отношений примеров протеаз, 65 Которье разрушают или не разрушают гемаглютинирующую активность интактньїх клеток М.сайагтпаї|в5).
Другими словами, расщепление протеазой, которая разрушает или снижает гемагглютинирующую активность
НА штамма или культивара, будет также изменять, в ЗО5-РАСЕ, обилие или положение полипептида ОМР 106, вьіделенного из штамма или культивара после такого расщепления, в сравнений с полипептидом ОМР106, вьіделенньїм из того же самого штамма или культивара перед расщеплением.
Полипептид ОМР1О6 может бьїть также идентифицирован в виде полипептида в 00- или саркозильном зкстракте везикул или интактньїх клеток М.сайагтпаїїв, которьій имеет среднюю молекулярную массу более 196кДа, определенную при помощи денатурирующего гель-злектрофореза в 1295 ПААГ с ДСН, с использованием процедур, описанньїх Нагіом/ апа І апе (Апііїродіев: А І арогаїогу Мапиа!Ї, Соїд Зргіпд Нагрог
І арогаїогу Ргезв, Соїй Зргіпд Нагрог, МУ, Аррепаїх І, 1988). Обработка нагреванием О0- или саркозильного 7/0 Зкстракта при 100"С в течение 5 минут может дать полипептид ОМР106, имеющий среднюю молекулярную массу приблизительно 180кДа-230кДа, как определено 5О5-РАСЕ в 695 ПААГ без восстанавливающих агентов с использованием процедур, описанньх в Нагіоуу апа І апе, ії. В специфическом варианте, полипептид ОМР106 в обработанном нагреванием О0- или саркозильном зкстракте штамма АТСС 4 9143 М.сайагтнаїїв имеет среднюю молекулярную массу около 190кДа.
В специфических вариантах полипептид ОМР106 является полипептидом, полученньм из любого из штаммов М.сайагтнаїїв (но не только), включающих АТСС 49143, АТСС 25238, АТСС 25240, АТОСС 43617, АТОС 43618, АТСС 43627 и АТСС 43628. Предпочтительньм источником полипептида ОМРІ106 является НА культивар таких штаммов. Более предпочтительнь!м источником является НА культивар АТСОС штамма 49143.
В конкретном варианте полипептид ОМР106 содержит, предпочтительно при амино-конце, аминокислотную го последовательность ІБІЗЕДОСОКОВАМАКООКЗІАІВПІАОАІ ОЗОБІАІСОМКІМ (ЗБО ОО Мо 1) или последовательность, по существу гомологичную ей. Полипептид ОМР106 может дополнительно содержать карбоксилдистально относительно вьшеупомянутой последовательности октапептид, имеющий аминокислотную последовательность ТМ СОКК (5БО ІО М 2) или последовательность, по существу гомологичную ей. В применениий здесь, по существу гомологичная, аминокислотная последовательность по с меньшей мере на 8095, предпочтительно на 10095, идентична цитированной вьше аминокислотной о последовательности.
В соответствий с различньми аспектами данного изобретения полипептидьі данного изобретения характеризуются их средними молекулярньми массами на основе миграции полипептидов в 5О5-РАСЕ относительно маркеров известньїх молекулярньїх масс. Хотя з злектрофорезе в ПААГ-ДСН (505-РАСЕ) могут с бьть использованьії любье стандарть! молекулярньїх масс, известнье в данной области, предпочтительнье маркерьї молекулярньїх масс включают по меньшей мере миозин скелетньїх мьішц кролика, В-галактозидазу і,
Е.соїї и фосфо-рилазу В мьішц кролика. Специалисту в данной области будет понятно, что полипептидьї данного с изобретения могут мигрировать различно в различньїх типах систем геля (например, в различньїх буферах; при различной концентрации геля, сшивающего средства или ДСН). Специалисту в данной области будет также со
Зз5 Понятно, что полипептидь! могут иметь различнье средние молекулярнье массь! в зависимости от различньх со маркеров молекулярньїх масс, используемьїх при 50О5-РАСЕ. Таким образом, характеристика при помощи молекулярньїх масс полипептидов данного изобретения предполагает охват одних и тех же полипептидов на любой системе ЗО5-РАСЕ и с любьми маркерами молекулярньїх масс, которье могут показьвать слегка отличающиеся молекулярнье массьй для зтих полипептидов, в сравнений со средними молекулярньми « 70 массами, описанньїми здесь. в с 5.3. Производнье от ОМР106 полипептидь!
Производньій от ОМР106 полипептид данного изобретения может бьіть фрагментом полипептида ОМР 106. з Интактньій полипептид ОМР10О6 может содержать один или несколько аминокислотньїх остатков, которье не являются необходимьми для его иммуногенности. Может бьіть, например, так, что только аминокислотнье статки, образующие специфический зпитоп полипептида ОМР106, являются необходимь!ми для иммуногенной б активности. Необязательнье аминокислотнье последовательности могут бьїть удалень! способами, хорошо известньми в данной области. Например, нежелательнье аминокислотнье последовательности могут бьть со удаленьї ограниченньім протеолитическим расщеплением с применением таких ферментов, как трипсин, папаин оо или родственнье протеолитические ферменть, или химическим расщеплением с использованием таких агентов, как цианогенбромид, с последующим фракционированием продуктов гидролиза или расщепления . о Производньій от ОМРІТОб полипептид данного изобретения может бьть также модифицированньм
Ге полипептидом ОМР106 или его фрагментом (т.е. полипептидом ОМР106 или фрагментом, имеющим одну или несколько замен, вставок и/или делеций аминокислот последовательности ОМРІ06 дикого типа). Такие модификации могут усиливать иммуногенность полученного полипептидьюого продукта или не влиять на зту ов активность. Способь! модификации, которье могут бьіть использованьі), включают способь), описаннье в 0.5.
Раїепі М 4 526 716. (Ф) Производньій от ОМР106 полипептид может, кроме того, бить химерньім полипептидом, содержащим один ка или несколько гетерологичньїх полипептидов, слитьїх с амино-концевьім или карбокси-концевьм или внутренним сегментом полного полипептида ОМРІТОб, или его частью или фрагментом. Применимье бор гетерологичнье полипептидь!, содержащие такой химерньй полипептид, включают (но не ограничиваются ими) а) пре- и/или про-последовательности, которье облегчают транспорт, транслокацию и/или процессинг производного от ОМР106 полипептида в клетке-хозяине, Б) последовательности для аффинной очистки и с) любье применимье иммуногеннье последовательности (например, последовательности, кодирующие один или несколько зпитопов поверхностно-зкспонированного белка микробного патогена). 65 Предпочтительно, производнье от ОМР106 полипептидь! данного изобретения являются иммунологически перекрестно-реактивньми с полипептидом ОМРІ106 и, таким образом, способньми индуцировать в животном иммунньій ответ на М.саїйагпарйв. Более предпочтительно, производнье от ОМРІ06 полипептидь! данного изобретения содержат последовательности, образующие один или несколько зпитопов наружной поверхности нативного полипептида ОМРІ106 М.всайагтнпаїїв (те. поверхностно-зкспонированньїх зпитопов полипептида
ОМРІТОб в том виде, в котором он существует в интактньїх клетках М.сайатнаїїв). Такие предпочтительнье производнье от ОМРІО0б6 полипептидьй могут бьть идентифицировань по их способности специфически связьвать антитела, индуцированнье интактньіми клетками М.сайагнаїз (например, антитела, индуцированнье фиксированньми формальдегидом или глутаровьм альдегидом клетками М.саїйагтнаїїв; такие антитела назьваются здесь "анти-цельноклеточньми" антителами"). Например, полипептидьй или пептидь из 7/0 ограниченного или полного протеазного гидролиза полипептида ОМРІТОб фракционируют при помощи стандартньїх способов и отестируют на их способность связьшвать анти-цельноклеточнье антитела.
Реакционноспособнье полипептидьі включают предпочтительнье произведеннье из ОМР106 полипептидь!. ИхХ вьіделяют и их аминокислотнье последовательности определяют способами, известньіми в данной области.
Таюке предпочтительно, произведеннье из ОМРІ106 полипептидьй данного изобретения содержат 7/5 последовательности, которне образуют один или несколько зпитопов нативного полипептида ОМР 106, которне медиируют (опосредуют) гемагг'лютинацию, вьізьїваемую НА клетками М.сайагтнпаїйв. Такие предпочтительнье производнье от ОМР106 полипептидь! могут бьіть идентифицировань! по их способности противодействовать гемагглютинации, вьізьваемой НА клетками М.саїйагтаїй»в. Например, полипептидь! ограниченного или полного протеазного гидролиза или химического расщепления полипептида ОМРІ106 фракционируют при помощи 2о стандартньх способов и тестируют на способность препятствовать гемагглютинации, вьізьіваемой клетками
М.сагагтнаїїв. После идентификации и вьіделения аминокислотнье последовательности таких предпочтительньх производньїх от ОМРІ106 полипептидов определяют при помощи стандартньїх способов секвенирования.
Определенная последовательность может бьть использована для получения таких полипептидов синтетическими химическими и/или генно-инженерньіми способами. с
Зти предпочтительнье производнье от ОМРІ106 полипептидь! могут бьїть также идентифицировань! с использованием антител против цельїх клеток для скрининга бактериальньїх библиотек, зкспрессирующих і) случайнье фрагментьї геномной ДНК М.саїйагтнаїїв или клонированньїх нуклеотидньїх последовательностей, кодирующих полипептид ОМР106. См., например, Затьгоок еї аї., МоіІесшаг Сіопіпд: А І арогаїюгу Мапиаї, 2па
Еа., Соїа Зргіпу Нагброг І арогаїюгу Ргезз, МУ, МоІ.1, Спаріег 12. Реактивнье клоньії идентифицируют и их вставки су зо Ввіделяют и секвенируют для определения аминокислотньїх последовательностей предпочтительньх производньїх от ОМР106 полипептидов. і 5.4. Вьиіделение и очистка полипептида ОМР106 и производньїх от ОМР106 полипептидов с
Данное изобретение обеспечиваєт вьіделеннье полипептидьї ОМРІОб и производнье от ОМРІ106 полипептидь. В применении здесь, термин "вьіделенньій" обозначает, что продукт по существу свободен от со з5 других биологических материалов, с которьіми он природно связан. Т.е., например, содержащая вьіделенньй со полипептид ОМРІТОб6 композиция имеет между 7Омасс.уо и З94масс.бю чистого полипептида ОМР1І0О6.
Предпочтительно, полипептид ОМР106 и производнье от ОМР106 полипептидьі являются очищенньіми. В применений здесь, термин "очищенньй" обозначает, что продукт по существу свободен от другого биологического материала, с которьім он природно связан. Т.е. содержащая очищенньій полипептид ОМР1О6 « Композиция имеет, по меньшей мере, 95масс.96 чистого полипептида ОМР106, предпочтительно, по меньшей шщ с мере, 98масс.уо чистого полипептида ОМРІ106 и, найболее предпочтительно, по меньшей мере, 9О9масс.9о чистого полипептида ОМР 106. з Полипептид ОМР106 данного изобретения может бьїть вьіделен из белковьїх зкстрактов, в том числе цельно-клеточного зкстракта, любого штамма или культивара М.саїйагтнйаїїв. Предпочтительно, белковьм Зкстрактом является октилглюкозидньй или саркозильньй зкстракт везикул наружньїх мембран (т.е. пузьірьков)
Ге» или цельїх клеток М.саїйагтнаїїв5, в том числе (но не только) любьїх из штаммов АТСС 49143, АТСС 25238, АТСС 25240, АТСС 43617, АТСС 43618, АТСС 43627 и АТСС 43628. Предпочтительньі!м источником таких зкстрактов со является НА культивар таких штаммов. Более предпочтительньім источником таких зкстрактов является НА 2) культивар АТСС 49143. Другим источником полипептида ОМР106 являются белковье препарать! из генньх Ззкспрессионньїх систем, зкспрессирующих клонированнье последовательности, кодирующие полипептид і ОМРІ06 или производнье от ОМР106 полипептидьі! (см. Раздел 5.8. іпіта).
Ге Полипептид ОМРІОб может бьть вьіделен и очищен из материала источника при помощи любого биохимического способа и подхода, хорошо известного специалистам в данной области. При одном подходе наружную мембрану М.сайагттайв получают стандартньми способами и белки наружной мембрань в Ссолюбилизируют с использованием солюбилизирующего соединения, такого как детергент. Предпочтительньм солюбилизирущим раствором является раствор около 1,2595 октилглюкопиранозида (м/об) (05). Другим (Ф, предпочтительньм солюбилизирующим раствором является раствор, содержащий около 1,2595 саркозил. ка Полипептид ОМРІ06 находится в солюбилизированной фракции. Клеточнье остатки и нерастворимьй материал в зтом зкстракте отделяют и удаляют предпочтительно центрифугированием. Полипептидь! в бо Зкстракте концентрируют, инкубируют в буфере Лзммли для проб для содержащего ДСН геля при 1007С в течение 5 минут и затем фракционируют при помощи злектрофореза в бо денатурирующем содержащем додецилсульфат натрия (ДСН) полиакриламидном (ПААГ), геле без восстанавливающего агента. См. І аеттії, 1970, Майте 227:680-685. Полоса или фракция, идентифицированная как полипептид ОМР106, как описано вьіше (например, окрашенная серебром полипептидная полоса, которая присутствует в Об- или саркозильном 65 Зкстракте НА, но не в зкстракте соответствующего МНА культвара или в зкстракте НА культивара после гидролиза протеазой, которьій уничтожает гемагглютинирующую активность) может бьть затем вьіделена непосредственно из зтой фракции или кусочка геля, содержащего полипептид ОМР106. В предпочтительном варианте, полипептид ОМР106 имеет среднюю молекулярную массу 190кДа, как определено сравнением его расстояния или скорости миграции в денатурирующем 505-РАСЕ относительно расстояния или скорости Миграции миозина скелетньїх мьішц кролика (200кДа) и В-галактозидазь Е.соїї (116кДа).
Другим способом очистки полипептида ОМР106 является аффинная хроматография с использованием антител против ОМРІ106 (см. Раздел 5.5). Предпочтительно, используют моноклональнье антитела против
ОМРІ06. Зти антитела ковалентно связьівают с агарозньмми гелями, активированньми цианогенбромидом или сложньми зфирами сукцинамида (Апйі-Сеї, ВіоКайд, Іпс.), или другими способами, известньми специалистам в 7/0 данной области. Белковьій зкстракт нагружают на верхнюю часть геля, как описано вьіше. Зто контактирование проводят в течение периода времени и при стандартньїх условиях реакции, достаточньїх для связьнвания полипептида ОМРІТО0б6 с антителом. Предпочтительно твердьй носитель представляет собой материал, используемьй в хроматографической колонке. Затем полипептид ОМР106 удаляют из антитела, что позволяет извлечь полипептид ОМР106 в вьіделенном или, предпочтительно, очищенном виде.
Производньій от ОМРІТО0б6 полипептид данного изобретения может бьть получен химическим и/или ферментативньм расщеплением или деградацией вьіделенного или очищенного полипептида ОМРІ1І06.
Производньій от ОМРІ106 полипептид может бьть также химически синтезирован на основе известной аминокислотной последовательности полипептида ОМРІ10Об и, в случае химерного полипептида, аминокислотньїх последовательностей гетерологичного полипептида, способами, хорошо известньіми в данной области. См., например, Стгеідпіоп, 1983, Ргоїеіпе: Зігисійгез апа Моїесшіаг Ргіпсіріез, МУ.Н. Егеетап апа Со., МУ.
