SK284812B6

SK284812B6 - Izolovaný OMP106 polypeptid alebo jeho fragment, vakcína a antigénový prostriedok s ich obsahom, izolovaná DNA, izolovaná protilátka a ich použitie

Info

Publication number: SK284812B6
Application number: SK1509-98A
Authority: SK
Inventors: Kenneth Tucker; Laura Plosila
Original assignee: Antex Biologics, Inc.
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-04-28
Publication date: 2005-12-01
Also published as: HU223004B1; CN1800359A; BG102983A; ZA973809B; NO985113D0; EA002743B1; CZ298034B6; AU3118097A; EA199800973A1; GEP20022695B; PL189375B1; US7576179B2; CA2253636A1; JP4401437B2; ATE244016T1; EP0900025B1; US20080145916A1; HUP9902695A3; CN1223549A; NZ332896A

Abstract

Je opísaný izolovaný OMP106 polypeptid, ktorý je p@âŇolypeptidom vonkajších membrán Moraxella catarrhal@âŇis, a má molekulovú hmotnosť asi 180 kD až asi 230@âŇ kD podľa určenia pomocou SDS polyakrylamidovej gé@âŇlovej elektroforézy, peptidový fragment z OMP106 p@âŇolypeptidu, izolovaná protilátka, vakcína, antigén@âŇový prostriedok a izolovaná DNA. Ďalej je opísané @âŇpoužitie polypeptidu, peptidového fragmentu a izol@âŇovanej protilátky na prípravu liečiva na liečenie @âŇalebo prevenciu infekcie s Moraxella catarrhalis.@@âŇ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa všeobecne týka vonkajšieho membránového proteín-106 (OMP106) polypeptidu z Moraxella catarrhalis. Vynález zahrnuje čistený OMP106 polypeptid a polypeptidy z neho odvodené (OMP 106-od vodené polypeptidy). Vynález tiež zahrnuje protilátky, vrátane cytotoxických protilátok, ktoré špecificky viažu OMP106 polypeptid a/alebo OMPlOó-odvodené polypeptidy. Vynález ďalej zahrnuje profylaktické alebo terapeutické zmesi, vrátane vakcín, ktoré obsahujú OMP106 polypeptid a/alebo OMP106-odvodené polypeptidy. Vynález okrem toho poskytuje spôsoby indukovania imunitných odoziev na M. catarrhalis u cicavcov. Vynález ďalej poskytuje izolované nukleotidové sekvencie kódujúce OMP106 polypeptid a OMP106-odvodené polypeptidy, vektory, ktoré majú tieto sekvencie, a hostiteľské bunky obsahujúce tieto vektory.

Doterajší stav techniky

Moraxella catarrhalis, tiež známa ako Moraxella (Branhamella) catarrhalis alebo Branhamella catarrhalis a skôr známa ako Neisseria catarrhalis alebo Micrococcus catarrhalis, sú gram-negatívne baktérie často nachádzané v respiračnom trakte ľudí. M. catarrhalis, ktoré sa pôvodne nepovažovali za nebezpečné symbiotické organizmy, sú teraz spoznané ako dôležitý patogén v infekciách horného a dolného respiračného traktu zvierat. U ľudí spôsobuje M. catarrhalis vážne infekcie v dolnom respiračnom trakte dospelých s chronickou chorobou pľúc, systémické infekcie u pacientov s oslabenou imunitou, a zápal stredného ucha a zápal prínosových dutín u dojčiat a detí. Pozri Helminen a spol., 1993, Infect. Immun. 61:2003 až 2010; Catlin, B. W., 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3:293 až 320; a odkazy tam citované.

Proteíny vonkajšej membrány a ochranné protilátky

Zložky vonkajšieho povrchu Moraxella catarrhalis sa študovali ako pokus pochopiť patogénny proces infekcie M. catarrhalis a vyvinúť užitočné terapeutické liečebné metódy a profylaktické opatrenia proti takejto infekcii. Proteíny vonkajšej membrány (OMP) dostali zvlášť pozoruhodnú pozornosť ako možné faktory virulencie a ako potenciálne vakcínové antigény. M. catarrhalis má okolo 10 až 20 rôznych OMP, pričom 6 až 8 z nich, OMP A až H, ako prevládajúce látky (Murphy a Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159 až 174). Molekulové hmotnosti OMP A až H sú v rozsahu od 97 do 20 kD. Pozri Bartos a Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158: 761 až 765; Helminen a spol., 1993, Infect. Immun. 61: 2003 až 2010; Murphy a spol., 1993, Molecul. Microbiol. 10: 87 až 97; a Sarwar a spol., 1992, Infect. Immun. 60. 804 až 809. Porovnania proteínových profilov pomocou gélovej elektroforézy na sodnom dodecylsulfát polyakrylamide (SDS-PAGE) preparátov vonkajšej membrány z 50 M. catarrhalis kmeňov majú takmer homogénne obrazy OMP A až H (Bartos a Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761 až 765).

Okrem OMP A až H sa OMP s vysokou molekulovou hmotnosťou, označované ako HMW-OMP, ktoré majú zdanlivú hmotnosť 350 až 720 kD podľa SDS-PAGE, tiež identifikovali ako ďalšie prominentné povrchové zložky prítomné v mnohých kmeňoch M. catarrhalis. HWM-OMP pri denaturácii kyselinou mravčou tvorí jednoduchý pás 120 až 140 kD a teda sa javí ako oligomémy proteín (Klingman a Murphy, 1994, Infect. Immun. 62:1150 až 1155). HMW-OMP sa javí ako rovnaký proteín, ako je proteín označovaný UspA Helminenom a spol., (1994, J. Infect. Dis. 170:867 až 872) a ukázalo sa, že je prítomný v mnohých kmeňoch M. catarrhalis.

Pri intaktých baktériách alebo z baktérií získaných mechúrikov vonkajšej membrány, viaceré z identifikovaných OMPs predstavujú povrchovo exponované epitopy, ktoré vyvolávajú tvorbu protilátok, ktoré viažu OMP. Tieto antigénové OMP zahrnujú OMP E a OMP G (Murphy a Bartos, 1989, Infect. Immun. 57: 2938 až 2941); OMP C/D (Sarwar a spol., 1992, Infect. Immun. 60: 804 až 809); CopB, 80 kD OMP, (Helminen a spol., 1993, Infect. Immun. 61: 2003 až 2010); a UspA (Helminen a spol., 1994, J. Infect. Dis. 170: 867 až 872).

Terapeutický potenciál protilátok na povrchovo-exponované epitopy CopB a UspA sa vyhodnotil na modeli so zvieratami. Model zahrnoval priame bolusové naočkovanie do pľúc BALB/c VAF/Plus myší kontrolovaného počtu buniek M. catarrhalis a následné sledovanie rýchlosti pulmonálneho klírensu baktérií (Unhanand a spol., 1992, J. Infect. Dis. 165: 644 až 650). Rôzne klinické izoláty M. catarrhalis mali rôzne rýchlosti klírensu, ktoré korelovali s hladinou granulocytového posilnenia na infikovanom mieste. Pasívna imunizácia s monoklonálnymi protilátkami určenými proti povrchovo-exponovanému epitopu, buď CopB, alebo UspA, zvýšila rýchlosť pulmonálneho klírensu M. catarrhalis (Helminen a spol., 1993, Infect. Immun. 61: 2003 až 2010; Helminen a spol., 1994, J. Infect. Dis. 170: 867 až 872).

Priľnavosť baktérie/hostiteľské bunky a zrážanie krvi

Priľnavosť bakteriálnych patogénov na povrch hostiteľských buniek podporuje kolonizáciu a iniciuje patogenézu. Pozri E.H. Beachey, 1981, J. Infect. Dis. 143: 325 až 345. Gram-negativne baktérie typicky prejavujú povrchové lectíny, ktorc sa viažu na špecifické oligosacharidy glykoproteíny a/alebo glykolipidy na povrchu hostiteľskej bunky. Takéto lectíny sú často spojené s proteínovými strapcami alebo vláknami v stenách baktérií. Bakteriálna priľnavosť sa tiež môže vyskytovať pri nešpecifickom viazaní v dôsledku hydrofóbnej a/alebo nábojovej interakcie s povrchom hostiteľskej bunky.

Mechanizmus priľnutia M. catarrhalis na bunky v respiračnom trakte zostáva slabo pochopeným. Organizmy sa priľnú na kultivované ľudské orofaryngeálne epitelové bunky (Mbaki a spol., 1987, Tohuku J. Exp. Med. 153: 111 až 121). Štúdium Rikitomiho a spol. ukazuje, že proteínové strapce v stenách baktérií môžu mať úlohu pri priľnutí na takéto bunky, pretože denaturácia proteínových strapcov v stenách, alebo opracovanie s protilátkami proti týmto strapcom, znížilo priľnutie strapcovitými kmeňmi (Rikitomi a spol., 1991, Scand. J. Infect. Dis. 23:559 až 567). Proteínovými strapcami sprostredkované viazanie však nemôže byť jediným základom tohto priľnutia, pretože najpnľnavejší kmeň spomedzi rôznych preskúmaných kmeňov, bol nestrapcovitý kmeň.

Reakcie zrážania krvi často nahradzujú komplikovanejšie skúšky priľnavosti pri klasifikovaní bakteriálnych adhézií. Ale Rikitomi a spol. nezistili koreláciu medzi priľnavosťou ľudských orofaryngeálnych epitelových buniek a zrážaním krvi s M. catarrhalis kmeňmi (Id.). Teda trikrát viac priľnavé kmene nezrážali ľudské erytrocyty. Priľnavosť ľudských orofaryngeálnych epitelových buniek a zrážanie teda zahrnovali rôzne mechanizmy viazania.

Naproti tomu nedávna štúdia Kellensa a spol. ukazuje, že zrážanie krvi s M. catarrhalis je korelované s priľnavosťou hostiteľskej bunky (Kellens a spol., 1995, Infection 23: 37 až 41). Ale táto štúdia použila skúšku pri ľnavosti založenú na bakteriálnom viazaní na tracheálne re7.y ošípanej. Je nejasné, či sa tracheálne tkanivo ošípanej môže považovať za homologické k ľudskému tkanivu respiračného traktu vzhľadom na priľnavosť patogénnych kmeňov M. catarrhalis.

Napriek problematickej skúške priľnavosti, Kellens a spol. preskúšali aktivitu zrážania krvi osemdesiatich klinických izolátov M. catarrhalis (Kellens a spol., 1995, Infection 23: 37 až 41). Takmer tri štvrtiny skúmaných kmeňov zrážali ľudské, králičie, morčacie, psie alebo potkanie erytrocyty, kým ostatné kmene to nerobili. Aktivity zrážania krvi niektorých kmeňov zrážajúcich krv sa ďalej charakterizovali a ukázali sa ako závislé od vápnikového iónu a inhibované digesciou trypsínom alebo vysoko-teplotným opracovaním, alebo prídavkom D-glukózamínu alebo D-galaktózamínu.

Prieskum hemaglutinačných a ne-hemaglutinačných M. catarrhalis kmeňov Tuckerom a spol. ukázal, že všetky kmene viažu glykolipid gangliotetraozylceramidu, ale len hemaglutinačné kmene viažu glykolipid globotetraozylceramidu (Tucker a spol., 1994, Annual Meeting of Amer. Soc. Microbiol., Abstrakt č. D124). Navyše sa ukázalo, že M. catarrhalis hemaglutinačná aktivita sa inhibuje rôznymi monosacharidmi, ktoré obsahujú sacharidovú skupinu globotetraozylceramidu. Tieto pozorovania viedli Tuckera a spol. k tvrdeniu, že M. catarrhalis zráža krvinky naviazaním na globotetra-ozylceramidy v bunkových membránach citlivých erytrocytov, vrátane buniek ľudských červených krviniek. Doteraz v tejto oblasti nebola identifikovaná molekula na vonkajšom povrchu M. catarrhalis, ktorá je zodpovedná aj za priľnavosť hostiteľskej bunky aj za zrážanie krviniek.

Citácia alebo identifikácia odkazov v tejto sekcii alebo ktorejkoľvek inej sekcii tejto prihlášky by nemala byť zostavená ako znak, že takýto odkaz je dostupný ako doterajší stav techniky pre tento vynález.

Podstata vynálezu

Tento vynález zahrnuje OMP106 polypeptid M. catarrhalis a OMPlOô-odvodené polypeptidy a spôsoby výroby týchto polypeptidov. Vynález tiež zahrnuje antiséra a protilátky, vrátane cytotoxických protilátok, špecifických pre OMP106 polypeptid a/alebo OMPlOô-odvodené polypeptidy. Vynález ďalej zahrnuje imunogénne, profylaktické alebo terapeutické zmesí, vrátane vakcín, obsahujúce jeden alebo viaceré z týchto polypeptidov. Vynález okrem toho zahrnuje nukleotidové sekvencie kódujúce tieto polypeptidy. Vynález ďalej zahrnuje imunogénne, profylaktické alebo terapeutické zmesi, vrátane vakcín, obsahujúce utlmený alebo inaktivovaný ne-hemaglutinačný kultivar M. catarrhalis.

Tento vynález má mnohé užitočné vlastnosti. Napríklad OMP106 polypeptid a OMP106-odvodené polypeptidy sa môžu použiť ako Ugandy na detegovanie protilátok vyvolávajúcich odozvu infekcie M. catarrhalis (napríklad, pri diagnóze M. catarrhalis infekcie). OMP106 polypeptid a OMPlOô-odvodené polypeptidy môžu tiež byť použité ako imunogény na indukovanie M. caZarrúafe-špecifických protilátok. Takéto protilátky sú užitočné pri imunoskúškach na detegovanie M. catarrhalis v biologických vzorkách. Cytotoxické protilátky podľa tohto vynálezu sú užitočné pri pasívnych imunizáciách proti M. catarrhalis infekcii. OMP106 polypeptid a OMPlOô-odvodené polypeptidy môžu ďalej byť použité ako aktívne zložky vakcín proti M. catarrhalis infekcii.

Vynález je založený na prekvapivom zistení, že hemaglutinačné M. catarrhalis kmene a kultivary majú proteín vonkajšej membrány, OMP106 polypeptid, ktorý má molekulovú hmotnosť okolo 180 kD až okolo 230 kD a proteín vonkajšej membrány nehemaglutinačných M. catarrhalis kmeňov a kultivarov alebo nemá OMP106 polypeptid, alebo majú nevhodne modifikovaný OMP106 polypeptid, ktorý je neaktívny pri zrážaní krviniek a nie je zafarbiteľný striebrom. Vynález je ďalej založený na zistení, že polyklonálne antisérum indukované pomocou OMP106 polypeptidu izolovaného z hemaglutinačného kmeňa M. catarrhalis má cytotoxickú aktivitu proti rôznym hemaglutinačným M. catarrhalis kmeňom, ale nie proti nehemaglutinačným M. catarrhalis kmeňom.

1. Hemaglutinačný a nehemaglutinačný kultivar

Vynález poskytuje izolovaný alebo v podstate čistý OMP106 polypeptid M. catarrhalis. OMP106 polypeptid obsahuje celý proteín alebo podjednotku proteínu vloženú alebo umiestnenú na vonkajšom povrchu vonkajších membrán hemaglutinačných (HA) kmeňov a mnohých nehemaglutinačných (NHA) kmeňov a kultivarov M. catarrhalis. OMP106 prispieva priamo alebo nepriamo hemaglutinačnému fenotypu HA kmeňov a kultivarov. Podľa tohto vynálezu, HA M. catarrhalis bunky zrážajú ľudské alebo králičie erytrocyty pri štandardnej hemaglutinačnej skúške tak, ako je ukázané Soto-Hemandezom a spol. 1989, J. Clin. Microbiol. 27: 903 až 908. Hoci sa nechceme obmedziť akýmkoľvek konkrétnym mechanizmom pôsobenia, súčasne sa predpokladá, že M. catarrhalis zráža erytrocyty naviazaním na globotetrózovú (Gb₄) skupinu glykolipidových a glykoproteínových receptorov na povrchoch hostiteľskej bunky a že hemaglutinačná aktivita je čiastočne sprostredkovaná príslušne modifikovaným OMP106 polypeptidom, ktorý má zvláštnu vlastnosť v tom, že je citlivý na vyfarbovanie striebrom. Naproti tomu, nemodifikovaný alebo nevhodne modifikovaný OMP106 polypeptid nie je ani aktívny pri sprostredkovaní hemaglutinácie ani nie je vyfarbiteľný striebrom. Navyše, OMP106 polypeptid je jediný polypeptid, ktorý má zdanlivú molekulovú hmotnosť okolo 180 kD až okolo 230 kD pri SDS-PAGE, ktorý je OG- alebo sarkozyl-extrahovateľný z HA alebo NHA M. catarrhalis pľuzgierikov alebo intaktných buniek.

