ES2303616T3 - Reactivos para el diagnostico y la terapia de alergia al latex, y metodo para prepararlos. - Google Patents
Reactivos para el diagnostico y la terapia de alergia al latex, y metodo para prepararlos. Download PDFInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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Abstract
Un método para producir una composición que contiene sustancialmente todas las proteínas del látex del caucho natural (NRL) de unión de IgE humana natural, que comprende las etapas de : (a)preparar una o más fracciones de proteínas de NRL o uno de sus extractos mediante precipitación fraccionada, y (b)someter a separación cromatográfica la fracción o fracciones de proteínas obtenida(s) en la etapa (a).
Description
Reactivos para el diagnóstico y la terapia de
alergia al látex, y método para prepararlos.
La presente invención se refiere a reactivos
para el diagnóstico y/o el tratamiento terapéutico de alergia al
látex o alergia a frutas y a un método para preparar los
reactivos.
La alergia de tipo I al látex del caucho natural
(NRL) ha surgido durante las dos últimas décadas del sigo 20 como
un problema sanitario de consecuencias de mucho alcance para los
pacientes, tomando en consideración tanto su situación ocupacional
como su seguridad en el cuidado médico. La "sensibilización" o
"sensibilidad" al látex se define como la presencia de
anticuerpos específicos de IgE a alergenos del látex en el suero de
un individuo. La "alergia" al látex describe la provocación de
síntomas alérgicos de tipo inmediato por contacto con látex o
productos de látex en un individuo sensibilizado.
La mayor parte del caucho natural del mundo se
obtiene desde el látex del árbol del caucho Hevea
brasiliensis. La composición del látex del caucho natural es
bastante compleja y contiene una diversidad de sustancias tales
como agua, caucho (cis-1,4-poliisopreno),
proteínas, resinas, azúcares, ceniza y glicósidos de esteroles.
Para los productos comerciales de caucho, el látex tal como se
obtiene se mezcla con amoniaco hasta una concentración final de 200
mmol/l para evitar su coagulación, denominándose entonces látex
amoniacado (AL). Por otra parte la centrifugación a alta velocidad
de látex sin tratar con amoniaco (NAL) origina tres fracciones
diferentes: (i) una capa de partículas de caucho de color blanco
cremoso en la parte superior, (ii) una fracción en el fondo (suero
B) que consiste principalmente en los lutoides semejantes a
vacuolas, y (iii) un suero C, amarillento, entre ellas que contiene
el citosol procedente de las células de los vasos laticíferos.
La primera etapa para el diagnóstico de las
alergias de tipo I al NRL consiste en registrar una historia clínica
extensa de síntomas alérgicos al NRL. En una segunda etapa, se
llevan a cabo ensayos confirmatorios necesarios para identificar el
estado de sensibilización. Los ensayos confirmatorios más comúnmente
utilizados son el ensayo de pinchazo en la piel (skin prick test)
(SPT) y el ensayo del suero para detectar anticuerpos de IgE
específicos del látex. Extractos del ensayo SPT estandarizados y
mezclas de alergenos bien caracterizadas para la determinación de
IgE, son, por tanto, requisitos preliminares importantes para
diagnosticar una alergia a látex.
La detección en la piel de anticuerpos de IgE
específicos de alergenos es un método interesante, debido a que
es rápido, sensible, y a que lleva consigo una respuesta observable
clínicamente e importante desde el punto de vista biológico, en la
piel o el individuo. En 1995 y 1996 los ensayos de pinchazo en la
piel fueron realizados con el reactivo de látex Bencard, que estaba
basado en un AL sin procesar producido en Canadá. Los
investigadores describieron un predominio del 4,2% de respuestas
positivas al ensayo de la piel con látex entre pacientes
hospitalizados en una práctica de asma y alergia^{1} y una
asociación positiva entre la magnitud de la respuesta del ensayo
SPT y la gravedad de los síntomas inducidos por látex^{2}. En un
estudio cínico inicial de fase I/II se determinó la seguridad
relativa y la exactitud del diagnóstico de tres materiales
candidatos como origen de látex - AL, NAL y extractos de guantes de
látex pulverizados-. Como resultado de ello, se describió que el
NAL era el látex más interesante como candidato para el desarrollo
posterior debido a su estabilidad y facilidad de control de
calidad^{3}. Ebo et al. (J. Allergy Clin. Immunol. 1997
Nov; 100(5):618.-3) llevaron a cabo un estudio comparativo
de métodos de detección de anticuerpos de IgE incluyendo el ensayo
SPT. Estos investigadores usaron un extracto de NAL (Diagnostic
Products Corp) que puso de manifiesto una sensibilidad de 68% y una
especificidad de 100%. En un estudio Finish se examinó el
comportamiento en el diagnóstico de un reactivo del ensayo SPT
basado en suero C de látex de NAL procedente de Stallergènes
(Fresnes, Francia)^{4}. Se indicó una sensibilidad de
diagnóstico del 93% y una especificidad del 100%. Este es el único
extracto de látex de caucho natural comercial estandarizado de que
se dispone actualmente en Europa. Se llevó a cabo un estudio
clínico de fase III en varios centros con el reactivo
Investigational de Greer (Greer Laboratories, Lenoir, Nc), con un
extracto a base de NAL^{5}. En este estudio la sensibilidad del
diagnóstico fue 95% y la especificidad 100%. Un nuevo análisis de
los resultados obtenidos cambió la sensibilidad global del reactivo
para el ensayo SPT de NAL de Greer a 70%-75%^{6}.
Además, un extracto adicional para el ensayo SPT
puede adquirirse de ALK-Abello (Hörsholm, Dinamarca)
que está basado en suero C de látex de NAL de que se dispone.
Además de los productos de que se dispone en el comercio, los
especialistas en alergias que desean llevar a acabo ensayos de
diagnóstico en la piel pueden preparar sus propios extractos de
látex domésticos a partir de guantes, en especial en el caso de que
en los países respectivos, por ejemplo, en EE.UU., no exista
reactivo estandarizado para el ensayo de látex en la piel,
autorizado por la correspondiente organización de aprobación de
medicamentos (por ejemplo, la FDA).
