NO324816B1

NO324816B1 - Moraxella Catarrhalis ytre membran protein-106 polypeptid, og fragment av dette, DNA som koder for polypeptidet, antistoffer og vaksiner, samt anvendelse av peptidene til fremstilling av et medikament for behandling av infeksjoner.

Info

Publication number: NO324816B1
Application number: NO19985113A
Authority: NO
Inventors: Kenneth Tucker; Laura Plosila
Original assignee: Antex Biolog Inc
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1998-11-02
Publication date: 2007-12-10
Also published as: NO985113D0; ZA973809B; CN1222618C; BG102983A; EA002743B1; US20070087019A1; EE04684B1; HUP9902695A3; EP0900025A1; AU3118097A; BG64832B1; US7128910B2; PL189375B1; CN1800359A; US20080145916A1; DE69723254D1; BR9711090A; CN100415871C; AR006999A1; NO20063711L

Description

1. Innledning

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt det ytre membranprotein-106 (OMP106) polypeptidet av Moraxella catarrhalis. Oppfinnelsen omfatter et isolert OMP106 polypeptid og OMP106 polypeptidvarianter. Oppfinnelsen omfatter også antistoffer som spesifikt binder OMP106 polypeptidet. Oppfinnelsen omfatter videre profylaktiske eller terapeutiske sammensetninger, innbefattende vaksiner, som innbefatter OMP106 polypeptid. Oppfinnelsen tilveiebringer videre anvendelse av OMD106 polypeptid for fremstilling av et medikament for behandling av infeksjoner, spesielt de forårsaket av M. catarrhalis hos pattedyr. Oppfinnelsen tilveiebringer videre isolerte nukleotidsekvenser som koder OMP106 polypeptidet og OMP106 polypeptidvarianter.

2. Bakgrunn for oppfinnelsen

Moraxella catarrhalis, også kjent som Moraxella (Branhamella) catarrhalis eller Branhamelle catarrhalis og tidligere kjent som Neisseria catarrhalis eller Micrococcus catarrhalis, er en gram-negativ bakterie som ofte finnes i respirasjonskanalen hos mennesker. M. catarrhalis, opprinnelig antatt å være en harmløs kommensal organisme, erkjennes nå som et viktig patogen for infeksjoner i øvre og nedre respirasjonskanal hos dyr. Hos mennesker forårsaker M. catarrhalis alvorlige infeksjoner i den nedre respirasjonskanalen hos voksne mennesker med kronsik lungesykdom, systemiske infeksjoner hos immunkompromitterte pasienter, og otitis media og sinustitt hos mindreårige og barn. Se Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Catlin, B.W., 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3:293-320; og referanser som der er sitert.

2.1. Ytre membranproteiner og beskyttende antistoffer

De ytre overflate komponentene til Moraxella catarrhalis har vært studert i forsøk på å forstå den patogene prosessen ved M. catarrhalis infeksjoner og for å utvikle nyttige terapeutiske behandlinger og profylaktiske forholdsregler mot slike infeksjoner. De ytre membranproteinene (OMP'er) har spesielt fått betydelig oppmerksomhet som positive virulensfaktorer og som potensielle vaksineantigener. M. catarrhalis har ca. 10-20 forskjellige OMP'er med 6-8 av disse, OMP'er A til H som dominerende arter (Murphy and Loeb, 1989, Microbial Pathogen, 6:159-174). Molekylvektene til OMP'er A til H varierer fra henholdsvis 97 til 20 kD. Se Bartos og Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765; Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Murphy et al., 1993, Molecul. Microbiol. 10: 87-97; og Sarwar et al., 1992, Infect. Immun. 60:804-809. Sammenligninger av proteinprofiler ved natrium dodesylsulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) av ytre membran preparater fra 50 M. catarrhalis stammer viser tilnærmet homogene mønstre av OMP'er A til H (Bartos og Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765).

I tillegg til OMP'er A til H er det også identifisert en OMP med høy molekyl vekt, betegnet HMW-OMP, som har en tilsynelatende masse på 350 til 729 kD ved SDS-PAGE som en annen fremtredende overflatekomponent tilstede i mange stammer av M. catarrhalis. HWM-OMP produserer ved maursyre denaturering et enkelt bånd på 120 til 140 kD, og synes følgelig å være et oligomert protein (Klingman og Murphy, 1994, Infect. Immun. 62:1150-1155). HMW-OMP synes å være det samme proteinet som det som betegnes UspA av Helminen et al., (1994, J. Infect. Dis. 170:876-872) og er vist å være tilstede i flere av M. catarrhalis stammer.

Hos intakt bakterie eller bakterieavledete ytre membran vesikler, viser flere av de ovenfor angitte OMP'er overflateeksponerte epitoper som fremmer produksjonen av antistoffer som binder OMP'ene. Disse antigene OMP'er innbefatter OMP E og OMP G (Murphy og Bartos, 1989, Infect. Immun. 57:2938-2941); OMP C/D (Sarwar et al., 1992, Infect. Immun. 60:804-809); CopB, et 80 kD OMP, (Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010): og UspA (Helminen et al., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).

Det terapeutiske potensialet av antistoffer til overflateeksponerte epitoper av CopB og UsPA har vært vurdert i en dyremodell. Modellen innbefatter direkte bolus inokulering av lunger av BALB/c VAF/plus mus med et kontrollert antall av M. catarrhalis celler og etterfølgende undersøkelse av hastigheten for pulmonær clearance av bakterien (Unhanand et al., 1992, J. Infect. Dis. 165:644-650). Forskjellige kliniske isolater av M. catarrhalis viste forskjellige hastigheter for clearance som korrelerte med nivået av granulocytt tilgang inn i infeksjonsstedet. Passiv immunisering med et monoklonalt antistoff rettet mot en overflate-eksponert epitop av enten CopB eller UspA øket hastigheten for pulmonar clearance av M. catarrhalis (Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Helminen et al., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).

Annen kjent teknikk som beskriver membranproteiner fra M. catarrrhalis omfatter K. Sasaki et al., 96th ASM General Meeting, 1996, abstrakt B-181, s. 186 og

WO 9634960.

2.2. Bakteriell/ vertcellevedheng og hemagglutinering

Adherens av bakterielle patogener til en vertcelleoverflate fremmer kolonisering og initierer patogenese. Se, E.H. Beachey, 1981, J. Infect. Dis. 143-325-345. Gram-negative bakterier uttrykker typisk overflatelektiner som bindes til spesifikke oligo-sakkarider av glykoproteiner og/eller glykolipider på vertcelleoverflaten. Slike lektiner er ofte forbundet med pili eller fimbriae. Bakteriell adhesjon kan også finne sted ved ikke-spesifikk binding som skyldes hydrofob og/eller ladningsinteraksjon med vertcelle-overflaten.

Mekanismen for M. catarrhalisadhesjon til celler i respirasjonskanalen er fremdeles dårlig forstått. Organismen festes til dyrkede humane orofaryngeale epitelceller (Mbaki et al., 1987, Tohuku J. Exp. Med. 153:111-121). En undersøkelse av Rikitomi et al., antyder at fimbriae kan ha en rolle ved adhesjon av slike celler idet fimbriae denaturering eller behandling med anti-fimbriae antistoffer reduserer avhesjon av fimbrierte stammer (Rikitomi et al., 1991, Scand. J. Infect. Dis. 23:559-567). Fimbriaformidlet binding kan imidlertid ikke være den eneste basis for denne adhesjonen idet den sterkest bindende adhesjonsstammen, blant de mange som ble undersøkt, var en ikke-fimbriert stamme.

Hemaggluineringsreaksjoner erstatter ofte de mer kompliserte adhesjonsanalysene for klassifisering av bakterielle adhesiner. Imidlertid fant Rikitomi et al. ingen korrelasjon mellom human orofaryngeal epitelcelleadherens og hemaggluinering ved M. catarrhalis-stammer (Id.). Det vil si tre meget adherende stammer av glutinerte ikke-humane erytrocytter. Følgelig er forskjellige bindingsmekanismer innbefattet i human orofaryngeal epitelcelle-adherens og hemaggluinering.

Deriomot antyder en senere undersøkelse av Kellens et al. at hemaggluinering ved M. catarrhalis er korrelert med vertcelle-adherens (Kellens et al, 1995, Infection 23:37-41). Imidlertid anvendte denne undersøkelsen en adherens-analyse basert på bakteriell binding til svinetrakeale seksjoner. Det er uklart om svinetrakealt vev kan betraktes som homologt med humant vev fra respirasjonskanalen med hensyn til adherens av patogene stammer av M. catarrhalis.

Uansett den problematiske adherensanalysen undersøkte Kellens et al. hemaggluinerings-aktivitetene av drøyt åtti kliniske isolater av M. catarrhalis (Kellens et al., 1995, Infection 23:37-41). Tilnærmet 3A av de undersøkte stammene agglutinerte humane, kanin, marsvin, hunde- og rotte-erytrocytter, mens de gjenværende stammene ikke gjorde dette. Agglutineringsaktivitetene for noen av de hemaggluinerende stammene ble videre karakterisert og vist å være kalsiumioneavhengige og inhibert ved trypsinned-brytning eller høy temperaturbehandling eller tilsetting av D-glukosamin eller D-galaktosamin.

En oversikt over hemaggluinerende og ikke-hemaggluinerende M. catarrhalis-stammer av Tucker et al., har vist at alle stammer binder glykolipid gangliotetraosylceramid, men bare hemaggluinerende stammer binder glykolipidet globotetraosylceramid (Tucker et al, 1994, Annual Meeting of Amer. Soc. Microbiol., Abstract No. D124). Videre ble M. catarrhalis hemaggluineirngsaktivitet vist å bli inhibert ved forskjellige monosakkarider som innbefatter karbohydratenheten av globotetraosylceramid. Disse observa-sjonene førte til at Tucker et al., antydet at M. catarrhalis hemaggluinerer ved binding til globo-tetraosylceramider i cellemembranene av mottagelige erytrocytter, innbefattende de av humane røde blodceller. Frem til dags dato har teknikkens stand ikke identifisert et molekyl på den ytre overflaten av M. catarrhalis som er ansvarlig for enten vertcelle-adherens eller hemaggluinering.

3. Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår OMP 106 polypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter aminosyresekvensen SEQ ID nr. 1 eller SEQ ID nr. 2.

Oppfinnelsen angår videre isolert eller i det vesentlige rent OMP 106 polypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter varianter av SEQ ID nr. 1 som har tilsvarende biologisk aktivitet.

Oppfinnelsen angår videre isolert antistoff, kjennetegnet ved at det spesifikt binder OMP 106 polypeptidet ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår videre peptidfragment av OMP 106 polypeptidet ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at det spesifikt bindes til et antistoff som spesifikt binder nevnte OMP 106 polypeptid.

Oppfinnelsen angår videre vaksine, kjennetegnet ved at den innbefatter OMP 106 polypeptidet ifølge oppfinnelsen samt antigen sammensetning, kjennetegnet ved at den innbefatter OMP 106 polypeptidet ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår videre i det vesentlige rent DNA, kjennetegnet ved at det innbefatter en nukleotidsekvens som koder OMP 106 polypeptidet ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår videre i det vesentlige rent DNA, kjennetegnet ved at det innbefatter en nukleotidsekvens som koder for peptidet ifølge SEQ ID nr. 1.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av en effektiv mengde av OMP 106 polypeptid ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av infeksjoner og/eller svekke sykdom forårsaket av M. catarrhalis hos pattedyr.

Foreliggende oppfinnelse har mange anvendelser. For eksempel kan OMP 106-polypeptidet og OMP 106 polypeptidvarianter anvendes som ligander for å detektere antistoffer fremmet som respons overfor M. catarrhalis-infeksjon (for eksempel ved diagnostisering av M. catarrhalis-infeksjoner). OMP106 polypeptidet og OMP106-avledete polypeptider kan også anvendes som immunogener for å indusere M. catarrhalis-spesifikke antistoffer. Slike antistoffer er nyttige i immunoanalyser for å detektere M. catarrhalis i biologiske prøver. De cytotoksiske antistoffene ifølge oppfinnelsen er nyttige ved passiv immunisering mot M. catarrhalis-infeksjoner. OMP 106 polypeptidet og OMP 106 polypeptidvarianter kan videre anvendes som aktive bestanddeler i vaksiner mot M. catarrhalis-infeksjoner.

Oppfinnelsen er basert på den overraskende oppdagelsen at hemaggluinerende M. catarrhalis-stammer og kulturer har et ytre membranprotein, OMP 106 polypeptid, som er ca. 180 kD til ca. 230 kD i molekylvekt, og at ikke-hemaggluinerende M. catarrhalis-stammer og kulturer enten ikke har OMP 106 polypeptid eller har uegnet modifisert OMP 106 polypeptid som er inaktivt ved hemaggluinering og ikke kan sølvfarges. Oppfinnelsen er videre basert på den oppdagelsen at polyklonalt antiserum indusert ved OMP 106 polypeptid isolert fra en hemaggluinerende M. catarrhalis-stamme har cytotoksisk aktivitet mot en annen hemaggluinerende M. catarrhalis-stamme, men ikke mot en ikke-hemaggluinerende M. catarrhalis-stamme.

3.1 Definisjoner og forkortelser

anti-OMP 106 = en anti-OMP 106 polypeptid antistoff eller antiserum ATTCC = American Type Culture Collection blebs = naturlig forekommende ytre membranvesikler av M.

catarrhalis

Gb4 = GalNac<p>l-3Galal-4Galpl-4Glcl-lseramid

HA = hemaggluinerende

immunreaktiv = i stand til å utløse en cellulær eller humoral immunrespons

kD = kilodalton

M. catarrhalis = Mc;

Moraxella catarrhalis;

Moraxella (Branhamella) catarrhalis;

Branhamella catarrhalis;

Neisseria catarrhalis; eller

Micrococcus catarrhalis

NHA = ikke-hemaggluinerende

OG = n-oktyl (3-D-glukopyranosid eller oktyl glukosid OMP 106 = det ytre membranprotein-106 polypeptidet av Moraxella catarrhalis, som har en molekylvekt på ca. 180 kD til 230 kD ved SDS-PAGE; ekstraherbart fra blebs eller intakte celler av M. catarrhalis ved OG eller sarkosyl

detergens.

