ES2303616T3 - Reactivos para el diagnostico y la terapia de alergia al latex, y metodo para prepararlos. - Google Patents

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Abstract

Un método para producir una composición que contiene sustancialmente todas las proteínas del látex del caucho natural (NRL) de unión de IgE humana natural, que comprende las etapas de : (a)preparar una o más fracciones de proteínas de NRL o uno de sus extractos mediante precipitación fraccionada, y (b)someter a separación cromatográfica la fracción o fracciones de proteínas obtenida(s) en la etapa (a).

Description

Reactivos para el diagnóstico y la terapia de alergia al látex, y método para prepararlos.
La presente invención se refiere a reactivos para el diagnóstico y/o el tratamiento terapéutico de alergia al látex o alergia a frutas y a un método para preparar los reactivos.
La alergia de tipo I al látex del caucho natural (NRL) ha surgido durante las dos últimas décadas del sigo 20 como un problema sanitario de consecuencias de mucho alcance para los pacientes, tomando en consideración tanto su situación ocupacional como su seguridad en el cuidado médico. La "sensibilización" o "sensibilidad" al látex se define como la presencia de anticuerpos específicos de IgE a alergenos del látex en el suero de un individuo. La "alergia" al látex describe la provocación de síntomas alérgicos de tipo inmediato por contacto con látex o productos de látex en un individuo sensibilizado.
La mayor parte del caucho natural del mundo se obtiene desde el látex del árbol del caucho Hevea brasiliensis. La composición del látex del caucho natural es bastante compleja y contiene una diversidad de sustancias tales como agua, caucho (cis-1,4-poliisopreno), proteínas, resinas, azúcares, ceniza y glicósidos de esteroles. Para los productos comerciales de caucho, el látex tal como se obtiene se mezcla con amoniaco hasta una concentración final de 200 mmol/l para evitar su coagulación, denominándose entonces látex amoniacado (AL). Por otra parte la centrifugación a alta velocidad de látex sin tratar con amoniaco (NAL) origina tres fracciones diferentes: (i) una capa de partículas de caucho de color blanco cremoso en la parte superior, (ii) una fracción en el fondo (suero B) que consiste principalmente en los lutoides semejantes a vacuolas, y (iii) un suero C, amarillento, entre ellas que contiene el citosol procedente de las células de los vasos laticíferos.
La primera etapa para el diagnóstico de las alergias de tipo I al NRL consiste en registrar una historia clínica extensa de síntomas alérgicos al NRL. En una segunda etapa, se llevan a cabo ensayos confirmatorios necesarios para identificar el estado de sensibilización. Los ensayos confirmatorios más comúnmente utilizados son el ensayo de pinchazo en la piel (skin prick test) (SPT) y el ensayo del suero para detectar anticuerpos de IgE específicos del látex. Extractos del ensayo SPT estandarizados y mezclas de alergenos bien caracterizadas para la determinación de IgE, son, por tanto, requisitos preliminares importantes para diagnosticar una alergia a látex.
La detección en la piel de anticuerpos de IgE específicos de alergenos es un método interesante, debido a que es rápido, sensible, y a que lleva consigo una respuesta observable clínicamente e importante desde el punto de vista biológico, en la piel o el individuo. En 1995 y 1996 los ensayos de pinchazo en la piel fueron realizados con el reactivo de látex Bencard, que estaba basado en un AL sin procesar producido en Canadá. Los investigadores describieron un predominio del 4,2% de respuestas positivas al ensayo de la piel con látex entre pacientes hospitalizados en una práctica de asma y alergia^{1} y una asociación positiva entre la magnitud de la respuesta del ensayo SPT y la gravedad de los síntomas inducidos por látex^{2}. En un estudio cínico inicial de fase I/II se determinó la seguridad relativa y la exactitud del diagnóstico de tres materiales candidatos como origen de látex - AL, NAL y extractos de guantes de látex pulverizados-. Como resultado de ello, se describió que el NAL era el látex más interesante como candidato para el desarrollo posterior debido a su estabilidad y facilidad de control de calidad^{3}. Ebo et al. (J. Allergy Clin. Immunol. 1997 Nov; 100(5):618.-3) llevaron a cabo un estudio comparativo de métodos de detección de anticuerpos de IgE incluyendo el ensayo SPT. Estos investigadores usaron un extracto de NAL (Diagnostic Products Corp) que puso de manifiesto una sensibilidad de 68% y una especificidad de 100%. En un estudio Finish se examinó el comportamiento en el diagnóstico de un reactivo del ensayo SPT basado en suero C de látex de NAL procedente de Stallergènes (Fresnes, Francia)^{4}. Se indicó una sensibilidad de diagnóstico del 93% y una especificidad del 100%. Este es el único extracto de látex de caucho natural comercial estandarizado de que se dispone actualmente en Europa. Se llevó a cabo un estudio clínico de fase III en varios centros con el reactivo Investigational de Greer (Greer Laboratories, Lenoir, Nc), con un extracto a base de NAL^{5}. En este estudio la sensibilidad del diagnóstico fue 95% y la especificidad 100%. Un nuevo análisis de los resultados obtenidos cambió la sensibilidad global del reactivo para el ensayo SPT de NAL de Greer a 70%-75%^{6}.
Además, un extracto adicional para el ensayo SPT puede adquirirse de ALK-Abello (Hörsholm, Dinamarca) que está basado en suero C de látex de NAL de que se dispone. Además de los productos de que se dispone en el comercio, los especialistas en alergias que desean llevar a acabo ensayos de diagnóstico en la piel pueden preparar sus propios extractos de látex domésticos a partir de guantes, en especial en el caso de que en los países respectivos, por ejemplo, en EE.UU., no exista reactivo estandarizado para el ensayo de látex en la piel, autorizado por la correspondiente organización de aprobación de medicamentos (por ejemplo, la FDA).