Las técnicas más frecuentes para la medida in
vitro de IgE específica de látex natural de un suero, son el
ensayo radioalergoabsorbente (RAST) y el ensayo inmunoabsorbente
con enzimas ligadas (ELISA). Varios ensayos radioalergoabsorbentes
están disponibles en el comercio. Tres ensayos in vitro (DPC
Microplate Alastat, sistema CAP de Pharmacia FEIA e Hycor HYTECH)
fueron comparados para la detección de anticuerpo de IgE específico
del látex del caucho natural^{7} El sistema CAP de Pharmacia y el
Alastat de DOC pusieron de manifiesto una especificidad de
diagnóstico de 97% y una sensibilidad de diagnóstico de 76 ó 73%,
respectivamente, cuando se compararon con el ensayo de látex en la
piel con el reactivo de látex experimental de Greer. Ambos ensayos
clasificaron erróneamente, aproximadamente, el 25% de casos
sensibilizados con al látex, como falsos negativos para anticuerpos
de IgE específicos de látex. En un estudio separado de
comportamiento, la sensibilidad del diagnóstico y la especificidad
puestas de manifiesto por ambos ensayos eran equivalentes a las
obtenidas en el estudio anteriormente citado^{8}. El ensayo de
HYTECH en el primer estudio manifestó una especificidad de 73%, lo
que indica que produjo 27% de resultados falsos positivos cuando se
comparó con el ensayo de la piel^{7}. Se ha especulado que las
razones de la baja sensibilidad de diagnóstico de los ensayos CAP y
AlaSTAT puede estar relacionada con alergenos pobremente
representados y/o desnaturalizados en los reactivos que contienen
el alergeno que se usan en estos ensayos ^{6}. Se llegó a la
conclusión de que la exactitud y la fiabilidad de los ensayos
empleando reactivos que derivan de látex de caucho natural total,
dependen
de la disponibilidad de los alergenos y de su presencia en excesos molares en relación con el anticuerpo de IgE.
de la disponibilidad de los alergenos y de su presencia en excesos molares en relación con el anticuerpo de IgE.
El kit de RAST más ampliamente usado es,
probablemente, el RAST k82 de látex producido por Pharmacia
Diagnostics y su sistema inmunoabsorbente con enzimas ligadas
(sistema CAP de Pharmacia). Otro nuevo RAST de látex procedente de
Pharmacia Diagnostics está basado en el k82 pero está reforzado con
una molécula recombinante de Hev b 5 (rHev b 5). Adicionalmente, se
encuentran disponibles RASTs basados en alergenos recombinantes de
látex. Los Hev b 1, 2, 3, 6.01, 6.02, 8, 9 y 11, se encuentran
disponibles como proteínas de fusión con la proteína de unión a
maltosa (MBP), rHev b 5 sin MBP.
En el 2000, Yip et al., pusieron de
manifiesto que alergenos recombinantes de látex clínicamente
reactivos, pueden ser producidos de modo estandarizado y que
podrían proporcionar, potencialmente, reactivos sensibles y
específicos para el diagnóstico de alergias por látex^{9}. No
obstante, la capacidad de diagnóstico de una proteína recombinante
depende de la equivalencia respecto a la proteína natural. Ensayos
SPT con Hev b 2 natural pusieron de manifiesto que este alergeno es
uno de los principales alergenos del látex^{10}. Raulf Heimsoth
et al, han descrito una mala correlación entre la reactividad
de IgE de la molécula rHev b 2 y Hev b 2 natural^{11}. Estos
investigadores observaron casi ninguna reactividad de la IgE para su
rHev b 2. Esta observación puede ser debida al plegamiento erróneo
del producto de E. coli o a restos de hidratos de carbono
de Hev b 2 que representan epítopos de unión de IgE^{12} y que no
están presentes en la proteína recombinante expresada en E.
coli.
La solicitud de patente europea EP 0 704 457,
describe la purificación de solamente tres alergenos individuales
de látex designados Hev b II, III y IV. Los tres alergenos descritos
con más detalle representan solo una parte muy pequeña de los
numerosos alergenos del látex y en particular, no incluyen ni
siquiera los alergenos de látex más importantes actualmente
señalados, por ejemplo el Hev b 5.
La solicitud de patente internacional WO
01/61305 describe el uso de anticuerpos monoclonales y policlonales
que están dirigidos contra solamente cuatro alergenos recombinantes
de látex, a saber, Hev b 1, 3, 5, 6.02, y su uso en métodos
inmunológicos.
La publicación de Wagner et al., en Eur.
J. Biochem. 267 (2000), páginas 7006-7014,
describe un método que había sido desarrollado con objeto de
purificar un único alergeno, a saber el Hev b 9.
Además, la publicación de Hufnagel et
al., Clin. Exp. Immunol. 133 (2003), páginas
170-176. describe un modelo en ratón de alergia al
látex usando dos alergenos principales del látex para HCWs
(operarios de cuidado de la salud) y pacientes de espina bífida
(SB), el Hev b 1 y el Hev b 3, para sensibilización.
Hasta la fecha, trece alergenos de látex han
sido reconocidos por la Unión Internacional de Sociedades
Inmunológicas. Se ha descrito que el látex de caucho Natural
procedente del árbol Hevea brasiliensis contiene más de 250
polipéptidos, 60 de los cuales, por lo menos, demuestran
propiedades de unión de IgE^{13}. Por tanto, el diagnóstico de
alergia al látex con los 13 alergenos recombinantes o purificados,
parece no ser suficiente. Adicionalmente, algunos de los alergenos
principales del látex se originan a partir del suero B. Sin embargo,
la totalidad de los extractos de látex de que se dispone en el
comercio derivados de NAL han sido derivados, exclusivamente,
desde el suero C de látex.