Hemaglutinačná aktivita HA M. catarrhalis buniek je inhibovaná pomocou globotetrózy (GalNAcjilGGalal-4Gal β 1 -4GlcP 1; Gb₄) a monosacharidmi, ktoré obsahujú Gb₄, vrátane N-acetyl-D-galaktózamínu, D-galaktózy a glukózy, a ich derivátov, ako napríklad metyl-a-galaktózy alebo metyl-[5-galaktózy. Hemaglutinačná aktivita HA M. catarrhalis buniek je tiež inhibovaná relatívne vyššími koncentráciami mnohých iných cukrov vrátane, ale bez obmedzenia na ne, D-manózy, L-fukózy, D-glukózy a N-acetyl-D-glukózamínu.

Hemaglutinačná aktivita a OMP106 polypeptid intaktných HA M. catarrhalis buniek sú oba znižované alebo deštruované digesciou intaktných M. catarrhalis buniek pomocou rôznych proteáz vrátane, ale bez obmedzenia na ne, TLCK (Να-ptozyl-L-lyzin-chlórmetylketón [tiež známy ako l-chlór-3-tozylamino-7-amino-L-2-heptanón)] - opracovaný chymotrypsín, proteináza K a TPCK (N-tozyl-L-fenylalanín-chlórmetyl ketón)-opracovaný trypsín. Digescia proteázou V8 intaktných HA M. catarrhalis buniek však nepôsobí ani na hemaglutinačnú aktivitu ani na fyzickú integritu OMP106 polypeptidu takýchto buniek.

Nehemaglutinačný (NHA) kultivar sa môže získať z HA M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru pomocou sériovej pasáže v statických kvapalných kultúrach (t.j., kvapal

SK 284812 Β6 ných kultúrach udržiavaných pri 35 °C bez pretrepávania). Napríklad kmeň HA M. catarrhalis alebo kultivar sa pestoval v Mueller Hintonovom bujóne a každých päť dní sa inokulum odobralo z povrchu statickej kultúry na očkovanie následnej statickej kultúry. Výhodné inokulum je plávajúci chumáč buniek na povrchu kultúry. Pasážovanie statických kultúr je udržiavané dovtedy, kým sa tvorí NHA kultivar. NHA kultivar podľa tohto vynálezu môže byť použitý na výrobu ochranných vakcín, ako napríklad vakcín s úplnými bunkami, proti infekcii M. catarrhalis.

Naproti tomu hemaglutinačný fenotype HA M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru sa môže udržiavať pasážovaním kmeňa alebo kultivaru v pretrepávaných kvapalných kultúrach. V jednom uskutočnení sa HA M. catarrhalis kmeň alebo kultivar pestuje v Muellerovom Hintonovom bujóne pri 35 až 37 °C s pretrepávaním s okolo 200 ot./min. a pasážoval sa každých 24 až 48 hodín. Hemaglutinačný fenotyp HA M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru sa tiež môže udržiavať pasážovaním na tuhom médiu. Napríklad, HA M. catarrhalis kmeň alebo kultivar sa pestuje na platni obsahujúcej krvný agar alebo Muellerov Hintonov agar.

2. OMP106 polypeptid

OMP106 polypeptid podľa tohto vynálezu je samostatný proteín vonkajších membrán HA M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru, ktorý má zdanlivú molekulovú hmotnosť pri SDS-PAGE okolo 180 kD až okolo 230 kD, výhodne okolo 190 kD. Podľa tohto vynálezu je proteín vonkajších membrán M. catarrhalis polypeptid, ktorý je prítomný v M. catarrhalis pľuzgierikoch, alebo ktorý sa môže extrahovať z M. catarrhalis pľuzgierikov alebo intaktných buniek pomocou n-oktyl-P-D-gluko-pyranozidu (OG) alebo sarkozylového detergentu v pufrovom roztoku pri laboratórnej teplote. Pozri Murphy a Loeb, 1989, Microbial Pathogenesis 6: 159 až 174, na diskusiu M. catarrhalis pľuzgierikov, ktorými sú prirodzene sa vyskytujúce mechúriky pozostávajúce z vonkajších membrán M. catarrhalis. NHA M. catarrhalis kmene alebo kultivary buď nemajú OMP106 polypeptid, alebo nemajú OMP106 polypeptid vo forme, ktorá viaže anti-OMP106 protilátky (pozri odsek 5., infra) ale nereagujú pri vyfarbovaní striebrom (t.j. s použitím Silver Stain Plus od BioRad (Richmond, CA), alebo postupom opísaným Gottliebom a Chaukom, 1987, Anál. Biochem. 165: 33). Naproti tomu OMP106 polypeptid z HA M. catarrhalis kmeňov alebo kultivary viažu anti-OMPlOô protilátky a reagujú pri vyfarbovaní striebrom.

OMP106 polypeptid môže byť identifikovaný v HA M. catarrhalis pľuzgierikoch alebo intaktných bunkách pomocou jeho citlivosti ku degradácii opracovaním proteázou, ktorá tiež odstraňuje alebo zoslabuje hemaglutinačnú aktivitu rovnakého HA kmeňa (pozri odstek 1. pre príklady proteáz, ktoré deštruujú alebo nedeštruujú hemaglutinačnú aktivitu intaktných M. catarrhalis buniek). Inými slovami, digescia s proteázou, ktorá deštruuje alebo znižuje hemaglutinačnú aktivitu HA kmeňa alebo kultivaru bude tiež meniť pri SDS-PAGE, zastúpenie alebo umiestnenie OMP 106 polypeptidu izolovaného z kmeňa alebo kultivaru po takejto digescii v porovnaní s polypeptidom rovnakého kmeňa alebo kultivaru pred digesciou.

OMP106 polypeptid sa tiež môže identifikovať ako polypeptid v OG alebo sarkozylovom extrakte M. catarrhalis pľuzgierikov alebo intaktných buniek, ktorý má zdanlivú molekulovú hmotnosť väčšiu než 106 kD podľa určenia pomocou denaturačnej gélovej elektroforézy v 12 % hmotnostných PAG s SDS, s použitím prípravkov, ako je opísané v Harlow a Lane (Antibodies: A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har bor, N Y, Appendix I, 1988). Tepelné opracovanie OG alebo sarkozylového extraktu pri 100 °C počas 5 minút môže spôsobiť, že OMP 106 polypeptid má mať zdanlivú molekulovú hmotnosť okolo 180 kD až okolo 230 kD podľa určenia pomocou SDS-PAGE v 6 % hmotnostných PAG bez redukujúcich činidiel, s použitím prípravkov, ako je opísané v Harlow a Lane, rovnaká citácia. V konkrétnom uskutočnení, OMP 106 polypeptid v tepelne opracovanom OG alebo sarkozylovom extrakte M. catarrhalis kmeňa ATCC 49143 má zdanlivú molekulovú hmotnosť okolo 190 kD.

V niektorých uskutočneniach OMP 106 polypeptidom je polypeptid pripravený z M. catarrhalis kmeňov vrátane, ale bez obmedzenia na ne, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628. Výhodný zdroj OMP106 polypeptidu je HA kultivar takýchto kmeňov. Výhodnejším zdrojom je HA kultivar ATCC 49143.

V určitom uskutočnení OMP106 polypeptid obsahuje, výhodne na amino-zakončení, aminokyselinovú sekvenciu IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGD1AQALGSQSIAIG DNKIV (Sekvencia ID NO:1) alebo sekvenciu v podstate ku nej homologickú. OMP 106 polypeptid môže okrem toho obsahovať, karboxyl-vzdialený od vyššie zmienenej sekvencie, oktapeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu GTVLGGKK (Sekv. ID NO:2) alebo sekvenciu v podstate ku nej homologickú. V tomto dokumente sa používa ako v podstate homologickú aminokyselinovú sekvencia taká, ktorá je najmenej 80 %, výhodne 100 %, identická s uvedenou aminokyselinovou sekvenciou.

Podľa rôznych aspektov vynálezu, polypeptidy podľa tohto vynálezu sú charakterizované ich zdanlivou molekulovou hmotnosťou založenou na polypeptidovej migrácii pri SDS-PAGE blízkej na migráciu markerov známej molekulovej hmotnosti. Hoci sa môžu použiť štandardy molekulovej hmotnosti známe v odbore pri SDS-PAGE, výhodné markery molekulovej hmotnosti zahrnujú aspoň králičí skeletálny svalový myozín, E. coli /J-galaktozidázu a králičiu svalovú fosforylázu B. Odborník v tejto oblasti ohodnotí, že polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu migrovať rozdielne v rôznych typoch gólových systémov (napríklad rôznych pufroch; rôznych koncentráciách gélu, zosieťujúcim činidlom alebo SDS). Odborník v tejto oblasti tiež ohodnotí, že polypeptidy môžu mať rôznu zdanlivú molekulovú hmotnosť v dôsledku rôznych markerov molekulovej hmotnosti použitých pri SDS-PAGE. Teda charakterizácia molekulovej hmotnosti polypeptidov podľa tohto vynálezu je zamýšľaná tak, že má byť určená na pokrytie rovnakých polypeptidov v akýchkoľvek SDS-PAGE systémoch a s akýmikoľvek markermi molekulovej hmotnosti, ktoré by mohli indikovať viditeľne rôzne zdanlivé molekulové hmotnosti pre polypeptidy než tie, ktoré sú opísané v tomto dokumente.

3. OMP106-odvodené polypeptidy

OMP 106-odvodený polypeptid podľa tohto vynálezu môže byť fragmentom OMP 106 polypeptidu. Intaktný OMP 106 polypeptid môže obsahovať jeden alebo viaceré aminokyselinové zvyšky, ktoré nie sú potrebné na jeho imunogenicitu. Môže to byť v prípade napríklad vtedy, keď sú pre imunogénnu aktivitu potrebné len aminokyselinové zvyšky tvoriace zvláštny epitope OMP106 polypeptidu. Nepotrebné aminokyselinové sekvencie sa môžu odstrániť pomocou techník dobre známych v odbore. Napríklad sa neočakávané aminokyselinové sekvencie môžu odstrániť pomocou obmedzenej proteolytickej digescie s použitím enzýmov, ako je napríklad trypsín, papain alebo príbuzné proteolytické enzýmy alebo pomocou chemického štiepenia s použitím činidiel, ako je napríklad brómkyán a následnou frakcionáciou produktov digescie alebo štiepenia.

OMP106-odvodeným polypeptidom podľa tohto vynálezu môže tiež byť modifikovaný OMP 106 polypeptid alebo jeho fragment (t.j. OMP106 polypeptid alebo fragment, ktorý má jednu alebo viaceré aminokyselinové substitúcie, vložené časti a/alebo odstránené časti divokého-typu OMP 106 sekvencie). Takéto modifikácie môžu zvýšiť imunogenicitu výsledného polypeptidového produktu alebo môžu byť bez účinku na túto aktivitu. Modifikačné techniky, ktoré sa môžu použiť, zahrnujú techniky opísané v U.S. Patente č. 4,526,716.

OMP 106-odvodeným polypeptidom môže ďalej byť chimérický polypeptid obsahujúci jeden alebo viaceré heterologické polypeptidy kondenzované na amino-zakončenie alebo karboxylové-zakončenie, alebo interne na úplný OMP 106 polypeptid alebo jeho diel, alebo fragment. Užitočné heterologické polypeptidy obsahujúce takýto chimérický polypeptid zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, a) pre- a/alebo pro- sekvencie, ktoré napomáhajú transportu, translokácii a/alebo upravovaniu OMPlOó-odvodeného polypeptidu v hostiteľskej bunke, b) sekvencie afinitného čistenia, a c) akékoľvek užitočné imunogénne sekvencie (napríklad, sekvencie kódujúce jeden alebo viaceré epitopy povrchovo-exponovaného proteinu mikrobiálneho patogénu).

Výhodne OMP106-odvodenými polypeptidmi podľa tohto vynálezu sú imunologický krížovo-reaktívne s OMP 106 polypeptidom, teda sú schopné vyvolať u živočícha imunitnú odozvu na M. catarrhalis. Výhodnejšie obsahujú ΟΜΡΙΟδ-odvodené polypeptidy podľa tohto vynálezu sekvencie tvoriace jeden alebo viaceré vonkajšie-povrchové epitopy pôvodného OMP 106 polypeptidu M. catarrhalis (t. j. povrchovo-exponované epitopy OMP 106 polypeptidu tak, ako existuje v intaktných M. catarrhalis bunkách). Takéto výhodné OMP 106-odvodené polypeptidy sa môžu identifikovať pomocou ich schopnosti špecificky viazať protilátky vyvolané intaktnými M. catarrhalis bunkami (napríklad protilátky vyvolané formaldehydom alebo glutaldehydom viazanými M. catarrhalis bunkami; takéto protilátky sa označujú v tomto dokumente ako protilátky „proti celej bunke“). Napríklad polypeptidy alebo peptidy z obmedzenej alebo úplnej proteázovej digescie OMP 106 polypeptidu sa fŕakcionizujú s použitím štandardných spôsobov a testujú na ich schopnosti viazať protilátky „proti celej bunke“. Reaktívne polypeptidy obsahujú výhodné OMP 106-odvodené polypeptidy. Tieto sa izolujú a ich aminokyselinové sekvencie sa určia pomocou spôsobov známych v tomto odbore.

OMP 106-odvodené polypeptidy podľa tohto vynálezu tiež výhodne obsahujú sekvencie, ktoré tvoria jeden alebo viaceré epitopy pôvodného OMP 106 polypeptidu, ktoré sprostredkujú hemaglutináciu s HA M. catarrhalis bunkami. Takéto výhodné OMP 106-odvodené polypeptidy môžu byť identifikované podľa ich schopnosti interferovať s hemaglutináciou s HA M. catarrhalis bunkami. Napríklad polypeptidy z obmedzenej alebo úplnej proteázovej digescie alebo chemického štiepenia OMP 106 polypeptidu sa fŕakcionizujú s použitím štandardných spôsobov a testujú sa na schopnosti interferovať pri hemaglutinácii s M. catarrhalis bunkami. Už identifikované a izolované aminokyselinové sekvencie takýchto výhodných OMP 106-odvodených polypeptidov sa určili s použitím štandardných spôsobov sekvenovania. Určená sekvencia môže byť použitá na to, aby sa mohli vyrábať takéto polypeptidy pomocou metód chemickej syntézy a/alebo genetického inžinierstva.

Tieto výhodné OMP 106-odvodené polypeptidy sa tiež môžu identifikovať s použitím protilátok „proti celej bunke“, čím sa robí skríning bakteriálnych knižníc prejavujúce náhodné fragmenty M. catarrhalis genomickej DNA alebo klonované nukleotidové sekvencie kódujúce OMP 106 polypeptid. Pozri napríklad Sambrook a spol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Press, NY, Diel 1, Kapitola 12. Zistia sa reaktívne klony a ich inzerty sa izolujú a sekvencujú, aby sa určili aminokyselinové sekvencie takýchto výhodných OMP 106-odvodených polypeptidov.

4. Izolácia a čistenie OMP 106 polypeptidu a OMP 106-odvodených polypeptidov

Vynález poskytuje izolované OMP106 polypeptidy a OMP 106-odvodené polypeptidy. V tomto dokumente sa používa výraz „izolované“ vo význame, že produkt je významne bez iných biologických materiálov, s ktorými je prirodzene spojený. Teda to je napríklad izolovaná OMP106 polypeptidová zmes, ktorá má medzi okolo 70 % hmotnostných a 94 % hmotnostných čistého OMP106 polypeptidu. Výhodne sú OMP 106 polypeptidy a OMP 106-odvodené polypeptidy podľa tohto vynálezu vyčistené. V tomto dokumente sa používa výraz „čistený“ tak, že znamená, že produkt je v podstate bez iných biologických materiálov, s ktorými je prirodzene spojený. Teda obsahuje čistenú OMP106 polypeptidovú zmes, ktorou je najmenej 95 % hmotnostných čistého OMP 106 polypeptidu, výhodne najmenej 98 % hmotnostných čistého OMP106 polypeptidu, a najvýhodnejšie najmenej 99 % hmotnostných čistého OMP 106 polypeptidu.