Las técnicas más frecuentes para la medida in vitro de IgE específica de látex natural de un suero, son el ensayo radioalergoabsorbente (RAST) y el ensayo inmunoabsorbente con enzimas ligadas (ELISA). Varios ensayos radioalergoabsorbentes están disponibles en el comercio. Tres ensayos in vitro (DPC Microplate Alastat, sistema CAP de Pharmacia FEIA e Hycor HYTECH) fueron comparados para la detección de anticuerpo de IgE específico del látex del caucho natural^{7} El sistema CAP de Pharmacia y el Alastat de DOC pusieron de manifiesto una especificidad de diagnóstico de 97% y una sensibilidad de diagnóstico de 76 ó 73%, respectivamente, cuando se compararon con el ensayo de látex en la piel con el reactivo de látex experimental de Greer. Ambos ensayos clasificaron erróneamente, aproximadamente, el 25% de casos sensibilizados con al látex, como falsos negativos para anticuerpos de IgE específicos de látex. En un estudio separado de comportamiento, la sensibilidad del diagnóstico y la especificidad puestas de manifiesto por ambos ensayos eran equivalentes a las obtenidas en el estudio anteriormente citado^{8}. El ensayo de HYTECH en el primer estudio manifestó una especificidad de 73%, lo que indica que produjo 27% de resultados falsos positivos cuando se comparó con el ensayo de la piel^{7}. Se ha especulado que las razones de la baja sensibilidad de diagnóstico de los ensayos CAP y AlaSTAT puede estar relacionada con alergenos pobremente representados y/o desnaturalizados en los reactivos que contienen el alergeno que se usan en estos ensayos ^{6}. Se llegó a la conclusión de que la exactitud y la fiabilidad de los ensayos empleando reactivos que derivan de látex de caucho natural total, dependen
de la disponibilidad de los alergenos y de su presencia en excesos molares en relación con el anticuerpo de IgE.
El kit de RAST más ampliamente usado es, probablemente, el RAST k82 de látex producido por Pharmacia Diagnostics y su sistema inmunoabsorbente con enzimas ligadas (sistema CAP de Pharmacia). Otro nuevo RAST de látex procedente de Pharmacia Diagnostics está basado en el k82 pero está reforzado con una molécula recombinante de Hev b 5 (rHev b 5). Adicionalmente, se encuentran disponibles RASTs basados en alergenos recombinantes de látex. Los Hev b 1, 2, 3, 6.01, 6.02, 8, 9 y 11, se encuentran disponibles como proteínas de fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP), rHev b 5 sin MBP.
En el 2000, Yip et al., pusieron de manifiesto que alergenos recombinantes de látex clínicamente reactivos, pueden ser producidos de modo estandarizado y que podrían proporcionar, potencialmente, reactivos sensibles y específicos para el diagnóstico de alergias por látex^{9}. No obstante, la capacidad de diagnóstico de una proteína recombinante depende de la equivalencia respecto a la proteína natural. Ensayos SPT con Hev b 2 natural pusieron de manifiesto que este alergeno es uno de los principales alergenos del látex^{10}. Raulf Heimsoth et al, han descrito una mala correlación entre la reactividad de IgE de la molécula rHev b 2 y Hev b 2 natural^{11}. Estos investigadores observaron casi ninguna reactividad de la IgE para su rHev b 2. Esta observación puede ser debida al plegamiento erróneo del producto de E. coli o a restos de hidratos de carbono de Hev b 2 que representan epítopos de unión de IgE^{12} y que no están presentes en la proteína recombinante expresada en E. coli.
La solicitud de patente europea EP 0 704 457, describe la purificación de solamente tres alergenos individuales de látex designados Hev b II, III y IV. Los tres alergenos descritos con más detalle representan solo una parte muy pequeña de los numerosos alergenos del látex y en particular, no incluyen ni siquiera los alergenos de látex más importantes actualmente señalados, por ejemplo el Hev b 5.
La solicitud de patente internacional WO 01/61305 describe el uso de anticuerpos monoclonales y policlonales que están dirigidos contra solamente cuatro alergenos recombinantes de látex, a saber, Hev b 1, 3, 5, 6.02, y su uso en métodos inmunológicos.
La publicación de Wagner et al., en Eur. J. Biochem. 267 (2000), páginas 7006-7014, describe un método que había sido desarrollado con objeto de purificar un único alergeno, a saber el Hev b 9.
Además, la publicación de Hufnagel et al., Clin. Exp. Immunol. 133 (2003), páginas 170-176. describe un modelo en ratón de alergia al látex usando dos alergenos principales del látex para HCWs (operarios de cuidado de la salud) y pacientes de espina bífida (SB), el Hev b 1 y el Hev b 3, para sensibilización.
Hasta la fecha, trece alergenos de látex han sido reconocidos por la Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas. Se ha descrito que el látex de caucho Natural procedente del árbol Hevea brasiliensis contiene más de 250 polipéptidos, 60 de los cuales, por lo menos, demuestran propiedades de unión de IgE^{13}. Por tanto, el diagnóstico de alergia al látex con los 13 alergenos recombinantes o purificados, parece no ser suficiente. Adicionalmente, algunos de los alergenos principales del látex se originan a partir del suero B. Sin embargo, la totalidad de los extractos de látex de que se dispone en el comercio derivados de NAL han sido derivados, exclusivamente, desde el suero C de látex.
