JPH01149734A - 家禽の大腸菌敗血症に対するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｅｏｌｉ（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）敗血症から家禽を防御するためのワクチンと、
該ワクチンを投与することによって家禽におけるＥ、ｃ
ｏｌｉ敗血痙に対抗する方法とに関する。

Ｅ、ｃｏｌｉ敗血症若しくは大腸菌症は通常にニワトリ
及びシチメンチョウといった）家禽に発生し、かなりの
損失の原因となる疾患である。この疾患にかかった鳥類
の特徴的な症候は、気嚢炎症、心嚢炎及び肝周囲炎に現
れる。この分野の研究のほとんどにおいて、前記疾患を
持つ鳥類に見られるＥ、ｃｏｌｉ株の半分以上が３種の
血清型、即ち０１：に１．０２：に１又は０フ８：に８
０のいずれかに属することが明らかになっている。米国
では血清型０３５もしばしば見られる。一般にＥ、ｃｏ
！ｉ敗血症は、例えば呼吸器系疾患を引き起こすウィル
ス又はマイコプラズマによって生体が衰弱した後に気道
を通って生体内に入る二次感染症であると言われている
。

家禽における大腸菌症の病原論で役割を演じるとルレン
ス因子についてはほとんど知られていない、哺乳類にお
ける感染症で役割を演じるＥ、ｃｏｌｉ株のビルレンス
因子には、例えば付着性フィムブができる。

通常は極めて宿主に特異的である多くの再々の付着性フ
ィムブリエが記述されて来た。即ちＣＦ＾フィムブリエ
は下痢のヒトに見られ、Ｋ８８フィムブリエは下痢の仔
ブタに、Ｋ９９は下痢のヒツジ、仔ウシ及び仔ブタに、
（Ｆｌｌ型を包含する）Ｐフィムブリエは尿道感染症の
ヒトに見られる。更に、精製形態の前記型の付着性フィ
ムブリエをワクチンとして投与するとそれぞれ動物の種
類に応答して感染防御免疫ができる。しかじ家禽におけ
る大腸菌症については同様のビルレンス因子が同定され
ていない。

Ｆｌｌ型のフィムブリエ若しくはその免疫原性セクショ
ン（部分）、又は前記フィムブリエ若しくはその免疫原
性セクションの産生及び必要によっては分泌をコードす
る遺伝物質を含む有機体を含有することを特徴とする、
Ｅ、ｃｏｌｉ敗血症から家禽を防御するためのワクチン
が発見された。

特に、大腸菌症に感染したニワトリの心臓から単離され
たＥ、ｃｏｌｉ株が、ヒトに尿道感染を引き起こすＥ、
ｃｏｌｉ株にも存在するＦ１１型フィムブリエと同一の
フィムブリエを産生することを研究によって示すことが
可能となった。

Ｅ、ｃｏｌｉ敗血症に冒された鳥類の大部分が、Ｆ１１
型フィムブリエを含有するＥ、ｃｏｌｉ株に感染してい
ることを血清学的に証明することが可能となった。

このようなフィムブリエは５ＯＳ−ＰＡ（：Ｅによる見
掛けの分子Ｎ１８．ｏｋＤのサブユニットタンパク質を
含有する。

上記フィムブリエは、３７℃の固体寒天培地上で培養さ
れた野生鳥類のＥ、ｃｏｌｉ株によって生産され得るも
ｇ鷹って、ブイヨン中でＥ、ｅｏｌｉを培養しても見ら
れない。（例えば０ｘｏｉｄ”’製の）血液寒天（ベー
ス）プレート上で細菌を培養すると、１８ｋＤフイムブ
リエの最適発現が行なわれる。同様に適した培地にはｐ
ｅｎａｓｓａｙ寒天プレート（Ｄｉｒｃｏ＋″’）があ
る。

２０℃で成長させると１８ｋＤフイムブリエは形成され
ない。

Ｆ１１フィムブリエはもう既に尿路疾患性野生型Ｅ、ｃ
ｏｌｉ株からクローン化されている（ｄｅ　Ｒｅｅ、Ｊ
、Ｍ、ｅＬ　ａｌ、、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ　Ｌｅｔｔ、２９．９１−９７．１９８５）。