OMP 106 polypeptid podľa tohto vynálezu môže byť izolovaný z proteínových extraktov, vrátane celobunkového extraktu niektorého M catarrhalis kmeňa alebo kultivaru. Výhodne jc proteínovým extraktom oktylglukozidový alebo sarkozylový extrakt vonkajších membrán mechúrikov (t. j., pľuzgierikov) alebo celých buniek M. catarrhalis vrátane, ale bez obmedzenia na ne, niektorých kmeňov ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628. Výhodný zdroj takýchto extraktov je HA kultivar takýchto kmeňov. Výhodnejším zdrojom takýchto extraktov je HA kultivar ATCC 49143. Ďalším zdrojom OMP106 polypeptidu je proteínový preparát zo systémov génovej expresie prejavujúcej klonované sekvencie kódujúce OMP 106 polypeptid alebo OMP 106-odvodené polypeptidy (pozri odsek 8., v tomto dokumente).

OMP 106 polypeptid sa môže izolovať a čistiť od zdrojového materiálu s použitím niektorej biochemickej techniky a prístupom dobre známym odborníkom v tejto oblasti. Pri jednom prístupe sa M. catarrhalis vonkajšie membrány získajú pomocou štandardnej techniky a vonkajšie membránové proteíny sa solubilizujú s použitím solubilizačnej látky, ako je napríklad detergent. Výhodným solubilizačným roztokom je roztok obsahujúci okolo 1,25 % hmotn./obj. oktyl-glukopyranozidu (OG). Ďalším výhodným solubilizačným roztokom je roztok obsahujúci okolo 1,25 % hmotnostného sarkozylu. OMP 106 polypeptid je v solubilizovanom podiele. Bunkové zlomky a nerozpustný materiál v extrakte sa separujú a odstránia výhodne pomocou ccntrifugácie. Polypeptidy v extrakte sa skoncentrujú, inkubujú v SDS-obsahujúcom Laemmli gélovom pufri pri 100 °C počas 5 minút a potom sa fŕakcionizujú pomocou elektroforézy v 6 % hmotnostných denaturujúcom sodnom dodecylsulfát (SDS) polyakrylamidovom géli (PAG) bez redukčného činidla. Pozri Laemmli, 1970, Náture 227: 680 až 685. Pás alebo frakcia identifikovaná ako OMP106 po lypeptid, ako jc opísané (napríklad striebrom vyfarbený polypcptidový pás, ktorý je prítomný v OG alebo sarkozylovom extrakte HA, ale nie je v zodpovedajúcom NHA kultivare alebo pás HA kultivaru po digescii s proteázou, ktorá odstraňuje hemaglutinačnú aktivitu), môže potom byť izolovaný priamo z frakcie alebo gélového výrezu obsahujúceho OMP106 polypeptid. Vo výhodnom uskutočnení má OMP106 polypeptid zdanlivú molekulovú hmotnosť 190 kD podľa určenia pomocou porovnávania jeho migračnej vzdialenosti alebo rýchlosti v denaturačnej SDS-PAGE vo vzťahu ku rýchlosti králičieho skeletálneho svalového myozínu (200 kD) a E. coli //-galaktozidázy (116 kD).

Ďalším spôsobom čistenia OMP106 polypeptidu je afinitná chromatografia s použitím anti-OMP106 protilátky, (pozri odsek 5.). Výhodne sa používajú monoklonálne antiOMP106 protilátky. Tieto protilátky sú kovalentne naviazané na agarózové gély s brómkyánom alebo jantaranamidovými estermi (Affi-Gel, BioRad, Inc.) alebo pomocou iných spôsobov známych odborníkom v tejto oblasti. Proteínový extrakt sa nanáša na vrch gélu, ako je opísané. Kontaktuje sa počas doby a za štandardných podmienok, ktoré sú dostatočné na to, aby sa OMP106 polypeptid viazal na protilátku. Výhodne je tuhým nosičom materiál používaný v chromatografíckej kolóne. OMP 106 polypeptid sa potom odstráni od protilátky, čo dovoľuje získanie OMP 106 polypeptidu v izolovanej alebo výhodne v čistenej forme.

OMPlOó-odvodený polypeptid podľa tohto vynálezu sa môže vyrábať pomocou chemického a/alebo enzymatického štiepenia alebo degradáciou izolovaného alebo čisteného OMP 106 polypeptidu. OMPlOó-odvodený polypeptid môže byť tiež chemicky syntetizovaný na základe známej aminokyselinovej sekvencie OMP 106 polypeptidu a v prípade chimérického polypeptidu na základe sekvencie heterologického polypeptidu pomocou spôsobov dobre známych v tejto oblasti. Pozri napríklad Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Prínciples, W.H. Freeman aCo.,NY.

OMPlOó-odvodený polypeptid môže tiež byť vyrábaný v systéme génovej expresie, pričom sa expresuje rekombinantná nukleotidová konštrukcia obsahujúca sekvencie kódujúce OMPlOó-odvodené polypeptidy. Nukleotidové sekvencie kódujúce polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu byť použité syntetizované, a/alebo klonovanč, a expresované podľa techniky dobre známej odborníkom v tejto oblasti. Pozri napríklad Sambrook, a spol., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Diely 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY, Kapitola 9.

OMPlOó-odvodené polypeptidy podľa tohto vynálezu sa môžu frakcionizovať a čistiť pomocou aplikovania štandardnej čistiacej techniky proteínov, modifikovanej a aplikovanej v zhode so zisteniami a vysvetleniami opísanými v tomto dokumente. Konkrétne, výhodné OMP 106-polypeptidy podľa tohto vynálezu, teda tie, ktoré tvoria vonkajší-povrchový epitop pôvodného OMP106 polypeptidu, môžu byť izolované a čistené podľa afinitných opísaných postupov na izoláciu a čistenie OMP 106 polypeptidu (napríklad afinitne čistenie s použitím anti-OMP106 protilátok).

Ak sa to požaduje, polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu byť ďalej čistené s použitím štandardnej proteínovej alebo peptidovej čistiacej techniky vrátane, ale bez obmedzenia na ne, elektroforézy, centrifugácie, gélovej filtrácie, zrážania, dialýzy, chromatografie (vrátane ionovovýmennej chromatografie, afinitnej chromatografie, imunoadsorbentovej afinitnej chromatografie, vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie na obrátených fázach a gélovej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie), izoelektrickej fokusácie, a ich variácii a kombinácií.

Jedna alebo viaceré z týchto techník môžu byť použité sekvenčne v postupe vyvinutom na separovanie molekúl podľa ich fyzikálnych alebo chemických charakteristík. Tieto charakteristiky zahrnujú hydrofobicitu, náboj, schopnosť viazania a molekulovú hmotnosť proteínu. Rôzne frakcie materiálov získaných každou z techník sa testovali na ich schopnosť viazať OMP 106 receptor alebo ligand, viazať anti-OMP106 protilátky alebo interferovať s hemaglutináciou HA M. catarrbalis buniek („test“ aktivít). Tie frakcie, ktoré majú takúto aktivitu, sú potom podrobené nasledujúcej technike v sekvenčnom postupe, a nové frakcie sa znova testujú. Proces sa opakuje, kým nezostane len jedna frakcia, ktorá má opísané „testové“ aktivity a táto frakcia tvorí len jediný pás alebo jednotku, ak sa podrobí polyakrylamidovej gélovej elektroforéze alebo chromatografii.

5. OMP 106 imunogény a anti-OMP106 protilátky

Tento vynález poskytuje protilátky, ktoré špecificky viažu OMP 106 polypeptid alebo OMPlOó-odvodené polypeptidy. Na tvorbu takýchto protilátok sa používajú ako imunogény izolované alebo výhodne čistené preparáty OMP 106 polypeptidu alebo OMPlOó-odvodených polypeptidov.

V jednom uskutočnení sa OMP106 polypeptid separuje od iných vonkajších membránových proteínov prítomných v OG alebo sarkozylovom extrakte vonkajších membrán HA M. catarrhalis buniek alebo pľuzgierikov s použitím SDS-PAGE (pozri odstek 2) a gélové rezy obsahujúce OMP 106 polypeptid sa použili ako imunogén a injektovali sa králikom, aby sa vytvorili antiséra obsahujúce polyklonálne OMP 106 protilátky. Rovnaký imunogén sa môže použiť na imunizovanie myší na výrobu hybridémových línií, ktoré tvoria monoklonálne anti-OMP106 protilátky. V konkrétnych uskutočneniach sa ako imunogén použili PAG rezy obsahujúce izolované alebo čistené OMP 106 z niektorých kmeňov ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628. Vo výhodných uskutočneniach sa ako imunogén použili PAG rezy obsahujúce izolované alebo čistené OMP 106 z HA kultivarov takýchto kmeňov. Vo výhodnejšom uskutočnení sa ako imunogén použili PAG rezy obsahujúce izolované alebo čistené OMP 106 z HA kultivaru kmeňa ATCC 49143.

V ďalších uskutočneniach sa ako imunogén použili peptidové fragmenty OMP 106 polypeptidu. Výhodne sa použijú peptidové fragmenty čisteného OMP106 polypeptidu. Peptidy môžu byť produkované pomocou proteázovej digescie, chemického štiepenia izolovaného alebo čisteného OMP 106 polypeptidu, alebo chemickej syntézy, a potom môžu byť použité izolované alebo čistené. Takéto izolované alebo čistené peptidy sa môžu použiť priamo ako imunogény. V konkrétnych uskutočneniach, užitočné peptidové fragmenty zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, fragmenty, ktoré majú sekvenciu IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (Sekv. ID NO:1) alebo jej istá časť, teda 6 alebo viac aminokyselín za sebou. V ďalšom uskutočnení má peptidový fragment sekvenciu GTVLGGKK (Sekv. ID NO:2).

Užitočné imunogény môžu tiež obsahovať takéto peptidy alebo peptidové fragmenty konjugované na molekulu nosiča, výhodne nosičového proteínu. Nosičovými proteínmi môžu byť akékoľvek bežne používané v imunológii, vrátane, ale nie sú na ne obmedzené, bovinného sérového albumínu (BSA), kuracieho albumínu, „keyhole limpet“ hemokyanínu (KLH) a podobne. Diskusiu o hapténových proteínových konjugátoch, pozri napríklad, Hartlow, a spol., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, alebo štandardné imunologické učebnice, ako napríklad Roitt, I. a spol., IMMUNOLOGY, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1985) alebo Klein, J., IMMUNOLOGY, Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, MA, (1990).

V ešte ďalšom uskutočnení sa na produkciu protilátok, ktoré špecificky viažu jeden alebo viaceré vonkajších-povrchových epitopov pôvodného OMP106 polypeptidu, ako imunogén použili intaktné HA M. catarrhalis bunky alebo pľuzgieriky z nich pripravené. Bunky alebo pľuzgieriky môžu byť pred imunizáciou fixované s činidlami, ako sú napríklad formaldehyd alebo glutaldehyd. Pozri Harlow a Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, Kapitola 15. Je výhodné, ak takéto protilátky „proti celej bunke“ sú monoklonálne protilátky. Línie hybridómov produkujúce požadované monoklonálne protilátky sa môžu identifíkovať pomocou použitia čisteného OMP106 polypeptidu ako vyhľadávacieho ligandu. Bunky alebo pľuzgieriky nejakého M. catarrhalis kmeňa vrátane, ale bez obmedzenia na ne, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628 sú použité ako imunogén na indukovanie týchto protilátok. Výhodne sú použité ako imunogén, bunky alebo pľuzgieriky HA kultivaru takýchto kmeňov. Výhodnejšie sú ako imunogén na indukovanie týchto protilátok použité bunky alebo pľuzgieriky HA kultivaru kmeňa ATCC 49143.

Polyklonálne protilátky tvorené pri imunizáciách celými bunkami alebo pľuzgierikmi obsahujú protilátky, ktoré viažu inú M. catarrhalis vonkajšie membránové proteíny („neanti-OMP 106 protilátky“) a teda sú ťažkopádnejšie na použitie, kde je známe alebo podozrivé, že vzorka obsahuje iné M. catarrhalis vonkajšie membránové proteíny alebo materiály, ktoré sú krížovo reaktívne s týmito inými proteínmi vonkajších membrán. Za takýchto okolností, viazanie protilátkami typu „proti celej bunke“ danej vzorky alebo pása musí byť overené pomocou koincidenčného viazania rovnakej vzorky alebo pása protilátkami, ktoré špecificky viažu OMP106 polypeptid (napríklad, anti-OMP106) a/alebo OMPlOó-odvodený polypeptid, alebo konkurenčnými testami s použitím anti-OMP106 protilátok, OMP106 polypeptidu alebo OMP106-odvodeného polypeptidu ako konkurenčnej látky (t.j. prídavok anti-OMP106 protilátky, OMP106 polypeptidu alebo OMP106-odvodeného polypeptidu do reakčnej zmesi znižuje alebo odstraňuje viazanie vzorky protilátkami typu “proti celej bunke“). Alternatívne môžu takéto polyklonálne antiséra, obsahujúce neanti-OMP 106 protilátky, byť čistené od takýchto protilátok pomocou štandardných prístupov a spôsobov. Napríklad sa neanti-OMP 106 protilátky môžu odstrániť pomocou zrážania s bunkami NHA M. catarrhalis kultivarov alebo M. catarrhalis kmeňov známych tým, že nemajú OMP106 polypeptid (napríklad ATCC 8176, výhodnejšie NHA kultivar ATCC 49143); alebo pomocou absorpcie na stĺpce obsahujúce takéto bunky alebo proteíny vonkajších membrán takýchto buniek.

V ďalších uskutočneniach obsahujú užitočné imunogény na vyvolanie protilátok podľa tohto vynálezu zmesi dvoch alebo viacerých zo zmienených individuálnych imunogénov.

Imunizácia cicavcov s imunogénmi opísanými v tomto dokumente, výhodne ľudí, králikov, potkanov, myší, oviec, kôz, kráv alebo koní, sa uskutočňuje podľa postupov dobre známych odborníkom v tejto oblasti, na účely získania antiséra obsahujúceho polyklonálne protilátky alebo hybridómových línií vylučujúcich monoklonálne protilátky.

Monoklonálne protilátky sa môžu pripraviť pomocou štandardných techník, daných vysvetleniami obsiahnutými v tomto dokumente. Takéto techniky sú opísané napríklad v U.S. Patente č. 4,271,145 a U.S. Patente č. 4,196,265. Stručne povedané, živočích sa imunizuje s imunogénom. Hybridómy sa pripravujú pomocou fúzujúcich slezinových buniek imunizovaného živočícha s myelómovými bunkami. Produkty fúzie sa sledujú na zistenie buniek produkujúcich protilátky, ktoré sa viažu na imunogén. Pozitívne hybridómové klony sa odizolujú a z týchto klonov sa získajú monoklonálne protilátky.

Imunizačné režimy na produkciu tak polyklonálnych ako aj monoklonálnych protilátok sú dobre známe v tomto odbore. Imunogén sa môže injektovať niektorým z početných spôsobov, vrátane subkutánneho, intravenózneho, intraperitoneálneho, intradermálneho, intramuskulárneho, mukosálneho alebo ich kombinácie. Imunogén môže byť injektovaný v rozpustnej forme, agregátovej forme, spojený s fyzikálnym nosičom alebo zmiešaný s adjuvansom, s použitím spôsobov a materiálov dobre známych v tomto odbore. Antiséra a protilátky môže byť čistené s použitím kolónovej chromatografie, spôsobom dobre známym odborníkom v tomto odbore.

Podľa tohto vynálezu, OMP106 polypeptidy M. catarrhalis kmeňov, HA alebo NHA, sú imuno-krížovo reaktívne. Teda protilátky vzniknuté proti OMP106 polypeptidu jedného M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru špecificky viažu OMP106 polypeptid a OMP106-odvodené polypeptidy ďalších M. catarrhalis kmeňov a kultivarov. Napríklad polyklonálne anti-OMP106 protilátky indukované OMP106 polypeptidom kmeňa ATCC 49143 špecificky viažu nielen homologický OMP106 polypeptid (t. j. OMP106 polypeptid kmeňa ATCC 49143), ale tiež OMP106 polypeptid a/alebo OMP106-odvodené polypeptidy ďalších M. catarrhalis kmeňov vrátane, ale bez obmedzenia na ne, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240 a ATCC 25238.