Производньій от ОМРІТОб полипептид может бьть также получен в генной зкспрессионной системе, зкспрессирующей рекомбинантную нуклеотидную конструкцию, содержащую последовательности, кодирующие производнье от ОМР106 полипептидьї. Нуклеотиднье последовательности, кодирующие полипептидь! данного изобретения, могут бьіть синтезировань! и/или клонированьі и зкспреесировань! в соответствии со способами, с об Хорошо известньми специалистам в данной области. См., например, ЗатрбгооК еї аі., МоїІесшаг Сіопіпд: А
Ї арогаюгу Мапиаї, Моїв, 1-3, Соїд Зргіпд Нагброг І арогагу Ргезв, МУ, Спаріег 9. (8)
Производнье от ОМР106 полипептидьі данного изобретения могут бьіть фракционированьі и очищень с применением стандартньїх способов очистки белков, модифицированньїх и примененньїх в соответствии с приведенньїми здесь откритиями и описаниями. В частности, предпочтительнье полипептидьі ОМРІОб данного су зо изобретения/ те, которне образуют зпитоп наружной поверхности нативного полипептида ОМР106, могут бьіть вьіделеньі и очищень! в соответствий с аффинньми способами, описанньми вьіше для вьіделения и очистки і, полипептида ОМР106 (например, аффинной очисткой с использованием антител против ОМР 106). с
Если желательно, полипептидь! данного изобретения могут бьіть очищеньі! дополнительно с применением стандартньїх способов очистки белков или опептидов, в том числе (но не только) злектрофореза, со з5 Чентрифугирования, гель-фильтрации, преципитации, диализа, хроматографии (в том числе ионообменной со хроматографии, аффинной хроматографии, иммуноадсорбентной аффинной хроматографии, жидкостной хроматографийи вьісокого разрешения с обращенной фазой и гель-проникающей жидкостной хроматографийи вьісокого разрешения), изозлектрического фокусирования и их вариаций и комбинаций.
Один или онесколько из озтих оспособов могут бьть примененьй последовательно в процедуре, « предназначенной для разделения молекул в соответствий с их офизическими или химическими в с характеристиками. Зти характеристики включают гидрофобность, заряд, связьвающую способность и
Й молекулярную массу белка. Различнье фракции веществ, полученнье после каждого способа, тестируют на их и?» способности связьувать рецептор или лиганд ОМР106 или препятствовать гемагглютинации, вьізьіваемой НА клетками М.саїйагтпаїїв ("тест" - активности). Затем фракции, обнаруживающие такую активность, подвергают спедующему способу в последовательной процедуре, и новье фракции снова тестируют. Зтот процесс б повторяют до тех пор, пока не остается только одна фракция, имеющая вьішеописаннье "темст"-активности, и зта фракция дает только единственную полосу или молекулярную частицу при злектрофорезе в со поли-акриламидном геле или хроматографии. 2) 5.5. Иммуногеньї ОМР106 и антитела против ОМР106
Данное изобретение обеспечиваєт антитела, которне специфически связьвают полипептид ОМР106 или о производнье от ОМРІТ0б6 полипептидь. Для получения таких антител вьіделеннье или предпочтительно
Ге очищеннье препарать! полипептида ОМР106 или производньїх от ОМР106 полипептидов используют в качеству иммуногенов.
В одном варианте полипептид ОМР106 отделяют от других белков наружной мембрань, присутствующих в бв о Об- или саркозильном зкстракте наружной мембраньй НА клеток или везикулов М.сайагтнаїї5, при помощи
ЗО5-РАСЕ (См. Раздел 5.2. вьіше) и срезьі геля, содержащие полипептид ОМР106, используют в качестве (Ф, иммуногена и иньецируют в кролика для получения антисьівороток, содержащих поликлональнье антитела ка против ОМР106. Тот же самьій иммуноген может бьіть использован для иммунизации мьішей для получения гибридомньїх линий, продуцирующих моноклональнье антитела против ОМРІ06. В конкретньїх вариантах бо ломтик ПААГ, содержащий вьіделенньій или очищенньй ОМР106 из любого из штаммов АТСС 49143, АТСС 25238, АТСС 25240, АТОСС 43617, АТСС 43618, АТСС 43627 и АТСС 43628, используют в качестве иммуногена.
В предпочтительньїх вариантах, в качестве иммуногена используют вьірезанньй ломтик ПААГ, содержащий ввіделенньій или очищенньій ОМР106 из НА культивара зтих штаммов. В более предпочтительном варианте, в качестве иммуногена используют ломтик ПААГ, содержащий вьіделенньій или очищенньй ОМРІ106 из НА 65 Культивара штамма АТСС 49143.
В других вариантах в качестве иммуногенов используют пептиднье фрагментьї полипептида ОМР106.
Предпочтительно, используют пептидньіе фрагментьї очищенного полипептида ОМР106. Пептидь! могут бьїть полученьії протеазньім гидролизом, химическим расщеплением вьіделенного или очищенного полипептида
ОМРІОб6 или химическим синтезом и затем могут бьїть вьіделеньь или очищеньі. Такие вьіделеннье или Очищеннье пептидь! могут бьїть использованьії непосредственно в качестве иммуногенов. В специфических вариантах, применимье пептиднье фрагментьі включают (но не ограничиваются ими) последовательность
ІСВІЗЕАДОСОКОСАМАКОСОКВІАІСОІАОАІ ЗБОЗІАІСОМКІМ (ЗЕО ІО М 10 или любую ее часть длиной 6 или более аминокислот. В другом варианте пептидньій фрагмент имеет последовательность СТМІ СОКК (ЗЕО ІО М 2).
Применимье иммуногеньі могут также содержать такие пептидьі или пептиднье фрагменть, 7/0 Коньюгированнье с молекулой-носителем, предпочтительно белком-носителем. Белки-носители могут бьть любьми обьічно используемьми в иммунологии белками-носителями, и включают (но не ограничиваются ими) бьічий сьівороточньій альбумин (БСА) , куриньій альбумин, гемоцианин фиссурелль (КІН) и т.п. В отношений обсуждения коньюгатов гаптен-белок см., например, Нагпіом/ еї аї., Апіїбодіев: А І арогаїогу Мапиаї, Соїй
Зргіпуд Нагбог І арогаїогу Ргезв, Соїд Зргіпд Нагрог, МУ, 1988, или стандартньій учебник по иммунологии, такой /5 Как Коїнй, І. Ебаі., ІММОМОГОСУ, С.М. Мозбру Со., ЗІ. Гоців, МО (1985), или Кіеїп, у., ІММОМОГОСУ, Віаскмуеї!
Зсіепійіс Рибіїсабопв, Іпс., Сатьгідде, МА (1990).
Еще в одном варианте, для получения антител, которне специфически связьвают один или несколько зпитопов нативного полипептида ОМР106, в качестве иммуногена используют интактнье НА клетки М.сайагтнаїв или везикуль!, полученнье из них. Зти клетки или везикульі могут бьіть фиксировань! такими агентами, как формальдегид или глутаровьій альдегид, перед иммунизацией. См. Напіом/ еї аї., Апіїродіев: А І арогайгу
Мапааї, Соїа Зргіпд Нагбог І арогаїгу Ргезв, Соїд Зргіпд Нагрог, МУ, 1988, Спаріег 15. Предпочтительно, такие анти-цельноклеточнье антитела являются моноклональньми антителами. Гибридомнье линии, продуцирующие желательнье моноклональнье антитела, могут бьть идентифицированьй с применением очищенного полипептида ОМР106 в качестве скринирующего лиганда. Клетки или везикульі любого штамма М.саїйагтпаїв, в сч ов том числе (но не только) АТСС 49143, АТСС 25238, АТСС 25240, АТСС 43617, АТСС 43618, АТСС 43627 и АТОС 43628, используют в качестве иммуногена для индуцирования зтих антител. Предпочтительно, используют в і) качестве иммуногена клетки или везикуль! НА культивара таких штаммов. Более предпочтительно, в качестве иммуногена для индуцирования зтих антител используют клетки или везикульї НА культивара штамма АТОоС 49143. с зо Поликлональнье антитела, продуцируемье при иммунизации цельмми клетками или везикулами, содержат антитела, которне связьивают другие белки наружной мембрань! М.сайагтнаїїз (-"антитела не против ОМР106") и, о следовательно, являются более трудньіми для использования, когда известно или предполагается, что проба со содержит другие белки наружной мембрань! М.сайагтнаїїз или вещества, которне перекрестно реагируют с зтими другими белками наружной мембрань. В зтих обстоятельствах любое связьшвание анти-цельноклеточньіми со
Зз5 антителами данной пробьі или полосьї должно подтверждаться соответствующим связьиванием той же самой со пробьї или полосьї антителами, которне специфически связьівают полипептид ОМР106 (например, антителами против ОМР106) и/или произведенньій из ОМР106 полипептид, или конкурентньіми тестами с использованием антител против ОМРІ106, полипептида ОМРІ106 или произведенньїх из ОМР10Об полипептидов в качестве конкурента (т.е. добавление антител против ОМР106, полипептида ОМР106 или произведенного из ОМР1О6 « полипептида к реакционной смеси снижаєт или устраняет связьшание пробьі с анти-цельноклеточньми в с антителами). Альтернативно, такие поликлональнье антиськворотки, содержащие антитела "не против
ОМРІ06", могут бьіть очищень от таких антител стандартньіми подходами и способами. Например, антитела "не ;» против СМР 106» могут бьіть удаленьї преципитацией с клетками МНА культиваров
М.саїагтнайв или штаммов М.саїйагтнпаїї5, о которьїх известно, что они не имеют полипептида ОМР106 (например, АТСС 8176, более предпочтительно МНА культивара АТСС 49143); или адсорбцией на колонках, б содержащих такие клетки или белки наружной мембрань! таких клеток.
В других вариантах, применимье иммуногень! для индуцирования антител данного изобретения включают со смеси двух или более из любьїх вьішеупомянутьїх индивидуальньїх иммуногенов. оо Иммунизацию млекопитающих описанньми здесь иммуногенами, предпочтительно людей, кроликов, крьс, Мьшей, овец, коз, коров или лошадей, проводят согласно процедурам, хорошо известньім специалистам в о данной области, для получения антисьівороток, содержащих поликлональнье антитела или гибридомньх
Із линий, секретирующих моноклональнье антитела.
Моноклональнье антитела могут бьіть полученьі! стандартньми способами, с учетом содержащегося здесь описания. Такие способьі! описаньії, например, ьі 0.5. Раїепі М 4 271 145 и ).85. Раїепі М 4 196 265. Вкратце, 5Б Животное иммунизируют иммуногеном. Гибридомь! получают слиянием клеток селезенки из иммунизированного животного с миеломньми клетками. Продуктьї слияния подвергают скринингу на клетки, продуцирующие (Ф, антитела, которье связьиваются с зтим иммуногеном. Позитивнье гибридомнье клонь! вьіделяют, и из зтих ка клонов вьіделяют моноклональньсе антитела.
Схемь! иммунизации для получения как поликлональньх, так и моноклональньїх антител хорошо известнь! в бо данной области. Иммуноген можно иньецировать любьм из ряда путей, в том числе, подкожньім, внутривенньм, внутрибрюшинньм, интрадермальнь/м, внутримьшечньїм, через слизистую оболочку или сочетанием зтих путей введения. Иммуноген может бьть иньецирован в растворенном виде, в форме агрегата, присоединенньім к физическому носителю или смешанньім с адьювантом при помощи способов и материалов, хорошо известньх в данной области. 65 Согласно данному изобретению, полипептидьї ОМР106 штаммов М.саїагтаїї5, НА или МНА, являются иммуно-перекрестно-реактивньїми. Так, антитела, индуцированнье полипептидом ОМР106 одного штамма или культивара М.саїйагтттпарйв, специфически связьвают полипептид ОМРІОб и производнье от ОМРІ1О06 полипептидьі других штаммов и культиваров М.саїйагтпаїйв. Например, поликлональнье антитела против
ОМРІ06, индуцированнье полипептидом ОМР106 штамма АТСС 49143, специфически связьшвают не только гомологичньЬІй полипептид ОМРІ106 (те. полипептид ОМР106 штамма АТСС 49143), но также полипептид
ОМРІ06 и/или производнье от ОМР106 полипептидь! других штаммов М.сайагтнаїйв, в том числе, но не только,
АТСС 43628, АТСС 43627, АТСС 43618, АТСС 43617, АТСС 25240 И АТСС 25238.
Антитела данного изобретения, в том числе (но не только) антитела против ОМРІ106, могут бьть использованьі для облегчения вьіделения и очистки полипептида ОМРІ106 и производньїх от ОМР106 7/0 полипептидов. Зти антитела могут бьіть также использовань! в качестве зондов для идентификации клонов в зкспрессионньїх библиотеках, имеющих инсерции, кодирующие полипептид ОМР106 или его фрагменть!. Зти антитела могут бьїть также использованьії в иммуно-тестах (например, ЕПІЗА, РИА, Вестерн-блоттинге) для специфического обнаружения и/или количественного определения М.саїйагтнаїйз в биологических образцах.
Антитела против ОМР106 данного изобретения специфически связьівают полипептид ОМР106 и не связьівают белки из родственньїх бактериальньїх патогенов, таких как Могахеїйа омів, Могахеїїа Іасипайа, Могахеїйа овіоепзіз, Могахейа бБомів5, Меїіззегіа тепіпоуйіаї, Меіззега допогпоеае. Таким образом, антитела против
ОМРІ06 могут бьїіть использовань! для диагностики инфекций М.саїйагтпаїв.
Антитела данного изобретения, в частности, антитела, которне являются цитотоксическими, могут бьїть также использованьї в пассивной иммунизации для предупреждения или аттенуирования инфекций М.сагагтнаїїв ЖивВоОтнЬьХх, в том числе человека. (В применений здесь, цитотоксическим антителом является антитело, которое усиливает опсонизацию и/или киллинг (убиваниє) комплементом бактерии, связьиваемой зтим антителом).
Зффективная концентрация поликлональньїх или моноклональньїхх антител, виіработанньїх против иммуногенов данного изобретения, может бьіть введена хозяину для достижения таких зффектов. Точная концентрация вводимьїх антител будет меняться в соответствии с каждьм конкретньмм препаратом антител, но она может с бьіть определена при помощи стандартньх способов, хорошо известньїх специалистам в данной области.
Введение зтих антител может вьіполняться при помощи различньїх способов, в том числе, не не только, і) описанньх в Разделе 5.6. для доставки вакцин.
Профилактическая и терапевтическая зффективности антител данного изобретения могут бьіть определень! стандартньми фармацевтическими процедурами на зкспериментальньх животньх. Данньюе, полученнье в су зо Мсследованиях на животньмх, могут бьіть использовань! в приготовлений диапазона доз применимьїх для людей. 5.6. Вакцинь! о
Данное изобретение обеспечиваєт таюке терапевтические и профилактические вакциньі против инфекций (су
М.саїйагтвайв животньїх, в том числе млекопитающих и, более конкретно, грьізунов, приматов и человека.
Предпочтительньмм использованием зтих вакцин является использование для людей. Вакцинь! могут бьть со з5 Пприготовлень способами, известньмми специалистам в данной области, и могут, например, включать антиген в со форме иммуногена, фармацевтически приегмлемьй носитель, возможно, подходящий адьювант и, возможно, другие материальй традиционно применяемье в вакцинах. Иммунологически зффективное количество иммуногена, которое должно бьіть использовано в вакцине, определяют способами, известньми в данной области с учетом приведенного здесь описания. «
Вакцинь! данного изобретения содержат иммунологически зффективное количество любого из иИмМмМуногенов, нта) с описанньх в разделе 5.5., в фармацевтически приемлемом носителе.
Й Согласно другому варианту, вакциньіь данного изобретения содержат иммунологически зффективное и?» количество инактивирозанного или аттенуированного НА культивара М.саїйагтнайв или МНА культивара
М.сайагтнаїйз данного изобретения. Инактивированньій или ат-тенуированньй НА культивар М.саїйагтнаїїв или МНА культивар М.саїйагтаїйв получают с применением любьїх способов, известньїх в данной области, в том б числе, но не только, химической обработкой (например, формалином), тепловой обработкой и облучением.
