JPH0827028A - 油性アジュバント及びアルミニウムゲルアジュバントからなる動物用ワクチン製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 鶏伝染性コリーザ（ＩＣ）の原因菌であるヘ
モフィルス・パラガリナルム（Ｈｐｇ）のＣ型菌に対す
る免疫初期の抗体産生に優れており、他の製剤に対する
抗体と同様にそれが長期間持続する鶏伝染性コリーザに
対するワクチン製剤を提供する。 【構成】 Ｈｐｇ Ｃ型菌を不活化した抗原液を、親水
性油性アジュバント中に乳化した乳剤と、該抗原液をア
ルミニウムゲルアジュバントに吸着させた乳剤とを混合
してワクチン製剤とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、不活化された細菌、細
菌由来抗原、ウイルスの少なくともいずれかを抗原とし
て含む動物用ワクチン製剤に関するものである。

【０００２】

【従来技術】従来、免疫増強のために、細菌やウイルス
等の抗原を含む液に水酸化アルミニウムゲル、リン酸ア
ルミニウムゲル等のアジュバントを添加することが知ら
れている。

【０００３】また近年、畜産業界、特に養鶏及び養豚業
界では、ワクチンの注射作業を省力化するために、各種
ワクチンの混合及び１回注射により長期の免疫持続性を
示す油性（オイル）アジュバントを添加することが行な
われ、このようなワクチン製剤として、界面活性剤と流
動パラフィンを併用した油性アジュバントを用いた動物
用ワクチン（特開昭６３−３５５２５号）、あるいは貯
蔵安定性や取扱性の改善を目的として抗原液に非イオン
性界面活性剤で油中に乳化させる油性アジュバントワク
チン製剤（特開平５−１１２４６６号）も提案されてい
る。

【０００４】しかし、従来の油性アジュバントワクチン
は、生体内での長期の残留と高度の生体反応を伴って種
々の傷害を示すという問題がある。

【０００５】そこでこのような問題を軽減するために、
例えば鶏では注射部位を頚部皮下等に限定する用法を必
要とし、そのためワクチン注射時の作業性が悪いという
問題を招いている。また、抗原の種類によっては、油性
アジュバントが免疫増強作用を示さない例もあり、例え
ばP.J.Blackallらは、この油性アジュバントにより免疫
増強作用が示されないものとして鶏伝染性コリーザの例
を報告している（G.G.Reid et al ,Avian Diseases 31,
59-63,1986）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のように油性アジ
ュバントは、混合ワクチンの接種を可能とする点、ある
いは長期免疫持続等の点で有効なものであるが、反面に
おいて、上述した生体内での長期の残留や高い生体反応
の問題を避けるために、注射部位が限定されるなどの問
題を別に招く欠点があり、このような制約がなくて、十
分な安全性と有効性を有することができる油性アジュバ
ントが要望されているが、未だ適当な油性アジュバント
は提供されていない。

【０００７】本発明者はこのような従来技術の状況か
ら、有効な長期免疫持続性を示すワクチン製剤。特に、
低粘度であるため注射剤として接種が容易なワクチン製
剤を提供することを目的として本発明を完成するに至っ
たものである。

【０００８】また本発明の別の目的は、安定性に優れ、
長期に渡って保存が可能なワクチン製剤を提供すること
を目的とする。

【０００９】本発明の更に別の目的は、注射局所におけ
る注射物質の残留及び肉芽腫形成が軽度であり、接種個
体に対する安全性の高いワクチン製剤を提供するところ
にある。

【００１０】本発明の他の目的は、特に、鶏伝染性コリ
ーザ（ＩＣ）の原因菌であるヘモフィルス・パラガリナ
ルム（Ｈｐｇ）のＣ型菌に対する免疫初期の抗体産生に
優れており、他の製剤に対する抗体と同様にそれが長期
間持続する鶏伝染性コリーザに対するワクチン製剤を提
供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに本発明より提供される動物用ワクチン製剤の特徴の
一つは、細菌由来抗原、ウィルスの少なくともいずれか
を抗原として含む抗原液を親水性油性アジュバント中に
乳化させた乳剤と、同上抗原液をアルミニウムゲルに吸
着させた乳剤と、を混合したという構成をなすところに
あり、特に、このワクチン製剤が豚あるいは鶏用のもの
であるところにある。