El látex tal como se obtiene contiene, aproximadamente, 1-2 proteínas y puede ser separado por centrifugación con alta velocidad en tres fracciones principales: (i) una capa superior blanca de partículas de caucho; (ii) una capa acuosa (suero C) que contiene el citoplasma de las células de los vasos laticíferos; y (iii) la fracción del fondo (suero B), que consiste principalmente en los lutoides parecidos a vacuolas.
Además, una comparación de procedimientos de ensayo de que se dispone en el comercio para alergias de látex, reveló una variación grande de los resultados y ninguno de los métodos sometidos a evaluación pudo ser correlacionado con los síntomas indicados de alergia de tipo I al látex.^{18}. Una desventaja importante de los ensayos de que se dispone actualmente es que hasta la fecha son necesarios varios métodos in vitro para detectar sensibilización de IgE al látex.^{19}.
Por consiguiente, un problema técnico esencial en la presente invención es proporcionar reactivos mejorados para el diagnóstico y el tratamiento terapéutico de alergias a látex y afines.
La solución al problema técnico anterior está proporcionada por las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
En particular, la presente invención proporciona un método para producir una composición que contiene sustancialmente todas las proteínas del látex del caucho natural (NRL) de unión de IgE humana natural, que comprende la etapa de preparar una o más fracciones de proteínas de NRL o uno o más de sus extractos, mediante precipitación fraccionada y/o separación cromatográfica.
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El término "composición" al que se hace referencia en esta memoria, comprende, en general, una o más fracciones de proteínas derivadas de NRL (o uno de sus extractos o fracciones).
La expresión "látex del caucho natural" significa todo látex de caucho que puede obtenerse a partir de cualquier fuente natural. Se ha observado que en el látex sin refinar la cantidad de proteínas y la distribución de sus pesos moleculares varían considerablemente entre fuentes diferentes de la materia prima, lo que se atribuye a factores tales como el origen, condiciones de crecimiento y maduración (clima, estación, suelo)^{14,15}. No obstante, en el caso de que el NRL sea recogido desde un clon particular del árbol Hevea brasiliensis (por ejemplo, el clon RRIM 600 de Hevea brasiliensis del Rubber Research Institute of Malaysia), por medio de un procedimiento de preparación estandarizado, el contenido de proteínas y su especificidad, son uniformes y reproducibles^{16}. Por tanto, se prefiere que el NRL proceda de H. brasiliensis. Preferiblemente, el NRL es látex sin tratar con amoniaco (NAL).
La expresión "proteínas de látex del caucho natural de unión de IgE humana natural" significa todas las proteínas presentes en NRL que pueden actuar como alergeno en el ser humano y que contribuyen, por tanto, a la alergia al látex o, por lo menos, a sensibilización por el látex.
La expresión "extracto de NRL" comprende cualquier fracción o solución o suspensión o emulsión modificada derivada de NRL, en tanto que dicho extracto contenga la totalidad de los alergenos del látex natural, según la definición anterior.
Extractos de NRL particularmente preferidos, en particular el NAL, se obtienen por centrifugación, de preferencia centrifugación a alta velocidad, obteniendo las fracciones anteriormente descritas (i) capa de partículas de caucho de color blanco cremoso, (II) suero B (fondo) y (III) suero C entre (I) y (II). Para los fines de las presente invención los extractos preferidos de NAL son el suero B y el suero C.
En una realización de la presente invención, el fraccionamiento de diferentes lotes de NRL recogido mediante un procedimiento de preparación estandarizado, proporciona extractos de proteínas de composición muy parecida.
Por consiguiente, el método según la presente invención comprende las etapas de:
(a)
preparar mediante precipitación fraccionada una o más fracciones de proteínas de NRL o uno de sus extractos, y
(b)
someter a separación cromatográfica la(s) fracción(es) de proteínas obtenida(s) en la etapa (a).
La expresión "precipitación fraccionada" significa que pueden precipitarse proteínas causando perturbaciones en el disolvente en lo que respecta al pH, fuerza iónica, y temperatura. El precipitado es recuperado, preferiblemente, mediante etapas de centrifugación de uso común. Las propiedades del disolvente pueden modificarse también mediante la adición de concentraciones altas de ciertas sales o de disolventes orgánicos miscibles. Las sales en solución con fuerza iónica baja con relación con la de la solución salina isotónica. puede representar una perturbación que puede ocasionar el que ciertas proteínas precipiten desde la solución. Por otra parte, las sales presentes en concentraciones muy altas con fuerza iónica mucho mayor que la de los medios tisulares pueden ocasionar la precipitación de muchas proteínas. La precipitación tiene lugar por neutralización de cargas superficiales por la sal, por reducción de la actividad química de la proteína y por disminución de la concentración efectiva del agua. A esta proceso se denomina "precipitación de proteínas por sales". La concentración de una sal necesaria para ocasionar la precipitación de una proteína particular está relacionada con el número y distribución de cargas y de grupos polares no iónicos existentes sobre la superficie de la proteína, y con el número y distribución de restos hidrófobos expuestos y que se hacen dominantes a medida que las cargas van siendo neutralizadas. El tamaño y la forma de la proteína contribuyen también a la facilidad relativa de capacidad de precipitación. El sulfato amónico es el precipitante usado con la mayor frecuencia para la precipitación de proteínas por sales. Sus principales ventajas son (1), en saturación, es de una molaridad lo suficientemente alta para causar la precipitación de la mayoría de las proteínas; (2) no posee un calor de solución grande; (3) incluso su solución saturada tiene una densidad que no es tan grande como para interferir con la sedimentación de la mayor parte de las proteínas precipitadas por centrifugación; (4) sus soluciones concentradas evitan o limitan la mayoría del crecimiento bacteriano; y (5) en solución, protege de la desnaturalización a la mayor parte de las proteínas.