El látex tal como se obtiene contiene,
aproximadamente, 1-2 proteínas y puede ser separado
por centrifugación con alta velocidad en tres fracciones
principales: (i) una capa superior blanca de partículas de caucho;
(ii) una capa acuosa (suero C) que contiene el citoplasma de las
células de los vasos laticíferos; y (iii) la fracción del fondo
(suero B), que consiste principalmente en los lutoides parecidos a
vacuolas.
Además, una comparación de procedimientos de
ensayo de que se dispone en el comercio para alergias de látex,
reveló una variación grande de los resultados y ninguno de los
métodos sometidos a evaluación pudo ser correlacionado con los
síntomas indicados de alergia de tipo I al látex.^{18}. Una
desventaja importante de los ensayos de que se dispone actualmente
es que hasta la fecha son necesarios varios métodos in vitro
para detectar sensibilización de IgE al látex.^{19}.
Por consiguiente, un problema técnico esencial
en la presente invención es proporcionar reactivos mejorados para
el diagnóstico y el tratamiento terapéutico de alergias a látex y
afines.
La solución al problema técnico anterior está
proporcionada por las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones.
En particular, la presente invención proporciona
un método para producir una composición que contiene sustancialmente
todas las proteínas del látex del caucho natural (NRL) de unión de
IgE humana natural, que comprende la etapa de preparar una o más
fracciones de proteínas de NRL o uno o más de sus extractos,
mediante precipitación fraccionada y/o separación
cromatográfica.
\global\parskip0.930000\baselineskip
El término "composición" al que se hace
referencia en esta memoria, comprende, en general, una o más
fracciones de proteínas derivadas de NRL (o uno de sus extractos o
fracciones).
La expresión "látex del caucho natural"
significa todo látex de caucho que puede obtenerse a partir de
cualquier fuente natural. Se ha observado que en el látex sin
refinar la cantidad de proteínas y la distribución de sus pesos
moleculares varían considerablemente entre fuentes diferentes de la
materia prima, lo que se atribuye a factores tales como el origen,
condiciones de crecimiento y maduración (clima, estación,
suelo)^{14,15}. No obstante, en el caso de que el NRL sea
recogido desde un clon particular del árbol Hevea
brasiliensis (por ejemplo, el clon RRIM 600 de Hevea
brasiliensis del Rubber Research Institute of Malaysia), por
medio de un procedimiento de preparación estandarizado, el
contenido de proteínas y su especificidad, son uniformes y
reproducibles^{16}. Por tanto, se prefiere que el NRL proceda de
H. brasiliensis. Preferiblemente, el NRL es látex sin tratar
con amoniaco (NAL).
La expresión "proteínas de látex del caucho
natural de unión de IgE humana natural" significa todas las
proteínas presentes en NRL que pueden actuar como alergeno en el ser
humano y que contribuyen, por tanto, a la alergia al látex o, por
lo menos, a sensibilización por el látex.
La expresión "extracto de NRL" comprende
cualquier fracción o solución o suspensión o emulsión modificada
derivada de NRL, en tanto que dicho extracto contenga la totalidad
de los alergenos del látex natural, según la definición
anterior.
Extractos de NRL particularmente preferidos, en
particular el NAL, se obtienen por centrifugación, de preferencia
centrifugación a alta velocidad, obteniendo las fracciones
anteriormente descritas (i) capa de partículas de caucho de color
blanco cremoso, (II) suero B (fondo) y (III) suero C entre (I) y
(II). Para los fines de las presente invención los extractos
preferidos de NAL son el suero B y el suero C.
En una realización de la presente invención, el
fraccionamiento de diferentes lotes de NRL recogido mediante un
procedimiento de preparación estandarizado, proporciona extractos de
proteínas de composición muy parecida.
Por consiguiente, el método según la presente
invención comprende las etapas de:
- (a)
- preparar mediante precipitación fraccionada una o más fracciones de proteínas de NRL o uno de sus extractos, y
- (b)
- someter a separación cromatográfica la(s) fracción(es) de proteínas obtenida(s) en la etapa (a).
La expresión "precipitación fraccionada"
significa que pueden precipitarse proteínas causando perturbaciones
en el disolvente en lo que respecta al pH, fuerza iónica, y
temperatura. El precipitado es recuperado, preferiblemente,
mediante etapas de centrifugación de uso común. Las propiedades del
disolvente pueden modificarse también mediante la adición de
concentraciones altas de ciertas sales o de disolventes orgánicos
miscibles. Las sales en solución con fuerza iónica baja con
relación con la de la solución salina isotónica. puede representar
una perturbación que puede ocasionar el que ciertas proteínas
precipiten desde la solución. Por otra parte, las sales presentes
en concentraciones muy altas con fuerza iónica mucho mayor que la de
los medios tisulares pueden ocasionar la precipitación de muchas
proteínas. La precipitación tiene lugar por neutralización de
cargas superficiales por la sal, por reducción de la actividad
química de la proteína y por disminución de la concentración
efectiva del agua. A esta proceso se denomina "precipitación de
proteínas por sales". La concentración de una sal necesaria para
ocasionar la precipitación de una proteína particular está
relacionada con el número y distribución de cargas y de grupos
polares no iónicos existentes sobre la superficie de la proteína, y
con el número y distribución de restos hidrófobos expuestos y que se
hacen dominantes a medida que las cargas van siendo neutralizadas.
El tamaño y la forma de la proteína contribuyen también a la
facilidad relativa de capacidad de precipitación. El sulfato
amónico es el precipitante usado con la mayor frecuencia para la
precipitación de proteínas por sales. Sus principales ventajas son
(1), en saturación, es de una molaridad lo suficientemente alta
para causar la precipitación de la mayoría de las proteínas; (2) no
posee un calor de solución grande; (3) incluso su solución saturada
tiene una densidad que no es tan grande como para interferir con la
sedimentación de la mayor parte de las proteínas precipitadas por
centrifugación; (4) sus soluciones concentradas evitan o limitan
la mayoría del crecimiento bacteriano; y (5) en solución, protege de
la desnaturalización a la mayor parte de las proteínas.