Protilátky podľa tohto vynálezu, vrátane, ale bez obmedzenia na anti-OMP106 protilátky, sa môžu použiť na umožnenie izolácie a čistenia OMP106 polypeptidu a OMP106-odvodených polypeptidov. Protilátky sa môžu tiež použiť ako sondy na identifikovanie klonov v knižniciach expresie, ktoré majú vložené časti kódujúce OMP106 polypeptid alebo jeho fragmenty. Protilátky môžu tiež byť použité v imunoskúškach (napríklad ELISA, RIA, Westemové skúšky) na špecifické detegovanie a/alebo kvantifikáciu M. catarrhalis v biologických vzorkách. Anti-OMP106 protilátky podľa tohto vynálezu špecificky viažu OMP106 polypeptid a neviažu proteíny príbuzných bakteriálnych patogénov, ako sú napríklad Moraxella ovis, Moraxella lacunata, Maraxella osloensis, Moraxella bovis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae. Teda anti-OMP106 protilátky sa môžu použiť na diagnózu M. catarrhalis infekcie.

Protilátky podľa tohto vynálezu, konkrétne tie, ktoré sú cytotoxické, môžu byť tiež použité v pasívnej imunizácii na prevenciu alebo zoslabenie M. catarrhalis infekcie živočíchov, vrátane ľudí. (Ako sa používa v tomto dokumente, cytotoxickou protilátkou je tá, ktorá zvyšuje opsonizáciou a/alebo doplnkové usmrtenie baktérií naviazaných protilátkami). Účinná koncentrácia polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok vzniknutých proti imunogénom podľa tohto vynálezu môže byť podávaná hostiteľovi na dosiahnutie takýchto účinkov. Presná podávaná koncentrácia protilátky sa bude meniť podľa každého špecifického prípravku protilátky, ale môže byť určená s použitím štandardných techník dobre známych odborníkom v tomto odbore. Podávanie protilátky môže byť vykonané s použitím rôznych techník, vrátane, ale bez obmedzenia na ne, techník opísaných v odseku 6. na podávanie vakcín.

Profylaktické a terapeutické účinnosti protilátky podľa tohto vynálezu sa môžu určiť pomocou štandardných farmaceutických postupov na pokusných zvieratách. Údaje získané pri štúdiu na zvieratách sa môžu použiť pri určení rozsahu dávok na použitie u ľudí.

6. Vakcíny

Tento vynález tiež poskytuje terapeutické a profylaktické vakcíny proti M. catarrhalis infekciám živočíchov, vrátane cicavcov, a konkrétnejšie hlodavcov, primátov, a ľudí. Výhodné je použitie vakcín u ľudí. Vakcíny sa môžu pripraviť pomocou technik známych odborníkom v tejto oblasti a obsahovali by napríklad antigén vo forme imunogénu, farmaceutický prijateľný nosič, možno vhodný adjuvans, a možno iné materiály tradične sa vyskytujúce vo vakcínach. Imunologický účinné množstvo imunogénu, ktoré sa má použiť vo vakcíne, sa určuje prostriedkami známymi v tomto odbore, s hľadiska vysvetlení v tomto dokumente.

Vakcíny podľa tohto vynálezu obsahujú imunologický účinné množstvo niektorých imunogénov opísané v odseku 5. vo farmaceutický prijateľnom nosiči.

Podľa ďalšieho uskutočnenia, vakcíny podľa tohto vynálezu obsahujú imunologický účinné množstvo inaktivovaného alebo zoslabeného HA M. catarrhalis kultivaru alebo NHA M. catarrhalis kultivaru podľa tohto vynálezu. Inaktivovaný alebo zoslabený HA M. catarrhalis kultivar alebo NHA M. catarrhalis kultivar je získaný s použitím niektorého spôsobu známeho v tomto odbore vrátane, ale bez obmedzenia na ne, chemického opracovania (napríklad formalmom), tepelného opracovania a ožiarenia.

Pojem „imunologický účinné množstvo“ je použitý v tomto dokumente na označenie množstva dostatočného na vyvolanie imunitnej odozvy, ktorá môže zabrániť M. catarrhalis infekcii alebo zoslabiť silu už existujúcej alebo následnej M. catarrhalis infekcie. Presná koncentrácia bude závisieť od špecifického imunogénu, ktorý sa podáva, ale môže byť určená pomocou použitia štandardných techník dobre známych odborníkom v tejto oblasti pre skúšky vývoja imunitnej odozvy.

Užitočné polypeptidové imunogény zahrnujú izolovaný OMP106 polypeptid a OMPlOó-odvodené polypeptidy. Výhodné imunogény zahrnujú čistený OMP106 polypeptid a odvodené polypeptidy alebo peptidy OMP106. Spojeným imuno-génom a nosičom môže byť vodný roztok, emulzia alebo suspenzia. Všeobecne bude množstvo polypeptidového imunogénu medzi 0,1 a 500 mikrogramov na dávku. Nosiče sú známe odborníkom v tejto oblasti a zahrnujú stabilizátory, zrieďovadlá a pufre. Vhodné stabilizátory zahrnujú cukry; také ako sorbitol, laktóza, manitol, škrob, sacharóza, dextrán a glukóza a proteíny, také ako albumín alebo kazeín. Vhodné zrieďovadlá zahrnujú soľanku, Hanksove vyvážené soli a Rmgersov roztok. Vhodné pufre zahrnujú fosforečnan alkalického kovu, uhličitan alkalického kovu alebo uhličitan kovu alkalickej zeminy. Vakcína môže tiež obsahovať jeden alebo viaceré adjuvansy na zlepšenie alebo zvýšenie imunologickej odozvy. Vhodné adjuvansy zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, peptidy; hydroxid hlinitý; fosforečnan hlinitý; oxid hlinitý; zmes, ktorá pozostáva z minerálneho oleja, takého ako Marcol 52, alebo rastlinného oleja a jedného alebo viacerých emulzifikač ných činidiel, alebo povrchovo aktívnych látok, takých ako lyzolecitín, polykatióny, polyanióny; a potenciálne užitočné ľudské adjuvansy, také ako BCG a Corynebacterium parvume. Vakcína môže tiež obsahovať iné imunogény. Takáto koktailová vakcína má výhodu v tom, že imunita proti viacerým patogénom sa môže získať pomocou jediného podávania. Príklady ďalších imunogénov sú imunogény použité v známej DPT vakcíne.

Vakcíny podľa tohto vynálezu sa pripravujú pomocou techník známych odborníkom v tejto oblasti, daných vysvetleniami, ktoré obsahuje tento dokument. Všeobecne sa imunogén zmieša s nosičom, čím sa vytvorí roztok, suspenzia, alebo emulzia. Jedno alebo viaceré z diskutovaných aditív sa môže použiť v nosiči alebo môže byť pridané následne. Vakcinové preparáty môžu byť na účely uskladnenia vysušené, napríklad pomocou sušenia vymrazovaním. Ak je to tak, môžu byť následne rekonštituované do kvapalných vakcín prídavkom príslušného kvapalného nosiča.

Vakcíny sa podávajú ľuďom alebo iným cicavcom, vrátane hlodavcov a primátov. Môžu sa podávať v jednej alebo viacerých dávkach. Vakcíny môžu byť podávané známymi spôsobmi podávania. Na zavedenie tu opísaných vakcínových prípravkov môžu byť použité mnohé spôsoby. Tieto spôsoby zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, orálny, intradermálny, intramuskulámy, intraperitoneálny, intravenózny, subkutánny a intranasálny spôsob. Výhodnými spôsobmi sú intramuskuláma alebo subkutánna injekcia.

Vynález tiež poskytuje spôsob na indukovanie imunitnej odozvy na M. catarrhalis u cicavcov, aby sa cicavce ochránili proti infekcii a/alebo aby sa zmiernila choroba spôsobená M. catarrhalis. Tento spôsob zahrnuje podávanie imunologický účinného množstva imunogénov podľa tohto vynálezu hostiteľovi a výhodne podávanie hostiteľovi vakcín podľa tohto vynálezu.

7. Nukleové kyseliny kódujúce OMP106 polypeptid a OMPlOó-odvodené polypeptidy

Tento vynález tiež poskytuje nukleové kyseliny, DNA a RNA, kódujúce OMP106 polypeptid a OMPlOó-odvodené polypeptidy. V jednom aspekte môžu byť nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu syntetizované s použitím spôsobov známych v tomto odbore. Špecificky, časť alebo celá aminokyselinová sekvencia OMP106 polypeptidu alebo OMP 106-odvodeného polypeptidu môže byť určená s použitím techník dobre známych odborníkom v tomto odbore, takých ako pomocou Edmanovej degradačnej techniky (Pozri napríklad Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molccular Principles, W.H. Freeman & Co., N.M., str. 34 až 49). Získaná aminokyselinová sekvencia sa použije ako vodidlo pre syntézy DNA kódujúcej OMP 106 polypeptid alebo OMP 106-odvodený polypeptid s použitím konvenčných chemických prístupov alebo polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) amplifikácie prekrytých oligonukleotidov.

V ďalšom aspekte sa aminokyselinová sekvencia môže použiť ako vodidlo na syntézu oligonukleotidovej zmesi, ktorá naopak sa môže použiť na skríning OMP 106 polypeptid kódujúcej sekvencie v M. catarrhalis genomických knižniciach. Takéto knižnice môžu byť pripravené izolovaním DNA z buniek niektorého M. catarrhalis kmeňa. Výhodne DNA použitá ako zdroj OMP 106 polypeptid kódujúcej sekvencie, pre genomické knižnice aj na PCR amplifikáciu, je pripravená z buniek niektorého M. catarrhalis kmeňa vrátane, ale bez obmedzenia na ne, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628.

Pri príprave genomických knižníc sa DNA fragmenty generujú tak, že niektoré z nich budú kódovať časti alebo celý M. catarrhalis OMP106 polypeptid. DNA môže byť štiepená na špecifických miestach s použitím rôznych reštrikčných enzýmov. Alternatívne sa môže na fŕagmentovanie DNA použiť DN-áza v prítomnosti horčíka, alebo sa DNA môže fyzicky strihať, ako napríklad pôsobením ultrazvuku. DNA fragmenty sa potom môžu separovať podľa veľkosti pomocou štandardných techník, vrátane, ale bez obmedzenia na ne, agarózovej a polyakrylamidovej gélovej elektroforézy, kolónovej chromatografie a sacharózovej gradientovej centrifugácie. DNA fragmenty sa potom môžu vložiť do vhodných vektorov, vrátane ale bez obmedzenia na ne, plazmidov, kozmidov, bakteriofágov lambda alebo T₄, a kvasinkových umelých chromozómov (YAC). (Pozri napríklad Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2, vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Diel I, II.) Genomická knižnica môže byť sledovaná pomocou hybridizácie nukleovej kyseliny na označenú sondu (Benton a Davis, 1977, Science 196: 180; Grunstein a Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961).

Genomické knižnice môžu byť vyhľadávané s označeným degenerovaným oligonukleotidom zodpovedajúcim aminokyselinovej sekvencii niektorého peptidu OMP106 polypeptidu s použitím optimálnych prístupov dobre známych v tomto odbore. V konkrétnych uskutočneniach je skríningovou sondou degenerát oligonukleotidu, ktorý zodpovedá peptidu, ktorý má sekvenciu 1GISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNK1V (Sekv. ID NO:1) alebo jej podiel. V ďalšom uskutočnení ako skríningová sonda môže byť použitý degenerát oligonukleotidu, ktorý zodpovedá peptidu, ktorý má sekvenciu GTVLGGKK (Sekv. ID NO:2). V ďalšom uskutočnení sa ako sonda použili oligonukleotidy GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (Sekv. ID NO: 3) a

GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (Sekv. ID NO:7), každý zodpovedajúci OMP106 peptidu GTVLCGKK (Sekv. ID NO:2), V ďalších uskutočneniach môže byť ako sonda použitá sekvencia GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA (Sekv. ID NO:4) alebo jej fragmenty, alebo doplnky sekvencie, alebo fragmentov. Výhodné použité sondy majú 15 nukleotidov alebo sú dlhšie.

Klony v knižniciach s vloženým DNA kódujúcim OMP106 polypeptidom alebo ich fragmenty budú hybridizovať na jednu alebo viaceré z degenerátových oligonukleotidových sond. Hybridizácia takýchto oligonukleotidových sond na genomické knižnice sa uskutočňuje s použitím spôsobov známych v tomto odbore. Napríklad, hybridizácia s dvoma zmienenými oligonukleotidovými sondami môže byť uskutočnená v 2X SSC, 1,0 % SDS pri 50 °C a premytá s použitím rovnakých podmienok. V konkrétnom uskutočnení, ATCC 49143 DNA sekvenciou kódujúcou celý alebo časť OMP106 polypeptidu je HindlII reštrikčný fragment dĺžky asi 8000 bp alebo DRAI reštrikčný fragment dĺžky okolo 4200 bp.

V ešte ďalšom aspekte môžu klony nukleotidových sekvencii kódujúce časť alebo celý OMP106 polypeptid alebo OMP106-odvodené polypeptidy tiež byť získané pomocou skríningu M, catarrhalis knižníc expresie. Napríklad sa izoluje M, catarrhalis DNA a pripravia sa náhodné fragmenty a uskutoční sa ligácia na expresívny vektor (napríklad bakteriofág, plazmid, fágmid alebo kozmid) tak, že vložená sekvencia vo vektore je schopná expresie hostiteľskou bunkou, do ktorej sa vektor potom zavedie. Rôzne vyhľadávcie skúšky sa potom môžu použiť na výber expresovaných OMP106 polypeptidu alebo OMP106-odvodených polypeptidov. V jednom uskutočnení sa môžu použiť rôzne anti-OMP106 protilátky podľa tohto vynálezu (pozri odsek 5.) na identifikovanie požadovaných klonov s použitím spôsobov známych v tomto odbore. Pozri napríklad Harlow a Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Appendix IV. Klony alebo plaky z knižníc sa uviedli do kontaktu s protilátkami, čím sa identifikujú tie klony, ktorc sa viažu.

V jednom uskutočnení by kolónie alebo plaky obsahujúce DNA, ktorá kóduje OMP106 polypeptid alebo OMP106-odvodený polypeptid, mohli byť detegované s použitím DYŇA Beads podľa Olsvicka a spol., 29th ICAAC, Houston, Tex. 1989, ktorý je tu uvedený ako odkaz. Anti-OMP106 protilátky sú naviazané na tozylované DYŇA Beads M280, a tieto protilátky obsahujúce perličky by potom mohli byť použité na absorbovanie na kolónie alebo plaky s expresiou OMP106 polypeptidu alebo OMP106-odvodeného polypeptidu. Kolónie alebo plaky s expresiou OMP106 polypeptidu alebo OMP106-odvodených polypeptidov sa identifikujú ako niektoré z tých, ktoré sa viažu na perličky.

Alternatívne sa anti-OMP106 protilátky môžu nešpecifický imobilizovať na vhodný nosič, taký ako silikagél alebo živicu Celit™. Tento materiál by potom mal byť použitý na adsorbovanie bakteriálnych kolónií s expresiou OMP106 polypeptidu alebo ΟΜΡΙΟΰ-odvodeného polypeptidu, ako je opísané v predchádzajúcom paragrafe.

V ďalšom aspekte sa môže použiť PCR amplifikácia na výrobu v podstate čistej DNA kódujúcej časti alebo celý OMP106 polypeptid M. catarrhalis genomickej DNA. Oligonukleotidové primery, degeneráty alebo nie, zodpovedajúce známej OMP106 polypeptidovej sekvencii, sa môžu použiť ako primery. V konkrétnych uskutočneniach môžu byť použité ako 5' primer, oligonukleotid, degenerát alebo nie, kódujúci peptid IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (Sekv. ID NO:1) alebo jeho časť. Napríklad 5' primerom môže byť nukleotidová sekvencia GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAA-ATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA (Sekv. ID NO:4) alebo tej časť. Nukleotidové sekvencie, degeneráty alebo nie, ktoré sú reverznými doplnkami sekvencia kódujúcej GTVLGGKK (Sekv. ID NO:2) môžu byť použité ako 3' primer. Napríklad oligonukleotid, degenerát alebo nie, ktorý má degenerátovú nukleotidovú sekvenciu YTTYTTNCCNCCNAGNACNCTNCC (Sekv. ID NO:6) alebo YTTYTTNCCNCCYAANACNGTNCC (Sekv. JD NO:8), môže byť použitý ako 3’ primer v spojení s rôznymi 5' diskutovanými primermi.