Por consiguiente, es parte de la presente invención que, en una primera etapa, las proteínas del suero C ó B del látex son fraccionadas mediante concentraciones diferentes de sulfato amónico.
En una realización preferida de la presente invención, las proteínas de las fracciones son separadas posteriormente mediante cromatografía de intercambio iónico como una segunda etapa.
Por tanto, el método de la presente invención comprende, preferiblemente, las etapas de:
(i)
preparar una o más fracciones de proteínas de suero C de NAL mediante precipitación fraccionada,
(ii)
someter a separación cromatográfica una o más de la(s) fracción(es) de proteínas obtenidas en la etapa (a), y
(iii)
someter a separación cromatográfica suero B de NAL.
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La separación cromatográfica puede incluir cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía hidrófoba y/o cromatografía de afinidad, usando preferiblemente inmunoglobulinas específicas de alergenos de látex.
La cromatografía de intercambio iónico (IEC) es la técnica cromatográfica preferida de la presente invención. La IEC está ideada específicamente para la separación de compuestos iónicos o ionizables. La IEC se diferencia de los otros tipos de cromatografía líquida en que la fase estacionaria transporta grupos funcionales ionizables, fijados mediante enlace químico a la fase estacionaria. Para satisfacer los requisitos de neutralidad eléctrica, estas cargas fijadas pueden llevar un ion contrario de signo opuesto. Este ion contrario no está fijado y puede ser desplazado. Dos acontecimientos separados están implicados en la IEC. El primero de ellos la unión de la proteína a las cargas fijadas y el segundo la elución o desplazamiento de la proteína desde las cargas fijadas mediante un nuevo ion contrario que posea una mayor afinidad que la proteína para las cargas fijadas. Preferiblemente, se usa la cromatografía de intercambio aniónico para la separación cromatográfica de extractos de NRL o sus fracciones de proteínas, por ejemplo, NAL, suero C ó B de NAL, o los precipitados obtenidos mediante precipitación fraccionada, preferiblemente precipitación por sales usando sulfato amónico, de NRL (por ejemplo NAL) o suero B ó C de NAL.
En una realización preferida se usan como medio iónico MonoBeads (Pharmacia, Uppsala, Suecia), basadas en resinas hidrófilas de poliestireno/divinilbenceno, configuradas en bolas de 10 \mum. Preferiblemente las Beads están sustituidas con grupos amino cuaternarios proporcionando el intercambiador aniónico fuerte, MonoQ. La estabilidad de la matriz de MonoBeads juntamente con procedimientos controlados de síntesis y de relleno de las columnas, asegura separaciones muy reproducibles tanto a lo largo del tiempo como de columna a columna.
Como es lógico son adecuadas también otras resinas cromatográficas, en particular resinas de intercambio iónico. Ejemplos de ellas incluyen Agarose, Sepharose, Sephadex, Sephacryl, Sephacel, etc.
Una realización preferida de la cromatografía de intercambio aniónico, por ejemplo sobre MonoQ, se lleva a cabo en el seno de una solución tampón de Tris-HCl 10 a 50 mM, de preferencia 15 a 30 mM, en particular 20 mM, de pH 5 a 7,8, de preferencia 7,3 a 7,8, en particular 7,5, con un gradiente lineal de elución con NaCl de 0 a 1 M. Por supuesto, es posible utilizar otras formas de gradientes (por ejemplo, gradientes escalonados) o una combinación de gradientes lineales y escalonados, otras soluciones tampón (por ejemplo, tampones de fosfatos) y sales de elución (por ejemplo, KCl).
Como ya se ha mencionado anteriormente, la precipitación fraccionada se lleva a cabo mediante cambio del pH y/o de la fuerza iónica del NRL, o de sus extractos, y/o por introducción en él de un agente desnaturalizante y/o de una sal. La adición de sales para la precipitación fraccionada es lo más preferido. Las sales adecuadas incluyen sulfato amónico, NaCl y/o Na_{2}SO_{4}. Alternativamente, pueden usarse disolventes orgánicos tales como etanol o acetona (en lugar de sales). En lo que se refiere a la discusión anterior de precipitación de proteínas, el sulfato amónico es la sal más preferida, útil en la presente invención.
Según otra realización preferida del método de la presente invención, la precipitación fraccionada se lleva a cabo:
(1)
añadiendo al NRL o uno de sus extractos, sulfato amónico hasta una concentración de 15 a 35%, preferiblemente 20 a 30%, más preferiblemente 22 a 28%, y en particular una saturación de 25%.
(2)
recuperando por centrifugación un primer precipitado y un primer sobrenadante,
(3)
añadiendo al primer sobrenadante sulfato amónica hasta una concentración de 40 a 60%, preferiblemente 45 a 55%, más preferiblemente 47 a 53%, y en particular una saturación de 50%.
(4)
recuperando por centrifugación un segundo precipitado y un segundo sobrenadante,
(5)
añadiendo ala segundo sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 65 a 85%, preferiblemente 70 a 80%, más preferiblemente 72 a 78%, y en particular una saturación de 75%, y
(6)
recuperando por centrifugación un tercer precipitado y un tercer sobrenadante.
El extracto de NRL preferido en este caso, es suero C de NAL. No obstante, la precipitación fraccionada anterior puede aplicarse a cualquier NRL (por ejemplo NAL) o cualquier otro extracto derivado de NRL.
Como una etapa final, la fracción de proteína diferente obtenida por precipitación fraccionada y/o cromatografía, puede combinarse, con objeto de dar lugar a una composición única que contenga todos los alergenos del látex en concentraciones suficientes para detectar IgE específica de los alergenos.