Por consiguiente, es parte de la presente
invención que, en una primera etapa, las proteínas del suero C ó B
del látex son fraccionadas mediante concentraciones diferentes de
sulfato amónico.
En una realización preferida de la presente
invención, las proteínas de las fracciones son separadas
posteriormente mediante cromatografía de intercambio iónico como
una segunda etapa.
Por tanto, el método de la presente invención
comprende, preferiblemente, las etapas de:
- (i)
- preparar una o más fracciones de proteínas de suero C de NAL mediante precipitación fraccionada,
- (ii)
- someter a separación cromatográfica una o más de la(s) fracción(es) de proteínas obtenidas en la etapa (a), y
- (iii)
- someter a separación cromatográfica suero B de NAL.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La separación cromatográfica puede incluir
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión
por tamaños, cromatografía hidrófoba y/o cromatografía de afinidad,
usando preferiblemente inmunoglobulinas específicas de alergenos de
látex.
La cromatografía de intercambio iónico (IEC) es
la técnica cromatográfica preferida de la presente invención. La
IEC está ideada específicamente para la separación de compuestos
iónicos o ionizables. La IEC se diferencia de los otros tipos de
cromatografía líquida en que la fase estacionaria transporta grupos
funcionales ionizables, fijados mediante enlace químico a la fase
estacionaria. Para satisfacer los requisitos de neutralidad
eléctrica, estas cargas fijadas pueden llevar un ion contrario de
signo opuesto. Este ion contrario no está fijado y puede ser
desplazado. Dos acontecimientos separados están implicados en la
IEC. El primero de ellos la unión de la proteína a las cargas
fijadas y el segundo la elución o desplazamiento de la proteína
desde las cargas fijadas mediante un nuevo ion contrario que posea
una mayor afinidad que la proteína para las cargas fijadas.
Preferiblemente, se usa la cromatografía de intercambio aniónico
para la separación cromatográfica de extractos de NRL o sus
fracciones de proteínas, por ejemplo, NAL, suero C ó B de NAL, o los
precipitados obtenidos mediante precipitación fraccionada,
preferiblemente precipitación por sales usando sulfato amónico, de
NRL (por ejemplo NAL) o suero B ó C de NAL.
En una realización preferida se usan como medio
iónico MonoBeads (Pharmacia, Uppsala, Suecia), basadas en resinas
hidrófilas de poliestireno/divinilbenceno, configuradas en bolas de
10 \mum. Preferiblemente las Beads están sustituidas con grupos
amino cuaternarios proporcionando el intercambiador aniónico fuerte,
MonoQ. La estabilidad de la matriz de MonoBeads juntamente con
procedimientos controlados de síntesis y de relleno de las
columnas, asegura separaciones muy reproducibles tanto a lo largo
del tiempo como de columna a columna.
Como es lógico son adecuadas también otras
resinas cromatográficas, en particular resinas de intercambio
iónico. Ejemplos de ellas incluyen Agarose, Sepharose, Sephadex,
Sephacryl, Sephacel, etc.
Una realización preferida de la cromatografía de
intercambio aniónico, por ejemplo sobre MonoQ, se lleva a cabo en
el seno de una solución tampón de Tris-HCl 10 a 50
mM, de preferencia 15 a 30 mM, en particular 20 mM, de pH 5 a 7,8,
de preferencia 7,3 a 7,8, en particular 7,5, con un gradiente lineal
de elución con NaCl de 0 a 1 M. Por supuesto, es posible utilizar
otras formas de gradientes (por ejemplo, gradientes escalonados) o
una combinación de gradientes lineales y escalonados, otras
soluciones tampón (por ejemplo, tampones de fosfatos) y sales de
elución (por ejemplo, KCl).
Como ya se ha mencionado anteriormente, la
precipitación fraccionada se lleva a cabo mediante cambio del pH
y/o de la fuerza iónica del NRL, o de sus extractos, y/o por
introducción en él de un agente desnaturalizante y/o de una sal. La
adición de sales para la precipitación fraccionada es lo más
preferido. Las sales adecuadas incluyen sulfato amónico, NaCl y/o
Na_{2}SO_{4}. Alternativamente, pueden usarse disolventes
orgánicos tales como etanol o acetona (en lugar de sales). En lo
que se refiere a la discusión anterior de precipitación de
proteínas, el sulfato amónico es la sal más preferida, útil en la
presente invención.
Según otra realización preferida del método de
la presente invención, la precipitación fraccionada se lleva a
cabo:
- (1)
- añadiendo al NRL o uno de sus extractos, sulfato amónico hasta una concentración de 15 a 35%, preferiblemente 20 a 30%, más preferiblemente 22 a 28%, y en particular una saturación de 25%.
- (2)
- recuperando por centrifugación un primer precipitado y un primer sobrenadante,
- (3)
- añadiendo al primer sobrenadante sulfato amónica hasta una concentración de 40 a 60%, preferiblemente 45 a 55%, más preferiblemente 47 a 53%, y en particular una saturación de 50%.
- (4)
- recuperando por centrifugación un segundo precipitado y un segundo sobrenadante,
- (5)
- añadiendo ala segundo sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 65 a 85%, preferiblemente 70 a 80%, más preferiblemente 72 a 78%, y en particular una saturación de 75%, y
- (6)
- recuperando por centrifugación un tercer precipitado y un tercer sobrenadante.
El extracto de NRL preferido en este caso, es
suero C de NAL. No obstante, la precipitación fraccionada anterior
puede aplicarse a cualquier NRL (por ejemplo NAL) o cualquier otro
extracto derivado de NRL.
Como una etapa final, la fracción de proteína
diferente obtenida por precipitación fraccionada y/o cromatografía,
puede combinarse, con objeto de dar lugar a una composición única
que contenga todos los alergenos del látex en concentraciones
suficientes para detectar IgE específica de los alergenos.
En particular, la composición o composiciones
obtenidas mediante el método anteriormente definido, contienen la
proteína alergénica del NRL en mayor concentración que el material
original (el propio NRL o su(s) extracto(s) tales
como el suero B ó el suero C del NAL).
