ES2253784T3

ES2253784T3 - Nuevo polipeptido extraido de hemophilus paragallinarum y su procedimiento de produccion.

Info

Publication number: ES2253784T3
Application number: ES97940361T
Authority: ES
Inventors: Eiji Tokunaga; Masashi Sakaguchi; Kazuo Matsuo; Fukusaburo Hamada; Sachio Tokiyoshi
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1996-09-19
Filing date: 1997-09-12
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2017-09-12
Also published as: AU4220097A; BR9706813B1; DE69734761T2; AU702080B2; EP0870828A1; ID20029A; US6919080B2; CN1149288C; TR199800898T2; EP0870828B1; BR9706813A; US6544519B1; CA2236165A1; US20030027987A1; KR100584904B1; DE69734761D1; KR19990067655A; EP0870828A4; JPH1084969A; CN1208436A

Abstract

SE DESCRIBE UN NUEVO POLIPEPTIDO PROCEDENTE DE HAEMOPHILUS PARAGALLINARUM, QUE RESULTA UTIL PARA LA PREVENCION DE LA CORIZA CONTAGIOSA DE LAS AVES. SE DESCRIBE UN NUEVO POLIPEPTIDO PROCEDENTE DE HAEMOPHILUS PARAGALLINARUM QUE INDUCE LA PRODUCCION DE UN ANTICUERPO HI Y PREVIENE LA INFECCION Y LA APARICION DE LA CORIZA CONTAGIOSA DE LAS AVES, UN GEN QUE CODIFICA PARA DICHO POLIPEPTIDO, UN VECTOR RECOMBINANTE PARA LA EXPRESION DE DICHO GEN, UN HUESPED TRANSFORMADO CON DICHO VECTOR, UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR DICHO POLIPEPTIDO EN EL CUAL DICHO POLIPEPTIDO ES PRODUCIDO POR DICHO HUESPED, UNA VACUNA PARA LA CORIZA CONTAGIOSA DE LAS AVES QUE INCLUYE COMO PRINCIPIO ACTIVO DICHO POLIPEPTIDO, UN ANTICUERPO MONOCLONAL OBTENIDO UTILIZANDO DICHO POLIPEPTIDO COMO INMUNOGENO, Y UN AGENTE DE DIAGNOSTICO Y UN AGENTE TERAPEUTICO PARA LA CORIZA CONTAGIOSA DE LAS AVES QUE UTILIZAN DICHO PEPTIDO Y DICHO ANTICUERPO.

Description

Nuevo polipéptido extraído de Hemophilus paragallinarum y su procedimiento de producción.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un polipéptido que puede prevenir la coriza infecciosa aviar. Más particularmente, la presente invención se refiere a un polipéptido de Haemophilus paragallinarum, el agente causante de la coriza infecciosa aviar, a un gen que codifica dicho polipéptido y a una proteína anticuerpo que reconoce dicho polipéptido. La presente invención se refiere además a un proceso para preparar dicho polipéptido y a la utilización de dicho polipéptido para una vacuna, un agente de diagnóstico y un agente terapéutico.

Antecedentes

La coriza infecciosa aviar es una de las enfermedades respiratorias más importantes de las aves de corral, la cual es una enfermedad respiratoria aguda causada por la infección con Haemophilus paragallinarum (referido también de aquí en adelante como "HPG") siendo los síntomas principales nariz moqueante, inflamación de la cara y epífora. La coriza infecciosa aviar produce un gran daño económico, ya que da lugar a una disminución de la tasa de cría de las aves de corral, retrasando la puesta de huevos, a la disminución de la producción de huevos o a un fallo de la puesta de huevos. Para la prevención de la coriza infecciosa aviar, se ha estado utilizando mucho hasta ahora una vacuna inactivada que es obtenida cultivando Haemophilus paragallinarum, recuperando e inactivando las células con formalina, timerosal y similares. Sin embargo, los efectos colaterales adversos causados por tal vacuna inactivada han sido un problema, ya que se ha informado que se forman lesiones necróticas locales en los pollos inoculados cuando se administra la vacuna (M. Matsumoto y R. Yamamoto, Avian Dis., 15: 109-117, 1971) y, por tanto, se desea fervientemente el desarrollo de una vacuna muy segura.

En los años recientes, el ahorro de trabajo en la cría y en el manejo de las aves de corral está progresando con un incremento a escala de la cría de aves de corral. Como parte de esto, se ha deseado también fervorosamente un ahorro de trabajo en la vacunación y, como resultado, ya se ha desarrollado y se está utilizando ampliamente en el campo una vacuna mixta, de tal manera que puede reducirse la frecuencia de inoculación mediante la mezcla de varios tipos de vacunas.

Con el fin de proporcionar una vacuna mixta que presente una inmunogenicidad equivalente a la de cada vacuna individual sin incrementar la cantidad de dosificación, es necesario incrementar la cantidad de cada antígeno contenido en una vacuna mixta o encontrar y utilizar un adyuvante más adecuado. Sin embargo, en el caso de las bacterias Gram-negativas tales como HPG, es probable que una mayor cantidad de antígeno incremente la respuesta a la inyección, tal como una inflamación en el sitio inoculado. Por tanto, para reducir tal respuesta adversa, es preferible obtener solamente un antígeno protector, esto es un componente eficaz, a partir de las células bacterianas o del sobrenadante del cultivo, o bien clonar un gen que codifique dicho antígeno mediante la técnica de recombinación genética, expresar dicho gen en bacterias, levaduras, células animales, células vegetales, células de insecto y similares, y purificar un producto expresado en gran cantidad, que es luego mezclado con un adyuvante apropiado junto con otras
vacunas.

Otro procedimiento para ahorrar trabajo en la vacunación es la utilización de virus o bacterias como vectores. Esto es, los genes que codifican antígenos protectores de uno o varios patógenos han sido incorporados a un virus o a una bacteria atenuados para preparar una vacuna viva polivalente. Para las aves de corral, los poxvirus, el virus de la Enfermedad de Marek y similares han sido investigados como vectores. Se ha puesto en práctica una vacuna que comprende un vector vírico, en la cual los genes que codifican las proteínas HN y F del virus de la enfermedad de Newcastle están incorporados en el poxvirus de las aves de corral.

Es por tanto muy importante identificar un antígeno protector de HPG para el desarrollo de una vacuna segura y eficaz frente a la coriza infecciosa aviar, como un componente de la vacuna o como un vector de la vacuna.

Entre los antígenos protectores de HPG tales como la hemaglutinina (HA) y la proteína de la membrana externa, se considera que la HA es un antígeno muy importante, ya que la inmunización de pollos con HPG aumenta un anticuerpo inhibidor de la hemaglutinación (referido de aquí en adelante como "anticuerpo HI") y se observa un mayor efecto protector en pollos con un nivel elevado de anticuerpos HI (K. Otsuki e Y. Iritani, Avian Dis., 18: 297-304, 1974 y K. Kume y col., Jpn. J. Vet. Sci., 46: 843-850, 1984).

El serotipo de HPG está clasificado en los serotipos A, B y C (Page, Am. J. Vet. Res., 23: 85-95, 1962) o en los serotipos 1 y 2 (Sawata y col., Jpn. J. Vet. Sci., 40: 645-652, 1978) basados en el ensayo de aglutinación. Se considera que el serotipo A de Page corresponde al serotipo 1 de Sawata y col., mientras que el serotipo C de Page corresponde al serotipo 2 de Sawata y col. (K. Kume y col., Am. J. Vet. Res., 41: 757-760, 1980 y Sawata y col., Am. J. Vet. Res., 41: 1901-1904, 1980).

Kume y col. informaron que HPG serotipo A (serotipo 1) tiene al menos tres tipos de HA, a saber HA-L (lábil al calor, sensible a tripsina), HA-HL (lábil al calor, resistente a tripsina) y HA-HS (estable al calor, resistente a tripsina), y que HA-L sola presenta no solamente actividad HA en eritrocitos de pollo frescos normales, sino también en eritrocitos de pollo fijados con glutaraldehído y está implicada en la protección frente a la infección por HPG serotipo A (K. Kume, Jpn. J. Vet. Sci., 45: 783-792, 1983 y Sawata y col., Jpn. J. Vet. Sci., 46: 21-29, 1984).

Iritani y col. informaron que HPG serotipo A tiene dos tipos de HA, a saber HA de tipo 1 (lábil al calor, sensible a proteasas) y HA de tipo 2 (lábil al calor, resistente a proteasas), y que la HA de tipo 1, que es lábil al calor y sensible a proteasas y que consta de un polipéptido que tiene un peso molecular de 39 kd aproximadamente como una subunidad, está implicada en la protección frente a la infección (T. Yamaguchi e Y. Iritani, Jpn. J. Vet. Sci., 42: 709-711, 1980 e Y. Iritani y col., Am. J. Vet. Res., 41: 2114-2118, 1980). Se considera que las HA-L y HA-HL de Kume y col. corresponden a la HA de tipo 1 y a la HA de tipo 2 de Iritani y col., respectivamente. En cuanto a HPG serotipo C (serotipo 2), Sawata y col. informaron que se había encontrado un antígeno que era lábil al calor y sensible a tripsina y que presentaba actividad HA en eritrocitos de pollo fijados en glutaraldehído, y que este antígeno era distinto de la HA de HPG serotipo A en su antigenicidad (Sawata y col., Am. J. Vet. Res., 43: 1311-1314, 1982). Sin embargo, hasta la fecha, no se ha identificado todavía materialmente un antígeno protector de HPG, excepto la HA de tipo 1 producida por HPG serotipo A, según está descrito por Iritani y col.

Según se mencionó en la presente anteriormente, la vacuna inactivada convencional obtenida mediante la inactivación de células de Haemophilus paragallinarum con timerosal, formalina y similares ha provocado problemas, ya que se inducen efectos colaterales adversos, según se mencionó anteriormente, cuando es aplicada a las aves de corral en una gran cantidad, ya que incluye varias sustancias de las células distintas del antígeno protector.

Descripción de la invención

El inventor ha estudiado con empeño con el fin de resolver los problemas y, como resultado, ha purificado con éxito a partir del sobrenadante de un cultivo de Haemophilus paragallinarum serotipo A un polipéptido que tiene 130 kd aproximadamente de peso molecular de Haemophilus paragallinarum serotipo A, induciendo dicho polipéptido la producción de anticuerpos HI y protegiendo frente a la coriza infecciosa aviar por Haemophilus paragallinarum serotipo A.

Además, el presente inventor ha preparado una biblioteca de ADN genómico de HPG serotipo A, ha clonado un fragmento génico que codifica el polipéptido anterior de 130 kd, ha expresado dicho fragmento génico en E. coli y ha encontrado que el polipéptido producido podía prevenir la coriza infecciosa aviar por Haemophilus paragallinarum serotipo A. Dicho fragmento génico que codificaba el polipéptido anterior de 130 kd fue utilizado también como sonda para clonar un fragmento génico hibridable con dicho fragmento de ADN procedente de HPG serotipo C, para proporcionar E. coli que expresa el polipéptido de HPG serotipo C.

La presente invención proporciona una vacuna eficaz, más segura, contra la coriza infecciosa aviar, cuya bacteria patógena es Haemophilus paragallinarum, con menos efectos colaterales adversos y un proceso para preparar la misma.

Esto es, un objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo polipéptido de Haemophilus paragallinarum así como un péptido que comparta al menos una porción de la secuencia de aminoácidos.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un gen que codifique dicho nuevo polipéptido de Haemophilus paragallinarum, así como el péptido que comparte al menos una porción de la secuencia de aminoácidos y un vector recombinante para la expresión de dicho gen.

Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un proceso para preparar dicho nuevo polipéptido de Haemophilus paragallinarum y el polipéptido que comparte al menos una porción de la secuencia de aminoácidos a partir de microorganismos o células transformadas con dicho vector recombinante.

Otro objeto todavía más de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal o policlonal que es preparado mediante la utilización como inmunógeno del nuevo péptido así preparado de Haemophilus paragallinarum o el polipéptido que comparte al menos una porción de la secuencia de aminoácidos.

Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un método para detectar Haemophilus paragallinarum o un anticuerpo hacia el mismo mediante una combinación del péptido, el fragmento de ADN, el transformante o el anticuerpo anteriormente mencionados.

Otro objeto adicional más de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico para la coriza infecciosa aviar que comprende como ingrediente activo el anticuerpo hacia el nuevo polipéptido de Haemophilus paragallinarum.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra los resultados obtenidos mediante el desafío de pollos con Haemophilus paragallinarum serotipo A, cepa 221, después de la inmunización pasiva con anticuerpos monoclonales (clones HpgA 59-40, HpgA 59-180 y HpgA 59-284), donde la aparición de la enfermedad se retrasó en los grupos a los que se habían administrado previamente los anticuerpos monoclonales que tenían la actividad HI (clones HpgA 59-40 y HpgA 59-180).

La Figura 2 muestra los resultados obtenidos mediante el desafío de pollos con Haemophilus paragallinarum serotipo A, cepa 221, después de la inmunización pasiva con anticuerpos monoclonales (clones HpgA 59-33, HpgA 59-48B y HpgA 59-180), donde la aparición de la enfermedad se retrasó en los grupos a los que se había administrado previamente el anticuerpo monoclonal que tenía la actividad HI (clon HpgA 59-180).

La Figura 3 muestra los resultados obtenidos mediante el desafío de pollos con Haemophilus paragallinarum serotipo A, cepa 221, después de la inmunización pasiva con anticuerpos monoclonales (clones HpgA 59-48A, HpgA 59-145 y HpgA 59-180), donde la aparición de la enfermedad se retrasó en los grupos a los que se habían administrado previamente los anticuerpos monoclonales que tenían la actividad HI (clones HpgA 59-145 y HpgA 59-180).