PCR sa môže vykonať, napríklad použitím Perkin-Elmer Cetus tepelného cyklovača a Taq polymerázy (Gene Amp™). Na použitie v PCR reakciách si možno vybrať syntézu viacerých rôznych degenerátových primerov. Je tiež možné meniť zviazanosť hybridizačných podmienok použitých v podkladových PCR reakciách, aby sa umožnil väčší alebo menší stupeň podobnosti nukleotidovej sekvencie medzi degenerátovými primermi a zodpovedajúcimi sekvenciami v M. catarrhalis DNA. Po úspešnom zosilnení segmentu sekvencie kódujúcej OMP106 polypeptid, môže tento segment byť molekulovo klonovaný a sekvenovaný, a použitý ako sonda na izolovanie úplného genomického klonu. To bude zas dovoľovať určenie génovo úplnej

SK 284812 Β6 nukleotidovej sekvencie, analýzy jej expresie, a výroby jej proteínového produktu na funkčnú analýzu, ako je opísané. Keď už bola OMP106 polypeptid kódujúca sekvencia izolovaná z jedného M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru, je možné použiť rovnaký prístup na izolovanie OMP 106 polypeptid kódujúcej sekvencie iných M. catarrhalis kmeňov a kultivarov. Odborník v tejto oblasti rozpozná, že DNA alebo RNA sekvencia kódujúca OMP106 polypeptid (alebo jeho fragmenty) podľa tohto vynálezu sa môžu použiť na získanie iných DNA alebo RNA sekvencii, ktoré s ňou hybridizujú za podmienok vedúcich k vysokej prísnosti, s použitím všeobecnej techniky známej v tomto odbore. Hybridizácia s OMP106 sekvenciou z jedného M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru za podmienok vysokej prísnosti bude identifikovať zodpovedajúcu sekvenciu z iných kmeňov a kultivarov. Podmienky vysokej prísnosti sa menia s dĺžkou sondy a zložením báz. Vzorce na určenie takýchto podmienok sú dobre známe v tomto odbore. Pozri Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, Kapitola 11. V tomto dokumente sa používa pojem podmienky vysokej prísnosti hybridizácie ako aplikovaný na sondu väčšiu než 300 báz do dĺžky, vrátane konečného premytia v 0,1 X SSC/0,1% SDS pri 68 °C počas najmenej 1 hodiny (Ausubel, a spol., Eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Diel I, Greene Publishing Associates, Inc. a John Wiley & Sons, Inc., New York, na strane 2.10.3). V konkrétnych uskutočneniach je vysoko ostrým premytím v hybridizácii s použitím sondy, ktorá má sekvenciu Sekv. ID NO:4 alebo jej doplnok, 2X SSC, 1% SDS pri 50 °C počas asi 20 až asi 30 minút.

Odborník v tomto odbore by mal byť schopný identifikovať úplné klony OMP106 polypeptid kódujúcej sekvencie s použitím prístupov dobre známych v tomto odbore. Rozsah OMP106 polypeptid kódujúcej sekvencie obsiahnutý v izolovanom klone môže byť zistený sekvenovaním klonovanej vloženej časti a porovnaním dedukovanej veľkosti polypeptidu kódovaného otvorenými čítacími rámcami (ORF) s veľkosťou OMP106 polypeptidu a/alebo porovnaním dedukovanej aminokyselinovej sekvencie so známou aminokyselinovou sekvenciou čisteného OMP106 polypeptidu. Ak má byť izolovaný čiastkový kloň OMP106 polypeptid kódujúcej sekvencie, môžu sa izolovať úplné klony s použitím vloženej časti čiastkového klonu ako hybridizačnej sondy. Alternatívne sa môže rekonštruovať úplná OMP106 polypeptid kódujúca sekvencia z prekrytých čiastkových klonov pomocou spojenia ich vložených častí. Úplnými klonmi môžu byť tie, ktoré majú ORF s dedukovanou aminokyselinovou sekvenciou zodpovedajúcou sekvencii OMP106 polypeptidu, alebo ak nie je dostupná úplná aminokyselinová sekvencia tohto peptidu, sekvencii peptidového fragmentu OMP106 polypeptidu a má molekulovú hmotnosť zodpovedajúcu hmotnosti OMP106 polypeptidu. Ďalej sa úplné klony môžu identifikovať podľa schopnosti ich vložených častí, keď sú umiestnené v expresívnom vektore, produkovať polypeptid, ktorý viaže protilátky špecifické na amino-zakončcnic OMP106 polypeptidu a protilátky špecifické na karboxylové-zakončenie OMP106 polypeptidu.

Sekvencie nukleových kyselín kódujúce OMP 106-odvodené polypeptidy môžu byť produkované pomocou spôsobov dobre známych v tomto odbore. V jednom aspekte môžu byť sekvencie kódujúce OMPlOó-odvodené polypeptidy získané z OMP106 polypeptid kódujúcej sekvencie pomocou metód rekombinantnej DNA /.hľadiska vysvetlení opísaných v tomto dokumente. Napríklad, kódujúce sekvencie OMP106 polypeptidu môžu byť menené, pričom tvoria aminokyselinové substitúcie, čo nebude pôsobiť na imunogenicitu OMP106 polypeptidu, alebo to môže zvýšiť jeho imunogenicitu. Môžu sa použiť rôzne spôsoby, vrátane ale bez obmedzenia na ne, na oligonukleotid namierenej, miestne špecifickej mutagenézy. Tieto a iné techniky známe v tomto odbore môžu byť použité na tvorbu jednoduchých alebo násobných mutácií, takých ako nahradenia, inzercie, delécie a transpozície, ako je opísané v Botstein a Shortle, 1985, Science 229: 1193 až 1210.

Ďalej môžu byť DNA OMP106 polypeptid kódujúce sekvencie odrezané pomocou reštrikčnej enzýmovej alebo exonukleázovej digescie. Heterologické kódujúce sekvencie môžu byť pridané k OMP 106 polypeptid kódujúcej sekvencii pomocou ligácie alebo PCR amplifikácie. Navyše, DNA kódovanie celého alebo časti OMP-odvodeného polypeptidu môže byť syntetizované chemicky alebo s použitím PCR amplifikácie založenej na známej alebo dedukovanej aminokyselinovej sekvencii OMP106 polypeptidu a požadovaných alternácií tejto sekvencie.

Identifikované a izolované DNA obsahujúce OMP106 polypeptid alebo OMP106-odvodený polypeptid kódujúce sekvencie sa môžu vložiť do príslušného klonujúceho vektora. Môže sa použiť veľký počet systémov vektor-hostiteľ známych v tomto odbore. Možné vektory zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, plazmidy alebo modifikované vírusy, ale vektorový systém musí byť kompatibilný s použitou hostiteľskou bunkou. Takéto vektory zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, bakteriofágy, také ako lambda deriváty, alebo plazmidy, ako napríklad pBR322 alebo pUC plazmidové deriváty. Inzercia do klonujúceho vektora sa môže uskutočniť napríklad pomocou ligácie DNA fragmentu do klonujúceho vektora, ktorý má komplementárne kohézne zakončenia. Ak však komplementárne reštrikčné miesta použité na fragment DNA nie sú prítomné v klonujúcom vektore, konce DNA molekúl môžu byť enzymaticky modifikované. Alternatívne sa môže vytvoriť akékoľvek požadované miesto pomocou ligácie nukleotidovej sekvencie (spojky) na DNA zakončenia; tieto ligované spojky môžu obsahovať špecifické chemicky syntetizované oligonukleotidy kódujúce reštrikčné endonukleázové rozpoznávacie sekvencie. V alternatívnom spôsobe sa štiepená DNA môže modifikovať pomocou homopolymémeho zakončovania. Rekombinantné molekuly sa môžu zaviesť do hostiteľskej bunky pomocou transformácie, transfekcie, infekcie, elektroporácie atď., takže sa generujú mnohé kópie génovej sekvencie.

V alternatívnom spôsobe sa môže požadovaná DNA obsahujúca OMP 106 polypeptid alebo OMPlOô-odvodený polypeptid kódujúcu sekvenciu identifikovať a izolovať po vložení do vhodného klonujúceho vektora s použitím „shotgun“ prístupu. Obohatenie požadovanou sekvenciou, napríklad pomocou frakcionizácie podľa veľkosti, sa môže urobiť pred vložením do klonujúceho vektora.

V špecifických uskutočneniach umožňuje transformácia hostiteľskej bunky s rekombinantnými DNA molekulami, ktoré obsahujú OMP106 polypeptid alebo OMP106-odvodený polypeptid kódujúce sekvencie, generovanie násobných kópií takejto kódujúcej sekvencie. Teda, kódujúca sekvencia môže byť získaná vo veľkých množstvách pestovaním transformantov, izolovaním molekúl rekombinantnej DNA z transformantov a ak je to potrebné, vyberaním vloženej kódujúcej sekvencie z izolovanej rekombinantnej DNA.

8. Rekombinantná produkcia OMP106 polypeptidu a OMP106-odvodených poly-peptidov

OMP106 polypeptid a OMPlOó-odvodené polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu byť produkované pomocou techniky genetického inžinierstva. V tom prípade sú produkované pomocou vhodnej hostiteľskej bunky, ktorá bola transformovaná s DNA, ktorá kóduje tento polypeptid. Nukleotidové sekvencie kódujúce OMP106 polypeptid alebo OMPlOó-odvodené polypeptidy podľa tohto vynálezu sa môžu vložiť do vhodného expresívneho vektora, t.j. vektora, ktorý obsahuje potrebné prvky na transkripciu a transláciu vloženej polypeptid-kódujúcej sekvencie. Nukleotidové sekvencie kódujúce OMP106 polypeptid alebo OMP106-odvodené polypeptidy sa vložia do vektorov takým spôsobom, že za vhodných podmienok bude prebiehať expresia (napríklad vo vhodnej orientácii a správnom čítacom rámci a s vhodnými sekvenciami expresie, vrátane sekvencie viazania RNA polymerázy a ribozomálne sekvencie viazania).

Na expresiu polypeptid-kódujúcej sekvencie sa môžu použiť rôzne systémy hostiteľ-vektor. Tieto zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, bunkové systémy cicavcov infikované s vírusom (napríklad vírusom kravských kiahní, adenovírusom atď.); bunkové systémy hmyzu infikované s vírusom (napríklad tyčinkovým vírusom); mikroorganizmy, ako sú napríklad kvasinky obsahujúce kvasinkové vektory, alebo baktérie transformované s bakteriofágovou DNA, plazmidovou DNA alebo kozmidovou DNA. Výhodne je hostiteľskou bunkou baktéria, a najvýhodnejšie je baktériou E. coli, B. subtilis alebo Salmonella.

Prvky expresie vektorov sa menia podľa ich sily a špecifických vlastností. V závislosti od použitého systému hostiteľ-vektor sa môže použiť ktorýkoľvek z početných vhodných transkripčných a translačných prvkov. V špecifickom uskutočnení prebieha expresia chimérického proteínu obsahujúceho sekvenciu OMP 106 polypeptidu alebo OMP106-odvodeného polypeptidu a pre a/alebo pro sekvenciu hostiteľskej bunky. V iných špecifických uskutočneniach prebieha expresia chimérického proteínu obsahujúceho sekvenciu OMP 106 polypeptidu alebo OMP 106-odvodeného polypeptidu a peptid afmitného čistenia. V ďalších špecifických uskutočneniach prebieha expresia chimérického proteínu obsahujúceho sekvenciu OMP 106 polypeptidu alebo OMP106-odvodeného polypeptidu a užitočného imunogénneho peptidu alebo polypeptidu. Vo výhodných uskutočneniach, OMP 106-odvodený polypeptid, ktorého expresia prebieha, obsahuje sekvenciu tvoriacu buď vonkajší-povrchový epitope alebo oblasť viazania receptora pôvodného OMP 106 polypeptidu.

Na konštrukciu expresívnych vektorov obsahujúcich chimérický gén pozostávajúci z vhodných transkripčných/translačných riadiacich signálov a polypeptid kódujúcej sekvencie, sa môže použiť akákoľvek metóda známa v tomto odbore na vloženie DNA fragmentov do vektora. Tieto spôsoby môžu zahrnovať in vitro rekombinantnú DNA a techniky syntézy a in vivo rekombinanty (genetická rekombinácia). Expresia sekvencie nukleovej kyseliny kódujúca OMP106 polypeptid alebo OMP 106-odvodený polypeptid môže byť regulovaná druhou sekvenciou nukleovej kyseliny tak, že vložená sekvencia je expresovaná v hostiteľovi transformovanom s rekombinantnou DNA molekulou. Napríklad expresia vloženej sekvencie sa môže riadiť pomocou nejakého prvku promótor/zosilňovač, známeho v tomto odbore. Promótory, ktoré sa môžu použiť na riadenie expresie vložených sekvencií zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, SV40 prvotnú promótorovú oblasť (Bernoist a Chambon, 1981, Náture 290: 304 až 310), promótor obsiahnutý v 3' dlhej terminálnej replikách vírusu Rousov ho sarkómu (Yamamoto a spol., 1980, Celí 22: 787 až 797), herpes tymidín kinázový promótor (Wagner a spol., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441 až 1445), regulačné sekvencie metalotioneínového génu (Brinster a spol., 1982, Náture 296: 39 až 42) na expresiu v bunkách živočíchov; promótory β-laktamázy (Villa-Kamaroff a spol., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727 až 3731), tac (DeBoer a spol., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21 až 25), Ž.P_L, alebo tre na expresiu v bakteriálnych bunkách (Pozri tiež Useful proteins trom recombinant bacteria v Scientific Američan, 1980, 242: 74 až 94); promótorova oblasť nopalínovej syntetázy alebo 35S RNA promótor vírusu karfiolovej mozaiky (Gardner a spol., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871), a promótor fotosyntetického enzýmu ribulóza bifosfát-karboxyláza (Herrera-Estrella a spol., 1984, Náture 310: 115 až 120) na expresiu implantátových buniek; promótorové prvky z kvasiniek alebo iných húb, ako napríklad Gal4 promótor, ADC (alkoholdehydrogenáza) promótor, PGK (fosfoglycerolkináza) promótor, promótor alkalickej fosfatázy.

Expresívne vektory obsahujúce OMP 106 polypeptid alebo OMP 106-odvodený polypeptid kódujúcej sekvencie sa môžu identifikovať pomocou troch všeobecných prístupov: (a) Hybridizácia nukleovej kyseliny, (b) prítomnosť alebo neprítomnosť „markerových“ génových funkčných častí a (c) expresia vložených sekvencií. V prvom prístupe môže byť prítomnosť cudzieho génu vloženého v expresívnom vektore detegovaná pomocou hybridizácie nukleovej kyseliny s použitím sond obsahujúcich sekvencie, ktoré sú homologické ku vloženým OMP 106 polypeptid alebo OMP 106-odvodený polypeptid kódujúcim sekvenciám. V druhom prístupe sa môže systém rekombinantný vektor/hostiteľ identifikovať a vybrať na základe prítomnosti alebo neprítomnosti určitých markerových génových funkčných častí (napríklad aktivita tymidíninkinázy, rezistencie ku antibiotikám, transformácia fenotypu, oklúzia tvorby tela pri tyčinkovom víruse, atď.) spôsobených inzerciou cudzích génov do vektora. Napríklad, ak je OMP 106 polypeptid alebo OMP 106-odvodený polypeptid kódujúca sekvencia vložená v rámci markerovej génovej sekvencie vektora, rekombinanty obsahujúce vloženú časť sa môžu identifíkovať pomocou neprítomnosti markerovej génovej funkčnej časti. V treťom prístupe sa rekombinantné expresívne vektory môžu identifikovať pomocou skúmania produktu cudzieho génu expresovaného rekombinantom. Takéto skúšky môžu byť založené napríklad na fyzikálnych alebo funkčných vlastnostiach OMP 106 polypeptidu alebo ΟΜΡΙΟδ-odvodeného polypeptidu v in vitro skúšobných systémoch, napríklad viazanie na OMP 106 ligand alebo receptor, alebo viazanie s anti-OMP106 protilátkami podľa tohto vynálezu, alebo schopnosti hostiteľskej bunky zrážať krvinky alebo schopnosti bunkového extraktu interferovať s hemaglutináciu s M. catarrhalis.

Keď je určitá rekombinantná DNA molekula identifikovaná a izolovaná, môžu sa na jej propagáciu použiť viaceré spôsoby známe v tomto odbore. Keď sú určené vhodný hostiteľský systém a podmienky rastu, rekombinantné expresívne vektory sa môžu propagovať a pripraviť vo veľkom množstve. Ako je vysvetlené, expresívne vektory , ktoré sa môžu použiť, zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, nasledujúce vektory alebo ich deriváty: ľudské alebo zvieracie vírusy, ako sú napríklad vírus kravských kiahní alebo adenovírus; vírusy hmyzu, ako napríklad tyčinkový vírus; kvasinkové vektory; bakteriofágové vektory (napríklad lambda), a plazmidové a kozmidové DNA vektory, aby sme pár menovali.