\newpage
El método de la presente invención proporciona
composiciones de proteínas que pueden ser usadas con éxito en el
diagnóstico y/o el tratamiento terapéutico (o para la preparación
de una composición de diagnóstico y/o farmacéutica (medicamento),
preferiblemente de sensibilización o alergia al látex.
Por consiguiente, otra realización de la
presente invención se refiere a una composición que contiene
sustancialmente la totalidad de las proteínas del látex de caucho
natural (NRL) de unión de IgE humana natural que pueden obtenerse
mediante el método anteriormente definido.
La composición contiene, preferiblemente,
fracciones de proteínas obtenidas:
- (A)
- preparando fracciones de proteínas de suero C de NAL por precipitación fraccionada,
- (B)
- sometiendo a cromatografía de intercambio aniónico las fracciones de proteínas obtenidas en la etapa (A), y
- (C)
- sometiendo a cromatografía de intercambio aniónico suero B de NAL.
A este respecto, esto es citado específicamente
para las explicaciones y realizaciones preferidas anteriormente
ilustradas con respecto al método de la presente invención.
Más preferido, la precipitación fraccionada
comprende las etapas de:
- (1)
- añadir al suero C de NAL sulfato amónico hasta una concentración de 15 a 35%, preferiblemente 20 a 30%, más preferiblemente 22 a 28%, y en particular una saturación de 25%,
- (2)
- recuperar por centrifugación un primer precipitado y un primer sobrenadante,
- (3)
- añadir al primer sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 40 a 60%, preferiblemente 45 a 55%, más preferiblemente 47 a 53%, y en particular una saturación de 50%
- (4)
- recuperar por centrifugación un segundo precipitado y un segundo sobrenadante,
- (5)
- añadir al segundo sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 65 a 85%, preferiblemente 70 a 80%, más preferiblemente 72 a 78%, y en particular una saturación de 75%, y
- (6)
- recuperar por centrifugación un tercer precipitado y un tercer sobrenadante.
En otra realización preferida, la composición
contiene las fracciones de proteínas siguientes (o la(s)
composición(es) está / están representadas por las
fracciones de proteínas siguientes).
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del segundo precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 120 a 230 mM, preferiblemente 140 a 210 mM, en particular 150 a 200 mM;
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del segundo precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 270 a 530 mM, preferiblemente 290 a 510 mM, en particular 300 a 500 mM;
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del tercer precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 270 a 480 mM, preferiblemente 290 a 460 mM, en particular 300 a 450 mM;
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del tercer precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 420 a 580 mM, preferiblemente 440 a 560 mM, en particular 450 a 550 mM;
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico de suero B de NAL, en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 120 a 280 mM, preferiblemente 140 a 260 mM, en particular 150 a 250 mM; y
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico de suero B del NAL en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye como el flujo a través de la columna sin adsorber.
Según otra realización de la presente invención
la(s) composición(es) o fracción(es) de
proteína está/están inmovilizada(s) sobre un soporte sólido
proporcionando el correspondiente conjugado de
soporte-proteína-.
Se prefiere que la composición este revestida
sobre el soporte o acoplada al mismo en el conjugado de
soporte-proteína de la presente invención. El
soporte puede seleccionarse entre el grupo que consiste en bolas,
membranas, varillas de nivel y esquirlas de vidrio. Los conjugados
de la presente invención son especialmente útiles en aplicaciones
de diagnóstico tales como la detección de alergia a látex o
sensibilización por látex en los seres humanos.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere también a un kit de diagnóstico que comprende la composición
y/o el conjugado definido anteriormente, en combinación con
reactivos o medios comúnmente usados para la detección de
anticuerpos de IgE humanos.
El kit de diagnóstico de la presente invención
puede estar presente en todas las formas comúnmente conocidas para
la detección de anticuerpos de IgE humanos. Como ejemplos se
incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, ensayos in vivo
tales como el Ensayo de Pinchazo de la Piel, SPT, que mide una
reacción alérgica en la piel de los pacientes, a proteínas
presentes en las fracciones, o ensayos in vitro tales como
los ensayos ImmunoCAP, ensayos RAST, ELISA, varillas de nivel,
liberación de histamina, etc., que miden la presencia de anticuerpos
de IgE anti-proteína del látex en los sueros de los
pacientes ensayados.
El kit de diagnóstico es especialmente útil para
la detección de IgE específica de alergenos (látex) (en particular
en los seres humanos).
Por consiguiente, la presente invención
proporciona, además, un método de diagnóstico para detectar IgE
específica de alergenos (látex) (por ejemplo, en seres humanos),
que comprende la etapa de poner en contacto la composición y/o el
conjugado de la presente invención, con un fluido corporal (por
ejemplo, sangre o sus fracciones tales como suero sanguíneo). La
puesta en contacto con un fluido corporal comprende también la
inyección de la composición de la presente invención bajo la piel o
en la piel, por ejemplo, mediante un ensayo de pinchazo de la piel
(SPT). El método de diagnóstico según la presente invención puede
llevarse a cabo también como un ensayo ImmunoCAP, un ensayo RAST,
ELISA, etc.
Los reactivos proporcionados por el método de la
invención, en particular la composición, son también útiles como
medicamentos (o útiles para su preparación). Preferiblemente la
composición de la invención puede ser usada para la prevención o
tratamiento terapéutico de alergia al látex o el síndrome de
látex-fruta (o para preparar un medicamento para
las citadas indicaciones). El medicamento o composición farmacéutica
pueden contener uno o más excipientes, vehículos y/o diluyentes
farmacéuticamente aceptables y usados comúnmente.