La Figura 4 muestra los resultados obtenidos mediante el desafío de pollos con Haemophilus paragallinarum serotipo A, cepa 221, después de la inmunización pasiva con anticuerpos monoclonales (clones HpgA 59-188, HpgA 59-236 y HpgA 59-180), donde la aparición de la enfermedad se retrasó en los grupos a los que se había administrado previamente el anticuerpo monoclonal que tenía la actividad HI (clon HpgA 59-180).

La Figura 5 es una fotografía que muestra el resultado de la SDS-PAGE con tinción con CBB del polipéptido HPGp130 que es purificado mediante cromatografía de afinidad utilizando el anticuerpo monoclonal que tiene la actividad HI (clon HpgA 59-180) como ligando.

La Figura 6 es (a) una fotografía que muestra los resultados de la SDS-PAGE con tinción con CBB del polipéptido HPGp130 purificado y de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 tratado con 2-mercaptoetanol; y (b) una fotografía que muestra los resultados de la detección de proteínas reactivas con antisuero de cobayo frente al polipéptido HPGp130 purificado después de SDS-PAGE del polipéptido HPGp130 purificado y de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 tratado con 2-mercaptoetanol y transferencia a una membrana fina (PVDF).

La Figura 7 es una ilustración esquemática que muestra la posición de los fragmentos ADN HPG1.2k, ADN HPG3.5k, ADN HPG4.1k, ADN HPG6.7k y ADN HPG2.7k clonados a partir del genoma de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221.

La Figura 8 es una ilustración esquemática que muestra la construcción del plásmido pSA4.1 mediante la inserción del fragmento XhoI-XbaI (ADN HPG4.1k) procedente del genoma de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 en el plásmido pSP72, seguido por la construcción del plásmido pTA4.1 mediante la inserción del fragmento XhoI-KpnI del plásmido pSA4.1 en el plásmido pTrcHisC.

La Figura 9 es una ilustración esquemática que muestra la construcción del plásmido pSA6.7 mediante la inserción del fragmento XhoI-PstI (ADN HPG6.7k) procedente del genoma de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 en el plásmido pSP72, seguido por la construcción del plásmido pSA2.7 mediante la inserción del fragmento de XbaI del plásmido pSA6.7 en el plásmido pSP7.2.

La Figura 10 es una fotografía que muestra los resultados de la detección de fragmentos de ADN hibridables con el ADN HPG1.2k como sonda después de la electroforesis en agarosa de fragmentos de ADN obtenidos por la digestión del genoma de Haemophilus paragallinarum serotipos A, B y C con el enzima de restricción EcoRI y transferencia a una membrana fina (Hybond N+).

La Figura 11 es una ilustración esquemática que muestra la posición de los fragmentos ADN HPG-C1, ADN HPG-C2, ADN HPG-C3 y ADN HPG-C4 clonados a partir del genoma de Haemophilus paragallinarum serotipo C cepa 53-47.

La Figura 12 es una fotografía que muestra el resultado de la electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de los productos de PCR obtenidos mediante PCR con cebadores preparados sobre la base de las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos N-terminal y C-terminal del polipéptido HMTp210 de HPG serotipo A y el genoma de Haemophilus paragallinarum serotipo A, B o C como molde.

Modo mejor de llevar a cabo la invención

La presente invención se explica con más detalle a continuación.

El polipéptido de Haemophilus paragallinarum serotipo A de la presente invención, que induce la producción del anticuerpo HI, es preparado a partir del sobrenadante de un cultivo de HPG serotipo A o de una suspensión de células rotas mediante cromatografía de afinidad con el anticuerpo monoclonal que tiene la actividad HI como ligando.

El anticuerpo monoclonal que tiene la actividad HI (referido también de aquí en adelante como "HI-MCA") es obtenido mediante la preparación de los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales que se unen a Haemophilus paragallinarum serotipo A por el procedimiento convencional de fusión celular y la selección posterior de los hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal que tiene la actividad HI con un ensayo de HI.

Para ser utilizado como inmunógeno para la producción del anticuerpo anterior, Haemophilus paragallinarum serotipo A es obtenido mediante el procedimiento convencional utilizado para el cultivo habitual de Haemophilus paragallinarum. Por ejemplo, las células de HPG cepa 221 pueden ser recuperadas mediante cultivo con agitación en un medio de infusión de carne de pollo suplementado con suero de pollo (incluyendo 300 ml de infusión de carne de pollo, 10 ml de suero de pollo, 5 g de polipeptona, 1 g de glucosa, 1 g de casaminoácidos, 5 g de glutamato de sodio, 5 g de cloruro de sodio, 0,025 g de dinucleótido de nicotinamida adenina en 1000 ml de medio) a 37ºC durante una noche, seguido por centrifugación.

La inmunización puede ser llevada a cabo de la manera habitual, por ejemplo, después de inactivar Haemophilus paragallinarum serotipo A con timerosal, formalina y similares, mediante la administración de las células inactivadas junto con el adyuvante convencional a ratones BALB/c mediante administración intraperitoneal, subcutánea, intradérmica o intravenosa. El inmunógeno incluye células de HPG per se o, alternativamente, las células tratadas con rodanida de potasio, sonicación o hialuronidasa, o un antígeno procesado obtenido por tratamiento con un surfactante tal como N-laurosilsarcosinato de sodio, Nonidet P-40 o Triton X-100. El adyuvante incluye adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, gel de hidróxido de aluminio y similares. Más específicamente, la inmunización es llevada a cabo según sigue: Haemophilus paragallinarum serotipo A, cepa 221, cultivado en un medio de infusión de carne de pollo suplementado con suero de pollo es inactivado con timerosal y sonicado posteriormente. Una emulsión obtenida mezclando la suspensión resultante de células rotas con adyuvante completo de Freund es administrada subcutáneamente en el lomo de ratones BALB/c, seguido por la administración subcutánea en el lomo de una emulsión preparada a partir de la misma cantidad de la suspensión y adyuvante incompleto de Freund cada 2 a 4 semanas. Se monitoriza el nivel de anticuerpos en suero y, después de confirmar el nivel elevado del título de anticuerpos, se administra posteriormente una suspensión de células rotas después de la sonicación, intravenosamente, después de 2 a 4 semanas adicionales como inmunización final.

Como inmunocitos para preparar un anticuerpo monoclonal, se utilizan preferiblemente esplenocitos extraídos de 2 a 4 días después de la última administración. Las células de mieloma de ratón incluyen, por ejemplo, NSI-Ag4/1 (Eur. J. Immunol., 6: 511, 1976), P3X63-Ag8.Ul (Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81: 1, 1978), X63-Ag8.653 (J. Immunol., 123: 1548, 1979) y similares. La fusión de los esplenocitos con las células de mieloma de ratón puede ser llevada a cabo según Milstein y col., Method Enzymol., 73, 3-46, 1981. Esto es, la fusión puede realizarse con una cantidad de esplenocitos 1 a 10 veces mayor que la cantidad de células de mieloma de ratón aproximadamente. Un agente estimulante de la fusión celular puede ser polietilén glicol con un peso molecular de 1.000-6.000 a una concentración del 30 a 50% (p/v). Más específicamente, la fusión celular se lleva a cabo preferiblemente con 10^{8} esplenocitos aproximadamente y 10^{7} células de mieloma P3X63-Ag8.Ul aproximadamente en un medio de cultivo utilizado normalmente para el cultivo de linfocitos, tal como medio RPMI 1640, conteniendo un 45% de polietilén glicol 4.000, que se ha calentado previamente a 37ºC.

Los hibridomas pueden ser obtenidos mediante cultivo en medio HAT durante un periodo de tiempo suficiente para que las células no fusionadas no puedan sobrevivir, normalmente de varios días a varias semanas. Los hibridomas así obtenidos son utilizados posteriormente para la selección y el clonaje de las cepas productoras de un anticuerpo deseado de acuerdo con el procedimiento habitual de la dilución limitante, utilizando el sobrenadante del cultivo de los hibridomas.

La selección de las cepas productoras de un anticuerpo que reconozca a Haemophilus paragallinarum serotipo A se lleva a cabo de acuerdo con las técnicas habituales de ELISA, RIA, transferencia Western y similares. Un antígeno utilizado en estos métodos puede ser una suspensión de células de Haemophilus paragallinarum serotipo A, las células tratadas con rodanida de potasio, sonicación, hialuronidasa y similares, o bien una extracción de dichas células con un surfactante.

Posteriormente, las cepas productoras de un anticuerpo con actividad HI son sometidas a selección de acuerdo con el ensayo habitual de HI, utilizando el sobrenadante de un cultivo de los hibridomas anteriores o líquido ascítico procedente de ratones a los que se habían administrado dichos hibridomas. El antígeno HA incluye una suspensión de células de Haemophilus paragallinarum o las células tratadas con rodanida de potasio, sonicación, hialuronidasa y similares. Los eritrocitos utilizados para el ensayo de HI pueden ser un 0,5% de eritrocitos de pollo frescos, un 1% de eritrocitos de pollo fijados en glutaraldehído o eritrocitos de pollo fijados en formalina, prefiriéndose los eritrocitos de pollo fijados en glutaraldehído.

Más específicamente, un sobrenadante obtenido después de la centrifugación de líquido ascítico tratado con una cantidad de 5 veces de una solución de caolín al 25%, es añadido a los precipitados de eritrocitos de pollo fijados en glutaraldehído, que son posteriormente agitado a 37ºC durante 60 minutos para la sensibilización. A diluciones seriadas de dos veces de este sobrenadante se añade la misma cantidad de una suspensión de células de la cepa 221 incluyendo 4 unidades de hemaglutinina y la mezcla se deja reposar durante 15 minutos. Se añade a la misma una suspensión de eritrocitos de pollo al 1% fijados en glutaraldehído, se deja reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 60 minutos y se observa el fondo de la placa de microvaloración. Se define un título de anticuerpos HI como la dilución máxima que puede bloquear la hemaglutinación.

La recuperación de los anticuerpos monoclonales con actividad HI de los hibridomas así obtenidos, se lleva a cabo cultivando dichos hibridomas en gran cantidad y recogiendo dichos anticuerpos del sobrenadante del cultivo, o administrando dichos hibridomas a ratones compatibles con dichos hibridomas, a fin de que dichos hibridomas proliferen, y recogiendo dichos anticuerpos del líquido ascítico de los mismos.

La purificación del anticuerpo monoclonal puede ser realizada mediante los procedimientos convencionales utilizados en la química de proteínas tales como, por ejemplo, desplazamiento salino, ultrafiltración, precipitación isoeléctrica, electroforesis, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad y similares. Más específicamente, la purificación del anticuerpo monoclonal a partir de líquido ascítico puede ser realizada utilizando Proteína A-Sefarosa CL-4B (fabricada por Pharmacia) y el Kit de Purificación de Anticuerpos Monoclonales de Ratón MAPS-II (producido por Bio Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Puede prepararse mediante un procedimiento habitual una columna de afinidad con el anticuerpo que tiene la actividad HI como ligando para la purificación del polipéptido de Haemophilus paragallinarum serotipo A que induce la producción del anticuerpo HI, por ejemplo, mediante la unión del anticuerpo anteriormente purificado a una columna HiTrap activada con NHS (fabricada por Pharmacia) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Utilizando la columna de afinidad así preparada, el polipéptido de Haemophilus paragallinarum serotipo A que induce la producción del anticuerpo HI puede ser obtenido del sobrenadante de un cultivo de células de HPG serotipo A o de una suspensión de células rotas. Específicamente, se obtuvo un polipéptido (referido de aquí en adelante como "HPGp130") con un peso molecular de 130 Kd aproximadamente, que tenía una gran capacidad para producir el anticuerpo HI y actividad para prevenir la coriza infecciosa aviar, a partir de un sobrenadante del cultivo de HPG cepa 221 cultivado en el medio de infusión de carne de pollo suplementado con suero de pollo a 37ºC durante dos días.

Puede determinarse la secuencia de aminoácidos del polipéptido así obtenido mediante los procedimientos habituales, tales como la degradación de Edman (P. Edman, Acta Chem. Scand., 4:283, 1950). La secuencia de aminoácidos del extremo N de dicho polipéptido está mostrada en la SEC ID Nº:2.

Puede realizarse el clonaje de un gen o de un fragmento génico que codifique el polipéptido de Haemophilus paragallinarum serotipo A mediante los procedimientos habituales, según está descrito por Sambrook y col. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989). Esto es, células de Haemophilus paragallinarum serotipo A, cepa 221, son cultivadas y recuperadas mediante los procedimientos anteriores, se extrae el ADN genómico y se purifica con el kit Sepagene (fabricado por Sanko Junyaku K.K.) de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. El ADN genómico es cortado posteriormente con un enzima de restricción disponible comercialmente (preferiblemente EcoRI), los fragmentos de ADN obtenidos son insertados en un vector de clonaje comercialmente disponible (por ejemplo \lambdagt11) para preparar una biblioteca de ADN, en la cual se someten a selección aquellos clones que expresen el antígeno que responde al anticuerpo deseado con actividad HI. El anticuerpo que tiene la actividad HI incluye el sobrenadante del cultivo de los hibridomas o el líquido ascítico de los ratones obtenido según se mencionó anteriormente. Se utiliza preferiblemente el antisuero que es obtenido por inmunización con el polipéptido de Haemophilus paragallinarum serotipo A aislado mediante cromatografía de afinidad con el anticuerpo monoclonal que tiene la actividad HI como ligando. Puede determinarse la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN exógeno en el ADN del fago \lambdagt11 recombinante así obtenido con un secuenciador de ADN (por ejemplo, Applied Biosystems 377). La novedad del fragmento de ADN exógeno obtenido puede ser confirmada mediante la búsqueda de homologías entre la secuencia de nucleótidos completa y las bases de datos existentes (por ejemplo, GeneBank, EMBL y similares).