Термин "иммунологически зффективное количество" используют здесь для обозначения количества, со достаточного для индуцирования иммунного ответа, которьій может предупреждать инфекции М.саїйагтнаїїв или 2) ослаблять тяжесть любой предсуществующей или последующей инфекций М.саїйагтнаїїв. Точная концентрация будет зависеть от конкретного вводимого иммуногена, но может бьіть определена при помощи стандартньх о способов, хорошо известньїх специалистам в данной области, для тестирования развития иммунного ответа.
Ге Применимье полипептиднье иммуногеньі включают вьіделенньій полипептид ОМР106 и производнье от
ОМРІТ06 полипептидь. Предпочтительнье иммуногеньї включают очищенньй полипептид ОМРІ10Об6 и производнье от ОМР106 полипептидьї или пептидьі. Обьединеннье иммуноген и носитель могут находиться в ов ВОодноМ растворе, змульсий или суспензий. В общем, количество полипептидного иммуногена должно находиться между 0,1 и 50Омкг на дозу. Зти носители известньї специалистам в данной области и включают (Ф, стабилизаторьі, разбавители и буферь. Подходящие стабилизаторьі включают углеводьі, такие как сорбит, ка лактоза, маннит, крахмал, сахароза, декстран и глюкоза, и белки, такие как альбумин или казеин. Подходящие разбавители включают солевой раствор, сбалансированньй солевой раствор Хенкса и раствор Рингера. бо Подходящие буферь включают фосфат щелочного металла, карбонат щелочного металла или карбонат щелочно-земельного металла. Вакцина может также содержать один или несколько адьювантов для улучшения или усиления иммунологического ответа. Подходящие адьювантьі включают (но не ограничиваются ими) пептидь), гидроксид алюминия; фосфат алюминия; оксид алюминия; композицию, которая состоит из минерального масла, такого как Магсо! 52, или растительного масла и одного или нескольких змульгаторов, или 65 поверхностно-активньїх веществ, таких как лизолецитин, поликатионь, полианионь; и потенциально применимьїх используемьх для людей адьювантов, таких как ВСО и Согіперасіегішт рагуиціп. Вакцина может также содержать другие иммуногеньі. Такая смешанная вакцина имеет преимущество, заключающееся в том, что иммунитет против нескольких патогенов может бьть получен одним введением. Примерами других иммуногенов являются иммуногень, применяемье в известньїх ассоциированньх коклюшно-дифтерийно-столбнячньїх (АКДС) вакцинах.
Вакцинь! данного изобретения получают способами, известньмми специалистам в данной области, с учетом содержащегося здесь описания. Как правило, иммуноген смешивают с носителем с образованием раствора, суспензии или змульсии. Одна или несколько добавок, рассмотренньхх свьіше, могут находиться в носителе или могут бьіть добавленьі впоследствии. Препарать! вакцин могут бьіть вьісушеньї, например, лиофильно, для 7/0 Челей хранения. В зтом случае они могут бьіть впоследствий воссоздань! в жидкие вакцинь! путем добавления соответствующего жидкого носителя.
Зти вакциньї вводят людям или другим млекопитающим, в том числе грьізунам и приматам, в видеодной или нескольких доз. Вакцинь! могут бьіть введень известньмми способами введения. Могут использоваться многие способь! для введения препаратов вакцин, описанньх здесь. Зти способь! включают (но не ограничиваются ими) /5 Ппероральное, интрадермальноє, внутримьшечноє, внутрибрюшинноє, внутривенноє, подкожное и интраназальное введение. Предпочтительньми способами введения являются внутримьшшечная или подкожная иньекция.
Данное изобретение обеспечиваєт также способ индуцирования иммунного ответа на М.саїйагпаїйв в млекопитающем для защить! зтого млекопитающего против инфекции и/или для ослабления заболевания, Вьізьіваемого М.сагїагтпаїв. Способ предусматриваєт введение иммунологически зффективного количества иммуногенов данного изобретения хозяину и, предпочтительно, введение вакцин данного изобретения хозяйну. 5.7. Нуклеиновне кислотьії, коюдирующие полипептид ОМР106 и производнье от ОМР106 полипептидь!
Данное изобретение обеспечиваєт также нуклеиновье кислотьї, ДНК и РНК, кодирующие полипептид
ОМРІ06 и производнье от ОМР106 полипептидь. В одном аспекте, нуклеийновье кислоть! данного изобретения сч об Могут бьть синтезировань при помощи способов, известньїх в данной области. Конкретно, часть всей аминокислотной последовательности или вся аминокислотная последовательность полипептида ОМР106 или і) производного от ОМР10О6 полипептида может бьть определена при помощи способов, хорошо известньх специалистам в данной области, таких как способ деградации Здмана (см., например, Стгеідпіоп, 1983, Ргоїеіпв:
Зігисійгев апа Моїіесшаг Ргіпсіріев, МУ.Н. Ргеетап апа Со., М.М., рр. 34-49). Полученную амино-кислотную су зр последовательность используют в качестве направляющей для синтеза ДНК, кодирующей полипептид ОМР1О06 или производной от ОМРІ06 полипептид, с использованием общепринятьїх химических подходов или і амплификации при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) перекриівающихся олигонуклеотидов. с
В другом аспекте зта аминокислотная последовательность может бьть использована в качестве направляющей для синтеза смесей олигонуклеотидов, которьіе в свою очередь могут бьіть использовань! для со
Зв Сскрининга на кодирующие последовательности полипептида ОМРІ06 в геномньїх библиотеках М.саїйагтнаїізв. «о
Предпочтительно, ДНК, используемую в качестве источника кодирующей последовательности полипептида
ОМРІ06, как для геномньїх библиотек, так и для ПЦР-амплификации, получают из клеток любого штамма
М.сагатнаїїв, в том числе (но не только) АТСС 49143, АТСС 25238, АТСС 25240, АТСС 43617, АТСС 43618,
АТСС 43627 и АТС 43628. «
При получениий геномньїх библиотек генерируют фрагменть! ДНК, некоторье из которьїх кодируют части ств) с полипептида ОМР106 М.саїагтаїйв или весь полипептид ОМР106 М.саїйагтнаїїв. ДНК может бьіть расщеплена в специфических сайтах различньіми рестриктазами. Альтернативно, можно использовать ДНКазу в присутствий ;» марганца для фрагментирования зтой ДНК или ДНК может бьїть физически разрезана, например, обработкой ультразвуком. Затем фрагменть! ДНК могут бьіть разделень! по размеру стандартньми способами, в том числе (но не только) злектрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле, колоночной хроматографией и б центрифугированием в сахарозном градиенте. Затем фрагментьі ДНК могут бьіть вставленьії в подходящие векторьї, в том числе (но не только) в плазмидьі, космидьі, бактериофаг лямбда или ТТ; и искусственную со хромосому дрожжей (УАС). (См., например, Затьгоок еї аї!., МоіІесціаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиаї, Соїд бргіпад 2) Нагрог І арогайїогу Ргезв, Соїй Зргіпд Нагрог, Мем/ МогК; СіІомег, Ю.М. (ед) , 1985, ОМА Сіопіпд: А Ргасіїса 5о Арргоасп, МК. Ргезв, Ца., Охюга, О.К. Мої. І, 1). Геномная библиотека может бьіть подвергнута скринингу о при помощи гибридизации нуклеийновьїх кислот с меченьм зондом (Вепіоп апа Оаміз, 1977, Зсіепсе 196:180;
Ге Сгип-вівіп апа Нодпезв, 1975, Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА 72:3961).
Геномнье библиотеки могут бьть подвергнутьь скринингу меченьм вьрожденньм олигонуклеотидом, соответствующим аминокислотной последовательности любого пептида полипептида ОМРІ06, с йспользованием оптимальньх подходов, хорошо известньїх в данной области. В специфических вариантах, зондом для скрининга является вьірожденньій олигонуклеотид, которьій соответствует пептиду, имеющему
Ф) последовательность ІСІЗЕАДОСОКОСАМАКОСОКЗІАІВОІАОА БОЗІАІСОМКІМ (ЗЕО ІО М 1) или ее часть. В ка другом варианте зонд для скрининга может бьіть вьірожденньм олигонуклеотидом, которьй соответствует пептиду, имеющему последовательность СТМІ СОКК (ЗЕО ІО М 2). В дополнительном варианте в качестве бр Зонда оиспользуют олигонуклеотидь СОМАСМОТМСТМООМООМААКААК /(ЗЕО І М 3), и
СОМАСМОТМТТКООМООМААКААК (5ЕО ТО М 7), каждьй из которьїх соответствует пептиду ОТМІ СОКК (ЗЕО
ТО М 2). В следующих вариантах в качестве зонда могут бьїть использованьії последовательность
САДОСОБАСОБОБОБААДАООСОБАвССААТОСОСОСОСТОАТАААТССАТТОСТАТТОСТОАСАТТОСОСАА (ЗЕО ТО М 4) или ее фрагменть!. Любой используемьйй зонд имеет длину 15 или более нуклеотидов. 65 Клоньї в библиотеках с ДНК-вставкой, кодирующей полипептид ОМРІТОб или его фрагменть,, будут гибридизоваться с одним или несколькими вьірожденньіми олигонуклеотидньіми зондами. Гибридизацию таких олигонуклеотидньїх зондов с геномньіми библиотеками проводят при помощи способов, хорошо -известньх в данной области. Например, гибридизацию с двумя вьішеупомянутьїми олигонуклеотидньіми зондами можно проводить в 2-х З5С, 1,096 ДСН при 507"С и промьівку можно проводить при тех же самьх условиях. В Конкретном варианте, последовательность ДНК АТСС 49143, кодирующая весь полипептид ОМР106 или его часть, является рестрикционньім фрагментом Ніпаїй! длиной около 8000п.н. или рестрикционньім фрагментом
Ога! длиной около 4200п.н.
Еще в одном аспекте, клоньії нуклеотидньїх последовательностей, кодирующих часть полипептида ОМР1О06 или цельій полипептид ОМР106 или произведеннье из ОМР106 полипептидьі, могут бьїть также получень 7/0 бкринингом зкспрессионньйх библиотек М.саїйагтпарйв. Например, ДНК М.саїагтпаїйв вьіделяют и получают случайнье фрагменть! и лигируют их в зкспрессирующий вектор (например, бактериофаг, плазмиду, фагмиду или космиду), так что вставленная последовательность в векторе способна зкспрессироваться клеткой-хозяином, в которую затем вводят зтот вектор. Затем могут бьїть использованьі различнье тесть скрининга для отбора на зкспрессированьй полипептид ОМР106 или производнье от ОМР106 полипептидь. В /5 одном варианте могут бьїть использованьії различнье антитела против ОМРІ106 (см. Раздел 5.5) для идентификации желательньїх клонов с использованием способов, известньїх в данной области. См., например,
Напом апа Іапе, 1988, Апіїродіев: А І арогаїогу Мапиа), Соїй Зргіпд Нагрог І арогаїогу Ргезв, Соїд Зргіпд
Нагрог, МУ, Аррепаїх ІМ. Клоньй и фаги из библиотеки приводят в контакт с зтими антителами для идентификации клонов, которье связьівают антитела.
В одном варианте колоний или бляшки, содержащие ДНК, которая кодирует полипептид ОМР106 или производньій от ОМР106 полипептид, могли бьї детектироваться с использованием гранул ЮОММА согласно
Оівміск еї аї., 294А ІСААС, Ноивіоп, Тех. 1989, включенньїх здесь в качестве ссьілки. Антитела против ОМР10О6 сшивают с тозилированньми гранулами ЮОММА Веадз М280, и зти содержащие антитела грануль! могут бьїть затем использованьь для адсорбции колоний или бляшек, зкспрессирующих полипептид ОМРІ106 или сч производньій из ОМРІТО0б6 полипептид. Колоний или бляшки, зкспрессирующие полипептид ОМРІ106 или производньій от ОМР106 полипептид, идентифицируют как любьсе из тех, которне связьввают зти грануль!. і)
Альтернативно, антитела против ОМР106 могут бьїть неспецифически иммобилизованьії на подходящем носителе, таком как диоксид кремния или смола Сеїйетм, Затем зтот материал может бьіть использован для адсорбции бактериальньх колоний, зкспрессирующих полипептид ОМРІТОб или производньій от ОМРІОб су полипептид, как описано в предьідущем абзаце.
В другом аспекте, ПЦР-амплификация может бьіть использована для получения по существу чистой ДНК, і. кодирующей часть полипептида ОМРІ10О6 или цельій полипептид ОМРІ106, из геномной ДНК М.саїагтаїї»в. В со качестве праймеров могут бьть использованьь олигонуклеотиднье праймерь, вьрожденнье или инье, соответствующие известньм последовательностям полипептида ОМРІ06. В специфических вариантах, со
Зз5 Оолигонуклеотид, вьрожденньй или иной, кодирующий пептид «о
ІСВІЗЕАДОСОКОСАМАКОСОКВІАІВОІАОАІ ЗБОЗВІАІСОМКІМ (ЗЕБЕО ІО М 1) или любую его часть, может бьть использован в качестве 5'і-праймера. Например, 5'і-праймер может бьіть нуклеотидной последовательностью
САДОСОБАСОБОБОБААДАООСОБАвССААТОСОСОСОСТОАТАААТССАТТОСТАТТОСТОАСАТТОСОСАА (ЗЕО ІЮО М 4) или любой ее частью. Нуклеотиднье последовательности, вьірожденнье или инье, которье « являются обращенньми комплементарньми последовательности, коюдирующей ЗТМІ ЗОКК (ЗЕО ІО М2), могут й с бьіть использовань! в качестве 3'--праймера. Например, олигонуклеотид, виірожденньй или иной, которьій имеет й вьрожденную олигонуклеотидную последовательность УТ ТТМССМССМАСМАСМОТМОСС (5ЕБЕО ІЮО М 6) или «» УТТУТТМССМССУААМАСМОТМСС (ЗЕО ІО М 8), может бьіть использован в качестве 3-праймера в сочетаний с различньіми 5'-праймерами, рассмотренньїми вьіше.
ПЦР может проводиться, например, с использованием термоблока Регкіп-ЕІтег Сейиз (пепгта! сусіег и б полимеразьї Тад (Сепе Атрім). Можно синтезировать несколько различньїх вьірожденньїх праймеров для применения в ПЦР-реакциях. Можно также менять условия строгости гибридизации, используемье в
Ме праймирований ПЦР-реакций, для создания возможности большей или меньшей степеней сходства 9) нуклеотидной последовательности между вьірожденньми праймерами и соответствующими последовательностями в ДНК М.саїйагтпайв. После успешной амплификации сегмента последовательности,
Мамі кодирующей полипептид ОМРІ106, зтот сегмент может бьть молекулярно клонирован и секвенирован и з использован в качестве зонда для вьіделения полного геномного клона. Зто, в свою очередь, позволит определить полную нуклеотидную последовательность гена, анализировать его зкспрессию и получить его белковьіїй продукт для функционального анализа, как описано іпіта.