Okrem toho, kmeň hostiteľskej bunky môže byť vybra

SK 284812 Β6 ný taký, aby moduloval expresiu vložených sekvencii, alebo modifikoval a upravil génový produkt špecifickým požadovaným spôsobom. Expresia určitých promótorov sa môže zvýšiť v prítomnosti určitých indukovadiel; teda expresia geneticky manipulovaného OMP106 polypeptidu alebo OMPlOó-odvodeného polypeptidu sa môže riadiť. Ďalej, rôzne hostiteľské bunky majú charakteristické a špecifické mechanizmy na translačné a post-translačné upravenie a modifikáciu proteínov. Vhodné bunkové línie alebo hostiteľské systémy sa môžu vybrať tak, aby zabezpečili požadovanú modifikáciu a upravenie cudzieho proteínu expresie.

9. Činidlá

Polypeptidy, peptidy, protilátky a nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu sú užitočné ako činidlá pre klinické alebo lekárske diagnózy M. catarrhalis infekcii a na vedecký výskum vlastností patogenity, virulencie a infekčnosti M. catarrhalis, ako aj obranných mechanizmov hostiteľa. Napríklad sa môže DNA a RNA podľa tohto vynálezu použiť ako sondy na identifikovanie prítomnosti M. catarrhalis v biologických vzorkách pomocou hybridizácie alebo PCR amplifikácie. DNA a RNA môže tiež byť použitá na identifikovanie iných baktérií, ktoré by mohli kódovať polypeptid spojený s M. catarrhalis OMP 106.

Tieto polypeptidy a peptidy podľa tohto vynálezu môžu byť použité na prípravu polyklonálnych a monoklonálnych protilátok, ktoré sa môžu použiť na ďalšie čistenie zmesí obsahujúcich polypeptidy podľa tohto vynálezu pomocou afinitnej chromatografie. Tieto polypeptidy a peptidy môžu tiež byť použité v štandardných imunoskúškach na vyhľadávanie prítomnosti protilátok pre M. catarrhalis vo vzorke.

Je treba rozumieť, že rozšírenie vysvetlení tohto vynálezu na špecifický problém alebo okolie bude v schopnostiach toho, kto má obvyklé skúsenosti v tomto odbore v svetle vysvetlení obsiahnutých v tomto dokumente. Príklady produktov podľa tohto vynálezu a spôsobov ich prípravy a použitia sú uvedené v nasledujúcom príklade.

Tento vynález sa môže úplne porozumieť pomocou nasledujúcich neobmedzujúcich príkladov špecifických uskutočnení vynálezu a priložených obrázkov.

Definície a skratky anti-OMP106 = anti-OMP106 polypeptidová protilátka alebo antisérum

ATCC pľuzgieriky

Gb₄

HA imuno-reaktívny kD

M. catarrhalis

NHA

OG

OMP 106 = Američan Type Culture Collection = prirodzene sa vyskytujúce mechúriky vonkajšej membrány M. catarrhalis = GalNAc31-3Galal-4Gaipi-4Glcl-lCeramide = hemaglutinácia = schopný vyvolať bunkovú alebo humorálnu imunitnú odozvu = kilodaltony = Mc;

Moraxella catarrhalis;

Moraxella (Branhamella) catarrhalis; Branhamella catarrhalis;

Neisseria catarralis; alebo Micrococcus catarrhalis = ne-hemaglutinácia = n-oktyl-P-D-glukopyranozid alebo oktylglukozid = Vonkajší membránový proteín-106 polypeptid

Moraxella catarrhalis, ktorý má molekulovú hmotnosť okolo 180 kD až 230 kD podľa SDS-PAGE; extrahovateľné z
OMP106-odvo-	pľuzgierikov alebo intaktných buniek M. catarrhalis pomocou OG alebo sarkozylového detergentu
dený polypeptid	= fragment OMP 106 polypeptidu; variant divokého typu OMP106 polypeptidu alebo jeho fragmentu, obsahujúceho jeden alebo viaceré aminkyselinové delécie, inzercie alebo substitúcie; alebo chimérický proteín obsahujúci heterologický polypeptid naviazaný na C-terminál alebo N-terminál, alebo vnútorný segment celého alebo časti OMP 106 polypeptidu
OMP	= proteín vonkajšej membrány
OMPs	= proteíny vonkajšej membrány
PBS	= fosfátom pufŕovaná soľanka
PAG	= polyakrylamidový gél
polypeptid	= peptid akejkoľvek dĺžky, výhodne taký, ktorý má desať alebo viac aminokyselinových zvyškov
SDS	= dodecylsulfát sodný
SDS-PAGE	= gélová elektroforéza na sodnom dodecylsulfát polyakrylamide

Sekvencie nukleotidu alebo nukleovej kyseliny definované v tomto dokumente sú prestavované pomocou jednopísmenových symbolov báz nasledujúcim spôsobom: A(adenín) C (cytosín) G (guán ín) T (tymín)

U (uracil)

M (A alebo C) R (A alebo G) W (A alebo T/U) S (C alebo G)

Y (C alebo T/U) K (G alebo T/U)

V (A alebo C, alebo G; nie T/U) H (A alebo C, alebo T/U; nie G) D (A alebo G, alebo T/U; nie C) B (C alebo G, alebo T/U; nie A)

N (A alebo C, alebo G, alebo T/U) alebo (neznáma)

Peptid a polypeptidová sekvencia definovaná v tomto dokumente sú predstavované pomocou jednopísmenových symbolov aminokyselinových zvyškov nasledujúcim spôsobom:

A (alanín)

R(arginín)

N (asparagín)

D (kyselina asparágová)

C (cystein)

Q (glutamín)

E (kyselina glutámová)

G(glycín) H (histidín) I (izoleucín) L (leucín) K (lyzín) M (metionín) F (fenylalanín) P (prolín) S (serín)

T (treonín) w (tryptofán)

Y (tyrozín)

V (valín)

X (neznáma)

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1: Porovnanie denaturačných PAGE profilov proteínov vonkajšej membrány M. catarrhalis mechúrikov alebo oktylglukozidových (OG) extraktov celej bunky M catarrhalis. Čísla nad pruhmi zodpovedajú označeniam ATCC kmeňov. Predfarbený SDS-PAGE štandard (BioRad katalóg # 161-0305) bol použitý ako markery molekulovej hmotnosti. Štandard pozostával z nasledujúcich polypeptidov s ich približnou molekulovou hmotnosťou uvedenou v zátvorkách: králičia svalová fosforyláza B (106 kD); bovinný sérový albumín (80 kD); ovalbumín bielka slepačích vajec (49,5 kD); teľacia uhličitá anhydráza (32,5 kD); sójový trypsínový inhibítor (27,5 kD); lyzozým bielka slepačích vajec (18,5 kD). Pozície markerov molekulovej hmotnosti v géli sú uvedené na ľavej strane nákresu pomocou šípiek s molekulovými hmotnosťami (kD) niektorých markerov nad šípkami.

Obr. 2: Výsledky z prekrytých tenkovrstvových chromatogramov glykolipidov s ¹²⁵I-označenými pľuzgierikmi vonkajších membrán. Na paneloch A-C pruh 1 obsahuje glykolipidové štandardy vyznačené vľavo; pruh 2 obsahuje asialo-GM]; pruh 3 obsahuje Gb3, Gb4, a Forssmanov antigén; a pruh 4 obsahuje Folchovú extrakciu ľudských erytrocytov. Chromatogram ukázaný na paneli A je vyfarbený s orcinolom, chromatogram ukázaný na paneli B je prevrstvený s ^l25I-označenými pľuzgierikmi ATCC kmeňa 8176 (nehemaglutinačný kmeň), a chromatogram ukázaný na paneli C je prevrstvený s ¹²⁵l-označeným pľuzgierikmi ATCC kmeňa 49143 (hemaglutinačný kmeň). Viazal sa len hemaglutinačný kmeň na Gb4 glykolipídovú zónu v treťom a štvrtom pruhu.

Obr.3: Proteínové profily pomocou vyfarbenia striebrom oktylglukozidových extraktov proteínov vonkajších membrán po digescii M. catarrhalis bunky s proteázami vyznačenými na obrázku. Hemaglutinačná aktivita bunky po digescii je vyznačená pod obrázkom v riadku označenom HA. Použili sa markery molekulovej hmotnosti ako pre obr. 1.

Obr. 4: Porovnanie proteínových profilov pomocou vyfarbenia striebrom proteínov vonkajších membrán z rôznych ATCC kmeňov M. catarrhalis. Označenia kmeňov sú vyznačené nad pruhmi. Hemaglutinačné aktivity kmeňov sú vyznačené v riadku označenom HA pod obrázkom. Treba poznamenať, že proteín, ktorý má zdanlivú molekulovú hmotnosť väčšiu, ako je molekulová hmotnosť králičej svalovej fosforylázy B (106 kD), je bežný pre hemaglutinačné kmene, ale je neprítomný pri nehemaglutinačných kmeňoch. Tento polypeptid je označovaný OMP106. Markery molekulovej hmotnosti sa použili ako pre obr. 1.

Obr. 5: Porovnanie proteínových profilov pomocou vyfarbenia striebrom proteínov vonkajších membrán z dvoch M. catarrhalis ATCC 49143 kultivarov: 49143 (hemaglutinačný kultivar) a 49143-NHA (nehemaglutinačný kultivar). Hemaglutinačné aktivity kultivarov sú vyznačené pod obrázkom v riadku označenom HA. Treba si všimnúť neprítomnosť OMP106 polypeptidového pásu (vyznačené pomocou <) v nehemaglutinačnom kultivare. Markery molekulovej hmotnosti sa použili ako pre obr. 1.

Obr. 6: Určenie molekulovej hmotnosti OMP106 na 6 % hmotnostných denaturačnom polyakrylamidovom géli s použitím OG extraktov ATCC kmeňa 49143, ktoré boli inkubované vo vzorkovacom pufri buď pri 25 °C alebo 100 °C pred aplikáciou na gél. Proteíny v géli sa vizualizovali pomocou redukčného vyfarbenia striebrom. Treba si poznamenať, že OMP106 polypeptidový pás (vyznačené pomocou <) je vidno len vo vzorke inkubovanej pri 100 °C. Sirokorozsahový SDS-PAGE štandard (BioRad katalóg # 161-0317) bol použitý ako markery molekulovej hmotnosti. Štandard pozostával z nasledujúcich polypeptidov (približná molekulová hmotnosť je poznamenaná v zátvorkách): králičí skeletálny svalový myozín (200 kD); E. coli β-galaktozidáza (116 kD); králičia svalová fosforyláza B (97,4 kD); bovinný sérový albumín (66,2 kD). Polohy markerov molekulovej hmotnosti v géli sú zaznamenané na pravej strane obrázka pomocou šípok s molekulovými hmotnosťami (kD) markerov nad šípkami.

Obr. 7: Southemova škvmová analýza Dral a Hindlll výluhu reštrikčnej endonukleázy M. catarrhalis chromozomálnej DNA skúšanej s Mc5-72. DNA M. catarrhalis kmeňa 49143 sa digeroval s Dral alebo Hindlll. Southemova analýza vyluhovanej DNA sa uskutočnila použitím Mc5-72 (Sekv. ID NO:4) ako sondy. Vysoko presným oplachom bol 2X SSC, 1% hmotnostné SDS pri 50 °C počas asi 20 až asi 30 minút. Pruh 1 obsahuje Hindlll výluh; hybridizačný pás má približnú veľkosť 8,0 kB. Pruh 2 obsahuje Dral výluh: hybridizačný pás má približnú veľkosť 4,2 kB.

Obr. 8A a 8B: Westemové škvrny proteínových extraktov M. catarrhalis a príbuzných látok s použitím králičieho antiséra na OMP106 ako sondy (obr. 8A), porovnané s reaktivitou séra pred imunizáciou králika s OMP106 (obr. 8B). Vzorky v pruhoch obrázkov 8A a 8B sú takéto: pruh A, M. catarrhalis; pruh B, Moraxella ovis; pruh C, Moraxella lacunata; pruh D, Moraxella osloensis; pruh E, Moraxella bovis; pruh F, Neisseria meningitidis; pruh G, Neisseria gonorrhoeae. Markery molekulovej hmotnosti sa použili ako pre obr. 1.

Obr. 9A. Westemová škvrna demonštrujúca, že králičie antisérum na OMP106 polypeptid M. catarrhalis ATCC 49143 krížovo reaguje s polypeptidom podobnej molekulovej hmotnosti v početných HA a NHA kmeňov M. catarrhalis (umiestnenie OMP106 polypeptidu je vyznačené pomocou šípky). Westemovo boli preskúmané oktylglukozidové extrakty rôznych M. catarrhalis kmeňov. ATCC prírastkové čísla kmeňov sú vyznačené na vrchole pruhov. Použité postupy prenosu a Westemových škvŕn boli identické na postupy použité na získanie škvŕn ukázané na obr. 8.

Obr. 9B. Westemové škvrny rovnakých extraktov ako na obr. 9A s použitím pred-imunitného séra zodpovedajúceho séru použitému na obr. 9A.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia a charakterizácia OMP106 polypeptidu a génu kódujúceho tento polypeptid kmeňa ATCC 49143 alebo iných kmeňov

Materiál a spôsoby

A. Hemaglutinačná skúška

Hemaglutinácia s M. catarrhalis sa testovala tak, ako je opísané Soto-Hemandez a spol. (J. Clin. Microbiol. 27: 903 - 908) s výnimkou, že sa použilo 5 % objemových, namiesto 3 % objemových erytrocytov v aglutinačnej skúške na sklíčku. Počiatočné hcmaglutinačné skúšky sa vykonávali s použitím 20 pg bakteriálnych buniek (vlhká hmotnosť). Pretože M. catarrhalis ATCC kmeň 49143 pestovaný na platniach krvného agaru pri 35 °C poskytol silnú hemaglutinačnú reakciu, vybral sa ako porovnávací kmeň. Sériovo zriedený ATCC kmeň 49143 v 1:2 zriedeniach viedol k poklesu hemaglutinačnej reakcie. Skóre od ++++ do + boli založené na hemaglutinácii pozorovanej pre ATCC kmeň 49143 po sériových 1:2 zriedeniach tak, že + reakciu spôsobilo použitie 1/4 počtu buniek požadovaných na dosiahnutie +++ reakcie.

B. Inhibícia hemaglutinácie

Suspenzia M. catarrhalis ATCC 49143 buniek bola sériovo zriedená 1 : 2, a zriedenie, ktoré poskytlo + hemaglutinačnú reakciu pri 7 μΐ Dulbeccovej fosfátom pufrovanej soľanky a 7 μΐ 5 % (objemových) ľudských O⁺ erytrocytov boli použité na skúšku inhibície hemaglutinácie jednoduchými sacharidmi a derivátmi sacharidov. Na určenie, či by jednotlivé sacharidy alebo deriváty sacharidov mohli inhibovať hemaglutináciu s M. catarrhalis, sa 7 μΐ daného sacharidu pri 500 mmol/1 zmiešalo so 7 μΐ M. catarrhalis buniek a inkubovalo sa počas 5 minút, aby sa sacharidu umožnilo interagovať s bunkami. Potom sa pridalo 7 μΐ 5 % (objemových) ľudských O⁺ erytrocytov a hemaglutinácia sa vyhodnotila pomocou skóre po 1 minúte. Každý sacharid a derivát sacharidu sa testoval na schopnosť inhibovať hemaglutináciu. Potom sa zásobný roztok každého sacharidu a derivátu sacharidu sériovo zriedil 1 : 2, a tieto zriedenia sa skúmali na schopnosť inhibovať hemaglutináciu s použitím opísaného postupu. Týmto spôsobom sa určila minimálna koncentrácia sacharidu požadovaná na inhibovanie hemaglutinácie.

C. Viazanie ligandu a receptora

Viazanie M. catarrhalis na glykolipidové receptory živočíšnych buniek sa skúšalo s použitím tenkovrstvovej chromatografickej (TLC) frakcionácie glykolipidov hostiteľskej bunky a prevrstvenie chromatogramu označenými bunkami podľa postupov opísaných Magnani a spol., 1982, J. Biol. Chem. 257: 14365 až 14369. Stručne opísané, glykolipidy získané od Matreya Inc. (Pleasant Gap, PA) sa rozdelili na platniach vysoko účinnej tenkovrstvovej chromatografie (HPTLC) v zmesi chloroform, metanol, voda (5:4:1). Platne sa vyfarbili buď s orcinolom pri 100 °C, alebo sa prevrstvili s '‘⁵I-označenými M. catarrhalis mechúrikmi pripravenými tak, ako je opísané (Murphy a Locb, 1989, Microbial Pathogen. 6: 159 až 174) pri 2 X 10⁶cpm/ml počas 2 hodín. Platne sa potom premyli 5-krát, vysušili a exponovali na rôntgenový film.