En particular, la composición o composiciones obtenidas mediante el método anteriormente definido, contienen la proteína alergénica del NRL en mayor concentración que el material original (el propio NRL o su(s) extracto(s) tales como el suero B ó el suero C del NAL).
\newpage
El método de la presente invención proporciona composiciones de proteínas que pueden ser usadas con éxito en el diagnóstico y/o el tratamiento terapéutico (o para la preparación de una composición de diagnóstico y/o farmacéutica (medicamento), preferiblemente de sensibilización o alergia al látex.
Por consiguiente, otra realización de la presente invención se refiere a una composición que contiene sustancialmente la totalidad de las proteínas del látex de caucho natural (NRL) de unión de IgE humana natural que pueden obtenerse mediante el método anteriormente definido.
La composición contiene, preferiblemente, fracciones de proteínas obtenidas:
(A)
preparando fracciones de proteínas de suero C de NAL por precipitación fraccionada,
(B)
sometiendo a cromatografía de intercambio aniónico las fracciones de proteínas obtenidas en la etapa (A), y
(C)
sometiendo a cromatografía de intercambio aniónico suero B de NAL.
A este respecto, esto es citado específicamente para las explicaciones y realizaciones preferidas anteriormente ilustradas con respecto al método de la presente invención.
Más preferido, la precipitación fraccionada comprende las etapas de:
(1)
añadir al suero C de NAL sulfato amónico hasta una concentración de 15 a 35%, preferiblemente 20 a 30%, más preferiblemente 22 a 28%, y en particular una saturación de 25%,
(2)
recuperar por centrifugación un primer precipitado y un primer sobrenadante,
(3)
añadir al primer sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 40 a 60%, preferiblemente 45 a 55%, más preferiblemente 47 a 53%, y en particular una saturación de 50%
(4)
recuperar por centrifugación un segundo precipitado y un segundo sobrenadante,
(5)
añadir al segundo sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 65 a 85%, preferiblemente 70 a 80%, más preferiblemente 72 a 78%, y en particular una saturación de 75%, y
(6)
recuperar por centrifugación un tercer precipitado y un tercer sobrenadante.
En otra realización preferida, la composición contiene las fracciones de proteínas siguientes (o la(s) composición(es) está / están representadas por las fracciones de proteínas siguientes).
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del segundo precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 120 a 230 mM, preferiblemente 140 a 210 mM, en particular 150 a 200 mM;
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del segundo precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 270 a 530 mM, preferiblemente 290 a 510 mM, en particular 300 a 500 mM;
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del tercer precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 270 a 480 mM, preferiblemente 290 a 460 mM, en particular 300 a 450 mM;
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del tercer precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 420 a 580 mM, preferiblemente 440 a 560 mM, en particular 450 a 550 mM;
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico de suero B de NAL, en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 120 a 280 mM, preferiblemente 140 a 260 mM, en particular 150 a 250 mM; y
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico de suero B del NAL en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye como el flujo a través de la columna sin adsorber.
Según otra realización de la presente invención la(s) composición(es) o fracción(es) de proteína está/están inmovilizada(s) sobre un soporte sólido proporcionando el correspondiente conjugado de soporte-proteína-.
Se prefiere que la composición este revestida sobre el soporte o acoplada al mismo en el conjugado de soporte-proteína de la presente invención. El soporte puede seleccionarse entre el grupo que consiste en bolas, membranas, varillas de nivel y esquirlas de vidrio. Los conjugados de la presente invención son especialmente útiles en aplicaciones de diagnóstico tales como la detección de alergia a látex o sensibilización por látex en los seres humanos.
Por consiguiente, la presente invención se refiere también a un kit de diagnóstico que comprende la composición y/o el conjugado definido anteriormente, en combinación con reactivos o medios comúnmente usados para la detección de anticuerpos de IgE humanos.
El kit de diagnóstico de la presente invención puede estar presente en todas las formas comúnmente conocidas para la detección de anticuerpos de IgE humanos. Como ejemplos se incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, ensayos in vivo tales como el Ensayo de Pinchazo de la Piel, SPT, que mide una reacción alérgica en la piel de los pacientes, a proteínas presentes en las fracciones, o ensayos in vitro tales como los ensayos ImmunoCAP, ensayos RAST, ELISA, varillas de nivel, liberación de histamina, etc., que miden la presencia de anticuerpos de IgE anti-proteína del látex en los sueros de los pacientes ensayados.
El kit de diagnóstico es especialmente útil para la detección de IgE específica de alergenos (látex) (en particular en los seres humanos).
Por consiguiente, la presente invención proporciona, además, un método de diagnóstico para detectar IgE específica de alergenos (látex) (por ejemplo, en seres humanos), que comprende la etapa de poner en contacto la composición y/o el conjugado de la presente invención, con un fluido corporal (por ejemplo, sangre o sus fracciones tales como suero sanguíneo). La puesta en contacto con un fluido corporal comprende también la inyección de la composición de la presente invención bajo la piel o en la piel, por ejemplo, mediante un ensayo de pinchazo de la piel (SPT). El método de diagnóstico según la presente invención puede llevarse a cabo también como un ensayo ImmunoCAP, un ensayo RAST, ELISA, etc.
Los reactivos proporcionados por el método de la invención, en particular la composición, son también útiles como medicamentos (o útiles para su preparación). Preferiblemente la composición de la invención puede ser usada para la prevención o tratamiento terapéutico de alergia al látex o el síndrome de látex-fruta (o para preparar un medicamento para las citadas indicaciones). El medicamento o composición farmacéutica pueden contener uno o más excipientes, vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables y usados comúnmente.