После вьіделения кодирующей последовательности полипептид ОМР106 из одного штамма или культивара
М.сагагтнаїїв можно использовать тот же подход для вьіделения кодирующих последовательностей полипептид о ОМРІ06 из других штаммов и культиваров М.саїйагтнаїїв. Специалистам в данной области должно бьїть понятно, ко что последовательность ДНК или РНК, кодирующая полипептид ОМРІТОб (или его фрагментьї) данного изобретения, может бьіть использована для получения других последовательностей ДНК или РНК, которье бо гибридизуются с ней при условиях умеренной-вьісокой строгости, с использованием обьічньїх способов, известньїх в данной области. Гибридизация с последовательностью ОМР106 из одного штамма или культивара
М.сагагтнаїїв в условиях вьісокой строгости будет идентифицировать соответствующую последовательность из других штаммов и культиваров. Условия вьісокой строгости меняются в зависимости от длинь! зонда и состава оснований. Формула для определения таких условий хорошо известна в данной области. См. Затрьгоок еї аї., 65 Моїіесціаг Сіопіпд: А ІГарогаїгу Мапиаї, Сої4 Зргіпд Нагрог ІГарогаїгу Ргез5в, МУ, Спаріег 11. В применений здесь, условия гибридизации вьісокой строгости, применяемье к зондам более 300 оснований в длину,
включают конечную промьівку в 0,1х555270,196 ДСН прю 68"С в течение ипо меньшей мере 1 часа (А!йзирБвеї, еї аі!., Едв., 1989, Ситепі РгоїосоЇїв іп Моіесціаг Віоіоду, Мої, Сгеепе Рибіїзпіпд Авззосіацев, Іпс. апа до|п
Ууйеу апа Зопв, Іпс., Мему МогкК, р. 2.10.3). В конкретньїх вариантах, промьївка вьісокой строгости в гибридизации б использованием зонда, имеющего последовательность ЗЕСО ТО М 4 или комплементарную ей последовательность, проводится 2х 55С, 1 95 ДСН при 50"С в течение приблизительно 20-30 минут.
Специалист в данной области должен бьть способен идентифицировать полнье клоньї кодирующей последовательности полипептида ОМРІ106 с применением подходов, хорошо известньїх в данной области.
Протяжение кодирующей последовательности полипептида ОМРІ106, содержащейся в вьіделенном клоне, 7/0 может бьіть определено секвенированием клонированной вставки и сравнением расшифрованного размера полипептида, кодируемого открьїтьїіми рамками считьмшвания (ОКЕ), с размером полипептида ОМР106 и/или сравнением расшифрованной аминокислотной последовательности с последовательностью очищенного полипептида ОМРІ106. Если бьл вьіделен частичньій клон кодирующей последовательности полипептида
ОМРІТ06, полньюе клоньі могут бьть вьіделеньії с использованием вставки частичного клона в качестве гибридизационного зонда. Альтернативно, полная кодирующая последовательность полипептида ОМР106 может бьіть реконструирована из перекрьівающихся частичньїх клонов сплайсингом их вставок вместе.
Полнье клоньії могут бьіть любьми клонами, которне имеют ОКЕ с расшифрованной аминокислотной последовательностью, совпадающей с последовательностью полипептида ОМРІ06б, или, когда полная аминокислотная последовательность последнего недоступна, совпадающей с последовательностью пептидного фрагмента полипептида ОМР106, и имеющей молекулярную массу, соответствующую молекулярной массе полипептида ОМР106. Далее, полнье клоньі могут бьїть идентифицированьі по способности их вставок, при помещений в зкспрессирующий вектор, продуцировать полипептид, которьій связьівает антитела, специфические для амино-конца полипептида ОМРІ06, и антитела, специфические для карбокси-конца полипептида ОМР 106. сч
Последовательности нуклеийновьїх кислоту кодирующие производнье от ОМР106 полипептидь, могут бьіть полученьі способами, хорошо известньми в данной области. В одном аспекте, последовательности, і) кодирующие производнье от ОМРІ0Об6 полипептидь), могут бьть произведеньй из последовательностей, кодирующих полипептид ОМР106, способами рекомбинантньїх ДНК с учетом рассмотренньїх здесь положений.
Например, кодирующая последовательность полипептида ОМРІОб может бьть изменена созданием с зо аминокислотньїх замен, которне не будут влиять на иммуногенность полипептида ОМР106 или которье могут улучшать его иммуногеннодть. Могут бьїть использованьі различнье способь, в том числе (но не только) і, управляемьй олигонуклеотидом, сайт-специфический мутагенез. Зти и другие способьі, известнье в данной со области, могут бьїть использованьі для создания одиночньїх или множественньїх мутаций, таких как замень, инсерции, делеции и транспозиции, описанньсе в Вої-вівіп апа 5погіе, 1985, Зсіепсе 229:1193-1210. со
Далее, ДНК, кодирующая последовательности полипептида ОМР106, может бьіть укорочена расщеплением «о рестриктазой или зкзо-нуклеазой. Гетерологичная кодирующая последовательность может бьіть присоединена к последовательности, кодирующей полипептид ОМР106, лигированием или ПЦР-амплификацией. Кроме того,
ДНК, кодирующая весь производньй от ОМРІТ0Об6 полипептид или его часть, может бьіть синтезирована химически или при помощи ПЦР-амплификации на основе известной или расшифрованной аминокислотной « последовательности полипептида ОМР106 и любьх желательньх изменений в зтой последовательности. в с Идентифицированнье и вьіделеннье ДНК, содержащие последовательность, кодирующую полипептид
ОМРІ106 или производного от ОМР106 полипептида, могут бьіть вставленьі в подходящий клонирующий вектор. ;» Могут бьіть использованьі многочисленнье системь! вектор-хозяин, известнье в данной области. Возможнье векторьї включают, но не ограничиваются ими, плазмидь! или модифицированньсе вирусь, но векторная система должна бьіть совместима с используемой клеткой-хозяином. Такие векторь! включают, но не ограничиваются б ими, бактериофаги, такие как производнье бактериофага лямбда, или плазмидьі, такие как производнье плазмид рВК322 или рис. Встраивание в клонирующий вектор может бьїть, например, вьіполнено лигированием со фрагмента ДНК в клонирующей вектор, имеющий комплементарнье липкие концьІ. Однако, если оо комплементарньсе сайть! рестрикции, используемье для фрагментирования зтой ДНК, не присутствуют в зтом Кклонирующем векторе, концьі зтих молекул ДНК могут бьіть модифицированьі! ферментативно. Альтернативно, о любой желательньй сайт может бьіть произведен лигированием нуклеотидньїх последовательностей (линкеров)
Із на концьі ДНК; зти лигированнье линкерьй могут содержать специфические химически синтезированнье олигонуклеотидьї, кодирующие -последовательности узнавания рестриктаз. В альтернативном способе расщепленная ДНК может бьїть модифицирована присоединением гомополимерного хвоста. Рекомбинантнье ов Молекульь могут бьть введень в клетки-хозяева трансформацией, трансфекцией, инфицированием, злектропорацией и т.д., так что образуются многочисленнье копий зтой генной последовательности. (Ф, В альтернативном способе желательная ДНК, содержащая кодирующую последовательность полипептида ка ОМРІТ06 или производного от ОМРІ106 полипептида, может бьть идентифицирована и вьіделена после введения в подходящий клонирующий вектор способом "дробовика" ("5пої дип"). Обогащение желательной бор последовательностью, например, фракционированием по размеру, может бьіть вьіполнено перед инсерцией в клонирующий вектор.
В специфических вариантах трансформация клеток-хозяев рекомбинантньми молекулами ДНК, которье содержат последовательность, кодирующую полипептид ОМРІТ0О6б и производного от ОМР106 полипептида, делает возможной образование многочисленньїх копий такой кодирующей последовательности. Таким образом, 65 зта кодирующая последовательность может бьть получена в больших количествах путем вьтращивания трансформантов, вьіделения из трансформантов рекомбинантньїх молекул ДНК и, если необходимо,
вьіделением вставленной кодирующей последовательности из вьіделенной рекомбинантной ДНК. 5.8. Рекомбинантное получение полипептида ОМР106 и производного от ОМР106 полипептида
Полипептид ОМР106 и производнье от ОМР106 полипептидьі! данного изобретения могут бьіть получень способами генной инженерии. В зтом случае их получают с применением подходящей клетки-хозяина, которая бьіла трансформирована ДНК, кодирующей зтот полипептид. Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ОМРІ106 или производнье от ОМРІ106 полипептидь), может бьть вставлена в подходящий зкспрессирующий вектор, т.е. вектор, которьій содержит необходимье злементьї для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей полипептид последовательности. Нуклеотиднье последовательности, 7/0 Кодирующие полипептид ОМРІО06 или производнье от ОМР106 полипептидьі, вставляют в зти векторь! таким образом, что они будут зкспрессироваться при подходящих условиях (например, в правильной ориентации и правильной рамке считьивания и с подходящими зкспрессионньми последовательностями, в том числе, связьвающей РНК-полимеразу последовательностью и последовательностью связьнания рибосом).
Многие системь: хозяин-вектор могут бьть использованьь для зкспрессий кодирующей полипептид /5 последовательности. Они включают (но не ограничиваются ми) системь клеток млекопитающих, инфицированньх вирусом (например, вирусом коровьей оспьї, аденовирусом и т.д.); системь! клеток насекомьх, инфицированньїх вирусом (например, бакуловирусом) ; микроорганизмь), такие как дрожжи, содержащие векторьі дрожжей, или бактерии, трансформированнье ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной
ДНК. Предпочтительно, клетка-хозяин является бактерией и, найболее предпочтительно, зта бактерия 2о представляет собой Е.соїї, В.Б или ЗаІтопег а.
Злементь! зкспрессии векторов различаются по их длине и специфичности. В зависимости от используемой системь! хозяин-вектор может бьть использован любой из ряда подходящих злементов транскрипции и трансляции. В характерном варианте зкспрессируется химерньй белок, содержащий последовательность полипептида ОМР106 или его производного и пре- и/или про-последовательность клетки-хозяина. В других сч г5 Ххарактерньїх вариантах, зкспрессируется химерньй белок, содержащий последовательность полипептида
ОМРІ06 или производного от ОМР106 полипептида и пептида для аффинной очистки. В других специфических і) вариантах, зкспрессируется химерньій белок, содержащий последовательность полипептида ОМР106 или его производного и ценного иммуногенного пептида или полипептида. В предпочтительньїх вариантах, зкспрессируемьій производньй от ОМРІ106 полипептид содержит последовательность, образующую либо с
Зо ЗпитОоп наружной поверхности, либо рецептор-связьівающий домен нативного полипептида ОМР 106.
Любой способ, известньй в данной области, для встрайвания фрагментов ДНК в вектор может бьть і использован для конструирования зкспрессирующих векторов, содержащих химерньій ген, состоящий из со подходящих регуляторньїх сигналов транскрипции/трансляции и кодирующих полипептид последовательностей.
Зти способьі могут включать способь іп мійго рекомбинантньх ДНК и синтетические способь и іп мімо со рекомбинанть! (генетическую рекомбинацию). Зкспрессия последовательности нуклеийновой кислоть, со кодирующей полипептид ОМР106 или произведенньй из ОМР106 полипептид, может регулироваться другой последовательностью нуклеийновой кислотьі таким образом, что введенная последовательность зкспрессируется в хозяине, трансформированном рекомбинантной молекулой ДНК. Например, зкспрессия вставленной последовательности может регулироваться любьм промоторньім/знхансерньм злементом, « 0 известньм в данной области. Промоторь), которье могут бьїть использованьі для регуляции зкспрессий в с вставленньїх последовательностей, включают (но не ограничиваются ими) район раннего промотора ЗМ40 (Вегпоївї апа Спатброп, 1981, Маїшйге 290:304-310), промотор, содержащийся в 3-длинном концевом повторе ;» вируса саркомьі Рауса (Уататоїо еї аїЇ., 1980, СеїІЇ 22:787-797), промотор тимидинкиназьії вируса герпеса (УУадпег еї аїЇ., 1981, Ргос. Ман.Асай.Зсі. ОБА 78:1441-14 45), регуляторнье последовательности гена Металлотионеина (Вгіпвіег еї аї., 1982, Маїшге 296:39-42) для зкспрессии в животньїх клетках; промоторь
Ге» В-лактамазь! (МіПа-Катагоїї еї аіЇ., 1978, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 75:3727-3731), ас (ОеВоег еї аї., 1983,
Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 80:21-25), ХРу, или ігс для зкспрессии в бактериальньїх клетках (см. также "Оветці бо ргоївіпе їйот гесотріпапі расієегіа" іп Зсіепійс Атегісап, 1980, 242:74-943; промоторньій район
Ге) нопалинсинтазь! или промотор 355 РНК вируса мозайики цветной капусть (Сагапег еї 901., 1981, Мисі.Асід5 Кез. 9:2871), м промотор фотосинтетического фермента рибулозобисфосфаткарбоксилазь! (Уеїгтега-ЕзігеМа еї аї., о 1984, Маїшге 310:115-120) для зкспрессии в клетках растений; промоторнье злементь! из дрожжей или других з грибов, такие как промотор Са1!4, опромотор АС (алкогольдегидрогеназь), промотор РОК (фосфоглицерокиназьї!), промотор щелочной фосфатази.
Зкспрессирующие векторьї, содержащие последовательности, кодирующие полипептид ОМРІ10б6 или 5в производного от ОМРІТОб6 полипептида, могут бьіть идентифицировань тремя основньіми подходами: (а) гибридизацией нуклеиновьїх кислот, (Б) присутствием или отсутствием функций "маркерного" гена и (с) іФ) зкспрессией вставленньїх последовательностей. В первом подходе, присутствие чужеродного гена, ко вставленного в зкспрессирующий вектор, может бьть обнаружено гибридизацией нуклеиновьх кислот с использованием //зондов, содержащих последовательности, которве // гомологичнь вставленной бо последовательности, кодирующей полипептид ОМР106 или производньій от ОМР106 полипептид. Во втором подходе, система рекомбинантньій вектор/хозялин может бьїть идентифицирована и отобрана на оснований присутствия или отсутствия функций определенного "маркерного" гена (например, активности тимидинкиназь, устойчивости к антибиотикам, трансформированного фенотипа, образования тел включения в бакуловирусе и т.д.), обусловленньїх вставлением чужеродньх генов в вектор. Например, если последовательность, 65 Кодирующая полипептид ОМРІТОб или его производного вставлена в последовательность маркерного гена вектора, рекомбинанть, содержащие зту вставку, могут бьіть идентифицировань по отсутствию функции маркерного гена. В третьем подходе, рекомбинантнье зкспрессирующие векторь могут /бьїть идентифицированьії анализом продукта чужеродного гена, зкспрессируемого рекомбинантом. Такие анализь могут бьіть основаньії, например, на физических или функциональньїх свойствах полипептида ОМР106 или его производного в системах анализа іп міго, например, на связьіваний с лигандом или рецептором ОМР106 или на связьвании с антителами против ОМР1ІТ0б6 данного изобретения, или на способности клетки-хозяина к гемагглютинации или на способности клеточного зкстракта препятствовать гемагглютинации, вьізьь'ваемой
М.сагатнаїів,
После идентификации и вьіделения молекульї рекомбинантной ДНК для ее размножения могут бьть 7/0 Мспользовань! несколько способов, известньїх в данной области. После установления подходящей системь хозяина и условий вьіращивания, рекомбинантнье зкспрессирующие векторь! могут бьть размножень! и полученьї в больших количествах. Как обьяснялось вьіше, зкспрессирующие векторьі, которье могут бьть использовань, включают (но не ограничиваются ими) следующие векторь или их производньсе: вирусь человека или животньїх, такие как вирус коровьей оспьі или аденовирус; вирусьі насекомьх, такие как /5 бакуловирус; вирусьі дрожжей; векторьі-бактериофаги (например, лямбда) и плазмиднье и космиднье
ДНК-векторьї, назьіваемьсе в качестве нескольких примеров из большого числа возможньмх векторов.
Кроме того, может бьть вьібран штамм клетки-хозяина, которьій модулирует зкспрессию вставленной последовательности или модифицирует и процессирует продукт гена специфическим желательньм образом.