OMP106-avledet

polypeptid = fragment av OMP 106 polypeptider; variant av villtype OMP 106 polypeptidet eller fragment derav, inneholdende en eller flere aminosyreutelukkelser, innskudd eller substitusjoner; eller kimært protein innbefattende et heterologt polypeptid kondensert til det C-terminale eller N-terminale eller interne segmentet av

et helt eller en del av OMP 106 polypeptidet. OMP106

polypeptidvariant = polypeptid med mer enn 80% sekvensidentitet og tilsvarende biologiske aktivitet som OMP 106-polypeptid

OMP = ytre membran protein

OMP'er = ytre membran proteiner

PBS = fosfatbufferet saltvannsoppløsning

PAG = polyakrylamid gel

polypeptid = et peptid som har en hvilken som helst lengde,

fortrinnsvis et som har ti eller flere aminosyrerester SDS = natrium dodesylsulfat

SDS-PAGE = natrium dodesylsulfat polyakrylamid gel elektroforese

Nukleotid eller nukleinsyresekvenser som her er definert er representert ved en bokstavsymbolene for basene som følger:

A (adenin)

C (sytosin)

G (guanin)

T (tymin)

U (urasil)

M (A eller C)

R (A eller G)

W (A eller T/U)

S (C eller G)

Y(C eller T/U)

R (Geiler T/U)

V (A eller C eller G; ikke T/U)

H (A eller C eller T/U; ikke G)

D (A eller G eller T/U; ikke C)

B (C eller G eller T/U; ikke A)

N (A eller C eller G eller T/U) eller (ukjent)

Peptid- og polypeptidsekvenser som heri definert er representert ved en bokstavsymboler for aminosyrerester som følger:

A (alanin)

R (arginin)

N (asparagin)

D (aspartinsyre)

C (systein)

Q (glutamin)

E (Glutaminsyre)

G (glysin)

H (histidin)

I (isoleusin)

L (leusin)

K (lysin)

M (metionin)

F (fenylalanin)

P (prolin)

S (serin)

T (treonin)

W (tryptofan)

Y (tyrosin)

V (valin)

X (ukjent)

Foreliggende oppfinnelse kan forstås mer fullstendig med henvisning til den følgende detaljerte beskrivelsen av oppfinnelsen, de ikke-begrensende eksempler av spesifikke utførelsesformer av oppfinnelsen og de etterfølgende figurene.

4. Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1:

Denaturerende PAGE sammenligning av ytre membran proteinprofiler av M. catharrhalis blebs eller oktyl glukosid (OG) ekstrakter av hele M. catarrhalis celler. Tallene over felten refererer til ATCC sammebetegnelser. En forfarget SDS-PAGE standard (BioRad katalog nr. 161-0305) ble anvendt som molekylvektmarkør. Standarden bestod av følgende polypeptider med deres tilnærmede molekylvekter angitt i parenteser: kaninmuskelfosforylase B (106 kD); bovint serum albumin (80 kD); hønseegghvite ovalbumin (49,5 kD); bovin karbonanisk anhydrase (32,5 kD); soyabønne trypsin inhibitor (27,5 kd); hønseeggehvite lysozym (18,5 kD). Posisjonene av molekylvektmarkørene i gelen er angitt på venstre side av tegningen ved piler med molekylvektene (kD) av noen av markørene over pilene.

Fig. 2:

Resultater fra overlegning av tynnsjiktkromatogrammer av glykolipider med øl-merkede ytre membranblebs. I panelene A-C inneholder felt 1 glykolipid standarder som indikert på venstre side; felt 2 inneholder asialo-GMi; felt 3 inneholder Gb3, Gb4, og Forssman antigen; og felt 4 inneholder en Folch ekstraksjon av humane erytrocytter. Kromatogrammet vist i panel A er farget med orsinol, kromatogrammet vist i panel B er overlagt med <125>I-merkede blebs av ATCC stamme 8176 (en ikke-hemaggluinerende stamme), og kromatogrammet vist i panel C er overlagt med i fyeI-merkede blebs av ATCC-stamme 49143 (en hemaggluinerende stamme). Bare den hemaggluinerende stammen er bundet til Gb4 glykolipid båndet i de tredje og fjerde feltene.

Fig. 3:

Denne figuren viser proteinprofiler ved sølvfarging av oktylglykosideekstrakter av ytre membranproteiner etter nedbryting av M. catarrhalis celler med proteasene angitt i figuren. Hemaggluineringsaktiviteten av cellene etter nedbrytingen er indikert under figuren i raden merket HA. Molekylvektmarkørene anvendt er som i figur 1.

Fig. 4:

Sammenligning av proteinprofilene ved sølvfarging av ytre membranproteinene fra forskjellige ATCC-stammer av M. catarrhalis. De samme betegnelsene er angitt over feltene. Hemaggluineringsaktiviteten av stammene er indikert i raden merket HA under figuren. Legg merke til at et protein som har en tilsynelatende molekylvekt større enn den for kaninmuskelfosforylase B (106 kD) er felles for hemaggluineringstammene, men er fraværende i de ikke-hemaggluinerende stammene. Dette polypeptidet betegnes OMP 106. Molekylvektmarkørene anvendt er som i figur 1.

Fig. 5:

Sammenligning av proteinprofiler ved sølvfarging av ytre membranproteiner fra to M. catarrhalis ATCC 49143 kulturer: 49143 (hemaggluinerende kulturer) og 49143-NHA (ikke-hemaggluinerende kulturer). De hemaggluinerende aktivitetene av kulturene er angitt under figuren i raden merket HA. Legg merke til fraværet av OMP 106 polypeptidbåndet (indikert ved <) i den ikke-hemaggluinerende kulturen. Molekylvekt-makørene anvendt er som i figur 1.

Fig. 6:

Molekylvektestimering av OMP 106 i en 6% denaturerende polyakrylamid gel ved anvendelse av OG ekstrakter fra ATCC stamme 49143 som ble inkubert i prøvebuffer ved enten 25°C eller 100°C før påføring på gelen. Proteiner i gelen visualiseres ved reduktiv sølvfarging. Legg merke til at OMP 106 polypeptidbåndet (indikert ved <) ses bare i prøven inkubert ved 100°C. En bred område SDS-PAGE standard (BioRad katalog nr. 161-0317) ble anvendt som molekylvektmarkører. Standarden besto av følgende polypeptider (tilnærmede molekylvekter angitt i parenteser): kaninskjelett-muskel myosin (200 kD): E. coli (3-galaktosidase (116 kD); kaninmuskelfosforylase B (97,4 kD); bovint serum albumin (66,2 kD). Posisjonene av molekylvekten av markørene i gelen er angitt på høyre side av figuren ved piler med molekylvektene (kD) av markørene over pilene.

Fig. 7:

Southern blot analyse av Dral og Hindlll restriksjonsendonuklease nedbrytninger av M. catarrhalis kromosomal DNA probet med Mc5-72. DNA av M. catarrhalis stamme 49143 ble nedbrutt med Dral eller Hindlll. Southern analyse av det nedbrutte DNA ble utført ved anvendelse av Mc5-72 (Seq Id. Nr. 4) som proben. Den høye stringent-vaskingen var to ganger SSC, 1% SDS ved 50°C i ca. 20 til ca. 30 minutter. Felt 1 inneholder Hindffl nedbrytning; hybridiseringsbåndet har en tilnærmet størrelse på 8,0 kB. Felt 2 inneholder Dral nedbrytning: hybridiseringsbåndet har en tilnærmet størrelse på 4,2 kB.

Figurene 8A og 8B:

Western blot av proteinekstrakter av M. catarrhalis og beslektede arter ved anvendelse av et kaninantiserum mot OMP 106 som progen (fig. 8 A), sammenlignet med reaktivi-teten av serumet før immunisering av kaninen med OMP 106 (fig 8B). Prøvene i feltene i figur 8A og 8B er som følger: Felt A, M. catarrhalis; felt B, Moraxella ovis; felt C, Moraxella lacunata; felt D, Moraxella osloensis; felt E, Moraxella bovis; felt F, Neisseria meningitidis; felt G, Neisseria gonorrhoeae. Molekylvektmarkørene anvendt er som i figur 1.

Fig. 9A:

Western blot som demonstrerer at et kaninantiserum til OMP 106 polypeptidet fra M. catarrhalis ATCC 49143 kryssreagerer med et polypeptid av en tilsvarende molekylvekt i et antall av HA- og NHA-stammer av M. catarrhalis (lokaliseringen på OMP 106 polypeptidet indikeres ved pilen). Western undersøkte oktylglukosidekstrakter av forskjellige M. catarrhalis stammer. ATCC aksesjonsnumrene av stammene er indikert ved toppen av feltene. Overføringen og Western blot-fremgangsmåter anvendt var identiske med de anvendt for å oppnå blottene vist i figur 8.

Fig. 9B:

Western blot av de samme ekstraktene som de i figur 9A, ved anvendelse av preimmunserumet tilsvarende det anvendt i figur 9A.

5. Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

5.1 Hemagglutinerende og ikke- hemagghitinerende kulturer

Oppfinnelsen tilveiebringer OMP 106 polypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter aminosyresekvensen SEQ ID nr. 1 eller SEQ ID nr. 2 samt isolert eller i det vesentlige rent OMP 106 polypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter varianter av SEQ ID nr. 1 som har mer enn 80% sekvensidentitet og tilsvarende biologisk aktivitet.

OMP 106 polypeptid innbefatter hele eller en underenhet av et protein innstøpt i eller anbragt på den ytre overflaten av den ytre membranen av hemaggluinerende (HA) stammer og mange ikke-hemaggluinerende (NHA) stammer og kulturer av M. catarrhalis. OMP 106 bidrar direkte eller indirekte til hemaggluinerings fenotypen av HA-stammen og kulturene. HA M. catarrhalis celler agglutinerer humane eller kaninerytrocytter i en hvilken som helst standard hema-glutineringsanalyse, slik som den som er beskrevet av Soto-Hernandez et al. 1989, J. Clin, Microbiol. 27:903-908. Selv om man ikke ønsker å være bundet til noen spesiell virkningsmekanisme antas det i dag at M. catarrhalis agglutinerer erytrocytter ved binding til globotetrose (Gb4) enheten av glykolipid og glykoproteinreseptorer på verts-celleoverflatene og at hemaggluineringsaktiviteten formidles tildels ved egnet modifisert OMP 106 polypeptid, som har den spesielle egenskapen at den er mottagelig for sølv-farging. Derimot er umodifisert eller uegnet modifisert OMP 106 polypeptid hverken aktivt ved formidling av hemaggluinering eller sølvfarging. Imidlertid er OMP 106 polypeptidet det eneste polypeptidet som har en tilsynelatende molekylvekt på ca. 180 kD til ca. 230 kD som er OG- eller sarkosyl-ekstraherbart fra HA eller NHA M. catarrhalis blebs eller intakte celler.

Hemaggluineringsaktiviteten av HA M. catarrhalis celler inhiberes av globotetrose (GalNacpi-3Galal-4Gal(31-4Glc|31; Gb4) og monosakkaridene som innbefatter Gb4, innbefattende N-asetyl-D-galaktosamin, D-galaktose og glukose, og derivater derav, så som metyl-oc-galaktose eller metyl-P-galaktose. Hemaggluineringsaktiviteten av HA M. catarrhalis celler inhiberes også ved relativt høye konsentrasjoner av et antall andre sukre, innbefattende, men ikke begrenset til D-mannose, L-fukose, D-glukose og N-asetyl-D-glukosamin.

Hemaggluineringsaktiviteten og OMP 106 polypeptidet av intakte HA M. catarrhalis celler blir begge redusert eller ødelagt ved nedbrytning av intakte M. catarrhalis celler ved forskjellige proteaser innbefattende, men ikke begrenset til, TLCK (Na-ptosyl-L-lysin klor metyl keton [også kjent som l-klor-3-tosylamino-7-amino-L-2-heptanon])-behandlet kymotrypsin, proteinase K og TPCK (N-tosyl-L-fenylalanin klormetyl keton)-behandlet trypsin. Protease V8 nedbrytning av intakte HA M. catarrhalis celler påvirker imidlertid hverken hemaggluineringsaktiviteten eller den fysiske integriteten av OMP 106 polypeptidet av slike celler.

En ikke-hemaggluinerende (NHA) kultur kan avledes fra en HA M. catarrhalis stamme eller kultur ved serievis passasje i statiske flytende kulturer (dvs. flytende kulturer holdt ved 35°C uten risting). For eksempel dyrkes en HA M. catarrhalis stamme eller kultur i Mueller Hinton kulturoppløsning og hver femte dag tas et inokulum fra overflaten av den statiske kulturen for å inokulere en etterfølgende statisk kultur. Det foretrukne inokulum er en hvilken som helst flytende matte av celler ved overflaten av kulturen. Gjennomgang i statisk kulturer opprettholdes inntil det fremstilles en NHA kultur. En NHA kultur ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å fremstille beskyttende vaksiner, så som fullcelle vaksiner, mot M. catarrhalis infeksjoner.

Derimot kan den hemaggluinerende fenotypen av en HA M. catarrhalis stamme eller kultur opprettholdes ved passasje av stammen eller kulturen i ristende væskekulturer. I en utførelsesform dyrkes en HA M. catarrhalis stamme eller kultur i Mueller Hinton oppløsning ved 35 til 37°C med risting ved ca. 200 OPM og overføring hver 24 til 48 timer. Den hemaggluinerende fenotypen av en HA M. catarrhalis stamme eller kultur kan også opprettholdes ved passasje på faste medier. For eksempel dyrkes en HA M. catarrhalis stamme eller kultur på en plate inneholdende blodagar eller Mueller Hinton agar.

5.2 OMP106 polypeptid

OMP 106 polypeptid er det eneste ytre membranproteinet av en HA M. catarrhalis stamme eller kultur som har en tilsynelatende molekylvekt i SDS-PAGE på ca. 180 kD til ca. 230 kD, fortrinnsvis ca. 190 kD. Et ytre membranprotein av M. catarrhalis er et polypeptid som er tilstede i M. catarrhalis blebs, eller som kan ekstraheres fra M. catarrhalis blebs eller intakte celler ved n-oktyl-P-D-glukopyranosid (OG) eller sarkosyl detergens i bufferoppløsning ved romtemperatur. Se Murphy og Loeb, 1989, Microbial Pathogenesis 6:159-174, for en diskusjon av M. catarrhalis blebs, som er naturlig forekommende vesikler bestående av den ytre membranen av M. catarrhalis. NHA M. catarrhalis stammer eller kulturer har enten ikke OMP 106 polypeptid, eller har OMP 106 polypeptid i en form som binder anti-OMP 106 antistoffer (se pkt. 5.5, nedenfor) men som ikke reagerer med sølvfarge (dvs. ved anvendelse av Silver Stain Plus fra BioRad [Richmond, CA], eller fremgangsmåten beskrevet av Gottlieb og Chauko, 1987, Anal. Biochem. 165:33). Derimot binder OMP106 polypeptid fra HA M. catarrhalis stammer eller kulturer anti-OMP 106 antistoffer, og reagerer med sølvfarge.