D. OG extrakcia OMP

Kmene M. catarrhalis sa pestovali pri 35 °C pri 200 ot./min. v 1 litri Mueller Hintonovom živnom roztoku v 4 litrovej banke. Preparáty proteínov vonkajších membrán (OMP) sa izolovali opracovaním 50 mg buniek (vlhká hmotnosť) s 0,67 ml 1,25 % hmotnostného n-oktyl-P-D-glukopyranozidu (t. j. oktylglukozid; OG) vo fosfátom pufrovanej soľanke (PBS) počas 30 minút pri laboratórnej teplote. Bunky sa peletovali v mikrocentrifúge počas 5 minút a supematant bol použitý ako oktylglukozidový extrakt. Porovnanie proteínových profilov týchto extraktov z viacerých kmeňov M. catarrhalis s profilmi pľuzgierikov (t. j. mechúrikov vonkajších membrán) izolovaných pomocou diferenciálnej centrifugácie, ktoré sú vysoko obohatené proteínmi vonkajších membrán (OMP) z M. catarrhalis (Murphy a Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6: 159 až 174) indikuje, že oktylglukozidové extrakty obsahujú prevládajúco proteíny vonkajších membrán M. catarrhalis (obr. 1). To indikuje, že oktylglukozidová extrakcia poskytuje rýchlejší postup s vyšším výťažkom proteínov vonkajších membrán v porovnaní s proteínmi vonkajších membrán pripravenými z pľuzgierikov.

E. Proteolytická digescia OMP106 mg buniek ATCC kmeňa 49143 v 1 ml Dulbeccovej fosfátom pufrovanej soľanky sa digerovalo počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote s nasledujúcimi proteázami: TLCK-opracované chymotrypsínom (5 mg), proteínázou K (5 mg), TPCK-opracované trypsínom (5 mg) alebo proteázou V8 (100 jednotiek). Všetky proteázy sa získali od Sigma Chemicals (St. Louis, MO). Ihneď nasledovalo opracovanie proteázou, bunky sa premyli raz v PBS a resuspendovali v 1 ml PBS a testovala sa ich hemaglutinačná aktivita. Okrem toho, proteázou-opracované bakteriálne bunky sa extrahovali s oktylglukozidom, čim by mohli proteíny vonkajšej membrány byť rozdelené na identifikovanie špecifických proteínov, ktoré sa možno digerovali pomocou proteázy.

F. Nehemaglutinačné kultivary

Normálne sa hemaglutinačné M. catarrhalis kultúry pestovali v trepacích bankách obsahujúcich Mueller Hintonov živný roztok pri 35 až 37 °C pri 200 ot./min. počas 24 až 48 hodín. Bunky odobrané priamo z platní krvného agaru alebo platní agaru s Mueller Hintonovým médiom tiež prejavovali hemaglutinačný fenotyp. Na vybranie nehemaglutinačného (NHA) kultivaru bol ATCC kmeň 49143 sériovo pasážovaný každých 5 dní v statických kultúrach pestovaných v Mueller Hintonovom živnom roztoku pri 35 °C. Pri každej pasáži sa inokulum bralo len z povrchu živného roztoku kultúry. Pri druhej pasáži sa vyvinul plávajúci chumáč buniek a tento chumáč buniek bol použitý ako inokulum pre následné kultúry. Sériové kultivovanie týmto spôsobom produkovalo NHA kultivary ATCC 49143 typicky po troch pasážach.

G. Izolácia OMP 106 polypeptidu

OMP106 polypeptid z extraktu vonkajších membrán M. catarrhalis ATCC 49143 sa detegoval (napríklad pomocou vyfarbovania striebrom alebo anti-OMP106 protilátkami) v denaturujúcich géloch len po tom, ako sa extrakt inkuboval pri 100 °C počas piatich minút. Aby sa určilo, či výskyt OMP106 pásu po inkubácii pri 100 “C je dôsledkom nižšej molekulovej hmotnosti proteínov agregujúcich počas varu alebo či var umožňuje normálne agregovanému proteínu uvádzať gél, nevarený oktylglukozidový extrakt vonkajších membrán ATCC 49143 bol analyzovaný na pôvodnom polyakrylamidovom géli. Špecifické oblasti gélu vrátane oblasti ihneď pod vzorkou sa vyrezali a varili. Výsledné vzorky sa potom rozdelili na denaturačnom polyakrylamidovom géli a vyfarbili sa striebrom (Silver Stain Plus, Katalógové číslo 161-0449, BioRad Laboratories, Richmond, CA). Na N-terminálové sekvenovanie bol oktylglukozidový extrakt vonkajších membrán ATCC 49143 zmiešaný s PAGE vzorkovým pufrom obsahujúcim SDS, a bol inkubovaný počas 5 minút vo vriacom vodnom kúpeli. Potom sa proteíny rozdelili na 12 % hmotnostných PAG s SDS a preniesli sa na PVDF membránu pomocou elektropijakovania. Oblasť membrán obsahujúca OMP 106 pás sa potom vyrezala na amino-terminálové sekvenovanie. Žiaden z PAGE postupov použitý na izolovanie OMP 106 polypeptidu nepoužíval redukujúce činidlá vo vzorke alebo gélových pufroch.

H. Anti-OMP106 antisérum

Antisérum na OMP106 bolo pripravené pomocou rozdelenia OMP106 polypeptidu z HA kultivaru ATCC 49143 v denaturačnom sodnom dodecylsulfát polyakrylamidovom géli ako je opísané skôr (Lammeli, 1970, Náture 227: 680 - 685), a vyrezaním OMP106-obsahujúceho pásu z gélu. Vyrezaný pás bol macerovaný a injektovaný králikom na generovanie antiséra na OMP106 polypeptid. Antisérum bolo použité na inhibovanie hemaglutinácie, ako je opísané v príklade IB, ale s použitím antiséra namiesto sacharidu. Antisérum bolo tiež preskúšané na doplnkom sprostredkovanú cytotoxickú aktivitu proti M. catarrhalis, ako je opísané v príklade 2.

I. Westemový prenos s ANTI-OMP106 antisérom

M. catarrhalis ATCC 49143, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240, ATCC 25238 a ATCC 8176; M. ovis ATCC 33078; M. lacunata ATCC 17967; M. bovis ATCC 10900; M. osloensis ATCC 10973; Neisseria gonorrhoeae (klinický izolát); a N. meningitidis ATCC 13077 sa pestovali na platniach čokoládového agaru počas 48 hodín pri 35 °C v 5 % hmotnostných CO₂. Bunky sa odstránili zoškrabaním kolónie z agarového povrchu s použitím polystyrénovej očkovacej slučky. Bunky sa potom solubilizovali pomocou suspendovania 30 pg bunky v 150 pl PAGE vzorkovacom pufri (360 mmol/1 Tris pufer [pH 8.8], obsahujúci 4 % hmotnostné dodecylsulfátu sodného a 20 % hmotnostných glycerolu), a inkubovania suspenzie pri 100 °C počas 5 minút. Solubilizované bunky sa rozdelili na 12 % hmotnostných polyakrylamidovom géli ako u Laemmliho a separované proteíny sa elektroforeticky preniesli na PVDF membrány pri 100 V počas 195 hodín ako je opísané (Thebaine a spol. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 až 4354) s výnimkou, že sa pridalo 0,05 % hmotnostných dodecylsulfátu sodného do prenosového pufra na uľahčenie pohybu proteínov z gélu. PVDF membrány sa potom predopracovali s 25 ml Dulbeccovej fosfátom pufrovanej soľanky obsahujúcej 0,5 % hmotnostného sodného kazeínu, 0,5 % hmotnostného bovinného sérového albumínu a 1 % hmotnostné kozieho séra. Všetky následné inkubácie sa vykonali s použitím tohto predopracovaného pufra.

PVDF membrány sa inkubovali s 25 ml 1 : 500 zriedenia králičieho séra pred imunizáciou alebo séra králika imunizovaného s OMP106 polypeptidom (ako je opísané) počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote. PVDF membrány sa potom premyli dvakrát s premývacím pufrom (20 mmol/1 Tris pufor [pH 7.5.] obsahujúci 150 mmol/1 chloridu sodného a 0,05 % hmotnostného Tween-20). PVDF membrány sa inkubovali s 25 ml 1:5000 zriedenia peroxidázou-označeného kozieho anti-králičieho IgG (Jackson ImunoResearch Laboratories, West Grove Pcnn. Katalógové číslo 111-035-003) počas 30 minút pri laboratórnej teplote. PVDF membrány sa potom premyli 4-krát s premývacím pufrom, a vyvinuli sa s 3,3’-diaminobenzidin tetrahydrochloridom a peroxidu močoviny dodávaným Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo. Katalógové číslo D-4418) počas 4 minút.

J. Anti-OMP106 imunofluorescenčné vyfarbovanie bunkového povrchu

M. catarrhalis ATCC 49143 bol pestovaný počas noci pri 35 °C za pretrepávania vo vodnom kúpeli v Mueller Hintonovom živnom roztoku. Bunky sa peletovali pomocou centrifugácie a potom sa resuspendovali v rovnakom objeme Dulbeccovej modifikačnej fosfátom pufrovanej soľanky bez vápnika alebo horčíka (PBS/MC). 20 μΐ bunko vej suspenzie sa aplikovalo na každé z 5 čistých mikroskopových sklíčok. Po usadení počas 10 sekúnd sa prebytok kvapaliny odstránil mikropipetou, a sklíčka sa nechali na vzduchu schnúť počas 1 hodiny. Sklíčka sa potom teplom fixovali nad otvoreným plameňom, kým sklo nebolo horúce na dotyk. Sklíčka sa najprv opracovali s 40 μΐ 1:40 zriedenia anti-OMP106 antiséra alebo séra pred imunizovaním z rovnakého zvieracieho zriedenia v PBS/MC alebo PBS/MC počas 10 minút, potom sa premyli 5-krát s PBS/MC. Sklíčka sa opracovali s 40 μΐ 5 pg/ml PBS/MC fluoresceín izotiokyanátom označenými kozími protilátkami na králičí IgG (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc, Gaithersburg, MD katalógové číslo 02-15-06). Sklíčka sa inkubovali v tme počas 10 minút a premyli sa 5-krát v PBS/MC. Sklíčka sa uložili pokryté s PBS/MC pod krycím sklíčkom a pozorovali sa s fluorescenčným mikroskopom vybaveným s 489 nm filtrom. Pre každú vzorku sa vizuálne preskúšalo päť zorných poli na vyhodnotenie rozsahu rozmnoženia.

Výsledky

Hemaglutinačná aktivita

Aglutinačná aktivita M. catarrhalis vzhľadom na erytrocyty je látkovo špecifická s najsilnejšou aktivitou pozorovanou pre ľudské erytrocyty. Králičie erytrocyty sú tiež aglutinované s M. catarrhalis, ale menej dramaticky než pri ľudských bunkách. Erytrocyty myši, koňa alebo ovce sa neaglutinovali (pozri tabuľka 1).

Tabuľka 1: Sila hemaglutinácie erytrocytov rôznych organizmov s použitím M. catarrhalis ATCC 49143

Zdroj erytrocytov	Skóre hemaglutinácie“
Človek	++++
Králik	+4-
Myä	-
Kôň	-
Ovca	-

^a ++++ = najsilnejšia aglutinácia, - označuje stav bez aglutinácie

OMP106 receptory a ligandy

M. catarrhalis hemaglutinačná aktivita je spôsobená viazaním na globotetrózu (Gb₄). Pľuzgieriky hemaglutinačných kmeňov sa viažu na glykolipid, ktorý má Gb₄, kým ne-hemaglutinačné kmene sa neviažu na tento glykolipid (pozri obr. 2). M. catarrhalis hemaglutinačná aktivita je inhibovaná monosacharidovými zložkami Gb₄ alebo derivátmi takýchto monosacharidov, pričom najsilnejšími inhibítormi sú N-acetyl-galaktózamín a galaktóza (zvlášť alfa anomér galaktózy) (pozri tabuľka 2).

Tabuľka 2: Minimálna koncentrácia cukrov požadovaná na inhibovanie hemaglutinácie (MIC) s M. catarrhalis

Cukor	MIC (mmol/1)*
D-Glukóza	>167
D-Manóza	83
D-Galaktóza	41
l.-ľukóza	83
N-acetyl-D-Glukózamín	>167
N-acetyl -D-Galaktózamín	41
Metyl-cc-Glukóza	>167
Metyl-a-Manóza	167
Metyl-a-Galaktóza	10
Metyl-3-Galaktóza	83

* Minimálna koncentrácia cukru požadovaná na inhibovanie 1+ hemaglutinačnej reakcie s M. catarrhalis ATCC 49143 s 5 % hmotnostnými premytých ľudských O⁺ erytrocytov.

Aj N-acetyl galaktózamín aj alfa-galaktóza sú časťou Gb₄ tctrasacharidu. Korelácia medzi hemaglutináciou a viazaním na Gb₄, a pozorovanie, že hemaglutinácia je inhibovaná monosacharidmi, ktoré obsahujú Gb₄ receptor ukazuje, že sa M. catarrhalis bunky viažu na tetrasacharidový Gb₄. Tento tetrasacharid je prítomný na ľudských erytrocytoch a tkanivách, a mohol by sprostredkovať pripojenie M. catarrhalis na eukaryatické membrány.

Identifikácia OMP106 polypeptidu

Proteolytická digescia M. catarrhalis buniek a následná analýza hemaglutinácie digerovanými bunkami demonštrovala, že opracovanie proteázou s chymotrypsínom a proteínázou K rozrušilo hemaglutinačnú aktivitu a opracovanie s trypsínom čiastočne rozrušilo hemaglutinačnú aktivitu, čo znamená, že hemaglutinačná aktivita je proteínom sprostredkovaná. Analýza OMP proteínových profilov proteázy digerovaných M. catarrhalis buniek ukázala, že v každej vzorke sa násobné proteíny degradovali, takže profily neposkytli dôkaz o tom, ktorý proteín je priamo zodpovedný za hemaglutinačnú aktivitu alebo nepriamo prispel ku hemaglutinačnej aktivite (pozri obr. 3).

Pretože proteázové opracovanie indikuje, že polypeptid je priamo alebo nepriamo zodpovedný za hemaglutinačnú aktivitu, použili sme SDS-PAGE na porovnanie OMP profilov hemaglutinačných kmeňov s OMP profilmi nehemaglutinačných kmeňov (obr. 4). Analýza rozdielov medzi týmito profilmi ukázala, že hemaglutinačné kmene mali dva unikátne polypeptidy, jeden so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 27 kD (označované ako OMP27) a druhý bol jediný proteín so zdanlivou molekulovou hmotnosťou väčšou ako 106 kD (označované ako OMP 106). Pozoruhodne, OMP 106 polypeptidový pás bol neprítomný v OMP preparátoch rôznych proteázovo opracovaných buniek, ktoré majú zníženú alebo žiadnu hemaglutinačnú aktivitu, kým OMP27 pás bol prítomný v OMP preparátoch z buniek opracovaných proteinázou K, ktorc nemajú hemaglutinačnú aktivitu. Okrem toho OMP 106 polypeptidový pás nebol degradovaný proteinázovou V8 digesciou, ktorá neovplyvňovala hemaglutinačnú aktivitu opracovaných buniek.

OMP profil NHA kultivarov

Sériové kultivovanie NHA kultivaru ATCC 49143 v statických kultúrach pri 35 °C produkovalo NHA kultivar (označovaný ako 49143-NHA) pri tretej pasáži kultúry. Táto strata hemaglutinačnej aktivity bola opakovateľná. Analýza OMP profilov OG extraktov vonkajších membrán HA a NHA kultivarov ukázala, že OMP106 polypeptidový pás sa stratil z 49143-NHA extraktu (obr. 5). To ukazuje, že OMP106 polypeptid jc M., catarrhalis hemaglutinín (t.j. OMP 106 polypeptid viaže Gb₄ receptor alebo je podjednotkou homopolymémeho proteínu, ktorý sa viaže na Gb₄ receptor) alebo tvorí časť M. catarrhalis hemaglutinínu (t. j. OMP 106 polypeptid je podjednotkou heteropolymémeho proteínu, ktorý sa viaže na Gb₄ receptor).