Según se muestra en el Ejemplo 3, por ejemplo, se obtuvieron diez fagos \lambdagt11 positivos de la biblioteca de ADN, y cada ADN de estos fagos incluía un fragmento de ADN exógeno de 1,2 kb aproximadamente (de aquí en adelante referido también como "fragmento de ADN HPG1.2k") según se demostró en electroforesis en gel de agarosa. La secuencia de nucleótidos de dicho ADN exógeno corresponde a la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido Nº 1988 al nucleótido Nº 3157 de la SEC ID Nº: 1.

Como no se encontraron un codón de inicio ni un codón de terminación en el ADN HPG1.2k, se considera que este fragmento de ADN codifica una porción del polipéptido de Haemophilus paragallinarum serotipo A. Puede obtenerse un gen que codifique la longitud completa de dicho polipéptido mediante la utilización del ADN HPG1.2k como sonda para dar lugar a un fragmento de ADN más largo, la determinación de la secuencia de nucleótidos de este fragmento de ADN y el hallazgo de un codón de inicio y de un codón de terminación.

Más específicamente, el ADN genómico de Haemophilus paragallinarum serotipo A, cepa 221, es cortado con un enzima de restricción cuyo sitio de corte no esté presente en el ADN de 1,2 kb (por ejemplo, HindIII) y los fragmentos de ADN resultantes son separados con una electroforesis en agarosa. Utilizando el kit "DIG-DNA Labeling Kit" (fabricado por Boehringer Mannheim), se lleva a cabo una hibridación Southern utilizando el fragmento de ADN de 1,2 kb marcado con digoxigenina (DIG) como sonda para detectar los fragmentos de ADN deseados. Como resultado, se obtuvo un fragmento de ADN digerido con HindIII de 3,5 kb aproximadamente que hibridaba con el fragmento de ADN de 1,2 kb (referido también de aquí en adelante como "fragmento de ADN HPG3.5k"). Una secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN HPG3.5k corresponde a la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido Nº 1 al nucleótido Nº 3450 de la SEC ID Nº: 1. Se encontró una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos del extremo N del polipéptido HPGp130 anterior en la secuencia de aminoácidos desde el residuo de aminoácido Nº 1 al residuo de aminoácido Nº 13 (correspondiente a la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido Nº 453 al nucleótido Nº 491) de la SEC ID Nº: 1.

Como se encontró solamente un codón de inicio en el ADN HPG3.5k pero no se encontró un codón de terminación, se utilizaron como sondas el fragmento de ADN de 1,2 kb y el fragmento de ADN de 3,5 kb marcados con DIG para dar un fragmento de ADN digerido con XhoI-XbaI de 4,1 kb aproximadamente (referido también de aquí en adelante como "fragmento de ADN HPG4.1k"). Una secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN HPG4.1k corresponde a la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido Nº 2212 al nucleótido Nº 6275 de la SEC ID Nº: 1. Como no se encontró un codón de terminación en el fragmento de ADN HPG4.1k, se obtuvo un fragmento de ADN digerido con XhoI-PstI de 6,7 kb aproximadamente (referido también de aquí en adelante como "fragmento de ADN HPG6.7k"; este fragmento incluye el fragmento de ADN HPG4.1k anterior) utilizando el ADN de 1,2 kb y el ADN de 3,5 kb marcados con DIG. La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN HPG6.7k corresponde a la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido Nº 2212 al nucleótido Nº 8930 de la SEC ID Nº: 1. Existía un codón de terminación en el fragmento de ADN HPG6.7k.

Se encontró que la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 1, que constaba de un total de 8930 nucleótidos, incluía una marco de lectura abierto que comenzaba a partir del nucleótido Nº 243 y que podía codificar 2042 residuos de aminoácidos. Un polipéptido que comprende los 2042 residuos de aminoácidos es referido también de aquí en adelante como "HMTp210 de serotipo A". La búsqueda de homologías con las bases de datos existentes (GeneBank y EMBL) reveló que no había homología con ninguna secuencia de nucleótidos ni de aminoácidos conocidas, indicando que el polipéptido HMTp210 de serotipo A es una sustancia nueva.

Se sugirió también la presencia de otro posible marco de lectura abierto en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1, que comienza a partir del nucleótido Nº 8375 y puede codificar 185 residuos de aminoácidos. No se encontró ningún codón de terminación en esta secuencia. La búsqueda de homologías con las bases de datos existentes (GeneBank y EMBL) reveló que no había homología con ninguna secuencia de nucleótidos ni de aminoácidos conocidas, indicando que el polipéptido codificado por este marco de lectura abierto es también una sustancia nueva.

Los fragmentos de ADN de Haemophilus paragallinarum serotipo A pueden ser también utilizados como sonda para obtener fragmentos de ADN de diferentes serotipos de Haemophilus paragallinarum, tales como el serotipo B o el serotipo C, así como polipéptidos codificados por dichos fragmentos de ADN.

Más específicamente, se extrae y purifica ADN genómico de HPG serotipo C cepa 53-47 y se corta con un enzima de restricción adecuado (preferiblemente HindIII); los fragmentos de ADN obtenidos se insertan en un vector de clonaje disponible comercialmente (por ejemplo, \lambdaDASHII) para preparar una biblioteca de ADN, en la que los clones son sometidos a selección utilizando como sonda el fragmento de ADN HPG3.5k de serotipo A marcado con DIG.

Según se muestra en el Ejemplo 5, se obtuvieron diez fagos \lambdaDASHII positivos de la biblioteca de ADN y cada ADN de estos fagos incluía un fragmento de ADN exógeno de 13,5 kb aproximadamente (referido también de aquí en adelante como "ADN HPG-C1"), según se demostró en electroforesis en gel de agarosa.

Como el fragmento de ADN HPG-C1 de 13,5 kb aproximadamente es demasiado grande para ser subclonado en un vector plasmídico, fue cortado con un enzima de restricción adecuado (preferiblemente XbaI) y los fragmentos de ADN resultantes fueron insertados en un vector de clonaje disponible comercialmente (por ejemplo, pUC119). Como resultado, se obtuvieron fragmentos de ADN de 5,6 kb aproximadamente (referido también de aquí en adelante como "ADN HPG-C2"), de 0,9 kb aproximadamente (referido también de aquí en adelante como "ADN HPG-C3") y de 6,9 kb aproximadamente (referido también de aquí en adelante como "ADN HPG-C4"). Se determinó la secuencia de nucleótidos de una porción del fragmento de ADN HPG-C2 y del fragmento de ADN HPG-C4 para revelar la presencia de un codón de inicio y de un codón de terminación en estos fragmentos de ADN, respectivamente.

Se encontró que la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 5, que constaba de un total de 7486 nucleótidos, incluía un marco de lectura abierto que comenzaba a partir del nucleótido Nº 848 y que podía codificar 2039 residuos de aminoácidos. Un polipéptido que comprende los 2039 residuos de aminoácidos es referido también de aquí en adelante como "HMTp210 de serotipo C". La búsqueda de homologías con las bases de datos existentes (GeneBank y EMBL) reveló que no había homología con ninguna secuencia de nucleótidos ni de aminoácidos conocidas, indicando que el polipéptido HMTp210 de serotipo C es una sustancia nueva.

La búsqueda de homologías entre las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido HMTp210 de serotipo C y el polipéptido HMTp210 de serotipo A, reveló un 80% de homología aproximadamente. Se reveló además que la región de 3,4 kb aproximadamente en el sitio 5' y la región de 1,2 kb aproximadamente en el sitio 3' presentaban una homología extremadamente elevada, mientras que la región de 1,5 kb aproximadamente entre estas regiones 5' y 3' presentaba una baja homología. Lo mismo era también aplicable a los polipéptidos correspondientes codificados por estos genes.

Sobre la base de la secuencia de nucleótidos que codificaba el polipéptido HMTp210 de serotipo A, podían obtenerse también mediante PCR fragmentos de ADN de diferentes serotipos de Haemophilus paragallinarum, tales como serotipo B o serotipo C, así como polipéptidos codificados por dichos fragmentos de ADN.

Más específicamente, sobre la base de la secuencia de nucleótidos que codificaba el polipéptido HMTp210 de serotipo A, se preparó un ADN sintético que tenía la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 3 como un cebador de PCR corriente arriba y un ADN sintético que tenía la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 4 como un cebador de PCR corriente abajo. Estos cebadores fueron diseñados de tal manera que se añadieran secuencias de reconocimiento de BamHI en los sitios 5', respectivamente, y pudo amplificarse una longitud completa de la región de traducción del polipéptido HMTp210 de serotipo A. Utilizando estos cebadores, se llevó a cabo una PCR utilizando como molde los ADNs genómicos de un total de nueve cepas, a saber, Haemophilus paragallinarum serotipo A cepas 221, 083, W, Germany y Georgia, HPG serotipo B cepas Spross y 0222 y HPG serotipo C cepas Modesto y 53-47. El análisis de los productos de PCR obtenidos mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% confirmó el fragmento amplificado de 6,1 kb aproximadamente en cualquiera de estas cepas.

El fragmento de ADN así obtenido, o una porción del mismo, puede ser incorporado a un vector de expresión adecuado, el vector de expresión resultante es utilizado para la transformación de un microorganismo o de una célula animal, y el transformante es cultivado para producir el polipéptido de la presente invención de Haemophilus paragallinarum o un péptido que comparta al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido. El péptido que comparte una porción de la secuencia de aminoácidos puede ser también producido con un sintetizador peptídico.

Una secuencia señal adecuada para la secreción en un microorganismo o en una célula animal puede ser también ligada corriente arriba al ADN que codifica el polipéptido de la presente invención con el fin de que dicho polipéptido pueda ser secretado al medio de cultivo. El ADN así modificado para la secreción es ventajoso en cuanto a que dicho polipéptido secretado al medio de cultivo puede ser fácilmente purificado. Una secuencia señal incluye la señal de pelB (S.P. Lei y col., J. Bacteriology, 169: 4379-4383, 1987) para E. coli, la señal del factor \alpha (A.J. Brake, Yeast Genetic Engineering, p269, Butterworth, 1989) para levaduras, la señal SG-1 de inmunoglobulina (H. Maeda y col., Hum. Antibod. Hybridomas, 2: 124-134, 1991), la señal C25 (Publicación Internacional PCT Nº 94/20632) para una célula animal.

Un vector de expresión incluye un plásmido, un vector vírico y similares. Puede incluirse cualquier promotor en el vector de expresión tal como lac, tac, pho5, adh, temprano de SV40, tardío de SV40, \beta-actina y similares, teniendo en consideración el microorganismo o la célula animal utilizada como huésped, en la medida en que se obtenga finalmente el polipéptido que tiene la actividad para prevenir la coriza infecciosa aviar. El polipéptido de la presente invención puede ser expresado también como una proteína de fusión con otra proteína o péptido tal como \beta-galactosidasa, glutation-S-transferasa, proteína de unión a maltosa, Proteína A, hexámero de histidina y similares. Un gen marcador incluye, en el caso de un vector de expresión para una célula de un microorganismo, el gen de resistencia a ampicilina, el gen de resistencia a tetraciclina para E. coli como huésped, el gen de la \beta-isopropil malato deshidrogenasa (Leu2) para una levadura como huésped, y en el caso de un vector de expresión para una célula animal, el gen de la aminoglicósido 3' fosfotransferasa (neo), el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr), el gen de la glutamina sintetasa (GS) y similares. Un aditivo para la selección incluye G418, neomicina, metotrexato y
similares.

La transformación de una célula huésped puede ser llevada a cabo mediante los métodos conocidos incluyendo, por ejemplo, el método del cloruro de calcio, el método de coprecipitación con fosfato de calcio, el método de DEAE dextrano, el método de la lipofectina, el método de fusión de protoplastos con polietileno, electroporación y similares, que pueden ser seleccionados adecuadamente dependiendo del huésped utilizado.

El nuevo polipéptido de la presente invención de Haemophilus paragallinarum o un péptido que comparta al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido, pueden ser preparados según se describe en la presente a continuación. Por ejemplo, el fragmento de ADN HPG3.5k de HPG serotipo A es incorporado en el vector de expresión pTrcHisC (producido por Invitrogen), dicho vector de expresión es introducido en E. coli cepa JM109 para su transformación. Entre las células transformadas resultantes, se someten a selección aquellos transformantes que produzcan el nuevo polipéptido diana mediante una transferencia de manchas con un índice de reactividad con el anticuerpo frente a dicho polipéptido. Pollos inmunizados con un sobrenadante obtenido después de la centrifugación de una suspensión de las células rotas tienen una protección elevada frente al desafío con HPG serotipo A, cepa
221.

El nuevo polipéptido puede ser purificado a partir de un extracto de células o del sobrenadante de un cultivo procedente de un cultivo a gran escala del transformante que produce dicho polipéptido, mediante la utilización de los métodos anteriormente mencionados utilizados en el campo de la química de proteínas.

El nuevo polipéptido de Haemophilus paragallinarum así obtenido tiene la actividad de prevenir la coriza infecciosa aviar. Dicho polipéptido de Haemophilus paragallinarum, los anticuerpos monoclonales y policlonales contra dicho polipéptido y el vector de expresión mencionados anteriormente, pueden ser utilizados como una vacuna o como un agente terapéutico para la coriza infecciosa aviar, solos o en combinación con un vehículo, diluyente o agente estabilizante adecuado de la manera convencional, tal como inyecciones o fármacos orales.