フィムブリエを含有しないＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２株ＡＭ
１７２７を、Ｆｉｔフィムブリエをコードする遺伝子を
含有するプラスミドｐＰＩＬ　２９１−１５によって形
質転換すると、この形質転換株はＦ１１フィムブリエを
生産することができる。前記Ｆｉｔフィムブリエを、鳥
類にしばしば存在する０２：に１：ｔｌ−血清型に属す
るＥ、ｃｏｌｉ株Ｃ１１４から精製された１８ｋＤフイ
ムブリエと次の点について比較した。

ａ、１．Ｆｌｌ及び１８ｋＤフイムブリエは電子盟微鏡
では同一に見える：いずれのフィムブリエも長さ約１μ
ｍ及び直径的７ｎｍである； ｂ、１土ｉ　、５ＯＳ−ＰＡＧＥによってＦ１１及び１
８ｋ［ｌフィムブリエ両方のサブユニットについて見上
けの分子景が１８ｋＤであることが分かった； ｃ、％　ｍＬ工Ｍ！ｔＨＨｉ、ＥＬＩｓ＾において、Ｆ
１１及び１８ｋＤフイムブリエは、ｄｅ　Ｒｅｅ、Ｊ、
Ｍ、ｅｔ　ａｌ、によりＪ。

Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２４，１２１−１２５
；１９８６に記述された抗−Ｆ１１モノクローン抗体に
は全く同様に反応するが、Ｆ１＾、ＦＩＣ，Ｆ７、Ｆフ
２、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１２又はＦ１ａ型のフィムブリエに
対するモノクローン抗体には反応しない； ｄ、７えス叔皿戎、１８ｋＤサブユニットのアミノ酸組
成はＦ１１サブユニットの組成と本質的に同一である（
ｖａｎ　Ｄｉｅ、１．ｅｔ　ａｌ、；ｉｎ：Ｄ、Ｌ、Ｌ
ａｒｋ（ｅｄ、）。

Ｐｒｏｔｅｉｎｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　１ｎｔｅｒ
ａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｙｓｔ
ｅｍｓ、＾ｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ
。

ベージ３９−４６．１９８６）　（表１参照）；表ユ １）第１図の配列に基づいて算出 ２）ｅＮ　ＨＣＮ中で加水分解した後にウルトラバック
（ｕｌｔｒａｐａｅ）８カラム（ＬＫＢ）を使用してＳ
ＯＤＩｔＩＭ系によって測定した。

ｅ５アミノ　ｒアミノ　　　１１．１８ｋＤサブユニツ
トのアミノ末端の最初の１７個のアミノ酸の配列はＦ１
１サブユニットについて公知の対応する配列と同一であ
る（ｖａｎ　Ｄｉｅ、１．ｅｔ　ａｌ、；１９８６）−
第一図はＦ１１サブユニットタンパク質全体のアミノ酸
配列を示す。実際の分子ｆｆ１１６．４ｋＤはこの配列
から算出することができる。

Ｆ１１と同様にＰフィムブリエの付着特性は、ヒト赤血
球のマンノース耐性血球凝集反応（ＭＲＩＩ＾）によっ
て可視化することができる。このＭＲＩＩ＾は、十分な
量の前記Ｐフィムブリエを発現するＥ、ｃｏｌｉ細菌を
マンノースの存在下でヒト赤血球と混合すると見ること
ができる。

Ｐフィムブリエがヒト赤血球に付着するのに適した最小
の受容体ｆｌＩ！造は、三糖Ｇａ１ａｌ→４Ｇａ　ｌβ
であると同定された（Ｋｉ１１ｌｅｎｉｕｓ、Ｇ、ｅｔ
　ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ。

６０４−６．１９８１）。この三糖をラテックス粒子に
連結すると、ラテックス凝集によって細菌上のＰフィム
ブリエの存在を特異的に示す道具となる（ｄｅＭａｎ、
Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、２５，４０１−６；１９８７）。

最近になって、Ｆ１１フィムブリエ自体ではなくてこの
フィムブリエと関係する（「少量成分Ｊとも指体される
）特異的なアトへシン（ａｄｈｅｓｉｎｓ）が付着性の
要因であることが分かった（ｖａｎ　Ｄｉｅ、１．ｅｔ
　ａｌ。