La presente invención se refiere también a un
método para la prevención o el tratamiento terapéutico de las
indicaciones anteriores, que comprende la etapa de administrar la
composición o el medicamento de la presente invención a un paciente
humano aquejado, en particular, de alergia o sensibilización por
látex y/o alergia a las frutas. Los métodos de administración
preferidos incluyen la inyección por la vía intramuscular o la
aplicación a las mucosas tal como por vía sublingual. El método
preventivo/terapéutico de la presente invención se realiza,
preferiblemente, en la forma de un protocolo de
hipersensibilización. El protocolo puede incluir la administración
de concentraciones crecientes de extracto del alergeno durante un
período de tiempo.
Una ventaja de la presente invención es que
pueden realizarse diagnósticos extensos usando un número bastante
bajo de fracciones de látex de Hevea. La presente solicitud
de patente describe con detalle la preparación de estas fracciones.
Por el contrario, los diagnósticos comerciales de alergia al látex
se efectúan corrientemente usando extractos totales.
Las Figuras muestran:
Figura 1 muestra un ensayo
SDS-PAGE de las cuatro fracciones obtenidas a partir
de suero C de látex. Se usaron dos lotes diferentes de suero C de
látex y se comparó el contenido de proteínas.
Figura 2 muestra la reactividad de IgE de 5
asociaciones de sueros, consistiendo cada uno de los 5 sueros de
sujetos alérgicos a látex a) suero C de látex y las cuatro
fracciones C de látex, y b) a suero C de látex y las dos fracciones
B de látex. Fracciones transferidas a nitrocelulosa fueron
incubadas con las asociaciones de sueros y se detectó la IgE unida
con un anticuerpo anti-IgE humana marcado con
^{125}I (calles 1-5). Las calles P y N muestran
el testigo de solución tampón y la asociación de sueros testigo.
Están indicados marcadores de pesos moleculares.
Figura 3 demuestra la existencia de Hev b 5, Hev
b 6, y Hev b 8 en los extractos de látex. rHev b 5, rHev b 6 y rHev
b 8, transferidos a nitrocelulosa, fueron incubados con asociaciones
de sueros cada una de las consistía en tres sueros de sujetos
alérgicos al alergeno respectivo. La asociación de sueros para Hev b
5 fue preincubada con la fracción C3, la asociación de sueros de
Hev b 6 con la fracción B2 y la asociación de sueros de Hev b 8 con
C1. La IgE unida se detectó con un anticuerpo
anti-IgE humana marcado con ^{125}I (calles
1-5). Las calles P y N muestran el testigo de
solución tampón y la asociación de sueros testigo. Están indicados
marcadores de pesos moleculares.
La presente invención se ilustra, además,
mediante los ejemplos no limitativos que siguen.
Se recogió látex de Hevea de reciente
obtención en recipientes refrigerados desde árboles del caucho
(H. brasiliensis, clon RRIM 600). El látex se centrifugó a
44.000 g, a 4ºC, durante 1 hora, separándole en tres fracciones
principales: una fracción de la parte superior que contenía las
partículas de caucho, una fase acuosa, el suero C, y una fracción
"pesada" en el fondo que contenía lutoides. Se recogió la fase
acuosa y se repitió la centrifugación. El suero C acuoso, claro,
se liofilizó y se almacenó a -20ºC. La fracción del fondo que
contenía los lutoides, se volvió a suspender en manitol, 0,4 mol/l,
se volvió a dejar sedimentar y se sometió a ciclos alternados
repetidos de congelación y descongelación para romper los lutoides.
El fluido de los lutoides, el suero B, se recuperó después mediante
centrifugación^{17}.
Cien miligramos de suero C de látex liofilizado
se disolvieron en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. Se
añadió
(NH_{4})_{2}SO_{4} hasta saturación de 25% y se agitó durante 30 minutos a 4ºC. El material que precipitó se centrifugó a 12.000 g durante 20 minutos a 4ºC. Las proteínas del sobrenadante fueron precipitadas después añadiendo (NH_{4})_{2}SO_{4} hasta una saturación de 50%. Las proteínas que precipitaron se recogieron por centrifugación y se añadió sulfato amónico al sobrenadante hasta una saturación de 75%. La solución se centrifugó de nuevo y las proteínas procedentes de las tres etapas de precipitación se almacenaron a -20ºC.
(NH_{4})_{2}SO_{4} hasta saturación de 25% y se agitó durante 30 minutos a 4ºC. El material que precipitó se centrifugó a 12.000 g durante 20 minutos a 4ºC. Las proteínas del sobrenadante fueron precipitadas después añadiendo (NH_{4})_{2}SO_{4} hasta una saturación de 50%. Las proteínas que precipitaron se recogieron por centrifugación y se añadió sulfato amónico al sobrenadante hasta una saturación de 75%. La solución se centrifugó de nuevo y las proteínas procedentes de las tres etapas de precipitación se almacenaron a -20ºC.
Los precipitados procedentes del fraccionamiento
con sulfato amónico se disolvieron en Tris-HCl 20
mM, pH 7,5, y se desalaron haciéndolos pasar a través de una
columna PD-10 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Cada una
de las fracciones se aplicó a una columna MonoQ HR5/5 (Pharmacia).
Del mismo modo, cien miligramos de suero B de látex liofilizado se
disolvieron en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, y se
aplicaron a una columna MonoQ HR5/5. Las proteínas sin adsorber
fueron eluídas desde la columna con la misma solución tampón y las
proteínas adsorbidas fueron eluídas usando un gradiente lineal de
NaCl 0 - 1 M en el seno de Tris-HCl 20 mM, pH
7,5.
Los grupos de picos eluídos con NaCl de
diferentes concentraciones fueron asociados a las fracciones C1 -
C4. La fracción C1 contenía las proteínas que habían eluído con NaCl
150 - 200 mM, la fracción C2 las proteínas eluídas con NaCl
300-500 mM, ambas derivadas del precipitado con
sulfato amónico de 50%. La fracción C3 contenía las proteínas
eluídas con NaCl 300-450 mM y la C4 con NaCl
450-550 mM, ambas derivadas del precipitado con
sulfato amónico de 75%. El procedimiento operatorio completo se
llevó a cabo con dos lotes diferentes de suero C de látex Se
separaron cinco \mug de cada una de las fracciones mediante
SDS-PAGE al 12% y se tiñeron con azul de Coomassie
(Figura 1). Los tipos de proteínas aparecían como muy similares con
pequeñas diferencias en la concentración de ciertas proteínas
(Figura 1, calles 1 y 2).