【００１２】上記において用いられる親水性油性アジュ
バントとは、乳化剤とオイルを用いて構成されるもので
あり、乳化剤としては例えば脂肪酸と糖（ソルビトー
ル、マンニトール、ショ糖、ブドウ糖等）とのエステル
あるいはエーテル、脂肪酸とグリセロールまたはポリオ
ールとのエステルが用いられる。オイルとしては、例え
ばマルコール５２（フランスＥＳＳＯ社製）ドラケオー
ル６ＶＲ（米国ＰＥＮＲＥＫＯ社製）等の鉱油、ピーナ
ッツ油、オリーブ油、ゴマ油、大豆油、小麦麦芽油等の
植物油、スクアレン、スクアラン、鯨ろう油等の動物油
などを用いることができる。特に好ましいものとして、
オクタデセノ酸無水マンニトールエーテル１０〜２０％
と、流動パラフィン８０〜９０％を混合した親水性油性
アジュバントを代表的に挙げることができる。

【００１３】油性アジュバントの抗原液量に対する添加
量は、一般的には２５〜７０％の範囲とされることがよ
い。

【００１４】また上記において用いられるアルミニウム
ゲルは、水酸化アルミニウムゲル又はリン酸アルミニウ
ムゲルのいずれも用いてもよい。アルミニウムゲルアジ
ュバントの抗原液に対する添加量は、一般的にはアルミ
ニウム量として０．３〜２．０ｍｇ／ｍｌとすることが
よい。

【００１５】抗原液を油性アジュバント中に乳化させた
乳化剤と、抗原液をアルミニウムゲルアジュバントに吸
着させた乳剤との混合は、この数値に厳に限定されるも
のではないがそれぞれ５０％とするのが好ましい場合が
多い。

【００１６】本発明の対象となる抗原としては、細菌、
細菌由来の抗原、またはウィルスのいずれか一つあるい
はこれらから選択した複数のものを使用でき、例えば、
鶏感染症に対するワクチン製剤を例にすると、細菌とし
て鶏伝染性コリーザ（ＩＣ）の原因菌であるヘモフィル
ス・パラガリナルム（Ｈｐｇ）、鶏マイコプラズマ症
（ＭＧ）のマイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｇ）、
ウィルスとしてニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）、
鶏伝染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）、鶏伝染性ファブ
リキウス嚢病ウィルス（ＩＢＤＶ）などを挙げることが
できる。また、豚感染症に対するワクチン製剤として
は、豚伝性萎縮性鼻炎（ＡＲ）のボルデテラ・ブロンキ
セプチカ（Ｂｂ）及びパスツレラ・ムルトシダ（Ｐｍ）
の毒素（ＰＭＴ）、豚マイコプラズマ肺炎（ＭＰＳ）の
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｈｐ）、豚胸
膜肺炎のアクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ（Ａ
ｐ）及びＡｐ由来の毒素などを例に挙げることができ、
これらの抗原は、使用目的により１つの抗原に対するワ
クチン製剤として、或いは複数の抗原を混合した混合ワ
クチン製剤として用いることができる。

【００１７】

【作用】本発明によれば、従来の油性アジュバントワク
チン製剤に比べ、安定性に優れまた高度の安全性と有効
性を保有する動物用ワクチン製剤を作り出すことができ
る。

【００１８】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて更に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００１９】実施例１鶏ＩＣ（Ａ・Ｃ型）・ＭＧ混合アジュバントワクチン製
剤 （１）抗原液の調製 ＜ＩＣ＞ Ｈｐｇ Ａ型菌２２１株、及びＣ型菌Ｇ−１
株を、それぞれ液体培地で３７℃、１６〜２４時間培養
した。両培養菌液に界面活性剤を添加して処理した後、
菌液を遠心して集菌した。沈殿菌を培養量の約１／２０
〜１／１００のリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）に均一に浮
遊した後、ホルマリンを０．１Ｖ／Ｖ％の割合に加え、
２〜５℃で７日間以上静置し、不活化したものを抗原液
とした。なお、ワクチンの調整時には、あらかじめ所定
の総菌数になる様に上記ＰＢＳで調整した。

【００２０】＜ＭＧ＞ Ｍｇ ＳＡＳ株を液体倍地で３
７℃、２日間培養した。この培養菌液にホルマリンを
０．１Ｖ／Ｖ％の割合に加えて不活化した。不活化後、
この菌液を遠心して集菌した。得られた沈殿菌をＰＢＳ
に均一に浮遊した後、所定の総菌数になるようＰＢＳで
濃度調整したものを抗原液とした。

【００２１】（２）ワクチン製剤の調製 上記調整した抗原液を下記表１に示すように混合（数字
は容量％）した。混合にあたり各抗原液はあらかじめ２
５℃に加温し、ＨｐｇとＭｇの抗原を別々に油性アジュ
バント、アルミニウムゲルアジュバントと混合した後、
これらの両液を再混合した。撹拌時間はそれぞれ１０分
間とした。