、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　１
．５１−５６；１９８６）。

表２は、Ｆ１１フィムブリエの発現と、尿路疾患性Ｅ、
ｃｏｌｉ株、Ｆ１１フィムブリエ生産性組換えクローン
、及び大腸菌症に冒されたニワトリの心臓から単離され
た多数のＥ、ｅｏｌｉ株の付着特性との相関関係を比較
して示すものである。この表から、ニワトリから単離さ
れたＥ、ｅｏｌｉのＦ１１フィムブリエは少なくともヒ
トＥ、ｃｏｌｉのＦｉｔフィムブリエと同じ受容体を認
識すると言える。

人ス （ａ）１１２９１はヒトＥ、ｃｏｌｉ、　Ｆ１１基準株
Ｃ１９７６であり；ＡＭ１７２７／ｐＰＩＬ２９１−１
５はフィムブリエを含有しないに１２株ＡＭ１７２７の
Ｆ１１−フィムブリエ産生組換えクローンであり； Ｃ１＋は大腸菌症に冒されたニワトリから単離されなＥ
、ｃｏｌｉ株である。

（ｂ）抗Ｆ１１血清を用いた全細菌のＥＬＩＳＡ；バッ
クグラウンド値の少なくとも２倍のへ５４０値を有する
最高血清希釈度として定義したｌｏｌｏｇ力価。

（ｃ）抗Ｆ１１血清を用いた粗フィムブリエ調製物のウ
ェスタンブロッティング（ｕ＋ｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
ＬｉＢ）。

（ｄ）ヒト赤血球を用いたマンノース耐性血球凝集反応
。

（ｅ）Ｇａｌａｌ→４Ｇａｌβで被覆しであるラテック
ス粒子の凝集。

記号の意味 ｍ：上記テストにおいては反応無しを表し、十から＋＋
＋＋：上記テストにおける反応の程度の大きさを表す。

本発明のワクチンは、Ｆｉｔフィムブリエと一緒に若し
くはＦ１１フィムブリエの代わりにＦ１１フィムブリエ
の免疫原性セクションを含有することもできる。前記免
疫原性セクションとは、例えば１８ｋＤサブユニツト又
はそのサブユニットの集合体若しくはフラグメント、或
いはＦ１１フィムブリエ又はその集合体若しくはフラグ
メントに特徴的なアトへシンであると理解してよい。上
記１８ｋＤサブユニツトのフラグメント又は前記型のＦ
１１アトへシンは、家禽においてＦ１１型のＥ、ｃｏｌ
ｉに対する感染防御抗体を刺激することができる１個以
上のエピトープを含有するポリペプチドであり得る。

１８ｋＤサブユニツト又はＦ１１アトへシンの適当なポ
リペプチドフラグメントは、例えば公知の方法によって
見い出だすことができる。このような方法は、Ｔ、Ｐ、
Ｈｏｐｐ及びに、Ｒ，Ｗｏｏｄｓ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏ
ｎ　ｏｒｐｒｏｔｅｉｎ　　ａｎＬｉｇｅｎｉｃ　　ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　　ｆｒｏｍ　　ａｍｉｎ。

ａｃｉｄ　　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ；Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、八ｃａｄ、ｓｃｉ、η８，３８２４−３８２８．１９
８１）によって記述されており、該方法はアミノ酸鎖の
連続するセグメントの平均親水性を測定することによる
ものである。この測定の結果を第２図に示す。この図に
は公知のアミノ酸配列を基にしたＦ１１サブユニットの
親水性の分布を表しである。ここに図示した分布はアミ
ノ酸７個毎にその７個の親水性の重み付き平均値を順次
プロットしたものである。最も強い親水性を有する領域
は、恐らく抗原決定基を構成する領域であると考えられ
る。第２図ではこれらの領域を黒く塗って示してあり、
それらはアミノ酸セグメン１−二２４−３３　　　１ｉ
ｅ−Ｓｅｒ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−八Ｉａ−＾５ｐ
−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−１ｅ ４５−５７　　＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅ
ｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｎｅｔ−Δ５ｐ−Ｌｅｕ−＾５ｐ
１１ｅ−Ｇｌｕ ６７−７８　　　　Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ａｌａ−＾１ａ−Ｌｙｓ−八５ｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ｇｌｎ ８７−９５　　　　Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−へＩａ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−へＩａ−Ｔｈｒ１２３−１３
０　　Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Δ５ｐ−Ｇ　１ｙ−Ａ
ｓｐ−八５ｎ−Ｖａ１１３６−１４２　Ｌｅｕ−Ｖａｔ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Δｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙに対応する
。