El nuevo polipéptido de Haemophilus paragallinarum anterior o un polipéptido que comparta al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido, pueden ser utilizados como inmunógeno para preparar anticuerpos policlonales y monoclonales de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente anteriormente. Dicho polipéptido, así como el anticuerpo que tiene capacidad para unirse al mismo, puede ser también utilizado en un sistema de detección de antígenos o anticuerpos tal como transferencia Western, ELISA y similares, y puede ser también un material para la construcción de un agente de diagnóstico. Además, puede utilizarse cromatografía de afinidad con un vehículo adecuado al que esté unido el anticuerpo anterior para la purificación del polipéptido anterior.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona el nuevo polipéptido de Haemophilus paragallinarum y el fragmento génico que codifica dicho polipéptido para la prevención de la coriza infecciosa aviar, y el anticuerpo que tiene actividad HI que puede ser utilizado como agente terapéutico.

El polipéptido de Haemophilus paragallinarum, que ha encontrado el presente inventor, tiene un peso molecular de 130 Kd aproximadamente, tiene la actividad de inducir la producción del anticuerpo HI y es un nuevo polipéptido importante para la prevención de la coriza infecciosa aviar. Los problemas técnicos asociados con la obtención de dicho polipéptido, tales como el aislamiento del gen que codifica dicho polipéptido, la construcción del vector de expresión, la preparación de la célula para la expresión y la purificación de dicho polipéptido, están resueltos por la presente invención, que permite la provisión de una vacuna más eficaz que las vacunas de la técnica anterior. Además, son útiles como material para proporcionar un agente de diagnóstico de la coriza infecciosa aviar rápido y
sencillo.

La presente invención se ilustra con más detalle por medio de los ejemplos siguientes, pero no debe considerarse que está limitada a los mismos.

Ejemplo 1 Preparación y características del anticuerpo monoclonal (1) Preparación del anticuerpo monoclonal

Células de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 fueron inoculadas a 100 ml de medio de infusión de carne de pollo suplementado con suero de pollo y cultivadas con agitación a 37ºC durante una noche, seguido por centrifugación (8.000 rpm, 20 minutos) para recuperar las células. Las células obtenidas fueron lavadas con PBS mientras se centrifugaban y posteriormente suspendidas en PBS que contenía un 0,01% de timerosal a 5 x 10^{10} células/ml aproximadamente. La suspensión fue sonicada con un Sonicador Branson 350 a 20 kHz, 4ºC durante 10 minutos (repetición alternativa de la sonicación durante 0,5 segundos y enfriamiento durante 0,5 segundos). La suspensión así obtenida de las células rotas por sonicación fue mezclada con la misma cantidad de adyuvante completo de Freund y la mezcla se mezcló bien hasta que se consiguió una emulsión agua en aceite (w/o). Se administraron 0,1 ml de esta emulsión subcutáneamente a ratones BALB/c en dos lugares del lomo. Cuatro semanas después, se administraron subcutáneamente 0,1 ml de una emulsión preparada de manera similar con adyuvante incompleto de Freund en dos lugares del lomo. Después de 18 días adicionales, se administraron intravenosamente 0,1 ml de la suspensión de células rotas por sonicación.

Tres días después de la última administración, se extrajeron los esplenocitos. Dichos esplenocitos (1 x 10^{8} células) fueron mezclados con células de mieloma de ratón P3X63-Ag8.Ul (1 x 10^{7} células) mediante impregnación, a ello se añadió medio RPMI 1640 conteniendo un 45% de polietilén glicol calentado previamente a 37ºC para llevar a cabo la fusión celular. Las células después de la reacción de fusión fueron suspendidas en medio HAT (medio RPMI 1640 conteniendo un 5% de suero de ternera fetal suplementado con hipoxantina 1 x 10^{-4} M, aminopterina 4 x 10^{-7} M y timidina 1,6 x 10^{-5} M) y sembradas posteriormente en placas de microvaloración de 96 pocillos para cultivo celular (fabricadas por Coning), y cultivadas bajo las condiciones de 37ºC y 5% de CO_{2}.

En los pocillos en los que se propagaron los hibridomas, la presencia del anticuerpo monoclonal que reconocía a Haemophilus paragallinarum en el sobrenadante del cultivo fue determinada con un ELISA según se describe en la presente a continuación. Una suspensión de células rotas por sonicación de Haemophilus paragallinarum serotipo A, cepa 221, preparada según se mencionó anteriormente, fue diluida 300 veces con PBS y 100 \mul de la suspensión fueron sembrados en los pocillos de una placa de microvaloración para ELISA (Immulon II, fabricadas por Dynatech). La placa de microvaloración se dejó reposar a 4ºC durante una noche y se enmascaró con PBS que contenía un 5% de leche desnatada a 200 \mul por pocillo, a temperatura ambiente, durante 2 horas. La placa de microvaloración fue lavada con PBS que contenía un 0,05% de Tween 20 (PBS-T) y a la misma se añadieron 100 \mul del sobrenadante del cultivo de los hibridomas diluido 10 veces con PBS-T conteniendo un 5% de leche desnatada, para reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar con PBS-T, se añadieron 100 \mul de anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa (fabricado por Bio-Rad) diluido 10.000 veces con PBS-T conteniendo un 5% de leche desnatada, para reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, después de lavar con PBS-T, se añadieron 100 \mul de tampón citrato 0,05 M-hidrogenofosfato disódico 0,1 M (pH 5,0) conteniendo 6 mg por 11 ml de diclorhidrato de orto-fenilendiamina (OPD; fabricado por Katayama Kagaku K.K.) y 4,75 \mul de peróxido de hidrógeno (conteniendo H_{2}O_{2} al 31%; fabricado por Mitsubishi Gasu Kagaku K.K.) para reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron 50 \mul de ácido sulfúrico 3 M para amortiguar la reacción y se midió la absorbancia (490 nm) de cada pocillo con un lector Autoreader de ELISA.

Los hibridomas de los pocillos en los que se secretó el anticuerpo contra Haemophilus paragallinarum serotipo A en el sobrenadante del cultivo, fueron clonados mediante el método de dilución limitante a fin de que resultaran monoclonales. De este modo, se obtuvieron nueve clones productores del anticuerpo monoclonal contra Haemophilus paragallinarum serotipo A.

(2) Actividad HI de los anticuerpos monoclonales

Estos hibridomas fueron cultivados en gran cantidad y administrados intraperitonealmente a ratones BALB/c, pretratados con un agente inmunosupresor, pristano (2,6,10,14-tetrametil-pentadecano; fabricado por Aldrich), en los que se propagaron los hibridomas. De diez a veinte días después, los ratones fueron sacrificados y se extrajo de los mismos el líquido ascítico producido y se determinó la actividad HI del líquido ascítico.

Una suspensión de células de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 inactivadas con timerosal fue utilizada como antígeno HA para el ensayo de HI y preparada sobre la base del título de HA. Primeramente, utilizando una placa de microvaloración de fondo en forma de V (Sanko Junyaku K.K.), se añadió una suspensión de eritrocitos de pollo al 1% fijados en glutaraldehído (0,05 ml) a una dilución seriada de 2 veces de antígeno HA (0,05 ml) y, después de estar a temperatura ambiente durante 60 minutos, se observó el fondo de la placa. La máxima dilución que aglutinaba los eritrocitos fue definida como título de HA y, considerando una concentración del antígeno HA a esta dilución como 1 unidad, se preparó una solución madre de antígeno HA de tal manera que contuviera 4 unidades.

Posteriormente, a 0,2 ml de líquido ascítico de ratón se añadió una cantidad de 5 veces de solución de caolín al 25% y la mezcla fue agitada a 37ºC durante 30 minutos para la sensibilización, seguido por centrifugación para dar un sobrenadante. Este sobrenadante de la centrifugación después del tratamiento con caolín fue añadido a los precipitados obtenidos mediante la centrifugación de eritrocitos de pollo al 10% fijados en glutaraldehído (2 ml) y la mezcla fue agitada para sensibilización a 37ºC durante 60 minutos. Después de la sensibilización, se obtuvo un sobrenadante por centrifugación y se utilizó como líquido ascítico de ratón diluido 5 veces para la determinación del anticuerpo HI. Utilizando una placa de microvaloración de fondo en forma de V, a 0,025 ml de una dilución seriada de 2 veces de este sobrenadante se añadió la misma cantidad de la suspensión de células de la cepa 221 inactivadas con timerosal conteniendo 4 unidades de hemaglutinación y, después de mezclar, la mezcla de dejó reposar durante 15 minutos. Después de una sensibilización suficiente, se añadieron 0,05 ml de una suspensión de eritrocitos de pollo al 1% fijados en glutaraldehído. Después de dejar la mezcla reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos, se observó el fondo de la placa de microvaloración. La máxima dilución que inhibía la hemaglutinación fue definida como título de anticuerpos HI. Entre los nueve clones, los anticuerpos monoclonales procedentes de tres clones (HpgA 59-40, HpgA 59-145 y HpgA 59-180) presentaban una elevada actividad HI (Tabla 1). El clon HpgA 59-180 ha sido depositado por el solicitante como FERM BP-6084 en la National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken) el 5 de Septiembre de 1996.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Anticuerpo monoclonal  \+  \hskip3cm  \+  Título
de anticuerpos HI \cr  HpgA 59  -  33 \+ \+ <50\cr
 HpgA 59  -  40 \+ \+ 25.600\cr  HpgA
59  -  48A \+ \+ <50\cr  HpgA 59  -  48B
\+ \+ <50\cr  HpgA 59  -  145 \+ \+ 1.600\cr  HpgA
59  -  180 \+ \+ 12.800\cr  HpgA 59  -  188
\+ \+ <50\cr  HpgA 59  -  236 \+ \+ <50\cr  HpgA
59  -  284 \+ \+
<50\cr}

(3) Actividad protectora de los anticuerpos monoclonales

Un líquido ascítico de ratón (0,3 ml) que contenía estos anticuerpos fue administrado intraperitonealmente a pollos Leghorn blancos SPF de 4 a 6 semanas de edad, conteniendo cada grupo de 8 a 10 pollos, y al día siguiente, se aplicaron gota a gota 10^{8} células aproximadamente de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 en la cavidad nasal de los pollos para el desafío. Se utilizó también un grupo control al que no se había administrado líquido ascítico de ratón y fue desafiado de la misma manera. Se observó cada grupo para detectar la presencia de síntomas de la coriza (esto es, nariz moqueante, inflamación de la cara y epífora) durante 10 días. Todos los grupos que recibieron previamente los anticuerpos monoclonales con actividad HI (referidos también de aquí en adelante como "HI-MCA") retrasaban adecuadamente la aparición de la enfermedad en comparación con el grupo control. Por el contrario, los grupos a los que se administraron los anticuerpos monoclonales de los otros clones no mostraban ninguno diferencia significativa (Figs. 1 a 4).

Ejemplo 2 Purificación y propiedades del antígeno reconocido por HI-MCA (1) Purificación de HI-MCA

El HI-MCA (HpgA 59-180) fue purificado a partir de líquido ascítico de ratón utilizando Proteína A-Sefarosa CL-4B (fabricada por Pharmacia) y el Kit de Purificación de Anticuerpos Monoclonales de ratón MAPS-II (fabricado por Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. En primer lugar, a 4 ml de líquido ascítico de ratón se añadió la misma cantidad de un tampón de unión incluido en el Kit de Purificación de Anticuerpos. Una vez que la mezcla fue filtrada a través de un filtro Sterivex de 0,45 micras (fabricado por Millipore), fue aplicada a la columna de Proteína A-Sefarosa CL-4B (5 ml de volumen del lecho del gel) y fue lavada a fondo con el tampón de unión hasta que se obtuvo una absorbancia inferior a 0,05 a 280 nm. Posteriormente, los anticuerpos unidos a la columna fueron eluidos con un tampón de elución incluido en el kit. Los anticuerpos eluidos fueron dializados frente a hidrógeno carbonato de sodio 0,2 M (pH 8,3) conteniendo cloruro de sodio 0,5 M, para dar 40 mg de HI-MCA (HpgA 59-180) purificado. De manera similar, HI-MCA (HpgA 59-40) fue también purificado para dar 12 mg.

(2) Unión de HI-MCA a un transportador

Posteriormente, el HI-MCA (HpgA 59-180) purificado fue unido como ligando a una columna HiTrap activada con NHS (fabricada por Pharmacia) de acuerdo con el protocolo adjunto a la misma. En primer lugar, la columna HiTrap activada con NHS (1 ml de volumen del lecho del gel) fue lavada con ácido clorhídrico 1 mM y posteriormente se hizo circular una solución de hidrógeno carbonato de sodio 0,2 M (10 ml) que contenía cloruro de sodio 0,5 M y 10 mg del HI-MCA (HpgA 59-180) purificado anterior a temperatura ambiente durante 30 minutos, con el fin de que el HI-MCA se uniera a la columna. La columna HiTrap con HI-MCA unido obtenida fue lavada tres veces alternativamente con etanolamina 0,5 M (pH 8,3) conteniendo cloruro de sodio 0,5 M, y tampón acetato de sodio 0,1 M (pH 4,0) conteniendo cloruro de sodio 0,5 M y equilibrada con PBS para la purificación de un antígeno reconocido por el HI-MCA.

(3) Purificación del antígeno reconocido por el HI-MCA

Se purificó un antígeno de un cultivo de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 mediante cromatografía de afinidad utilizando como ligando HI-MCA. Un antígeno fue detectado mediante el método de ELISA según se describe en la presente a continuación.

El HI-MCA (HpgA 59-40) purificado anterior fue diluido con tampón carbonato de sodio 0,05 M (pH 9,0) a una concentración de 1,6 \mug/ml y fue colocado en un pocillo de una placa de microvaloración para ELISA. La placa se dejó reposar a 4ºC durante una noche y se bloqueó con PBS que contenía un 5% de leche desnatada a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar con PBS-T, un eluato procedente de la columna diluido 10 veces con PBS-T conteniendo un 5% de leche desnatada se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar con PBS-T, se hizo reaccionar HI-MCA (HpgA 59-180) marcado con peroxidasa diluido 10.000 veces con PBS-T conteniendo un 5% de leche desnatada, a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, después de la lavar con PBS-T, se añadió una solución de sustrato que contenía OPD y peróxido de hidrógeno para reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. El HI-MCA (HpgA 59-180) marcado con peroxidasa fue preparado uniendo peroxidasa de rábano picante (fabricada por Toyobo K.K.) al HI-MCA (HpgA 59-180) purificado anterior según está descrito por Yoshitake y col. (J. Biochem., 92: 1413-1424, 1982).