La presente invención se refiere también a un método para la prevención o el tratamiento terapéutico de las indicaciones anteriores, que comprende la etapa de administrar la composición o el medicamento de la presente invención a un paciente humano aquejado, en particular, de alergia o sensibilización por látex y/o alergia a las frutas. Los métodos de administración preferidos incluyen la inyección por la vía intramuscular o la aplicación a las mucosas tal como por vía sublingual. El método preventivo/terapéutico de la presente invención se realiza, preferiblemente, en la forma de un protocolo de hipersensibilización. El protocolo puede incluir la administración de concentraciones crecientes de extracto del alergeno durante un período de tiempo.
Una ventaja de la presente invención es que pueden realizarse diagnósticos extensos usando un número bastante bajo de fracciones de látex de Hevea. La presente solicitud de patente describe con detalle la preparación de estas fracciones. Por el contrario, los diagnósticos comerciales de alergia al látex se efectúan corrientemente usando extractos totales.
Las Figuras muestran:
Figura 1 muestra un ensayo SDS-PAGE de las cuatro fracciones obtenidas a partir de suero C de látex. Se usaron dos lotes diferentes de suero C de látex y se comparó el contenido de proteínas.
Figura 2 muestra la reactividad de IgE de 5 asociaciones de sueros, consistiendo cada uno de los 5 sueros de sujetos alérgicos a látex a) suero C de látex y las cuatro fracciones C de látex, y b) a suero C de látex y las dos fracciones B de látex. Fracciones transferidas a nitrocelulosa fueron incubadas con las asociaciones de sueros y se detectó la IgE unida con un anticuerpo anti-IgE humana marcado con ^{125}I (calles 1-5). Las calles P y N muestran el testigo de solución tampón y la asociación de sueros testigo. Están indicados marcadores de pesos moleculares.
Figura 3 demuestra la existencia de Hev b 5, Hev b 6, y Hev b 8 en los extractos de látex. rHev b 5, rHev b 6 y rHev b 8, transferidos a nitrocelulosa, fueron incubados con asociaciones de sueros cada una de las consistía en tres sueros de sujetos alérgicos al alergeno respectivo. La asociación de sueros para Hev b 5 fue preincubada con la fracción C3, la asociación de sueros de Hev b 6 con la fracción B2 y la asociación de sueros de Hev b 8 con C1. La IgE unida se detectó con un anticuerpo anti-IgE humana marcado con ^{125}I (calles 1-5). Las calles P y N muestran el testigo de solución tampón y la asociación de sueros testigo. Están indicados marcadores de pesos moleculares.
La presente invención se ilustra, además, mediante los ejemplos no limitativos que siguen.
Ejemplos Ejemplo 1 Generación de las fracciones de látex Suero B y C de látex
Se recogió látex de Hevea de reciente obtención en recipientes refrigerados desde árboles del caucho (H. brasiliensis, clon RRIM 600). El látex se centrifugó a 44.000 g, a 4ºC, durante 1 hora, separándole en tres fracciones principales: una fracción de la parte superior que contenía las partículas de caucho, una fase acuosa, el suero C, y una fracción "pesada" en el fondo que contenía lutoides. Se recogió la fase acuosa y se repitió la centrifugación. El suero C acuoso, claro, se liofilizó y se almacenó a -20ºC. La fracción del fondo que contenía los lutoides, se volvió a suspender en manitol, 0,4 mol/l, se volvió a dejar sedimentar y se sometió a ciclos alternados repetidos de congelación y descongelación para romper los lutoides. El fluido de los lutoides, el suero B, se recuperó después mediante centrifugación^{17}.
Fraccionamiento de suero C de látex mediante sulfato amónico
Cien miligramos de suero C de látex liofilizado se disolvieron en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. Se añadió
(NH_{4})_{2}SO_{4} hasta saturación de 25% y se agitó durante 30 minutos a 4ºC. El material que precipitó se centrifugó a 12.000 g durante 20 minutos a 4ºC. Las proteínas del sobrenadante fueron precipitadas después añadiendo (NH_{4})_{2}SO_{4} hasta una saturación de 50%. Las proteínas que precipitaron se recogieron por centrifugación y se añadió sulfato amónico al sobrenadante hasta una saturación de 75%. La solución se centrifugó de nuevo y las proteínas procedentes de las tres etapas de precipitación se almacenaron a -20ºC.
Cromatografía de intercambio aniónico
Los precipitados procedentes del fraccionamiento con sulfato amónico se disolvieron en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, y se desalaron haciéndolos pasar a través de una columna PD-10 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Cada una de las fracciones se aplicó a una columna MonoQ HR5/5 (Pharmacia). Del mismo modo, cien miligramos de suero B de látex liofilizado se disolvieron en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, y se aplicaron a una columna MonoQ HR5/5. Las proteínas sin adsorber fueron eluídas desde la columna con la misma solución tampón y las proteínas adsorbidas fueron eluídas usando un gradiente lineal de NaCl 0 - 1 M en el seno de Tris-HCl 20 mM, pH 7,5.
Los grupos de picos eluídos con NaCl de diferentes concentraciones fueron asociados a las fracciones C1 - C4. La fracción C1 contenía las proteínas que habían eluído con NaCl 150 - 200 mM, la fracción C2 las proteínas eluídas con NaCl 300-500 mM, ambas derivadas del precipitado con sulfato amónico de 50%. La fracción C3 contenía las proteínas eluídas con NaCl 300-450 mM y la C4 con NaCl 450-550 mM, ambas derivadas del precipitado con sulfato amónico de 75%. El procedimiento operatorio completo se llevó a cabo con dos lotes diferentes de suero C de látex Se separaron cinco \mug de cada una de las fracciones mediante SDS-PAGE al 12% y se tiñeron con azul de Coomassie (Figura 1). Los tipos de proteínas aparecían como muy similares con pequeñas diferencias en la concentración de ciertas proteínas (Figura 1, calles 1 y 2).