Ｆ１１フィムブリエの１８ｋＤサブユニツトの抗原決定
基も上記領域内に位置することが予測される。

１、ｖａｎ　ＤｉｅＪ、１１ｏｅｋｓｔｒａ及び）１．
Ｂｅｒｇｍａｎｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　。

ｒ’ａＬｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　３，１４９−１５４；１
９８７）によってＦ１１フィムブリエに対しても同じモ
デルを使用して同様の結論が出された。

１８ｋＤサブユニット若しくはＦｉｔアトへシンの適当
な免疫化学的活性ポリペプチドフラグメントも同様に、
特許用ｊ７ＪｉＷ０８４１０３５０Ｂ明細書に記述され
た所謂ペップ−スキャン法（ｐｅｐ−ｓｃａｎ　ｍｅｔ
ｈｏｄ）によって見つけることができる。前記ペップ−
スキャン法では、当該タンパク質の部分配列に対応する
一部重なり合った一連のポリペプチドを合成し、抗体を
用いてそれらの反応性を調査する。

免疫原性を高めるために、このようなポリペプチドフラ
グメントを必要によってはキャリヤ（担体）に連結して
もよい。

Ｆｌｌフィムブリエ若しくはその免疫原性セクションは
、Ｆｉｔ型の野生Ｅ、ｃｏｌｉ株若しくはその誘導体か
らフィムブリエを公知の方法で分離し、必要によ、では
その免疫原性セクションを単離することによって調製す
るこができる。

Ｆ１１フィムブリエ若しくはその免疫原性セクションは
、Ｆ１１フィムブリエ若しくはその免疫原性セクション
の産生及び必要によっては分泌をコードする遺伝物質を
含有する組換えＤＮ八を用いて形質転換された細胞から
出発して産生ずることもできる。

更に、特にポリペプチドフラグメントがより小さい場合
には、例えば固相を使用するＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法に
よって完全なる合成によって調製することも可能である
。

本発明のワクチンは、Ｆ１１フィムブリエ若しくはその
免疫原性セクションの産生及び／又は分泌をコードする
遺伝物質を含む有機体を含有することもできる。

これは非病原性の有機体であれば好ましい。

上記有機体は生来前記抗原物質を産生じたり、所望の抗
原物質をコードする組換えポリペプチドを有することが
できる。

このような組換え有機体としてはとりわけライスル若し
くは細菌を使用することができる。前記組換え有機体は
所望の抗原物質を産生することができるし、必要であれ
ばそれを分泌することができる。

本発明のワクチンは、非経口投与、例えば皮下若しくは
筋肉的投与するのが好ましい。この方法でワクチンは、
ワクチンを投与された鳥類の能動免疫感作のため及び妊
烏に投与してその生まれて来る雛の受動免疫感作のため
に投与することができる。免疫感作された妊鳥において
は、その個体内に作られた抗体が当然卵黄中に入り、従
って卿化した記にも抗体がある。

本発明のワクチンは経口若しくは鼻孔を通しても、又は
エーロゾルを吸収させることによっても投与することが
できるが、この場合にはワクチンは、Ｆ１１フィムブリ
エ若しくはその免疫原性セクションの産生及び分泌をコ
ードする遺伝物質を含む非病原性有機体の生体を含有す
るのが好ましい。

本発明のワクチンは、まず、タンパク質若しくはタンパ
ク質から誘導されるポリペプチドを準備するか、或いは
Ｆ１１フィムブリエ又は上記Ｆ１１フィムブリエ、タン
パク質若しくはポリペプチドを含有する有機体の製造に
よって調製することができる。