Зкспрессия от определенньх промоторов может бьіть повьішена в присутствий определенньїх индукторов; 2о таким образом, зкспрессия генетически сконструированного полипептида ОМР106 или его производного может бьїть регулируемой. Кроме того, различньюе клетки-хозяева имеют характернье и специфические механизмь! трансляционного и пост-трансляционного процессинга и модификации белков. Могут бьть виьібрань подходящие клеточнье линии или системь! хозяев для обеспечения желательньхх модификации и процессинга зкспрессируемого чужеродного белка. с 5.9. Реагенть
Полипептидьі, пептидьї, антитела и нуклейновье кислотьі данного изобретения применимь! в качестве і) реагентов для клинической и медицинской диагностики инфекций М.саїйагтнаїйв и для исследований свойств патогенности, вирулентности и инфекционности М.сагагтнаїї5, а также защитньїх механизмов хозяина. Например,
ДНК и РНК данного изобретения может бьіть использована в качестве зондов для идентификации присутствия с
М.саїатнаї» в биологических образцах посредством гибридизации или ПЦР-амплификации. Зта ДНК или РНК может бьїть также использована для идентификации других бактерий, которье могут кодировать полипептид, і, родственньій ОМР106 М.сагагтнаїів. с
Полипептидь и пептидь! данного изобретения могут бьіть использованьі для получения поликлональньх и моноклональньх антител, которье могут бьіть использовань! для дальнейшей очистки композиций, содержащих со з5 полипептидь! данного изобретения, аффинной хроматографией. Зти полипептидь! и пептидь! могут бьіть также (9 использовань в стандартньїх иммунотестах для скрининга на присутствие антител к М.сайагтнаїїз в пробе.
Должно бьїть понятно, что применение положений данного изобретения к конкретной проблеме или конкретньім обстоятельствам также будет в рамках способностей специалиста с обьічной квалификацией в данной области в свете содержащихся здесь описаний. В следующем далее примере приведеньі примерь! « продуктов данного изобретения и способов их получения и использования. в с 6. Пример: вьіделение и характеристика полипептида ОМР106 и гена, кодирующего его, из штамма АТСС 49143 или из других штаммов ;» 6.1. Материал и способь 6.1.1. Тест гемагглютинации
Гемагглютинацию, вьізьшаемую М.саїагтнайв, тестировали, как описанобоїо-Негпапде2 еї аї.,
Ге» (9.Сііп.Місгобіо!ї. 27:903-908), за исключением того, что в тесте с реакцией агг'лютинации на предметном стекле вместо 395 использовали 595 (об/0б) зритроцить. Мсходнье тестьь гемаглютинации вьіполняли с со использованием 2Омкг бактериальньх клеток (сьірой вес). Поскольку штамм 49143 М.саїйагтнаїї5, виращиваемьй оо на чашках с кровяньмм агаром, давал сильную реакцию гемаггллютинации, он бьл отобран в качестве 5ор бравнительного штамма. Серийное разведение штамма АТСС 49143 в разведениях 1:2 приводило к о снижающимся реакциям гемагглютинации. Оценки в баллах от ї--- до жк били основаньї на гемагглютинации,
Ге наблюдаемой с использованием штамма АТСС 49143, после серийньїх разведений 1:2, таким, образом, что реакция «т бьіла при использований 1/4 числа клеток, необходимого для достижения реакции жк. 6.1.2. Ингибирование гемагглютинации
Суспензию клеток М.саїагтпаїйв 49143 серийно разводили 1:2 и разведение, которое давало реакцию гемагглютинации ж при 7мкл забуференного фосфатом солевого раствора Дульбекко и 7мкл 595 (об/об) о О"-зритроцитов человека, использовали для анализа ингибирования гемагглютинации простьми сахарами и ко производньми Сахаров . Для определения, могут ли простье сахара и производнье сахаров ингибировать гемагглютинацию, вьізьваемую М.сагйагтнаїїв, 7/мкл конкретного сахара при 500ММ смешивали с 7/мкл клеток бо М.сайдатнаїїз и инкубировали в течение 5 минут, чтобь! позволить сахару взаймодействовать с клетками. Затем добавляли 7мкл 595 (об/об) 0"-зритроцитов человека и гемагглютинацию оценивали в баллах после 1 минути.
Каждьй сахар и каждое производное сахара тестировали на способность ингибировать гемаггллютинацию.
Затем исходньій раствор каждого сахара и производного сахара серийно разводили 1:2 и зти разведения тестировали на их способность ингибировать гемагг'лютинацию при помощи описанной вьіше процедурь!. Таким 65 образом определяли минимальную концентрацию углевода, необходимую для ингибирования гемаглютинации. 6.1.3. Связьівание лиганда и рецептора
Связьшвание М.сайатнайв с о гликолипидньмми рецепторами клеток животного исследовали фракционированием при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ) гликолипидов клетки-хозяина и покрьїтия хроматограммь! меченьми клетками согласно процедурам, описанньм Мадпапі еї аї., 1982, 9.ВіоЇї. Спет. 257:14365-14369. Вкратце, гликолипидьії, полученнье из Маїгеуа Іпс. (Ріегазапі Сар, РА), разделяли на пластинках для тонкослойной хроматографиий вьісокого разрешения (НРТІ С) в смеси хлороформ:метанол:вода (Б:4:1). Пластинки либо окрашивали орсином при 1002С, либо покрьшвали 129І-меченьми пузьірьками
М.сагагтнаїїв, приготовленньіми, как описано ранее (Мигрпу апа Іоебр, 1989, Місгобіа! Раїйодеп. 6:159-174) при гіс(Об имп/мин. на мл в течение 2 чавов. Затем пластинки промьшвали 5 раз, сушили и зкспонировали на 70 рентгеновской пленке. 6.1.4. ОС-Зкстракция ОМР
Штаммь! М.саїйагтнаїїз вьиращивали отдельно при 35"С при 200об/мин, в Тл бульона Мюллера-Хинтона в колбе на 4л. Препарать! белка (ОМР) наружной мембрань! вьіделяли обработкой 5Омг клеток (сьірой вес) 0,67мл 1,2596. н-октил-В-О-глюкопиранозида (т.е. октилглюкозида; 00) в забуференном фосфатом солевом растворе 75 «(РВЗБ) в течение 30 минут при комнатной температуре. Клатки осаждали в микроцентрифуге в течение 5 минут и супернатант использовали в качестве октилглюкозидного зкстракта. Сравнение белковьїх профилей зтих зкстрактов из ряда штаммов М.саїйагтайв с зкстрактами пузьірьков (т.е. везикульь наружной мембрань)), вьіделенньїх дифференциальньм центрифугированием, которье являются в сильной степени обогащенньми белками наружной мембраньі (ОМР) из М.саїйагтнаїїз (Мигрпу апа І оер, 1989, Місгоріа! Раїйодеп. 6:159-174), показьвает, что октилглюкозиднье зкстрактьі содержат преимущественно белки наружной мембрань
М.саїйагтнаїїз (Фиг.1). Зто свидетельствовало о том, что зкстракция октилглюкозидом обеспечила более бьіструю процедуру с более вьісоким входом белков наружной мембрань! в сравнений с белками наружной мембрань, полученньїми из пузнірьков (везикул наружной мембраньї). 6.1.5. Протеолитическое расщепление ОМР10О6 с
БОмг клеток из штамма АТСС 49143 в їмл забуференного фосфатом солевого раствора Дульбекко о расщепляли в течение 1 часа при комнатной температуре следующими протеазами: обработанньм ТІСК химотрипсином (бмг), Протеиназой К (5мг), обработанньім ТРСК трипсином (мг) или протеазой М8 (100
Единиц). Все протеазьі получали из бідта СПетісаїв (ЗІ. Гоців, МО). Сразу же после протеазной обработки клетки промьівали один раз в РВ5 и ресуспендировали в їмл РВ5 и тестировали на гемаггллютинирующую «М активность. Кроме того, обработаннье протеазами бактериальнье клетки зкстрагировали октилглюкозидом, чтобьі белки наружной мембрань! могли бьіть разделеньі для идентификации специфических белков, которьіе со могли бьїть гидролизовань! зтими протеазами; Го) 6.1.6. Негемагглютинирующие культиварь
Обьічно гемаггллютинирующие культурь! М.сайагтаїїв вьиращивают во встряхиваемьх колбах, содержащих со бульон Мюллера-Хинтона, при 35-37"С при 200об/мин, в течение 24-48 часов. Клетки, взятье непосредственно «(о из чашки с кровяньім агаром на среде Мюллера-Хинтона, также зкспрессируют гемагглютинирующий фенотип.
Для отбора на не гемагглютинирующий (МНА) культивар штамм 49143 подвергали серийному пассажу каждье 5 дней в статических культурах, виращиваемьх в бульоне Мюллера-Хинтона при 35"С. При каждом пассаже « инокулят брали только с поверхности бульонной культурьі. При втором пассаже развивался плавающий ковер клеток и зтот ковер клеток использовали в качестве инокулята для последующих культур. Серийное - с культивирование таким образом давало МНА культиварьі АТСС 49143 обьічно после трех пассажей. а 6.1.7. Вьіделение полипептида ОМР10О6 "» Полипептид ОМРІ106 из зкстракта наружньїх мембран М.саїйагтнаїйз АТСС 49143 детектируют (например, окрашиванием серебром или антителами против ОМР106) в денатурирующих гелях только после того, как зтот зкстракт бьіл инкубирован при 100"С в течение 5 минут. Для определения, является ли появление полось (о) ОМРІ06 после инкубирования при 100"С результатом агрегации белков более низкой молекулярной массь! во со время кипячения, или позволяет ли кипячение нормально агрегированному белку входить в гель, непрокипяченньій октилглюкозидньій зкстракт наружньїх мембран АТСС 49143 анализировали на нативном (95) полиакриламидном геле. Специфические участки геля, в том числе непосредственно ниже колодца для пробь, о 50 Ввірезали и кипятили. Затем полученнье пробьї разделяли на денатурирующем полиакриламидном геле и окрашивали содержащим серебро красителем (5іїмег Зіаіп Рішз, Сайаіюд питбрег 161-0449, ВіоКкаай І арогайгієв, що) Кісптопа, СА). Для М-концевого секвенирования октилглюкозидньій зкстракт наружньїх мембран АТСС 49143 смешивали с буфером для проб РАСЕ, содержащим ДСН, и инкубировали в течение 5 минут в кипящей водяной бане. Затем белки разделяли на 1295 ПААГ с ДСН и переносили на мембрану РМОЕ злек-троблоттингом. Затем область мембраньії, содержащую полосу ОМР106, вьірезали для аминоконцевого секвенирования. Ни одна из процедур РАСЕ, использованньїх для вьіделения полипептида ОМР106, не применяла восстанавливающие о агенть! в буферах для проб или для гелей. іме) 6.1.8. Антисьіворотка против ОМР106
Антисьіворотку к ОМР106 получали разделением полипептида ОМР106 из НА культивара АТСС 49143 в 60 денатурирующем содержащем додецилсульфат натрия полиакриламидном геле, как описано ранее (І аттеї, 1970, Маїшцге 227:680-685), и вьурезанием содержащей ОМРІ106 полосьі из зтого геля. Вьірезанную полосу мацерировали и иньецировали в кролика для генерирования антисьшворотки к полипептиду ОМР106. Зту антисьіворотку использовали для ингибирования гемагглютинации, как описано в разделе 6.1.2. зирга, но с применением антисьворотки вместо углевода. Зту антисьшворотку исследовали также на медиируемую 65 комплементом цитотоксическую активность против М.сайатнаїїз, как описано в Разделе 7. 6.1.9. Вестерн-блоть! с антисьівороткой против ОМР 106 М.сагагтнаїїв АТСС 49143, АТСС 43628, АТСС 43627,
АТСС 43618, АТСС 43617, АТСС 25240, АТСС 25238 и АТОСС 8176; М.оміз АТОС 33078; М.Іасипага АТСС 17967;
М.ромів АТСС 10900; М.овіоепзіз АТСС 10973; Меїіззегіа допогіпоеае (клинический изолят) ; и М.тепіпоіаїв
АТОСС 13077 вьіращивали на чашках с шоколадньм агаром в течение 48 часов при 357С в 5956 СО». Клетки удаляли вьіскребанием колоний из поверхности агара при помощи полистироловой петли для посева. Затем клетки солюбилизировали суспендированием ЗОмкг клеток в 150мкл буфера для проб РАСЕ (360мМ Трис-НС1
ІрН8,8), содержащий 495 додецилсульфат натрия и 2095 глицерин) и инкубированием суспензии при 1007С в течение 5 минут. Солюбилизированнье клетки разделяли на 1295 полиакриламидньїх гелях по Лзммли и разделеннье белки злектрофоретически переносили на мембраньі РМОЕ при 1008 в течение 1,5 часов, как 7/0 описано ранее (Тпебаїп еї аї., 1979, Ргос.Май. Асад. Зсі. ОБА 76:4350-4354), за исключением того, что к буферу для переноса добавляли 0,05956 додецилсульфат натрия для облегчения вьіхода белков из геля. Затем мембрань РМОБ предобрабатьвали 25мл забуференного фосфатом солевого раствора Дульбекко, содержащего 0,595 казеин натрия, 0,595 бьмчий сьвороточньй альбумин и 195 козью сьіворотку. Все последующие инкубации проводили с использованием зтого буфера для преодобработки.
Мембрань! РМОЕ инкубировали с 25мл разведения 1:500 пре-иммунной кроличьей сьіворотки или сьіворотки из кролика, иммунизированного полипептидом ОМР106 (как описано вьіше), в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем мембраньь РМОЄ промьввали дваждь буфером (20ММ Трис-буфер |рн7,5), содержащий 150ММ хлорид натрия и 0,0595 Твин-20). Мембраньї РМОЕ инкубировали с 25мл разведения 1:5000 меченого пероксидазой козьего антитела против (ДО кролика (дасквзоп ІттипоКезеагсі І арогайгіез, МУеві Сгоме Репп. 2о Саївіод питрег 111-035-003) в течение З0 минут при комнатной температуре. Затем мембрань РМОЕ промьшвали 4 раза промьівньм буфером и проявляли тетрагидрохлоридом 3,3 - диаминобензидина и пероксидом мочевинь, поставляемьми бідта Спетіса! Со. (51. І оців, МО, саїаіод питбрег О-4418), в течение 4 минут в каждом. 6.1.10. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами против ОМР106 клеточной поверхности сч
М.сайатнаїїз АТСС 49143 вьиращивали в течение ночи при 357"С во встряхиваемой водяной бане в бульоне
Мюллера-Хинтона. Клетки осаждали центрифугированием и затем ресуспендировали в равном обьеме і) модифицированного Дульбекко забуференного фосфатом солевого раствора без кальция или магния (РВБ/МС). 20мкл клеточной суспензий наносили на каждое из 5 чистьїх предметньїх стекол для микроскопа. После отстайвания в течение 10 секунд избьток жидкости удаляли микропипеткой и предметньм стеклам давали с зо Вьісохнуть на воздухе в течение 1 часа. Затем стекла фиксировали нагреванием на открьітом пламени до тех пор, пока стекло не становилось тепльім (при прикосновенийи). Предметнье стекла сначала обрабатьівали 40мкл і, разведения 1:40 антисьворотки против ОМРІ0Об6 или пре-иммунной сьворотки из того же животного, с разведенной в РВБЗ/МС, или РВБЗ/МС в течение 10 минут, затем промьшвали 5 раз РВ5Б/МО. Стекла обрабатьшвали 40мкл б5мкг/мл РВБ/МС меченьїх изотиоцианатом флуоресцеина козьих антител к дО кролика со (Кігкедаага апа Регту Іаброгайогіев, Іпс, Саййпегериго, МО сайаіюд питбрег 02-15-06). Предметнье стекла «о инкубировали в темноте в течение 10 минут и промьівали 5 раз в РВ5З/МС. Каждое предметное стекло хранили покрьїтьїім РВ5Б/МС под покровньім стеклом и просматривали под флуоресцентньім микроскопом, снабженньм фильтром 489нм. Для каждой пробьії визуально просматривали пять полей для оценки степени окрашивания. 6.2. Результать « 6.2.1. Гемагглютинирующая активность з с Агглютинирующая активность М.саїйїагтнайзв в отношений зритроцитов является видоспецифической с найболее сильной активностью, наблюдаемой с озритроцитами человека. Зритроцитьі кролика также ;» агглютинируются М.сайагтнаїїв5, но в меньшей степени, чем зритроцить! человека. Зритроцить! из мьіши, лошади или овць не агглютинируются (см. Таблицу 1).