Células de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 fueron inoculadas a 100 ml de medio de cultivo de infusión de carne de pollo suplementado con suero de pollo y cultivadas con agitación a 37ºC durante 2 días. A un sobrenadante del cultivo obtenido después de la eliminación de las células por centrifugación a 8.000 rpm durante 20 minutos se añadió inmediatamente un inhibidor de proteasas de serina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, a 1 mM, y la mezcla fue filtrada a través de un filtro Sterivex de 0,45 micras. A la columna HiTrap con HI-MCA unido preequilibrada con PBS, se añadieron 60 ml del filtrado anterior y se lavó con PBS. Cuando la absorbancia a 280 nm fue inferior a 0,05, se eluyó un antígeno unido a HI-MCA con tiocianato de sodio 3 M. No se encontraron antígenos reconocidos por el HI-MCA en las fracciones no unidas, pero en su mayoría fueron recuperados en las fracciones eluidas con tiocianato de sodio 3 M. Este eluato fue dializado frente a tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) conteniendo cloruro de sodio 50 mM.

(4) Análisis de la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal del antígeno reconocido por HI-MCA

Después del tratamiento con 2-mercaptoetanol, el eluato de la columna de afinidad fue sometido a electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE) con un gel del 5 al 20% de poliacrilamida de acuerdo con Laemmli, Nature, 227: 680-685, 1970, que fue teñido con Azul Brillante de Coomassie R250 (CBB) al 0,25% disuelto en metanol 50%-ácido acético 10%, para revelar una banda de un peso molecular de 130 Kd aproximadamente (Fig. 5). Este polipéptido fue referido como HPGp130 y se determinó la secuencia de aminoácidos de su extremo N-terminal según se describe en la presente a continuación.

En primer lugar, el polipéptido HPGp130 purificado fue tratado con 2-mercaptoetanol y sometido posteriormente a SDS-PAGE utilizando gel de poliacrilamida al 5%. Después de la electroforesis, el gel fue lavado con un tampón de transferencia (ácido N-ciclohexil-3-amino-propanosulfónico 10 mM, metanol 10%, pH 11) y depositado sobre una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (fabricada por Millipore), que había sido sumergida previamente de forma sucesiva en metanol 100% y un tampón de transferencia, seguido por la transferencia con TRANS-BLOT CELL (fabricado por Bio-Rad) a 20 V durante una noche. Después de la transferencia, la membrana de PVDF fue lavada con agua y teñida con Negro Amido al 0,1% disuelto en metanol 45%-ácido acético 10% durante 30 segundos, seguido por decoloración con agua destilada.

La banda teñida de un peso molecular de 130 Kd fue cortada y analizada con un Secuenciador de Proteínas (Applied Biosystems 477A). Se analizaron trece residuos de aminoácidos del extremo N-terminal y, como resultado, se encontró que la secuencia de aminoácidos era Lys-Trp-Leu-Glu-Val-Tyr-Ser-Ser-Ser-Val-Lys-Leu-Ser, según se muestra en la SEC ID Nº: 2.

(5) Inducción de la producción de anticuerpos HI por HPGp130

Se investigó si el polipéptido HPGp130 podía inducir la producción de anticuerpos HI. Una emulsión (1 ml; 20 \mug aproximadamente de polipéptido HPGp130 por animal) preparada mezclando la solución del polipéptido HPGp130 (40 \mug/ml aproximadamente) con la misma cantidad de adyuvante completo de Freund, fue inyectada subcutáneamente a cobayos en dos lugares del lomo para inmunización. Alrededor de tres semanas más tarde, se inyectó subcutáneamente en dos lugares del lomo 1 ml de una emulsión preparada de manera similar con adyuvante incompleto de Freund. Dos semanas adicionales más tarde, la emulsión preparada con adyuvante incompleto de Freund fue inyectada subcutáneamente como refuerzo en dos lugares del lomo y cuatro semanas más tarde los animales de ensayo fueron sangrados. El título de anticuerpos HI de los antisueros obtenidos fue determinado según se describió anteriormente, para revelar un título elevado de anticuerpos HI (5.120 veces). Por tanto, se encontró que el polipéptido HPGp130 inducía la producción de anticuerpos HI profundamente implicados en la protección frente a la coriza infecciosa aviar.

(6) Péptido reconocido por el suero de cobayo anti-polipéptido HPGp130

Se analizó mediante transferencia Western un polipéptido reconocido por el suero de cobayo anti-polipéptido HPGp130. En primer lugar, el polipéptido HPGp130 purificado y células de HPG serotipo A cepa 221 cultivadas en medio de infusión de carne de pollo suplementado con suero de pollo, fueron tratadas con 2-mercaptoetanol y sometidas a SDS-PAGE. Después de la finalización de la electroforesis, el gel fue sumergido en un tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, etanol 20%, pH 8,3) durante 5 minutos y depositado sobre una membrana de PVDF, que había sido sumergida previamente en metanol 100% y en el tampón de transferencia, en este orden, y se llevó a cabo una transferencia utilizando TRANS-BLOT SD CELL (fabricado por Rio-Rad) a 7 V durante 1 hora. La membrana fue bloqueada con PBS que contenía un 5% de leche desnatada a 4ºC durante una noche, lavada con PBS-T y reaccionada posteriormente con suero de cobayo anti-polipéptido HPGp130 diluido 1.000 veces con PBS-T conteniendo un 5% de leche desnatada a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar con PBS-T, se hizo reaccionar anti-IgG de cobayo marcado con peroxidasa (fabricado por Zymed) diluido 2.000 veces con PBS-T conteniendo un 5% de leche desnatada a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar con PBS-T, la membrana fue sumergida en 10 ml de tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5) conteniendo 5 mg de tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB; fabricado por Dojin Kagaku K.K.) y 3 \mul de peróxido de hidrógeno para la reacción. Como resultado, el suero de cobayo anti-polipéptido HPGp130 reconocía al polipéptido HPGp130 y a una banda de un peso molecular de 160 Kd aproximadamente, posiblemente un precursor del polipéptido (Fig. 6).

(7) Inmunogenicidad del polipéptido HPGp130

De acuerdo con los procedimientos descritos en la presente anteriormente, diez pollos Leghorn blancos SPF de 5 semanas de edad fueron inmunizados mediante administración subcutánea en la pata de 0,5 ml de una emulsión (que contenía 10 \mug aproximadamente de polipéptido HPGp130) preparada mezclando una solución de polipéptido HPGp130 (40 \mug/ml aproximadamente) y la misma cantidad de adyuvante completo de Freund. Tres semanas después, se administró a los pollos subcutáneamente en la pata 0,5 ml de una emulsión preparada de manera similar con adyuvante incompleto de Freund. Dos semanas más tarde, los pollos recibieron una inyección de refuerzo subcutáneamente en la pata de una emulsión preparada de manera similar con adyuvante incompleto de Freund. Siete semanas después de la primera inmunización, los pollos fueron desafiados con Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221. Como control, un grupo fue inmunizados dos veces con 0,5 ml de HPG serotipo A cepa 221 inactivado con formalina al 0,25% (número de células antes de la inactivación: 4 x 10^{8} células/ml) suplementado con gel de hidróxido de aluminio (en términos de aluminio: 0,5 mg/ml) en el intervalo de tres semanas y otro grupo no fue inmunizado, y ambos grupos control fueron desafiados de manera similar. Los resultados están mostrados en la Tabla 2. Ambos grupos inmunizados con el polipéptido HPGp130 o con las células inactivadas con formalina mostraron protección frente a la aparición de la enfermedad en todos los pollos. En el grupo no inmunizado, sin embargo, los síntomas se presentaron en todos los pollos.

TABLA 2

Grupo de	Pollos	Pollos	Tasa de
Inmunización	Analizados	Protegidos	Protección (%)
HPGp130 purificado	10	10	100
Cepa 221 inactivada con formalina	10	10	100
Control no inmunizado	8	0	\; 0

Ejemplo 3 Clonaje del gen que codifica el polipéptido (HMTp210 serotipo A) de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 (1) Proceso de selección de una biblioteca genómica

Células de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 fueron inoculadas a 5 ml de medio de infusión de carne de pollo suplementado con suero de pollo y cultivadas con agitación a 37ºC durante una noche y las células fueron recuperadas por centrifugación. Después de lavar las células obtenidas con PBS mediante centrifugación, se extrajo y purificó el ADN de las células con el kit Sepagene (fabricado por Sanko Junyaku K.K.) de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. El ADN fue disuelto en 50 \mul de tampón TE (tampón Tris-HCl 10 mM conteniendo EDTA 1 mM, pH 8,0) y la solución obtenida fue utilizada como solución de ADN genómico. Posteriormente, utilizando el kit "cDNA Rapid Cloning Module \lambdagt11" (fabricado por Amersham), 0,2 \mug del ADN genómico digerido con el enzima de restricción EcoRI fueron ligados a 0,5 \mug de un brazo de \lambdagt11 digerido con el enzima de restricción EcoRI de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. Utilizando el kit "\lambda-DNA In Vitro Packaging Module" (fabricado por Amersham), el producto ligado fue insertado en el fago \lambda de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. La soluciones de fago recombinante obtenidas fueron utilizadas como biblioteca genómica.

Las soluciones anteriores de biblioteca genómica fueron añadidas a una suspensión de 10^{8} células aproximadamente de E. coli cepa Y1090 (producida por Amersham) en solución acuosa de sulfato de magnesio 10 mM para absorción a 37ºC durante 15 minutos. A todo ello se añadió medio de agar blando LB (conteniendo 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio, 50 mg de ampicilina, 4 g de maltosa y 8 g de agar en 1000 ml, pH 7), calentado a 45ºC para cubrir. La mezcla fue colocada sobre medio de agar LB (conteniendo 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio, 50 mg de ampicilina y 15 g de agar en 1000 ml, pH 7) e incubada a 42ºC durante 3 horas. Una membrana de nitrocelulosa sumergida en una solución acuosa de isopropil-\beta-D-tiogalacto-piranósido (IPTG) 10 mM fue secada al aire, se dispuso sobre la placa anterior y se incubó a 37ºC durante una noche. La membrana de nitrocelulosa fue posteriormente separada de la placa, lavada con PBS-T y bloqueada con PBS conteniendo un 5% de leche desnatada a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, se repitieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 2 (6) de tal manera que se hicieron reaccionar sucesivamente suero de cobayo anti-polipéptido HPGp130, anti-IgG de cobayo marcado con peroxidasa y un sustrato. Una serie de estos procedimientos dio lugar a placas que expresaban un antígeno reactivo específicamente con el suero de cobayo anti-HPGp130 de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221. Se sometieron a selección inmunológica alrededor de 5.000 placas según se describió anteriormente para dar 43 placas positivas. Estas placas positivas fueron recuperadas en un tampón SM (tampón Tris-HCl 50 mM conteniendo cloruro de sodio 0,1 M, sulfato de magnesio 10 mM y un 0,01% de gelatina, pH 7,5) y, después de añadir varias gotas de cloroformo, se almacenó a 4ºC. Diez de las placas positivas recuperadas fueron sometidas posteriormente a un segundo y un tercer proceso de selección igual que en el proceso de selección primario.

Los fagos \lambdagt11 recombinantes encontrados positivos en el proceso de selección inmunológica fueron añadidos a una suspensión de E. coli cepa Y1090, 10^{8} células aproximadamente en una solución acuosa de sulfato de magnesio 10 mM para absorción a 37ºC durante 15 minutos. A todo ello se añadieron 10 ml de medio líquido LB conteniendo un 0,4% de maltosa, cloruro de calcio 5 mM y 50 \mug/ml de ampicilina y las células fueron cultivadas posteriormente a 37ºC durante una noche. Después de la bacteriolisis por la adición de varias gotas de cloroformo, la solución de lisis fue centrifugada para eliminar las células de E. coli intactas y los desechos celulares. A 5 ml del sobrenadante del cultivo obtenido se añadió la misma cantidad de una solución acuosa de cloruro de sodio 2,5 M conteniendo un 20% de polietilén glicol 6.000 y la mezcla se dejó reposar sobre hielo durante 1 hora. Después de centrifugación a 10.000 rpm, el fago \lambdagt11 precipitado fue sometido a tratamiento con fenol y precipitación con isopropanol para recuperar el ADN del fago. Alrededor de 150 \mug del ADN de fago obtenido fueron digeridos con EcoRI y sometidos después a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para separar los fragmentos de ADN derivados de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221. Utilizando el kit "Sephaglas™ BandPrep Kit" (fabricado por Pharmacia), los fragmentos de ADN fueron eluidos y recuperados del gel de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. Todos los fragmentos de ADN obtenidos de los diez fagos positivos tenían una longitud de 1,2 kb aproximadamente. Un fragmento de ADN (referido de aquí en adelante como "ADN HPG1.2k") obtenido del fago de un clon (clon 2) fue utilizado en el ensayo siguiente.