フィムブリエをＥ、ｃｏｌｉから得る後者の場合が最も
好ましい態様である６通常、Ｆ１１フィムブリエを有す
るＥ、ｃｏｌｉを培養した後に、例えば機械的にかき取
り（剪断）及び／又は加熱し、（遠心分離及び／又は（
限外）濾過によって）細胞を除去することによってＭｉ
菌からＦ１１フィムブリエを分離し、続いて、限外濾過
、カラムクロマトグラフィー又は（硫酸アンモニウム若
しくはその他の塩を使用するか又はｐｉをフィムブリエ
の等電点に変えることによる）特定の沈澱法によって培
地及び／又は細菌の膜に由来する夾雑物を除去してフィ
ムブリエを更に精製することができる。

非経口的なワクチン投与のためには、活性成分は通常、
活性を高めたり保存期間を延長するために、塩、ホルマ
リン、ｐｉｆ緩衝液、乳化剤及び免疫応答を向−ヒさせ
るための補助剤（アジュバント）といったその他の成分
と混合しであることが多い水溶液若しくは懸濁液中に含
有される。適当な補助剤としては、例えば鉱油、ムラミ
ルジペプチド（ｍｕｒａｍｙｌ　ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）
　、水酸化アルミニウム、サポニン、ポリ、アニオン及
び両親媒性物質を挙げることができる。

ワクチンの組成及びワクチン投与系は、防御するべき鳥
の種類、烏の年齢及び体重、所望する防御の期間、投与
方法、並びに能動免疫感作及び行先移行の受動免疫感作
のいずれを所望かに従って変えることができる。ワクチ
ン中の活性成分の有効量は、非経口のワクチン投与では
１回の投与当たり約１０〜１００■である。

Ｆ１１フィムブリエを有するＥ、ｃｏｌｉに対する上記
能動免疫感作は主に健康な烏における予防措置として使
用される。Ｆ１１フィムブリエを有するＥ、ｃｏｌｉに
既に感染してしまった烏を、Ｆ１１フィムブリエに又は
そのセクション若しくは集合体に対する抗体を用いて処
置できることは言うまでもない。

フィムブリエを精製するために、３種類の野生Ｅ、ｃｏ
ｌｉ株を３７℃の血液寒天ベース（Ｏｘｏｉｄ”’）プ
レー　＋−上で一晩培養した。このためには、大腸菌症
に冒されたニワトリの心臓から単離したＣ！１２（０７
８：に８０：１１４）、ＣＨ４（０２：Ｋｌ：Ｉト）及
びＣＨ６（Ｏｌ：Ｋｌ：Ｈ−）Ｅ、ｃｏｌｉ株を使用し
た。Ｆ１１フィムブリエクローン八８へ７２７−ｐｌ’
Ｉｌ、２９１−１５（ｄｅ　　Ｒｅｅ　　ｅｔ　　ａｌ
、、１９８５）も　、　ＢｉｏｓｔａｔＣＲ１発酵器（
１３ｒａｕｎ）内に入れた５０ｐｙ／ｍ１アンピシリン
を含有する°’［！ｒａｉｎ　ｌ１ｅａｒｔ　Ｉｎｆｕ
ｓｉｏｎ”ブイヨン中で、一定温度３７℃、ｐＨ７，４
及び酸素飽和的４０％として１６時間培養した。

ｐＨ７，５の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｔＩ街液中で
純液中採取しな。

氷上に置いた５ｏｒｖａｌ　Ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ中で１
分間ずつ、合計１５回連続的に細菌を処理するか、又は
細菌を６５℃で１５分間加熱するか、又は前記２種類の
処理を組み合わせて細菌を処理するかのいずれかによっ
て細菌からフィムブリエを遊離した。

次いで細菌を遠心分離及び濾過によって除去し、粗フィ
ムブリエ溶液をｆ４縮し、ＹＭ１００フィルタを備えた
へｍ１ｃｏｎセル中でフィムブリエをよく洗浄した。

続いて例えばＫｏｒｈｏｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、によって
記述された方法（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、２７，５
６８−５７５．１９８０＞を幾らか変更した方法によっ
てフィムブリエを精製した。