Se sometió directamente suero B de látex a
cromatografía de intercambio aniónico obteniendo dos fracciones. La
fracción B1 contenía las proteínas sin adsorber y la fracción las B2
proteínas que habían eluído con NaCl
150-250 mM.
150-250 mM.
Diez microgramos de extracto de proteínas o un
microgramo de proteína recombinante por calle, fueron separados
sobre geles de SDS-PAGE al 12% y se transfirieron
sobre membranas de nitrocelulosa (Schleicher and Schuell, Dassel,
Alemania). Las membranas fueron cortadas en tiras y tratadas con
solución tampón de bloqueo (Na_{2}HPO_{4} 40 mM,
NaH_{2}PO_{4} 7 mM, BSA al 0,5%, azida de sodio al 0,05% p/v,
Tween-20 al o,5%, pH 7,5) durante 30 minutos. Las
tiras fueron incubadas después con sueros de pacientes diluidos 1 :
5 en la solución tampón de bloqueo, durante la noche, a 4ºC.
Después de tres etapas de lavado, las transferencias fueron
incubadas con Ig anti-(IgE humana) marcada con ^{125}I (IBL,
Hamburgo, Alemania) durante la noche. La IgE de los pacientes que
se unía a las proteínas se visualizó sobre película MS Biomax^{TM}
(Kodak, Nueva York, EE.UU.) Se usó como testigo negativo una
asociación de sueros procedentes de 7 individuos atópicos sanos con
niveles altos de IgE para ácaros del polvo doméstico, pero
negativos en los ensayos de pinchazo de la piel, y resultados de
CAP negativos para látex.
Se observó reactividad de IgE a proteínas del
suero C de látex para las asociaciones 1, 2 y 4 (Figura 2a, mancha
de suero C). Las reacciones de IgE de estas asociaciones de sueros
habían aumentado en las fracciones del suero C de látex, en
especial para proteínas en el intervalo de 40 - 80 kDa (Figura 2a,
manchas C1-C4, calles 1, 2 y 4). L asociación de
suero 3 mostró débil reactividad de IgE para solamente una proteína
del suero C de látex (Figura 2a, macha de suero C, calles 3) y
reacciones de IgE para al menos 6 proteínas diferentes fueron
medibles en las fracciones de suero C de látex. No pudieron
determinarse reacciones de IgE para proteínas del suero C de látex
para la asociación de sueros 5 (Figura 2a, mancha de suero C, calle
5) pero fueron reconocidas por lo menos 4 proteínas de las
fracciones de suero C del látex por la asociación de sueros 5
(Figura 2a, manchas C1-C4, calles 5). La asociación
de sueros de 7 sujetos alérgicos a ácaros del polvo casero y el
testigo de solución tampón, no mostraron reactividad de IgE en el
suero C de látex y ninguna de las fracciones (Figura 2a, manchas de
suero C y C1-C4, calles N y P).
Reacciones de IgE para proteínas del suero B de
látex, pudieron medirse con las asociaciones de sueros 1, 2, 3 y 4
(Figura 2d, mancha de suero B, calles 1-4). En las
fracciones del suero B de látex no fue detectable aumento obvio en
el número total de proteínas reactivas de IgE, con estas
asociaciones de sueros, pero pudo medirse una mayor concentración
de algunas proteínas, en especial en el intervalo de 33 a 35 kDa
(Figura 2b, manchas B1 y B2, calles 1-4). La
asociación de sueros 5 no mostró reactividad de IgE al suero B de
látex mientras que era detectable una banda de proteína de 33 kDa
aproximadamente en la fracción B1 (Figura 2b, manchas de suero B,
B1 y B2, calles 5). La asociación de sueros de 7 sujetos alérgicos a
ácaros del polvo doméstico y el testigo de solución tampón, no
mostraron reactividad de IgE en el suero B de látex ni en ninguna
de las fracciones (Figura 2b, manchas de suero B, B1 y B2, calles N
y P).
Las fracciones de látex de la presente invención
contienen los alergenos de látex importantes Hev b 5, Hev b 6 y Hev
b 8. Hev b 5 recombinante, rHev b 6 y rHev b 8, fueron separados
mediante SDS-PAGE al 12% y transferidos sobre
nitrocelulosa. Tiras de membrana fueron incubadas con asociaciones
de sueros cada una de las cuales consistía en tres sueros ensayados
para exponer IgE a los alergenos respectivos. Para realizar
experimentos de inhibición, se incubaron previamente sueros con 50
\mug de extracto de proteínas. Para la inhibición, la asociación
de sueros de Hev b 5 fue preincubada con la fracción C3, la
asociación de sueros de Hev b 6 con la fracción B2 y la asociación
de sueros de Hev b 8 con C1. La incubación previa de las
asociaciones de sueros con las fracciones dio por resultado una
disminución o la anulación completa de la unión de IgE a los
alergenos recombinantes (Figura 3).
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Claims (25)
1. Un método para producir una composición que
contiene sustancialmente todas las proteínas del látex del caucho
natural (NRL) de unión de IgE humana natural, que comprende las
etapas de:
- (a)
- preparar una o más fracciones de proteínas de NRL o uno de sus extractos mediante precipitación fraccionada, y
- (b)
- someter a separación cromatográfica la fracción o fracciones de proteínas obtenida(s) en la etapa (a).
2. El método según la reivindicación 1, en el
que el NRL procede de Hevea brasiliensis.
3. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que el NRL es látex sin tratar con
amoniaco (NAL).
4. El método según la reivindicación 3, en el
que el extracto de NAL se obtiene por centrifugación.
5. El método según la reivindicación 4, en el
que el (los) extracto(s) de NAL es/son suero C y/o suero
B.