(2) Secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG1.2k

El plásmido pUC119 (fabricado por Takara Shuzo K.K.) fue digerido con EcoRI y tratado posteriormente con fosfatasa alcalina para desfosforilar el extremo 5'. El ADN de pUC119 cortado fue tratado con fenol y cloroformo y recogido posteriormente mediante precipitación con etanol. El pUC119 cortado y el fragmento ADN HPG1.2k fueron ligados con el kit "DNA Ligation Kit" Ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo K.K.). Células competentes de E. coli cepa JM109 (producidas por Takara Shuzo K.K.) fueron transformadas con el producto ligado y cultivadas posteriormente en medio de agar Circle Grow (fabricado por BIO101) conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina a 37ºC durante una noche. Las colonias que crecieron en el medio de agar fueron inoculadas a 0,5 ml de medio Circle Grow conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina y cultivadas a 37ºC durante 5 horas. Los plásmidos fueron extraídos de las células mediante el método del álcali y, después de digestión con EcoRI, sometidos a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para detectar los plásmidos recombinantes que contenían un fragmento de ADN con la misma longitud que el ADN de 1.2k derivado de Haemophilus paragallinarum serotipo A, cepa 221, y de este modo se confirmaron las E. coli transformadas.

Los transformantes de E. coli obtenidos fueron cultivados en medio Circle Grow que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y posteriormente los plásmidos recombinantes (referidos de aquí en adelante como "pUA1.2") fueron recuperados de las células mediante el método de precipitación con PEG. Utilizando el método de Recorrido con Cebadores, se analizó la secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG1.2k utilizando un secuenciador de ADN (Applied Biosystems 377). Como resultado, se determinó una secuencia de 1170 nucleótidos. Se encontró que la secuencia de nucleótidos del ADN HPG1.2k correspondía a la secuencia desde el nucleótido Nº 1988 hasta el nucleótido Nº 3157 de la SEC ID Nº: 1, que es una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido HMTp210 de serotipo A según se describe en la presente posteriormente, y codifica 389 residuos de aminoácidos sin codón de inicio ni codón de terminación en esta región. Se mostró también la secuencia de aminoácidos correspondiente que no representa una secuencia equivalente a la secuencia de aminoácidos N-terminal del polipéptido HPGp130. Por consiguiente, se consideró que el ADN HPG1.2k codifica una porción del polipéptido HPGp130.

(3) Clonaje del ADN HPG3.5k

Utilizando el kit "DIG-DNA Labeling Kit" (fabricado por Boehringer Mannheim), 0,3 \mug aproximadamente del ADN HPG1.2k anterior fueron marcados con digoxigenina (DIG) de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. Después de que el ADN genómico de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 fuera cortado con varios enzimas de restricción, una cantidad adecuada de los productos cortados fue sometida a electroforesis en gel del agarosa al 0,8% y transferida posteriormente a una membrana Hybond N+ (fabricada por Amersham). Utilizando como sonda el ADN HPG1.2k marcado con DIG, se llevó a cabo una hibridación Southern con el kit "DIG Nucleic Acid Detection Kit" (fabricado por Boehringer Mannheim), de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo, para la detección de los ADNs deseados. Como resultado, un fragmento de 3,5 kb aproximadamente obtenido por digestión con HindIII hibridaba con el ADN HPG1.2k marcado con DIG. Por tanto, este fragmento fue separado en electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y eluido y recuperado del gel con el kit "Sephaglas™ BandPrep Kit" de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo.

Por otra parte, el plásmido pUC119 fue digerido con HindIII y tratado posteriormente con fosfatasa alcalina para desfosforilar el extremo 5'. El ADN de pUC119 cortado fue tratado con fenol y cloroformo y luego recuperado mediante precipitación con etanol. El pUC119 cortado y el digesto de HindIII anterior (3,5 kb aproximadamente) del genoma de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 fueron ligados con el kit "DNA Ligation Kit" Ver. 2. Células competentes de E. coli cepa JM109 fueron transformadas con el producto ligado y cultivadas posteriormente en medio de agar Circle Grow que contenía 50 \mug/ml de ampicilina a 37ºC durante una noche. El medio de agar en el que crecieron las E. coli transformadas se cubrió con una membrana Hybond N+ para levantar las colonias. Utilizando como sonda el ADN HPG1.2k marcado con DIG, se llevó a cabo una hibridación de colonias de la manera convencional y los clones positivos fueron sometidos a selección con el kit "DIG Nucleic Acid Detection Kit".

Los clones positivos fueron cultivados en medio Circle Grow que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Los plásmidos fueron recuperados de las células mediante el método de precipitación con PEG. El plásmido recombinante obtenido (referido de aquí en adelante como "pUA3.5") fue digerido con HindIII y sometido posteriormente a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para separar un fragmento de ADN de 3,5 kb derivado de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221. Utilizando el kit "Sephaglas™ BandPrep Kit", este fragmento de ADN (referido de aquí en adelante como "ADN HPG3,5k") fue eluido y recuperado de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. E. coli UA3.5JM transformada con el plásmido recombinante ha sido depositada por el solicitante como FERM BP-6083 en el National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken) el 5 de Septiembre de 1996.

(4) Expresión del ADN HPG3.5k

El vector de expresión pTrcHisC (fabricado por Invitrogen) fue digerido con HindIII y tratado posteriormente con fosfatasa alcalina para desfosforilar el extremo 5'. El ADN de pTrcHisC cortado fue tratado con fenol y cloroformo y luego recuperado mediante precipitación con etanol. El pTrcHisC cortado y el ADN HPG3.5k anterior fueron ligados con el kit "DNA Ligation Kit" Ver. 2. Células competentes de E. coli cepa JM109 fueron transformadas con el producto ligado y cultivadas posteriormente en medio de agar Circle Grow que contenía 50 \mug/ml de ampicilina a 37ºC durante una noche. Las colonias cultivadas en el medio de agar fueron inoculadas a 0,5 ml de medio Circle Grow que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y cultivadas a 37ºC durante 5 horas. Los plásmidos fueron extraídos de las células mediante el método del álcali y, después de digestión con HindIII, sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para detectar los plásmidos recombinantes que contenían el fragmento de ADN con la misma longitud que el ADN de 3.5k derivado de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221, y de este modo se confirmaron las células de E. coli transformadas.

Los transformantes de E. coli obtenidos fueron sembrados en 1 ml de medio Circle Grow que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y cultivados a 37ºC durante 3 horas. A ello se añadió posteriormente IPTG (concentración final de 1 mM) y los transformantes fueron cultivados a 37ºC durante 3 horas adicionales. Las células fueron recogidas del cultivo por centrifugación y suspendidas en 50 \mul de PBS. La suspensión de las células (10 \mul) fue mezclada con la misma cantidad de SDS al 2% y la mezcla fue llevada a ebullición durante 5 minutos, y posteriormente 2 \mul fueron depositados sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa fue secada al aire y posteriormente bloqueada con PBS que contenía un 5% de leche desnatada a 4ºC durante una noche. Posteriormente, se repitieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 2 (6) de tal manera que se hicieron reaccionar sucesivamente suero de cobayo anti-polipéptido HPGp130, anti-IgG de cobayo marcado con peroxidasa y un sustrato. Una serie de estos procedimientos dio lugar a E. coli que había sido transformada con un plásmido recombinante en el que el ADN HPG3.5k estaba ligado en dirección correcta y expresaba un antígeno reactivo específicamente con el suero de cobayo anti-HPGp130.

(5) Inmunogenicidad del polipéptido HPG3.5k-HIS

Los transformantes de E. coli obtenidos fueron inoculados a 200 ml de medio Circle Grow que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y cultivados a 37ºC durante 3 horas. A ello se añadió IPTG (concentración final de 1 mM) y los transformantes fueron cultivados a 37ºC durante 3 horas adicionales. Las células fueron recogidas del cultivo por centrifugación y suspendidas en 10 ml de PBS. A la suspensión se añadió lisozima a 100 \mug/ml para reacción a 4ºC durante 1 hora. La suspensión fue sonicada con un Sonicador Branson 350 a 4ºC durante 10 minutos para producir bacteriolisis. Las células intactas fueron eliminadas por centrifugación y el sobrenadante obtenido fue utilizado como un polipéptido HPG3.5k-HIS bruto.

Diez pollos Leghorn blancos SPF de 8 semanas de edad fueron inmunizados mediante administración subcutánea en la pata de 0,5 ml de una emulsión preparada mezclando a fondo la solución del polipéptido HPG3.5k-HIS bruto con la misma cantidad de adyuvante completo de Freund. Tres semanas más tarde, se administraron a los pollos subcutáneamente en la pata 0,5 ml de una emulsión preparada de manera similar con adyuvante incompleto de Freund. Dos semanas después, los pollos recibieron una inyección de refuerzo subcutánea en la pata de una emulsión preparada de manera similar con adyuvante incompleto de Freund. Siete semanas después de la primera inmunización, los pollos fueron desafiados con Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221. Como control, según se describió en el Ejemplo 2 (7), un grupo fue inmunizado con HPG serotipo A cepa 221 inactivado con formalina y otro grupo no fue inmunizado, y ambos grupos control fueron desafiados de manera similar. Los resultados están mostrados en la Tabla 3. El grupo inmunizado con el polipéptido HPG3.5k-HIS bruto mostró protección frente a la aparición de la enfermedad en siete de diez pollos. El grupo inmunizado con las células inactivadas con formalina mostró protección frente a la aparición de la enfermedad en todos los pollos, mientras que el grupo no inmunizado presentó síntomas en todos los pollos.

TABLA 3

Grupo de	Pollos	Pollos	Tasa de
Inmunización	Analizados	Protegidos	Protección (%)
HPG3.5k-HIS bruto	10	7	70
Cepa 221 inactivada con formalina	10	10	100
Control no inmunizado	8	0	\; 0

(6) Secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG3.5k

La secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG3.5k fue analizada con un secuenciador de ADN según se describió anteriormente. Como resultado, se determinó una secuencia de 3450 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG3.5k corresponde a la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido Nº 1 al Nº 3450 de la SEC ID Nº: 1. Se encontró una región que codificaba una secuencia de aminoácidos idéntica a la del extremo N-terminal del polipéptido HPGp130. Se obtuvo un marco de lectura abierto del ADN HPG3.5k en el mismo marco que el del polipéptido HPGp130, y se encontró que la traducción comenzaba en el nucleótido Nº 243 para codificar 1069 residuos de aminoácidos. No había codón de terminación en esta región y por tanto se asumió que el ADN HPG3.5k codificaba una porción del polipéptido HPGp130. Se muestra también la secuencia de aminoácidos correspondiente.

(7) Clonaje del ADN HPG4.1k

El fragmento ADN HPG3.5k anterior fue marcado con DIG según se describió anteriormente. Después de que el ADN genómico de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 fuera cortado con los enzimas de restricción XhoI y XbaI, se llevó a cabo una hibridación Southern según se describió en el Ejemplo 3 (3) utilizando como sonda el ADN HPG3.5k marcado con DIG o el ADN HPG1.2k marcado con DIG. Como resultado, se detectaron ADNs de 5,5 kb aproximadamente, de 4,1 kb aproximadamente y de 1 kb aproximadamente con el ADN HPG3.5k marcado con DIG como sonda. Cuando se utilizó como sonda el ADN HPG1.2k marcado con DIG, se detectaron ADNs de 4,1 kb aproximadamente y 1 kb aproximadamente. Como en el fragmento de ADN HPG3.5k había dos sitios de XhoI, según se muestra en la Fig. 7, se consideró que el ADN de 5,5 kb aproximadamente era un fragmento que correspondía al sitio 5' del primer sitio de corte de XhoI, el ADN de 4,1 kb aproximadamente era un fragmento correspondiente al sitio 3' del segundo sitio de corte de XhoI, y el ADN de 1 kb aproximadamente era un fragmento entre estos dos sitios de XhoI. Por tanto, el fragmento de 4,1 kb aproximadamente fue separado y recuperado en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8%.

Según se muestra en la Fig. 8, el plásmido pSP72 (producido por Promega) fue digerido con XhoI y XbaI y, después de desfosforilar el extremo 5', ligado con el digesto de XhoI-XbaI anterior (de 4,1 kb aproximadamente) derivado del genoma de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221. Células de E. coli cepa JM109 fueron transformadas con el producto ligado. Para los transformantes de E. coli obtenidos, se llevó a cabo una hibridación de colonias utilizando como sonda el ADN HPG3.5k marcado con DIG para seleccionar los clones positivos.

Los clones positivos fueron cultivados en medio Circle Grow que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Los plásmidos fueron recuperados de las células mediante el método de precipitación con PEG. El plásmido obtenido (referido de aquí en adelante como "pSA4.1"), en el que se había incorporado el fragmento digesto de XhoI-XbaI (referido de aquí en adelante como "ADN HPG4.1k") derivado de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221, fue digerido con XhoI y XpnI y sometido posteriormente a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para separar y recuperar un fragmento de ADN de 4,1 kb aproximadamente que era el ADN HPG4.1k anterior al que se había añadido el fragmento XbaI-KpnI procedente del plásmido pSP72.

(8) Expresión del ADN HPG4.1k

Según se describió en el Ejemplo 3 (4), el vector de expresión pTrcHisC fue digerido con XhoI y XpnI y, después de desfosforilar el extremo 5', ligado con el digesto de XhoI-XpnI anterior de 4,1 kb. Células de E. coli cepa JM109 fueron transformadas con el producto ligado. De los transformantes de E. coli obtenidos, se obtuvo E. coli que había sido transformada con un plásmido recombinante en el que el ADN HPG4.1k estaba ligado en dirección correcta y expresaba un antígeno reactivo específicamente con el suero de cobayo anti-HPGp130.

(9) Inmunogenicidad del polipéptido HPG4.1k-HIS

Los transformantes de E. coli obtenidos fueron inoculados a 200 ml de medio Circle Grow que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y cultivados a 37ºC durante 3 horas. A ello se añadió IPTG (concentración final de 1 mM) y los transformantes fueron cultivados a 37ºC durante 3 horas adicionales. Las células fueron recogidas del cultivo por centrifugación y suspendidas en 10 ml de PBS. A la suspensión se añadió lisozima a 100 \mug/ml para reacción a 4ºC durante 1 hora. La suspensión fue sonicada a 4ºC durante 10 minutos para producir bacteriolisis. Las células intactas fueron eliminadas por centrifugación y el sobrenadante obtenido fue utilizado como polipéptido HPG4.1k-HIS bruto.