Ф со с
ФО мше 22200000 го ешдь 111 бю 00000 6.2.2. Лигандьі и рецепторьї ОМР106
ІФ) Гемагглютинирующая активность М.сайагнаїїв обусловлена связьіванием с глоботетрозой (СБ 5). Пузьірьки ко (везикуль)) из гемаггллютинирующих штаммов связьшваются с гликолипидом, имеющим СБ у, тогда как негемагглютинируютие штаммь не связьшваются с зтим гликолипидом (см. Фиг.2). Гемагг'лютинирующая 60 активность М.саїйагтнайв ингибируєется моносахаридньми компонентами (ЗБ 4 или производньми таких моносахаридов, причем найболее сильньмми ингибиторами являются М-ацетилгалактозамин и галактоза (особенно альфа-аномер галактозь) (см. Таблицу 2). вв
Сахар МИК (мм)у"
о 595 промьїтьми 0 зритроцитами. 75 Как М-ацетилгалактозамин, так и альфа-галактоза являются частью тетрасахарида СБ 4. Корреляция между гемагглютинацией и связьіванием с 25; и наблюдение, что гемагглютинация ингибируется моносахаридами, которье содержат ОБ) рецептор, предполагают, что клетки М.сайатнаїїв связьіваются с тетрасахаридом ОБ у.
Зтот тетрасахарид присутствует на зритроцитах и тканях человека и мог бьі медиировать присоединение
М.сайатнаїй» к мембранам зритроцитов. 6.2.3. Идентификация полипептида ОМР106
Протеолитическое расщепление клеток М.сайагтнаїїв и последующий анализ гемагглютинации, вьізьіваемой расщепленньми клетками, показали, что протеазная обработка химотрипсином и протеиназой К разрушала гемагглютинирующую активность, а обработка трипсином частично разрушала гемаглютинирующую активность, что указьівало на то, что гемагглютинирующая активность опосредована белком. Анализ профилей сч ря белков ОМР обработанньїх протеазами клеток М.саїйагтаїйв показал, что в каждой пробе бьіли деградировань многочисленньюе белки, так что зти профили не дают ответа на вопрос, какой белок непосредственно или (о) опосредованно участвует в гемаглютинирующей активности (см. Фиг.3).
Поскольку протеазная обработка показала, что полипептид прямо или опосредованно ответственен за гемагглютинирующую активность, мьї использовали злектрофорез в полиакриламидном геле с ДСН(ІРАСЕ-505) сч 20 для сравнения профилей ОМР из гемагг'лютинирующих штаммов с профилями ОМР из негемагглютинирующих штаммов (Фиг.4). Анализ различий между зтими профилями показал, что гемагглютинирующиє штаммь имеют с два уникальньїх полипептида, один со средней молекулярной массой 27кДа (обозначенньій ОМР27) и другой, с являющийся единственньім белком со средней молекулярной массой более 106бкДа (обозначенньій ОМР106).
Следуєт отметить, что полоса полипептида ОМРІ06 отсутствовала в препаратах ОМР обработанньх 09 зв различньми протеазами клеток, которье имели уменьшенную гемаглютинирующую активность или не имели (з гемагглютинирующей активности, тогда как полоса ОМР27 присутствовала в препарате ОМР обработанньх протеиназой К клеток, которье не имели гемагглютинирующей активности. Кроме того, полоса полипептида
ОМРІ06 не разрушалась гидролизом протеиназой М8, которьій не влиял на гемагглютинирующую активность обработанньх клеток. « 20 6.2.4. Профиль ОМР МНА Культиваров -в
Последовательное (серийное) культивирование МНА культивара АТСС 49143 в статической культуре при с 35"С давало МНА культивар (названньй 49143-МНА) при третьем пассаже зтой культурь. Зта потеря :з» гемагглютинирующей активности бьіла воспроизводимой. Анализ профилей ОМР Об-зкстрактов наружньмх мембран НА и МНА культиваров показал, что полоса полипептида ОМРІ106 отсутстствовала в зкстракте 49143-МНА (Фиг.5). Зто предполагаєет, что полипептид ОМР106 является гемагглютинином М.сайагтпнаїїв (т.е. бо що полипептид ОМР106 связьювает гецептор СБ; или является субьединицей гомополимерного белка, которьй связьвваєт рецептор СБ/) или образует часть гемагглютинина М.сайагтнаїїв (т.е. полипептид ОМР106 является (ее) субьединицей гетерополимерного белка, которьій связьвваєт рецептор Обі). сю 6.2.5. ОМР106 и гемагглютинация
Поликлональная антисьіворотка, индуцированная полипептидом ОМРІ10О6 АТСС 49143, нейтрализовала (95) гемагглютинацию, вьізьіваемую АТСС 49143, а также гемагглютинацию, вьізьіваемую гетерологичньмм штаммом
КЗ АТСС 43627. Зто дополнительно подтверждает вьівод о том, что гемагглютинирующая активность М.сайагтнаїв включает полипептид ОМР106 и что полипептид ОМР106 является антигенно консервативньм среди штаммов.
См. также Фиг.9А, которьій показьвает антитела в поликлональной антисьіворотке, связьвающие полипептид 5 ОМРІ06 тетерологичньїх штаммов М.сайагтпаїв. 6.2.6. Локализация ОМР106 в наружной мембране
ГФ) Для определения, зкспонирован ли полипептид ОМРІ106 на наружной мембране клеток М.саїйагтпаїв,
Ге использовали кроличью антисьмворотку против ОМР10О6 в непрямом иммунофлуоресцентном окрашивании.
Клетки М.саїйагтнаїїз, обработаннье антисьмвороткой против ОМРІ06, окрашивались более интенсивно и во однородно, чем клетки, обработаннье пре-иммунной сьівороткой или РВБЗ/МС. Зто свидетельствует о том, что в интактньїх клетках М.саїагттайв полипептид ОМР106 бьл реактивен с антителами против ОМРІ106. Зтот результат показьшаєт, что полипептид ОМР106 зкспонирован на наружной поверхности М.саїйагтнаїїв. Зто открьтие согласуется с тем, что полипептид ОМРІОб играеєт роль в гемаггллютинации, и, кроме того, свидетельствует о том, что полипептид ОМР106 мог бь бьіть применимь!м в качестве вакцинь. 6.2.7. Свойства полипептида ОМР106 б5 Полипептид ОМР106 существует в виде большого белкового комплекса в его нативном состояниий или в виде агрегатов, когда его зкстрагируют октилглюкозидом. Зтот вьівод подтверждаєтся обнаружением того, что зкстракция клеток М.саїйагтнайв октилглюкозидом будет солюбилизировать полипептид ОМРІ106, но зкстрагированньій полипептид ОМРІОЄ не входит в денатурирующие полиакриламидньюе гели, если зтот Зкстракт не инкубируют сначала при 100"С (Фиг.б). Кроме того, полоса полипептида ОМР106, по-видимому, не образуется из полипептидов более низкой молекулярной массьі, которне полимеризуются или агрегируют при нагреваний, так как полипептид ОМР106 в не денатурированной нагреванием пробе удерживаеєется в зтой пробе хорошо и входит в разделяющий гель только в том случає, если пробу сначала инкубируют при 1007С. Зто биохимическое свойство является очень полезньімм для идентификации полипептида ОМР106 в различньх 7/0 геплях.
Используя октилглюкозидньсе зкстракть! М.сайагтнаїїз, затем инкубируя зти зкстракть! с додецилсульфатом натрия при 1007С и разделяя белки на денатурирующем полиакриламидном геле, мьі определили, что средняя молекулярная масса полипептида ОМРІ106 из различньїх штаммов М.саїйагтнаїї5, в частности, штаммов АТС 25238, АТСС 25240, АТСС 43617, АТСС 43618, АТСС 43627 и АТСС 43628, находится в диапазоне от около 180кДа до около 23ОкДа (Фиг.9А), тогда как полипептид ОМР10О6 штамма АТСС 49143 имеет, по-видимому, среднюю молекулярную массу примерно 190 кДа(Фиг.б).
Полипептид ОМРІ1О6 штамма АТСС 49143 бьл зкстрагирован из пластинки геля и его М-конец бьл секвенирован. Секвенированиеє показало, что М-конец полипептида ОМРІ106 из наружной мембраньї АТСС 49143 представляет собой
ІВІЗЕАОСОКОСАМАКООКЗІАІСЗОІАОАІ З5ОБІАІСОМКІМ (ЗЕО ІО М 1). Кроме того, биіл вьіделен внутренний пептид ОМРІ06, продуцируемьй продуктом расщепления І/увзг-С (Регпапде еї аї., 1994, Апаї. Віоспет. 218:112-117), и било определено, что его последовательность представляет собой СТМІ СОКК (5ЕО І М 2).
Мьї получили три олигонуклеотидньїх зонда. Два зонда соответствуют внутреннему пептиду СТМІ СОКК, один имеет следующую последовательность ОСМАСМОТМТТКООМООМААКААК (ЗЕО ІЮО М 7). Другой зонд, сч
Мо-5-72 кодирующий внутренний фрагмент (ЗЕО ІЮ М 5) ами-но-концевой последовательности ОМР 106, имеет следующую последовательность і)
САДОСОБАСОБОБОБААДАООСОБАвССААТОСОСОСОСТОАТАААТССАТТОСТАТТОСТОАСАТТОСОСАА (ЗЕО ІО М 4). Гибридизация зонда Мс-5-72 с полньім продуктом гидролиза Ніпаї! или Ога! ДНК М.сагатпаїїв в каждом случає давала единственную полосу в блоттинге по Саузерну (Фиг.7). Гибридизующаяся полоса в с зо продукте расщепления Ніпаїй! имеет приблизительньїй размер 8,0 т.п.н.; гибридизующаяся полоса в продукте расщепления Ога! имеет-приблизительньй размер 4,2 т.п.н.(Фиг.7). о 6.2.8. Консервативность полипептида ОМР1О6 с
Вестерн-блот-анализ зкстрактов белков наружной мембрань ряда штаммов М.сайагтнаїїв и родственньх видов бактерий показал, что антитела против ОМР106 связьіваются с полипептидом от приблизительно 180кДа со
Зв ДО 23ОкДа во многих штаммах М.сагатнаїїв, как в НА, так и в МНА штаммах или культиварах (Фиг.9А). Антитела «о против ОМР106 не связьівались с каким-либо полипептидом в белковьїх зкстрактах родственньїх бактерий (Фиг.8А). Зти результать! свидетельствуют о следующем: 1) Антитела против ОМР106 могут бьіть использованьі для специфической идентификации и отличения
М.саїйагттайв от родственньх видов бактерий. 2) Полипептид ОМРІ106 может бьть использован для « Генерирования антител, которне имеют диагностическое применение для идентификации М.саїагтпаїв. З) з с Антитела к полипептиду ОМР106 одного штамма (например, ОМР106 АТСС 49143) могут бьіть использовань . для идентификации и вьіделения соответствующего полипептида ОМРІ106 других штаммов М.сайагтпнаїв. и?» Интересно, что результатьї Вестерн-блоттинга показьшвают, что многие МНА штаммь!ї М.сайагтнаїїв имеют полипептид ОМРІ106 в ОС-зкстрактах их наружньх мембран. Зто обнаружение и факт, что окрашивание серебром ОМР из Об-зкстрактов наружньїх мембран МНА штаммов М.саїйагтарйвз после РАСЕ не вьіявляет
Ге» полосьі в диапазоне 180-230кДа, свидетельствуют о том, что полипептид ОМРІ106 зкспрессируется большинством штаммов или культиваров М.саїйагтнаїйв, но для того, чтобь! бьіть активньім в гемагглютинации со или окрашиваться серебром, полипептид ОМР106 должен бьіть правильно модифицирован некоторьі!м образом. оо Очевидно, толькюо НА штаммь! и культиварь! способньї подходящим образом модифицировать полипептид ОМРІО6, так чтобь! он мог медиировать бактериальное связьвание с рецептором агглютинина на поверхностях о клеток млекопитающих.
Ге 7. Пример: зффективность вакциньї ОМР 106: цитотоксическая активность антисьіворотки против ОМР106
Опосредованную комплементом цитотоксическую активность антител против ОМРІ10О6 исследовали для определения вакцинного потенциала полипептида ОМРІ06. Антисьмшворотку к полипептиду ОМРІ106 НА в Культивара АТСС 49143 получали, как описано в Разделе 6.1.8. зирга. Активности пре-иммунной сьіворотки и антисьмворотки против ОМР106 в медиирований киллинга (цитолиза) комплементом М.сайагтнаїйв исследовали
Ф) при помощи сьівороточного бактерицидного теста (Зегит ВасіегісіЗдаї Тез), описанного 7оПШпдег еї аї. ка (Іттипе Кезропзез (о Меїівззегіа тепіпуйів, іп Мапиа! ої Сіїпісаї І арогайогу Іттипоіоду, Зга ей. рр. 347-349), за исключением того, что вместо клеток Меїззегіа тепіпойів использовали клетки НА и МНА штаммов и бо Культиваров М.саїаггпаїв.
Результать! показьівают, что антисьіворотка против ОМР106 медиировала комплемент-киллинг (цитолиз) НА культивара гетерологичного штамма 43 627 М.сайагтпйаїїв, но не МНА культивара М.сайагтнаїїв АТСС 43627 или
МНА культивара М.саїйагттайв АТСС817 б. Таблица 3 обобщаєт опосредованнье комплементом цито-токсические активности пре-иммунной сьіворотки и антисьіворотки против ОМР106 в отношений (против) 65 НА культивара АТСС 43627.
Зюлеримнт? 11010118
Зтот титр является найвьісшим разведением, при котором сьіворотка может медиировать киллинг (цитолиз) /0 / Комплементом НА культивара АТСС 43 627 (например, 16 обозначаеєт 16-кратное разведение сьіворотки); чем больше число, тем вьіше цитотоксическая активность или титр.
Как показано в Таблице З, антисьиворотка против ОМРІТОб имеет в 8 раз большую цитотоксическую активность, чем пре-иммунная сьіворотка. Зтот результат свидетельствует о том, что полипептид ОМР106 применим в качестве вакциньі против НА штаммов и культиваров М.сагагтнпнаїїів.
Хотя данное изобретение описано подробно со ссьілкой на его характернье варианть! должно бьїть понятно, что изменения, которье являются функционально равноценньіми, находятся в обьеме данного изобретения.
Действительно, различнье модификации данного изобретения, в дополнение к показанньїм и описанньм здесь, будут очевидньми для специалистов в данной области из предшествующего описания и сопутствующих рисунков. Такие модификации должнь! находиться в рамках прилагаемьх пунктов формуль! изобретения.