即ち、硫酸アンモニウムを用いてフィムブリエを沈澱さ
せ、デオキシコール酸ナトリウムを用いて沈澱物を溶解
し、更にスクロース勾配中で遠心分離した。

このように精製されたフィムブリエ調製物は、（Ｖａｎ
　ｄｅｎ　Ｂｏｓｃｂ、Ｊ、Ｆ、　ｅＬ　ａｌ、によっ
てＩｎｆｅｃｔ。

ｒｍｍｕｎ　、剣、２２６−２３３．１９８０に記述さ
れたように）電子顕微鏡で見ると同一のフィムブリエ構
造を示した。

全てのフィムブリエ調製物は、（Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒｇ
　、　Ｂ　。

ｅｔ　ａｌ、によってＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、５８，２５
４−２５８．１９７５に記述されているような）ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで１８ｋＤに単一のバンドを示し、また種々
のフィムブリエに対して生成した全ての抗血清を用いた
（Ｍｕ１１ｅｒｍａｎ、Ｈ，Ｇ、ｅｔａｔ、によってＡ
ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、１２０．４８−５１．１９
８２に記述されているような）ウェスタンブロッティン
グにおいて同様の反応を示した。

去１ｕ汁ス Δ１本発明のフィムブリエを含有するワクチンを、乳化
剤としてポリソルベート８０及びソルビタンモノオレー
トを用いて鉱油（低粘度パラフィン）をベースにした油
中水型エマルジョンとして調製した。

Ｂ、ＣＨ４（０２：Ｋｌ：Ｈ−）野生Ｅ、ｃｏｌｉ株か
ら精製したＦ１１フィムブリエ５０ｐｙ／ｍ１を含有す
るワクチンを実施例２＾と同様に調製した。

Ｃ，クローン＾旧７２７−ｐＰＩＬ２９１−１５から精
製したＦ１１フィムブリエ５０ｐｙ／ｍｆを含有するワ
クチンを実施例２＾と同様に調製した。このクローンの
サンプルは１９８７年１０月１９日イ寸でパリのｔｈｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ
ｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ
に番号１−７０９で寄託した。

実施例３ 服隨免互ｊ１ 能動免疫感作実験のために、ワクチンを実施例２と同様
に調製し、調査対象の烏に筋肉内注射し、特異的な抗フ
ィムブリエ血清抗体力価の出現及び上昇をＥＬＩＳ＾に
よって測定した。

Δ玉ｌ錫 ＥＬＩＳへのために、０．０４Ｍ　ＰＢＳ（ｐＨ７，２
）　１　ｍｌ当たりフィムブリエ２．５１ｇを含有する
実施例１と同様に調製した精製フィムブリエ溶液１００
μｌをＰＶＣマイクロタイタープレートの各ウェルに入
れ、室温で一晩インキュベー１−　した。

次いで、各ウェルに５％ｌｌ５ＡのＰＢＳ溶液２００１
Ｊ１を入れてプレートを３７℃で２０分間インキュベー
トし、それらを水で洗浄し、空気中で乾燥させた。１５
１ＴＩ液（ｐｔ１７．４、０．２Ｍ　　Ｎａ２ＨＰＯ＜
、　０．２Ｍ　　ＮａＣｌ、　０．１％ＢＳ八及び０．
０５＄Ｔｕ＋ｅｅｎ８０）中に血清を順次希釈した液１
００．１を各ウェルに入れて３７℃で１時間インキュベ
ートすることによって抗フィムブリエ血清を調査した。

洗浄後、希釈抱合体（ウサギ抗ニワトリＩｇＧ／ＰＯ（
ｌｌ＋Ｌ）　、Ｎｏｒｄｉｃ）１００ｐ１をプレートの
各ウェルに入れて３０分間インキュベートし、それを再
び洗浄した。

ＤＭＳＯ溶液０．２ｎ＋１を含有する）酵素基質溶液１
００ｕ１を各ウェルに加えることによって比色分析を行
なって抗体の活性を測定した。

暗室内で酵素反応を実施し、１０分後にウェル毎に４Ｎ
Ｉｌ□Ｓｏ、　５０μｐを加えることによって反応を停
止させ、旧ｃｒｏｅｌｉｓａＬＲ’読取り機（Ｏｒｇａ
ｎｏｎＴｅｋｎｉｋａ）において４５０ｎｍでの吸収（
＾４５ｏ）を測定した。