Diez pollos Leghorn blancos SPF de 5 semanas de edad fueron inmunizados mediante la administración subcutánea en la pata de 0,5 ml de una emulsión preparada mezclando a fondo la solución del polipéptido HPG4.1k-HIS bruto con la misma cantidad de adyuvante completo de Freund. Alrededor de tres semanas después, se administró a los pollos subcutáneamente en la pata 0,5 ml de una emulsión preparada de manera similar con adyuvante incompleto de Freund. Dos semanas más tarde, los pollos recibieron una inyección de refuerzo subcutánea en la pata de una emulsión preparada de manera similar con adyuvante incompleto de Freund. Siete semanas después de la primera inmunización, los pollos fueron desafiados con Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221. Como control, según se describió en el Ejemplo 2 (7), un grupo fue inmunizado con HPG serotipo A cepa 221 inactivado con formalina y otro grupo no fue inmunizado, y ambos grupos control fueron desafiados de manera similar. Los resultados están mostrados en la Tabla 4. El grupo inmunizado con el polipéptido HPG4.1k-HIS bruto mostró protección frente a la aparición de la enfermedad en los diez pollos analizados. El grupo inmunizado con las células inactivadas con formalina presentó una protección frente a la aparición de la enfermedad en todos los pollos, mientras que el grupo no inmunizado mostró síntomas en todos los pollos.

TABLA 4

Grupo de	Pollos	Pollos	Tasa de
Inmunización	Analizados	Protegidos	Protección (%)
HPG4.1k-HIS bruto	10	10	100
Cepa 221 inactivada con formalina	10	10	100
Control no inmunizado	10	0	\; 0

(10) Secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG4.1k

Una secuencia de nucleótidos de una región del fragmento ADN HPG4.1k que no solapaba con el fragmento ADN HPG3.5k, esto es una región que se extendía desde el sitio de corte de HindIII hasta el sitio de corte de XbaI, fue analizada con un secuenciador de ADN según se describió anteriormente. Como resultado, se determinó una secuencia de 2831 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG4.1k analizada corresponde a la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido Nº 3445 al nucleótido Nº 6275 de la SEC ID Nº: 1. No se encontró codón de terminación en la región de dicho fragmento de ADN. Se muestra también la secuencia de aminoácidos correspondiente.

(11) Clonaje del ADN HPG6.7k

Después de que el ADN genómico de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 fuera cortado con XhoI y PstI, se llevó a cabo una hibridación Southern según se describió en el Ejemplo 3 (3) utilizando como sonda el ADN HPG3.5k marcado con DIG o el ADN HPG1.2k marcado con DIG. Como resultado, se detectaron ADNs de 9,4 kb aproximadamente, 6,7 kb aproximadamente y 1 kb aproximadamente con el ADN HPG3.5k marcado con DIG como sonda. Cuando se utilizó como sonda el ADN HPG1.2k marcado con DIG, se detectaron ADNs de 6,7 kb aproximadamente y 1 kb aproximadamente. Como hay dos sitios de corte de XhoI en el fragmento ADN HPG3.5k según se describió anteriormente, se consideró que el ADN de 9,4 kb aproximadamente era un fragmento correspondiente al sitio 5' del primer sitio de corte de XhoI, el ADN de 6,7 kb aproximadamente era un fragmento correspondiente al sitio 3' del segundo sitio de corte de XhoI y el ADN de 1 kb aproximadamente era un fragmento entre estos dos sitios de XhoI. Por tanto, el fragmento de 6,7 kb aproximadamente fue separado y recuperado en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8%.

Según se muestra en la Fig. 9, el plásmido pSP72 fue digerido con XhoI y PstI y, después de desfosforilar el extremo 5', ligado con el digesto de XhoI-PstI anterior (6,7 kb aproximadamente) derivado del genoma de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221. Células de E. coli cepa JM109 fueron transformadas con el producto ligado. Para los transformantes de E. coli obtenidos, se llevó a cabo una hibridación de colonias utilizando como sonda el ADN HPG3.5k marcado con DIG para seleccionar los clones positivos.

Los clones positivos fueron cultivados en medio Circle Grow que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Los plásmidos fueron recuperados de las células mediante el método de precipitación con PEG. El plásmido recombinante obtenido es referido de aquí en adelante como "pSA6.7". E. coli SA6.7JM transformada con el plásmido recombinante ha sido depositada por el solicitante como FERM BP-6081 en el National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken) el 27 de Agosto de 1997.

(12) Clonaje del ADN HPG2.7k

Como el fragmento de ADN de 6,7 kb aproximadamente (referido de aquí en adelante como "ADN HPG6.7k") incorporado en el plásmido recombinante obtenido (pSA6.7) incluye el ADN HPG4.1k anterior, se subclonó un fragmento de 2,7 kb aproximadamente (referido de aquí en adelante como "ADN HPG2.7k") que es una sustracción del ADN HPG4.1k del ADN HPG6.7k. El pSA6.7 fue digerido con XbaI y sometido posteriormente a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para separar y recuperar un fragmento de ADN de 2,7 kb aproximadamente que era el ADN HPG2.7k anterior al que se había añadido el fragmento PstI-XbaI del plásmido pSP72.

El plásmido pSP72 fue digerido posteriormente con XbaI y, después de desfosforilar el extremo 5', ligado con el digesto de XbaI anterior de 2,7 kb aproximadamente. Células de E. coli de la cepa JM109 fueron transformadas con el producto ligado. Los transformantes de E. coli obtenidos fueron cultivados en medio Cicle Grow que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Los plásmidos fueron recuperados de las células mediante el método de precipitación con PEG. El plásmido recombinante obtenido es referido de aquí en adelante como "pSA2.7".

(13) Secuencia de nucleótidos del ADN HPG2.7k

Se analizó la secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG2.7k con un secuenciador de ADN según se describió anteriormente. Como resultado, se determinó una secuencia de 2661 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG2.7k corresponde a la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido Nº 6270 al nucleótido Nº 8930 de la SEC ID Nº: 1. Se encontró un codón de terminación en la región. Se muestra también la secuencia de aminoácidos correspondiente.

Se encontró que la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1, que consta de un total de 8930 nucleótidos, incluía un marco de lectura abierto que comenzaba a partir del nucleótido Nº 243 y que podía codificar 2042 residuos de aminoácidos. Un polipéptido que comprendía los 2042 residuos de aminoácidos es referido de aquí en adelante como "HMTp210 de serotipo A". La búsqueda de homologías con las bases de datos existentes (GeneBank y EMBL) reveló que no había homología con ninguna secuencia de nucleótidos ni de aminoácidos conocidas, indicando que el polipéptido HMTp210 de serotipo A es una nueva sustancia.

Se sugirió también la presencia de otro posible marco de lectura abierto en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1, que comenzaba a partir del nucleótido Nº 8375 y que podía codificar 185 residuos de aminoácidos. No se encontró en esta secuencia ningún codón de terminación. La búsqueda de homologías con las bases de datos existentes (GeneBank y EMBL) reveló que no existía homología con ninguna secuencia de nucleótidos ni de aminoácidos conocidas, indicando que el polipéptido codificado por este marco de lectura abierto es también una sustancia nueva.

Ejemplo 4 Búsqueda de un fragmento de ADN hibridable con el ADN HPG1.2k procedente de otras cepas distintas de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221

Según se describió en el Ejemplo 3 (1) se prepararon ADNs genómicos de un total de nueve cepas, a saber HPG serotipo A cepas 221, 083, W, Germany y Georgia, HPG serotipo B cepas Spross y 0222 y HPG serotipo C cepas Modesto y 53-47. Después de que los ADNs genómicos preparados fueron cortados con el enzima de restricción EcoRI, se llevó a cabo una hibridación Southern utilizando como sonda el ADN HPG1.2k marcado con DIG, según se describió en el Ejemplo 3 (3). Como resultado, se detectaron en todas las cepas fragmentos hibridables con el ADN HPG1.2k, aunque el tamaño de cada fragmento variaba dependiendo de la cepa (Fig. 10).

Ejemplo 5 Clonaje del gen que codifica el polipéptido (HMTp210 de serotipo C) de Haemophilus paragallinarum serotipo C (1) Proceso de selección de una biblioteca genómica

Se preparó una biblioteca genómica de Haemophilus paragallinarum serotipo C cepa 53-47 de la misma manera que la descrita en el Ejemplo 3 (1). Esto es, un ADN genómico de HPG serotipo C cepa 53-47 digerido con el enzima de restricción HindIII fue ligado a un brazo de \lambdaDASHII (producido por STRATAGENE) digerido con en enzima de restricción HindIII, utilizando el kit "cDNA Rapid Cloning Module-\lambdagt11". Utilizando el módulo de empaquetamiento in vitro en ADN de \lambda, el producto ligado fue insertado en el fago \lambda. Las soluciones de fago recombinante obtenidas fueron utilizadas como biblioteca genómica.

Las soluciones anteriores de la biblioteca genómica fueron añadidas a una suspensión de 10^{8} células aproximadamente de E. coli cepa XL1-Blue MRA (P2) (producida por STRATAGENE) en una solución acuosa de sulfato de magnesio 10 mM para absorción a 37ºC durante 15 minutos. A todo ello se añadió medio de agarosa blanda LB (que contenía 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio, 50 mg de ampicilina, 4 g de maltosa y 8 g de agarosa en 1000 ml, pH 7) para recubrimiento, calentado a 45ºC. La mezcla fue depositada sobre el medio de agar LB e incubada a 37ºC durante una noche. El medio de agar en el que habían crecido las E. coli transformadas fue cubierto con una membrana Hybond N+ para levantar las placas de fago. Utilizando como sonda el ADN HPG3.5k de serotipo A marcado con DIG, se llevó a cabo una hibridación de placas de la manera convencional y se seleccionaron los clones positivos. Alrededor de 1.000 placas fueron sometidas a selección inmunológica según se describió anteriormente para dar 37 placas positivas. Diez de las placas positivas obtenidas fueron sometidas posteriormente a un segundo y un tercer proceso de selección igual que en el proceso de selección primario.

Los fagos \lambdaDASHII recombinantes que fueron positivos en la hibridación de placas fueron añadidos a una suspensión de 10^{8} células aproximadamente de E. coli cepa XL1-Blue MRA (producida por STRATAGENE) en una solución acuosa de sulfato de magnesio 10 mM para absorción a 37ºC durante 15 minutos. Según se describió en el Ejemplo 3 (1), el ADN de los fagos fue recuperado. El ADN de fago obtenido fue digerido con HindIII y sometido posteriormente a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para separar y recuperar fragmentos de ADN derivados de Haemophilus paragallinarum serotipo C cepa 53-47. Todos los fragmentos de ADN obtenidos de los diez fagos positivos tenían una longitud de 13,5 kb aproximadamente. Un fragmento de ADN (referido de aquí en adelante como "ADN HPG-C1") obtenido del fago de un clon (clon 1) fue utilizado en el ensayo siguiente.

(2) Fragmentación y subclonaje del ADN HPG-C1

Como el ADN HPG-C1 de 13,5 kb aproximadamente es demasiado grande para ser subclonado en un vector plasmídico, fue cortado con varios enzimas de restricción y una cantidad adecuada de los fragmentos de ADN resultantes fue sometida a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. Como resultado, se detectaron fragmentos de ADN de 6,9 kb aproximadamente, de 5,6 kb aproximadamente y de 0,9 kb aproximadamente cuando fue sometido a digestión con XbaI.

El plásmido pUC119 fue digerido con HindIII y XbaI y, después de desfosforilar el extremo 5', ligado con los digestos de XbaI anteriores del ADN HPG-C1. Células de E. coli cepa JM109 fueron transformadas con los productos ligados. Además, células de E. coli transformadas con el plásmido recombinante que contenía el fragmento de ADN de 5,6 kb aproximadamente o de 0,9 kb aproximadamente, fueron cultivadas y los plásmidos fueron recuperados de las células mediante el método de precipitación con PEG. Los plásmidos recombinantes obtenidos (referidos de aquí en adelante como "pU-C2" y "pU-C3", que contenían el fragmento de ADN de 5,6 kb aproximadamente y el fragmento de ADN de 0,9 kb aproximadamente, respectivamente) fueron digeridos con HindIII-XbaI y posteriormente sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para separar y recuperar fragmentos de ADN de 5,6 kb aproximadamente y 0,9 kb aproximadamente (referidos de aquí en adelante como "ADN HPG-C2" y "ADN HPG-C3", respectivamente). E. coli U-C2JM transformada con el plásmido recombinante pU-C2 ha sido depositada por el solicitante como FERM BP-6082 en el National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken) el 27 de Agosto de 1997.

El plásmido pUC119 fue digerido con XbaI y, después de desfosforilar el extremo 5', ligado con los digestos de XbaI anteriores del ADN HPG-C1. Células de E. coli cepa JM109 fueron transformadas con los productos ligados. Además, se cultivaron células de E. coli transformadas con el plásmido recombinante que contenía el fragmento de ADN de 6,9 kb aproximadamente y el plásmido fue recuperado de las células mediante el método de precipitación con PEG. El plásmido recombinante obtenido (referido de aquí en adelante como "pU-C4") fue digerido con XbaI y sometido posteriormente a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para separar y recuperar un fragmento de ADN de 6,9 kb aproximadamente (referido de aquí en adelante como "ADN HPG-C4"). E. coli U-C4JM transformada con el plásmido recombinante pU-C4 ha sido depositada por el solicitante como FERM BP-6080 en el National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken) el 27 de Agosto de 1997.