OMP 106 polypeptid kan identifiseres i HA M. catarrhalis blebs eller intakte celler ved dets mottakelighet for nedbrytning ved proteasebehandling som også opphever eller svekker hemaggluineringsaktiviteten av den samme HA stammen (se pkt. 5.1 ovenfor for eksempel protease som vil eller ikke vil ødelegge hemaggluineringsaktiviteten av intakte M. catarrhalis celler). Med andre ord vil en nedbrytning med en protease som ødelegger eller reduserer hemaggluineringsaktiviteten av en HA stamme eller kultur også endre, i SDS-PAGE, mengden eller lokaliseringen av OMP 106 polypeptid isolert fra stammen eller kulturen etter en slik nedbrytning sammenlignet med den isolert fra den samme stammen eller kulturen før nedbrytningen.

OMP 106 polypeptid kan også identifiseres som polypeptidet i OG eller sarkosyl ekstrakt av M. catarrhalis blebs eller intakte celler som har en tilsynelatende molekylvekt større enn 106 kD, som bestemt ved denaturerende gel elektroforese i 12% PAG med SDS, ved anvendelse av preparater beskrevet i Harlow og Lane, ( Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Appendix 1,1988). Varmebehandling av OG- eller sarkosylekstraktet ved 100°C i 5 minutter kan forårsake at OMP 106 polypeptidet har en tilsynelatende molekylvekt på ca. 180 kD til ca. 230 kD, som bestemt ved SDS-PAGE i 6% PAG uten reduserende middel, ved anvendelse av preparater som beskrevet i Harlow og Lane, id. I en spesiell utførelseform har OMP 106 polypeptidet i det varmebehandlede OG eller sarkosylekstraktet av M. catarrhalis stamme ATCC 49143 en tilsynelatende molekylvekt på ca. 190 kD.

OMP 106 polypeptidet kan fremstilles fra en hvilken som helst at M. catarrhalis stammer innbefattende, men ikke begrenset til, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 og ATCC 43628. Den foretrukne kilden for OMP 106 polypeptid er en HA kultur av slike stammer. Den mest foretrukne kilden er en HA kultur av ATCC 49143.

OMP 106 polypeptid ifølge oppfinnelsen omfatter aminosyresekvensen

IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKTV (SEQ ID nr. 1) eller en sekvens som er i det vesentlige homolog med denne. OMP106 polypeptidet kan i tillegg innbefatte, karboksyl-distal til den ovenfornevnte sekvensen, et oktapeptid som har aminosyresekvensen GTVLGGKK (SEQ ID nr. 2) eller en sekvens som er i det vesentlige homolog med denne. Slik betegnelsen her benyttes er en i det vesentlige homolog aminosyresekvens minst 80%, fortrinnsvis 100%, identisk med den refererte aminosyresekvensen, og tilsvarende biologisk aktivitet.

5.3. OMP106- avledede polypeptider

Et OMP106-avledet polypeptid kan være et fragment av OMP 106 polypeptidet. Det intakte OMP 106 polypeptidet kan inneholde en eller flere aminosyre-rester som ikke er nødvendige for dets immunogenisitet. Det kan være tilfellet for eksempel at bare aminosyrerestene som danner en spesiell epitop av OMP 106 polypeptidet er nødvendig for immunogenisk aktivitet. Unødvendige aminosyre-sekvenser kan fjernes ved teknikker som er velkjente innen faget. For eksempel kan de uønskede aminosyresekvensene fjernes ved begrenset proteolytisk nedbrytning ved anvendelse av enzymer så som trypsin, papain, eller beslektede proteolytiske enzymer eller ved kjemisk spaltning ved anvendelse av midler så som syanogen bromid og etterfulgt av fraksjonering av nedbrytnings- eller spaltningsproduktene.

Et OMP106-avledet polypeptid kan også være et modifisert OMP 106 polypeptid eller fragment derav (dvs. et OMP 106 polypeptid eller fragment som har en eller flere aminosyresubstitusjoner, innskudd og/eller utelatelser av villtype OMP106 sekvens). Slike modifikasjoner kan fremme immungenisiteten av det resulterende polypeptid-produktet eller ikke ha noen effekt på slik aktivitet. Modifiseringsteknikker som kan anvendes innbefatter de som er beskrevet i US patentnr. 4.526.716.

Et OMP106-avledet polypeptid kan videre være et kimært polypeptid innbefattende et eller flere heterologe polypeptider sammensmeltet til aminoterminalen eller karboksyl-terminalen eller internt av et fullstendig OMP 106 polypeptid eller en del av eller et fragment derav. Nyttige heterologe polypeptider innbefattende et slikt kimært polypeptid innbefatter, men er ikke begrenset til, a) pre- og/eller pro-sekvenser som letter tran-sport, translokering og/eller prosessering av det OMP106-avledede polypeptidet i en vertcelle, b) affinitetsrensingssekvenser og c) hvilke som helst nyttige immunogene sekvenser (for eksempel sekvenser som koder en eller flere epitoper av et overflate-eksponert protein av et mikrobielt patogen).

Fortrinnsvis er de OMP106-avledede polypeptidene immunologisk kryssreaktive med OMP 106 polypeptidet, og er således i stand til å fremkalle i et dyr en immun respons på M. catarrhalis. De OMP106-avledede polypeptidene har fortrinnsvis sekvenser som danner en eller flere ytre overflate epitoper på det native OMP 106 polypeptidet av M. catarrhalis (dvs. de overflate-eksponerte epitopene av OMP 106 polypeptidet som det eksisterer i intakte M. catarrhalis celler). Slike OMP106-avledede polypeptider kan identifiseres ved deres evne til spesifikt å binde antistoffer dyrket mot intakte M. catarrhalis celler (for eksempel antistoffer frembragt ved formaldehyd eller glutaldehyd fiksert M. catarrhalis celler; slike antistoffer refereres hertil som "anti-fullcelle" antistoffer). For eksempel fraksjoneres polypeptider eller peptider fra en begrenset eller fullstendig proteasenedbrytning av OMP 106 polypeptidet ved anvendelse av standard fremgangsmåter og testes med henblikk på deres evne til å binde anti-fullcelle antistoffer. Reaktive polypeptider innbefatter foretrukne OMP106-avledede polypeptider. De isoleres og deres aminosyre-sekvenser bestemmes ved fremgangsmåter som er kjente innen teknikken.

Videre omfatter de OMP106-avledede polypeptider sekvenser som danner en eller flere epitoper av nativt OMP 106 polypeptid som formidler hemaggluinering ved HA M. catarrhalis celler. Slike OMP106-avledede polypeptider kan identifiseres ved deres evne til å interferere med hemaggluinering ved HA M. catarrhalis celler. For eksempel fraksjoneres polypeptider fra en begrenset eller fullstendig protease nedbrytning eller kjemisk spaltning av OMP 106 polypeptid ved anvendelse av standard fremgangsmåter og testes med henblikk på evnen til å interferere i hemaggluinering ved M. catarrhalis celler. Når det er identifisert og isolert bestemmes aminosyresekvensene av slike OMP106-avledede polypeptider ved anvendelse av standard sekvenseringsfremgangs-måter. Den bestemte sekvensen kan anvendes for å muliggjøre fremstilling av slike polypeptider ved syntetisk kjemisk og/eller gentekniske fremgangsmåter.

Disse OMP106-avledede polypeptidene kan også identifiseres ved å anvende anti-fullcelle antistoffer for å screene bakterielle biblioteker som uttrykker tilfeldige fragmenter av M. catarrhalis genomisk DNA eller klonede nukleotid sekvenser som koder OMP 106 polypeptidet. Se for eksempel Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2<nd> ed. Cold Spring Harbor Press, NY, bind 1, kap. 12. De reaktive klonene identifiseres og deres innskudd isoleres og sekvenseres for å bestemme aminosyresekvensene til de OMP106-avledede polypeptider.

5.4. Isolering og rensing av OMP106 polypeptid og OMP106- avledede polypeptider

Oppfinnelsen tilveiebringer isolerte OMP 106 polypeptider og OMP106-polypeptidvarianter. Slik betegnelsen her benyttes betyr betegnelsen "isolert" at produktet er i det vesentlige fritt for andre biologiske materialer med hvilke det naturlig er forbundet. Det vil si for eksempel at en isolert OMP 106 polypeptid sammensetning er mellom ca. 70vekt% og 94vekt% rent OMP 106 polypeptid. Fortrinnsvis er OMP 106 polypeptidene og OMP106-polypeptidvarianter ifølge oppfinnelsen renset. Slik betegnelsen her benyttes betyr "renset" at produktet er i det vesentlige fritt for annet biologisk materiale med hvilke det naturlig er forbundet. Det vil si omfattet av en renset OMP 106 polypeptid sammensetning er minst 95vekt% rent OMP 106 polypeptid, fortrinnsvis minst 98vekt% rent OMP 106 polypeptid, og mest foretrukket minst 99vekt% rent OMP 106 polypeptid.

OMP 106 polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan isoleres fra proteinekstraktet innbefattende fullcelle-ekstrakt, av en hvilken som helst M. catarrhalis stamme eller kultur. Fortrinnsvis er proteinekstraktet et oktylglukosid eller sarkosylekstrakt av ytre membran vesikler (dvs. blebs) eller fullceller av M. catarrhalis innbefattende, men ikke begrenset til, en hvilken som helst av stammene ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 og ATCC 43628. Den foretrukne kilden for slike ekstrakter er en HA kultur av slike stammer. Den mer foretrukne kilden for slike ekstrakter er en HA kultur av ATCC 49143. Annen kilde for OMP 106 polypeptidet er proteinpreparater fra genekspresjonssystemer som uttrykker klonede sekvenser som koder OMP106 polypeptid eller OMP106-polypeptidvariant (se pkt. 5.8 nedenfor).

OMP 106 polypeptidet kan isoleres og renses fra kildematerialet ved anvendelse av en hvilken som helst biokjemisk teknikk og fremgangsmåte som er velkjent for fagmannen. I en fremgangsmåte oppnås M. catarrhalis ytre membran ved standard teknikker og ytre membran proteiner oppløseliggjøres ved å anvende en oppløseliggjørende forbindelse så som en detergens. En foretrukket oppløseliggjørende oppløsning er en som inneholder ca. 1,25% oktylglukopyranosid v/v (OG). En annen foretrukket opp-løseliggjørende oppløsning er en som inneholder ca. 1,25% sarkosyl. OMP 106 polypeptid er i den oppløselige fraksjonen. Celleavfall og det oppløselige materialet i ekstraktet separeres og fjernes fortrinnsvis ved sentrifugering. Polypeptidene i ekstraktet konsentreres, inkuberes i SDS-holdig Laemmli gelprøvebuffer ved 100°C i 5 minutter, og fraksjoneres ved elektroforese i en 6% denaturerende natrium dodesylsulfat (SDS) polyakrylamid gel (PAG) uten reduserende middel. Se Laemmli, 1970, Natue 227:680-685. Bandet eller fraksjonen identifisert som OMP106 polypeptid som beskrevet ovenfor (for eksempel det sølvfargede polypeptidbåndet som er tilstede i OG eller sarkosyl ekstraktet av en HA, men ikke den av en tilsvarende NHA kultur eller den av HA kulturen etter nedbrytning med en protease som opphever hemaggluineringsaktivitet) kan deretter isoleres direkte fra fraksjonen eller gelstykket inneholdende OMP 106 polypeptidet. I en foretrukket utførelsesform har OMP 106 polypeptidet en tilsynelatende molekylvekt på 190 kD som bestemt ved å sammenligne dets migrer-ingsavstand eller hastighet i en denaturerende SDS-PAGE relativt til de av kanin-sjelettmuskel myosin (200 kD) og E. coli P-galaktosidase (116 kd).

En annen fremgangsmåte for rensing av OMP 106 polypeptid er ved affinitetskromatografi ved anvendelse av anti-OMP106 antistoffer, (se avsnitt 5.5). Fortrinnsvis anvendes monoklonale anti-OMP 106 antistoffer. Antistoffene er kovalent bundet til agarosegeler aktivert ved cyanogenbromid eller suksinamidestere (Affi-Gel, BioRad, Inc.) eller ved andre fremgangsmåter som er kjente for fagmannen. Proteinekstraktet belegges på toppen av gelen som beskrevet ovenfor. Kontakten er i et tidsrom og under standard reaksjonsbetingelser tilstrekkelig for at OMP 106 polypeptidet bindet til antistoffet. Fortrinnsvis er den faste bæreren et materiale anvendt i en kromatografisk kolonne. OMP 106 polypeptidet fjernes deretter fra antistoffet, derved tillates utvind-ingen av OMP 106 polypeptidet i isolert, eller fortrinnsvis renset form.

OMP106-avledet polypeptid ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved kjemisk og/eller enzymatisk spaltning eller nedbrytning av isolert eller renset OMP 106 polypeptid. Et OMP106-avledet polypeptid kan også syntetisere kjemisk basert på den kjente aminosyresekvensen av OMP 106 polypeptid og, i tilfelle et kimært polypeptid, de av det heterologe polypeptidet ved velkjente fremgangsmåter innen teknikken. Se for eksempel Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freemang and Co., NY.

Et OMP106-avledet polypeptid kan også fremstilles i et genekspresjonssystem som uttrykker en rekombinant nukleotid konstruksjon innbefattende sekvenser som koder

OMP 106-avledede polypeptider. Nukleotidsekvensene som koder polypeptider ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres, og/eller klones, og uttrykkes i henhold til teknikker som er velkjente for fagmannen. Se for eksempel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, bind 1-3, Cold Spring Harbor Press NY, Kap. 9. OMP106-avledede polypeptider ifølge oppfinnelsen kan fraksjoneres og renses ved anvendelse av standard proteinrenseteknikker, modifiseres og anvendes i henhold til oppdagelsene og læren som her er beskrevet. Spesielt kan OMP 106 polypeptidene ifølge oppfinnelsen, de som danner en ytre overflateepitop av det native OMP 106 polypeptidet, isoleres og renses i henhold til affinitetsfremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor for isoleringen og rensingen av OMP 106 polypeptid (for eksempel affinitetsrensing ved anvendelse av anti- OMP 106 antistoffer).