OMP 106 a hemaglutinácia

Polyklonálne antisérum vytvorené na ATCC 49143 OMP 106 polypeptid neutralizovalo hemaglutináciu s ATCC 49143, ako aj hemaglutináciu s heterologickým ATCC 43627. To ďalej podporuje záver, že M. catarrhalis hemaglutinačná aktivita zahrnuje OMP 106 polypeptid, a že OMP106 polypeptid je antigénicky zachovávaný medzi kmeňmi. Pozri tiež obr. 9A, ktorý ukazuje protilátky v polyklonálnom antisére viažuce OMP 106 polypeptid heterologických M. catarrhalis kmeňov.

Vonkajšie povrchové umiestnenie OMP 106

Králičie anti-OMP106 antisérum bolo použité na nepriame imuno-fluorescenčné vyfarbovanie na určenie, či je OMP106 polypeptid exponovaný na vonkajšom povrchu M. catarrhalis buniek. M. catarrhalis bunky opracované s anti-OMP106 antisérom sa vyfarbovali intenzívnejšie a rovnomernejšie, než bunky opracované s predimunitným sérom alebo PBS/MC. To značilo, že v intaktných M. catarrhalis bunkách bol OMP 106 polypeptid reaktívny na anti-OMP106 protilátky. Tento výsledok naznačuje, že OMP106 polypeptid je exponovaný na vonkajšom povrchu M. catarrhalis. Toto zistenie je konzistentné s ÓMP106 polypeptidom, ktorý má úlohu v hemaglutinácii a navyše naznačuje, že OMP 106 polypeptid by bol užitočný ako vakcína.

Vlastnosti OMP 106 polypeptidu

OMP 106 polypeptid existuje ako veľký proteínový komplex vo svojom pôvodnom stave alebo agreguje, keď sa extrahuje s oktylglukozidom. Tento záver je podporený zistením, že extrahovanie M. catarrhalis buniek s oktylglukozidom bude solubilizovať OMP 106 polypeptid, ale extrahovaný OMP106 polypeptid sa nezúčastňuje denaturačnej PAG, ak nie je najprv extrakt inkubovaný pri 100 °C (obr. 6). Ďalej, OMP106 polypeptidový pás sa neobjavuje vtedy, keď sa má tvoriť pri nižšej molekulovej hmotnosti polypeptidov, ktoré polymerizujú alebo agregujú pri zahrievaní, kým OMP 106 polypeptid vo vzorke denaturovanej nie teplom sa zachytáva vo vzorkovacom kalisku a vstupuje do rozdeľovacieho gélu len, ak vzorka bola najprv inkubovaná pri 100 °C. Táto biochemická vlastnosť je veľmi užitočná na identifikovanie OMP 106 polypeptid v rôznych géloch.

S použitím oktylglukozidových extraktov M. catarrhalis, potom inkubovania extraktov s dodecylsulfátom sodným pri 100 °C a rozdelenia proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géli, sme určili zdanlivú molekulovú hmotnosť OMP 106 polypeptidu z rôznych kmeňov M. catarrhalis, konkrétne kmeňov ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628, v rozsahu od asi 180 kD do asi 230 kD (obr. 9A), kým OMP106 polypeptid kmeňa ATCC 49143 sa javí so zdanlivou hmotnosťou okolo 190 kD (obr. 6).

OMP 106 polypeptid kmeňa ATCC 49143 bol extrahovaný z rezov gélu a jeho N-zakončcnic bolo sekvenované. Toto sekvenovanie ukázalo, že N-zakončenie OMP106 polypeptidu vonkajších membrán ATCC 49143 je IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (Sekv. ID NO: 1). Okrem toho interný peptid OMP 106 produkovaný pomocou Lys-C digescie (Femandez a spol., 1994, Anál. Biochem 218: 112 - 117) bol izolovaný a jeho sekvencia bola určená ako GTVLGGKK (Sekv. ID NO:2).

Generovali sme tri oligonukleotidové sondy. Dve sondy zodpovedali vnútornému peptidu GTVLGGKK, jedna má nasledujúcu sekvenciu GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (Sekv. ID NO:3), druhá má nasledujúcu sekvenciu GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (Sekv. ID NO:7). Ďalšia sonda, Mc 5-72, kódujúca interný fragment (Sekv. ID NO:5) so sekvenciou amino-zakončenia OMP106 (Sekv. ID NO:1) má nasledujúcu sekvenciu GAAGCGGACGCGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCCGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTC16

SK 284812 Β6

Tabuľka 3

Doplnkom sprostredkované cytotoxické aktivity predimunitného séra a anti-OMP106 antiséra

CGCAA (Sekv. ID N0:4). Hybridizácia Mc 5-72 sondy na úplný HindlII alebo Dral výluh M. catarrhalis DNA v každom prípade tvorili jednoduchý pás v Southemovej analýze (obr. 7). Hybridizačný pás v HindlII výluhu má približnú veľkosť 8,0 kb; hybridizačný pás v Dral výluhu má približnú veľkosť 4,2 kb (obr. 7).

Konzervácia OMP106 polypeptidu

Westemová analýza škvŕn proteínových extraktov vonkajších membrán viacerých M. catarrhalis kmeňov a príbuzných organizmov baktérií ukázali, že anti-OMP106 protilátky sa viažu na polypeptid s asi 180 kD až asi 230 kD v mnohých M. catarrhalis kmeňoch, aj HA aj NHA kmeňov alebo kultivarov (obr. 9A). Anti-OMP106 protilátky sa neviazali na niektorý polypeptid v proteínových extraktoch príbuzných baktérií (obr. 8A). Tieto výsledky demonštrujú nasledujúce: 1. Anti-OMP106 protilátky môžu byť použité na špecifické identifikovanie a rozlíšenie M. catarrhalis od príbuzných organizmov baktérií. 2. OMP 106 polypeptid môže byť použitý na generovanie protilátok, ktoré majú diagnostickú aplikáciu na identifikáciu M. catarrhalis. 3. Protilátky na OMP106 polypeptid jedného kmeňa (napríklad,OMP106 ATCC 49143) môžu byť použité na identifikovanie a izolovanie zodpovedajúceho OMP106 polypeptidu ďalších M. catarrhalis kmeňov. Zaujímavo, výsledky Westernovej analýzy ukazujú, že mnohé z NHA M. catarrhalis kmeňov majú OMP106 polypeptid v OG extraktoch ich vonkajších membrán. Tieto zistenia a fakt, že vyfarbovanie striebrom OMP z OG extraktov vonkajších membrán NHA M. catarrhalis kmeňov po PAGE neodhaľuje pás v rozsahu 180 kD až 230 kD, indikuje, že OMP 106 polypeptid je expresovaný väčšinou M. catarrhalis kmeňov alebo kultivarov, ale že na to aby bol aktívny v hemaglutinácii (t.j. viazaní na receptor na povrchoch buniek cicavcov) alebo vyfarbiteľný striebrom, OMP106 polypeptid musí byť vhodne istým spôsobom modifikovaný. Zdanlivo len HA kmene a kultivary sú schopné vhodne modifikovať OMP 106 polypeptid tak, že môže sprostredkovať bakteriálne viazanie na hemaglutininový receptor na povrchoch buniek cicavcov.

Príklad 2

Účinnosť OMP 106 vakcíny: cytotoxická aktivita ANTIOMP106 antiséra

Doplnkom-sprostredkovaná cytotoxická aktivita anti-OMP106 protilátok sa skúmala na určenie potenciálu vakcíny OMP 106 polypeptidu. Antisérum na OMP 106 polypeptid HA kultivaru ATCC 49143 bolo pripravené tak, ako je opísané v príklade IH. Aktivity pred-imunitného séra a anti-OMP106 antiséra v sprostredkovaní doplnkového usmrtenia M. catarrhalis sa skúmali s použitím testu „Sérum Bacterícidal Test“, ktorý je opísaný Zollingerom a spol. (Immune Responses to Neiserria meningitis, v Manuál of Clinical Laboratory Immunology, 3. vydanie, strany 347 - 349), s výnimkou, že boli použité bunky HA a NHA M. catarrhalis kmeňov alebo kultivarov namiesto buniek Neiserria meningitis..

Tieto výsledky ukazujú, že anti-OMP106 antisérum sprostredkuje doplnkové usmrtenie HA kultivaru heterologických M. catarrhalis ATCC 43627, ale nie NHA kultivaru M. catarrhalis ATCC 43627 alebo NHA M. catarrhalis ATCC 8176. Tabuľka 3 sumarizuje doplnkom sprostredkovanú cytotoxickú aktivitu pred-imunitného séra a anti-OMP106 antiséra proti HA kultivaru ATCC 43627.

	Cytotoxický Titer¹
	Pred imunitné	AntiOMPlOó
Experiment 1	16	128
Experiment 2	8	64

¹ Titer je najvyššie zriedenie, pri ktorom sérum môže sprostredkovať doplnkové usmrtenie HA kultivaru ATCC 43627 (napríklad 16 predstavuje 16 násobné zriedenie séra), čím je číslo väčšie, tým vyššia cytotoxická aktivita alebo titer.

Ako je ukázané v tabuľke 3, anti-OMP106 antisérum má 8-násobnú väčšiu cytotoxickú aktivitu než predimunitné sérum. Tieto zistenia indikujú, že OMP 106 polypeptid je užitočný ako vakcína proti HA M. catarrhalis kmeňom a kultivarom.

Hoci vynález je opísaný podrobne s odkazom na jeho špecifické uskutočnenia, treba rozumieť, že variácie, ktoré sú funkčne ekvivalentné, sú v rozsahu tohto vynálezu. Rôzne modifikácie vynálezu, okrem modifikácií ukázaných a opísaných v tomto dokumente; sa stanú zjavnými odborníkom v tejto oblasti z predchádzajúceho opisu a priložených nákresov. Takéto modifikácie sú považované za modifikácie spadajúce do rozsahu priložených patentových nárokov.

Sú tu citované rôzne publikácie, ktorých obsah je tu začlenený v odkazoch ako celok

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÁ INFORMÁCIA:

(1) PRIHLASOVATEĽ: TUCKER, KENNETH PLOSILA, LAURA (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Polypeptid proteín-106 vonkajších membrán moraxella catarrhalis, génová sekvencia a jeho použitie (iii) POČET SEKVENCIÍ: 8 (iv) KOREŠPONDENČNÁ ADRESA:

(A) ADRESÁT: PENNIE & EDMONDS (B) ULICA: 1155 Avenue of the Americas (C) MESTO: New York (D) ŠTÁT: New York (E) KRAJINA: USA (F) ZIP: 10036-2711 (v) POČÍTAČOVO ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTVÉR: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) ÚDAJE O PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US (B) DÁTUM PODANIA:

(C) KLASIFIKÁCIA:

(viii) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI/AGENTOVI:

(A) MENO: Baldwin, Geraldine F.

(B) REGISTRAČNÉ ČÍSLO: 31,232 (C) REFERENČNÉ/SPISOVÉ ČÍSLO: 7969-045 (ix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:

(A) TELEFÓN: (212) 790-9090 (B) TELEFAX: (212) 869-8864 (C) TELEX: 66141 PENNIE (2) INFORMÁCIA PRE SEKV. ID NO:1:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 43 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID NO:1:

He Gly Íle Ser Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg 15 1015

Gly Asp Lys Ser Íle Ala Íle Gly Asp Ile Ala Gin Ala Leu Gly Ser

2530

Gin Ser Ile Ala Ile Gly Asp Asn Lys íle Val

3540 (2) INFORMÁCIA PRE SEKV. ID NO:2:

(1) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 8 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID NO:2:

Gly Thr Val Leu Gly Gly Lys Lys

5 (2) INFORMÁCIA PRE SEKV. ID NO:3:

(1) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: neznáma (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /dese = „sonda (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID NO:3:

GGNACNGTNC TNGGNGGNAA RAAR 24 (2) INFORMÁCIA PRE SEKV. ID No:4:

(1) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 72 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómická) (ix) ZNAK:

(A) MENO/KĽÚČ: COS (B) UMIESTNENIE: 1..72 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID NO:4:

GAA GCG GAC GGGGGG AAA GGC GGA GCC AAT GCG CGC GGT GAT AAA TCC 48 Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp Lys Ser 15 10 15

ATT GCT AK GGT GAC ATT GCG CAA 72

Ile Ala fle Gly Asp Íle Ala Gin (2) INFORMÁCIA PRE SEKV. ID NO:5:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 24 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ti) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: Sekv. ID NO:5:

Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp Lys Ser

5 10 15

De Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gin (2) INFORMÁCIA PRE SEKV. ID NO:6:

(1) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: neznáma (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS:/dese = sonda (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID NO:6:

YTTYTTNCCN CCNAGNACNG TNCC 24 (2) INFORMÁCIA PRE SEKV. ID NO:7:

(1) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: neznáma (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /dese = sonda (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID NO:7:

GGNACNGTNT TRGGNGGNAA RAAR 24 (2) INFORMÁCIA PRE SEKV. ID NO:8:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: neznáma (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /dese = sonda” (v) TYP FRAGMENTU: N-zakončenie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID NO:8:

YTTYTTNCCN CCYAANACNG TNCC 24

Claims

1. Izolovaný OMP106 polypeptid, ktorý je polypeptidom vonkajších membrán Moraxella catarrhalis, a má molekulovú hmotnosť asi 180 kD až asi 230 kD podľa určenia pomocou SDS polyakrylamidovej gélovej elektroforézy s použitím králičieho skeletálneho svalového myozínu ako štandardu 200kD molekulovej hmotnosti a E. coli β-galaktozidázy ako štandardu 116,25 kD molekulovej hmotnosti, a ktorý obsahuje sekvenciu Sekv. ID NO: 1 alebo Sekv. ID NO: 1 a Sekv. ID NO: 2.

2. OMP106 polypeptid podľa nároku 1, ktorý obsahuje sekvencie Sekv. ID NO: 1 a Sekv. ID NO: 2.

3. OMP106 polypeptid podľa nároku 1 alebo 2, ktorý má molekulovú hmotnosť okolo 190 kD.

4. OMP106 polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, ktorý je polypeptidom vonkajších membrán Moraxella catarrhalis, kmeňa vybraného zo skupiny pozostávajúcej z ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628 a ATCC 49143.

5. OMP106 polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde Moraxella catarrhalis kmeňom je ATCC 49143.

6. OMP 106 polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde Moraxella catarrhalis kmeňom je hemaglutinačný kultivar.

7. OMP 106 polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, ktorý reaguje pri vyfarbovaní striebrom.

8. Izolovaná protilátka, ktorá špecificky viaže OMP106

SK 284812 Β6 polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, alebo ktorá špecificky viaže peptidový fragment pozostávajúci z najmenej 6 po sebe nasledujúcich aminokyselinových zvyškov Sekv. ID NO: 1.

9. Izolovaná protilátka podľa nároku 8, ktorá je cytotoxickou protilátkou, ktorá sprostredkúva usmrtenie Maraxella catarrhalis komplementom.

10. Peptidový fragment z OMP106 polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, ktorý obsahuje 6 alebo viac po sebe nasledujúcich aminokyselinových zvyškov Sekv. ID NO: 1, ktorý sa špecificky viaže na protilátku, ktorá špecificky viaže Sekv. ID NO: 1.

11. Vakcína, vyznačujúca sa tým, že obsahuje OMP106 polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.

12. Vakcína, vyznačujúca sa tým, že obsahuje peptidový fragment podľa nároku 10.

13. Antigénový prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje OMP106 polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.

14. Antigénový prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje peptidový fragment podľa nároku 10.

15. Izolovaná DNA, ktorá obsahuje nukleotidová sekvenciu kódujúcu OMP106 polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.

16. Izolovaná DNA, ktorá obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu peptid, ktorý má Sekv. ID NO: 1.

17. Izolovaná DNA kódujúca OMP106 polypeptid, ktorá obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá hybridizuje za veľmi prísnych podmienok so sekvenciou Sekv. ID NO:4 alebo komplementárnou sekvenciou Sekv. ID NO:4.

18. DNA podľa nároku 16, ktorá obsahuje sekvenciu Sekv. ID NO:4 alebo komplementárnu sekvenciu Sekv. ID NO:4.

19. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 na prípravu liečiva na liečenie alebo prevenciu infekcie s M. catarrhalis.

20. Použitie izolovanej protilátky podľa nároku 8 alebo 9 na prípravu liečiva na liečenie alebo prevenciu infekcie s M. catarrhalis.

21. Použitie peptidového fragmentu podľa nároku 10 na prípravu liečiva na liečenie alebo prevenciu infekcie s M. catarrhalis.