Здесь цитируются многочисленнье публикации, описания которьїх включень! в качестве ссьілок во всей их полноте.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
(1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ: (І) ЗАЯВИТЕЛЬ: ТОСКЕК, КЕММЕТМ РІ ОБІГА, ГАКА сч (І) НАЗВАНИЄ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Полипептид белка-106 наружной мембрань М.Саїагтнаїів, последовательность гена и их применения (8) () ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 8 (1) АДРЕС ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ: (А) АДРЕСАТ: РЕММІЕЕ АМО ЕОМОМО5 с зо (В) УЛИЦА: 1155 Амепие ої Атегісаз (С) ГОРОД: Мем Хоїк о (0) ШТАТ: Мем Хогк со (Е) СТРАНА: ОА (Р) ПОЧТОВЬЙ КОД: (2ІР) 10036-2711 со (М) ФОРМА СЧИТЬІВАНИЯ КОМПЬЮТЕРОМ: со (А) ТИП НОСИТЕЛЯ: Гибкий диск (В) КОМПЬЮТЕР: ІВМ РС совместимьй (С) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РО-БО5/М5-БО5 (Б) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Раїепііп Кеїеазе « 20 1.0, Мегвіоп ЯЖ1.30 (ЕРО) з с (МІ) ДАННЬЇЕ ТЕКУЩЕЙ ЗАЯВКИ: (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: 5 з (В) ДАТА РЕГИСТРАЦИИ: (С) КЛАССИФИКАЦИЯ: (МІ) ИНФОРМАЦИЯ О ПОВЕРЕННОМІ/АГЕНТЕ:
Ф (А) ИМЯ: Ваїдм/іп, Сегаїдіпе Е. (В) РЕГИСТРАЦИОННЬЙИ НОМЕР: 31232 бо (С) ЕЄЕЕРЕКЕМСЕ/БОСКЕТ МОМВЕК: 7969-045 с (ІХ)У ИНФОРМАЦИЯ О ТЕЛЕКОММУНИКАЦИИ: (А) ТЕЛЕФОН: (212) 790-9090 і (В) ТЕЛЕФАКС: (212) 869-8864
ГЕ (С) ТЕЛЕКС: 66141 РЕММІЕ (2) Информация для ЗЕО ІЮ М 1: (І) Характеристика последовательности: (А) ДЛИНА: 43 аминокислоть (В) ТИП: аминокислота (Ф. (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: ко (6) ТОПОЛОГИЯ: неизвестная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: пептид во (ХІ) Описание последовательности: ЗЕО ІО М 1: б5
І1е сб1у Іїе бек 012 Аза Ар сіу біу уз С1у с1у Аза А5п А1а АКОа 1 2 10 15 сіу АБр Пує беїг І1їе Аза І1е с1у АвБр І1єе Аза сіп Аїіа Бей Сіу Зег 20 25 30
М дій Бех І1е А1а 116 біу Ар Авп цу І1е Уаї 35 40 (2) Информация для ЗЕО ІЮ М 2: (І) Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: 8 аминокислот (В) ТИП: аминокислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: (6) ТОПОЛОГИЯ: неизвестная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ: пептид (М) ТИП ФРАГМЕНТА: внутренний (ХІІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО М 2: с1і1у Тк Маії Ге сіу біу Пув Гуз сч 1 5 о (2) Информация для ЗЕО ІЮ М 3: (І) Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: 24 п.н. с (В) ТИП: нуклеиновая кислота со (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: нейизвестно (6) ТОПОЛОГИЯ: неизвестная со (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеийновая ксислота со (А) ОПИСАНИЕ: /дезс-"ргобе" (зонд) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ІО М 3: ООМАСМОТМО ТМОСМООМАА КААК (Се) (2) Информация для ЗЕО ТО М 4: (І) Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: 72 п.н. « (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна - с (6) ТОПОЛОГИЯ: неизвестная а (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: ДНК (геномная) "» (І) ПРИЗНАК: (А) ИМЯ/КЛЮЧ: СО5 (В) МЕСТОПОЛОЖЕНИЕ: 1..72 (о) (ХІІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО І М 4: (с) САА Со САС ообо соб ААА СОС осА ОСС ААТ ССО СОС бот ЗАТ ААА ТО і сі Аза Азр сбіу сб1у Гуз спіу б1у Аїа А5зп Аїа Ака б1у Авр Був бег о 1 5 10 15 й АТТ ОСТ АТТ ССТ САС АТТ СС САА
Т1е А1а І)їе С1у Азр І16 Аза біп 20
Ф) ка (2) Информация для ЗЕО ІЮ М 5: (І) Характеристика последовательности: во (А) ДЛИНА: 24 аминокислоть (В) ТИП: аминокислота (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: белок (ХІІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО М 5: б5
Січ Аза АБр сіу б1у груз сіу 51у А1а Аєп Аї1а Аку б1у Авр Гув Б5ег 1 Що. 8 10 15 -
Т1е Ала І1е сі1у Авр 112 Аза біп 29 (2) Информация для ЗЕО ІЮ М 6: (І) Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: 24 п.н. (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: нейизвестно (6) ТОПОЛОГИЯ: неизвестная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /дезс- ргоре (зонд) (ХІІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО М 6: уУТТУТТМССМ ССМАСМАСМО ТМСС (2) Информация для ЗЕО ІЮ М 7: (І) Характеристики последовательности: (А) ДЛИНА: 24 п.н. (В) ТИП: нуклеиновая кислота с (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: нейизвестно о (6) ТОПОЛОГИЯ: неизвестная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /дезс- ргоре (зонд) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ТО М 7: с
СОМАСМОТМТ ТКСОМОСМАА КААК со (2) Информация для ЗЕО ІЮ М 8: (І) Характеристики последовательности: ме) (А) ДЛИНА: 24 п.н. со (В) ТИП: нуклеиновая кислота
Зо (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: нейизвестно ісе) (6) ТОПОЛОГИЯ: неизвестная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /дезс- ргоре (зонд) « (М) ТИП ФРАГМЕНТА: М-концевой (ХІІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕСО ІО М 8 З с УТТУТТМССМ ССУААМАСМО ТМСС ч з» - : и 8іт6 23246 25258 дз й вів в; а
Об в внов сЄльд сво 0 те ші о ОМ Мо ня
Фиг. 1 60 б5 орсин ВІ 433 с са; м що Ку щй | Те щшх є м в А ня сон -- нн: Ну 75 12 3 494 125354 1254
Фиг. 2
Ге») й 7 з шщ- М Гл.
ШЕ х рев 8 ще й і е В м с їй о й о т
Ге ГИ ік -
В є в" Б о с сні й В т н зе в ЗД би: ання сч 8 КИ и ДО ЯЕНЙ ДАТ 495 дн! Збут, т. со з --о. шия ння
Й як яка що
ЕКО
30.5 до тен ето ана вно і: є 40 ет он п НН Аж ко що . но В кю - оно ен пн НН ВИ У ШЕ -
Ф Ні 4 0 щД0ж.214 4 ее)
Фиг. З
ОО ' о 50
Пе) (Ф)
По) бо б5 ей в: ж п УНН Я рин не с пон ИН шо Кт, тв : о : ши -5 70 жа яри 15 зв. ру учи 18.5 01 000 42 20 | Фиг. 4 «Ї - юю с 25 (о) се; їш - ся ЙТ с 30 пня 00 ння со
Панч і) 6, їй 35 80 й -- 1 ісе) 49500 ч и -о 40 ' с то з о 45 32.3,
Ге) со 21.5 чий (95) . . сю 70 й їз 18.5 Шо елек «ий
НА 4 - (Ф) ко бо 1 виг. 5 65 со ча (1 о - см 9 жк. 2 жк І он: ! но І - | НІ й би тлй гот 200 тост у В ро ше
Хр | й 29 -7 пк т : . шен " г. . | «ме нн . й є й т "кий. й ня г 66 ; и | Нм - з « - :
ФиИгГ. 6 ! 2» ї і
Ф шт в . в.
Я ї Е 8 (95) Нет ш 5 о 7о 007 Фориджин і» палю (качало репликации)
Ф) боб здяАю , з 40006. ля 5) щ- щ- 20009. - с тИГ. 7 . 65 ші т я ше Му
ТУ с- Ко. - 1 ше як - т ни и и; тах ; ІЙ й Й «І й г хе А рій хо -. зн -106 714 У я колона ми -4 ней у ояях 27.71 49.5 . 70 | . -32.5 п. 1, 27.5
С 7 т, я ка - 2, и т , Гашь ї
ПИЛИ но хм С УИОМ Ши 18. я Ка ин
УМ ВлОКя п сто мА БІ туї ТЕХ роза о ДАН т. -, п о МН зак похантчн З 1 тк ню РИ ня причи а й виг. ВА пек щи, ялин ни т х : : хм си му - 8 А є олив уя 17 - п А Її. 2 око пн :І 8 й а В ем сч «Есе ту НА -4 5 МЕ а и
ІЕЕ Ме сени лодже ги йти
ДЕСНИ р ВИ би -9
ЛУ о Ян и в з, 7 5 зо домі вв ' о ее ий Свт Ге
КА Дд я Ми ра и они Шви пе тро ОК дао АА .
КПУ Ки ла ВХ
ОУН
Ко ж
А Ле ВИ п
Пн ня «Дао
Ши оси М о - шоШЦЦ1МИТА
Фиг. 8в
ФоФ «
Я є с ФО ДТ - в пощоЯО с Бе З
Ф ою ге й час о
І» шо тут
Ов» яння кі - ї НЯ ся ява Я :
ОМР 106 в ть Ди шу Ой бух ай сих що йу Да сині ВАШУ м - " щ ТА тя п. - млини его. 50 . - 32.5
Ф! ФИГ. ЗА к бо б5 т апомою теме Га бю вдо тятя М 43 М Ши и НИ
А й а 106 шк і - 4880 - ще ! ре 7 и « Щі 77 ху Но шк Й - 875 пн і - 185 . і
Фиг. 9в
Фо с рмула винаходу о 1. Вьіделенньій полипептид ОМРІ106, которьій является полипептидом наружной мембрань! Могахеїйа сагагтнаїй» и имеет молекулярную массу приблизительно от 180 кДа до приблизительно 230 кДа, как определено злектрофорезом в ЗЮОЗ-полиакриламидном сгеле с использованием миозина скелетньх мьшц є кролика и В -галактозидазьі Е.сої в качестве стандартов молекулярньмх масс 200 кДа и 116,25 кдДа, с соответственно, и включаєт либо последовательность 5ЕС ІЮ МО: 1, либо последовательности ЗЕО ІЮ МО: 1 и
ЗЕБЕОІЮ МО: 2. Ге) 2. Вьіделенньій полипептид ОМР106 по п.1, отличающийся тем, что включает последовательности ЗЕО ІЮ со
МО: 1 и ЗЕО ІЮ МО: 2. 3. Вьіделенньій полипептид ОМР106 по пп. 1 или 2, отличающийся тем, что он имеет молекулярную массу (Се) около 190 кДа. 4. Вьіделенньій полипептид ОМРІТ0Об6 по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что он является полипептидом наружной мембраньі штамма МогахеїІа саїйагтнаїї5, вьібранного из группьі, состоящей из АТОС « 25238, АТСС 25240, АТСС 43617, АТСС 43618, АТСС 43627, АТСС 43628 и АТСС 49143. 5. Вьіделенньій полипептид ОМРІТ0Об6 по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что штамм МогахеїІа - с сагаттаїйй» представляет собой АТСС 49143. и 6. Вьіделенньій полипептид ОМРІТ0Об6 по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что штамм МогахеїІа ,» сагатнаїїв является гемагглютинирующим культиваром. 7. Ввіделенньій полипептид ОМР106 по любому из пп. 1-6, отгличающийся тем, что он взаймодействует с содержащим серебро красителем.
Ге) 8. Вьіделенньій полипептид ОМР 106 по п.1, отличающийся тем, что он имеет характеристики, показаннье на со фиг. 1-6 или 9. 9. Вьіделенньій полипептид ОМР 106 по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что его используют для (95) приготовления медикамента для лечения или предупреждения инфекции, вьізьіваемой Могахеїіа сайагтпаїв. сю 50 10. Вьіделенное антитело, которое специфически связьнвает полипептид ОМР106 по любому из пп. 1-8 или его фрагмент, причем указанньій фрагмент включает 6 или более аминокислот ЗЕО ІЮ МО: 1 или 5БЕО ІЮ МО: 2. ще) 11. Вьіделенное антитело по п.10, отличающееся тем, что оно является цитотоксическим антителом, которое опосредует уничтожение бактерий МогахеїІа сагагнаїїв с помощью комплемента. 12. Вьіделенное антитело по п. 10 или 11, отличающееся тем, что его используют для приготовления медикамента для лечения или предупреждения инфекции, вьізьіваемой Могахеїіа сайагтпаїв. о 13. Пептидньій фрагмент полипептида ОМР106 по любому из пп. 1-8, огличающийся тем, что он специфично связьіваєт антитело, которое специфично к указанному полипептиду ОМР 106. ко 14. Пептидньій фрагмент полипептида ОМРІ106 по п. 13, отличающийся тем, что его используют для приготовления медикамента для лечения или предупреждения инфекции, вьізьіваемой Могахеїіа сайагтпаїв. 6о0 15. Вакцина, содержащая вьіделенньій полипептид ОМР106 по любому из пп. 1-8. 16. Вакцина, содержащая пептидньій фрагмент по п. 13. 17. Антигенная композиция, содержащая полипептид ОМР106 по любому из пунктов 1-8. 18. Антигенная композиция, содержащая пептидньій фрагмент по п. 13. 19. Вьіделенная ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид ОМР106 по 65 любому из пп.1-8. 20. Вьіделенная ДНК по п. 19, отличающаяся тем, что она включает нуклеотидную последовательность,
Claims (1)
- кодирующую пептид ЗЕО ІЮ МО: 1.21. Вьіделенная ДНК по п. 19, отличающаяся тем, что она включает последовательность 5ЕО ІЮО МО: 4 или фрагмент указанной последовательности.22. Вьіделенная ДНК по любому из пп. 19-21, отличающаяся тем, что ее используют для идентификации или диагностики инфекции, вьізьіваемой Могахеїіа сайагтнаїв.23. Вьіделенная ДНК, кодирующая полипептид ОМРІ106, причем зта ДНК включаєет нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется в жестких условиях с последовательностью ЗЕО ІЮ МО: 4 или с фрагментом указанной последовательности. 70 24. Способ получения иммунного ответа в животном, включающий иммунизацию животного, отличающийся тем, что иммунизацию животного проводят зффективньі!м количеством полипептида ОМР106 по любому из пп.1-8.25. Способ получения иммунного ответа в животном, включающий иммунизацию животного, отличающийся тем, что иммунизацию животного проводят зффективнь!м количеством пептидного фрагмента по п. 13.26. Способ лечения и профилактики инфекции Могахеїіа садагтнаїйз, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в зтом, зффективного количества вакциньї по пп. 15 или 16.27. Способ лечения или профилактики инфекции Могахеїйа сайагтнайв, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в зтом, зффективного количества антигенной композиции по пп. 17 или 18. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2004, М 8, 15.08.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) с (зе) (зе) (ее) (Се)- . и? (о) (ее) (95) (95) Ко) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/642,712 US7341727B1 (en) | 1996-05-03 | 1996-05-03 | M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same |
| PCT/US1997/007679 WO1997041731A1 (en) | 1996-05-03 | 1997-04-28 | Moraxella catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, gene sequence and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA68332C2 true UA68332C2 (en) | 2004-08-16 |
Family
ID=24577687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA98126370A UA68332C2 (en) | 1996-05-03 | 1997-04-28 | Moraxeila catarrhalis outer membrane protein-106 (omp106) polypeptide, peptide fragment and encoding nucleotide sequences, antibodies binding omp106 polypeptide, vaccine and antigenic composition (variants), methods of inducing immune responses to m. catarrhalis in animals (variants), method for treatment and prevention of m. catarrhalis infection (variants) |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US7341727B1 (uk) |
| EP (1) | EP0900025B1 (uk) |
| JP (2) | JP4401437B2 (uk) |
| CN (2) | CN100415871C (uk) |
| AR (1) | AR006999A1 (uk) |
| AT (1) | ATE244016T1 (uk) |
| AU (1) | AU723528B2 (uk) |
| BG (1) | BG64832B1 (uk) |
| BR (1) | BR9711090A (uk) |
| CA (1) | CA2253636C (uk) |
| CZ (1) | CZ298034B6 (uk) |
| DE (1) | DE69723254T2 (uk) |
| EA (1) | EA002743B1 (uk) |
| EE (1) | EE04684B1 (uk) |
| ES (1) | ES2202624T3 (uk) |
| GE (1) | GEP20022695B (uk) |
| HK (2) | HK1021299A1 (uk) |
| HU (1) | HU223004B1 (uk) |
| NO (2) | NO324816B1 (uk) |
| NZ (1) | NZ332896A (uk) |
| PL (3) | PL189374B1 (uk) |
| SK (1) | SK284812B6 (uk) |
| TW (1) | TW541314B (uk) |
| UA (1) | UA68332C2 (uk) |
| WO (1) | WO1997041731A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA973809B (uk) |
Families Citing this family (71)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6335018B1 (en) * | 1995-05-01 | 2002-01-01 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
| US6440425B1 (en) * | 1995-05-01 | 2002-08-27 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
| US7341727B1 (en) * | 1996-05-03 | 2008-03-11 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same |
| AUPO652897A0 (en) | 1997-04-30 | 1997-05-29 | University Of Melbourne, The | Synthetic peptide constructs for the diagnosis and treatment of periodontitis |
| GB9714276D0 (en) * | 1997-07-08 | 1997-09-10 | Univ Dundee | Peptides and related compounds |
| US8129500B2 (en) * | 1997-12-10 | 2012-03-06 | Csl Limited | Porphyromonas gingivalis polypeptides and nucleotides |