Om ønsket kan polypeptidene ifølge oppfinnelsen renses ytterligere ved anvendelse av standard protein- eller peptidrenseteknikker, innbefattende, men ikke begrenset til, elektroforese, sentrifugering, gelfiltrering, utfelling, dialyse, kromatografi (innbefattende jonebyttekromatografi, affinitetskromatografi, immunoadsorbentaffinitetskromato-grafi, revers-fase høy ytelsesvæskekromatografi, og gelgjennomtrengnings-høy ytelses-væske-kromatografi) isoelektrisk fokusering og variasjoner og kombinasjoner derav.

En eller flere av disse teknikkene kan anvendes trinnvis i en fremgangsmåte utformet for å separere molekyler i henhold til deres fysiske eller kjemiske egenskaper. Disse egenskapene innbefatter hydrofobisiteten, ladningen, bindingsevnen og molekylvekten av proteinet. De forskjellige fraksjonene av materialer oppnådd etter hver teknikk testes med henblikk på deres evne til å binde OMP 106 reseptoren eller liganden, til å binde anti-OMP 106 antistoffer eller til å interferere med hemaggluineringen ved HA M. catarrhalis celler ("forsøks" aktiviteter). De fraksjonene som viser slik aktivitet underkastes deretter den neste teknikken i den trinnvise fremgangsmåten, og de nye fraksjonene testes igjen. Denne fremgangsmåten gjentas inntil bare en fraksjon som har de ovenforomtalte "forsøks" aktivitetene forblir og denne fraksjonen produserer bare et enkelt bånd eller en enhet når den underkastes polyakrylamidgel elektroforese eller kromatografi.

5.5. OMP106 immunogener og anti- OMP106 antistoffer

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer antistoffer som spesifikt binder OMP 106 polypeptid eller OMP106-polypeptidvarianter. For fremstillingen av slike antistoffer anvendes isolerte eller fortrinnsvis rensede preparater av OMP 106 polypeptid eller OMP106-polypeptidvarianter som immunogener.

I en utførelsesform separeres OMP 106 polypeptidet fra andre ytre membranproteiner tilstede i OG eller sarkosylekstrakt av ytre membran av HA M. catarrhalis celler eller blebs ved anvendelse av SDS-PAGE (se 5.2 ovenfor) og gelstykket inneholdende OMP 106 polypeptid anvendes som immunogenet og injiseres i en kanin for å fremstille antisera inneholdende polyklonale OMP 106 antistoffer. Det samme immunogenet kan anvendes for å immunisere mus for fremstillingen av hybridomlinjene som produserer monoklonale anti-OMP 106 antistoffer. I spesielle utførelsesformer anvendes et PAG stykke inneholdende isolert eller renset OMP 106 fra en hvilken som helst av stammene ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 og ATCC 43628 som immunogen. I foretrukne utførelsesformer anvendes et PAG stykke inneholdende isolert eller renset OMP 106 fra en HA kultur av slike stammer. I en mer foretrukket utførelsesform anvendes et PAG stykke inneholdende isolert eller renset OMP 106 fra en HA kultur av stamme ATCC 49143 som immunogen.

I andre utførelsesformer anvendes peptidfragmenter av OMP 106 polypeptid som immunogener. Fortrinnsvis anvendes peptidfragmenter av renset OMP 106 polypeptid. Peptidene kan fremstilles ved proteasenedbrytning, kjemisk spaltning av isolert eller renset OMP106 polypeptid eller kjemisk syntese og kan deretter isoleres eller renses. Slike isolerte eller rensede polypeptider kan anvendes direkte som immunogener. I spesielle utførelsesformer innbefatter peptidfragmentet, men er ikke begrenset til, de som har sekvensen IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (Seq Id nr. 1) eller en hvilken som helst del derav som er 6 eller flere aminosyrer i lengde. I en annen utførelsesform har peptidfragmentet sekvensen GTVLGGKK (Seq Id nr. 2).

Nyttige immunogener kan også innbefatte slike peptider eller peptidfragmenter konjugert til et bærermolekyl, fortrinnsvis et bærerprotein. Bærerproteiner kan være et hvilket som helst som er vanlig anvendt innen immunologi, innbefattende, men ikke begrenset til, bovinserum albumin (BSA), kyllingalbumin, "keyhole limpet" hemo-syanin (KLH) og lignende. For en diskusjon av haptenprotein konjugater, se for eksempel Hartlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, eller en standard immunologi lærebok så som Roitt, I. et al, Immunology, CV. Mosby Co., St. Louis, MO (1985) eller Klein, J., Immunolog<y>, Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, MA (1990).

Fremstillingen av antistoffet som spesifikt binder en eller flere ytre overflateepitoper av det native OMP 106 polypeptidet kan også foregå ved anvendelse av intakte HA M. catarrhalis celler eller blebs fremstilt derfra som immunogen. Cellene eller blebsene kan fikseres med midler så som formaldehyd eller glutaldehyd før immunisering. Se Harlow og Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Sprin Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, kap. 15. Det er foretrukket at slike anti-fullcelle antistoffer er monoklonale antistoffer. Hybridomlinjer som produserer de ønskede monoklonale antistoffene kan identifiseres ved å anvende renset OMP 106 polypeptid som screening-ligand. Celler eller blebs av en hvilken som helst M. catarrhalisstamme, innbefattende, men ikke begrenset til, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 og ATCC 43628 anvendes som immunogen for å indusere disse antistoffene. Fortrinnsvis anvendes celler eller blebs av en HA kultur av slike stammer som immunogen. Mer foretrukket anvendes celler eller blebs av en HA kultur av stamme ATCC 49143 som immunogen for å indusere disse antistoffene.

Polyklonale antistoffer fremstilt ved fullcelle eller blebs immuniseringer inneholder antistoffer som binder andre M. catarrhalis ytre membranproteiner ("ikke-anti-OMP106 antistoffer") og er følgelig mer omstendelig å anvende når det er kjent eller antatt at prøven inneholder andre M. catarrhalis ytre membranproteiner eller materiale som er kryssreaktive med disse andre membranproteinene. Under slike forhold må enhver binding ved anti-fullcelle antistoffene av en gitt prøve eller et bånd verifiseres ved samtidig binding av den samme prøven eller båndet ved hjelp av antistoffer som spesifikt binder OMP 106 polypeptid (for eksempel anti-OMP 106) og/eller et OMP 106-avledet polypeptid, eller ved konkurransestester ved anvendelse av anti-OMP 106 antistoffer, OMP 106 polypeptid eller OMP106-avledet polypeptid som konkurrent (dvs. tilsetning av anti-OMP 106 antistoffer, OMP 106 polypeptid eller OMP106-avledet polypeptid til reaksjonsblandingen reduserer eller opphever prøvebindingen ved anti-fullcelle antistoffer). Alternativt kan slike polyklonale antisera, inneholdende "non-anti-OMP106" antistoffer, klargjøres for slike antistoffer ved standardfremgangsmåter og metoder. For eksempel kan non-anti-OMP106 antistoffer fjernes ved utfelling med celler av NHA M. catarrhalis kultur eller M. catarrhalis stammer som er kjent for ikke å ha OMP 106 polypeptidet (for eksempel ATCC 8176, mer foretrukket en NHA kultur av ATCC 49143); eller ved absorbsjon til kolonner innbefattende slike celler eller ytre membranproteiner av slike celler.

I ytterligere utførelsesformer innbefatter nyttige immunogener for å frembringe antistoffer ifølge oppfinnelsen blandinger av to eller flere av et hvilket som helst av de ovenfor omtalte individuelle immunogenene.

hnmunisering av pattedyr med immunogenene som her er beskrevet, fortrinnsvis mennesker, kaniner, rotter, mus, sauer, geiter, kuer eller hester, utføres ved å følge

fremgangsmåter som er velkjente innen teknikken, for det formål å oppnå antisera inneholdende polyklonale antistoffer eller hybridomlinje som utskiller monoklonale antistoffer.

Monoklonale antistoffer kan fremstilles ved standard teknikker, gitt teknikkene som her er inneholdt. Slike teknikker er for eksempel beskrevet i US patent nr. 4,271.145 og US patent nr. 4,196,265. Kort uttrykt immuniseres dyret med immunogenet. Hybridomer fremstilles ved å sammensmelte miltceller fra immuniserte dyr med myelomceller. Fusjonsproduktene screenes for de som produserer antistoffer som binder til immunogenet. De positive hybridomklonene isoleres, og de monoklonale antistoffene fjernes fra disse klonene.

Immuniseringsfremgangsmåter for fremstilling av både polyklonale og monoklonale antistoffer er velkjente innen teknikken. Immunogenet kan injiseres ved en hvilken som helst av en rekke fremgangsmåter, innbefattende subkutan, intravenøs, intraperitoneal, intradermal, intramuskulær, slimhinne eller en kombinasjon av disse. Immunogenet kan injiseres i oppløselig form, aggregert form, knyttet til en fysisk bærer, eller blandet med et hjelpestoff, ved anvendelse av fremgangsmåter og materialer som er velkjente innen teknikken. Antisera og antistoffene kan renses ved å anvende kolonnekromatografi-fremgangsmåter som er velkjente for fagmannen.

OMP 106 polypeptider av M. catarrhalis stammer, HA eller NHA er immun-kryssreaktive. Følgelig binder antistoffer frembrakt mot OMP 106 polypeptid av en M. catarrhalis stamme eller kultur spesifikt OMP 106 polypeptid og OMP106-avledede polypeptider av andre M. catarrhalis stammer og kulturer. For eksempel binder polyklonale anti-OMP 106 antistoffer indusert ved OMP 106 polypeptid av stamme ATCC 49143 spesifikt ikke bare det homologe OMP 106 polypeptidet (dvs. OMP 106 polypeptidet av stamme ATCC49143) men også OMP 106 polypeptidet og/eller OMP 106-avledede polypeptider av andre M. catarrhalis stammer innbefattende, men ikke begrenset til ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43617, ATCC 25240 og ATCC 25238.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å lette isolering og rensing av OMP 106 polypeptid og OMP106-polypeptidvarianter. Antistoffene kan også anvendes som prober for å identifisere kloner i ekspresjonsbiblioteker som har innskudd som koder OMP 106 polypeptid eller fragmenter derav. Antistoffene kan også anvendes i immunoanalyser (for eksempel ELISA, RIA, Westerns) for spesifikt å detektere og/eller kvantifisere M. catarrhalis i biologiske prøver. Anti-OMP 106 antistoffer ifølge oppfinnelsen binder spesifikt OMP 106 polypeptid og binder ikke proteiner fra beslektede bakteriepatogener så som Moraxella ovis, Moraxella lacunata, Moraxella osoensis, Moraxella bovis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae. Følgelig kan anti-OMP106 antistoffer anvendes for å diagnostisere M. catarrhalis infeksjoner.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen, spesielt de som er cytotoksiske, kan også anvendes ved passiv immunisering for å forhindre eller svekke M. catarrhalis infeksjoner av dyr, innbefattende mennesker. (Slik betegnelsen her anvendes er et cytotoksisk antistoff et som fremmer opsonisering og/eller komplementavlivelse av bakterier bundet ved antistoffet). En effektiv konsentrasjon av polyklonale eller monoklonale antistoffer dyrket mot immunogener ifølge oppfinnelsen kan adminstreres til en vert for å oppnå slike effekter. Den eksakte konsentrasjonen av antistoffene administrert vil variere i henhold til hvert spesifikt antistoffpreparat, men kan bestemmes ved å anvende standardteknikker som er velkjente for fagmannen. Administrering av antistoffene kan oppnås ved å anvende en rekke teknikker, innbefattende, men ikke begrenset til de som er beskrevet i avsnitt 5.6 for administreringen av vaksiner.'

Profylaktiske og terapeutiske effekter av antistoffene ifølge oppfinnelsen kan bestemmes ved standard farmasøytiske fremgangsmåter i forsøksdyr. Data oppnådd fra dyre-undersøkelser kan anvendes ved formulering av et område doseringer for anvendelse i mennesker.

5.6. Vaksiner

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også terapeutiske og profylaktiske vaksiner mot M. catarrhalis infeksjoner hos dyr, innbefattende mennesker, og nærmere bestemt gnagere, primater og mennesker. Den foretrukne anvendelsen av vaksinene er i mennesker. Vaksinene kan fremstilles ved teknikker som er kjente for fagmannen og som vil innbefatte for eksempel antigenet i form av et immunogen, en farmasøytisk akseptabel bærer, eventuelt et egnet hjelpestoff, og eventuelt andre materialer som tradisjonelt finnes i vaksiner. En immunologisk effektiv mengde av immunogenet som skal anvendes i vaksinen bestemmes ved fremgangsmåter kjente innen teknikken på bakgrunn av beskrivelsen som er inneholdt heri.

Vaksinene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter en immunologisk effektiv mengde av et hvilket som helst av immunogenene ifølge oppfinnelsen i en farmasøytisk akseptabel bærer.

Betegnelsen "immunologisk effektiv mengde" anvendes her i betydningen en mengde tilstrekkelig til å indusere en immunrespons som kan forhindre M. catarrhalis infeksjoner eller attenuere graden av en hvilken som helst eksisterende eller senere M. catarrhalis infeksjon. Den nøyaktige konsentrasjonen vil avhenge av det spesifikke immunogenet som skal administreres, men kan bestemmes ved standard teknikker som er velkjente for fagmannen for analysering av utviklingen av en immun respons.