Cada uno de los fragmentos de ADN obtenidos, HPG-C2, HPG-C3 y HPG-C4, fue depositado sobre una membrana Hybond N+. Posteriormente, se llevó a cabo una hibridación de manchas utilizando como sonda el ADN HPG3.5k marcado con DIG anterior o el ADN HPG4.1k o HPG2.7k marcados de manera similar con DIG. Cuando se utilizó como sonda el ADN HPG3.5k marcado con DIG o el ADN HPG4.1k marcado con DIG, se detectó el ADN HPG-C4. Por otra parte, cuando se utilizó como sonda el ADN HPG2.7k, se detectó el ADN HPG-C2. A partir de esto, se asumió que HPG-C3, HPG-C4 y HPG-C2 estaban situados en este orden desde el sitio 5' y que HPG-C4 incluía principalmente una región que codificaba el polipéptido según está mostrado en la Fig. 11.

(3) Secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG-C4

Se analizó la secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG-C4 con un secuenciador de ADN según se describió anteriormente. Como resultado, se determinó una secuencia de 6871 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos del fragmento ADN HPG-C4 corresponde a la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido Nº 1 al nucleótido Nº 6871 de la SEC ID Nº: 5. Sobre la base de la alta homología con el gen que codifica HMTp210 de serotipo A, se obtuvo un marco de lectura abierto del ADN HPG-C4 en el mismo marco que el del gen que codifica HMTp210 de serotipo A, y se encontró que la traducción comenzaba en el nucleótido Nº 848 para codificar 2008 residuos de aminoácidos. Sin embargo, no se encontró ningún codón de terminación en la región de dicho fragmento de ADN. Se muestra también la secuencia de aminoácidos correspondiente.

(4) Secuencia de nucleótidos de una porción del fragmento ADN HPG-C2

Como no se encontró ningún codón de terminación en la región del fragmento ADN HPG-C4, se analizó una secuencia de nucleótidos en el lado 5' del fragmento ADN HPG-C2, que está en el lado 3' del fragmento ADN HPG-C4. Según se muestra en la Fig. 11, hay tres sitios de corte de AccI en el fragmento ADN HPG-C2. Se reveló también que un fragmento que se extendía desde el sitio de clonaje, esto es desde el sitio de corte de XbaI, hasta el primer sitio de corte de AccI tenía un tamaño de 0,6 kb aproximadamente según se demostró en electroforesis en gel de agarosa. Por tanto, se analizó la secuencia de nucleótidos de este fragmento de 0,6 kb aproximadamente con un secuenciador de ADN según se describió anteriormente. Como resultado, se determinó una secuencia de 621 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos de una porción del fragmento ADN HPG-C2 corresponde a la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido Nº 6866 al nucleótido Nº 7486 de la SEC ID Nº: 5. Se encontró un codón de terminación en la región de esta porción del fragmento ADN HPG-C2. Se muestra también la secuencia de aminoácidos correspondiente.

Se encontró que la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 5 que consta de un total de 7486 nucleótidos, incluía un marco de lectura abierto que comenzaba a partir del nucleótido Nº 848 y podía codificar 2039 residuos de aminoácidos. Un polipéptido que contenía los 2039 residuos de aminoácidos es referido de aquí en adelante como "HMTp210 de serotipo C". La búsqueda de homologías con las bases de datos existentes (GeneBank y EMBL) reveló que no había homologías con ninguna secuencia de nucleótidos ni de aminoácidos conocidas, indicando que el polipéptido HMTp210 de serotipo C es una sustancia nueva.

La búsqueda de homologías entre las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido HMTp210 de serotipo C y el polipéptido HMTp210 de serotipo A reveló un 80% de homología aproximadamente. Se reveló también que la región de 3,4 kb aproximadamente en el lado 5' y la región de 1,2 kb aproximadamente en el lado 3', presentaban una homología extremadamente elevada mientras que la región de 1,5 kb aproximadamente entre estas regiones 5' y 3' mostraba una baja homología. Lo mismo era también aplicable a los polipéptidos correspondientes codificados por estos genes.

Ejemplo 6 Amplificación por PCR del gen de HMTp210 procedente del ADN genómico de células de HPG de serotipo A, B y C

Según se describió en el Ejemplo 3 (1), se prepararon ADNs genómicos a partir de un total de nueve cepas, a saber HPG serotipo A cepas 221, 083, W, Germany y Georgia, HPG serotipo B cepas Spross y 0222 y HPG serotipo C cepas Modesto y 53-47. Sobre la base de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido HMTp210 de serotipo A, se prepararon un ADN sintético que tenía la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 3 como cebador de PCR corriente arriba y un ADN sintético que tenía la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 4 como cebador de PCR corriente abajo. Estos cebadores fueron diseñados de manera que se añadieran secuencias de reconocimiento de BamHI en el lado 5', respectivamente, y pudiera amplificarse una región de traducción de longitud completa del polipéptido HMTp210 de serotipo A. Utilizando estos cebadores, se llevó a cabo una PCR utilizando como molde los ADNs genómicos preparados según se mencionó anteriormente. La PCR se llevó a cabo con el kit "LA PCR Kit" Ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo K.K.) bajo las condiciones siguientes: después de la reacción a 94ºC durante 1 minuto, 30 ciclos de reacciones a 98ºC durante 40 segundos y a 60ºC durante 10 minutos, seguido por una reacción a 72ºC durante 10 minutos. El análisis de los productos de la PCR obtenidos en electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% confirmó el fragmento amplificado de 6,1 kb aproximadamente en cualquiera de estas cepas (Fig. 12).

Ejemplo 7 Expresión de los polipéptidos HMTp210 de serotipo A y C de longitud completa (1) Expresión del polipéptido HMTp210 de serotipo A

El producto de la PCR obtenido en el Ejemplo 6 con el ADN genómico de Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221 como molde, fue digerido con BamHI. Después de separación mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, la fracción de 6,1 kb aproximadamente amplificada fue eluida y recuperada con el kit "Sephaglas™ BandPrep Kit".

El plásmido pUC119 fue digerido con BamHI y, después de desfosforilar el extremo 5', ligado con el fragmento de 6,1 kb aproximadamente amplificado anteriormente. Células de E. coli cepa JM109 fueron transformadas con el producto ligado. Además, células de E. coli transformadas con el plásmido recombinante que contenía el fragmento de ADN de 6,1 kb aproximadamente fueron cultivadas y el plásmido fue recuperado de las células mediante el método de precipitación con PEG. El plásmido recombinante obtenido (referido de aquí en adelante como "pU-AP1") fue digerido con BamHI y posteriormente sometido a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para separar y recuperar el fragmento de ADN de 6,1 kb aproximadamente (referido de aquí en adelante como "ADN HPG-AP1").

Según se describió en el Ejemplo 3 (4), el vector de expresión pTrcHisA (producido por Invitrogen) fue digerido con BamHI y, después de desfosforilar el extremo 5', ligado con el ADN HPG-AP1 anterior. Células de E. coli cepa JM109 fueron transformadas con el producto ligado. De los transformantes de E. coli obtenidos, se obtuvo E. coli que había sido transformada con un plásmido recombinante en el que el ADN HPG-AP1 estaba ligado en dirección correcta y expresaba un antígeno reactivo específicamente con el suero de cobayo anti-HPGp130.

(2) Expresión del polipéptido HMTp210 de serotipo C

El producto de PCR obtenido en el Ejemplo 6 con el ADN genómico de Haemophilus paragallinarum serotipo C cepa 53-47 como molde, fue digerido con BamHI. Después de separación mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se recuperó la fracción de 6,1 kb aproximadamente amplificada.

El plásmido pUC119 fue digerido con BamHI y, después de desfosforilar el extremo 5', ligado con el fragmento de 6,1 kb aproximadamente amplificado anteriormente. Células de E. coli cepa JM109 fueron transformadas con el producto ligado. Además, células de E. coli transformadas con el plásmido recombinante que contenía el fragmento de ADN de 6,1 kb aproximadamente fueron cultivadas y el plásmido fue recuperado de las células mediante el método de precipitación con PEG. El plásmido recombinante obtenido (referido de aquí en adelante como "pU-CP1") fue digerido con BamHI y posteriormente sometido a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para separar y recuperar el fragmento de ADN de 6,1 kb aproximadamente (referido de aquí en adelante como "ADN HPG-CP1").

Según se describió en el Ejemplo 3 (4), el vector de expresión pTrcHisA (fabricado por Invitrogen) fue digerido con BamHI y, después de desfosforilar el extremo 5', ligado con el ADN HPG-CP1 anterior. Células de E. coli cepa JM109 fueron transformadas con el producto ligado. De los transformantes de E. coli obtenidos, se obtuvo E. coli que había sido transformada con un plásmido recombinante en el que el ADN HPG-CP1 estaba ligado en la dirección correcta y expresaba un antígeno específicamente reactivo con el suero de cobayo anti-HPGp130.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 6-1, Okubo 1-chome

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Kumamoto-ken

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Kumamoto-shi

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Japón

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 860

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVO POLIPÉPTIDO DE HAEMOPHILUS PARAGALLINARUM Y UN PROCESO PARA PREPARAR EL MISMO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

: NÚMERO DE SOLICITUD: EP 97 94 0361.5

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID Nº: 1

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 8930

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

TIPO DE HEBRA: doble

TOPOLOGÍA: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

FUENTE ORIGINAL: Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\newpage

\hskip0.95cm

1

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3

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7

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9

10

11

12

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID Nº: 2

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 13

TIPO DE SECUENCIA: aminoácido

TIPO DE HEBRA: sencilla

TOPOLOGÍA: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

FUENTE ORIGINAL: Haemophilus paragallinarum serotipo A cepa 221

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Trp Leu Glu Val Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID Nº: 3

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 43

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

TIPO DE HEBRA: sencilla

TOPOLOGÍA: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ADN sintético)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGATCCA TGAATAAAGT TTTTAAAATT AAATATTCTG TTG

\hfill

43

\newpage

SEC ID Nº: 4

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 39

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

TIPO DE HEBRA: sencilla

TOPOLOGÍA: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ADN sintético)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGATCCT TAAGGCTAAA AGCTAAATCC AACACTCAT

\hfill

39

SEC ID Nº: 5

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 7486

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

TIPO DE HEBRA: doble

TOPOLOGÍA: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

FUENTE ORIGINAL: Haemophilus paragallinarum serotipo C cepa 53-47

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

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Claims

1. Un polipéptido recombinante de Haemophilus paragallinarum capaz de inducir la producción de anticuerpos HI y/o de proteger frente a la coriza infecciosa aviar, seleccionado del grupo que consta de

(a): polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 o en la SEC ID Nº: 5;

(b): polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal como la mostrada en la SEC ID Nº: 2 y que tienen un peso molecular de 130 kD aproximadamente;

(c): polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos desde el residuo de nucleótido Nº 2212 al Nº 6275 de la SEC ID Nº: 1; y

(d): polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos codificada por los residuos de nucleótidos Nº 1 a Nº 3450 de la SEC ID Nº: 1.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, donde Haemophilus paragallinarum es Haemophilus paragallinarum de serotipo A o serotipo C.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 ó 2, en el que se han eliminado, añadido o sustituido uno o varios residuos de aminoácidos.

4. Un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El ADN de la reivindicación 4, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 o de la SEC ID Nº: 5.

6. Un ADN que codifica un polipéptido de Haemophilus paragallinarum capaz de inducir la producción de anticuerpos HI y/o de proteger frente a la coriza infecciosa aviar, que híbrida con un ADN de una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 1 o en la SEC ID Nº: 5.

7. Una molécula de ADN recombinante que comprende el ADN de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 7, en la que un vector de dicha molécula de ADN recombinante es seleccionado del grupo que consta de un plásmido, un vector vírico y un cósmido.

9. Una célula transformante transformada con el ADN de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o con la molécula de ADN recombinante descrita en la reivindicación 7 u 8.

10. La célula transformante de la reivindicación 9, que es un huésped seleccionado del grupo que consta de células bacterianas, de levadura, de insecto, células animales y células vegetales.

11. Un anticuerpo que reconoce el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11, que es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

13. Un proceso para preparar el polipéptido descrito en la reivindicación 1 ó 3, mediante la utilización de un anticuerpo monoclonal con actividad HI.

14. El proceso de la reivindicación 13, en el que dicho polipéptido deriva de Haemophilus paragallinarum.

15. El proceso de la reivindicación 14, en el que Haemophilus paragallinarum es Haemophilus paragallinarum de serotipo A o serotipo C.

16. Un proceso para preparar el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende el cultivo de la célula transformante descrita en la reivindicación 9 ó 10 de tal manera que dicha célula transformante pueda producir el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y la purificación de dicho polipéptido.

17. Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el ADN de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, la molécula de ADN recombinante descrita en la reivindicación 7 u 8 o la célula transformante descrita en la reivindicación 9 ó 10 y, opcionalmente, un vehículo, diluyente o agente estabilizante adecuado.

18. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 17 para la protección frente a la coriza infecciosa aviar.

19. Un agente terapéutico que comprende como ingrediente activo el anticuerpo descrito en la reivindicación 11 ó 12, el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el vector de la reivindicación 8 y, opcionalmente, un vehículo, diluyente o agente estabilizante adecuado.

20. Un agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 19 para la coriza infecciosa aviar.

21. Una composición vacuna que comprende un polipéptido recombinante de Haemophilus paragallinarum capaz de inducir la producción de anticuerpos HI y/o de proteger frente a la coriza infecciosa aviar, seleccionado del grupo que consta de:

(a): polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal como la mostrada en la SEC ID Nº: 2 y que tienen un peso molecular de 130 kD aproximadamente;

(b): polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos desde el residuo de nucleótido Nº 2212 al Nº 6275 de la SEC ID Nº: 1; y

(c): polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos codificada por los residuos de nucleótidos Nº 1 a Nº 3450 de la SEC ID Nº: 1.

22. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 21 para protección frente a la coriza infecciosa aviar.