| GB9808720D0 (en) * | 1998-04-23 | 1998-06-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| GB9810084D0 (en) | 1998-05-11 | 1998-07-08 | Cortecs Uk Ltd | Proteins |
| GB9810193D0 (en) * | 1998-05-12 | 1998-07-08 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| WO1999058682A2 (en) * | 1998-05-12 | 1999-11-18 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Compounds from moraxella catarrhalis |
| GB9810285D0 (en) * | 1998-05-13 | 1998-07-15 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| US6541616B1 (en) | 1998-10-01 | 2003-04-01 | Antex Biologics Inc. | Moraxella catarrhalis protein, gene sequence and uses thereof |
| DE60038166T2 (de) | 1999-03-19 | 2009-03-12 | Glaxosmithkline Biologicals S.A., Rixensart | Impfstoff gegen bakterielle antigene |
| US6673910B1 (en) | 1999-04-08 | 2004-01-06 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences relating to M. catarrhalis for diagnostics and therapeutics |
| EP1185658B1 (en) * | 1999-05-24 | 2008-06-04 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Novel compounds from moraxella catarrhalis |
| GB9915031D0 (en) * | 1999-06-25 | 1999-08-25 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| GB9921691D0 (en) * | 1999-09-14 | 1999-11-17 | Smithkline Beecham Sa | Novel compounds |
| EP1214339B1 (en) * | 1999-09-14 | 2007-08-01 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Polypeptides from moraxella (branhamella) catarrhalis |
| GB0022742D0 (en) | 2000-09-15 | 2000-11-01 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| GB0103171D0 (en) | 2001-02-08 | 2001-03-28 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
| SE0102410D0 (sv) * | 2001-07-04 | 2001-07-04 | Arne Forsgren | Novel surface exposed immunoglobulin D-binding protein from moraxella catarrhalis |
| EP2255826B1 (en) | 2002-08-02 | 2016-04-13 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Neisserial vaccine compositions comprising a combination of antigens |
| CN101180079B (zh) | 2005-04-08 | 2012-07-18 | 惠氏公司 | 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物 |
| CN100357318C (zh) * | 2005-10-11 | 2007-12-26 | 中山大学 | 美人鱼发光杆菌外膜蛋白w和编码序列及其制备方法和应用 |
| TWI457133B (zh) | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 新穎組合物 |
| NZ569168A (en) | 2005-12-22 | 2012-02-24 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Streptococcus pneumoniae polysaccharide conjugate vaccine comprising 19F-DT conjugate |
| GB0607088D0 (en) | 2006-04-07 | 2006-05-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| ZA200805602B (en) | 2006-01-17 | 2009-12-30 | Arne Forsgren | A novel surface exposed haemophilus influenzae protein (protein E; pE) |
| WO2008000028A1 (en) | 2006-06-27 | 2008-01-03 | Oral Health Australia Pty Ltd | Porphyromonas gingivalis polypeptides useful in the prevention of periodontal disease |
| KR101579947B1 (ko) | 2007-06-26 | 2015-12-28 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 다당류 컨쥬게이트를 포함하는 백신 |
| JP2010532766A (ja) * | 2007-07-12 | 2010-10-14 | オーラル ヘルス オーストラリア ピーティーワイ リミテッド | バイオフィルムに対する免疫学的治療 |
| DK2175851T3 (da) | 2007-07-12 | 2013-07-15 | Oral Health Australia Pty Ltd | Biofilmbehandling |
| WO2009049013A2 (en) * | 2007-10-09 | 2009-04-16 | Tufts University | Cholera vaccines |
| CN107266582B (zh) | 2008-08-29 | 2021-09-10 | 口腔健康澳洲私人有限公司 | 牙龈卟啉单胞菌感染的预防、治疗和诊断 |
| US8140041B2 (en) * | 2009-08-27 | 2012-03-20 | Mediatek Inc. | Tunable capacitive device with linearization technique employed therein |
| ES2366735B1 (es) * | 2009-10-08 | 2012-09-13 | Fundación Pública Andaluza Para La Gestión De La Investigación En Salud De Sevilla | Vacuna frente a acinetobacter baumannii. |
| US9700889B2 (en) | 2009-11-23 | 2017-07-11 | Cyvek, Inc. | Methods and systems for manufacture of microarray assay systems, conducting microfluidic assays, and monitoring and scanning to obtain microfluidic assay results |
| US9855735B2 (en) | 2009-11-23 | 2018-01-02 | Cyvek, Inc. | Portable microfluidic assay devices and methods of manufacture and use |
| US9651568B2 (en) | 2009-11-23 | 2017-05-16 | Cyvek, Inc. | Methods and systems for epi-fluorescent monitoring and scanning for microfluidic assays |
| WO2013134739A1 (en) | 2012-03-08 | 2013-09-12 | Cyvek, Inc. | Microfluidic assay operating system and methods of use |
| WO2011063408A1 (en) | 2009-11-23 | 2011-05-26 | Cyvek, Inc. | Method and apparatus for performing assays |
| US10065403B2 (en) | 2009-11-23 | 2018-09-04 | Cyvek, Inc. | Microfluidic assay assemblies and methods of manufacture |
| US9759718B2 (en) | 2009-11-23 | 2017-09-12 | Cyvek, Inc. | PDMS membrane-confined nucleic acid and antibody/antigen-functionalized microlength tube capture elements, and systems employing them, and methods of their use |
| US9500645B2 (en) | 2009-11-23 | 2016-11-22 | Cyvek, Inc. | Micro-tube particles for microfluidic assays and methods of manufacture |
| GB201003922D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
| GB201003924D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
| CN103002910A (zh) | 2010-03-10 | 2013-03-27 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 疫苗组合物 |
| CN103154034B (zh) | 2010-04-13 | 2016-06-08 | 塞尔德克斯医疗公司 | 结合人cd27的抗体及其用途 |
| US8501197B2 (en) | 2010-04-30 | 2013-08-06 | The Research Foundation for The State of New York | Compositions and methods for stimulating immune response against Moraxella catarrhalis |
| GB201103836D0 (en) | 2011-03-07 | 2011-04-20 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
| JP5978287B2 (ja) | 2011-03-22 | 2016-08-24 | サイヴェク・インコーポレイテッド | マイクロ流体装置並びに製造及び使用の方法 |
| RU2481401C2 (ru) * | 2011-07-15 | 2013-05-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (ГОУ ВПО УГМА Минздравсоцразвития России) | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ β-ЛАКТАМАЗОПРОДУЦИРУЮЩИХ ОКСИДАЗОПОЗИТИВНЫХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ДИПЛОКОККОВ, ПОДОЗРИТЕЛЬНЫХ НА ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ К MORAХELLA (BRANCHAMELLA) CATARRHALIS |
| US11210432B2 (en) * | 2013-08-20 | 2021-12-28 | Janus Technologies, Inc. | Method and apparatus for selectively snooping and capturing data for secure computer interfaces |
| US20180044429A1 (en) | 2015-03-09 | 2018-02-15 | Celldex Therapeutics, Inc. | Cd27 agonists |
| GB201518684D0 (en) | 2015-10-21 | 2015-12-02 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| US10228367B2 (en) | 2015-12-01 | 2019-03-12 | ProteinSimple | Segmented multi-use automated assay cartridge |
| CN109071665B (zh) | 2016-04-18 | 2022-11-01 | 塞德斯医疗公司 | 结合人cd40的激动性抗体及其用途 |
| GB201621686D0 (en) | 2016-12-20 | 2017-02-01 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel methods for inducing an immune response |
| IE87414B1 (en) | 2017-05-30 | 2023-07-19 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel methods for manufacturing an adjuvant |
| BR112020010790A2 (pt) | 2017-12-01 | 2020-11-10 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | purificação da saponina |
| KR20210011919A (ko) | 2018-04-17 | 2021-02-02 | 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. | 항-cd27 항체 및 항-pd-l1 항체 및 이중특이적 작제물 |
| MX2021001479A (es) | 2018-08-07 | 2021-04-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novedosos procesos y vacunas. |
| CN111157735B (zh) * | 2018-11-07 | 2023-02-07 | 广州万孚生物技术股份有限公司 | 凝集性卡他莫拉菌单克隆抗体及其制备方法和应用 |
| US20220339282A1 (en) | 2018-11-29 | 2022-10-27 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Methods for manufacturing an adjuvant |
| WO2020123444A1 (en) | 2018-12-11 | 2020-06-18 | Celldex Therapeutics, Inc. | Methods of using cd27 antibodies as conditioning treatment for adoptive cell therapy |
| JP2022535091A (ja) | 2019-06-05 | 2022-08-04 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | サポニン精製 |
| CN111778226B (zh) * | 2020-07-21 | 2022-04-05 | 东北师范大学 | 一种水稻耐碱胁迫相关的质膜H+-ATPase蛋白及其应用 |
| IL307519A (en) | 2021-04-09 | 2023-12-01 | Celldex Therapeutics Inc | Antibodies against ILT4, anti-ILT4\PD-L1 bispecific antibody and their uses |
| WO2023077521A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Celldex Therapeutics, Inc | Anti-ilt4 and anti-pd-1 bispecific constructs |
| GB202205833D0 (en) | 2022-04-21 | 2022-06-08 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Bacteriophage |
| WO2024017827A1 (en) | 2022-07-19 | 2024-01-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Continuous process for vaccine production |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4675176A (en) * | 1983-12-12 | 1987-06-23 | Norden Laboratories | Moraxella bovis protease vaccine |
| US4879213A (en) * | 1986-12-05 | 1989-11-07 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse |
| US5552146A (en) * | 1991-08-15 | 1996-09-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis |
| US5607846A (en) | 1994-05-17 | 1997-03-04 | Research Foundation Of State University Of New York | Vaccine for moraxella catarrhalis |
| US6440425B1 (en) * | 1995-05-01 | 2002-08-27 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
| US6335018B1 (en) * | 1995-05-01 | 2002-01-01 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
| US7341727B1 (en) * | 1996-05-03 | 2008-03-11 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same |
| GB9809683D0 (en) | 1998-05-06 | 1998-07-01 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| GB9812163D0 (en) | 1998-06-05 | 1998-08-05 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
-
1996
- 1996-05-03 US US08/642,712 patent/US7341727B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-04-28 BR BR9711090A patent/BR9711090A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-04-28 GE GEAP19974595A patent/GEP20022695B/en unknown
- 1997-04-28 WO PCT/US1997/007679 patent/WO1997041731A1/en active IP Right Grant
- 1997-04-28 CA CA002253636A patent/CA2253636C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-28 CZ CZ0352498A patent/CZ298034B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 CN CNB2005100924509A patent/CN100415871C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-28 SK SK1509-98A patent/SK284812B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 EE EE9800373A patent/EE04684B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 NZ NZ332896A patent/NZ332896A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 EA EA199800973A patent/EA002743B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 EP EP97926409A patent/EP0900025B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-28 AT AT97926409T patent/ATE244016T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 ES ES97926409T patent/ES2202624T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-28 PL PL97366359A patent/PL189374B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 DE DE69723254T patent/DE69723254T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-28 CN CNB971959900A patent/CN1222618C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-28 PL PL97330935A patent/PL189995B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 HU HU9902695A patent/HU223004B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 UA UA98126370A patent/UA68332C2/uk unknown
- 1997-04-28 AU AU31180/97A patent/AU723528B2/en not_active Ceased
- 1997-04-28 JP JP54015697A patent/JP4401437B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-28 PL PL97366360A patent/PL189375B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-05-01 TW TW086105809A patent/TW541314B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-05-02 ZA ZA9703809A patent/ZA973809B/xx unknown
- 1997-05-05 AR ARP970101850A patent/AR006999A1/es active IP Right Grant
- 1997-11-12 US US08/968,685 patent/US6214981B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-11-02 NO NO19985113A patent/NO324816B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-12-02 BG BG102983A patent/BG64832B1/bg unknown
-
2000
- 2000-01-18 HK HK00100316A patent/HK1021299A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-03-20 US US09/813,214 patent/US7128910B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-08-18 NO NO20063711A patent/NO20063711L/no not_active Application Discontinuation
- 2006-10-16 US US11/580,854 patent/US7576179B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-01-12 HK HK07100467.7A patent/HK1095358A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2007-10-26 US US11/925,586 patent/US20080145916A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-01-10 JP JP2008003407A patent/JP2008161194A/ja active Pending
-
2009
- 2009-08-14 US US12/541,701 patent/US7914795B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA68332C2 (en) | Moraxeila catarrhalis outer membrane protein-106 (omp106) polypeptide, peptide fragment and encoding nucleotide sequences, antibodies binding omp106 polypeptide, vaccine and antigenic composition (variants), methods of inducing immune responses to m. catarrhalis in animals (variants), method for treatment and prevention of m. catarrhalis infection (variants) | |
| KR100361562B1 (ko) | 프로테이나제k에대해내성을갖는네이쎄리아메닝기티디스의표면단백질 | |
| EA007409B1 (ru) | Антигенные полипептиды стрептококков, способы их получения и применения | |
| AU614718B2 (en) | A neisseria gonorrhoeae lectin useful as a vaccine and diagnostic marker and means for producing this lectin | |
| US10603373B2 (en) | Targets of Acinetobacter baumannii | |
| RU2252224C2 (ru) | Пептид со свойствами антигена neisseria meningitidis, кодирующий его полинуклеотид, вакцина для лечения или предотвращения заболеваний или состояний, вызванных neisseria meningitidis, (варианты), антитело, связывающееся с указанным пептидом | |
| US7311917B2 (en) | Moraxella catarrhalis protein, gene sequence and uses thereof | |
| KR100366482B1 (ko) | 백신으로서 정제된 분류가능하지 않은 헤모필루스 인프루엔자 p5단백질, 및 그의 정제방법 | |
| US20090246228A1 (en) | Moraxella catarrhalis Proteins | |
| El-Adhami et al. | Characterization of the gene encoding a 26-kilodalton protein (OMP26) from nontypeable Haemophilus influenzae and immune responses to the recombinant protein | |
| CA2520386A1 (en) | Nontypeable haemophilus influenzae virulence factors | |
| US20050032103A1 (en) | Nucleic acids and polypeptides specific for pathogenic strains of the Neisseria genus | |
| KR20010044842A (ko) | 백신 보조제로서 콜레라 독소 비 또는 장독소 비의펩타이드 단편 | |
| US6218147B1 (en) | Haemophilus adhesin protein | |
| KR100500000B1 (ko) | 모락셀라카타르할리스외측막단백질-16폴리펩티드,이의유전자서열및이의용도 |