【００２２】以上により実施例１のワクチン製剤は、Ｈ
ｐｇ抗原及びＭｇ抗原とを含み、またアジュバントとし
て油性アジュバントとリン酸アルミニウムゲルアジュバ
ントを含むワクチン製剤として調製された。

【００２３】また比較のために、上記両抗原を油性アジ
ュバント中に乳化させた比較例１のワクチン製剤を調製
した。

【００２４】尚、油性アジュバントの添加量は、実施例
１では２５％、比較例１では５０％とし、実施例１のリ
ン酸アルミニウムゲルアジュバントの添加量は０．３ｍ
ｇ／ｍｌとした。

【００２５】

【表１】

【００２６】（３）ワクチン製剤の特性 実施例１及び比較例１の各ワクチン製剤は、乳白色ない
し白色の不透明で均質な液体で、粘度及び電導度は表２
の通りであった。なお粘度はブルックフィールド社のＬ
ＶＦ型を用いて、温度２０℃±０．１℃、回転数３０ｒ
ｐｍの条件下で測定した。電導度はＴＯＡのＣＭ−３０
ＥＴ型を用い、温度２１．４°で測定した。結果を下記
表２に示した。

【００２７】

【表２】

【００２８】表２に示すように、実施例１のワクチン製
剤は６．４ｍＰａｓと低粘度であり注射は極めて容易に
行えた。これに対し、比較例１のワクチン製剤は、粘度
が２３．５ｍＰａｓと高かった。

【００２９】（４）ワクチン製剤の安定性 実施例１のワクチン製剤を２〜５℃の暗所に保存し、７
日，３０日，９０日，１８０日保存後の安定性を、肉眼
的観察による分離程度、粘度、電導度を指標に評価し
た。分離程度は以下により３段階評価した。結果を下記
表３に示した。

【００３０】

【表３】

【００３１】表３から分かるように、実施例１のワクチ
ン製剤は２〜５℃で１８０日間は安定であることが確認
された。

【００３２】（５）ワクチン製剤の安全性及び有効性 （安全性）実施例１及び比較例１の各ワクチン製剤０．
５ｍｌを、３５日齢の鶏１０羽ずつの下腿部筋肉内に注
射した。注射後２８日間、臨床的異常を観察した。注射
部位の剖検は注射後４２日目に行ない、注射物質の残留
及び肉芽組織形成を観察した。結果を下記表４に示し
た。

【００３３】

【表４】

【００３４】表４から分かるように、両ワクチン製剤を
注射した鶏にはいずれも臨床的異常を発現したものはな
かったが、４２日目の注射部位の剖検では、実施例１の
注射物質の残留が比較例１に比べ明かに軽度であった。

【００３５】（有効性）上記安全性を調べた鶏について
有効性を確認した。ＩＣの免疫効果は注射後２８日目の
ＨＩ抗体の測定で行った。ＭＧについては同時期の攻撃
試験による１４日後の気管の病理組織標本の観察により
判定した。結果を下記表５に示した。

【００３６】

【表５】

【００３７】表５から分かるように、実施例１のワクチ
ン製剤の免疫効果は高く、特にＩＣのＣ型菌に対するＨ
Ｉ抗体の産生で、比較例１の製剤より有意に優れてるこ
とが認められた。ＭＧについては両製剤とも良好な免疫
効果を認めた。

【００３８】（６）免疫の持続性及び注射物の残留性 前項（５）記載の要領で両ワクチン製剤を３０羽ずつに
免疫し、経時的に免疫の持続性と注射物の残留性を調べ
た。結果を下記表６及び７に示した。

【００３９】

【表６】

【００４０】

【表７】

【００４１】これらの表から分かるように、両ワクチン
製剤の免疫の持続は、表６に示すように２０週目迄は持
続していたが、実施例１の製剤は４週から８週目のＩＣ
のＣ型ＨＩ抗体生産性において比較例１より優れてい
た。また注射物質の残留は表７に示すように、２２週目
で２０〜３０％の鶏に残留が認められたが、実施例１は
比較例１より明らかに軽度であった。