Se sometió directamente suero B de látex a cromatografía de intercambio aniónico obteniendo dos fracciones. La fracción B1 contenía las proteínas sin adsorber y la fracción las B2 proteínas que habían eluído con NaCl
150-250 mM.
Ejemplo 2 Reactividad de IgE al suero C y B de látex
Diez microgramos de extracto de proteínas o un microgramo de proteína recombinante por calle, fueron separados sobre geles de SDS-PAGE al 12% y se transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa (Schleicher and Schuell, Dassel, Alemania). Las membranas fueron cortadas en tiras y tratadas con solución tampón de bloqueo (Na_{2}HPO_{4} 40 mM, NaH_{2}PO_{4} 7 mM, BSA al 0,5%, azida de sodio al 0,05% p/v, Tween-20 al o,5%, pH 7,5) durante 30 minutos. Las tiras fueron incubadas después con sueros de pacientes diluidos 1 : 5 en la solución tampón de bloqueo, durante la noche, a 4ºC. Después de tres etapas de lavado, las transferencias fueron incubadas con Ig anti-(IgE humana) marcada con ^{125}I (IBL, Hamburgo, Alemania) durante la noche. La IgE de los pacientes que se unía a las proteínas se visualizó sobre película MS Biomax^{TM} (Kodak, Nueva York, EE.UU.) Se usó como testigo negativo una asociación de sueros procedentes de 7 individuos atópicos sanos con niveles altos de IgE para ácaros del polvo doméstico, pero negativos en los ensayos de pinchazo de la piel, y resultados de CAP negativos para látex.
Se observó reactividad de IgE a proteínas del suero C de látex para las asociaciones 1, 2 y 4 (Figura 2a, mancha de suero C). Las reacciones de IgE de estas asociaciones de sueros habían aumentado en las fracciones del suero C de látex, en especial para proteínas en el intervalo de 40 - 80 kDa (Figura 2a, manchas C1-C4, calles 1, 2 y 4). L asociación de suero 3 mostró débil reactividad de IgE para solamente una proteína del suero C de látex (Figura 2a, macha de suero C, calles 3) y reacciones de IgE para al menos 6 proteínas diferentes fueron medibles en las fracciones de suero C de látex. No pudieron determinarse reacciones de IgE para proteínas del suero C de látex para la asociación de sueros 5 (Figura 2a, mancha de suero C, calle 5) pero fueron reconocidas por lo menos 4 proteínas de las fracciones de suero C del látex por la asociación de sueros 5 (Figura 2a, manchas C1-C4, calles 5). La asociación de sueros de 7 sujetos alérgicos a ácaros del polvo casero y el testigo de solución tampón, no mostraron reactividad de IgE en el suero C de látex y ninguna de las fracciones (Figura 2a, manchas de suero C y C1-C4, calles N y P).
Reacciones de IgE para proteínas del suero B de látex, pudieron medirse con las asociaciones de sueros 1, 2, 3 y 4 (Figura 2d, mancha de suero B, calles 1-4). En las fracciones del suero B de látex no fue detectable aumento obvio en el número total de proteínas reactivas de IgE, con estas asociaciones de sueros, pero pudo medirse una mayor concentración de algunas proteínas, en especial en el intervalo de 33 a 35 kDa (Figura 2b, manchas B1 y B2, calles 1-4). La asociación de sueros 5 no mostró reactividad de IgE al suero B de látex mientras que era detectable una banda de proteína de 33 kDa aproximadamente en la fracción B1 (Figura 2b, manchas de suero B, B1 y B2, calles 5). La asociación de sueros de 7 sujetos alérgicos a ácaros del polvo doméstico y el testigo de solución tampón, no mostraron reactividad de IgE en el suero B de látex ni en ninguna de las fracciones (Figura 2b, manchas de suero B, B1 y B2, calles N y P).
Ejemplo 3 Presencia de alergenos de látex importantes
Las fracciones de látex de la presente invención contienen los alergenos de látex importantes Hev b 5, Hev b 6 y Hev b 8. Hev b 5 recombinante, rHev b 6 y rHev b 8, fueron separados mediante SDS-PAGE al 12% y transferidos sobre nitrocelulosa. Tiras de membrana fueron incubadas con asociaciones de sueros cada una de las cuales consistía en tres sueros ensayados para exponer IgE a los alergenos respectivos. Para realizar experimentos de inhibición, se incubaron previamente sueros con 50 \mug de extracto de proteínas. Para la inhibición, la asociación de sueros de Hev b 5 fue preincubada con la fracción C3, la asociación de sueros de Hev b 6 con la fracción B2 y la asociación de sueros de Hev b 8 con C1. La incubación previa de las asociaciones de sueros con las fracciones dio por resultado una disminución o la anulación completa de la unión de IgE a los alergenos recombinantes (Figura 3).
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Claims (25)

1. Un método para producir una composición que contiene sustancialmente todas las proteínas del látex del caucho natural (NRL) de unión de IgE humana natural, que comprende las etapas de:
(a)
preparar una o más fracciones de proteínas de NRL o uno de sus extractos mediante precipitación fraccionada, y
(b)
someter a separación cromatográfica la fracción o fracciones de proteínas obtenida(s) en la etapa (a).