Nyttige polypeptid immunogener innbefatter det isolerte OMP 106 polypeptidet og OMP106-avledede polypeptider. Foretrukne immunogener innbefatter det rensede OMP 106 polypeptidet og avledede polypeptider eller peptider av OMP 106. Det kombinerte immunogenet og bæreren kan være en vandig oppløsning, emulsjon eller suspensjon. Generelt vil mengden av polypeptid immunogen være mellom 0,1 og 500 mikrogram pr. dose. Bærerne er kjente for fagmannen og innbefatter stabiliseringsmidler, fortynningsmidler og buffere. Egnede stabiliseringsmidler innbefatter karbo-hydrater, så som sorbitol, laktose, mannitol, stivelse, sukrose, dekstran, og glukose og proteiner, så som albumin eller kasein. Egnede fortynningsmidler innbefatter saltvanns-oppløsning, Hanks balanserte salter og Ringers oppløsning. Egnede buffere innbefatter et alkalimetallfosfat, et alkalimetallkarbonat, eller et jordalkalimetallkarbonat. Vaksinen kan også inneholde et eller flere hjelpestoffer for å forbedre eller fremme den immuno-logiske responsen. Egnede hjelpestoffer innbefatter, men er ikke begrenset til, peptider; aluminiumhydroksyd, aluminiumfosfat; aluminiumoksyd; en sammensetning som består av en mineralolje, så som "Marcol 52" eller en vegetabilsk olje eller et eller flere emulgeringsmidler, eller overflateaktive stoffer så som lysolecitin, polykationer, poly-anioner; og potensielt nyttige humane adjuvanser som BCG og Corynebakterium par-vum. Vaksinen kan også inneholde andre immunogener. En slik cocktail vaksine har fordelen at immunitet mot flere patogener kan oppnås ved en enkelt administrering. Eksempler på andre immunogener er de som er anvendt i de kjente DPT vaksinene.

Vaksinene ifølge oppfinnelsen fremstilles ved teknikker som er kjente innen teknikken, gitt foreliggende lære. Generelt blandes et immunogen med bæreren for å danne en oppløsning, suspensjon eller emulsjon. Et eller flere av additivene omtalt ovenfor kan være i bæreren eller kan tilsettes senere. Vaksinepreparatene kan tørkes, for eksempel ved frysetørking for lagringsformål. I så tilfelle kan de senere rekonstitueres til flytende vaksine ved tilsetting av en egnet flytende bærer.

Vaskinene administreres til mennesker eller andre pattedyr, innbefattende gnagere eller primater. De kan administreres i en eller flere doser. Vaksinene kan administreres ved kjente administreringsmåter. Mange fremgangsmåter kan anvendes for å introdusere vaksinepreparatene som her er beskrevet. Disse fremgangsmåtene innbefatter, men er ikke begrenset til, orale, transdermale, intramuskulære, intraperitonale, intravenøse, subkutane og intranasale fremgangsmåter. De foretrukne fremgangsmåtene er intramuskulær eller subkutan injeksjon.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre anvendelse av en effektiv mengde av OMP polypeptidet ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for å indusere en immunrespons overfor M. catarrhalis i et pattedyr for å beskytte pattedyret mot infeksjon og/eller svekke sykdom forårsaket av M. catarrhalis. Behandlingen innbefatter administrering av immunologisk effektiv mengde av immunogenene ifølge oppfinnelsen til verten og, fortrinnsvis, administrering av vaksine ifølge oppfinnelsen til verten.

5.7. Nukleinsyre som koder OMP106 polypeptid og OMP106- avledede

polypeptider

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også nukleinsyre, DNA og RNA, som koder for OMP 106 polypeptid ifølge oppfinnelsen. Ifølge et trekk kan nukleinsyre ifølge oppfinnelsen syntetiseres ved å anvende fremgangsmåter som er kjente innen teknikken. Spesifikt kan en del av eller hele aminosyresekvensen til OMP 106 polypeptid ifølge oppfinnelsen bestemmes ved å anvende teknikker som er velkjente for fagmannen, så som via Edman nedbrytningsteknikken (se for eksempel Creighton, 1983, Proteins: Structure and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y. s. 34-49). Aminosyresekvensen som oppnås anvendes som en guide for syntensen av DNA som koder OMP 106 polypeptid ifølge oppfinnelsen ved anvendelse av konvensjonelle kjemiske fremgangsmåter eller polymerase kjedereaksjon (PCR) amplifisering av overlappende oligonukleotider.

Ifølge et annet trekk kan aminosyresekvensen anvendes som guide for syntese av oligo-nukleotidblandinger som i sin tur kan anvendes for å screene for OMP 106 polypeptid kodende sekvenser i M. catarrhalis genomiske biblioteker. Slike biblioteker kan fremstilles ved å isolere DNA fra celler av en hvilken som helst M. catarrhalis stamme. Fortrinnsvis fremstilles DNA som anvendes som kilden for den OMP 106 polypeptid kodende sekvensen, for både genomiske biblioteker og PCR amplifisering, fra celler av en hvilken som helst M. catarrhalis stamme innbefattende, men ikke begrenset til, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 og ATCC 43628. Ved fremstillingen av genomiske biblioteker genereres DNA-fragmenter, hvorav noen vil kode for deler av eller hele M. catarrhalis OMP 106 polypeptid. DNA kan spaltes ved spesifikke seter ved å anvende forskjellige restriksjonsenzymer. Alternativt kan man anvende DNase i nærvær av mangan for å fragmentere DNA, eller DNA kan skjær-behandles fysisk, for eksempel ved ultralydsbehandling. DNA fragmentene kan deretter separeres i henhold til størrelse ved standardteknikker, innbefattende, men ikke begrenset til, agarose- og polyakrylamidgel elektroforese, kolonnoekromatografi og sukrose-gradientsentrifugering. DNA fragmentene kan deretter innføres i egnede vektorer, innbefattende, men ikke begrenset til, plasimider, kosmider, bakteriofager lamda eller T4, og gjær artifisielt kromosom (YAC). (Se for eksempel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboaratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. bind I, II). Det genomiske biblioteket kan screenes ved hjelp av nukleinsyre hybridisering til merket probe (Benton og Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein og Hogness, 1975, Proe. Acad. Sei. USA 72:3961).

De genomiske bibliotekene kan screenes med et merket degenerert oligonukleotid tilsvarende aminosyresekvensen til OMP 106 polypeptidet ifølge oppfinnelsen ved å anvende optimale fremgangsmåter kjent innen teknikken. I spesielle utførelsesformer er screening proben et degenerert oligonukleotid som tilsvarer peptidet som har sekvensen IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKrV (Seq Id nr. 1) eller en del derav. I en annen utførelsesform kan screening proben være et degenerert oligonukleotid som tilsvarer et peptid som har sekvensen GTVLGGKK (Seq Id nr. 2). Videre kan oligonukleotidene GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (Seq Id nr. 3) og GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (Seq Id nr. 7), hver tilsvarende OMP106 peptidet GTVLGGKK (Seq Id nr. 2) anvendes som probe. Videre kan sekvensen

GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCAT

TGCTATTGGTGACATTGCGCAA (Seq Id nr. 4) eller et hvilket som helst fragment derav, eller et hvilket som helst komplement av sekvensen eller fragmentene anvendes som probe. En hvilken som helst anvendt probe er fortrinnsvis 15 nukleotider eller lenger.

Kloner i biblioteket med innskudds-DNA som koder OMP 106 polypeptider eller fragmenter derav vil hybridisere til en eller flere av degenerat olignukleotidprobene. Hybridisering av slike oligonukleotidprober til genomiske biblioteker utføres ved å anvende fremgangsmåter som er velkjente innen teknikken. For eksempel kan hybridisering med de to ovenfornevnte oligonukleotidprobene utføres i 2X SSC, 1,0% SDS ved 50°C og vaskes ved anvendelse av de samme betingelsene. I en spesiell utførelsesform er ATCC 94143 DNA sekvens som koder hele eller deler av OMP 106 polypeptidet et Hindlll restriksjonsfragment på ca. 8.000 bp i lengde eller et DRAI restriksjonsfragment på ca. 4.200 bp i lengde.

I et tilfelle kan kloner av nukleotidsekvenser som koder en del av eller hele OMP 106 polypeptidet eller OMP106-avledede polypeptider også oppnås ved screening av M. catarrhalis ekspresjonsbiblioteker. For eksempel isoleres M. catarrhalis DNA og tilfeldige fragmenter fremstilles og ligeres i en ekspresjonsvektor (for eksempel en bakteriofag, plasmid, fagemid eller cosmid), slik at den innskutte sekvensen i vektoren er i stand til å uttrykkes ved vertscellen hvori vektoren så innføres. Forskjellige screening-analyser kan deretter anvendes for å velge for det uttrykte OMP 106 polypeptidet eller OMP106-avledede polypeptider. I en utførelsesform kan de forskjellige anti-OMP 106 antistoffene ifølge oppfinnelsen (se avsnitt 5.5) anvendes for å identifisere de ønskede kloner ved å anvende fremgangsmåter som er kjente innen teknikken. Se for eksempel Harlow og Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Appendix IV. Kloner eller plaquer fra biblioteket bringes i kontakt med antistoffene for å identifisere de klonene som binder.

I en utførelsesform kan kolonier eller plakk inneholdende DNA som koder OMP 106 polypeptid ifølge oppfinnelsen detekteres for å anvende DYNA kuler i henhold til Olsvick et al., 29th ICAAC, Houston, Texas, 1989, innbefattet heri som henvisning. Anti-OMP 106 antistoffer tverrbindes til tosylerte DYNA kuler M280, bg disse antistoffholdige kulene anvendes deretter for å adsorbere til kolonier eller plakk som uttrykker OMP 106 polypeptid ifølge oppfinnelsen. Kolonier eller plakk som uttrykker OMP 106 polypeptid ifølge oppfinnelsen identifiseres som hvilke som helst av de som binder disse kulene.

Alternativt kan anti-OMP 106 antistoffer immobiliseres ikke spesifikt til en egnet bærer, så som silisiumoksid eller "celite" harpiks. Dette materialet anvendes deretter for å adsorbere til bakterielle kolonier som uttrykker OMP 106 polypeptid ifølge oppfinnelsen, som beskrevet i det foregående avsnittet.

Ifølge et annet trekk kan PCR amplifisering anvendes for å fremstille i det vesentlige rent DNA som koder en del av eller hele, OMP 106 polypeptidet fra M. catarrhalis genomisk DNA. Oligonukleotidprimere, degenerert eller andre, tilsvarende kjente OMP 106 polypeptidsekvenser kan anvendes som primere. I spesielle utførelsesformer kan et oligonukleotid, degenerat eller annet, som koder peptidet IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKTV (Seq Id nr. 1) eller en hvilken som helst del derav anvendes som 5' primeren. For eksempel kan en 5' primer være nukleotidsekvensen

GAAGCGGACGGGGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGT

GACATTGCGCAA (Seq Id Nr. 4) eller en hvilken som helst del derav. Nukleotidsekvenser, degenerat eller andre, som er reverse komplementer av sekvens som koder GTVLGGKK (Seq Id nr. 2) kan anvendes som 3' primeren. For eksempel kan et oligonukleotid, degenerat eller på annen måte, som har degeneratnukleotidsekvensen YTTYTTNCCNCCNAGNACNGTNCC (Seq Id Nr. 6) eller YTTYTTNCCNCCYAANACNGTNCC (Seq Id nr. 8) kan bli anvendt som 3' primeren i forbindelse med de forskjellige 5' primerne omtalt ovenfor.

PCR kan utføres for eksempel ved å anvende en "Perkin-Elmer Cetus thermal cycler"

og Taq polymerase "Gene Amp". Man kan velge å syntetisere flere forskjellige degen-ererte primere, for anvendelse i PCR reaksjonene. Det er også mulig å variere stringen-sen av hybridiseringsbetingelsene anvendt ved priming av PCR reaksjonene, for å tillate i større eller mindre grad av nukleotid sekvens likhet mellom degeneratprimerne og de tilsvarende sekvensene i M. catarrhalis DNA. Etter vellykket amplifisering av et seg-ment av sekvensen som koder OMP 106 polypeptidet kan dette segmentet klones og sekvenseres molekylært, og anvendes som en probe for å isolere et fullstendig genomisk klon. Dette vil i sin tur tillate bestemmelsen av genets fullstendige nukleotidsekvens, analysen av dets ekspresjon, og fremstillingen av dets proteinprodukt for funksjonell analyse, som beskrevet infra.

Når en OMP 106 polypeptid kodende sekvens er isolert fra en M. catarrhalis stamme eller kultur er det mulig å anvende den samme fremgangsmåten for å isolere OMP 106 polypeptid kodende sekvenser fra andre M. catarrhalis stammer og kulturer. Det ville være kjent for fagmannen at DNA eller RNA sekvenskodende OMP 106 polypeptid (eller fragmenter derav) ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å oppnå andre DNA eller RNA sekvenser som hybridiserer med denne under betingelser med moderat til høy stringens, ved å anvende generelle teknikker som er kjente innen fagområdet. Hybridisering med en OMP 106 sekvens fra en M. catarrhalis stamme eller kultur under høy stringensbetingelser vil identifisere den tilsvarende sekvensen fra andre stammer og kulturer. Høy stringensbetingelser varierer med probelengde og basesammensetning. Formelen for bestemmelse av slike betingelser er velkjente innen teknikken. Se Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, kap. 11. Slik betegnelsen her benyttes betyr høy stringens hybridiserings-betingelser, som anvendt på prober av mer enn 300 baser i lengde, en endelig vasking i 0,1X SSC/0,1% SDS ved 68°C i minst 1 time (Ausubel et al., red., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Greene Publishing Associates, Inc. og John Wiley & Sons, Inc. New York, på side 2.10.3). I spesielle utførelsesformer er høy stringens vasking i hybridisering ved anvendelse av en probe som har sekvensen ifølge SEQ ID nr. 4 eller dens komplement 2X SSC, 1% SDS ved 50°C i ca. 20 til ca. 30 minutter.

Fagmannen vil være i stand til å identifisere fullstendige kloner av OMP 106 polypeptid kodende sekvens ved anvendelse av fremgangsmåter som velkjente innen teknikken. Omfanget av OMP 106 polypeptid kodende sekvens inneholdt i et isolert klon kan fast-slås ved sekvensering av det klonede innskuddet og sammenligning av den avledede størrelsen av polypeptidet kodet ved de åpne leserammene (ORF'er) med den for OMP 106 polypeptid og/eller ved sammenligning av den avledede aminosyresekvensen med den kjente aminosyresekvens av renset OMP 106 polypeptid. Når et delvis klon av OMP 106 polypeptid kodende sekvens er isolert kan fullstendige kloner isoleres ved å anvende innskuddet av partielt klon som hydridiseirngsprobe. Alternativt kan en fullstendig OMP 106 polypeptid kodende sekvens rekonstrueres fra overlappende partielt kloner ved å spleise innskuddene sammen.