【００４２】実施例２鶏ＮＤ・ＩＢ２価・ＩＣ（Ａ・Ｃ型）ＭＧ混合アジュバ
ントワクチン製剤 （１）抗原液の調製 ＜ＮＤ＞＜ＩＢ＞ ＮＤウィルス 石井株（ＮＤＶ 石
井株）、ＩＢウィルス石田および宮崎株（ＩＢＶ 石田
株、ＩＢＶ 宮崎株）を、それぞれ１０〜１２日齢の発
育鶏卵の尿膜腔内に注射し、１〜５日間感染増殖させ
た。これらの尿膜腔液にホルマリンを０．２Ｖ／Ｖ％の
割合に加え、３７℃で１〜２日間不活化し、限外濾過に
よる濃縮またはＰＢＳで希釈し所定のウィルス量に濃度
調整したものを抗原液とした。

【００４３】＜ＩＣ＞＜ＭＧ＞ 実施例１と同一の方法
で抗原液を調製した。

【００４４】（２）ワクチン製剤の調製 表８に示すように、各抗原液を実施例１と同様の方法で
混合（数字は容量％）した。

【００４５】また比較のために、比較例１と同様にして
下記表８に示すように上記各抗原液を油性アジュバント
中に乳化させて比較例２のワクチン製剤を調製した。

【００４６】

【表８】

【００４７】（３），（４）ワクチン製剤の特性と安定
性 この実施例２のワクチン製剤の特性及び安定性に関する
成績は、実施例１で記載した成績と同様であった。

【００４８】（５）ワクチン製剤の安全性及び有効性 （安全性）実施例２及び比較例２の各ワクチン製剤０．
５ｍｌを、３５日齢の鶏１０羽ずつの下腿部筋肉に注射
した。注射後２８日間、臨床的異常を観察した。注射部
位の剖検は注射後４２日目に行ない、注射物質の残留及
び肉芽組織形成を観察した。結果を下記表９に示した。

【００４９】

【表９】

【００５０】表９から分かるように、両ワクチン製剤を
注射された鶏にはいずれも臨床的異常を現したものはな
かったが、４２日目の注射部位の剖検では、実施例２の
注射物質の残留が比較例２に比べ明かに軽度であった。

【００５１】（有効性）上記安全性を調べた鶏について
有効性を確認した。すなわち、注射後２８日目の血清に
ついて、ＮＤとＩＣはＨＩ抗体を、ＩＢは中和抗体を測
定した。ＭＧは同時期の攻撃試験による１４日後の気管
の病理組織標本の観察により判定した。結果を下記表１
０に示した。

【００５２】

【表１０】

【００５３】表１０から分かるように，ＩＣについては
実施例１と同様の成績が得られ、実施例２のワクチン製
剤は比較例２の製剤より有意に優れていた。

【００５４】実施例３豚ＡＲ・ＭＰＳ混合アジュバントワクチン製剤 （１）抗原液の調製 ＜ＡＲ＞ Ｂｂ Ｎ−４０株を液体培地で３７℃、１８
〜２４時間培養した。

【００５５】この培養菌液にホルマリンを０．２５Ｖ／
Ｖ％の割合に加えて不活化した。不活化後、この菌液を
遠心して集菌し、所定の総菌数になるようＰＢＳで濃度
調整したものを抗原液とした。

【００５６】ＰｍＧ−７株を液体培地で３７℃、通気撹
拌培養した。この培養菌液を遠心して集菌し、所定の総
菌数になるようＰＢＳに再浮遊し、菌体を破砕処理し
た。処理後イオン交換クロマトグラフィ−により精製し
たものを所定の蛋白量になるようにＰＢＳで濃度調整し
不活化後、抗原液とした。

【００５７】＜ＭＰＳ＞ Ｍｈｐ ＭＩ−３株を液体培
地で３７°、２〜３日間培養した。

【００５８】この培養菌液を集菌し、所定の総菌数にな
るようにＰＢＳで濃度調整した菌液にホルマリンを０．
１Ｖ／Ｖ％の割合に加えて不活化したものを抗原液とし
た。 （２）ワクチン製剤の調製 表１１に示すように上記抗原液を実施例１と同じ方法に
より混合（数字は容量％）した。

【００５９】また比較のために、比較例１と同様にして
下記表１１に示すように上記各抗原液を油性アジュバン
ト中に乳化させて比較例３のワクチン製剤を調製した。

【００６０】

【表１１】

【００６１】（３），（４）ワクチン製剤の特性と安定
性 この実施例３のワクチン製剤の特性及び安定性に関する
成績は、実施例１で記載した成績と同様であった。

【００６２】（５）ワクチン製剤の安全性と有効性 （安全性）実施例３と比較例３の両ワクチン製剤１ｍｌ
を、３０日齢のブタ５頭ずつの頚部筋肉に３週間隔で２
回注射した。１回目注射後５週間、臨床的異常以上を観
察した。