2. El método según la reivindicación 1, en el que el NRL procede de Hevea brasiliensis.
3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el NRL es látex sin tratar con amoniaco (NAL).
4. El método según la reivindicación 3, en el que el extracto de NAL se obtiene por centrifugación.
5. El método según la reivindicación 4, en el que el (los) extracto(s) de NAL es/son suero C y/o suero B.
6. El método según la reivindicación 5, que comprende las etapas de:
(i)
preparar una o más fracciones de proteínas de suero C del NAL mediante precipitación fraccionada,
(ii)
someter a separación cromatográfica una o más de las fracciones de proteínas obtenidas en la etapa (a), y
(iii)
someter a separación cromatográfica el suero B del NAL.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la precipitación fraccionada se lleva a cabo cambiando el pH y/o la fuerza iónica del NRL o de su(s) extracto(s) y/o introduciendo en ellos un agente desnaturalizante y/o una sal.
8. El método según la reivindicación 7, en el que la precipitación fraccionada se lleva a cabo mediante la adición de una sal o de un disolvente orgánico.
9. El método según la reivindicación 8, en el que la sal se selecciona entre el grupo que consiste en sulfato amónico, NaCl y Na_{2}SO_{4}.
10. El método según la reivindicación 9, en el que la precipitación fraccionada se lleva a cabo:
(1)
añadiendo al NRL o uno de sus extractos, sulfato amónico hasta una concentración de 15 a 35%, preferiblemente 20 a 30%, más preferiblemente 22 a 28%, y en particular una saturación de 25%,
(2)
recuperando por centrifugación un primer precipitado y un primer sobrenadante,
(3)
añadiendo al primer sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 40 a 60%, preferiblemente 45 a 55%, más preferiblemente 47 a 53%, y en particular una saturación de 50%,
(4)
recuperando por centrifugación un segundo precipitado y un segundo sobrenadante,
(5)
añadiendo al segundo sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 65 a 85%, preferiblemente 70 a 80%, más preferiblemente 72 a 78%, y en particular una saturación de 75%, y
(6)
recuperando por centrifugación un tercer precipitado y un tercer sobrenadante.
11. El método según la reivindicación 10, en el que el extracto es suero C de NAL.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la separación cromatográfica incluye cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía hidrófoba y/o cromatografía de afinidad con inmunoglobulinas específicas de alergenos del látex.
13. El método según la reivindicación 12, en el que la cromatografía de intercambio iónico es cromatografía de intercambio aniónico.
14. El método según la reivindicación 13, en el que la cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo con una resina seleccionada entre el grupo que consiste en MonoQ y DEAE.
\newpage
15. El método según la reivindicación 14, en el que la cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo en el seno de una solución tampón de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, con un gradiente lineal de elución de NaCl 0 a 1 M.
16. Una composición que contiene sustancialmente todas las proteínas del látex del caucho natural (NRL) de unión de IgE humana natural, obtenida:
(A)
preparando por precipitación fraccionada fracciones de proteínas de suero C del NAL
(B)
sometiendo a cromatografía de intercambio aniónico las fracciones de proteínas obtenidas en la etapa (A), y
(C)
sometiendo a cromatografía de intercambio aniónico suero B del NAL.
17. La composición según la reivindicación 16, en la que la precipitación fraccionada comprende las etapas de:
(1)
añadir a suero C del NAL sulfato amónico hasta una concentración de 15 a 35%, preferiblemente 20 a 30%, más preferiblemente 22 a 28%, y en particular una saturación de 25%,
(2)
recuperar por centrifugación un primer precipitado y un primer sobrenadante,
(3)
añadir al primer sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 40 a 60%, preferiblemente 45 a 55%, más preferiblemente 47 a 53%, y en particular una saturación de 50%,
(4)
recuperar por centrifugación un segundo precipitado y un segundo sobrenadante,
(5)
añadir al segundo sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 65 a 85%, preferiblemente 70 a 80%, más preferible 72 a 78%, y en particular una saturación de 75%, y
(6)
recuperar por centrifugación un tercer precipitado y un tercer sobrenadante.
18. La composición según la reivindicación 17 que contiene:
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del segundo precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 120 a 230 mM, preferiblemente 140 a 210 mM, en particular 150 a 200 mM;
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del segundo precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 270 a 530 mM, preferiblemente 290 a 510 mM, en particular 300 a 500 mM;
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del tercer precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 270 a 480 mM, preferiblemente 290 a 460 mM, en particular 300 a 450 mM;
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del tercer precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 420 a 580 mM, preferiblemente 440 a 560 mM, en particular 450 a 550 mM;
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico de suero B del NAL, en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 120 a 280 mM, preferiblemente 140 a 260 mM, en particular 150 a 250 mM; y
-
la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico de suero B del NAL en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye como el flujo a través de la columna sin adsorber.
19. La composición según la reivindicación 18, en la que la cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo sobre MonoQ ó DEAE.
20. El conjugado de soporte-proteína en el que la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 está inmovilizada sobre un soporte sólido.
21. El conjugado según la reivindicación 20, en el que el soporte está revestido con la composición o enlazado a la misma.
22. El conjugado según la reivindicación 20 ó 21, en el que el soporte está seleccionado entre el grupo que consiste en bolas, membranas, varillas de introducción, y esquirlas de vidrio.
23. Un kit de diagnóstico que comprende la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 y/o el conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en combinación con reactivos empleados comúnmente para la detección de anticuerpos de IgE humana.
24. El uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, para la detección in vitro de IgE específica de alergenos.
25.El uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, para preparar un medicamento para la prevención o el tratamiento terapéutico de alergia al látex o el síndrome de látex-fruta.
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