Fullstendige kloner kan være et hvilket som helst som har ORF'er med avledet aminosyresekvens som stemmer overens med den for OMP 106 polypeptid eller, hvor den fullstendige aminosyresekvensen av sistnevnte ikke er tilgjengelig, den for et polypeptid fragment av OMP 106 polypeptid og som har en molekylvekt tilsvarende den for OMP 106 polypeptid. Videre kan fullstendige kloner identifiseres ved evnen av deres innskudd, når de er plassert i en ekspresjonsvektor, til å produsere et polypeptid som binder antistoffer som er spesifikke for aminoterminalen av OMP 106 polypeptidet og antistoffer som er spesifikke for det karboksylterminale OMP 106 polypeptidet.

Nukleinsyresekvenser som koder OMP 106 avledede polypeptider kan fremstilles ved fremgangsmåter som er velkjente innen teknikken. Sekvenser som koder OMP 106-avledede polypeptider kan avledes fra OMP 106 polypeptid som koder seskvenser ved rekombinante DNA fremgangsmåter med tanke på lærene som er beskrevet heri. For eksempel kan den kodende sekvensen av OMP 106 polypeptid endres ved at det skapes aminosyresubstitusjoner som ikke vil påvirke immunogenisiteten av OMP106 polypeptidet eller som kan forbedre dets immunogenisitet. Forskjellige fremgangsmåter kan anvendes, innbefattende, men ikke begrenset til oligonukleotid-rettet setespesifikk mutagenese. Disse og andre teknikker som er kjente innen teknikken kan anvendes for å skape enkle eller multiple mutasjoner, så som erstatninger, innskudd, utelatelser og transposisjoner, som beskrevet i Botstein og Shortle, 1985, Science 229:1193-1210.

Videre kan DNA av OMP 106 polypeptid kodende sekvenser avkortes ved restriksjons-hensyn eller eksonukleasenedbrytninger. Heterologt kodende sekvens kan tilsettet til OMP 106 polypeptid kodende sekvens ved legering eller PCR amplifisering. Videre kan DNA som koder hele eller en del av et OMP106-avledet polypeptid syntetiseres kjemisk eller ved anvendelse av PCR-amplifisering basert på den kjente eller avledede aminosyre-sekvensen av OMP 106 polypeptid og hvilke som helst ønskede endringer til denne sekvensen.

Den identifiserte og isolerte DNA-holdige OMP 106 polypeptid- eller OMP 106 -poly-peptidvariantkodende sekvensen kan innføres i en egnet klonende vektor. Et stort antall vert-vektorsystemer i systemer kjente innen teknikken kan anvendes. Mulige vektorer innbefatter, men er ikke begrenset til, plasmider eller modifiserte viruser, men vektorsystemet må være kompatibelt med den anvendte vertcellen. Slike vektorer innbefatter, men er ikke begrenset til, bakteriofager så som lambda derivater, eller plasmider så som pBR322 eller pUC plasmid-derivater. Innføringen i klonet vektor kan for eksempel oppnås ved ligering av DNA fragmentet inn i en klonende vektor som har komplementære kohesive termini. Dersom imidlertid de komplementære restriksjons-setene anvendt for å fragmentere DNA ikke er tilstede i den klonende vektoren kan endene av DNA-molekylet modifiseres enzymatisk. Alternativt kan et hvilket som helst ønsket sete fremstilles ved ligering av nukleotidsekvenser (linkere) til DNA termini; disse ligerte linkene kan innbefatte spesifikke kjemisk syntetiserte oligo-nukleotider som koder restriksjons endonuklease gjenkjenningssekvenser. I en alternativ fremgangsmåte kan det spaltede DNA modifiseres ved homopolymer tailing. Rekombinante molekyler kan innføres i vertsceller via transformering, transfeksjon, infeksjon, elektro-porering, osv. slik at mange kopier av gensekvensen genereres.

I en alternativ fremgangsmåte kan det ønskede DNA-holdige OMP 106 polypeptid- eller den OMP106-polypeptidvariantkodende sekvensen identifiseres og isoleres etter innfør-ing i en egnet klonende vektor i en "shot gun" fremgangsmåte. Anrikning av den ønskede sekvensen, for eksempel ved størrelsesfraksjonering, kan utføres før innføring i den klonende vektoren.

I spesifikke utførelsesformer muliggjør transformering av vertsceller med rekombinante DNA molekyler som inneholder OMP 106 polypeptid eller OMP106-avledet polypeptid-kodende sekvens generering av multiple kopier av slik kodende sekvens. Følgelig kan den kodende sekvensen oppnås i store mengder ved voksende transformanter, isolering av de rekombinante DNA molekylene fra transformantene og, om nødvendig, gjen-vinning av den innførte kodende sekvensen fra det isolerte rekombinante DNA.

5.8 Rekombinant fremstilling av OMP106 polypeptid og OMP106- polvpeptid-varianter

OMP 106 polypeptid og OMP106-polypeptidvarinter ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved gentekniske fremgangsmåter. I dette tilfellet fremstilles de ved en egnet vertscelle som har blitt transformert med DNA som koder for polypeptidet. Nukleotid-sekvensen som koder OMP 106 polypeptid eller OMP106-polypeptidvarianter ifølge oppfinnelsen kan innføres i en egnet ekspresjonsvektor, dvs. en vektor som inneholder de nødvendige elementene for transkripsjon og translasjon av den innførte polypeptid-kodende sekvensen. Nukleotidsekvensen som koder OMP 106 polypeptid eller OMP106-polypeptidvarianter innføres i vektoren ved en fremgangsmåte slik at de vil bli uttrykket under egnede betingelser (for eksempel i egnet orientering og korrekt leseramme med egnede ekspresjonssekvenser, innbefattende en RNA polymerase-bindende sekvens og en ribosomalbindende sekvens.

En rekke vert-vektorsystemer kan anvendes for å uttrykke den polypeptid-kodende sekvensen. Disse innbefatter men er ikke begrenset til, pattedyrcellesystemer infisert med virus (for eksempel vaksinavirus, adenovirus, osv.); insektcellesystemer infisert med virus (for eksempel baculovirus); mikroorganismer så som gjærholdige gjærvektorer, eller bakterier transformert med bakteriofag DNA, plasmid DNA eller kosmid DNA. Fortrinnsvis er vertcellen et bakterium, og mest foretrukket er bakterien E. coli, B. subtilis eller Salmonella.

Ekspresjonselementene av vektorer varierer i deres styrke og spesifisiteter. Avhengig av det anvendte vert-vektorsystemet kan et hvilket som helst av et antall egnede transkripsjons-og translasjonselementer anvendes. I en spesifikk utførelsesform uttrykkes et kimært protein innbefattende OMP 106 polypeptid- eller OMP 106- poly-peptidvariantsekvens og en pre- og/eller prosekvens av vertcellen uttrykkes. I andre spesifikke utførelsesformer uttrykkes et kimært protein innbefattende OMP 106 polypeptid- eller OMP106-polypeptidvariantsekvens og et affinitetsrensepeptid. I ytterligere spesifikke utførelsesformer uttrykkes et kimært protein innbefattende OMP 106 polypeptid- eller OMP106-polypeptidvariantsekvens og et nyttig immungent peptid eller polypeptid. I foretrukne utførelsesformer inneholder uttrykket OMP 106- polypep-tidvarianten en sekvens som danner enten en ytre overflate epitop eller det reseptor-bindende domene av nativt OMP 106 polypeptid.

En hvilken som helst fremgangsmåte som er kjent innen teknikken for innføring av DNA-fragmenter i en vektor kan anvendes for å konstruere ekspresjonsvektorer inneholdende et kimært gen bestående av egnede transkripsjons/translasjonskontroll-signaler og de polypeptidkodende sekvensene. Disse fremgangsmåtene kan innbefatte in vitro rekombinant DNA og syntetiske teknikker og in vivo rekombinanter (genetisk rekombinasjon). Uttrykking av en nukleinsyresekvens som koder OMP 106 polypeptid ifølge oppfinnelsen kan reguleres ved en andre nukleinsyresekvens slik at innskudds-sekvensen uttrykkes i en vert transformert med det rekombinante DNA-molekylet. For eksempel kan uttrykking av den innskutte sekvensen kontrolleres ved et hvilket som helst promotor/enhancer-element kjent innen teknikken. Promotorer som kan anvendes for å kontrollere uttrykkingen av innskutte sekvenser innbefatter, men er ikke begrenset til, SV40 tidlig promotor område (Bernois og Chambon, 1981, Nature 290:304-310), promotoren inneholdt i det 3' lange terminal gjentaket av Rous sarkoma virus (Yamaoto et al., 1980, Cell 22:787-797), herpes tymidin kinase promotor (Wagner et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:1441-1445), de regulatoriske sekvensene av metallo-tionein genet (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42) for ekspresjon i dyreceller; promotorene av pMaktamase (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. U'SA 75:3727-3731), tac (DeBoer et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:21-25), XPL, eller tre for ekspresjon i bakterieceller (se også "Useful proteins from recombinant bacteria" i Scientific American, 1980,242:74-94); nopalin syntetase promotorområdet eller blomkålmosaikkvirus 35S RNA promotor (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), og promotoren av det fotosyntetiske enzymet ribulose bifosfat karboksylase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120) for uttrykking av implantceller; promotorelementer fra gjær eller andre sopp som Gal 14 promotor, ADC (alkohol dehydrogenase) promotor, PGK (fosforglyserol kinase) promotor, alkalisk fosfatase promotor.

Ekspresjonsvektorer inneholdende OMP106 polypeptid- eller OMP106- polypeptid-variantkodende sekvenser kan identifiseres ved tre generelle tilnærmelser:

(a) nukleinsyre hybridisering,

(b) nærvær eller fravær av "markør" genfunksjoner, og

(c) ekspresjon av innskutte sekvenser.

I den første fremgangsmåten kan nærværet av et fremmed gen innført i en ekspresjonsvektor detekteres ved nukleinsyrehybridisering ved anvendelse av prober innbefattende sekvenser som er homologe til den innskutte OMP 106 polypeptid- eller OMP 106-polypeptidvariantkodende sekvensen. I den andre fremgangsmåten kan det rekombinante vektor/vertsystemet identifiseres og selekteres basert på nærværet eller fraværet av visse "markør"genfunksjoner (for eksempel tymidinkinaseaktivitet, resistens mot antibiotika, transformasjonsfenotype, dannelse av oklusjonslegeme i bakulovirus, osv.) forårsaket ved innføringen av fremmed gener i vektoren. Dersom for eksempel OMP 106 polypeptid- eller den OMP106-polypeptidvariantkodende sekvensen innføres i markørgensekvensen av vektoren kan det rekombinante inneholdende innskuddet identifiseres ved fraværet av markørgenfunksjonen. I den tredje fremgangsmåten kan rekombinante ekspresjonsvektorer identifiseres ved analysering av fremmed genproduktet uttrykket ved rekombinanten. Slike analyser kan for eksempel være basert på fysikalske eller funksjonelle egenskaper for OMP 106 polypeptid ifølge oppfinnelsen i in vitro analaysesystemer, for eksempel binding til en OMP 106 ligand eller reseptor, eller binding med anti-OMP 106 antistoffer ifølge oppfinnelsen, eller evnen av vertscellen til å hemaggluinere eller evnen av celle-ekstraktet til å interferere med hemaggluinering ved M. catarrhalis.

Når et spesielt rekombinant DNA molekyl er identifisert og isolert kan flere fremgangsmåter kjente innen teknikken anvendes for å formere dette. Når et egnet vertsystem og vekstbetingelser er etablert kan rekombinante ekspresjonsvektorer formeres og fremstilles i mengder. Som forklart ovenfor innbefatter ekspresjonsvektorene som kan anvendes, men er ikke begrenset til, de følgende vektorene eller deres derivater: humane eller animalske vimser så som vaksiniavirus eller adenovirus; insektviruser så som bakulovirus; gjærvektorer, bakteriofagvektorer (for eksempel lambda), og plasmid-og kosmid DNA vektorer, for å nevne noen.

I tillegg kan en vertscellestamme velges som modulerer ekspresjonen av de innskutte sekvensene, eller modifiserer og bearbeider genproduktet som spesifikt ønsket. Ekspresjon for visse promotorer kan eleveres i nærvær av visse indusere; følgelig kan ekspresjonen av det genteknisk fremstilte OMP 106 polypeptidet ifølge oppfinnelsen kontrolleres. Videre har forskjellige vertsceller egenskaper og spesifikke mekanismer for translasjons- og postranslasjonsbearbeidelsen og modifiseringen av proteiner. Egnede cellelinjer eller vertssystemer kan velges for å sikre den ønskede modifika-sjonen og bearbeidelsen av det uttrykkede fremmedproteinet.

5.9 Reagenser

Polypeptidene, peptidene, antistoffene og nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen er nyttige som reagenser på klinisk eller medisinsk diagnose av M. catarrhalis infeksjoner og for vitenskapelig forskning vedrørende egenskapene ved patogenisitet, virulens og infekti-vitet av M. catarrhalis, så vel som vertsforsvarsmekanismer. For eksempel kan DNA og RNA anvendes som prober for å identifisere nærværet av M. catarrhalis i biologiske prøver ved hybridisering eller PCS amplifisering. DNA og RNA kan også anvendes for å identifisere andre bakterier som kan kode et polypeptid forbundet med M. catarrhalis OMP106.

Polypeptidene og peptidene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å fremstille polyklonale- og monoklonale antistoffer som kan anvendes for ytterligere å rense sammensetninger inneholdende polypeptidene ifølge oppfinnelsen ved affinitetskromatografi. Polypeptidene og peptidene kan også anvendes i standard immunanalyse for å screene for nærværet av antistoffer til M. catarrhalis i en prøve.

Det er åpenbart at anvendelsen av læren ifølge oppfinnelsen på et spesifikt problem eller miljø vil ligge innenfor fagkunnskapen til en gjennomsnittlig fagmann i lys av læren som her er inneholdt. Eksempler på produktene ifølge foreliggende oppfinnelse og fremgangsmåter for deres fremstilling og anvendelse er gitt i det følgende eksemplet.

6. Eksempel: Isolering og karakterisering av OMP106 polypeptidet og gen som koder det samme fra stamme ATCC 49143 eller annen stamme

6.1. Materialer og fremgangsmåter

6.1.1. Hemaggluineringsananlyse

Hemaggluinering ved M. catarrhalis ble testet som beskrevet av.Soto-Hernandez et al.