第一の血清希釈度は１：５０であった。

ワクチン投与前に得た血清を１：５０に希釈して少なく
とも８個のウェルに入れることによって、各プレートに
おけるバックグラウンド値を測定した。

へ４５ｏバックグラウンドの平均値の少なくとも１．１
５倍のΔ、５ｏを生じた最大血清希釈度を抗体力価と定
義した。

Ｂ、ＳＰＦブロイラーのワ　　ン１ 生後６週間のＳＰＦブロイラー（Ｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄ
ｓｄｉｅｎｓｔｖｏｏｒ　Ｐｌｕｉｍｖｅｅ（Ｐｏｕｌ
ｔｒｙ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｅｒｖｉｃｅ）、Ｄｏｏｒｎ
。

オランダ）に、実施例２Ｂと同様に調製したワクチン１
ｎ＋１を筋肉内注射した。４週間後、同じワクチンを使
用して二次免疫注射を与えた。その結果を表３に示す。

及ユ ＊二次免疫注射 Ｃ，ブロイラー生殖雌ニワトリへのワクチン投与各々が
生後２０週間のブロイラー生殖雌ニワトリ（ｂｒｅｅｄ
ｉＢ　ｈｅｎ）　８羽からなる２群の雌ニワトリ（Ｅｕ
ｒｉｂｒｉｄ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダ）にそれぞれ
実施例２Ｂ及び２Ｃで調製したワクチン１ｍｌを筋肉的
注射した。

最初の注射から６週間後にそれぞれ同じワクチンを使用
して二次免疫注射を与えた。

表４から明らかなように、ブロイラー生殖雌ニワトリの
血清中には抗体が大量に産生され、抗体が卵黄及び群化
した雛の血清に移行したことが分かる。

表Ａ １）最初の注射から１０週間後に採取した血清サンプル
、 ２）最初の注射から１１週間後に採取した８個の卵の平
均、 ３）最初の注射から１２週間後に採取した卵から零化し
た生後１週間の５羽のニワトリの平均。

ＣＨ２株のＦ１１フィムブリエを用いたワクチン投与と
クローンΔ８１７２７−ｐＰＩＬ２９１−１５のＦ１１
フィムブリエを用いたワクチン投与とで同一の結果が得
られた。

ＥＬＩＳ＾においては２種類の調製物間に完全な交差反
応が見られた。

：Δ新１ ブロイラー生殖雌ニワトりに、クローン八８１７２７−
ｐｌ’ＴＬ２９１−１５から精製したＦｉｔフィムブリ
エをワクチン投与した（実施例３Ｃ参照）。

上記ワクチンを投与した生殖雌ニワトリ及びワクチンを
投与しないコントロール雌ニワｌ−りから零化したブロ
イラー雛に、生後３週間のとき胸部菌株は全て、大腸菌
症に感染したニワトリの心臓から単離し、ＰＢＳ中に適
当な濃度に懸濁させて血液寒天ベースプレー１”　（Ｏ
ｘｏｉｄ″″’）上で一晩培養したものである。ブロイ
ラー雛は飼料及び水を任意に与えて減圧された隔離室内
に収容した。

表５から分かるように、ワクチンを投与した生殖雌ニワ
トリから零化したブロイラー雛へは優れた感染防御が移
行した。ワクチンを投与しないコントロールニワトリと
比較すると、全体では、Ｆ１１フィムブリエを用いたワ
クチン投与による感染防御の効能は８５％であった。

られなことは驚くべきことである。この株は実際にはフ
ィムブリエをｉｎ　ｖｉｖｏ発現するが、そのｉｎν１
ｔｒｏ発現が使用した検出方法の限界以下であった回部
性がある。

表５ １）各血清型の株についてＦｉ１発現能及び細菌投与量
を示しである、 ２）細菌投与後７日以内に死んだニワトリ数／全供試動
物数、 ３）χ−平方テスト：Ｐ＜０．０００１゜ウサギに精製
Ｆ１１フィムブリエを接種することによって抗血清を調
製し、次いで５６℃で３０分間不活１ヒした。