6. El método según la reivindicación 5, que
comprende las etapas de:
- (i)
- preparar una o más fracciones de proteínas de suero C del NAL mediante precipitación fraccionada,
- (ii)
- someter a separación cromatográfica una o más de las fracciones de proteínas obtenidas en la etapa (a), y
- (iii)
- someter a separación cromatográfica el suero B del NAL.
7. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la precipitación fraccionada se
lleva a cabo cambiando el pH y/o la fuerza iónica del NRL o de
su(s) extracto(s) y/o introduciendo en ellos un
agente desnaturalizante y/o una sal.
8. El método según la reivindicación 7, en el
que la precipitación fraccionada se lleva a cabo mediante la
adición de una sal o de un disolvente orgánico.
9. El método según la reivindicación 8, en el
que la sal se selecciona entre el grupo que consiste en sulfato
amónico, NaCl y Na_{2}SO_{4}.
10. El método según la reivindicación 9, en el
que la precipitación fraccionada se lleva a cabo:
- (1)
- añadiendo al NRL o uno de sus extractos, sulfato amónico hasta una concentración de 15 a 35%, preferiblemente 20 a 30%, más preferiblemente 22 a 28%, y en particular una saturación de 25%,
- (2)
- recuperando por centrifugación un primer precipitado y un primer sobrenadante,
- (3)
- añadiendo al primer sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 40 a 60%, preferiblemente 45 a 55%, más preferiblemente 47 a 53%, y en particular una saturación de 50%,
- (4)
- recuperando por centrifugación un segundo precipitado y un segundo sobrenadante,
- (5)
- añadiendo al segundo sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 65 a 85%, preferiblemente 70 a 80%, más preferiblemente 72 a 78%, y en particular una saturación de 75%, y
- (6)
- recuperando por centrifugación un tercer precipitado y un tercer sobrenadante.
11. El método según la reivindicación 10, en el
que el extracto es suero C de NAL.
12. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que la separación cromatográfica
incluye cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
exclusión por tamaños, cromatografía hidrófoba y/o cromatografía
de afinidad con inmunoglobulinas específicas de alergenos del
látex.
13. El método según la reivindicación 12, en el
que la cromatografía de intercambio iónico es cromatografía de
intercambio aniónico.
14. El método según la reivindicación 13, en el
que la cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo con
una resina seleccionada entre el grupo que consiste en MonoQ y
DEAE.
\newpage
15. El método según la reivindicación 14, en el
que la cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo en el
seno de una solución tampón de Tris-HCl 10 a 50 mM,
preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8,
preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, con un gradiente
lineal de elución de NaCl 0 a 1 M.
16. Una composición que contiene sustancialmente
todas las proteínas del látex del caucho natural (NRL) de unión de
IgE humana natural, obtenida:
- (A)
- preparando por precipitación fraccionada fracciones de proteínas de suero C del NAL
- (B)
- sometiendo a cromatografía de intercambio aniónico las fracciones de proteínas obtenidas en la etapa (A), y
- (C)
- sometiendo a cromatografía de intercambio aniónico suero B del NAL.
17. La composición según la reivindicación 16,
en la que la precipitación fraccionada comprende las etapas de:
- (1)
- añadir a suero C del NAL sulfato amónico hasta una concentración de 15 a 35%, preferiblemente 20 a 30%, más preferiblemente 22 a 28%, y en particular una saturación de 25%,
- (2)
- recuperar por centrifugación un primer precipitado y un primer sobrenadante,
- (3)
- añadir al primer sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 40 a 60%, preferiblemente 45 a 55%, más preferiblemente 47 a 53%, y en particular una saturación de 50%,
- (4)
- recuperar por centrifugación un segundo precipitado y un segundo sobrenadante,
- (5)
- añadir al segundo sobrenadante sulfato amónico hasta una concentración de 65 a 85%, preferiblemente 70 a 80%, más preferible 72 a 78%, y en particular una saturación de 75%, y
- (6)
- recuperar por centrifugación un tercer precipitado y un tercer sobrenadante.
18. La composición según la reivindicación 17
que contiene:
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del segundo precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 120 a 230 mM, preferiblemente 140 a 210 mM, en particular 150 a 200 mM;
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del segundo precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 270 a 530 mM, preferiblemente 290 a 510 mM, en particular 300 a 500 mM;
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del tercer precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 270 a 480 mM, preferiblemente 290 a 460 mM, en particular 300 a 450 mM;
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico del tercer precipitado en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 420 a 580 mM, preferiblemente 440 a 560 mM, en particular 450 a 550 mM;
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico de suero B del NAL, en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye con NaCl 120 a 280 mM, preferiblemente 140 a 260 mM, en particular 150 a 250 mM; y
- -
- la fracción de proteínas obtenida mediante cromatografía de intercambio aniónico de suero B del NAL en el seno de Tris-HCl 10 a 50 mM, preferiblemente 15 a 30 mM, en particular 20 mM, pH 7 a 7,8, preferiblemente 7,3 a 7,6, en particular 7,5, que eluye como el flujo a través de la columna sin adsorber.
19. La composición según la reivindicación 18,
en la que la cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo
sobre MonoQ ó DEAE.
20. El conjugado de
soporte-proteína en el que la composición según una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 está inmovilizada sobre
un soporte sólido.
21. El conjugado según la reivindicación 20, en
el que el soporte está revestido con la composición o enlazado a la
misma.
22. El conjugado según la reivindicación 20 ó
21, en el que el soporte está seleccionado entre el grupo que
consiste en bolas, membranas, varillas de introducción, y esquirlas
de vidrio.
23. Un kit de diagnóstico que comprende la
composición según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19
y/o el conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a
22, en combinación con reactivos empleados comúnmente para la
detección de anticuerpos de IgE humana.
24. El uso de la composición según una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, para la detección in
vitro de IgE específica de alergenos.
25.El uso de la composición según una cualquiera
de las reivindicaciones 16 a 19, para preparar un medicamento para
la prevención o el tratamiento terapéutico de alergia al látex o el
síndrome de látex-fruta.
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