【００６３】また、１回目注射８週間後に注射部位を剖
検し、注射物質の残留及び肉芽組織形成を観察した。

【００６４】これらの結果を下記表１２に示した。

【００６５】

【表１２】

【００６６】表１２から分かるように、両ワクチン製剤
を注射されたブタにはいずれも臨床的異を発現したもの
はなかった。剖検時の注射物質の残留は両者に観察され
たが、その程度は実施例３は比較例３に比べ軽度であっ
た。

【００６７】（有効性）上記安全性を調べた豚について
有効性を確認した。すなわち、ＡＲの免疫効果は１回目
注射後５週目のＢｂに対する凝集（Ａｇｇ）抗体とＰＭ
Ｔ対するＥＬＩＳＡ抗体の測定で、ＭＰＳの免疫効果は
同時期の攻撃試験による３週後の肺病変の観察により判
定した。結果を下記表１３に示した。

【００６８】

【表１３】

【００６９】表１３から分かるように、両ワクチン製剤
とも良好な免疫効果をみとめた。

【００７０】（６）免疫の持続性及び注射物の残留性 前項（５）記載の要領で両ワクチン製剤を１０頭ずつに
免疫し経時的に免疫の持続性と注射物の残留性を調べ
た。結果を下記表１４及び１５に示した。

【００７１】

【表１４】

【００７２】

【表１５】

【００７３】免疫の持続は、表１４に示すように両製剤
とも少なくとも８か月目まで持続していた。また、表１
５に示すように４か月目と８か月目の注射部位の剖検成
績は明らかに実施例３が比較例３より優れていることを
示していた。

【００７４】実施例４豚胸膜肺炎多価アジュバントワクチン （１）抗原液の調製 ＜菌体＞ Ａｐｌ型菌４１−１株及び型菌ＳＨＰ−１株
を液体培地で３７℃、４〜１０時間培養した。この培養
菌液にホルマリンを０．２５Ｖ／Ｖ％の割合に加えて不
活化した。不活化後、この菌液を遠心して集菌し、所定
の総菌数になるようＰＢＳで濃度調整したものを抗原と
した。

【００７５】＜毒素＞ 上記１及び２型菌を液体培地で
３７℃、４〜１０時間培養した。この培養菌液を遠心し
て得られた上清を限外濾過により濃縮、部分精製し、所
定の蛋白量になるようにＰＢＳで稀釈したものを抗原液
とした。

【００７６】（２）製剤の調製 表１６に示すように上記抗原液を実施例１と同じ方法に
より混合（数字は容量％）した。

【００７７】また比較のために、比較例１と同様にして
下記表１６に示すように上記各抗原液を油性アジュバン
ト中に乳化させて比較例４の製剤を調製した。

【００７８】

【表１６】

【００７９】（３）製剤の有効性 油性アジュバントと水酸化アルミニウムゲルを含む実施
例４の製剤を、油性アジュバントだけを含む比較例４の
製剤と共に、ニワトリ，ブタに使用して、実施例１と同
じ項目について検査した。その結果、実施例４の製剤
は、比較例４の製剤に比べて注射局所の反応、注射物質
の残留が軽度であり、有効性のあることが確認された。

【００８０】

【発明の効果】以上のことから、本発明の油性アジュバ
ント及びアルミニウムゲルアジュバントを含む動物用ワ
クチン製剤は、従来の油性アジュバントだけを含むワク
チン製剤に比べて、下記の点において優れているという
効果が得られる。

【００８１】１．粘度が低く注射時の操作性が良い。

【００８２】２．注射局所における注射物質の残留及び
肉芽腫形成が軽度である。

【００８３】３．特に、従来の油性アジュバントでは免
疫増強作用が認められなかった鶏伝染性コリーザ（Ｉ
Ｃ）の原因菌であるヘモフィルス・パラガリナルム（Ｈ
ｐｇ）のＣ型菌に対する免疫初期の抗体産生に優れてお
り、他のワクチン製剤に対する抗体と同様にそれが長期
間持続する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不活化された細菌、細菌由来抗原、ウイ
   ルスの少なくともいずれかを含む抗原液を親水性油性ア
   ジュバント中に乳化した乳剤と、不活化された細菌、細
   菌由来抗原、ウイルスの少なくともいずれかを含む抗原
   液をアルミニウムゲルアジュバントに吸着させた乳剤
   と、を混合することを特徴とする動物用ワクチン製剤。
2. 【請求項２】 請求項１記載の鶏又は豚用ワクチン製
   剤。