(J. Clin, Microbiol. (27:903-908) bortsett fra at 5%, istedenfor 3%, v/v erytrocytter ble anvendt i en skråttstilt agglutineringsanalyse. Innledende hemaggluineringsanalyse ble utført ved anvendelse av 20 ug av bakterieceller (våt vekt). Siden M. catarrhalis ATCC stamme 49143 dyrket på blodagarplater ved 35°C ga en sterk hemaggluineirngsreaksjon

ble den valgt som refereransestamme. Serievis fortynning av ATCC stamme 49143 i 1:2 fortynninger resulterte i avtagende hemaggluineringsreaksjoner. Scoringer på ++++ til + var basert på hemaggluineringen observert ved ATCC stamme 49143 etter serievise 1:2 fortynninger, slik at en + reaksjon resulterte ved anvendelse av Va av antallet celler påkrevet for å oppnå en +++ reaksjon.

6.1.2. Inhibering av hemaggluinering

M. catarrhalis ATCC 49143 cellesuspensjon ble serievis fortynnet 1:2 og fortynningen som ga en + hemaggluineirngsreaksjon når 7 ul av Dulbecco's fosfatbufferet saltvanns-oppløsning og 7 ul av 5% (v/v) humane 0<+> erytrocytter ble anvendt for å analysere inhiberingen av hemaggluinering ved enkle sukre og sukkerderivater. For å bestemme om enkle sukre eller sukkerderivater kunne inhibere hemaggluinering ved M. catarrhalis, ble 7 ul av et gitt sukker ved 500 mM blandet med 7 (al av M. catarrhalis celler og inkubert i 5 minutter for å tillate sukkeret å interagere med cellene. Deretter ble 7 ul av 5% (v/v) human 0<+> erytrocytter tilsatt og hemaggluineringen ble skåret etter 1 minutt. Hvert sukker og sukkerderivat ble testet med henblikk på evnen til å inhibere hemaggluinering. Deretter ble forrådet av hvert sukker og sukkerderivat serievis fortynnet 1:2 og disse fortynningene ble analysert vedrørende deres evne til å inhibere hemaggluinering ved å anvende fremgangsmåten beskrevet ovenfor. På denne måten ble den minimale konsentrasjonen av karbohydrat påkrevet for å inhibere hemaggluinering bestemt.

6.1.3. Ligand og reseptorbinding

M. catarrhalis binding til dyrecelle glykolipid-reseptorer ble undersøkt ved å anvende tynnsjikt kromatografi (TLC) fraksjonering av vertcelle-glykolipidene og merket overlegning på kromatogrammet ved å følge fremgangsmåtene beskrevet av Magnani et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:14365-14369. Kort uttrykt ble glykolipider oppnådd fra Matreya Inc. (Pleasant Gap, PA) oppløst på høyytelses tynnsjikts kromatografiske plater (HPTLC) i kloroform, metanol, vann (5:4:1). Platene ble enten farget med orsinol ved 100°C eller ble overlagt med <125>I-merkede M. catarrhalis blebs fremstilt som beskrevet tidligere (Murphy og Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174) ved 2 X IO<6> cpm/ml i 2 timer. Platene ble deretter vasket 5 ganger, tørket og eksponert mot røntgenfilm.

6.1.4. OG ekstraksion av OMPS

Stammer av M. catarrhalis ble hver dyrket ved 35°C ved 200 opm i 1 liter Mueller Hinton oppløsning i en 4 liters kolbe. Ytre membran protein (OMP) preparater ble isolert ved behandling av 50 mg celler (våt vekt) med 0,67 ml 1,25% n-oktyl 0-D-glukopyronosid (dvs. oktylglukosid; OG) i fosfat bufferet saltvannsoppløsning (PBS) i 30 minutter ved romtemperatur. Celler ble pelletert i en mikrosentrifuge i 5 minutter, og supernatanten ble anvendt som et oktylglukosidekstrakt. Sammenligning av proteinprofiler av disse ekstraktene fra et antall stammer av M. ' catarrhalis med de av blebs (dvs. ytre membran vesikler) isolert ved differensiell sentrifugering, som er meget anriket ytre memberan proteiner (OMP'er) fra M. catarrhalis (Murphy og Loeb, 1989, Microbial Pathogen, 6:159-174) indikerer at oktylglukosid ekstraktene inneholder hovedsakelig ytre membranproteiner av M. catarrhalis (fig. 1). Dette indikerte at oktylglukosid-ekstrakt tilveiebragte en raskere prosedyre med et høyere utbytte av ytre membran-proteiner sammenlignet med ytre membranproteiner fremstilt fra blebs.

6.1.5. Proteolytisk nedbrytning av OMP106

50 mg celler fra ATCC stamme 49143 i 1 ml Dulbecco's fosfatbufferet saltvannsopp-løsning ble nedbrutt i 1 time ved romtemperatur med følgende proteaser: TLCK-behandlet kymotrypsin (5 mg), Proteinase K (5 mg), TPCK-behandlet trypsin (5 mg),

eller protease V8 (100 enheter). Alle proteasene ble oppnådd fra Sigma Chemicals (St. Louis, MO). Umiddelbart etter proteasebehandlingen ble cellene vasket en gang i PVS og resuspendert i 1 ml PBS og den hemaggluinerende aktiviteten ble testet. I tillegg ble proteasebehandlede bakterieceller ekstrahert med oktylglukosid slik at de ytre membranproteinene kunne oppløses for å identifisere spesifikke proteiner som kan ha blitt nedbrutt av proteasene.

6.1.6. Ikke- hemaggluinerende kulturer

Normalt dyrkes hemaggluinerende M. catarrhalis kulturer i rysteflasker inneholdende Mueller Hinton oppløsning ved 35 til 37°C i 200 opm i 24 til 48 timer. Celler tatt direkte fra en blodagarplate eller en agarplate av Mueller Hinton mediet uttrykker også den hemaggluinerende fenotypen. For å selektere for en ikke-hemaggluinerende (NHA) kultur, ble ATCC stamme 49143 serievis ført gjennom hver 5. Dag i statiske kulturer dyrket i Mueller Hinton oppløsning ved 35°C. Ved hver passasje ble inokulum tatt bare fra overflaten av kulturen. Ved den andre passasjen hadde en flytende matte av celler utviklet seg, og denne matten av celler ble anvendt som inokulum for etterfølgende kulturer. Serievis dyrking på denne måten ga NHA kulturer av ATCC 49143 typisk etter tre passasjer.

6.1.7. Isolering av OMP106 polypeptid

OMP106 polypeptid fra ytre membranekstrakt av M. catarrhalis ATCC 49143 detekteres (for eksempel ved sølvfarging eller anti-OMP 106 antistoffer) i denaturerende geler bare etter at ekstrakt er inkubert ved 100°C i 5 minutter. For å bestemme om utseendet av OMP 106 båndet etter inkubering ved 100°C er resultatet av lavere molekylvekt-proteiner somaggregerer under koking, eller om kokingen tillater et normalt aggregert protein å tre inn i gelen, ble et ukokt oktylglukosid ytre membranekstrakt av ATCC 49143 analysert på en nativ polyakrylamidgel. Spesifikke områder av gelen innbefattende de umiddelbart under prøvebrønnen ble skåret ut og kokt. De resulterende prøvene ble deretter oppløst på en denaturende polyakrylamid gel og farget med sølvfarge ("Silver Stain Plus", katalog nr. 161-0449, BioRad Laboratories, Richmond, CA). For N-terminal sekvensering ble et oktylglykosid ytre membranekstrakt av ATCC 49143 blandet med PAGE prøvebuffere inneholdende SDS, og ble inkubert i 5 minutter i kok-ende vannbad. Proteinene ble deretter oppløst på en 12% PAG med SDS og overført til en PVDF membran ved elektroblotting. Området av membranen inneholdende OMP 106 båndet ble deretter skåret ut for aminoterminalsekvensering. Ingen av PAG-fremgangsmåtene anvendt for å isolere OMP 106 polypeptidet anvendte reduserende midler i prøven eller gelbufferne.

6.1.8. Anti- OMP106 antiserum

Antiserum til OMP 106 ble fremstilt ved oppløsning av OMP 106 polypeptid fra en HA kultur av ATCC 49143 i en denaturerende natrium dodesylsulfat polyakrylamidgel som beskrevet tidligere (Lammeli, 1970, Nature 227:680-685), og kutting av det OMP106-holdige båndet ut av gelen. Det utskårede båndet ble maserert og injisert i en kanin for å generere antiserum til OMP 160 polypeptid. Antiserumet ble anvendt for å inhibere hemaggluinering som beskrevet i avsnitt 6.1.2 ovenfor, men ved anvendelse av antiserumet i stedenfor karbohydratet. Antiserumet ble også undersøkt med henblikk på komplement formidlet cytotoksisk aktivitet mot M. catarrhalis som beskrevet i del 7.

6.1.9. Western blots med anti- OMP106 antiserum

M. catarrhalis ATCC 49143, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240, ATCC 25238 og ATCC 8176; M. ovis ATCC 33078; M. lacunata ATCC 17976; M. bovis ATCC 10900; M. osloensis ATCC 10973; Neisseria gonorrhoeae (klinisk isolat); og N. meningtidis ATCC 13077 ble dyrket på sjokoladeagarplater 1 48 timer ved 35°C i 5% CO2. Celler ble fjernet ved skraping av koloniene fra agar-overflaten ved å anvende en polysteren inokulerende luke. Celler ble deretter oppløse-liggjort ved suspendering av 30 |ig celler i 150 ul av PAGE prøvebuffer (360 mM tris buffer [pH 8,8], inneholdende 4% natrium dodecylsulfat og 20% glyserol), og inkubering av suspensjonen ved 100°C i 5 minutter. De oppløseliggjorte cellene ble gjenopp-løst på 12% polyakrylamidgeler ifølge Laemmli og de separerte proteinene ble elektro-foretisk overført til PVDF membraner ved 100 Vi 1,5 timer som beskrevet tidligere (Thebaine et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76:4350-4354) bortsett fra at 0,05% natrium dodesylsulfat ble tilsatt til overføringsbufferen for å lette bevegelsen av proteiner fra gelen. PVDF-membranene ble deretter forbehandlet med 25 ml Dulbecco's fosfatbufferet saltvannsoppløsning inneholdende 0,5% natriumkasein, 0,5% bovint serumalbumin og 1% geiteserum. Alle senere inkuberinger ble utført ved å anvende denne forbehandlingsbufferen.

PVDF-membranene ble inkubert med 25 ml av en 1:500 fortynning av preimmunt kaninserum eller serum fra en kanin immunisert med OMP 106 polypeptid (som beskrevet ovenfor) i 1 time ved romtemperatur. PVDF-membranene ble deretter vasket 2 ganger med vaskebuffer (20 mM tris buffer [pH 7.5] inneholdende 150 mM natrium-klorid og 0,05% Tween-20). PVDF-membranet ble inkubert med 25 ml av en 1:5000 fortynning av peroksidase-merket geit anti-kanin i IgG (Jackson hnmunoResearch Laboratories, West Grove Penn. Katalog nr. 111-035-003) i 30 minutter ved romtemperatur. PVDF membranene ble deretter vasket 4 ganger med vaskebuffer, og ble utviklet med 3,3' diaminobensidin tetrahydroklorid og urea peroksyd som tilført fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, katalog nr. D-4418) i 4 minutter hver.

6.1.10. Anti- OMP106 immunofluoresensfarging av celleoverflate

M. catarrhalis ATCC 49143 ble dyrket over natten ved 35°C i et ristende vannbad i Mueller Hinton oppløsning. Cellene ble pelletisert ved sentrifugering og deretter resuspendert i et like stort volum av Dulbecco's modifisering av fosfatbufferet salt-vannsoppløsning uten kalsium eller magnesium (PBS/MC). 20 ul av cellesuspensjonen ble påført på hver av 5 rene objektsglasss. Etter å ha fått satt seg i 10 minutter ble over-skuddsfluidet fjernet med en mikropipette, og objektsglassene ble tillatt å lufttørke i 1 time. Objektsglassene ble deretter varmefiksert over en åpen flamme inntil glasset var varmt å berøre. Objektsglasssene ble innledningsvis behandlet med 4 ul av 1:40 fortynning av anti-OMP 106 antiserum eller preimmunserum fra det samme dyret fortynnet i PBS/MC, eller PBS/MC i 10 minutter, så vasket 5 ganger med PBS/MC. Objektsglassene ble behandlet med 40 ul av 5 ug/ml PBS/MC av fluoresein isotiaosyanat-merket geiteantistoff til kanin IgG (Kirkegaard og Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD katalog nr. 02-15-06). Objektsglassene ble inkubert i mørke i 10 minutter og ble vasket 5 ganger i PBS/MC. Hvert objektsglass ble lagret dekket med PBS/MC under et dekkglass og ble betraktet med et fluoresens mikroskop utstyrt med et 489 nm filter. For hver prøve ble 5 "fields-of-view" visuelt undersøkt for å vurdere omfanget av fargingen.

6.2. Resultater

6.2.1. Hemaggluingeringsaktivitet

Agglutineringsaktiviteten av M. catarrhalis med hensyn på erytrocytter er spesifikk med den sterkeste aktiviteten observert med humane erytrocytter. Kaninerytrocytter agglutin-eres også ved M. catarrhalis, men mindre dramatisk enri humane celler. Erytrocyttene fra mus, hest eller sau var ikke agglutinerte (se tabell I).

6.2.2, OMP106 reseptorer og ligander

M. catarrhalis hemaggluineringsaktivitet skyldes binding til globotetrose (Giu). Blebs fra hemaggluinerende stammer binder til et glykolipid som har Gb4, mens ikke-hemaggluinerende stammer ikke bindes til det samme glykolipidet (se figur 2). M. catarrhalis hemaggluineringsaktivitet inhiberes ved monosakkaridbestanddeler av Gb4, eller derivater av slike monosakkarider, de mest virkningsfulle inhibitorene er N-acetyl galaktosamin og galaktose (spesielt alfa anomeren av galaktosen) (se tabell 2).