この未希釈のＦｉｔ抗血抗血清１全ｆ後３週間のブロイ
ラー（Ｅｕｒｉｂｒｉｄ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダ）
に静脈注射した。

抗血清を静脈注射してから１時間以内に、ニワ１〜りの
胸部右後方の気嚢に細菌懸濁液０．２ｍｊ！を注射して
感染させた。コントロールとして、抗血清を投与してい
ない雛も同量の細菌に感染させた。

使用した細菌株は全て、大腸菌症に感染したニワトりの
心臓から単離し、ＰＯＳ中に適当な濃度に懸濁させて血
液寒天ベースプレー１□　（Ｏｘｏｉｄ”’）上で一晩
培養したものである。

ニワトリは飼料及び水を任意に与えて減圧された隔離室
内に収容した。

上記実験から、Ｆ１１フィムブリエ抗血清が、感染に使
用した６種類のＥ、ｃｏｌｉ株の内の５種類に対して優
れた防御をブロイラーに与えたことが明らかであった（
表６）。Ｃ）１６株はＦ１１フィムブリエを生産するけ
れども、この株による感染に対する防御はかなり低かっ
た。恐らくこの株はＦ１１フィムブリエに加えて１種以
上の強力なビルレンス因子も生産するが、抗体レベルが
この細菌株に対する防御を与えるには低すぎた可能性が
ある。

驚くべき特徴は、Ｆ１１フィムブリエ自体を生産するよ
うには見えないＣＲ２株を用いてさえも感染に対してか
なりの防御が見られたことである。恐らくこの株は実際
にＦ１１フィムブリエをｉｎ　ｖｉｖｏ生産するが、そ
のＦ１１フィムブリエのｉｎ　ｖｉｔｒｏ生産が使用し
た検出方法に対して少なすぎたのであろう。

表遼 本χ−平方テスト

【図面の簡単な説明】

第１図はＦ１１フィムブリエのサブユニットのアミノ酸
配列を示す図、第２図はＦ１１サブユニットのアミノ酸
７個毎のセグメントの平均親水性の測定値をプロットし
たグラフである。 連　アクｊ′・エヌ・り土− 代理人　ブ「層中　ｆｉ１台　　山　　　　武り註ｏａ
ｒｚユ ’　　　ａ’　　　　　　　　　ｅ　　　　　　　５ｕ
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　　　　　ｅ　　　ｓ　　　Ｇ道広！ッよＶａｌ　Ａｓ
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ｒ工１ａ　Ａｓｐ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎし川ｓｅｒ
　Ｌｙｓ　ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＡｌａＧ
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ｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｖａｌ　
Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐ
ｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｌ
ａＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
ＧｌｙＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　工１
ｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ】０６

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）敗血症から家禽を防御す
   るためのワクチンであって、Ｆ１１型のフィムブリエ若
   しくはその免疫原性セクション、又は前記フィムブリエ
   若しくはその免疫原性セクションの産生若しくは必要に
   よっては分泌をコードする遺伝物質を含む有機体を含有
   することを特徴とするワクチン。
2. （２）前記ワクチンが、前記免疫原性セクションとして
   、Ｆ１１フィムブリエサブユニットタンパク質のアミノ
   酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を有する免疫原性
   ポリペプチドを含有することを特徴とする請求項１に記
   載のワクチン。
3. （３）前記ワクチンが補助剤も含有することを特徴とす
   る請求項１又は２に記載のワクチン。
4. （４）Ｅ．ｃｏｌｉ敗血症から家禽を防御するための組
   成物であって、Ｆ１１型のフィムブリエ又はそのセクシ
   ョン若しくは集合体に対する抗体を含有することを特徴
   とする組成物。
5. （５）請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン又
   は請求項４に記載の組成物を投与することを特徴とする
   、Ｅ．ｃｏｌｉ敗血症から家禽を防御する方法。
6. （６）Ｅ．ｃｏｌｉ敗血症から家禽を防御するのに有効
   なワクチンを生産するための、Ｆ１１型のフィムブリエ
   若しくはその免疫原性セクションの使用、又は前記フィ
   ムブリエ若しくはその免疫原性セクションの産生及び必
   要によっては分泌をコードする遺伝物質を含む有機体の
   使用。