Både N-acetyl galaktosamin og alfa-galaktose er del av Gb4 tetrasakkaridet. Korrela-sjonen mellom hemaggluinering og binding til Gb4, og observasjonen at hemaggluinering inhiberes ved monosakkarider som innbefatter Gb4 reseptoren antyder at M. catarrhalis celler bindes til tetrasakkaridet Gb4. Dette tetrasakkaridet er tilstede på humane erytrocytter og vev, og kan formidle M. catarrhalis tilknytning til eukaryotiske membraner.

6.2.3. Identifikasjon av OMP106 polypeptid

Proteolytisk nedbrytning av M. catarrhalis celler, og senere analyse av hemaggluinering ved de nedbrutte cellene demonstrerte at proetase behandling med kymotrypsin og proteinase K ødela hemaggluineringsaktiviteten, og behandlingen med trypsin ødela delvis hemaggluineringsaktiviteten, hvilket indikerer at hemaggluineringsaktiviteten er protein-formidlet. Analyse av OMP proteinprofilene av proteasenedbrutte M. catarrhalisceller viste at multiple proteiner er nedbrutt i hver prøve, slik at profilene ikke tilveiebragte en nøkkel med hensyn til hvilke proteiner direkte ansvarlig for eller bidrar indirekte til hemaggluineringsaktiviteten (se figur 3).

Siden proteasebehandling indikerte at polypeptidet er direkte eller indirekte ansvarlig for hemaggluineirngsaktivitet ble SDS-PAGE anvendt for å sammenligne OMP profilene fra hemaggluinerigsstamme med OMP profilene fra ikke-hemaggluinerende stammer (fig. 4). Analyse av forskjellene mellom disse profilene indikerte at de hemaggluinerende stammene hadde to unike polypeptider, et med en tilsynelatende molekylvekt på 27 kD (betegnet OMP27) og det andre var det eneste proteinet med tilsynelatende molekylvekt større enn 106 kD (betegnet OMP106). Det skal bemerkes at OMP 106 polypeptid-båndet var fraværende i OMP-preparatene av forskjellige proteasebehandlede celler som har redusert eller ingen hemaggluineringsaktivitet, mens OMP27-båndet var tilstede i OMP preparatet av proteinase K behandlede celler som ikke hadde noen hemaggluineringsaktivitet. I tillegg ble OMP 106 polypeptidbåndet ikke nedbrutt ved proteinase V8 nedbrytning, hvilket ikke påvirket hemaggluineringsaktiviteten for behandlede celler.

6.2.4. OMP profil av NHA kulturer

Serievis dyrkning av NHA kultur av ATCC 49143 i statisk kultur ved 35°C ga en NHA kultur (betegnet 49143-NHA) ved den tredje passasjen for kulturen. Dette tapet av hemaggluineirngsaktivitet var gjentagbart. Analyse av OMP profiler av OG ytre membranekstrakter av HA og NHA kulturene viste at OMP 106 polypeptidbåndet manglet fra 49143-NHA ekstraktet (fig. 5). Dette antydet at OMP106 polypeptidet er M. catarrhalis hemaggluinin (dvs. OMP 106 polypeptid binder Gb4 reseptor eller er en underenhet av et homopolymert protein som binder Gb4 reseptor) eller danner en del av M. catarrhalis hemaggluininet (dvs. OMP 106 polypeptid er en underenhet av et hetero-polymert protein som binder Gb4 reseptoren).

6.2.5 OMP106 og hemagglutinering

Polyklonalt antiserum dyrket til ATCC 49143 OMP 106 polypeptid nøytraliserte hemagglutineringen ved ATCC 49143, såvel som den ved heterologt ATCC 43627. Dette understøtter ytterligere konklusjonen at M. catarrhalis hemagglutinerende aktivitet innbefatter OMP 106 polypeptid, og at OMP 106 polypeptid er antigenisk konservert blant stammer. Se også fig. 9A, som viser antistoffer i det polyklonale antiserum som binder OMP 106 polypeptid av heterologe M. catarrhalis stammer.

6.2.6. Ytre overflate lokalisering av OMP106

Kanin anti-OMP 106 antiserum ble anvendt i indirekte immunfluoresensfarging for å bestemme om OMP 106 polypeptid er eksponert på den ytre overflaten av M. catarrhalis celler. M. catarrhalis celler behandlet med anti-OMP 106 antiserum farget mer intenst og uniformt enn celler behandlet med preimmunt serum eller PBS/MC. Dette indikerte at de intakte M. catarrhalis celler var OMP 106 polypeptid-reaktivt med anti-OMP 106 antistoffer. Dette resultatet indikerer at OMP 106 polypeptid er eksponert på den ytre overflaten av M. catarrhalis. Dette funnet er konsistent med OMP 106 polypeptid som har en rolle ved hemagglutinering og indikerer videre at OMP 106 polypeptid ville være nyttig som en vaksine.

6.2.7. Egenskaper av OMP106 polypeptid

OMP 106 polypeptid eksisterer som et stort proteinkompleks i dets native tilstand eller aggregerer når det ekstraheres med oktyglukosid. Denne slutningen understøttes av funnet at ekstraksjon av M. catarrhalis celler med oktylglukosid vil solubilisere OMP 106 polypeptid, men det ekstraherte OMP 106 polypeptidet trer ikke inn i det denaturerende PAG'er med mindre ekstraktet først inkuberes ved 100°C (figur 6). Videre synes OMP 106 polypeptidbåndet ikke å dannes fra polypeptider av lavere molekylvekt som polymeriserer eller aggregerer ved oppvarming, idet OMP 106 polypeptid i en ikke-varme denaturert prøve er fanget i prøvebrønnen og trer inn i den oppløsende gelen bare dersom prøven først er inkubert ved 100°C. Denne biokjemiske egenskapen er meget nyttig for å indentifisere OMP 106 polypeptid i forskjellige geler.

Ved å anvende oktyl glukosidekstrakter av M. catarrhalis, deretter inkubere ekstraktene med natriumdodesylsulfat ved 100°C, og oppløsning av proteinene på en denaturerende polyakrylamidgel, er det estimert at den tilsynelatende molekylvekten av OMP 106 polypeptid fra forskjellige stammer av M. catarrhalis, spesifikt de fra ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 OG ATCC 43628, å variere fra ca. 180 kD til ca. 230 kD (figur 9A), mens OMP106 polypeptidet av stamme ATCC 49143 synes å ha en tilsynelatende vekt på ca. 190 kD (figur 6).

OMP106 polypeptid av stamme ATCC 49143 ble ekstrahert fra gelstykket og dets N-terminal ble sekvensert. Sekvenseringen viste at N-terminalen av OMP 106 polypeptidet fra den ytre membranen av ATCC 49143 var IGISEADGGKGGANARGDKSIAIQALGSQSIAIGDNKTV (Seq Id nr. 1). I tillegg er et internt peptid av OMP 106 produsert ved lys-C-nedbrytning (Fernandez et al., 1994, Anal Biochem 218:112-117) har blitt isolert og dets sekvensbestemt å være GTVLGGKK (Seq Id nr. 2).

Søkerne genererte tre oligonukleotidprober. To prober tilsvarer det interne peptidet GTVLGGKK, et har følgende sekvens GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (Seq Id nr. 3), det andre har følgende sekvens GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (Seq Id nr. 7). Den andre proben, Mc 5-72, som koder det interne fragmentet (Seq Id nr. 5) av den amino-terminale sekvensen av OMP 106 (Seq Id nr. 1) har følgende sekvens

GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCAT

TGCTATTGGTGACATTGCGGCAA (Seq Id nr. 4). Hybridisering av Mc 5-72 proben til en fullstendig Hindlll eller Dral nedbrytning av M. catarrhalis DNA i hvert tilfelle produserte et enkelt bånd i Southern Blot analyse (figur 7). Hybridiseringsbåndet i HindlJJ nedbrytningen har en tilnærmet størrelse på 8,0 kb; det hybridiserende båndet i Dral nedbrytningen har en tilnærmet størrelse på 4,2 kb (figur 7).

6.2.8. Konservering av OMP106 polypeptid

Western blot analyse av ytre membranproteinekstrakter av et antall M. catarrhalis stammer og beslektede spesies av bakterie viste at anti-OMP 106 antistoffene bindes til et polypeptid på ca. 180 kD til ca. 230 kD i mange M. catarrhalis stammer, både HA og NHA stammer eller kulturer (figur 9A). Anti-OMP 106 antistoffene ble ikke bundet til

noe polypeptid i proteinekstraktene av beslektede bakterier (figur 8 A). Disse resul-

tatene demonstrerer følgende:

1) Anti-OMP106 antistoffer kan anvendes for spesifikt å identifisere og skille M. catarrhalis fra beslektede spesis av bakterier. 2) OMP 106 polypeptid kan anvendes for å generere antistoffer som har diagnostisk anvendelse for identifikasjon av M. catarrhalis. 3) Antistoffer til OMP 106 polypeptid av en stamme (for eksempel OMP 106 av ATCC 49143) kan anvendes for å identifisere og isolere det tilsvarende OMP 106

polypeptidet av andre M. catarrhalisstammer.

Det er interessant at Western blot resultatene viser at mange av NHA M. catarrhalis stammene har OMP 106 polypeptid i OG ekstrakter av deres ytre membraner. Dette funnet og det faktum at sølvfarging av OMP'er fra OG ytre membran ekstrakter av NHA M. catarrhalisstammer etter PAGE ikke avslører et bånd i området 180 kD til 230 kD hvilket indikerer at OMP 106 polypeptidet uttrykkes ved de fleste M. catarrhalis stammer eller kulturer, men at, for å være aktiv ved hemaggluinering (dvs. binding til reseptor på pattedyrcelleoverflater) eller kunne farges med sølv, må OMP 106 polypeptidet være egnet modifisert på en eller annen måte. Tilsynelatende er bare HA-stammer og kulturer istand til på egnet måte å modifisere OMP 106 polypeptidet slik at det formidle bakteriell binding til hemagglutininreseptor på pattedyrcelleoverflater. 7. Eksempel: Virkningsfullhet av OMP106 vaksine: Sytotoksisk aktivitet av anti-OMP106 antiserum.

Komplementformidlet cytotoksisk aktivitet av anti-OMP 106 antistoffer ble undersøkt for å bestemme vaksinepotensialet av OMP 106 polypeptid. Antiserum til OMP 106 polypeptid av en HA kultur av ATCC 49143 ble fremstilt som beskrevet i avsnitt 6.1.8 ovenfor. Aktivitetene av preimmunserumet og anti-OMP 106 antiserumet ved formidling av komplement avlivelse av M. catarrhalis ble undersøkt ved å anvende "Serum Bactericidal Test" beskrevet av Zollinger et al., (Immune Responses to Neisseria meningitis, i Manual of Clinical Laboratory Immunologv, 3rd ed., s. 347-349), bortsett fra at celler av HA og NHA M. catarrhalis stammer eller kulturer ble anvendt istedenfor Neisseria meningitis celler.

Resultatene viser at anti-OMP 106 antiserum formidlet komplement-avlivelse av en HA-kultur av heterologt M. catarrhalis ATCC 43627, men ikke en NHA kultur av M. catarrhalis ATCC 43627 eller NHA M. catarrhalis ATCC 8176. Tabell 3 sammenfatter de komplementformidlede sytotoksiske aktivitetene av preimmunserum og anti-OMP106 antiserum mot en HA-kultur av ATCC 43627.

Som vist i tabell 3 har anti-OMP 106 antiserumet en 8 ganger større cytotoksisk aktivitet enn preimmunserumet. Dette funnet indikerer at OMP 106 polypeptidet er nyttig som en vaksine mot HA M. catarrhalis stammer og kulturer.

Claims

1. OMP 106 polypeptid, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen SEQ ID nr. 1 eller SEQ ID nr. 2.

2. Isolert eller i det vesentlige rent OMP 106 polypeptid, karakterisert ved at det omfatter varianter av SEQ ID nr. 1 som tilsvarende biologisk aktivitet.

3. OMP106 polypeptid ifølge krav 2, karakterisert ved at det i tillegg innbefatter sekvensen av SEQ ID nr. 2.

4. OMP 106 polypeptid ifølge krav 2, karakterisert ved at det innbefatter sekvensen av SEQ ID nr. 1.

5. OMP106 polypeptid ifølge krav 4, karakterisert ved at det i tillegg innbefatter sekvensen av SEQ ID nr. 2.

6. Isolert antistoff, karakterisert ved at det spesifikt binder OMP 106 polypeptidet ifølge krav 1.

7. Isolert antistoff, karakterisert ved at det spesifikt binder OMP 106 polypeptidet ifølge krav 2.

8. Isolert antistoff, karakterisert ved at det spesifikt binder OMP 106 polypeptidet ifølge krav 4.

9. Isolert antistoff ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at det er et cytotoksisk antistoff som formidler komplement-avlivelse av Moraxella catarrhalis.

10. Peptidfragment av OMP 106 polypeptidet ifølge krav 1, karakterisert ved at det spesifikt bindes til et antistoff som spesifikt binder nevnte OMP 106 polypeptid.

11. Peptidfragment av OMP 106 polypeptidet ifølge krav 2, karakterisert ved at det spesifikt binder til et antistoff som spesifikt binder nevnte OMP 106 polypeptid.

12. Vaksine, karakterisert ved at den innbefatter OMP 106 polypeptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 - 5 .

13. Vaksine, karakterisert ved at den innbefatter peptidfragmentet ifølge krav 10 eller 11.

14. Antigen sammensetning, karakterisert ved at den innbefatter OMP 106 polypeptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5.

15. Antigen sammensetning, karakterisert ved at den innbefatter peptidfragmentet ifølge krav 10 eller 11.

16. I det vesentlige rent DNA, karakterisert ved at det innbefatter en nukleotidsekvens som koder OMP 106 polypeptidet ifølge krav 1 -5.

17. I det vesentlige rent DNA, karakterisert ved at det innbefatter en nukleotidsekvens som koder for peptidet ifølge SEQ TD nr. 1.

18. Kjemisk forbindelse til bruk som terapeutikum, karakterisert ved at det består av OMP 106 polypeptid ifølge krav 1.

19. Anvendelse av en effektiv mengde av OMP 106 polypeptidet ifølge et hvilket som helst av de foregående krav for fremstilling av et medikament for behandling av infeksjoner og/eller svekke sykdom forårsaket av M.catarrhalis hos pattedyr.

20. Anvendelse av en effektiv mengde av OMP 106 peptidfragmentet ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for for behandling av infeksjoner og/eller svekke sykdom forårsaket av M.catarrhalis hos pattedyr.